KR100241268B1

KR100241268B1 - C형 간염 바이러스의 단백질분해효소의 변형체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100241268B1
Application number: KR1019970059161A
Authority: KR
Inventors: 박천길; 김은경; 오영림; 양재영; 민창희
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-11-11
Filing date: 1997-11-11
Publication date: 2000-02-01
Also published as: KR19990039173A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, 이하 ″HCV″로 약칭함)의 비구조단백질 4A를 HCV 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3의 아미노말단에 결합시킨 융합 단백질분해효소 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 단백질 분해효소의 활성화에 관여하는 비구조단백질 4A의 일부를 HCV 의 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3의 아미노 말단에 융합시킨 단백질분해효소 단백질, 그의 아미노산 서열 및 그를 암호하는 염기 서열 그리고 상기 재조합 단백질을 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 HCV 에서 유래한 융합 단백질분해효소를 대장균에서 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 단백질분해효소는 단백질 구조형성에 도움이 되는 비구조단백질 4A의 일부만을 포함하므로 그 크기가 작고 정제가 용이하며 비구조단백질 4A 가 비구조단백질 3 의 아미노 말단과 더욱 인접하게 존재하게 됨으로 그 활성이 증대되어 HCV 의 증식 억제제 등을 탐색·선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 단백질분해효소의 변형체 및 그의 제조방법

본 발명은 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, 이하 ″HCV″로 약칭함)의 비구조단백질 4A를 HCV 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3의 아미노말단에 결합시킨 신규한 융합 단백질분해효소 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 단백질 분해효소의 활성화에 관여하는 비구조단백질 4A의 일부를 HCV 의 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3의 아미노 말단에 융합시킨 단백질분해효소 단백질, 그의 아미노산 서열 및 그를 암호하는 염기 서열 그리고 상기 재조합 단백질을 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 HCV 에서 유래한 융합 단백질분해효소를 대장균에서 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 단백질분해효소는 단백질 구조형성에 도움이 되는 비구조단백질 4A의 일부만을 포함하므로 그 크기가 작고 정제가 용이하며 비구조단백질 4A 가 비구조단백질 3 의 아미노 말단과 더욱 인접하게 존재하게 됨으로 그 활성이 증대되어 HCV 의 증식 억제제 등을 탐색·선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.

C 형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, 이하 ″HCV″로 약칭함)는 비 A 형 또는 비 B 형 간염을 유발하는 것으로 알려진 간염의 주요 원인이 되는 바이러스로서, 사람에 침입하여 급성 또는 만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여한다고 한다 (Alter, H. J. et al., 1989, N. Eng. J. Med, 321 : 1494-1500). 현재 HCV 는 전세계 대륙에 감염환자가 분포되어 있으며 특히 아프리카, 일본 및 한국에는 전체인구의 1.5-2.0 %가 만성 보균자인 것으로 알려져 있다.

HCV 의 감염에 의한 간염이 B 형 간염 바이러스(HBV)에 의한 간염과 구별되는 주요한 특징은 만성간염의 가능성이 HBV 감염에 비하여 훨씬 높다는 것이다. HCV 에 의한 비 A 형 또는 비 B 형 간염 환자들 중 약 40-50% 는 간염이 진전되어 만성 간염 환자가 되고, 약 20% 정도는 더욱 진전되어 간경변 또는 간암 환자가 되는 것으로 알려져 있다 (Dienstag, J. L., 1986, Semin. Liver. Dis, 6 : 67-81). 또한 HCV 에 감염되지 않고 간경변 또는 간암을 앓는 환자의 항-HCV 항체 형성율이 대조군보다 훨씬 높다고 알려져 있다(Ikeda et al., 1993). 이 조사에 의하면 HCV 감염환자의 75% 가 15년후에 간암으로 진행된 것으로 나타났다. 이는 HBV 감염에 의한 간암 발생율인 27% 보다 훨씬 높은 수치이며 지금까지 알려진 어느 발암제보다 강한 상관관계를 갖는 것이다.

