KR20020010241A

KR20020010241A - Ｃ형 간염 바이러스 ｒｎａ-의존성 ｒｎａ 중합효소의대량 발현 기구 및 이로부터 발현된 융합단백질을 이용한효소활성 분석방법

Info

Publication number: KR20020010241A
Application number: KR1020000043669A
Authority: KR
Inventors: 민미경; 김하정; 정수일; 진승원; 성백린; 최성일
Original assignee: 허영섭; 재단법인 목암생명공학연구소; 민경윤; 한미약품공업 주식회사; 성백린; 프로테온 주식회사
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-02-04

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)의 RNA 중합효소를 수용성 형태로 대량 발현하는 재조합 발현 기구 및 상기 중합효소의 활성에 대한 생체외 분석 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 대장균 라이실-tRNA 중합효소(lysyl-tRNA synthetase)의 아미노 말단을 융합짝으로 이용하여 HCV의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, NS5B)를 수용성 형태로서 대량 발현하도록 구축된 재조합 발현 기구 및 이로부터 발현된 단백질을 이용하여 상기 중합효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 발현 기구를 이용하면 상기 HCV의 효소 단백질을 수용성 형태로서 높은 수준으로 발현시킬 수 있어 상기 효소 단백질의 생체외 분석 시스템의 구축 및 항바이러스제(antiviral agent)의 스크리닝에 유용하며, 또한 본 발명의 RNA 중합효소의 활성측정방법은 HCV에 대한 저해제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 ＲＮＡ-의존성 ＲＮＡ 중합효소의 대량 발현 기구 및 이로부터 발현된 융합단백질을 이용한 효소활성 분석방법{GENE EXPRESSION SYSTEM FOR MASS PRODUCTION OF HEPATITIS C VIRAL RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE AND ENZYME ASSAY USING FUSION PROTEIN EXPRESSED THEREFROM}

C형 간염바이러스(Hepatitis C virus, 이하 HCV라고 약칭함)는 비 A형(nonA) 및 비 B형(non B) 간염을 유발하는 주요한 원인이 되는 바이러스이다. 이 바이러스에 감염되면 감염자의 10 내지 20 %가 급성 간염으로 발전하며 이 감염자들 중 80 내지 90%가 만성적 감염상태(chronic infection state)로 발전한다고 알려져 있다(Alter, H.J. et al.,N. Eng. J. Med, 321:1494-1500, 1989). HCV에는 세계적으로 1억 7 천만 인구가 감염되어 있는 것으로 보고되고 있으며, 특히 아프리카, 일본과 한국에는 전체 인구의 1.5 내지 2.0%가 만성 보균자이고, 새롭게 HCV에 감염되는 환자의 수가 매년 약 백만명 정도에 이르는 것으로 추정된다. HCV 감염에 의한 간염이 B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 의한 간염과 구별되는 주요한 특징은 만성간염의 가능성이 HBV 감염에 의한 경우보다 훨씬 높다는 것이다. HBV에 감염되지 아니하고 다른 원인으로 간경변 또는 간암을 앓고 있는 환자에게서 항-HCV 항체 형성률이 대조군에 비해 현저히 높다는 보고가 있었는데(Ikeda et al.,Hepatology, 18:47-53, 1993), 이 보고에 따르면 HCV 감염환자의 75%가 15년 후에 간암으로 진행된다고 하고 있는바 이는 HBV 감염시 간암으로 진행되는 확률이 27%인 것에 비해 훨씬 높은 것으로 지금까지 알려진 어떠한 발암제보다 암의 발병과 강한 상관관계를 갖고 있음을 보여주는 것이다.

HCV의 만성적 간염을 효과적으로 치료하기 위하여 α-인터페론(α-interferon)을 이용하고 있는데, 간염 환자에게 α-인터페론을 투여하는 경우 약 20%의 환자만이 그 치료 효과를 보인다고 보고된 바 있다(Hoofnagal, J.H.,And. Intern. Med., 39:241-275, 1994). α-인터페론이 세계적으로 가장 널리 사용되고 있는 HCV 치료제의 주된 유형이지만, 간경화 또는 간암으로 이행되는 비율이 높은HCV-1b형에는 그 효과가 낮아 HCV 감염에 의한 간염을 치료하는데는 문제점이 있다. 또한 최근에 인터페론-내성 서열(interferon resistance sequence)을 갖는 HCV에 대해서는 효과가 없는 것으로 보고되고 있다. 따라서, HCV 감염에 의한 간염에 대한 새로운 치료제 또는 치료방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

