JP2002509075A - Ｈｃｖのｎｓ３タンパク質に関連したセリンプロテアーゼ活性のペプチド阻害剤、関連する使用およびその製造方法 - Google Patents

Ｈｃｖのｎｓ３タンパク質に関連したセリンプロテアーゼ活性のペプチド阻害剤、関連する使用およびその製造方法

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シュタインクユーラー、クリスチャン
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Abstract

(57)【要約】 本発明の主題は、ＨＣＶウイルスのＮＳ３タンパク質に関連したセリンプロテアーゼ活性を阻害することができるペプチド、その利用法およびＨＣＶウイルスのポリタンパク質のＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合部位の配列のうち少なくとも１つを含むポリペプチドの蛋白質分解を含む、その産生プロセスである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 概要 発明の分野 本発明は、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の分子生物学およびウイルス学に
関する。特に、このウイルスの感染症の結果として起こる多様な肝炎の治療に用
いられる可能性がある分子の研究に関する。
【０００２】 技術の現状 現在、ウイルス病態に対して治療的可能性を有する分子を生成するために当技
術分野において最もよく用いられている方法は、高度の分子多様性を有する単一
の化学物質を多数含む化合物の集団に、単一の活性物質が存在するか否かを検出
する自動プログラムを行うことである。次に、それらの物質にその治療的可能性
を改善することを目的とした化学改変を行う。
【０００３】 特殊なＨＣＶの場合、細胞培養において感染性の粒子をインビトロで培養およ
び継代する方法は、当技術分野でまだ論文として発表されていない。その上、唯
一の動物感染モデルは霊長類を利用している。これらの動物モデルは費用が高い
ことから、その抗ウイルス活性をアッセイすることができる調製物の数は著しく
制限される。実際に、治療能を有する分子の同定は現在のところ、完全なウイル
ス体の外側でともかくも発現されたウイルスタンパク質の生物活性を妨害するこ
とができる分子の同定に限られている。上記の制限によってかなり妨害されたと
はいえ、ＨＣＶ生物学の研究によって、その生物活性がウイルス複製にとって必
須であるように思われ、したがってその阻害がおそらく治療的有用性を有するよ
うに思われるウイルスタンパク質が同定された。
【０００４】 ＨＣＶウイルスは非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢ）の主な病因であり、血清中におけ
るその慢性感染症はしばしば肝硬変を引き起こし、２０〜３０年の間に肝細胞癌
に進行する可能性がある。ＨＣＶの分子生物学に関して、知られているように、
ＨＣＶは、約９．４ｋｂのカプシドに包まれたＲＮＡ＋ゲノムを含む、膜を有す
るウイルスである。
【０００５】 ＨＣＶウイルスのゲノム構築は、協力してウイルス構造を形成するタンパク質
をコードする構造領域と、機能的タンパク質（ヘリカーゼ／プロテアーゼ；ＲＮ
Ａ−依存的ＲＮＡポリメラーゼ）をコードする非構造領域ＮＳとを含む。
【０００６】 いずれの領域も、９０３０ヌクレオチド〜９０９９ヌクレオチドの間で可変で
ある単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に存在し、これが単一のウ
イルスポリタンパク質に翻訳され、その長さはアミノ酸３０１０〜３０３３個の
間となることがあるが、その後ウイルス感染サイクルの間に蛋白質分解的に加工
されて個々の遺伝子産物となる。異なる分子生物学研究から、ポリタンパク質の
成熟は異なる酵素によることが示されている。特に、ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ
−ＮＳ４Ｂ−ＮＡ５Ａ−ＮＳ５Ｂタンパク質（この順に並ぶ）を含むＨＣＶポリ
タンパク質の非構造部分のプロセシングは、異なる２つのプロテアーゼの活性に
よって起こるが、その一つはＮＳ３タンパク質のＮ−末端（アミノ酸１〜１８１
位）の中に含まれるセリンプロテアーゼ（したがってＮＳ３プロテアーゼと呼ぶ
）であり、これがＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ
、およびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ部位での切断の原因である（バーテンシュラーガー
（Bartenschlager, R.）、Antiviral Chemistry & Chemotherapy 1997）。
【０００７】 ＮＳ３は６８ｋＤａタンパク質であり、実際に２つの機能的ドメインを示し、
一つはアミノ末端アミノ酸の最初の２００個におけるセリンプロテアーゼドメイ
ンであり、もう一つはカルボキシ末端でのＲＮＡ−依存的ＡＴＰアーゼドメイン
である。
【０００８】 当初、ＮＳ３プロテアーゼの基質特異性は、一過性のトランスフェクション（
コリクハロフ（Kolykhalov, A.）ら、J. Virol. 1994；バーテンシュラーガー（
Bartenschlager, R.）ら、J. Virol. 69、198〜205、1995）、インビトロ翻訳（ラ
インバック（Leinbach, S.）ら、Virology 1994）または大腸菌における融合タ ンパク質の細胞内プロセッシング（コモダ（Komoda, Y.）ら、J. Virol. 1994）
を用いて定量的に調べられた。最近では、酵素的に活性なプロテアーゼドメイン
の効率的な異種発現および精製が記述されており（シミズ（Shimizu, Y.）ら、J
. Virol. 1996；スタインキューラー（Steinkuhler, C.）ら、J. Biol. Chem. 1
996；カキウチ（Kakiuchi, N.）ら、Biochem.Biophys. Res. Commun. 1995；オ バートン（Overton, H.）ら、J. Gen. Virol. 1995；ディソウザ（D’Souza, E.