현재 HCV 에 대해서는 진단시약이 개발되어 수혈에 의한 감염은 어느 정도 방지가 가능하게 되었지만 아직 백신이 개발되어 있지 않아서 수혈이외의 경로를 통한 감염위험은 남아있는 상태이다. 그리고 감염후 6개월 이상의 시간이 지나야만 진단시약으로 혈액내의 항체감지가 가능하므로 HCV 에 감염된 이후부터 6개월 이내의 혈액은 수혈에 사용될 수 있고, HCV 감염자의 약 10% 는 항체가 발견되지 않으므로 이 그룹의 간염환자의 혈액도 수혈에 사용될 수 있어 여전히 수혈에 의한 감염 위험성이 존재한다.

HCV 의 만성적인 감염을 효과적으로 치료하기 위한 보편적인 치료법은 아직까지 개발되어 있지 않고, 거의 유일하게 인터페론-알파를 치료제로서 투여하는 것이 시행되고 있으나 최근들어 인터페론 내성서열(Interferon resistance sequence)을 갖는 HCV 에 대해서는 효과가 없는 것으로 나타나고 있어 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있는 상황이다. AIDS 바이러스와 같은 RNA 바이러스의 경우에서 처럼 바이러스 증식에 필요한 단백질분해효소나 RNA 중합효소 같은 단백질에 대한 저해제 등의 개발이 가장 효과적인 치료방법으로 예상될 수 있다.

HCV 는 비 A 형 또는 비 B 형 간염환자의 혈장을 침팬지에 접종시켜 분리함으로써 회수할 수 있다 (Bradley, D. W. et al., 1988, Gastroenterology, 88 : 773-779). 이렇게 얻어진 HCV 는 9400 염기로 이루어진 양성가닥 리보핵산 형태의 유전자를 가지고 있으며, 이로부터 3010-3033 개의 아미노산으로 이루어지는 다단백질 (polyprotein)을 만들어 낸다 (Choo, Q. L. et al., 1989, Science, 244 : 359-362 ; Choo, Q. L. et al., 1991, PNAS, 88 : 2451-2455). 상기와 같은 유전자 구조를 고려할 때 HCV 는 플래비바이러스 (flaviviruses) 또는 페스티바이러스 (pestiviruses)와 유사하므로, HCV 는 플래비비리대 (Flaviviridae)에 속하는 새로운 속 (genus)으로 분류되었다 (van Doorn, 1994, review. J. Med. Virol, 43 : 345-356).

HCV 의 다단백질은 아미노 말단으로부터 Core-E1-E2-NS2-NS3 -NS4A-NS4B-NS5A-NS5B의 순서로 구성되어 있다. 즉, 다단백질상의 아미노 말단에 바이러스의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)와 외피 (envelope)의 구성요소인 구조 단백질 (core, E1, E2)이 존재하고, 그의 카복시 말단 쪽에는 HCV 가 증식하는데 필수적인 비구조 단백질들 (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)이 위치하고 있다. 이 다단백질은 세포내 시그날 펩티다제 (signal peptidase) 및 바이러스에 존재하는 단백질 분해효소인 비구조 단백질 2-3 단백질 및 비구조 단백질 3 단백질이 작용하여 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써 9개의 숙성된 바이러스 단백질을 만들어 낸다. 구체적으로 비구조 단백질 2-3 단백질은 비구조 단백질 3 의 아미노말단 부위를 절단하고 비구조 단백질 3 단백질은 비구조단백질 4A, 4B, 5A, 5B 등을 유리시키는데 관여한다 (Hijikata, et al., 1991, PNAS, 88 : 5547-5551 ; Bartenschlarger, et al., 1994, J. Virol, 68 : 5045-5055 ; Grakoui, et al., 1993, J. Virol, 67 : 1385-95 ; Tomei, et al., 1993, J. Virol, 67 : 4017-4026).