HCV는 플레비바이러스 과(flavivirus family)에 속하고, HCV의 게놈(genome)은 약 9.5kb 크기의 양성 단일 가닥 RNA(positive single strand RNA)로 구성되어 있다. 이 RNA는 하나의 ORF(open reading frame) 및 약 3000 개의 아미노산으로 구성된 다단백질(polyprotein) 형태로서 다른 종류의 10 여개 단백질에 대한 염기서열로 구성되어 있다. 단백질 합성에 중요한 약 340 뉴클레오티드(nucleotide, 이하 nt라고 약칭함) 이내의 5′UTR(untraslated region) 및 짧은 가변 부위-폴리피리미딘 트랙(short variable region-polypyrimidine tract)으로서 98 nt로 구성된 3′UTR이 포함되어 있다. 특히 상기 98 nt 3′UTR은 다양한 HCV에 매우 보존적인 염기서열이다.

상기 다단백질은 NH₃-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH 의 순서로 구성되어 있다. 즉 다단백질 상의 아미노 말단에는 바이러스의 뉴클레오캡시드(nucleocapside)와 외피(envelope)의 구성요소인 구조 단백질(structural proteins), C(core), E1, E2가 존재하고, 그의 카르복실 말단쪽에는 HCV가 증식하는데 필수적인 비구조 단백질들(nonstructural proteins), NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B가 위치하고 있다. 이 전구체 다단백질에 숙주세포내 시그날 프로테아제(signal peptidase) 및 바이러스내 단백질 분해효소인 NS2-3, NS3가 작용하여 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써 9개의 성숙 바이러스 단백질을 만들어 낸다. 구체적으로는 NH₃-C-E1-E2-p7-NS2 사이의 절단은 숙주 세포 프로테아제에 의해 절단되고, NS2-NS3 사이는 NS2와 NS3의 아미노 말단쪽 1/3로 구성된 메탈로프로테아제(metalloprotease)에 의해 자가분해(autocleavage)되며, 그 외 나머지 부분은 NS3 세린 프로테아제(serine protease)에 의해 절단된다.

이 중 NS5B 단백질은 RNA 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)의 보존적 GDD 모티프(GDD motif)를 가지고 있어, 양성 가닥(positive strand)으로부터 음성 가닥(minus strand)을 합성하고 이 음성 가닥를 주형으로 하여 바이러스 게놈을 합성하므로 바이러스 복제에 매우 중요한 성분이다. 상기 NS5B 단백질은 HCV RNA 게놈에 대한 특이성이 없으며 모노폴리머 RNA(monopolymeric RNA)를 주형으로 시발체-의존적(primer-dependent) 또는 시발체-비의존적(primer-independent)인 RNA 합성반응을 수행할 수 있다고 보고 되고 있다(Behren, S.E. et al.,EMBO J, 15:12-22, 1996; Luo, G. et al.,J. Virol., 74:851-863, 2000).

상기와 같은 HCV의 구조를 볼 때 새로운 형태의 치료제 또는 치료방법으로는AIDS 바이러스와 같은 RNA 바이러스의 경우와 같이 치료제로서 단백질 분해효소 또는 RNA 중합효소와 같은 단백질에 대한 저해제가 가장 효과적인 것임을 예상할 수 있다. 이러한 저해제를 개발하기 위해서는 저해 대상 물질의 활성을 신속하게 측정하는 방법이 정립되어야 할 것이며, 이러한 활성 측정 방법의 정립을 위해서는 저해 대상 물질의 활성에 대한 연구가 선행되어야 하는데 이러한 물질, 즉 상기 바이러스 단백질의 활성에 대한 생체외 연구가 충분히 이루어져야 하며 이를 위해서는 상기 바이러스 단백질을 활성형으로 대량생산하는 시스템의 구축이 요구된다.

