ITRM960632A1

ITRM960632A1 - Polipeptidi solubili con l'attivita' di serino-proteasi di ns3 del vi= rus dell'epatite c, e procedimento per la loro preparazione e il loro

Info

Publication number: ITRM960632A1
Authority: IT
Inventors: Francesco Raffaele De; Anna Tramontano; Christian Steinkuhler; Andrea Urbani; Licia Tomei; Stefano Colloca; Maria Chiara Nardi; Rosa Letizia Vitale
Original assignee: Angeletti P Ist Richerche Bio
Priority date: 1996-09-17
Filing date: 1996-09-17
Publication date: 1998-03-17
Also published as: CA2264487A1; AU4397097A; IT1285158B1; WO1998012308A1; EP0950094A1; JP2001500735A

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "POLIPEPTIDI SOLUBILI CON L'ATTIVITÀ' DI SERINO-PROTEASI DI NS3 DEL VIRUS DELL'EPATITE C, E PROCEDIMENTO PER LA LORO PREPARAZIONE E IL LORO ISOLAMENTO"

DESCRIZIONE

Il virus dell'epatite C (HCV) e' il principale agente eziologico dell'epatite non-A, non-B (NANB). Si stima che HCV causi almeno il 90% delle epatiti virali NANB post-trasfusionali ed il 50% delle epatiti NANB sporadiche. Nonostante i notevoli progressi nella selezione dei donatori di sangue e nella caratterizzazione immunologica del sangue per trasfusione, esiste ancora un' elevata incidenza di infezioni acute di HCV tra le persone che ricevono trasfusioni di sangue che risulta in un milione o piu1 di infezioni ogni anno in tutto il mondo. Circa il 50% degli individui infettati con HCV sviluppa cirrosi epatica in un periodo che può' variare tra 5 e 40 anni e recenti studi clinici hanno suggerito l'esistenza di una correlazione tra l' infezione cronica di HCV e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare . A tutt'oggi non e' disponibile ne' un vaccino contro il virus dell'epatite C, ne1 una terapia efficace per le epatiti croniche causate da esso .

HCV e' un virus con membrana che contiene un genoma a RNA positivo di circa 9,4 kb. Questo virus e' un membro della famiglia dei Flaviviridae , di cui fanno parte anche i pestivirus ed i flavivirus .

Il genoma a RNA di HCV e' stato recentemente sequenziato. Paragonando le sequenze del genoma di virus isolati in diversi punti del mondo, si e1 visto che queste possono essere estremamente eterogenee. La maggior parte del genoma di HCV e' occupata da uno schema di lettura aperto (ORF) variabile tra 9030 e 9099 nucleotidi. Questo ORF codifica per una singola poliproteina virale, la cui -lunghezza può' ovviamente variare fra 3010 e 3033 aminoacidi. Durante il ciclo di infezione virale, la poliproteina e' processata proteoliticamente nei prodotti proteici individuali necessari per la replicazione del virus.

I geni che codificano per le proteine strutturali di HCV sono localizzati all'estremità 5' dell' ORF, mentre la regione che codifica per le proteine nonstrutturali occupa il resto dell' ORF. Le proteine strutturali sono: C (core, 21 kDa), E1 (envelope, gp37) e E2 (NS1, gp61). C e' una proteina non glicosilata di 21 kDa che probabilmente costituisce il nucleocapside virale. La proteina E1 e' una glicoproteina di circa 37 kDa e si ritiene che sia una proteina strutturale dell ' involucro virale esterno. E2, un' altra glicoproteina di membrana di 61 kDa, costituisce probabilmente una seconda proteina strutturale dell' involucro esterno del virus .

La regione non-strutturale comincia con NS2 (p24), una proteina idrofobica di 24 kDa la cui funzione non e' nota. NS3, una proteina di 68 kDa che segue NS2 nella poliproteina, ha due domini funzionali: un dominio di serino-proteasi nei primi 180 amminoacidi ammino-terminali e un dominio di ATPasi RNA-dipendente nella porzione carbossi-terminale . La regione genica corrispondente a NS4 codifica per NS4A (p6), una proteina di membrana di 54 amminoacidi, e per NS4B (p26). Il gene corrispondente a NS5 codifica per due proteine, NS5A (p56) e NS5B (p65), di 56 e 65 kDa rispettivamente. Di recente e' stato dimostrato che la regione NS5B possiede un'attività' di RNA-polimerasi RNA dipendente (1).

Diversi studi di biologia molecolare hanno indicato che la peptidasi del segnale, una proteasi associata al reticolo endoplasmatico della cellula ospite, e' responsabile del processamento proteolitico della regione non strutturale, ovvero ai siti C/El, E1/E2 e E2/NS2 (2). Una prima attività' proteasica di HCV e1 responsabile del taglio tra NS2 e NS3 , questa attività' e1 contenuta in una regione che comprende sia parte di NS2 che la parte di NS3 che contiene il dominio di serino-proteasi, ma non utilizza lo stesso meccanismo catalitico di quest'ultima (3). La serinoproteasi contenuta nei 180 ammino acidi all' ammino terminale di NS3 e' invece responsabile del taglio alle giunzioni tra NS3 e NS4A, tra NS4A e NS4B, tra NS4B e NS5A e tra NS5A e NS5B (4-8). In particolare si e' trovato che il taglio effettuato da questa serino-proteasi lascia un residuo di cisteina o di treonina sul lato ammino-terminale {posizione PI) ed un residuo di alanina o di serina sul lato carbossiterminale (posizione PI') del substrato (6,9). Di recente si e' visto che NS4A, _ mediante la sua porzione centrale idrofobica, si lega alla estremità' N-terminale di NS3, aumentando in questo modo l'attività' proteolitica di NS3 per tutti i siti di taglio sulla poliproteina (10-12).

L'inibizione della attività' proteasica comporterebbe dunque l'arresto del processamento proteolitico della porzione non strutturale della poliproteina di HCV e, di conseguenza, impedirebbe la replicazione del virus nelle cellule infette. Questa sequenza di eventi e' stata verificata per un flavivirus omologo al virus dell'epatite C, il quale infetta cellule in coltura. In questo caso si e' potuto dimostrare che manipolazioni genetiche, che comportano la generazione di una proteasi non piu' in grado di esercitare la sua attività' catalitica, aboliscono la capacita' del virus di replicarsi (13). Inoltre e1 stato dimostrato ampiamente, sia in vitro che in studi clinici, che composti in grado di interferire con l'attività' della proteasi di HIV sono in grado di inibire la replicazione di questo virus (14). Infine si hanno evidenze del fatto che la regione NS5 di HCV, che come abbiamo ricordato possiede un'attività' di RNA-polimerasi RNA dipendente, non esplica tale funzione se non in seguito al processamento ad opera della proteasi NS3.