D.A.）ら、J. Gen. Virol. 1995；スズキ（Suzuki, T.）ら、J. Gen. Virol. 19
95；ショウジ（Shoji, I.）ら、Hepathology 1996；モリ（Mori, A.）ら、FEBS
Lett. 1996；ホン（Hong, Z.）ら、Anal. Biochem. 1996；スタインキューラー （Steinkuhler, C.）ら、J. Virol. 1996）、プロテアーゼ活性測定のための最 適な条件が確立されている（スタインキューラー（Steinkuhler, C.）ら、J. Vi
rol. 1996；ウルバニ（Urbani, A.）ら、J. Biol. Chem. 1997；ビアンキ（Bian
chi, E.）ら、Anal. Biochem. 1996；タリアニ（Taliani, M.）ら、Anal. Bioch
em. 1996）。
【０００９】 ウイルス生物学および感染症とウイルス複製サイクルに関してこれまでに記述
された内容に従えば、蛋白質分解活性に関連したＮＳ３タンパク質を妨害するこ
とができる物質は新規治療物質となる可能性があることは明らかである。実際に
、このプロテアーゼ活性の阻害はＨＣＶポリタンパク質の非構造領域のタンパク
質分解プロセッシングの停止を必然的に伴い、したがって、感染した細胞におけ
るウイルス複製を妨害するであろう。
【００１０】 酵素的に活性なＮＳ３を産生させる方法、および酵素活性アッセイ法の開発に
より、ＮＳ３プロテアーゼ活性を妨害する新規化学物質の研究プログラムが計画
された。これらのプログラムは本質的に、プロテアーゼに及ぼすその特異的活性
を決定するために、多数の単一の化学物質を酵素的活性アッセイに導入すること
からなる。次に、このように活性であると定義された化合物に、治療能を改善す
ることを目的とする化学修飾をさらに行う。第二の一般的に用いられるアプロー
チは、高い結合親和性で生物活性を変化または消失させることができる化合物を
開発するために、プロテアーゼの基質リガンドの合理的な改変を含む。
【００１１】 本発明の概要 本発明の主題は、ＨＣＶ ＮＳ３酵素に関連したプロテアーゼ活性を阻害する
ことができるペプチドである。それらは、ウイルスポリタンパク質に対するＮＳ
３タンパク質分解作用の産物における同定により、プロテアーゼそのものの阻害
剤として作用することができる幾つかのペプチドのＮＳ３酵素基質特異性に関す
る試験の際に同定された。
【００１２】 特に、その配列のＣ−末端部分に、接合部位ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／Ｎ
Ｓ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ａ／ＮＳ５ＢのＰ４、Ｐ３、Ｐ２、
およびＰ１位に本来存在するアミノ酸を有する、蛋白質分解に由来するペプチド
は、ＮＳ３プロテアーゼそのものに対して阻害能を示すことが判明した。ＮＳ３
酵素の上記の４つの切断部位の配列を表Ｉに記載する。
【００１３】 ＨＣＶ Ｂｋ株ポリタンパク質切断部位のＰ６−Ｐ′４残基。配列中のアミノ
酸は一文字コードで示す。Ｐ１とＰ′１は太字で示す。
【００１４】 ウイルス起源のペプチドの中で、その配列がＮＳ４Ａ／ＮＳ４ＢおよびＮＳ５
Ａ／ＮＳ５Ｂ部位のＰ６−Ｐ１残基にそれぞれ対応する、配列番号：１および配
列番号：８として配列表に示される２つのペプチドにおいて特定の阻害有効性が
示された。
【００１５】 酵素作用の産物が、その産生に関係する酵素の競合的阻害剤として作用するこ
とができるという事実は、ＮＳ３としてのセリンプロテアーゼにとっては非常に
珍しく、したがって非Ａ非Ｂ肝炎に対するより有効な薬剤の開発に関する新たな
見通しが得られたことは予想外であった。
【００１６】 そのようなペプチドの特徴付けを行った後、そのような阻害能が、そのような
ペプチドのＣ−末端部分における遊離の酸機能少なくとも１つの存在に帰するこ
とができることをさらに評価した。ペプチドの他の位置におけるアミノ酸は、ペ
プチドの阻害能のレベルに有意な影響を及ぼすが、それ自身、同じペプチドに阻
害特性を与えることはできない。
【００１７】 したがって、それぞれの位置に対応して、関連する阻害能が増加したアミノ酸
または複数のアミノ酸が同定された。Ｃ−末端位で酸機能を示すさらなるペプチ
ドは化学合成されて、そのアミノ酸配列はウイルスペプチド配列によって部分的
に得られており、それらは阻害能の著しい増加を示すという特徴を有する。
【００１８】 いずれにせよ、ウイルス起源のペプチドの配列はそれらが由来するウイルス部
位のＰ６−Ｐ１残基に対応するため、得られた全てのペプチドにおいてそれぞれ
のアミノ酸残基が占める位置は慣例的にＰ６〜Ｐ１と命名されており、Ｐ６がＮ
−末端位置であり、Ｐ１がＣ−末端位置である。
【００１９】 そのことに関連して、そして以降開示することに関連して、本発明の主題はま
ず第一に、Ｐ１位のアミノ酸が少なくとも遊離の酸機能を有し、それらがＮＳ３
タンパク質に関連したＨＣＶウイルスのプロテアーゼ活性を阻害することができ
ることを特徴とする、Ｐ６がＮ−末端であって、Ｐ１がＣ−末端である、Ｐ６か
らＰ１位に配列するアミノ酸残基６個を含むペプチドである。
【００２０】 特に、本発明の主題は以下の通りである： − Ｐ１位のアミノ酸がシステイン、その類似体または誘導体であって、特に
Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ホモシステイン、Ｓ−メチルシステイン、ア
ラニン、Ｓ−エチルシステイン、トレオニン、メチオニン、セリンおよびペニシ
ラミンからなる群より選択されるアミノ酸であるペプチド。
【００２１】 − 特にアスパラギン酸、コハク酸およびアシルスルホンアミドからなる群よ
り選択される酸機能をＰ６位に有する上記ペプチド。
【００２２】 − 特に、アスパラギン酸、コハク酸、およびアシルスルホンアミドからなる
群より選択される酸機能をＰ５位に有する上記ペプチド。
【００２３】 − 特に、３，３−ジフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびフェ
ニルグリシンからなる群より選択される疎水性アミノ酸をＰ４位に有する上記ペ
プチド。
【００２４】 − グルタミン酸、バリンおよびイソロイシンからなる群より選択されるアミ
ノ酸をＰ３位に有する上記ペプチド、および具体例としてアスパラギン酸、ｐ−
ニトロフェニルアラニン、チロシン、ｇ−カルボキシグルタミン酸、Ｄ−フェニ
ルアラニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−３，３−ジフ
ェニルアラニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、およびＤ−ｇ−カル
ボキシグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸をＰ５位に有するペプチ