NS5B 단백질 활성에 대한 생체외 연구는 재조합 NS5B 단백질(recombinant NS5B protein)을 사용하여 이루어졌는데, 예를 들어, 바큘로바이러스 벡터 기구(Baculovirusvector system)을 이용하여 곤충세포에서 재조합 NS5B를 발현하여 이 단백질이 RdRp 활성이 있음을 확인한 바 있고(Behren, S.E. et al.,EMBO J, 15:12-22, 1996), 또한 대장균에서 GST 융합을 이용해 봉입체(inclusion body) 형태로 발현시킨 바 있다(Yuan, Z.H. et al.,BBRC, 232:231-235, 1997). 이에 더 나아가 단백질의 용해도를 높이기 위해 NS5B의 카르복실 말단부의 높은 소수성을 가진 21개의 아미노산을 결실시킨 NS5B를 GST와 융합하여 30 ℃에서 재조합 대장균을 배양함으로써 수용성의 NS5B-GST 융합단백질 형태로서 발현시켜 1 mg/L 수율 수준으로 상기 단백질을 분리하는 기술이 보고되었다(Yamacita, T. et al.,J.Biol.Chem, 273:15479-15486, 1998). 상기와는 다른 방법으로 NS5B를 대장균에서 직접 발현(direct expression)시켜 봉입체 형태의 단백질을 리폴딩(refolding)시킴으로써 활성 단백질을 얻거나 극히 소량의 수용성 형태의 단백질을 분리하는 방법이 보고된 바 있다(Al, R.H. et al,Virus Res., 53:141-149, 1998; Ferrari, E. et al.,J. Virol., 73: 1649-1654, 1999).

상기한 종래의 재조합 NS5B 단백질 발현 시스템은 재조합 단백질 생산에 가장 많이 사용되는 대장균 발현 시스템을 이용하는 경우 발현 수준이 너무 낮으며, 특히 리폴딩을 해야하는 경우에는 최종적으로 얻어지는 단백질의 양이 매우 적어서 단백질의 구조 분석이나 스크리닝 시스템(screening system) 구축 등 생체외 연구에 있어 어려움이 많다.

상기한 바와 같이 HCV 복제에 필수적인 역할을 담당하고 있는 NS5B 단백질은 NS3 세린 프로테아제(serine protease)와 더불어 중요한 항바이러스제 개발의 대상 물질이다. 특히, HCV는 생체외 세포 배양(in vitro cell culture)이 안되고 적당한 동물 모델(animal model)이 없으므로, 상기 단백질의 생화학적 성질을 이용하여 생체외 분석 시스템 또는 스크리닝 시스템을 확립하는 것은 더욱 큰 의미를 갖고 있다. 이와 같은 시스템의 확립이 가능하기 위해서 활성을 가지고 있는 대상 단백질인 NS5B 단백질을 다량 확보하는 것이 가장 중요한 관건이다.

한편, 본 발명자들은 종래의 재조합 단백질 발현벡터의 단점을 보완하여 불활성의 봉입체 형태로 발현되는 것을 최소화하고 수용성을 증가시켜, 활성이 매우우수한 형태로 단백질을 발현시키는 기구를 개발한 바 있는데, 구체적으로 대장균의 라이실-tRNA 중합효소(lysyl-tRNA synthetase, lysS)의 아미노 말단 154개 잔기를 융합짝으로 사용한 발현 벡터(pGE-lysN)를 제조하고 이를 이용하여 많은 단백질을 대장균에서 수용성으로 발현시키는데 성공한 바 있다(대한민국 특허출원 제96-44010호, 국제특허출원 PCT/KR97/00186).

이에 본 발명자들은 상기 발현벡터를 이용하여 HCV NS5B 단백질의 대량발현 시스템을 구축하고, 이에서 얻어진 단백질을 이용함으로써 상기 단백질 활성에 대한 생체외 분석 시스템을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 대장균 라이실-tRNA 중합효소의 아미노 말단부에 대한 유전자 및 C형 간염 바이러스의 NS5B의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자 컨스트럭트(gene construct)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트가 클로닝된 재조합 발현 플라스미드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

아울러, 본 발명은 상기 재조합 발현 플라스미드를 형질전환시킨 형질전환 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환 균주를 발현시켜 얻어지는 융합단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 발현된 융합단백질을 이용하여 RNA-의존성 RNA 중합효소의 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 재조합 발현 플라스미드 plysNβ-NS5B△의 제조과정을 나타낸 모식도이고,