비구조단백질 3은 아미노말단에서 1/3 부위에 단백질 분해활성이 있고 나머지 부분에 헬리케이즈(helicase) 활성이 있어 따로 발현을 시켰을 때 세포외 조건(in vitro)에서 각각의 활성을 갖는다(D'Souza et al., 1993, J.Gen.Virol. 76, 1729-1736). 또한 비구조단백질 3 은 아미노산 서열 57번에 히스티딘, 81번에 아스파테이트 그리고 139번에 세린이 존재하여 트립신-유사 세린 단백질분해효소(tripsin-like serine proteinase)가 갖는 전형적인 활성부위(catalytic motif)를 가지고 있고 이것은 지금까지 발견된 수많은 HCV 의 변종에서도 완벽하게 일치하고 있다. 그러나 비구조단백질 3 단백질은 몇가지 면에서 트립신-유사 세린 단백질분해효소와 구분이 되는데 첫번째로 헬리케이즈 단백질과 연결되어 있고, 두번째로 그의 활성에 아연(Zinc)과 같은 2가 금속이온을 필요로 하고, 세번째로 분해효소 활성을 나타내는데는 비구조단백질 4A 가 주요인자로 관여한다는 것이다.

비구조단백질 3 다단백질은 아미노 말단의 약 180개 아미노산으로 구성된 펩타이드만으로도 분해효소 활성을 나타낸다고 밝혀져 있고(Raffaele D. F. et al., 1996, Biochemistry 35, 13282-13287), 비구조단백질 4A 가 있고 없음에 따라 그 활성도가 크게 차이가 난다는 것이 알려졌는데 비구조단백질 3과 비구조단백질 4A 가 서로 작용하여 분해효소 활성을 갖는 단백질 구조를 형성하도록 도움을 준다는 것이다(Hijikata et al.,1993, J. Virol. 67, 4665-4675).

비구조단백질 3의 아미노 말단의 180개 정도의 아미노산만으로 구성된 펩타이드만을 발현시켜 정제한 단백질의 경우 낮은 농도에서는 비구조단백질 4A 가 약 1000-2000 배 높은 농도로 존재하여야만 최상의 활성도(Vmax)를 보인다는 것이 밝혀졌는데, 이는 비구조단백질 4A 가 낮은 농도로 존재할 때는 비구조단백질 3 - 비구조단백질 4A 의 복합 단백질분해효소가 아주 낮은 농도의 활성구조로 존재함으로써 전체 반응속도가 늦고 비구조단백질 4A 가 높은 농도로 존재할 때는 복합 단백질분해효소가 대부분 활성구조로 존재하여 높은 반응속도를 보인다는 것이다.

비구조단백질 4A 는 전체로 54개의 아미노산으로 구성되는데 그중 아미노산 번호 21-34 서열이 단백질분해효소를 활성구조로 형성하는데 가장 중요하다고 알려져 있다. 이러한 이유로 하여 활성구조를 갖는 단백질분해효소를 얻기위해 비구조단백질 3 의 일부 혹은 전부에 비구조단백질 4A 의 일부 혹은 전부를 차례대로 융합하여 발현시키는 시도가 이루어졌다.

또한 단백질의 3차 구조 형성 혹은 수용성 비율을 높이기 위해 아미노 말단쪽에 다른 단백질, 예를 들어 글루타티온 에스-트란스퍼라아제(GST) 혹은 말토스 결합 단백질(maltose binding protein)을 융합시키거나 (Akiko Mori et al.,1996, FEBS Letter 378, 37-42), 아미노말단 혹은 카르복시 말단에 히스티딘 텍(Histidine Tag)를 붙이기도 하였다. 그러나 어느 경우에서나 비구조단백질 3 과 비구조단백질 4A 의 배열은 HCV 제놈상에 나타난 그 순서대로 융합하였다.