ド、もう一つの具体例としてＰ５位にそのようなアミノ酸を有する、または有し
ないことに加えて、アミノ酪酸、ノルバリンおよびバリンからなる群より選択さ
れるアミノ酸をＰ１位に有するペプチド。
【００２５】 特に関連するペプチドは、ペプチドが２μＭ（ＩＣ50）より低い濃度またはこ
れと等しい濃度でＮＳ３酵素活性を５０％阻害することができる場合、およびペ
プチドがＰ４、Ｐ３、Ｐ２およびＰ１位に、ＨＣＶウイルスの一つの接合部位の
Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２およびＰ１位にそれぞれ本来存在するアミノ酸を有し、接合部
位がＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、およびＮＳ
５Ａ／ＮＳ５Ｂからなる群より選択されるものである。
【００２６】 本発明のさらなる主題は、接合部位がＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ
、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合部位からなる群より選択
される、ＨＣＶウイルスのポリタンパク質の接合部位少なくとも１つを含むポリ
ペプチドの蛋白質分解反応によって得ることができるペプチドである。
【００２７】 このように、特に関連するペプチドは、接合部位がデカペプチドから成り、Ｎ
Ｓ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ａ／
ＮＳ５Ｂ接合部位のＰ４、Ｐ３、Ｐ２、およびＰ１位に本来存在するアミノ酸を
含むペプチド； ＨＣＶウイルスが、非制限的な例としてトキタ（Tokita, M.）
ら、J. of Gen. Virol. 1996；およびミヤカワ（Myakawa, Y.）ら、Molecular M
ed. Today, 1995に記載される、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、 ２ｅ、２ｆ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、
５ａ、５ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、
１０ａおよび１１ａ遺伝子型のＨＣＶウイルスを含む群より選択されるペプチド
；ならびにウイルスが、非制限的な例としてグラコウ（Grakou）ら、J. of Viro
l. 1993に記載される、Ｈ−ＦＤＡ、Ｈ−ＡＰ、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣ Ｖ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＣ−Ｊ８、ＨＣＶ−ＪＴおよびＨＣＶ−
ＪＴ′株のウイルスであるペプチド。
【００２８】 好ましい態様において、本発明のペプチドは配列番号：１〜配列番号：６９と
して添付の配列表に報告される配列を含む群より選択されるアミノ酸配列を有す
るペプチドである。
【００２９】 本発明のさらなる主題は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの酵素活性の結合また
は阻害アッセイを導出するために上記ペプチドを利用すること、しかし特に非Ａ
非Ｂ肝炎の治療用薬剤を調製するためにそれらのペプチドを利用することである
。
【００３０】 その上、特に関連するのは、酵素活性部位に関する構造的情報を得るために、
このペプチド阻害剤を酵素との「共結晶化」に用い、それによってペプチド特性
を有するまたは有しない新規酵素活性調節物質の発見を容易にすることである。
【００３１】 上記の全てのペプチドは、上記ペプチドの少なくとも１つのほかに、薬学的に
有効な担体、溶媒、または補助物質を含むことを特徴とする薬学的組成物と共に
、該ペプチドの少なくとも１つを同様に含む組成物を調製するために用いること
ができる。
【００３２】 本発明のさらなる主題は、ＨＣＶウイルスのポリタンパク質のＮＳ３／ＮＳ４
Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合
部位の配列のうち少なくとも１つを含むポリペプチドのタンパク質分解を実施す
る工程を特徴とする、上記ペプチド少なくとも１つを産生するプロセスである。
【００３３】 特に、ＨＣＶウイルスが、非制限的な例としてトキタ（Tokita, M.）ら、J. o
f Gen. Virol. 1996；およびミヤカワ（Myakawa, Y.）ら、Molecular Med. Toda
y, 1995に記載される、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、 ２ｅ、２ｆ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、
５ａ、５ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、
１０ａおよび／または１１ａを示す、蛋白質分解反応がＨＣＶウイルスのＮＳ３
プロテアーゼによって行われる場合；ならびにウイルスが、非制限的な例として
グラコウ（Grakou）ら、J. of Virol. 1993に記載される、Ｈ−ＦＤＡ、Ｈ−Ａ Ｐ、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＣ−
Ｊ８、ＨＣＶ−ＪＴおよび／またはＨＣＶ−ＪＴ′株のウイルスである場合、を
考慮する。
【００３４】 特に関連するもう一つの場合は、ＮＳ３ポリペプチド基質に含まれる接合部位
が同じ接合部位自身のＰ４、Ｐ３、Ｐ２およびＰ１位に本来存在するアミノ酸を
含む、デカペプチドから成る場合である。
【００３５】 本発明は、添付の図を参照することによりよりよく理解されるであろう。
【００３６】 発明の詳細な説明 本発明の主題は、その幾つかがウイルス起源のペプチドに対応し、その他は１
つまたはそれ以上のアミノ酸残基の改変によって得られる、ＮＳ３−関連プロテ
アーゼ活性に対して関連する阻害能を有するペプチドである。
【００３７】 表ＩＩは、非制限的な例としてＮＳ３酵素基質特異性に及ぼす試験から得られ
たペプチド阻害剤６９個のコードおよび特徴を報告し、単一のペプチドの阻害能
がより高い、またはより低い効率であるかを評価するための参考パラメータとし
て、ＮＳ３酵素活性の５０％阻害（ＩＣ50）が得られる化合物のμＭでの濃度を
示す。