도 2는 plysNβ-NS5B△의 개열지도를 나타낸 모식도이며,

lysN: 대장균 라이실-tRNA 중합효소의 아미노말단(154 aa)

GSGSGS: 글리신과 세린으로 이루어진 연결서열

H: 히스티딘

D4K: 엔테로키나아제 인식 부위(enterokinase recognition site)

NS5B△: 카르복실 말단 20 개의 아미노산 잔기가 제거된 HCV의 NS5B

도 3은 배양된 재조합 균주로부터 얻은 세포 분쇄물을 원심분리하여 얻은 세포 파쇄물 및 그 상층액을 SDS-PAGE한 결과이며,

레인 1: 단백질 크기 표지

레인 2 : HMS174(plysNβ-NS5B△) IPTG 유도, 총 세포 파쇄물

레인 3 : HMS174(plysNβ-NS5B△) IPTG 비유도, 총 세포 파쇄물

레인 4 : HMS174(plysNβ-NS5B△) IPTG 유도, 상층액

레인 5 : 분리 정제된 LysNβ-NS5B△

도 4는 LysNβ-NS5B△ 단백질의 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제(polyuridylylase) 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이며,

첫번째 막대: RdRp 활성에 대한 음성 대조군에 대한 결과

두번째 막대: 시발체로 올리고 dT 12-18를 사용한 경우

세번째 막대: 시발체로 올리고 dT 12-18를 사용하고, 리파마이신을

첨가한 경우

도 5는 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제 활성에 미치는 2가 양이온 Mg²⁺와 Mn²⁺의 농도에 따른 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이며,

도 6은 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제 활성에 미치는 온도의 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이며,

도 7은 LysNβ-NS5B△ 단백질 양에 따른 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제 활성을 나타낸 그래프이며,

도 8은 LysNβ-NS5B△ 단백질의 시간에 따른 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제 활성을 나타낸 그래프이며,

도 9는 LysNβ-NS5B△ 단백질의 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제 활성에 대한 반응 역학 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

a;고정된 값의 효소 농도에서 주형/시발체를 포화 농도로 고정시킨 반응에서 얻은 기질 UTP에 대한 Lineweaver-Burk 그래프

b;다양한 농도의 UTP 농도에서 초기 속도의 측정치

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 융합짝 단백질(conjugate protein), 연결 펩타이드(linker peptide), 히스티딘 표지서열(histidine tagging sequence), 단백질 가수분해효소 인지 부위, 제한효소 인지부위 및 C형 간염 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소(NS5B, 1773 bps)의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자 컨스트럭트(lys Nβ-NS5B)를 제공한다.

본 발명은 상기 융합짝 단백질로서 대장균의 라이실-tRNA 중합효소의 아미노 말단 도메인(lysyl-tRNA synthetase, 이하 lys N이라 약칭함)을 사용하며, 이 도메인은 상기 라이실-tRNA 중합효소내 아미노 말단의 1번부터 154번 까지의 아미노산을 포함하여 융합짝 단백질로 효과적이도록 구성된 것이다.

상기 연결 펩타이드로는 글리신(G)과 세린(S)의 올리고 펩타이드인 GSGSG(서열 번호 1)를 상기 lys N에 연결한다. 이러한 연결 펩타이드의 길이는 보다 길게 조절될 수 있다.

본 발명의 유전자 컨스트럭트는 생산되는 융합단백질의 정제 분리를 용이하게 하기 위하여 상기 연결 펩타이드 유전자 뒤 쪽에 표지서열을 포함한다. 이러한 표지서열로서는 바람직하게는 6 내지 10개의 히스티딘 표지 유전자를 이용할 수 있으며, 그외에 폴리아르기닌 등을 사용할 수 있다. 표지서열을 포함한 융합단백질은 다양한 친화 칼럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)를 이용하여 쉽게 분리된다.

또한, 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 발현된 융합단백질로부터 외래 단백질만을 용이하게 분리할 수 있도록 단백질 분해효소가 인지하는 절단 부위를 포함한다. 구체적으로 본 발명에서는 엔테로펩티다아제(enteropeptidase)의 인지서열인 DDDDKKK(D₄K₃;서열번호 2)을 히스티딘 표지서열 뒤 쪽에 포함한다. 상기 엔테로펩티다아제는 상기 인지 서열의 카르복시 말단을 절단한다.