Quindi una sostanza in grado di interferire con l'attività' proteolitica associata alla proteina NS3 potrebbe costituire un nuovo agente terapeutico. In questa ottica la conoscenza dettagliata della struttura tridimensionale della proteasi assume un'importanza rilevante consentendo sia una maggiore comprensione dei fenomeni biologici in cui essa e' coinvolta, sia l'analisi, lo studio e la progettazione di molecole inibitori capaci di interferire con l'attività' proteasica, aprendo cosi' la strada allo sviluppo di farmaci utili per la terapia della epatite C. Tuttavia la determinazione della struttura sia mediante tecniche NMR che mediante cristallografia a raggi X, richiede quantità' elevate di proteina solubile e a tutt'oggi non si e' riusciti a soddisfare tale richiesta. Infatti se il modo piu' semplice ed economico per ottenere grandi quantità' del polipeptide desiderato e' l'espressione del gene corrispondente in batteri e nonostante esista una grande disponibilità' di numerosi promotori eucariotici e di tecniche per massimizare l' espressione di geni eterologhi in E.coli, tuttavia una efficiente produzione del polipeptide di interesse se anche e' necessaria può' non essere sufficiente. Molte proteine ricombinanti non assumono il ripiegamento corretto della catena polipeptidica quando vengono espresse in E.coli. Il risultato e' la sintesi di polipeptidi che o venogono degradati nella cellula ospite, o vengono accumulati in forma insolubile nei cosiddetti corpi di inclusione (15). Inoltre nei casi di proteine molto idrofobiche, di proteine di origine virale o di proteine tossiche per la cellula batterica (come accade per alcune proteasi di origine virale) si incontrano difficolta' insormontabili nella loro produzione, in una forma nativa e solubile.

Nel caso della serino-proteasi NS3 del virus dell'epatite C, per le condizioni in cui avviene normalmente la produzione della proteina, finora non si e' riusciti a ottenere, in E. coli una proteasi in forma nativa, solubile e in quantità1 tali da rendere possibili studi di carattere strutturale per i quali si ha necessita1 di soluzioni ad una concentrazione millimolare di proteina.

Si e' ora inaspettatamente trovato che queste importanti limitazioni possono essere superate adottando la metodologia descritta nella seguente invenzione. Essa e' basata, come risulterà' evidente dal seguito, sulla scoperta inaspettata che il dominio di serino-proteasi di NS3 lega, nella sua conformazione nativa, uno ione Zn2+.

“Poiché1, come abbiamo già ricordato, la struttura della proteasi NS3 di HCV non e' ancora nota, si e1 proceduto alla costruzione di un modello strutturale della proteina allo scopo di usarlo come guida per il lavoro sperimentale. Tuttavia la similarità' della proteasi NS3 con le altre serino-proteasi di struttura nota e1 estremamente bassa (meno del 15%), il che non permette un buon allineamento tra sequenze e di conseguenza neanche la costruzione di un modello tridimensionale solo sulla base dell'omologia. Per questo motivo sono state utilizzate le strutture disponibili di serino-proteasi, per costruire un allineamento multiplo delle regioni strutturalmente conservate e per dedurre da questo modo un profilo a cui allineare successivamente la sequenza della proteasi NS3 . In questo modo e' stato possibile costruire un modello tridimensionale approssimativo della proteasi NS3 di HCV (9,16).

Di recente sono stati scoperti tre nuovi virus responsabili di epatiti umane (17). Questi nuovi virus, denominati GBV-A, GBV-B e GBV-C mostrano una organizzazione della poliproteina comune a quella di HCV (18,19). Dall'allineamento della regione corrispondente ad NS3 di questi nuovi tre virus con quella di diversi sierotipi di HCV, sono stati individuati alcuni amminoacidi conservati. Questi residui comprendono: gli amminoacidi del sito attivo, alcune glicine e proline (probabilmente coinvolte nella stabilizzazione della struttura della proteina) e tre cisteine e un'istidina (figura 1). Nel modello da noi proposto per la proteasi NS3 questi ultimi quattro residui si trovano in una regione della molecola opposta a quella del sito attivo, sono spazialmente vicini e la loro posizione relativa e' tale da formare un sito di legame per uno ione metallico divalente, come ad esempio la ione Zn2 (figura 2).

Questa osservazione e' stata successivamente confermata sperimentalmente, infatti come verrà1 illustrato meglio negli esempi, la proteasi NS3 di HCV ha effettivamenete un contenuto in metallo pari ad una mole di zinco per mole di proteina e come accade per altre proteine, lo zinco e1 necessario perchè l'enzima assuma la sua struttura nativa e sia cataliticamente attivo (20,21).

Il fatto che la proteasi NS3 abbia un sito di legame per uno ione metallico e che tale sito di legame sia cosi1 ben conservato, anche tra virus non vicini filogeneticamente, apre le porte per lo studio di agenti terapeutici antivirali che hanno come sito bersaglio proprio questa regione della proteina. Infatti, nel caso di un'altra proteina virale che lega ioni Zn2+, cioè' il nucleocapside del virus HIV, e' stato possibile identificare composti che interferiscono selettivamente con il legame tra la proteina e gli ioni Zn2+ (22,23) e si e' anche visto che questi composti interferiscono con l’infezione virale di cellule cresciute in coltura.

Uno scopo della presente invenzione e1 pertanto quello di fornire una metodologia per l' espressione con alte rese, in forma nativa, cioè1 come proteina contenente uno ione metallico bivalente, ed altamente solubile della protessi NS3 di HCV utilizzando sistemi di espressioni eterologhi come ad esempio cellule di E. coli trasformate con opportuni costrutti genetici e coltivate in un mezzo arricchito con sali contenenti ioni metallici divalenti.

Un altro scopo dell' invenzione e' di fornire una metodologia generale che consenta la preparazione e l'isolamento in forma nativa, pura e altamente solubile di grandi quantità' di polipeptidi contenenti Zn2+, Co2+ o Cd2+, con l'attività1 proteasica NS3 di HCV.