【００３８】 Ａｂｕ＝２−アミノ酪酸 Ａｌｇ＝アリルグリシン ＡｓＧｌｕ＝Ｎ−末端位にアシルスルホンアミドを示すグルタミン酸 ＡｓｐＳ＝サクシニル基が結合しているアスパラギン酸 ｂＡｌａ＝ベータアラニン Ｃｈａ＝ベータシクロヘキシルアラニン ＣｎＡｌａ＝シアノアラニン Ｃｐｃ＝１−アミノ−１−シクロペンタン−カルボン酸 ＣｙｓＡｓ＝Ｃ−末端位にアシルスルホンアミドを示すシステイン Ｃｙｓ（Ｍｅ）＝Ｓ−メチルシステイン Ｃｙｓ（ｏｌ）＝システイノール ＣｙｓＮ＝システアミン Ｄｐｒ＝ｂ−ジアミノプロピオン酸 △Ａｌａ＝デヒドロアラニン Ｄｉｆ＝３，３−ジフェニルアラニン Ｄｎｓ＝ダンシル（５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル） ＦＣＩ＝４−クロロフェニルアラニン Ｆｎｏ＝４−ニトロフェニルアラニン Ｇｌａ＝ｇ−カルボキシグルタミン酸 ＧｌｕＳ＝サクシニル基が結合しているグルタミン酸 ＭｅｔＳ＝サクシニル基が結合しているメチオニン ＭｅＧｌｕ＝Ｎ−メチル−グルタミン酸 ＭｅＧｌｙ＝メチル−グリシン ＭｅＶａｌ＝メチル−バリン Ｎａｐ＝ナフチルアラニン Ｎｌｅ＝ノルロイシン Ｎｖａ＝ノルバリン Ｐｈｇ＝フェニルグリシン Ｔｈａ＝２−チエニルアラニン ＶＧｌｙ＝ビニルグリシン
【００３９】 表ＩＩに記載したペプチドの中で、既に述べたように、２つ（配列番号：１お
よび８）は、ウイルスポリタンパク質の４Ａ／４Ｂ部位（配列番号：１）および
５Ａ／５Ｂ部位（配列番号：８）上でそれぞれＮＳ３そのものの切断によって直
接生成される。この阻害は、部位４Ａ／４Ｂに対応する基質の、ＮＳ３酵素活性
によって媒介される蛋白質分解的な切断反応の時間依存性を調べることによって
証明することができる（表Ｉ参照）。図１は、その切断産物におけるこのペプチ
ドの酵素変換が経時的に減少することを示している。当技術分野で既知の方法を
用いて、このＮＳ３プロテアーゼ活性の減少は、蛋白質分解的な切断反応の際に
、酵素阻害剤複合体の解離定数として定義されるＫｉ定数６００ｎＭで酵素を阻
害する産物の形成と一致する。上記の表に示された値と比較すると、ウイルス起
源のペプチドに関連した阻害能と比較して、大部分の合成ペプチドの阻害能が顕
著に増加していることが明らかに証明される。
【００４０】 ウイルスペプチド配列（配列番号：１、配列番号：８）のＰ１〜Ｐ６位のアミ
ノ酸の置換を参考にして、結果を以降詳細に報告する。
【００４１】 Ｐ１残基 配列番号：１４のように、Ｐ１位のシステインをシステアミンに置換すると、
または配列番号：１７のようにアルコールに還元すると（いずれも配列番号：１
に由来するシリーズに属する）、必然的に阻害能の１００倍以上の減少を伴う。
配列番号：４１に示されるペプチドでは、システインのカルボキシル基をアシル
スルホンアミド基に置換した。
【００４２】 Ｐ５およびＰ６残基 配列番号：１に由来するシリーズ（ＩＣ50＝１．０μＭ）、および配列番号：
８（ＩＣ50＝５．３μＭ）に由来するシリーズをいずれも参考にすると、酸の存
在はＰ６と共にＰ５においても重要であるように思われる。実際に、配列番号：
１からＰ６位を欠失させると阻害活性は有意に減少し（配列番号：７、ＩＣ50＝
２１μＭ）、双方の残基を欠失させると、１００倍の減少を生じる（配列番号：
６、ＩＣ50＝１５０μＭ）。
【００４３】 この結果は、配列番号：３５（ＩＣ50＝０．０５５μＭ）および配列番号：５
３（ＩＣ50＝０．０６３μＭ）のようなより強力な類似体において同じ改変を行
った場合にも確認される。最初のＰ６位の欠失の場合、配列番号：４２（ＩＣ50 ＝１．４μＭ）および配列番号：４３（ＩＣ50＝３０μＭ）が得られ；第二の双
方の欠失の場合、配列番号：５０（ＩＣ50＝２．５μＭ）および１００μＭ濃度
で５０％阻害を生じる配列番号：５１が得られる。
【００４４】 しかし、配列番号：１のＰ６位のアスパラギン酸は、阻害能の有意な減少を認
めることなくコハク酸（アセチルアミン部分が失われている）、またはアシルス
ルホンアミドのような単純なカルボン酸に置換することが可能である（配列番号
：１８と比較すると、ＩＣ50＝１．３μＭ、配列番号：２０、ＩＣ50＝０．６μ
Ｍ）。これはまた、配列番号：８に由来するシリーズについても確認されており
、配列番号：２５（ＩＣ50＝２．８μＭ）は配列番号：９（ＩＣ50＝２．８μＭ
）と同程度に活性である。
【００４５】 最後に、配列番号：１のＰ５およびＰ６位の２つの酸は互換可能である（配列
番号：８、ＩＣ50＝５．３μＭを配列番号：１０、ＩＣ50＝２．１μＭと比較）
。
【００４６】 Ｐ２置換 Ｐ２置換の効果は、もとのウイルスペプチドに由来する両方のシリーズにおい
て調べた。配列番号：８に由来するシリーズに関して、Ｐ２のシステインを配列
番号：９（ＩＣ50＝２．８μＭ）のようにアミノ酪酸に置換すると許容されるが
、同じ位置をグリシンにするとペプチドは活性が１０倍弱くなる（配列番号：１
１、ＩＣ50＝２０μＭ）。
【００４７】 配列番号：１に由来するシリーズでは、より劇的な効果が認められ、Ｐ２位の
グルタミン酸を疎水性残基に置換すると阻害活性は維持されるか、または改善さ
れる（配列番号：２２、ＩＣ50＝１．１μＭ；配列番号：２４、ＩＣ50＝０．８
μＭ；配列番号：２３、ＩＣ50＝０．３μＭ）。
【００４８】 Ｐ４置換 配列番号：２３をＰ４位の最適化の開始点として用いた。これは、Ｐ４位のみ
に改変を示す、開始配列の一般構造を有する一連の類似体を合成することによっ
て実現した。
【００４９】 結果から、Ｐ４位は疎水性アミノ酸、つまり脂肪族側鎖および芳香族側鎖の双
方に関して強い選択性を有することが示され、最善の残基は３，３−ジフェニル
アラニン（配列番号：３５、ＩＣ50＝０．０５５μＭ）であり、これに続いてロ
イシン（配列番号：３２、ＩＣ50＝０．１１８μＭ）、イソロイシン（配列番号
：２９、ＩＣ50＝０．１２２μＭ）、およびフェニルグリシン（配列番号：３８
、ＩＣ50＝０．１２０μＭ）であった。
【００５０】 Ｐ３置換 Ｐ３位を最適化するために今度は配列番号：３２を開始点として用いた。Ｐ４
位の場合と同様に、配列番号：３２と同じ構造を示すが、Ｐ３位のみを改変した
一連の類似体を合成することによって、結果を系統的に得た。
【００５１】 配列番号：３２のＰ３位のグルタミン酸と同等の強さを生じたのは、２つの残
基、すなわちＰ３位でのバリンとイソロイシンに過ぎなかった。
【００５２】 Ｐ３位を最適化するために配列番号：３２を開始点として用いた。Ｐ３および
Ｐ４位の場合と同様に、配列番号：３２と同じ構造を示すが、Ｐ５位のみを改変
した一連の類似体を合成することによって、結果を系統的に得た。この位置にお
いて最も注目に値するＬ−アミノ酸は、Ｐ５＝アスパラギン酸（配列番号：５７
、ＩＣ50＝０．２９０μＭ）、Ｐ５＝ｐ−ニトロフェニルアラニン（配列番号：
５８、ＩＣ50＝０．２４０μＭ）、Ｐ５＝チロシン（配列番号：５９、ＩＣ50＝
０．１３５μＭ）、およびＰ５＝ｇ−カルボキシグルタミン酸（配列番号：６０
、ＩＣ50＝０．０５５μＭ）である。同様にＤキラリティのアミノ酸もこの位置
においてよく許容され、実際により強力な２つの化合物はこのキラリティを示す
：Ｐ５＝Ｄ−フェニルアラニン（配列番号：６１、ＩＣ50＝０．８２０μＭ）、
Ｐ５＝Ｄ−チロシン（配列番号：６２、ＩＣ50＝０．６８０μＭ）、Ｐ５＝Ｄ−
バリン（配列番号：６３、ＩＣ50＝０．４７０μＭ）、Ｐ５＝Ｄ−イソロイシン
（配列番号：６４、ＩＣ50＝０．３３０μＭ）、Ｐ５＝Ｄ−３，３−ジフェニル