상기 단백질 절단부위 뒤 쪽에는 외래단백질의 클로닝을 유리하게 하는 제한효소 인지서열을 삽입한다. 상기 제한효소 인지서열로서는 모든 종류의 제한효소 인지서열을 이용할 수 있으나, 구체적으로 본 발명에서는 상기 단백질 절단부위의 뒤 쪽에 Kpn I - Bam HI - Eco RI - Sal I - Hind III로 구성된 제한효소 인지서열을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 NS5B 전부를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 클로닝한 재조합 발현 플라스미드(plysNβ-NS5B)를 제공한다. 또한 보다 수용성이 큰 융합단백질을 발현하도록, 상기 NS5B의 일부 즉, HCV NS5B의 카르복실 말단의 소수성이 높은 20개의 아미노산에 대한 서열이 결실된 NS5B△를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 클로닝한 재조합 발현 플라스미드(plysNβ-NS5B△)를 제공한다(도 1및도 2 참조).

본 발명의 재조합 발현 플라스미드는 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 유전자 단편을 플라스미드 pGE-lys N(대한민국 특허출원 제96-44020호)에 삽입하여 제조된다. pGE-lys N는 T7 프로모터 및 lys N-히스티딘 6개 잔기-단백질 절단부위 서열(DDDDK)-제한효소 인지서열을 포함하는 재조합 플라스미드로서, 상기 lys N-히스티딘 6개 잔기-단백질 절단부위 서열(DDDDK)-제한효소 인지서열 위치에 상기 유전자 컨스트럭트를 삽입함으로써 본 발명의 재조합 발현 플라스미드를 제조할 수 있다(도 1참조).

상기와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 plysNβ-NS5B△를 대장균 HMS174(DE3)plysE에 형질전환시켜 얻어진 재조합 균주를 HMS174(plysNβ-NS5B△)로 명명하고, 상기 재조합 균주를 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2000년 7월 5일자로 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10193).

상기와 같이 제조된 재조합 균주를 배양하여 수용성의 융합단백질 LysNβ-NS5B△을 발현시켜 분리 정제하였으며(도 3참조), 발현된 융합단백질 LysNβ-NS5B△에 단백질 분해효소를 처리하여 NS5B 단백질만을 분리해낼 수 있다.

상기 LysNβ-NS5B△ 융합단백질 또는 NS5B 단백질의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp)의 활성을 측정하기 위해, 폴리 A를 주형으로, 올리고 dT를 시발체로 한 혼합 반응액에 첨가된 폴리우리디릴라제(polyuridylylase) 활성을 분석한 결과(도 4참조), 상기 효소의 활성에 필수적인 2 가 양이온에 대한 요구도에 대해서는 Mg²⁺5 mM 에서 최적 활성을, Mn²⁺의 경우 10 mM에서 최적의 활성을 보이나 Mg²⁺에서 보이는 최적활성의 62 %에 해당하는 활성을 보임을 확인하였으며(도 5참조), 최적 반응 온도는 30 ℃(도 6참조)이며, 효소반응 생성물의 양은 효소량(도 7참조) 및 반응시간(도 8참조)에 비례하여 증가함을 확인하였다. 일정 반응시간을 경과한 후에는 생성물의 양이 감소되는데, 이러한 현상은 상기 RNA 중합효소 단백질이 RNase에 의해 분해된 결과로 보여지며, 이러한 현상이 나타나는 시점은 주어진 효소반응 조건(반응 온도, 단백질의 양, RNase 저해제의 양)에서의 생성속도와 분해속도에 의해 결정된다. 또한 상기 효소는 시발체로서의 RNA에 대한 특이성은 보이지 않으며, 미카엘리스-멘텐 효소 반응 역학(Michaelis-Menten steady-state kinetics)을 조사한 결과, 45 μM의 Km 값을 가지는 것으로 나타났다(도 9참조).