Inoltre un altro scopo dell'invenzione e' quello di fornire una metodologia che permetta la preparazione e l'isolamento in forma nativa, pura e altamente solubile di grandi quantità' di polipeptidi con l'attività' proteasica NS3 di HCV ed allo stesso tempo marcati con isotopi pesanti stabili come 13C o 15N, come richiesto per gli esperimenti di determinazione della struttura tridimensionale della proteina mediante NMR.

Infine nella presente invenzione vengono forniti nuovi costrutti genetici per l'espressione, in cellule di E. coli, di polipeptidi modificati con l'attività' proteasica NS3 di HCV, che abbiano alte rese della forma nativa e solubile della protessi NS3 di HCV.

Questi ed altri scopi vengono raggiunti con una o piu' delle forme di realizzazione dell' invenzione che sono descritte di seguito.

In una forma di realizzazione dell’ invenzione viene fornito una procedura per ottenere la produzione del dominio di serino-proteasi di NS3 nella sua forma nativa, cioè’ contenente uno ione metallico bivalente, necessario per l'integrità strutturale della proteina. L'innovazione della procedura consiste nell' aggiunta al terreno di coltura in cui vengono cresciute le cellule batteriche trasformate, di composti contenenti metalli quali Zn , Co, Cd, Mn, Cu, Ni, Ag, Fe, Cr, Hg, Au, Pt, V. Questi composti forniscono al terreno gli ioni necessari alla proteina per assumere la sua struttura nativa. In questo modo la proteina si trova in forma nativa solubile nel citoplasma delle cellule batteriche invece di rimanere sequestrata nei corpi inclusi, dai quali può1 essere ottenuta solo applicando faticose procedure di risolubilizzazione.

In un' altra forma di realizzazione dell' invenzione, viene fornito un procedimento che consente di sostituire nella proteasi, lo zinco, spettroscopicamente silente, con altri atomi (per esempio Co2+ o Cd2+) spettroscopicamente attivi, in modo da consenteire lo studio di eventuali inibitori capaci di coordinare il metallo contenuto nella proteina e quindi di perturbare il legame della proteina per il metallo.

In un' altra forma di realizzazione dell' invenzione, l'aggiunta di ioni metallici bivalenti ad un terreno minimo di coltura contenente come uniche fonti di carbonio e di azoto, glucosio e sali di ammonio arricchiti con 13C o 15N rispettivamente, consente di ottenere grandi quantità' di proteina solubile e marcata con isotopi pesanti stabili come 13C o 15N. Questo tipo di arricchimento isotopico e1 richiesto per la determinazione della struttura tramite tecniche di NMR.

In una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione vengono fornite sequenze di polipeptidi che contengono il dominio di serino proteasi di NS3 del virus dell'epatite C opportunamente modificato. Tali polipeptidi sono caratterizzati dal fatto di possedere alla loro estremità' C-terminale una sequenza di amminoacidi molto idrofilici, come per esempio una serie di lisine, che non sono presenti nella sequenza originale. Adottando questa ulteriore nuova metodologia si ottiene un sostanziale miglioramento in termini di solubilità ed integrità della proteina prodotta. Queste molecole di proteasi opportunamente modificate sono anch'esse da considerarsi oggetto della presente invenzione.

Oggetto della presente invenzione sono quindi:

a) Polipeptidi isolati e purificati che contengono la sequenza del dominio di serino-proteasi di NS3 di HCV, caratterizzati dal fatto di possedere alla loro estremità1 C-terminale una coda di almeno tre lisine. b) Un procedimento -per la preparazione di polipeptidi che contengano il dominio di serinoproteasi di NS3 di HCV in forma solubile, utili per esperimenti di enzimologia, determinazione della struttura tridimensionale dell' enzima sia mediante tecniche di NMR che di cristallografia a raggi X-comprendente le seguenti operazioni:

- trasformazione di una cellula ospite procariotica con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per un polipeptide con l'attività' proteolitica della proteasi NS3 di HCV;

-crescita della cellula ospite procariote su un particolare terreno di coltura contenente Zn2+ od alternativamente sali di metalli di transizione come Co, Cd, Mn Cu Ni, Ag, Fe, Cr, Hg, Au, Pt, V;

- espressione della sequenz'a di DNA desiderata per produrre il polipeptide prescelto;

- purificazione del polipeptide senza dover ricorrere a protocolli di risolubilizzazione e di rinaturazione della proteina partendo da corpi inclusi.

c) Un procedimento per la rinaturazione in vitro di tali polipeptidi, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti operazioni:

- trasformazione di una cellula ospite procariotica con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per un_polipeptide con l'attività' proteolitica della proteasi NS3 di HCV.

- espressione della sequenza di DNA desiderata per produrre il polipeptide prescelto.

purificazione del polipeptide denaturato e rinaturazione della proteina sfruttando tamponi che contengano Zn2+ od alternativamente sali di metalli di transizione quali Co, Cd, Mn, Cu, Ni, Ag, Fe, Cr, Hg, Au, Pt, V.

d) Vettori di espressione per produrre i polipeptidi rappresentati dalle sequenze da SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO :4 con l'attività' proteolitica di NS3 di HCV comprendenti: un polinucleotide che codifica per uno di detti polipeptidi; sequenze di regolazione, di trascrizione e di traduzione, funzionali in detta cellula ospite, legati operativamente a detto polinucleotide; ed, eventualmente, un marcatore selezionabile .

e) -Una cellula procariotica trasformata con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per polipeptidi con l'attività' proteolitica della proteasi NS3 di HCV in modo da permettere a detta cellula ospite di esprimere lo specifico polipeptide codificato nella sequenza prescelta .

Figura 1 mostra l'allineamento tra la sequenza delle serino proteasi NS3 di HCV e dei virus GBV-A, GBV-B e GBV-C/HGV {Hcv, Hga, Hgb, Hgc) , con la cisteino proteasi 2A di poliovirus (Poi). Amminoacidi che sono conservati nelle protessi di HCV e nei virus GBV-A, GBV-B e GBV-C/HGV sono ombreggiati. I residui catalitici sono sottolineati ed i residui che legano lo zinco sono indicati dal simbolo

Figura 2 mostra un modello schematico del dominio di serino protessi di NS3. In particolare e1 mostrata la posizione nella strutttura degli amminoacidi coinvolti nel legame con lo zinco (grigio scuro) e della triade catalitica (grigio chiaro).