김 등이 비구조단백질 3 단백질분해효소와 비구조단백질 4A 가 활성 구조를 이룬 복합(complex)단백질의 결정(crystal) 구조를 밝힘으로써 비구조단백질 4A 가 비구조단백질 3 상의 어떠한 위치에 옴으로써 비구조단백질 3 의 활성 구조 형성에 기여하는지를 보여주었는데, 그 구조를 자세히 살펴보면 실제 비구조단백질 4A 는 비구조단백질 3 의 아미노 말단 부위와 더 인접합 곳에 위치함을 알 수 있다(J.L.Kim, et al.,1996, cell 87, 343-355).

이에 본 발명자들은 HCV 의 감염을 치료하기 위한 바이러스 증식억제제나 단백질분해효소 저해제 등을 검색하는데 효과적인 단백질분해효소를 개발하기 위하여, 비구조단백질 4A 를 비구조단백질 3 의 분해활성을 가지는 아미노 말단 부위와 더 인접한 곳에 위치할 수 있도록 원래의 HCV 제놈서열과는 반대로 비구조단백질 4A 를 181개 아미노산으로 구성된 비구조단백질 3 단백질 분해효소의 아미노말단 절편에 결합시켜 대장균에서 발현시킴 다음 그 활성도를 단백질 분해 반응속도를 측정하여 알아본 결과 본 발명의 융합 단백질분해효소는 원래의 비구조단백질 3 단백질분해효소에 비하여 탁월한 활성도를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 비구조단백질 4A 를 HCV 의 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3의 아미노 말단에 융합시킨 단백질분해효소 단백질, 그의 아미노산 서열 및 그를 암호하는 염기 서열 그리고 상기 재조합 단백질을 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 HCV 에서 유래한 융합 단백질분해효소를 대장균에서 얻는 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1 은 본 발명의 발현 벡터 pET NS4aS7HCP6H 로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)이 생산하는 C형 간염 바이러스 유래의 융합 단백질분해효소를 분리·정제하여 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : 표준 분자량 표지 단백질

레인 2 : 용출된 단백질

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HCV 의 비구조단백질 4A 가 HCV 의 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3의 단백질분해활성을 가진 아미노말단 절편에 결합되어 단백질 분해활성이 증가된 융합 단백질분해효소를 제공한다. 구체적으로 상기 융합 단백질분해효소는 단백질의 정제를 용이하게 하는 히스티딘 아미노산을 비구조단백질 3 의 아미노말단 절편의 하류에 포함할 수 있으며 또한 상기 융합 단백질분해효소의 구조적 유연성(flexiblilty)을 높여주는 아미노산 링커(linker)를 비구조단백질 4A 펩타이드와 비구조단백질 3 아미노 말단 절편 사이에 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 융합 단백질분해효소를 암호하는 cDNA 유전자를 제공한다. 구체적으로 비구조단백질 4A 와 비구조단백질 3 아미노말단 절편 사이에 링커가 삽입된 융합 단백질분해효소를 암호하는 cDNA 유전자는 서열 4의 염기서열을 가지고, 링커가 삽입되지 않은 융합 단백질분해효소를 암호하는 cDNA 유전자는 서열 4의 염기서열에서 염기번호 73-93 서열이 제거된 cDNA 유전자를 가진다.

또한 본 발명은 융합 단백질분해효소를 대장균에서 생산하는 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 상기 링커가 포함된 융합 단백질분해효소를 생산하는 발현벡터는 pET NS4aS7HCP6H 이고 링커가 포함되지 않은 융합 단백질분해효소를 생산하는 발현벡터는 pET NS4aHCP6H 이다.