본 발명은 상기와 같이 대량 발현된 융합단백질 또는 NS5B 단백질을 이용한 RNA-의존성 RNA 중합효소 활성 측정방법을 이용하여 상기 중합효소의 저해제로서 작용하는 항바이러스제를 스크리닝하는데에 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예1> plysNβ-NS5B△ 의 제조

HCV-3a형의 C형 간염 바이러스의 NS5B(1773 bps)를 pTrcHisA 벡터의 5′BamHI과 3′EcoRI 절단부위에 가지고 있는 플라스미드 pTrcHisA+NS5B를 주형으로 하여, 시발체 1(서열번호 3)과 시발체 2(서열번호 4)를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR로 약칭함)을 수행하여 5′- H4-D4K-NS5B-BamHI-3′를 포함하는 DNA 단편(단편 A)을 얻었다.

대장균의 라이실 tRNA 중합효소의 아미노말단의 154 잔기를 융합짝으로 사용하는 pGE-lysNβ를 pGE-lysN(대한민국 특허출원 제96-44010호)의 LysN과 히스티딘 표지(histidine tag)사이에 GSGSG를 삽입하고 히스티딘을 4 개 내지 6 개를 더 삽입하여 제조하여 이를 주형으로 사용하고 시발체 3(서열번호 5)과 시발체 4(서열번호 6)를 사용하여 PCR 증폭을 하여 5'-NdeI-LysN-GSGSG-H10-D4K-3'을 포함하는 단편(단편 B)를 얻었다.

상기 DNA 단편 A와 B를 각각 아가로스 겔에서 순수 분리 정제한 후 이 두 단편을 주형으로 하여 시발체 3(서열번호 5)과 시발체 2(서열번호 4)를 사용하여 융합 PCR 증폭을 수행하였다. 이렇게 얻은 생성물을 분리한 다음 제한효소 NdeI과 BamHI로 절단한 다음 pGE-lysN의 NdeI과 BamHI 절단부위에 클로닝하여 plysNβ-NS5B plasmid를 제조하였다.

상기 plysNβ-NS5B로 대장균 HMS174(DE3)pLysE를 형질전환시킨 후 발현시켜 발현 수준을 확인한 결과 발현수준이 낮았다. 이에 따라 보다 높은 발현율을 얻기 위해 하기와 같이 NS5B의 일부 유전자를 결실시킨 발현 플라스미드를 제조하였다.

NS5B의 카르복실 말단부의 20 개 아미노산을 제거한 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 상기 재조합 플라스미드 plysNβ-NS5B를 주형으로, 시발체 3(서열번호 3)과 시발체 5(서열번호 7)를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 다음 생성된 절편을 NdeI/BamHI으로 절단하고, pGE-lysN의 NdeI과 BamHI 절단부위에 클로닝하여 발현 플라스미드 plysNβ-NS5B△를 제조하였다. 제조된 plysNβ-NS5B△를 대장균 HMS174(DE3)plysE에 형질전환시켜 재조합 균주를 얻은 후 이를 HMS174(plysNβ-NS5B△)로 명명하고, 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2000년 7월 5일자로 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10193).

발현 벡터의 제조과정은도 1에 나타내었으며, plysNβ-NS5B△의 개열지도는도 2에 나타내었다.

<실시예 2> HCV NS5B△ 단백질의 발현 및 정제

상기 재조합 균주 HMS174(plysNβ-NS5B△) 단일 콜로니를 암피실린 (ampicillin) 50 μg/ml 및 클로르암페니콜(chloramphenicol) 30 μg/ml를 포함하는 LB 배지에 접종한 후 종자 배양(seed culture)시킨 다음 상기와 동일한 조성을갖는 LB 배지에 1/10 내지 1/50로 희석하고, 37 ℃에서 OD₆₀₀흡광도가 1일 때 IPTG를 1 mM로 첨가 후 4 시간 동안 동일한 온도로 배양하였다.

그후 세포를 원심분리한 다음 얼음에 30 분 동안 둔 다음 초음파 분해처리(sonication)하였다. 분쇄물을 12,000 g으로, 4 ℃에서, 25 분 동안 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리하였다. 먼저 상기 단백질의 발현 유무를 확인하기 위해서 총 세포 파쇄물(cell lysate), 상층액 그리고 침전물 일부를 취해서 2 × SDS 완충용액과 혼합한 후 2 분 동안 100 ℃에서 끓인 다음 6 % SDS-PAGE로 분리하여 코마시 염색액(Comassie dye)으로 염색한 다음 발색시켰다.도 3에서 보듯이, 37 ℃에서 배양한 결과 발현된 단백질은 수용성이었고, 발현 수준도 전체 수용성 단백질의 5 %로 높게 나타났다.

