KR19980069020A - 히스티딘이 표지된 한국형 c 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4a 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히스티딘이 표지된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스의 증식에 중요한 단백질 분해효소 활성을 나타내는 비구조 단백질 3-4A 의 아미노 말단에 히스티딘이 표지된 재조합 단백질, 이를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용한 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 단백질 분해효소 단백질은 히스티딘 표지를 포함하여 용이하게 분리·정제할 수 있고 C 형 간염 바이러스의 증식 억제제 등을 선별하는데 널리 사용될 수 있다.

Description

히스티딘이 표지된 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 및 그의 제조방법

본 발명은 히스티딘이 표지된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스의 증식에 중요한 단백질 분해효소 활성을 나타내는 비구조 단백질 3-4A 의 아미노 말단에 히스티딘이 표지된 재조합 단백질, 이를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용한 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 단백질 분해효소 단백질은 히스티딘 표지를 포함하여 용이하게 분리·정제할 수 있고 C 형 간염 바이러스의 증식 억제제 등을 선별하는데 널리 사용될 수 있다.

C 형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus)는 비 A 형 또는 비 B 형 간염을 유발하는 것으로 알려진 간염의 주요 원인이 되는 바이러스로서, 사람에 침입하여 급성 또는 만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여한다고 한다 (Alter, H. J. et al., 1989, N. Eng. J. Med, 321 : 1494-1500). C 형 간염 바이러스는 전 세계 인구의 1% 가 감염되어 있는 것으로 보고된 바 있으며, 새로이 C 형 간염 바이러스에 감염되는 환자의 수가 매년 약 백만명 정도에 이르는 것으로 추정된다 (Purcell, 1994, FEMS Microbial. Rev, 14 : 181-192 ; van der Poel, 1994, Hepatitis C Virus : Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, H. W. Reesink ed., pp.137-193 ; Alter, H. J., 1988, A. J. Zuckerman ed., Viral Hepatitis and Liver Disease, pp.537-542). 또한 C 형 간염 바이러스에 감염된 환자들 중 약 40-50% 는 간염이 진전되어 만성 간염 환자가 되고, 약 20% 정도는, 더욱 진전되어 간경변 또는 간암 환자가 되는 것으로 알려져 있다 (Dienstag, J.L., 1986, Semin. Liver. Dis, 6 : 67-81).

C 형 간염 바이러스는 비 A 형 또는 비 B 형 간염 환자의 혈장을 침팬지에 접종시켜 분리함으로써 회수할 수 있다 (Bradley, D. W. et al., 1988, Gatroenterology, 88 : 773-779). 이렇게 얻어진 C 형 간염 바이러스는 9400 염기로 이루어진 양성가닥 리보핵산 형태의 유전자를 가지고 있으며, 이로부터 3010-3033 개의 아미노산으로 이루어지는 다단백질 (polyprotein)을 만들어 낸다 (Choo, Q. L. et al., 1989, Science, 244 : 359-362, Choo, Q. L. et al., 1991, PNAS, 88 : 2451-2455). 상기와 같은 유전자 구조를 고려할 때 C 형 간염 바이러스는 플래비바이러스 (flaviviruses) 또는 페스티바이러스 (pestiviruses)와 유사하므로, C 형 간염 바이러스는 플래비비리대 (Flaviviridae)에 속하는 새로운 속 (genus)으로 분류되었다 (van Doorn, 1994, review. J. Med. Virol, 43 : 345-356).