또한 본 발명은 상기 발현벡터 pET NS4aS7HCP6H 와 pET NS4aHCP6H 를 대장균 BL21(DE3) 에 형질전환시킨 대장균 형질전환체(수탁번호:KCTC 0397 BP) 와 대장균 형질전환체(수탁번호:KCTC 0396 BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 융합 단백질분해효소의 발현을 유도하고 이로부터 조세포 용출액을 얻어 히스티딘 친화 크로마토그래피를 수행하여 상기 융합 단백질 분해효소를 얻는 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명에서 얻은 융합 단백질분해효소 단백질은 바이러스의 증식억제제 및 단백질분해효소 제해제를 탐색·선별하는데 사용할 수 있고, 이를 응용하면 HCV 에 의한 간염, 간경화 및 간암 등의 효과적인 치료제를 개발할 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 HCV 의 비구조단백질 4A를 HCV 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3 의 아미노말단 부위에 결합시킨 융합 단백질분해효소를 제공한다.

이 때 단백질분해효소의 구조형성에 도움을 주는 비구조 단백질 4A 를 비구조단백질 3 의 아미노말단 절편의 앞쪽에 결합시키면, 비구조단백질 4A 가 비구조단백질 3 의 아미노 말단 절편과 인접합 곳에 위치하여 활성구조를 만들어 줌으로써 높은 단백질 분해활성을 보인다.

구체적으로 상기 융합 단백질분해효소의 비구조단백질 4A 는 54개 아미노산 전부 혹은 그 중 일부를 포함할 수 있는데 이 때 비구조단백질 4A의 아미노산 서열중 단백질 분해활성을 보이는데 필요한 최소 21-35 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

비구조단백질 3의 아미노 말단 부위는 단백질 분해활성을 갖는 아미노산번호 1-170 서열을 포함하고 최대로 1-300 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 비구조단백질 4A 펩타이드의 서열중 21번째부터 41번째까지의 21개의 아미노산을 메티오닌(Methionine)과 두 개의 염기성 아미노산인 라이신(Lysine) 다음에 위치시키고, 비구조단백질 3 의 전체 단백질중 아미노말단에서 181개 까지의 아미노산을 연결시켰다. 따라서 비구조단백질 3-비구조단백질 4A 의 순서를 가진 야생형 단백질분해효소보다 그 크기가 줄어들어 정제가 용이하다

또한 본 발명은 히스티딘 표지를 비구조단백질 3의 아미노말단 절편의 하류에 결합시킨다. 구체적으로 본 발명에서는 비구조단백질 3 아미노 말단 절편 1-181 서열 다음에 2개의 글라이신, 세린 아미노산을 넣어주고 6개의 히스티딘 아미노산을 연결시켰다.

또한 본 발명은 상기 융합 단백질분해효소 단백질의 구조적 유연성(flexiblilty)을 높여주는 아미노산 링커(linker)를 비구조단백질 4A 펩타이드와 비구조단백질 3 아미노말단 절편 사이에 삽입한다. 구체적으로 본 발명에서는 글라이신(Glysine)과 세린(Serine)으로 구성된 7개의 아미노산을 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 순으로 포함하는 링커를 사용한다.

본 발명은 상기 HCV 의 비구조단백질 4A 를 단백질 분해활성을 가진 비구조단백질 3 의 아미노 말단 절편의 상류에 결합시킨 융합 단백질분해효소의 유전자 및 그 염기서열을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 융합 단백질분해효소의 유전자를 얻기 위하여, 한국형 C형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 서열 1과 서열 2의 시발체및 서열 3의 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행한다.

이 때 서열 1의 시발체 1은 클로닝의 편이를 위하여 5'-말단에 NdeI제한 효소 인지부위를 포함하는 72개의 염기로 구성된 NS4aHCP-1로서 메티오닌-라이신-라이신 염기서열과 비구조단백질 4A 의 21-38 아미노산서열을 암호하는 염기서열을 포함하고, 서열 2의 시발체 2는 65개의 염기로 구성된 NS4aHCP-2로서 비구조단백질 4A 의 35-41 아미노산서열과 링커부위의 아미노산서열 그리고 비구조단백질 3의 1-7 아미노산 서열을 암호하는 염기서열을 포함하며, 서열 3의 시발체 3은 융합 단백질분해효소의 카복시말단 염기와 상보적인 서열로서 5'-말단에 클로닝의 편이를 위해 Sal I제한 효소 인지 부위와 번역 종료코돈을 포함하는 60개의 염기로 구성되어 있는 HCPH6Sal이다.