NS5B 단백질의 분리를 위해 상기 상층액에 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 30% 첨가하여 그외 다른 단백질들은 침전시키고 남은 상층액을 얻어서 50 mM NaPO₄(pH 6.8), 100 mM NaCl, 0.25 M 수크로오스, 10 % 글리세롤, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1 mM 수크로오스 모노라우레이트(sucrose monolaurate), 0.02 % 아자이드나트륨(NaAzide), 프로테아제 저해제로 구성된 b1 완충용액에 투석한 다음 UNO S6 칼럼(Biorad)으로 단백질 분획을 분리한 다음 암모늄 설페이트를 50 % 첨가하여 b1 완충용액에 녹인 후 Superdex 75 칼럼으로 젤 여과를 수행하여 NS5B 단백질을 얻었다.

<실시예 3> LysNβ-NS5B△ 융합단백질의 효소 활성 분석

LysNβ-NS5B△의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp)의 활성을 분석하기 위하여, 폴리 A(poly A, Pharmacia)을 주형으로, 올리고 dT 12-18(oligo dT 12-18, Pharmacia)를 시발체로 하는 폴리우리디릴라제(polyuridylylase) 활성 분석 시스템을 사용하여 병합되는 UTP의 양을 [³²P] UTP 양의 분석으로 측정하였다.

상기 효소활성 측정을 위한 표준 반응 조건은 다음과 같았다: 50 mM Hepes (pH 8.0), 25 mM KCl, 5mM MgCl₂, 1mM DTT, 1mM EDTA, 10μM UTP, 2.0 μCi [³²P] UTP, 50 ng/μl 악티노마이신 D(actinomycin D, Sigma), 20 μg/ml 리파마이신(rifamycin, Sigma), 20 U RNasin(Gibco-BRL), 0.5 μg 순수정제된 LysNβ-NS5B△, 100 μg/ml 폴리 A, 25 μg/ml 올리고 dT 12-18의 조성을 가진 20 μl의 반응액을 30 ℃에서 60 분간 반응시켰다. 이 반응액에 EDTA를 최종 농도 10 mM가 되도록 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 반응액 전체를 DE81 여과원판(DE81 filter disc, whatman)에 얹어 공기 중에서 말렸다. 이 원판들을 0.5 M Na₂HPO₄용액에서 3번, DW에서 1번, 100% 에탄올에서 1번 씻어 공기 중에서 말린 후 액체 신틸레이션 분석기(liquid scintillation analyzer, PACKARD)에서 방사성 활성(radioactivity)를 측정하였다.

또한, 폴리 A-의존성 폴리우리디릴라제(poly(A)-dependent polyuridylylase) 활성에 대한 음성 대조군(negative control)으로 올리고 dT 12-18를 올리고 dA 12-18로 대체하여 반응액을 조성하여 사용하였으며, RdRp 활성에 대한 양성 대조군(positive control)으로E.coliRNA 중합효소의 RdRp 활성을 이용하였다.

LysNβ-NS5B△에 대한 효소 활성 분석을 위하여 이를 호주 BRI에서 생산, 정제하여 4 ℃, 수용액 상태로 운반된 단백질을 이용하였다. 수개월 동안의 간헐적인 활성 측정을 통하여 이 단백질은 4 ℃, 수용액 상태에서 수개월간 효소 활성을 유지함을 알 수 있었다. 효소 활성 분석에는 합성 주형 및 시발체인 폴리 A, 올리고 dT 12-18를 각각 사용하였으며, RNA-의존성 RNA 중합효소에서 유래된 cpm 값만을 측정하고자 상기 효소 반응액에 DNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 저해제로서 악티노마이신 D를,E.coli에서 유래한 RNA 중합효소에 대한 저해제로서 리파마이신을 첨가하였다. 또한 별도로 시발체를 올리고 dA 12-18로 대체한 반응액을 준비하여 RdRp 이외의 다른 UTP 병합 활성을 가진 단백질에 의한 cpm 값을 보정하였다. 그 결과 시발체를 올리고 dA 12-18로 대체한 반응액에서는 단백질이 없는 반응에 해당하는 cpm치가 검출된 반면, 올리고 dT 12-18를 사용한 반응에서는 RdRp 활성에 대한 대조군인E.coliRNA 중합효소의 활성에 미치는 cpm치가 검출되었다. 한편 리파마이신이 첨가되고 시발체로 올리고 dT 12-18가 사용된 반응액내에서는E.coliRNA 중합효소는 그 활성을 거의 100% 저해 받는 반면, LysNβ-NS5B△ 활성은 전혀 변화를 보이지 않았다(도 4). 이를 통하여 LysNβ-NS5B△의 활성은 오직 HCV RdRp활성으로부터 유래되었음을 알 수 있었다.