C 형 간염 바이러스의 다단백질은 아미노 말단으로부터 core-E1-E2-NS2-NS3- NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 의 순서로 구성되어 있다. 즉, 다단백질상의 아미노 말단에는 바이러스의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)와 외피 (envelope)의 구성요소인 구조 단백질 (core, E1, E2)이 존재하고, 그의 카복시 말단 쪽에는 C 형 간염 바이러스가 증식하는데 필수적인 비구조 단백질들 (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)이 위치하고 있다. 이 다단백질은 세포내 시그날 펩티다제 (signal peptidase) 및 바이러스에 존재하는 단백질 분해효소인 비구조 단백질 2-3 및 비구조 단백질 3이 작용하여 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써 9개의 숙성된 바이러스 단백질을 만들어 낸다. 구체적으로 비구조 단백질 3은 비구조 단백질 3 과 4A 사이, 4A 와 4B 사이, 4B 와 5A 사이, 5A 와 5B 사이에 존재하는 4개의 절단 부위에 작용하는 것으로 밝혀져 있다 (Hijikata et al., 1991, PNAS, 88 : 5547-5551, Bartenschlarger et al., 1994, J.Virol, 68 : 5045-5055, Grakoui et al., 1993, J. Virol, 67 : 1385-95, Tomei et al., 1993, J.Virol, 67 : 4017-4026). 또한 이러한 비구조 단백질 3은 조효소인 비구조 단백질 4A 와 결합하고 결합한 조효소와 상호 작용하여 그의 효소 활성이 증가한다고 보고되어 있다 (Shimizu, Y. et al., 1996, J. Virol, 70 : 127-132, Love R. A. et al., 1996, Cell. 87 : 331-342).

C 형 간염 바이러스의 만성적 감염을 효과적으로 치료하기 위하여 보편적인 치료법은 아직까지 개발되어 있지 않고 거의 유일하게 인터페론-알파를 C 형 간염 바이러스의 치료제로서 투여하는 것이 시행되고 있다. 그러나 상기 간염 환자에게 인터페론-알파를 투여하는 경우 15-20% 의 환자만이 그 치료 효과를 보인다 (Hoofnagal, J. H., 1994, And. Intern. Med., 39 : 241-275). 또한 세계적으로 가장 널리 발견되고, 특히 아시아, 아메리카, 유럽 지역에서 C 형 간염을 유발하는 주된 바이러스 유형이며, 간경화 또는 간암으로 이행되는 진전율이 높은 C 형 간염 바이러스-1b 형에는 그 효과가 낮아 C 형 간염 바이러스에 의한 간염을 치료하는데 널리 사용할 수 없는 문제점이 있다 (van Doorn, L. J., 1994, review, J. Med. Virol. 43 : 345-356). 따라서 C 형 간염 바이러스의 감염에 대한 새로운 치료법을 개발하는 것이 매우 중요하다.

C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3은 전구체 다단백질을 절단하여 숙성된 비구조 단백질 3, 4A, 4B, 5A 및 5B 를 생산하는 매우 중요한 작용을 담당하고 있다 (Kim, J. L. et al., 1996, Cell, 87 : 343-355). 이러한 비구조 단백질 3은 단일 단백질 내에 세린계 단백질 분해효소, 뉴클레오티드 탈인산화 효소 (NTPase) 및 RNA 헬리카제 (helicase) 활성을 나타내는 아미노산 모티프 등으로 구성되는데, 헬리카제 기능은 카복시 말단에 존재하고, 단백질 분해효소 기능은 아미노 말단에 존재하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 1995, BBRC 215 : 160-165, Han et al., 1995, J. Gen. Virol 76 : 985-993). C 형 간염 바이러스가 증식하는 과정에서 비구조 단백질 3 의 단백질 분해효소 활성 부위는 다단백질을 절단하여 바이러스 입자가 생성되는데 중요한 작용을 하므로, 이 효소 활성 부위를 포함하는 비구조 단백질 3 을 얻어 그에 대한 저해제 등을 선별할 수 있다면 C 형 간염에 대한 효과적인 치료제를 용이하게 개발할 수 있다. 또한 상기에서 언급한 바와 같이 이러한 비구조 단백질 3을 그의 활성을 증가시키는 조효소인 비구조 단백질 4A 와 결합된 형태로 얻는다면 C 형 간염 치료제를 개발하는데 매우 유용한 것이다.

이에 본 발명자들은 보다 효과적인 C 형 간염 치료제를 개발하기 위하여, C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하는 비구조 단백질 3-4A 를 생산하기 위하여, 바이러스의 유전자를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 비구조 단백질 3-4A 유전자를 얻고, 이를 아미노 말단에 히스티딘 표지가 첨가된 재조합 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터에 클로닝한 다음 이 발현 벡터를 이용하여 상기 비구조 단백질 3-4A 를 대장균에서 대량 생산하고 히스티딘 표지 친화 칼럼 등으로 분리·정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 히스티딘이 표지된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 아미노 말단에 히스티딘 표지 및 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하는 재조합 단백질 형태로 제공한다.