Figura 3 mostra l'effetto dello ione zinco sull'attività' della serino protessi NS3 di HCV.

Figura 4 mostra gli effetti dello ione zinco sulla produzione della proteasi NS3 di HCV come proteina solubile in E. coli in terreno minimo. La colonna 2 si riferisce al risultato dell'esperimento condotto sulle cellule senza indurre la produzione di proteasi (-IPTG). Le colonne 3,4 e 5 indicano che in assenza di ZnCl2 e in seguito a induzione della produzione di proteasi (+IPTG) la proteina rimane sequestrata nella porzione insolubile (indicata con la sigla PT) . Al contrario in presenza di ZnCl2 la proteasi si ritrova completamente nella porzione solubile (indicata con la sigla SN).

Figura 5 mostra gli spettri elettronici della proteasi NS3 di HCV. In figura 5a viene mostrato lo spettro nel visibile e nel vicino UV della Co2 -proteasi. In figura 5b sono riportati gli spettri di assorbimento UV della Zn2+-proteasi e della Cd2 -proteasi .

DEPOSITI

Ceppi di E. coli DHl/p -trasformati con i plasmidi pT7-7{Pro BK-as K4) pT7-7 (Pro)-asK4), pT7-7 (Pro H-asK4) e pT7-7 (Pro J8-asK4) che codificano per le sequenze amminoacidiche SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO :3 e SEQ ID NO :4, rispettivamente -sono stati depositati l'8 agosto 1996 presso The National Collections of Industriai and Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Aberdeen, Scozia, U.K., con i numeri di accesso NCIMB 40821, NCIMB 40822, NCIMB 40823 e NCIMB 40824 rispettivamente.

Si e’ data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei sequenti esempi verrà ora fornita una descrizione particolareggiata di specifiche forme di realizzazione dell' invenzione' finalizzate a far meglio comprendere i suoi scopi, le sue caratteristiche, i suoi vantaggi, le sue modalità' di applicazione .

ESEMPIO 1

ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI POLIPEPTIDI CON

L'ATTIVITÀ' PROTEAS ICA DI NS3 DI HCV IN FORMA NATIVA SOLUBILE

I plasmidi pT7-7(Pro BK-asK4) , pT7-7(Pro H-asK4) , pT7-7 (Pro J-asK4) e pT7-7{Pro J8-asK4) sono stati costruiti per permettere l'espressione in E.coli di polipeptidi caratterizzati dall'avere una sequenza scelta tra quelle del gruppo da SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO :4 . I polipeptidi contengono il dominio di proteasi di NS3 di diversi isolati di HCV (BK, H, J e J8, rispettivamente) con l'aggiunta di una "coda" di quattro lisine all'estremità' C-terminale.

pT7-7 (Pro BK-asK4) contiene la sequenza di HCV-BK (Numero di accesso della banca dati EMBL : M58335) compresa tra i nucleotidi 3411 e 3950, clonata nel vettore pT7-7.

pT7-7 (Pro H-asK4) contiene la sequenza di HCV-H (Numero di accesso della banca dati EMBL M67463) compresa tra i nucleotidi 3420 e 3959, clonata nel vettore pT7-7.

pT7-7 (Pro J-asK4) contiene la sequenza di HCV-J (Numero di accesso della banca dati EMBL: D90208) compresa tra i nucleotidi 3408 e 3947, clonata nel vettore pT7-7.

pT7-7 (Pro J8-asK4) contiene la sequenza di HCV-J8 (Numero di accesso della banca dati EMBL: D10988/D01221) compresa tra i nucleotidi 3432 e 3971, clonata nel vettore pT7-7.

Il vettore di espressione pT7-7 e1 un derivato di pBR322 che contiene, in aggiunta al gene della S-lattamasi ad all'origine di replicazione di ColEl, il promotore ed il sito di legame con il ribosoma del gene 010 del batteriofago T7 (24).

I frammenti codificanti per la proteasi NS3 di HCV sono stati clonati a valle del promotore 010 del batteriofago T7, in fase di lettura con il primo codone ATG della proteina del gene 10 del fago T7 utilizzando metodiche note nel settore.

II frammento di cDNA contenente la sequenza di HCV-BK compresa tra i nucleotidi 3411 e 3950 e' stato amplificato mediante l'uso della Polymerase Chain Reaction (PCR) utilizzando come primers gli oligonucleotidi PROT(BK-K4)S (SEQ ID NO:5) e PROT (BK-K4)AS (SEQ ID NO :6). Il frammento di cDNA cosi' ottenuto e' stato digerito con l'enzima di restrizione NdeI, e clonato in pT7-7 che era stato prima linearizzato con gli enzimi di restrizione NdeI e SmaI.

Il frammento di cDNA contenente la sequenza di HCV-H compresa tra i nucleotidi 3420 e 3959 e' stato amplificato mediante l'uso della PCR utilizzando come primers gli oligonucleotidi PROT(H-K4)S (SEQ ID NO:7) e PROT{H-K4)AS (SEQ ID NO:8). Il frammento di cDNA cosi1 ottenuto e' stato digerito con gli enzimi di restrizione NdeI e EcoRI, e clonato in pT7-7 che era stato prima linearizzato con gli stessi enzimi di restrizione .

Il frammento di cDNA contenente la sequenza di HCV-J compresa tra i nucleotidi 3408 e 3947 e' 'stato amplificato mediante l'uso della PCR utilizzando come primers gli oligonucleotidi PR0T(J-K4)S (SEQ ID NO:9) e PR0T(J-K4)AS (SEQ ID NO:10). Il frammento di cDNA cosi' ottenuto e' stato digerito con gli enzimi di restrizione NdeI e EcoRI, e clonato in pT7-7 che era stato prima linearizzato con gli stessi erizimi di restrizione .

Il frammento di cDNA contenente la sequenza di HCV-J8 compresa tra i nucleotidi 3432 e 3971 e' stato amplificato mediante l'uso della PCR utilizzando come primers gli oligonucleotidi PROT(J8-K4)S (SEQ ID NO:11) e PROT(J8-K4)AS (SEQ ID NO:12). Il frammento di cDNA cosi' ottenuto e' stato digerito con gli enzimi di restrizione NdeI e EcoRI, e clonato in pT77 che era stato prima linearizzato con gli stessi enzimi di restrizione.