또한, 미카엘리스-멘텐 효소 반응 역학(Michaelis-Menten steady-state kinetics)을 조사하기 위해 기질 UTP에 대한Km값을 측정하였는데, 효소량을 0.5 μg으로 고정하고 UTP 이외의 기질인 폴리 A, 올리고 dT 12-18에 대해서는 그 양을 주어진 효소량에 대해 포화되도록 각각 2 μg, 0.5 μg으로 고정하여 사용하였다. UTP 농도는 0.8 μM 내지 30 μM의 범위 내에서 5 개 지점을 잡아 사용하였다. 사용한 반응 조건에서 생성물의 양은 반응 시간 10 내지 60 분내에서 비례적인 증가를 보였으므로 각 UTP농도에서의 초기 속도는 반응 시간 20 분에서의 값을 사용하였다.

상기와 같은 효소활성의 분석 결과는도 5 내지 도 9에 나타내었다.

본 발명의 NS5B 단백질의 발현 기구에 의하면 수용성 형태로 활성을 가진 NS5B 단백질을 높은 수준으로 얻을 수 있으며, 이를 이용한 생체외 분석 시스템을 구축할 수 있다. 또한 본 발명의 생체외 분석 시스템은 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제로서 특정의 단백질 특히, NS5B 단백질의 활성 저해제의 신속한 스크리닝에 이용될 수 있으므로, C형 간염 바이러스의 감염에 의한 간염 환자의 치료 및 예방에 유용한 치료제 또는 치료방법을 개발하는데 매우 효과적으로 이용가능하다.

Claims

융합짝단백질, 연결 펩타이드, 히스티딘 표지서열, 단백질 가수분해효소 인지 부위, 제한효소 인지부위 및 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus)의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, NS5B, 1773 bps)의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
제 1항에 있어서, 상기 융합짝 단백질은 대장균 라이실-tRNA 중합효소(lysyl-tRNA polymerase)의 아미노 말단에 위치한 1번부터 154번까지의 아미노산 도메인인 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
제 1항에 있어서, 상기 NS5B의 일부는 카르복실 말단에 위치한 20개의 아미노산이 제거된 NS5B△인 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
제 1항의 유전자 컨스트럭트를 포함하며, T7 프로모터 및 표지 유전자로서 항생제 유전자를 포함하는 재조합 발현 플라스미드.
제 4항에 있어서, 도 2의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 플라스미드 plysNβ-NS5B△.
제 5항의 재조합 발현 플라스미드가 형질전환된 미생물 형질전환체.
제 6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 대장균 형질전환체 HMS174(plysNβ-NS5B△)(수탁번호: KCCM 10193).
제 7항의 형질전환체로부터 발현되는 C형 간염 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소의 활성을 갖는 융합단백질 LysNβ-NS5B△.
제 8항의 융합단백질, 주형, 시발체, DNA-의존성 RNA 중합효소 활성 저해제 및 UTP를 포함하는 혼합 반응액을 이용하여 폴리우리디릴레이즈(polyuridylylase)의 활성을 측정하는 RNA-의존성 RNA 중합효소 활성 측정방법.
제 9항에 있어서, 상기 주형은 폴리 A(poly A)인 것을 특징으로 하는 RNA-의존성 RNA 중합효소 활성 측정방법.
제 9항에 있어서, 상기 시발체는 올리고 데옥시티미딘(oligodeoxythymidine)인 것을 특징으로 하는 RNA 중합효소 활성 측정방법.