アラニン（配列番号：６５、ＩＣ50＝０．２７６μＭ）、Ｐ５＝Ｄ−アスパラギ
ン酸（配列番号：６６、ＩＣ50＝０．１２２μＭ）、Ｐ５＝Ｄ−グルタミン酸（
配列番号：６７、ＩＣ50＝０．０４５μＭ）、およびＰ５＝Ｄ−ｇ−カルボキシ
グルタミン酸（配列番号：６８、ＩＣ50＝０．００１５μＭ）。
【００５３】 Ｐ１置換 配列番号：１に由来する阻害剤シリーズにおけるＰ１残基の影響も、基質につ
いて認められた傾向と同等である。ＩＣ50を減少させるために残基は：システイ
ン（配列番号：１、ＩＣ50＝１μＭ）、アミノ酪酸（配列番号：３、ＩＣ50＝５
．８μＭ）、１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（配列番号：４８、Ｉ
Ｃ50＝９μＭ）、アリルグリシン（配列番号：１２、ＩＣ50＝１２μＭ）、Ｓ−
メチル−システイン（配列番号：２７、ＩＣ50＝１７μＭ）、シアノアラニン（
配列番号：５２、ＩＣ50＝１９μＭ）、ビニルグリシン（配列番号：２１、ＩＣ 50 ＝３８μＭ）、セリン（配列番号：４、ＩＣ50＝４１μＭ）、グリシン（配列
番号：５、ＩＣ50＝６２μＭ）、β−アラニン（配列番号：４０、濃度２００μ
Ｍで２０％阻害）である。
【００５４】 Ｐ１システインのキラリティは、キラリティが反転すると活性が７０倍減少す
るため（配列番号：２６、ＩＣ50＝１９４μＭ）、配列番号：８ではＬでなけれ
ばならない。
【００５５】 同様に、Ｄ−システインをＬ−システインに交換すると、Ｐ２およびＰ４位が
改変された最も強力な類似体の阻害能にとって非常に有害となる（配列番号：３
５、ＩＣ50＝０．０５μＭと配列番号：３９、ＩＣ50＝３．４μＭとを比較）。
【００５６】 Ｌ−システインは配列番号：８ではＤ−システインに変更することができない
（配列番号：９、ＩＣ50＝２．８μＭおよび配列番号：２６、ＩＣ50＝１９４μ
Ｍ）。
【００５７】 配列番号：３２のより強力な類似体（ＩＣ50＝１１８ｎＭ）を基礎として用い
てさらに分析を行った。これらの分析から、システイン置換がいずれにせよ阻害
活性の１０倍減少を引き起こすことが確認された；最善の置換体はアミノ酪酸（
配列番号：５４、ＩＣ50＝１．６μＭ）と共にノルバリン（配列番号：５６、Ｉ
Ｃ50＝１．３μＭ）であり、次にバリン（配列番号：５５、ＩＣ50＝４．０μＭ
）であった。
【００５８】 配列番号：４９においてＰ１残基を欠失させると、活性は７００倍以上減少す
る。
【００５９】 配列番号：１と配列番号：８に由来するＮ−メチル化ペプチド模倣体 既に述べたように、もとのウイルスペプチドのＰ１およびＰ６位におけるアミ
ノ酸残基の置換の影響を調べたことのほかに、われわれは、配列番号：１および
配列番号：８の配列に常に由来する一連の類似体における、結合したペプチドの
Ｎ−メチル化の影響も系統的に調べた。
【００６０】 これまで、本発明について全般的な説明を行ってきた。以下の実施例を参考に
して、本発明の目的、特徴、長所および応用方法をより明確に理解することを目
的として、本発明の特定の態様に関してより詳しく説明する。単純にするために
、実施例においてアミノ酸残基は一文字コードで示す。
【００６１】 実施例１ 酵素の調製 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、バクテリオファージＴ７遺伝子１０プロモ
ーターの制御下で、ＨＣＶ ＢＫ株ＮＳ３タンパク質のセリンプロテアーゼドメ
イン（アミノ酸１〜１８０位）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドによって
形質転換した。プロテアーゼドメインをこれまでに記述されているように精製し
た（スタインキューラー（Steinkuhler, C.）ら、J. Biol. Chem. 1996）。酵素
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリルアミ
ドゲル上での電気泳動によって検出器として銀染色を用いて評価したところ、均
一であり、４．６×２５０ｍｍバイダックＣ４カラムを用いて実施した逆相ＨＰ
ＬＣから評価すると９５％以上純粋であった。酵素の調製物は、パーキン・エル
マーＡＰＩ １００機器を用いてＨＰＬＣによって精製した試料について行う質
量分析法によってチェックし、Ｎ−末端配列分析は、アプライド・バイオシステ
ムズモデル４７０Ａガス相シークエンサー上でエドマン分解を用いて実施した。
いずれの技法によっても、酵素分子の９０％以上において、Ｎ−末端メチオニン
およびアラニンが除去されており、２位のプロリンで始まる酵素が得られたこと
が示された。酵素原液をアミノ酸含有量の定量的分析によって定量して、液体窒
素中でショック凍結して、使用するまで−８０℃でアリコットにして保存した。
対照実験によって、この凍結技法が酵素の特異的活性に影響を及ぼさないことが
証明された。
【００６２】 ペプチド合成 ペプチド合成は、本質的にアサートン＆シェパード（Atherton and Sheppard、
1989）に記載のように、Ｆｍｏｃ化学（フルオレニルメチル−オキシカルボニル
）／ｔ−ブチル（ターシャルブチル）化学を用いて実施した。ペプチドをノバシ
ン（登録商標）ＴＧＡ（ノバビオケム）樹脂上で集合させ、ＴＦＡ ８８％、フ
ェノール５％、トリイソプロピルシラン２％、水５％（ソール＆バラニー（Sole
, N. A. and Barany, G.）、J. Org. Chem. 1992）による合成の終了時にポリマ
ーを切断して除去した。
【００６３】 粗ペプチドは、ヌクレオシルＣ１８、２５０×２１ｍｍ、１００Å、７μｍ上
で、水、０．１％ＴＦＡ、およびアセトニトリル０．１％ＴＦＡを溶出剤として
用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。分析的ＨＰＬＣは、ウルトラスフェアＣ
１８、２５０×４．６ｍｍ、８０Å、５μｍ（ベックマン）上で実施した。質量
分析、［1Ｈ］−ＮＭＲ、およびアミノ酸分析によって、精製したペプチドの特 徴付けを行った。
【００６４】 ＨＰＬＣプロテアーゼ活性アッセイ ＤＭＳＯまたは緩衝水性溶液中で調製して、使用するまで−８０℃で保存した
ペプチド原液の濃度を、共沸塩酸加水分解試料について実施する定量的アミノ酸
分析によって決定した。特に明記していなければ、切断アッセイは５０ｍＭトリ
スｐＨ７．５、２％ＣＨＡＰＳ、５０％グリセロール、１０ｍＭのＤＴＴ（緩衝
液Ａ）溶液５７μｌ中で実施し、これに基質ペプチドＡｃ−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨ
ＬＰＹＫ（Ａｃ）−ＮＨ2３μｌを加えた。プロテアーゼ共因子として、溶解度 を高めるためにＮ−末端にリジン３個のタグを有する、ＮＳ４Ａタンパク質につ
いては、中央の疎水性コア（残基２１〜３４位）に及ぶペプチド、Ｐｅｐ４ＡＫ
（ＫＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＲ−ＮＨ2）を用いた（ビアンキ（Bianchi