I plasmidi pT7-7(Pro BK-asK4), pT7-7{Pro J-asK4), pT7-7 {Pro H-asK4), pT7-7(Pro J8-asK4) contenenti sequenze da NS3 contengono anche il gene per la S-lattamasi che può' essere usato come marcatore di selezione di cellule E. coli trasformate con questi plasmidi .

I frammenti sono stati clonati a valle del promotore del batteriofago T7, in fase di lettura con il primo codone ATG- della proteina del gene 10 del fago T7 utilizzando metodiche note nel settore. I plasmidi pT7-7 (Pro BK-asK4), pT7-7(Pro J-asK4), pT7-7(Pro H-asK4), pT7-7(Pro J8-asK4) contenenti sequenze da NS3 contengono anche il gene per la β-lattamasi che può essere usato come marcatore di selezione di cellule E. coli trasformate con questi-plasmidi.

I plasmidi vengono poi trasformati nel ceppo di E.coli BL21 (DE3), normalmente usato per elevati livelli di espressione di geni clonati in vettori d'espressione che contengono il promotore T7. In questo ceppo il gene della polimerasi T7 viene portato sul batteriofago λ DE3 che e' integrato nel cromosoma di cellule BL21 (25). L'espressione del gene e' indotta incubando le colture a un Α600 nm di 0.7-0.9 con 0.4 mM di isopropil-l-thio-P-D-galattopiranoside (IPTG) per 3 ore a 20 °C in terreno LB supplementato con ZnC12 ad una concentrazione che può1 variare tra 50 μΜ e 1 mM. Dopo le tre ore le cellule vengono raccolte e lavate in un tampone fosfato salino (20mM sodio fosfato pH7.5, 140 mM NaCl), quindi vengono risospese in 25 mM di sodio fosfato a pH 7.5, 10% glicerolo, 500mM NaCl, lOmM DTT, 0.5% CHAPS (10ml per 11 di coltura). Le cellule vengono quindi lisate mediante due passaggi in "French pressure celi" e l'omogenato ottenuto viene centrifugato a lOO.OOOxg per 1 ora, mentre gli acidi nucleici vengono rimossi mediante precipitazione con 0.5% polietilenimina. I supernatanti vengono caricati su una colonna HiLoad 16/10 SP Sepharose High Performance (Pharmacia), ed equilibrati con 50 mM di sodio fosfato a pH 7.5, 5% glicerolo, 3mM DTT, 0.1% CHAPS (tampone A). La colonna e' stata lavata ripetutamente con il tampone A e la proteasi e' stata eluita applicando un gradiente da 0 a 0.6 M NaCl. Le frazioni contenenti la proteasi sono state quindi raccolte e concentrate usando una camera per ultrafiltrazione sotto ~ agitazione magnetica equipaggiata con una membrana YM-10 (Amicon). Il campione e' stato quindi caricato su una colonna HR 26/60 HiLoad Superdex 75 (Pharmacia) equilibrata con il tampone A, operante ad un flusso di lml/min.

Le frazioni contenenti NS3 sono state raccolte e ulteriormente purificate su una colonna HR 5/5 Mono S (Pharmacia) , equilibrata con il tampone B ed operante ad un flusso di lml/min. La proteasi e1 stata eluita in forma pura dalla colonna applicando un gradiente lineare di 0-0.6 NaCl nel tampone A.

Dopo questo passaggio la proteina e' stata conservata in aliquote a concentrazioni di 50-150 μΜ ad una temperatura di -80 °C dopo congelamento in azoto liquido. La concentrazione della proteina e' stata stimata dalla determinazione dell'assorbanza a 280 nm usando un coeffieciente di estinzione derivato dai dati di sequenza o dalla analisi amminoacidica quantitativa. Entrambi i metodi conducono agli stessi risultati a meno di un errore del 10%. La purezza dell'enzima e1 stata accertata su gel di poliacrilammide SDS e per HPLC usando una colonna a fase inversa Vydac C4 (4.6x250 mm, 5 mm, 300 A). Gli eluenti usati sono stati H20/0.1% TFA (A) e acetonitrile/O .1% TFA (B). E' stato usato un gradiente -lineare dal 3% al 95% B in 60 minuti .L'analisi dell'estremità' N-terminale e' stata effettuata usando la degradazione Edman su un sequenziatore a fase gassosa (Applied Biosystem modello 470A) e l'analisi per spettroscopia di massa ha rivelato che piu' del 96% della proteina purificata ha la sequenza N-terminale PITAYSSQ. Il rimanente 3% ha la sequenza MAPITAYSSQ come atteso dai dati sulla sequenza nucleotidica .

Allo scopo di misurare l' attività’ enzimatica della proteina purificata, e' stato usato come substrato un peptide sintetico di 13 amminoacidi. Tale peptide e' stato derivato dalla sequenza di taglio della giunzione NS4A-NS4B (DEEMECSSHLPYK) . Come cofattore della protessi e' stato usato un peptide di 14 amminoacidi corrispondente alla regione idrofobica centrale della proteina NS4A (dalla posizione 21 alla posizione 34) (Pep4A2l-34: GSW IVGRIILSGR) .

I peptidi’ sono stati sintetizzati per sintesi su fase solida basata sulla chimica Fmoc. Dopo il lavaggio e la deprotezione i peptidi "grezzi" sono stati purificati tramite HPLC fino al 98% di purezza. L'identità' dei peptidi e' stata determinata per spettrometria di massa. Le soluzioni dei peptidi che sono state immagazzinate sono state preparate in DMSO e conservate a -80°C, inoltre le concentrazioni sono state determinate per analisi amminoacidica quantitativa effettuata su campioni idrolizzati con HCl .