또한 본 발명은 히스티딘이 표지된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 생산하는 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 발현 벡터는 상기 비구조 단백질 3-4A 유전자의 5′-말단에 히스티딘 표지를 암호하는 염기 서열을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 로 형질전환시킨 대장균 형질전환체 (수탁번호 : KCTC 8780P)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 히스티딘이 표지된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로 본 발명은 형질전환체를 배양하여 상기 비구조 단백질 3-4A 의 발현을 유도한 다음, 조세포 용출액을 얻어 히스티딘 표지 친화 크로마토그라피 등을 수행함으로써 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하는 비구조 단백질 3-4A 를 분리·정제한다. 이 때 히스티딘 표지 친화 크로마토그라피에 사용하는 용출 용매로는 이미다졸 농도 구배를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 방법으로 상기에서 제조한 단백질은 바이러스의 증식에 관여하는 단백질 분해효소 저해제를 선별하는데 사용될 수 있다. 또한 상기의 저해제는 C 형 간염 바이러스에 의한 간염, 간경화 및 간암의 치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 히스티딘이 표지된 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 생산하는 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 의 제조 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)pLysS 가 생산하는 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 분리·정제하여 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : 정제 전의 세포파쇄 총액 (TCL; total cell lysate)

레인 2-7 : 용출분획 (eluted fractions)

도 3은 본 발명의 정제된 비구조 단백질 3-4A 의 단백질 분해효소 활성을 측정하여 HPLC 크로마토그램으로 나타낸 것이다.

본 발명은 히스티딘이 표지된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스에 있어서 그의 다단백질 성숙에 관여하는 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하는 비구조 단백질 3 에 조효소로 작용하는 비구조 단백질 4A 가 결합한 재조합 단백질 형태로 제공한다. 본 발명의 비구조 단백질 3-4A 의 아미노 말단에는 히스티딘 표지가 포함된다.

이 때 한국형 C 형 간염 바이러스는 한국인인 C 형 간염 환자의 혈청으로부터 얻는데, 그의 유전자는 기존의 미국형 및 일본형 C 형 간염 바이러스와는 상이하므로 이를 한국형 C 형 간염 바이러스라고 한다.

본 발명은 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 유전자를 발현 벡터에 삽입하여 대장균에서 발현시킴으로써 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 활성부위를 포함하는 비구조 단백질 3-4A 를 생산한다.

따라서, 본 발명은 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터는 비구조 단백질 3 과 조효소인 비구조 단백질 4A 유전자를 하나의 전사해독틀 (open reading frame, ORF)로서 포함한다.

구체적으로, 본 발명은 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 유전자를 한국형 C 형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻는다. 이 때 시발체로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드를 합성하여 사용한다 (서열 1 및 서열 2 참조). 구체적으로, 서열번호 1의 시발체는 제한효소 Nhe I 인지 부위 (GCTAGC)를 갖고, 한국형 C 형 간염 바이러스의 다단백질 상의 1027번째 아미노산부터 1032번째 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함하며, 서열번호 2의 시발체는 제한효소 Eco RI 인지 부위 (GAATTC)와 한 개의 종료코돈을 갖고, 한국형 C 형 간염 바이러스 다단백질 상의 1707번째 아미노산부터 1711번째 아미노산을 포함한다.

상기 과정으로 얻은 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 유전자를 T7 프로모터와 6개의 히스티딘에 해당하는 염기 서열을 포함하는 대장균 발현 벡터 pRSET-A 에 삽입하여 본 발명의 발현 벡터를 제조한다 (도 1 참조).

구체적으로 상기 비구조 단백질 3-4A 유전자는 5'-말단에 대장균 발현 벡터에 클로닝하는 것이 용이하도록 제한효소 인지 부위를 포함하고 이에 대응하는 3'-말단은 종료 코돈과 제한효소 인지 부위를 포함하므로, 본 발명의 발현 벡터는 시작 코돈에서 단백질의 합성이 시작되어 6개의 히스티딘을 포함하는 상기 비구조 단백질 3-4A 가 발현된 다음 인위적으로 삽입한 종료 코돈에서 단백질의 합성이 완료되도록 구성된다.