, E.）ら、Biochemistry 1997）。ＰｅＰ４ＡＫは、基質を加える前に１０〜５ ０ｎＭプロテアーゼと共に１０分間プレインキュベートした。インキュベーショ
ン時間は基質変換が７％未満となるように選択した。１％ＴＦＡ ４０μｌを加
えて反応を停止させ、基質切断の程度を、自動採取装置を備えたメルク・ヒタチ
クロマトグラフを用いてＨＰＬＣによって決定した。試料の８０μｌをリクロス
ファーＣ−１８逆相カートリッジカラム（４×７５ｍｍ、５μｍ、メルク）に注
入して、流速２．５ｍｌ／分を用いて５％／分で１０〜４０％アセトニトリル勾
配を用いて断片を分離した。ピークの検出は、２２０ｎｍでの吸光度とチロシン
残基の蛍光の双方をモニターすることによって得た（λｅｘ＝２６０ｎｍ、λｅ
ｍ＝３０５ｎｍ）。切断産物は適当な標準物質に関してクロマトグラムを積分す
ることによって定量した。切断初速度は７％未満の基質変換速度を特徴とする試
料について決定した。速度論パラメータは、ミカエリス・メンテン速度論を仮定
して、カレイドグラフ（登録商標）ソフトウェアの助けを借りて基質濃度の関数
として初速度から計算した。
【００６５】 マイクロプレートプロテアーゼ活性アッセイ ＨＣＶ−プロテアーゼ（Ｊ株）は、使用するまで−８０℃で２５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、燐酸緩衝液、ｐＨ６．５、５０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ中で
保存した；ＰｅＰ４ＡＫはＤＭＳＯ中で−８０℃で保存した；トリチウム化基質
Ａｃ−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ（3Ｈ−Ａｃ）−ＮＨ2および対応するコール
ドの基質Ａｃ−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ（Ａｃ）−ＮＨ2は、ＤＭＳＯ／Ｄ ＴＴ中で−８０℃で保存した。
【００６６】 アッセイはコスター社のポリプロピレン９６ウェルプレートにおいて行った。
反応混合物の組成は以下の通りであった（１００μｌ）： グリセロール １５％ ＤＴＴ ３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５ ５０ｍＭ トライトンＸ−１００ ０．０５％ プロテアーゼ １０ｎＭ ホット＋コールド基質 ５μＭ（３００．０００ｃｐｍ） ＰｅＰ４ＡＫ １５μＭ
【００６７】 反応混合液はＤＭＳＯによって希釈した（最終濃度１０％ＤＭＳＯ）。
【００６８】 ＰｅＰＡＫは、基質混合液を加える前に５分間プロテアーゼと共にプレインキ
ュベートした。これらの条件において、基質のＫｍは７±２μＭであった。プレ
ートを室温で３０分間振とうさせて、非プロセス基質を捕獲するためにイオン交
換樹脂（２０％フラクトゲルＴＳＫ−ＤＥＡＥ（登録商標）６５０Ｓ １００μ
ｌ、メルク社）を加えて、プレートをさらに１０分間振とうさせた。樹脂を重力
によって沈降させた後、反応混合液３０μｌを９６ウェルプレート（ピコプレー
ト、パッカード社）に移して、２５０μｌのシンチレーションカクテルマイクロ
シント４０と混合して、シンチレーションパッカードトップカウントβ−カウン
ター中で放射活性を測定した。
【００６９】 実施例２ 産物阻害剤に基づく競合アッセイ ＮＳ３プロテアーゼ基質の切断に由来するペプチドが酵素の活性部位に結合す
る特性は、特異的に標識された阻害剤ペプチドが同じ部位に結合するもう一つの
分子に置換される、競合的アッセイの開発に利用される。この技術はＮＳ３競合
的阻害剤の同定に利用される。阻害剤ペプチドの標識は当技術分野で既知の技術
を用いて化学、放射活性、蛍光、発光、または発色官能基を導入することによっ
て得ることができる。例えば、チロシン残基を含むペプチドに125Ｉ原子を導入 する技術は既知である。同様に、3Ｈ、14Ｃ、または35Ｓのような放射性同位元 素で標識したアミノ酸残基を用いて、ＮＳ３プロテアーゼの活性部位に結合する
ペプチドを合成することも可能である。当技術分野において、放射性同位元素を
含む試薬を用いてペプチドに放射活性標識を導入するために応用することができ
る化学修飾技法も、既知である。例えば、3Ｈを含む無水酢酸と当該基との反応 によって、１級アミン基を含むペプチド配列を3Ｈで標識することが可能である 。
【００７０】 放射性同位元素を含むＮＳ３活性部位に結合するペプチドは、当技術分野で既
知の技法を用いて同じ部位に結合するその他の化合物を探索するために応用する
ことができる。例えば、上記技術を用いて標識したＮＳ３プロテアーゼ活性部位
に結合する配列を有するペプチドは、ＮＳ３プロテアーゼまたはＮＳ３プロテア
ーゼとその共因子であるＮＳ４Ａ、またはこの共因子の配列に由来するペプチド
を含む緩衝溶液に加えることができる。ペプチドに結合したプロテアーゼは濾過
技法、クロマトグラフィー樹脂結合、または生理食塩液もしくは有機試薬を用い
た沈殿によって単離することができる。標識したペプチドの量はシンチレーショ
ンのような放射活性崩壊過程の検出技術を用いて容易に決定することができる。
このプロセスにおいて、該技術を用いてプロテアーゼを単離する前にＮＳ３活性
部位に結合することができる基質を加えると、標識したペプチドの置換が必然的
に起こり、従って、放射活性崩壊産物の放出の減少が起こる。
【００７１】 ＮＳ３プロテアーゼ活性部位に結合する配列を有するペプチドに蛍光特性を有
する化学官能基を導入することも可能である。幾つかの化学官能基の分光学的特
性は、分光的特性が決定されている物理化学条件に応じて変化することは当技術
分野で既知である。これらの条件は、ｐＨ、イオン強度、誘電率、および分光測
光を実施する特異的溶媒を含む。特に、幾つかの分子は一度タンパク質に結合す
ると、分光学的に検出可能な変化を生じることが知られている。これらの分子の
いくつかは、「蛍光プローブと研究化学物質ハンドブック（Handbook of Fluore
scent Probes and Research Chemicals）」に記載されており、市販されている 。その他の分子は、既知の分光学的特性を有する分子の化学修飾によって得るこ
とができ、それらをＮＳ３プロテアーゼ活性部位にペプチドが結合する状況にす
ることができる。この目的のために用いることができる化学官能基の例は：フル
オレセイン、マンシル、クマリン、ローダミン、およびダンシルである。特にダ
ンシルは共鳴エネルギーを転移させるトリプトファン残基と相互作用することが
できることが証明された。このプロセスにおいて、トリプトファンは２８０〜２
９５ｎｍの間の波長で励起され、その励起エネルギーをダンシル分子に転移し、
今度はダンシル分子が５１０〜５４０ｎｍの間の波長でエネルギーを放出する。
共鳴エネルギーの転移現象は距離の６乗で崩壊し、１０〜１００Åの間の距離で
機能的であることから、２つの分子間の結合を決定するために極めて感度がよい
。