상기 과정으로 얻은 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소의 유전자를 pET 벡터에 삽입하여 본 발명의 발현 벡터를 제조한다.

본 발명의 발현 벡터를 pET NS4aS7HCP6H 로 명명하고 이를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 그 형질전환체를 1997년 11월 4일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0397 BP).

핵산 서열 자동분석기를 이용하여 본 발명의 발현 벡터 pET NS4aS7HCP6H 에 클로닝된 유전자의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로 상기 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소 유전자는 서열 5의 염기서열을 갖는다.

융합 단백질분해효소의 구성 성분중 링커 아미노산은 생략하여도 단백질 분해활성을 갖는다. 따라서 본 발명은 HCV 의 비구조단백질 4A 펩타이드와 비구조단백질 3 의 아미노말단 절편 사이에 링커를 포함하지 않는 융합 단백질분해효소의 유전자 및 그 염기서열을 제공한다.

구체적으로, 링커를 포함하지 않는 융합 단백질분해효소의 유전자를 얻기 위하여 한국형 C형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 서열 1과 서열 3 및 서열 4의 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행한다. 이 때 시발체 4는 44개의 염기로 구성된 NS4aHCP-3로서 비구조단백질 4A 의 35-41 아미노산서열과 비구조단백질 3의 1-7 아미노산 서열을 암호하는 염기서열을 포함하며, 시발체 2가 포함하는 링커부위의 염기서열은 포함하지 않는다.

상기 과정으로 얻은 링커를 포함하지 않는 융합 단백질분해효소의 유전자를 제한효소 Nde I, Sal I로 절단하고 pET 벡터에 삽입하여 본 발명의 발현 벡터를 제조한다.

상기 발현 벡터를 pET NS4aHCP6H 로 명명하고 이를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 그 형질전환체를 1997년 11월 4일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0396 BP).

핵산서열 자동분석기를 이용하여 상기 발현 벡터 pET NS4aHCP6H 에 클로닝된 유전자의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로 상기 링커를 포함하지 않는 융합 단백질분해효소 유전자의 염기서열은 서열 5에서 염기번호 73-93 이 제거된 서열과 같다.

또한 본 발명은 상기에서 제조한 발현벡터 및 형질전환체를 이용하여 본 발명의 융합 단백질분해효소를 얻는 제조방법을 제공한다.

구체적으로 상기 대장균 형질전환체를 배양하고 단백질의 발현을 유도한 다음 상기 융합 단백질이 발현된 대장균 세포를 파쇄하여 조세포 용출액을 얻는다.

상기에서 제조한 융합 단백질분해효소는 카복시말단에 6개의 히스티딘을 포함하므로 히스티딘 표지 친화 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리·정제한다. 이 때 용출용매로는 이미다졸 농도구배를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 의하여 약 24 KDa (링커가 포함된 단백질), 혹은 약 23 KDa (링커가 포함되지 않은 단백질) 크기의 융합 단백질이 합성되었음을 확인하였다(도 1 참조).

상기에서 분리·정제한 융합 단백질분해효소의 분해활성도를 형광기질을 사용하여 확인하였다. 구체적으로 형광기질은 10개의 아미노산 4A/4B 펩티드의 아미노말단에 크로모퍼인 DABCYL{ 4-(4-다이메틸 아미노페닐아조) 벤조일 [4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoyl]}기를 카복시말단의 곁가지에 형광기인 EDANS{ 5(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌 술폰산 [5-(2-aminoethylamino)-1-naphthalene sulfonic acid]}기를 함유하고 있어서 기질이 분해되면 공명 에너지 전이효과가 중단됨으로 형광현상이 증가하는데, 이를 형광 분광기를 이용하여 기질의 분해 속도를 측정한다.