본 발명의 발현 벡터를 pRSET-NS3-4A 로 명명하고, 이를 대장균에 형질전환시켜 그 형질전환체를 1997년 1월 29일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8780P).

또한 본 발명은 상기에서 제조한 발현 벡터 및 대장균 형질전환체를 이용하여 한국형 C 형 간염 바이러스에서 유래한 비구조 단백질 3-4A 를 생산하는 제조방법을 제공한다.

구체적으로 상기 대장균 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 로 형질전환시킨 대장균 형질전환체에서 비구조 단백질 3-4A 를 발현시키기 위하여, 앰피실린 등을 함유하는 액체 배지를 이용하여 종배 배양하고 이를 다시 단백질의 발현을 유도하면서 대량 배양한다. 다음 상기 재조합 단백질이 발현된 대장균 세포를 파쇄하여 조세포 용출액을 제조한다.

본 발명의 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 를 이용하면 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 가 그의 아미노 말단에 6개의 히스티딘 표지가 포함된 재조합 단백질 형태로 생산되므로 히스티딘 표지 친화 칼럼 크로마토그라피 등으로 용이하게 분리·정제된다. 이 때 히스티딘 표지 친화 칼럼 크로마토그라피에 사용하는 용출 용매로는 이미다졸 농도 구배를 사용하는 것이 바람직하다.

상기에서 제조한 히스티딘 표지가 포함된 비구조 단백질 3-4A 는 친화 칼럼 크로마토그라피 등으로 용이하게 분리·정제될 뿐만 아니라 안정하여 정제 과정중에 단백질의 효소 활성이 그대로 유지될 수 있다.

상기에서 분리·정제한 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 의 분자량 및 순도 등은 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 수행하여 확인한다 (도 2 참조). 하나의 해독틀로부터 하나의 단백질로 만들어진 비구조 단백질 3-4A 는 자체활성에 의해 단백질 3 과 단백질 4A 의 두 분자로 잘리고, 이 두 분자는 결합한 형태로 존재한다. 상기 비구조 단백질 3-4A 의 단백질 분해효소 활성을 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 5A 및 5B 의 절단 서열에 해당하는 펩타이드를 이용하여 측정하고 이를 HPLC 크로마토그라피를 수행하여 확인한다 (도 3 참조).

이하 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 의 발현 벡터 제조

(단계 1) 중합효소 연쇄반응용 시발체 합성

한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3 부위의 유전자를 얻기 위해 핵산 합성기 (DNA synthesizer, Applied Biosystems Inc. 미국)를 이용하여 중합효소 연쇄반응용 시발체들을 합성하였는데, 이는 기존의 클로닝된 한국형 C 형 간염 바이러스의 DNA의 염기서열 (대한민국 특허출원 제 93-9913 호)을 이용하여 비구조 단백질 3-4A 부위를 코딩하는 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 염기서열을 포함하도록 고안된 것이다.

구체적으로 서열번호 1의 시발체는 제한효소 Nhe I 인지 부위 (GCTAGC)를 가지고 한국형 C 형 간염 바이러스의 1027번째 아미노산부터 1032번째 아미노산을 코딩하는 염기서열을 갖도록 고안하였으며, 서열번호 2의 시발체는 제한효소 Eco RI 인지 부위 (GAATTC)와 한 개의 종료코돈을 갖고, 한국형 C 형 간염 바이러스 다단백질 상의 1707번째 아미노산부터 1711번째 아미노산을 가지도록 고안하였다.

(단계 2) 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 유전자의 증폭

한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A 의 유전자를 증폭하기 위하여 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 상기 (단계 1)에서 얻은 100 pmole의 서열번호 1의 시발체와 100 pmole의 서열번호 2의 시발체를 넣고, 주형으로 플라스미드 벡터 M13-KHCV-L2 (대한민국 특허출원 제 93-9913 호, 수탁번호 ATCC 75447)를 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액 (500mM 염화칼륨, 100mM 트리스-염산 pH 9.0, 1% 트리톤 X-100, 2.5mM 염화마그네슘), 10㎕의 2mM dNTP, 2.5 단위체의 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후, 95℃ 에서 1분 (변성단계), 55℃ 에서 1분 (담금단계), 72℃에서 2분 (중합단계)의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 25회 실시하였다. 이로부터 얻은 핵산 절편을 7% 폴리아크릴아마이드 젤에서 분리한 결과, 약 2,000 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 2% 아가로스 젤로부터 유전자 클린 Ⅱ 키트 (Gene clean Ⅱ kit, Bio 101사, 미국)를 이용하여 분리·정제하여 비구조 단백질 3-4A 유전자를 함유하는 약 2kb 의 핵산 절편을 얻었다.