I saggi di taglio sono stati effettuati usando 300 nM - 1.6 μΜ di enzima in 301 di 50 mM Tris pH 7.5, 50% glicerol, 2% CHAPS, 30mM DTT e quantità1 appropriate di substrato e/o di peptide-NS4A a 22°C. La reazione e ' stata fermata per aggiunta di 70 μl di H2O contenenti 0.1% TFA. Il taglio dei peptidi substrato e' stato determinato per HPLC usando un cromatografo Merck-Hitachi . Quindi 90 μΐ di ciascun campione sono stati iniettati su una colonna a cartuccia a fase inversa Lichrospher C18 (4x125 mm, 5 μτα, Merck) e i frammenti sono stati separati usando un gradiente di acetonitrile 3-100% a 2%/min. La identificazione del picco e' stata realizzata seguendo sia l'assorbanza a 220 nm, sia la fluoscerenza della tirosina (kex= 260 nm,·Xem= 305 nm)

Nelle tabelle 1 e 2 vengono riportati i dati di solubilità' e resa relativi alla proteasi NS3 corispondenti a diversi isolati del virus dell1 HCV. Nella tabella 1 sono riportati i dati relativi alla produzione delle diverse forme della proteasi con e senza l'aggiunta di quattro lisine all'estremità' C-terminale e con e senza aggiunta di ZnCl2 nel terreno di coltura. I dati sono espressi come percentuale di proteina recuperata nella frazione solubile degli estratti cellulari, e proteina ritrovata nei corpi inclusi. Nella tabella 2 sono riportate le rese e le solubilità' delle diverse forme della proteasi, purificata da cellule di E. coli cresciute in presenza di ZnCl2. Come si vede dai risultati riportati le proteasi modificate (BK-ASK4, J-ASK4, H-ASK4) risultano da 10 a 20 volte piu' solubili e, quando vengono espresse in un terreno di cultura contenente un eccesso di ZnCÌ2, offrono una resa fino a 10 volte maggiore rispetto alle rispettive proteasi senza coda di lisine.

ESEMPIO 2

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO METALLICO DI POLIPEPTICI CON L'ATTIVITÀ' PROTEQLITICA DELLA PROTEASI NS3 DI HCV

I polipeptidi purificati secondo la procedura descritta nel'esempio 1, 3 e 5 sono stati ulteriormente dializzati contro tamponi contenenti un agente chelante, allo scopo di rimuovere eventuali ioni metallici legati alla proteina e il loro contenuto metallico e' s-tato determinato mediante spettrometria ad assorbimento atomico con uno spettrometro Perkin-Elmer Instrument . La vetreria usata per l'analisi del contenuto metallico e' stata lavata con 30% acido nitrico e sciacquata completamente con acqua deionizzata. La proteasi (ad una concentrazione di 4mg/ml) e' stata dializzata per una durata di almeno 16 ore contro un tampone contenente 50 mM Tris/HCl pH 7.5, 3mM DTT, 10% glicerolo, 0.1% CHAPS. In sospensione nel tampone di dialisi e' stata tenuta una resina Chelex-100 (2.5 g/l) allo scopo di prevenire contaminazioni da ioni metallici casuali. La proteina e1 stata successivamente idrolizzata con acido nitrico e quindi utilizzata per la determinazione del contenuto metallico. Le soluzioni Zn2+ , Co2+, Cd2+ standardizzate sono state acquistate dalla Merck.

Il contenuto metallico e' risultato essere di 1 gatomo per 1 mole di enzima (vedi tabella 3 - n.d.=non determinato) , eccetto che per la apoproteina per cui il contenuto in metallo e' trascurabile.

ESEMPIO 3

PROCEDURA PER LA RINATURAZIONE DELLA PROTEASI NS3 IN PRESENZA DI ZINCO

Per accertarsi se lo zinco e' richiesto per l'attività' della serino-proteasi NS3 di HCV, si e1 inizialmente misurata la sua attività proteolitica su un peptide substrato sintetico. Tale misurazione e' stata effettuata in presenza di concentrazioni crescenti di EDTA o di 1,10-fenantrolina . E1 stato trovato che questi due composti non inibiscono la proteolisi da parte di NS3 a concentrazioni inferiori a ImM. Al di sopra di queste concentrazioni sia l'EDTA che la 1,10 -fenantrolina mostrano solo un'inibizione modesta dell'attività' di NS3. Tuttavia un comportamento di inibizione simile e' stato ottenuto in esperimenti di controllo in cui sono stati usati analoghi strutturali del 1,10-fenantrolina che non e' in grado di chelare ioni zinco e l'attività non e' stata riottenuta mediante presenza di ioni Zn2 in eccesso. Questi risultati -suggeriscono che o lo zinco non e' richiesto per l'attività1 enzimatica o esso e' cosi' fortemente legato alla "proteina da non poter essere rimosso tramite trattamento con agenti chelanti. Si e' quindi deciso di procedere alla preparazione di una proteina priva di zinco (apoproteina) e di misurare la sua attività' biochimica in assenza e in presenza del metallo. Lo zinco legato non può essere rimosso per dialisi contro chelatori a pH superiore a 7, al contrario una dialisi prolungata dell'enzima a pH minore di 5 e in presenza di 10mM EDTA causa una perdita di zinco accompagnata da una precipitazione irreversibile del campione. Tutte quetse osservazioni suggeriscono che lo zinco e' fortemente legato e che esso e' essenziale per l'integrità' strutturale della proteina. Allo scopo Si facilitare il rilascio dello zinco l 'apoproteina e' stata ottenuta applicando la seguente procedura: 1.7 mg di proteasi NS3 sono stati denaturati per aggiunta di TFA ad una concentrazione finale dell'1%. La proteina denaturata e' stata successivamente purificata su una colonna Resource RPC 3ml usando un gradiente di acetonitrile dallo 0% allo 85% in presenza di 0.1% di TFA. Il flusso della colonna e' pari a 2ml/min e il volume del gradiente di 45 mi. Il contenuto di zinco della apoproteina e' risultato trascurabile. Si e' quindi saggiata l'attività' enzimatica della apoproteina in presenza e in assenza di zinco. La apoproteina e1 stata diluita ad una concentrazione finale di 60 nM nel tampone di attività' contenente le concentrazioni di ZnCl2 indicate nel grafico e 10 mM DTT per prevendire l' ossidazione dei gruppi tiolo. Dopo una incubazione di 1 ora a 22 °C, la reazione e' stata fatta partire aggiungendo il peptide substrato ad una concentrazione di 40 mM. La reazione quindi e1 stata fatta procedere per una altra ora prima di effettuare le misurazioni. Come viene mostrato nella figura 3 la ricostituzione dell'attività' enzimatica dipende dalla concentrazione di ioni zinco nel tampone. La riattivazione massima e' stata osservata ad una concentrazione di ZnCl2 di 25μΜ. A questa concentrazione l'attività enzimatica risulta di circa il 50% rispetto alla proteasi contenente lo zinco (diluita nello stesso tampone alla stessa concentrazione finale). Quest'ultimo esperimento dimostra inequivocabilmente che lo zinco e1 necessario perche' l'enzima sia strutturalmente integro e sia attivo,- inoltre esso fornisce una metodologia per la ricostituzione dell' attività' di serino-proteasi di NS3 a partire dall' apoproteina.