【００７２】 配列番号：６９の分子は、配列番号：２３のＮＳ３プロテアーゼ切断産物の配
列の最適化によって誘導されたヘキサペプチドであって、メチオニン残基が２，
３−ジアミノプロピオン酸残基に置換されていて、Ｐ３位のアミノ酸基がダンシ
ル基によって誘導体化されている。
【００７３】 配列番号：６９の分子はＫｉ＝２００ｎＭでＮＳ３プロテアーゼ活性部位に結
合することが証明されている。プロテアーゼとの結合は蛍光分光計によって測定
することができる。特に、分子に存在するダンシル基の官能基は、波長３３５ｎ
ｍの光を用いて直接的に、またはＮＳ３プロテアーゼに存在する２つのトリプト
ファンの存在を利用してＮＳ３トリプトファンと酵素に結合した配列番号：６９
の分子との間の共鳴エネルギー転移という上記現象を間接的に用いることによっ
て、励起させることが可能である。いずれの場合も、遊離分子と結合分子の分光
的特性が異なるために、結合は直接観察可能である。しかし、共鳴エネルギー転
移現象を利用するほうがより感度がよいために好ましい。
【００７４】 配列番号：６９の分子はＮＳ３プロテアーゼ活性部位に対する他の分子の結合
を決定するために利用することができ、したがって、それを酵素との相互作用か
ら置換させることができる。典型的な実験を図２に示す。Ｐｅｐ４ＡＫと複合体
を形成したＮＳ３プロテアーゼ２００ｎＭを含む緩衝溶液に、配列番号：６９の
２００ｎＭを加えた。２つの分子の結合は、ＮＳ３トリプトファンを波長２８０
ｎｍで励起して、５２０ｎｍ周辺の放出スペクトルを記録することによって測定
した。ＮＳ３プロテアーゼ競合的阻害剤である配列番号：１を加えると、ＮＳ３
活性部位からの配列番号：６９の置換が起こり、蛍光エネルギー転移現象がそれ
と共に減少する。この実験から配列番号：１のＩＣ50値を１μＭと決定すること
ができ、これはＮＳ３プロテアーゼ活性に及ぼすこの分子の作用を調べた場合と
同じ値である。
【００７５】
【００７６】 本願明細書で用いられる略語および記号 ＣＨＡＰＳ＝３〔（３−コラミドプロピル）−ジメチル−アンモニウム〕−１
−プロパン−スルホネート； ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー； ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸； ＯＲＦ＝オープンリーディングフレーム ＮＭＲ＝核磁気共鳴 ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド ＤＴＴ＝ジチオスレイトール
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＮＳ３プロテアーゼによって触媒されるＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ基質切断の反応速
度論を示す。
【図２】 配列番号：６９のペプチドに由来する蛍光マーカーの置換による配列番号：１
のペプチドのＩＣ50の決定を示す。図２Ａでは、配列番号：６９のＮＳ３プロテ
アーゼ−ペプチド複合体の蛍光スペクトル強度の減少を、配列番号：１のペプチ
ドの増加濃度に対してプロットする。図２Ｂでは、ＩＣ50を評価するために、５
２０ｎｍでの蛍光スペクトル強度の変化を配列番号：１のペプチド濃度に対して
プロットする。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１０月２５日（１９９９．１０．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/18 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＣＡ，ＣＮ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＵＳ (72)発明者 デ フランセスコ、ラファエル イタリア国 マリノ、ビア アッピア ヌ オバ、133 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ36 QR48 QR66 QX02 QX07 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA16 BA17 BA41 CA01 DC32 NA14 ZA752 ZB332 ZC542 4H045 AA10 BA14 CA01 DA56 EA29 EA53 FA41 FA74 GA25

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｐ６がＮ−末端位置であり、Ｐ１がＣ−末端位置であって、
    Ｐ１位のアミノ酸が少なくとも遊離の酸機能を有し、しかもそれらがＮＳ３タン
    パク質に関連したＨＣＶウイルスのプロテアーゼ活性を阻害することができるこ
    とを特徴とする、Ｐ６からＰ１位に配列するアミノ酸残基６個を含むペプチド。
  2. 【請求項２】 Ｐ１位のアミノ酸がシステイン、その類似体または誘導体で
    ある、請求項１記載のペプチド。
  3. 【請求項３】 Ｐ１位のアミノ酸が、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ホ
    モシステイン、Ｓ−メチルシステイン、アラニン、Ｓ−エチルシステイン、トレ
    オニン、メチオニン、セリンおよびペニシラミンからなる群より選択される、請
    求項２記載のペプチド。
  4. 【請求項４】 Ｐ６位に酸機能を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記
    載のペプチド。
  5. 【請求項５】 Ｐ６位の酸機能がアスパラギン酸、コハク酸およびアシルス
    ルホンアミドからなる群より選択される、請求項４記載のペプチド。
  6. 【請求項６】 Ｐ５位に酸機能を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記
    載のペプチド。
  7. 【請求項７】 Ｐ５位の酸機能がアスパラギン酸、コハク酸およびアシルス
    ルホンアミドからなる群より選択される、請求項６記載のペプチド。
  8. 【請求項８】 Ｐ４位に疎水性アミノ酸を有する、請求項１〜７のいずれか
    一項に記載のペプチド。
  9. 【請求項９】 Ｐ４位のアミノ酸が、３，３−ジフェニルアラニン、ロイシ
    ン、イソロイシン、およびフェニルグリシンからなる群より選択される、請求項
    ８記載のペプチド。
  10. 【請求項１０】 Ｐ３位に、グルタミン酸、バリンおよびイソロイシンから
    なる群より選択されるアミノ酸を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    ペプチド。
  11. 【請求項１１】 Ｐ５位に、アスパラギン酸、ｐ−ニトロフェニルアラニン