(단계 3) 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 유전자를 함유하는 대장 균 발현 벡터의 제조

본 발명의 발현 벡터를 제조하기 위하여, 플라스미드 벡터 pRSET-A (인비트로젠사, 미국) 3㎍ 을 BM (베링거만하임, 독일) 완충용액 (10mM 트리스-염산 pH 7.5, 10mM 염화마그네슘, 50mM 염화나트륨, 1mM 디티오트레이톨)에서 제한효소 Nhe I 으로 절단하고, 기브코 (Gibco) 완충용액 (50mM 트리스-염산 pH 8.0, 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륨)에서 제한효소 Eco RI 으로 완전 절단한 다음, 1% 아가로스 젤에서 전기영동으로 분리하여 2.9kb 크기의 플라스미드 벡터 핵산 절편을 얻었다.

한편, 상기 (단계 2)에서 얻은 비구조 단백질 3-4A 유전자를 함유하는 핵산 절편 5㎍ 을 BM 완충용액에서 제한효소 Nhe I 으로 절단하고, 기브코 완충용액에서 제한효소 Eco RI으로 완전 절단한 다음, 2.0kb 크기의 상기 유전자의 핵산 절편을 얻었다.

접합 반응 용기에 100ng 의 2.9kb 의 플라스미드 벡터 핵산 절편과 100ng 의 2.0kb 비구조 단백질 3-4A의 핵산 절편을 넣고, 2㎕의 10배 접합 반응용액 (50mM 트리스-염산 pH 7.8, 10mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25㎍/㎖ 소혈청알부민)과 10 단위체의 T4 DNA 리가제를 가한 다음 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가하고 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 접합반응이 끝나면 대장균 HB101 세포에 형질전환 시킨 다음 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 루리아 아가 플레이트 상에서 형질전환체를 선별하고 이로부터 발현 벡터를 추출하여 제한효소 분석에 의해 비구조 단백질 3-4A 부위 유전자를 함유하는 대장균 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 를 얻은 것을 확인하였다. 도 1은 상기 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 를 제작하는 과정을 도시화한 것이다.

상기 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 로 대장균 BL21(DE3)pLysS 균주를 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체 (BL21(DE3)/pLysS pRSET-NS3-4A)를 1997년 1월 29일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8780P).

(단계 4)대장균에서 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 유전자의 발현

상기 (단계 3)에서 형질전환된 대장균 세포를 50㎍/㎖ 의 앰피실린 및 35㎍/㎖ 의 클로람페니콜이 함유된 액체 루리아 배지 (6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액 20㎖를 다시 2ℓ의 액체 루리아 배지로 옮겨서 37℃ 에서 약 6시간 동안 진탕 배양하여 배양액의 흡광도가 600nm 에서 약 0.5 가 될 때 온도를 23℃로 바꾼 다음 최종 농도가 1mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하였다. IPTG 를 첨가한지 3시간이 경과한 다음 원심분리기 (Beckman J2-21 rotor ; JA10)를 이용하여 6,000rpm 에서 10분간 원심분리하고 대장균 세포 침전물을 수거하였다.

실시예 2 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 의 정제

(단계 1) 대장균의 파쇄

상기와 같이 배양에서 얻은 대장균을 완충용액 1 (20mM 인산나트륨 pH 7.6, 300mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 10% 글리세롤, 0.1% 트윈-20, 1mM β-머캅토에탄올)에 현탁시킨 다음, 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기 (Heat Systemas -Ultrasonics, Inc. W225, 미국)를 이용하여 50% 의 출력으로 2분간 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이 용액을 원심분리기 (Beckman J2-21 rotor ; JA20, 미국)로 15,000 rpm 에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 다음 실험에 사용하였다.