ESEMPIO 4

PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE DELLA PROTEASI NS3 DI CV IN FORMA UTILE PER LA DETERMINAZIONE DELLA SUA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE TRAMITE TECNICHE DI NMR

La scoperta che la proteasi NS3 di HCV contiene una atomo di zinco strutturale e' stata utilizzata per incrementare la produzione di proteina solubile in cellule batteriche (E. coli) e quindi per produrre una proteina in forma utile per gli esperimenti di determinazione della struttura mediante NMR.

Infatti, la determinazione della struttura mediante NMR richiede marcature metaboliche con e con 13C da effettuarsi in terreno di coltura minimo, per esempio in terreno M9 modificato (NH4)2S04 lg/1, K-fosfato lOOmM, MgS04 0.5 mM, CaCl2 0.5 mM, biotina 5μΜ, tlamina 7 μΜ, ampicillina 5μ9/ml, glucosio 4 g/1, FeS04.7H20 13 μΜ) . L'induzione in questo terreno, che non comprende nella sua composizione sali di zinco, comporta inevitabilmente la produzione di proteina insolubile, l'aggiunta di 50μΜ di ZnCl2 porta invece alla produzione di una proteasi completamente solubile. In questo modo si può' produrre una proteina marcata utilizzando (15NH4)2S04 come fonte di azoto e 13C-glucosio come fonte di carbonio.

Seguendo la nuova procedura si e1 ottenuta una proteina che rimane in forma solubile nel citoplasma e non viene sequestrata nei corpi d'inclusione come accadeva adottando le vecchie procedure. Diventano quindi inutili le procedure di risolubilizzazione il che comporta notevoli vantaggi infatti tali procedure hanno rese molto variabili, necessitano di condizioni estremamente controllate e inoltre spesso causano alterazioni irreversibili della proteina. In figura 4 si vede come la proteasi (a circa 21 kDa-indicata in figura dalla freccia) venga prodotta come aggregato insolubile (PT) quando le cellule batteriche sono cresciute in terreno minimo carente di zinco (colonne 3, 4 e 5). Al contrario se al terreno viene aggiunto ZnCl2 ad una concentrazione di 50 mM la proteina si ritrova nella frazione solubile (SN) (colonne 6,7 e 8) e scompare dalla porzione insolubile (PT).

ESEMPIO 5

SOSTITUZIONE DELLO Zn2+ LEGATO AD NS2 CON SONDE SPETTROSCOPICHE COME Co2+ 0 Cd2+

Il sito di legame allo zinco della proteasi NS3 di HCV puo' essere studiato sostituendo lo zinco con metalli che permettono studi spettroscopici . Lo stretto legame dello zinco strutturale all'enzima rende difficile lo rimozione del metallo e la sua sostituzione in vitro. Di conseguenza si e' proceduto alla sostituzione di Zn2+ con Co2+ e Cd2+ per incorporazione in vivo. Le cellule batteriche (E.coli) vengono trasformate con un appropriato vettore d'espressione e cresciute in terreno minimo contenente 100 mM potassio fosfato a pH 7.0, 0.5 mM MgSO4 , 0.5 mM CaCl2, 13 μΜ FeS04, 7 μΜ tiamina, 6 μΜ biotina. Come sorgenti di carbonio e azoto sono stati usati glucosio (4 g/1) e (NH4)2S04 (lg/1) rispettivamente. Per ridurre la quantità' di ioni Zn2 nel terreno, il tampone fosfato e1 stato fatto passare attraverso una colonna Chelex-100. Per ottenere la produzione di Co2+ o Cd2+-NS3 sono stati aggiunti 50mM di C0CI2 e di CdCl2 rispettivamente 20 minuti prima della aggiunta di IPTG. La purificazione delle Co2+ e Cd2+-proteasi e1 stata ottenuta secondo la procedura descritta nell'esempio 1, eccetto che tutti i tamponi usati sono stati trattati con resina Chelex-100 (2.5 g/1) e il DTT e' stato eliminato.

L'aggiunta di C0CI2 o di CdCl2 al terreno di crescita porta ancora alla produzione di enzima solubile, ciò' indica che gli ioni Co2+ e Cd2+ possono sostituire lo zinco nel sito di legame al metallo della proteasi. La proteasi contenente Co2+ e Cd2+ e' stata analizzata per spettroscopia ad assorbimento elettronico. La protessi contenente Co2+ mostra un caratteristico spettro d'assorbimento nella regione del visibile (figura 6a) che e' indicativo di un sito di legame con una geometria tetraedica (26) . Le due bande principali a 640 nm e a 685 nm e i minimi a 585 nm e a 740 nm sono indicativi di transizioni d-d. Le energie di queste transizioni e i coefficienti d'estinzione molare sono caratteristici di complessi con una geometria di coordinazione tetraedrica distorta (27). L'energia della transizione d-d e’ consistente con un legame di coordinazione misto zolfo-azoto. In piu' il centroide della banda corrispondente alla transizione d-d e' indicativo di un complesso del Co2+ con legame S3N (26). E' stata osservata una tipica banda di trasferimento di carica S -> Co2+ intorno a 365 nm (figura 6a), il che implica che lo ione metallo e' coordinato da tiolati. In accordo con questi dati, lo spettro d'assorbimento UV della Cd2+-proteasi (figura 6b) mostra un aumento d'assorbanza intorno a 250 nm che molto probabilmente e 1 dovuta ad una banda di trasferimento di carica S -> Cd2+ (28). In conclusione l'anàlisi spettroscopica delle Co2+- e Cd2+- proteasi e' completamente consistente con il modello tridimensionale da noi proposto. Infatti nel modello il sito di legame al metallo e1 formato dai tre gruppi tiolo di tre cisteine e da un atomo d'azoto della catena laterale di una istidina. Ciascuno dei residui che secondo il modello formano il sito di legame al metallo e' stato mutato in alanina e come atteso nessuno dei mutanti ottenuti riesce ad essere espresso in forma solubile in E.coli.