    、チロシン、ｇ−カルボキシグルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−チロシ
    ン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−３，３−ジフェニルアラニン、Ｄ−ア
    スパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、およびＤ−ｇ−カルボキシグルタミン酸から
    なる群より選択されるアミノ酸を有する、請求項１０記載のペプチド。
  12. 【請求項１２】 Ｐ１位にアミノ酪酸、ノルバリン、およびバリンからなる
    群より選択されるアミノ酸を有する、請求項１０または１１記載のペプチド。
  13. 【請求項１３】 ペプチドが２μＭ（ＩＣ50）より低い、またはこれに等し
    い濃度でＮＳ３酵素活性を５０％阻害することができる、請求項１〜１２のいず
    れか一項に記載のペプチド。
  14. 【請求項１４】 Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２およびＰ１位にそれぞれ、ＨＣＶウイル
    スの１つの接合部位のＰ４、Ｐ３、Ｐ２およびＰ１位に本来存在するアミノ酸を
    有し、接合部位がＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ
    、およびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂからなる群より選択される、請求項１〜１３のいず
    れか一項に記載のペプチド。
  15. 【請求項１５】 ペプチドがＨＣＶウイルスのポリタンパク質の接合部位を
    少なくとも１つ含むポリペプチドの蛋白質分解反応によって得ることができ、接
    合部位がＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ、および
    ＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合部位からなる群より選択される、請求項１４記載のペプ
    チド。
  16. 【請求項１６】 接合部位がデカペプチドからなり、該接合部位のＰ４、Ｐ
    ３、Ｐ２およびＰ１位に本来存在するアミノ酸を含む、請求項１５記載のペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 ＨＣＶウイルスが１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、
    ２ｄ、２ｅ、２ｆ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、
    ４ｄ、５ａ、５ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、
    ９ｃ、１０ａおよび１１ａ遺伝子型のＨＣＶウイルスからなる群より選択される
    、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のペプチド。
  18. 【請求項１８】 ＨＣＶウイルスがＨ−ＦＤＡ、Ｈ−ＡＰ、ＨＣＶ−１、Ｈ
    ＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＣ−Ｊ８、ＨＣＶ−ＪＴ
    およびＨＣＶ−ＪＴ′株のＨＣＶウイルスからなる群より選択される、請求項１
    ７記載のペプチド。
  19. 【請求項１９】 添付の配列表に配列番号：１〜配列番号：６９として報告
    された配列を含む群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
  20. 【請求項２０】 ＨＣＶウイルスのＮＳ３プロテアーゼの酵素活性の結合ま
    たは阻害アッセイを導出するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のペ
    プチドの使用。
  21. 【請求項２１】 非Ａ非Ｂ肝炎の治療用薬剤を調製するための、請求項１〜
    １９のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの
    ペプチドおよび薬学的に有効な担体、溶媒、または補助物質を含むことを特徴と
    する、非Ａ非Ｂ肝炎を治療するための薬学的組成物。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの
    ペプチドを含むことを特徴とする、ＮＳ３タンパク質に関連したＨＣＶウイルス
    のプロテアーゼ活性を阻害する組成物。
  24. 【請求項２４】 ＨＣＶウイルスのポリタンパク質のＮＳ３／ＮＳ４Ａ、Ｎ
    Ｓ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａおよび／またはＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合
    部位の配列の中から少なくとも１つを含むポリペプチドのタンパク質分解を行う
    工程を特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペ
    プチドの製造方法。
  25. 【請求項２５】 蛋白質分解反応がＨＣＶウイルスのＮＳ３プロテアーゼに
    よって行われる、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ＨＣＶウイルスが１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、
    ２ｄ、２ｅ、２ｆ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、
    ４ｄ、５ａ、５ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、
    ９ｃ、１０ａおよび１１ａ遺伝子型のＨＣＶウイルスからなる群より選択される
    、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ＨＣＶウイルスがＨ−ＦＤＡ、Ｈ−ＡＰ、ＨＣＶ−１、Ｈ
    ＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＣ−Ｊ８、ＨＣＶ−ＪＴ
    およびＨＣＶ−ＪＴ’株のＨＣＶウイルスからなる群より選択される、請求項２
    ６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 接合部位がデカペプチドを含み、該接合部位のＰ４、Ｐ３
    、Ｐ２およびＰ１位に本来存在するアミノ酸を含む、請求項２４〜２７のいずれ
    か一項に記載の方法。
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