(단계 2) Ni-킬레이팅 히스티딘 표지 친화 (Ni-chelating Histidine Affinity) 젤 크로마토그라피

상기 (단계 1)의 상등액을 상기 (단계 1)의 완충용액 1 로 미리 평형시켜 놓은 2ml의 히스티딘 표지 친화 수지 칼럼 (인비트로젠사, 미국)에 흘려 보내어 6개의 히스티딘이 아미노 말단에 융합되어 있는 비구조 단백질 3-4A 를 수지에 결합시켰다. 비특이적 결합으로 약하게 부착되어 있는 단백질 등은 6ml 의 5mM 이미다졸을 포함하는 평형 완충용액 1, 12ml 의 5 내지 60mM 선형농도구배의 완충용액 1 로 씻어 내었다. 히스트딘 표지가 결합된 단백질은 60 내지 160mM 선형농도구배의 이미다졸을 포함하는 12ml 의 완충용액 1 을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 용출시켜 각 분획들을 수집하였다. 수집된 분획들을 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 비구조 단백질 3-4A 를 함유하는 분획들을 선별한 다음 이를 모았다. 그런 다음 mwco 8000 (molecular weight cut off 8000)의 투석막 (스펙트럼사, 미국)을 이용하여 200mM 인산나트륨 pH 7.6, 50mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 5mM β-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.1% 트윈-20 조성의 완충용액에서 투석하였다.

실시예 3 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 의 단백질 분해효소 활성 측정

본 발명의 비구조 단백질 3-4A 의 단백질 분해효소 활성을 조사하기 위하여 이 단백질 분해효소의 기질로 알려진 C 형 간염 바이러스의 5A 의 카복시 말단 10개 아미노산과 5B 의 아미노 말단 10개 아미노산으로 구성된 5A-5B 펩타이드 유사체인 EEASEDVVPCSMSYSWTGAL 을 본 발명의 상기 단백질 분해효소와 20mM 인산나트륨 pH 7.6, 10% 글리세롤, 0.1% 트윈-20, 50mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 5mM β-머캅토에탄올 조건에서 반응시켰다. 그 반응액을 같은 부피의 5% TFA (트리플루오르아세테이트)를 섞어 반응을 정지시키고 C18 칼럼 (워터스, 미국) 역상 (reverse -phase) HPLC (시마쯔, 일본)를 이용하여, 공급된 20개의 아미노산의 펩타이드가 시스테인과 세린 사이의 펩타이드 결합에서 상기 효소에 의해 가수분해되어 10개 아미노산 펩타이드인 SMSYSWTGAL 로 변화됨을 확인하였다 (도 3 참조).

본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하고 이들 효소가 더욱 효과적으로 활성을 나타내도록 비구조 단백질 4A 를 결합시킨 비구조 단백질 3-4A 를 히스티딘이 표지된 재조합 단백질 형태로 대량 생산하고 이들이 친화 칼럼 크로마토그라피 등으로 용이하게 분리·정제되게 한다.

따라서 본 발명의 히스티딘이 표지된 비구조 단백질 3-4A 는 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하고, 안정하므로 다양하게 이용할 수 있다. 구체적으로 상기 비구조 단백질 3-4A 를 이용하면 C 형 간염 바이러스의 증식 저해제 등을 용이하게 선별할 수 있고 궁극적으로 바이러스의 감염으로 유발되는 간염, 간경화 및 간암 등의 치료제를 개발할 수 있다.

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 27

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열 1]

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 27

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열 2]

Claims (4)

1. 히스티딘이 표지된 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A.
2. 제 1항의 히스티딘이 표지된 비구조 단백질 3-4A 를 생산하는 발현 벡터 pRSET-NS3-4A.
3. 제 2항의 발현 벡터 pRSET-NS3-4A 로 형질전환시킨 대장균 형질전환체 (수탁번호 : KCTC 8780P).
4. 제 3항의 대장균 형질전환체를 배양하여 단백질의 발현을 유도한 다음, 조세포 용출액을 얻고 히스티딘 표지 친화 크로마토그라피를 이미다졸 농도 구배를 사용하여 수행함으로써 비구조 단백질 3-4A 를 얻는 제조방법.