LISTA DI SEQUENZE

INFORMAZIONI GENERALI

(ii) TITOLO DELL’INVENZIONE:

"POLIPEPTIDI SOLUBILI CON L'ATTIVITÀ DI SERINO PROTEASI DI NS3 DEL VIRUS DELL'EPATITE C, E PROCEDIMENTO PER LA LORO PREPARAZIONE E IL LORO ISOLAMENTO"

(iii)NUMERO DI SEQUENZE: 12

(v) FORMA LEGGIBILE AL COMPUTER:

(A) TIPO DI SUPPORTO: Floppy Disk 3.5” 1.44 Mbytes (B) COMPUTER: IBM PC compatibile

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Rev. 5.0

(D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0

(1) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO :1

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 187 amminoacidi

(B) TIPO:amminoacidica

(C) NUMERO DI CATENE :singola

(D) TIPOLOGIA: lineare

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: Pro BK-asK4

(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza della proteasi NS3 di HCV-isolato BK

_ {xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO :1

(2) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO :2

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 187 amminoacidi

(B) TIPO: amminoacidica

(C) NUMERO DI CATENE :singola

(D) TIPOLOGIA: lineare

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI :

(A) NOME: Pro H-asK4

(B) ALTRE INFORMAZIONI :sequenza della proteasi NS3 di HCV-isolato H

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO :2

(3) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO :3

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 187 amminoacidi

{B) TIPO :amminoacidica

(C) NUMERO DI CATENE :singola

(D) TIPOLOGIA: lineare

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: Pro J-asK4

(B) ALTRE INFORMAZIONI :sequenza della proteasi NS3 di HCV-isolato J

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO :3

(4) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 4

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 186 amminoacidi

(B) TIPO :amminoacidica

(C) NUMERO DI CATENE :singola

(D) TIPOLOGIA: lineare

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: Pro J8-asK4

(B) ALTRE INFORMAZIONI :sequenza della protessi NS3 di HCV-isolato J8

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA :SEQ ID NO :4

(5) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO:5

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 26 nucleotidi (B) TIPO:acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE:singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico . (iv) ANTISENSO: No

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PROT(BK-K4)S

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:5

(6) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO:6 (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 33 nucleotidi (B) TIPO:acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE:singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico (iv) ANTISENSO : Si

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PROT(BK-K4)AS

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:6

(7) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO:7 (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 26.nucleotidi (B) TIPO:acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE:singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico (iv) ANTI SENSO: No

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PROT(H-K4)S

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA :SEQ ID NO :7

(8) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO :8

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 42 nucleotidi (B) TIPO:acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE :singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico (iv) ANTI SENSO: Si

(vii) FONTE IMMEDIATA:- sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PROT(H-K4)AS

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:8

(9) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO :9 (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 27 nucleotidi (B) TIPO:acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE :singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico (iv) ANTISENSO : No

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PROT(J-K4)S

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:9

(10) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO:10 (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 42 nucleotidi (B) TIPO: acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE :singola

(D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico (iv) ANTISENSO: Si

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI :

(A) NOME: PROT (J-K4)AS

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA :SEQ ID NO:10

(11) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO:11 CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 24 nucleotidi (B) TIPO: acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE :singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico (iv) ANTISENSO: No

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PROT{J8-K4)S

xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:11

(12) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO:12 (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA (A) LUNGHEZZA: 42 nucleotidi (B) TIPO:acido nucleico

(C) NUMERO DI CATENE :singola (D) TIPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico -(iv) ANTISENSO : Si

(vii) FONTE IMMEDIATA: sintetizzatore di oligonucleotidi

(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:

(A) NOME: PHOT (J8-K4)AS

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:12

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Polipeptidi isolati e purificati che contengono la sequenza del dominio di serino-proteasi di NS3 di HCV, caratterizzati dal fatto di possedere alla loro estremità' C-terminale una coda di almeno tre lisine .
2. Vettori di espressione per produrre i polipeptidi come da rivendicazione 1, caratterizzati dal fatto di comprendere: un polinucleotide che codifica per uno di detti polipeptidi; - sequenze di regolazione e di traduzione funzionali nella cellula ospite e legati operativamente a detto polinucleotide; ed eventualmente un marcatore selezionabile.
3. Cellula procariotica, caratterizzata dal fatto di essere trasformata con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per i polipeptidi come da rivendicazione 1, in modo da permettere a tale cellula di esprimere il polipeptide codificato dalla sequenza prescelta.
4. Procedimento per la preparazione di polipeptidi isolati e purificati che contengono la sequenza del dominio di serino-proteasi di NS3 di HCV, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti operazioni : - trasformazione di una cellula procariotica con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per un polipeptide che contiene la sequenza del dominio di serino-proteasi di NS3 di HCV; -crescita della cellula ospite procariote su un particolare terreno di coltura contenente Zn2+ od alternativamente sali di metalli di transizione, quali Co, Cd, Mn Cu Ni, Ag, Fe, Cr, Hg, Au, Pt, V; - espressione della sequenza di DNA desiderata per produrre il polipeptide prescelto; purificazione del polipeptide senza dover ricorrere a protocolli di risolubilizzazione e rinaturazione della proteina partendo da corpi inclusi, tale procedimento permettendo di ottenere detti polipeptidi in forma nativa e solubile idonea a consentire la determinazione della struttura tridimensionale dell1 enzima mediante tecniche di NMR o di cristallografia mediante raggi X.
5. Procedimento per la rinaturazione in vitro di polipeptidi che contengono la sequenza del dominio di serino-proteasi di NS3 di HCV, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti operazioni: - trasformazione di una cellula procariotica con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per un polipeptide che contiene la sequenza del dominio di serino-proteasi di NS3 di HCV; - espressione della sequenza di DNA desiderata per produrre il polipeptide prescelto ,--purificazione del polipeptide denaturato e rinaturazione della proteina sfruttando tamponi che contengano Zn2+ od alternativamente sali di metalli di transizione quali Co, Cd, Mn ,Cu Ni, Ag, Fe, Cr, Hg, Au, Pt, V, tale procedimento permettendo di ottenere detti polipeptidi in forma nativa e solubile idonea a consentire la determinazione della struttura tridimensionale dell' enzima mediante tecniche di NMR o di cristallografia mediante raggi X.