본 발명의 융합 단백질분해효소는 HCV 의 치료제로서, 단백질 분해 효소 저해제를 개발하는데 수많은 저해제 후보물질의 검색(screening)에 용이하며비구조단백질 3 단백질과 비구조단백질 4A 펩타이드 사이의 상호 결합관계를 규명하는 기초 자료를 제공할 수 있으며, 또한 본 발명의 융합 단백질분해효소 단백질의 아미노산서열을 이용하여 세포외 조건(in vitro) 상에서 세포를 이용한 분석 시스템(assay system)을 만들 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 중합효소 연쇄반응용 시발체 합성

본 발명의 융합 단백질분해효소의 유전자를 얻기 위하여, 핵산 합성기(DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc. Model 394)를 이용하여 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4의 시발체를 합성하였는데 이는 기존의 한국형 HCV 의 DNA 염기서열(대한민국 특허출원 제 91-9510 호 및 제 91-13601 호)을 참고로 한 것이다.

〈실시예 2〉 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소 유전자의 클로닝

링커를 포함하는 융합 단백질분해효소의 유전자를 증폭하기 위하여, Taq 핵산 중합 효소 연쇄반응을 이용하였는데 그 주형으로는 본 발명자의 선행 특허인 ″한국형 C형 간염 진단시약 및 백신″(한국 특허출원 제91-9510호 및 91-13601호)에서 언급하였던 한국형 바이러스 유전자 DNA를 사용하였다.

상기 바이러스 유전자 DNA 10ng, 0.75μg 의 NS4aHCP-2 시발체, 0.75μg의 HCP6HSal 시발체에 10배 농축 반응 완충용액(500mM KCl, 100mM 트리스-HCl(pH 9.0, 25℃), 1.0% 트리톤 X-100) 10μl, 25mM MgCl₂6μl 및 10mM dNTP 2μl를 넣고 증류수를 이용하여 최종부피가 100μl이 되도록 맞춘 다음 Taq 중합효소(5U/μl, Perkin-Elmer Cetus, USA) 0.4μl를 첨가하여 반응액을 만들었다. 반응액을 사용하여 중합 효소 연쇄반응(94℃, 1분 30초; 50℃, 1분; 72℃, 1분 30초)을 25회 반복하여 수행한 결과 약 621 염기쌍의 유전자가 증폭되었다.

이를 다시 주형으로 하고 주형 10ng, 0.75μg 의 NS4aHCP-1 시발체, 0.75μg의 HCP6HSal 시발체에 10배 농축 반응 완충용액(500mM KCl, 100mM 트리스-HCl(pH 9.0, 25℃), 1.0% 트리톤 X-100) 10μl, 25mM MgCl₂6μl 및 10mM dNTP 2μl를 넣고 증류수를 이용하여 최종부피가 100μl이 되도록 맞춘 다음 Taq 중합효소(5U/μl, Perkin-Elmer Cetus, USA) 0.4μl를 첨가하여 반응액을 만들었다. 반응액을 사용하여 2번째 중합 효소 연쇄반응(94℃, 1분 30초; 50℃, 1분; 72℃, 1분 30초)을 25회 반복하여 수행함으로서 전체 681 염기쌍의 핵산을 얻었다.

상기 681 염기쌍의 핵산을 정제한 후 Nde I, Sal I 제한 효소로 절단하고 그 절편을 순수 분리하였다. 이 절편을 pET11c (New England Biolab) 의 Bam HI 인지부위 앞에 Sal I 인지부위를 첨가시킨 변형벡터 pET 의 Nde I, Sal I 부위에 클로닝하여 본 발명의 발현벡터 pET NS4aS7HCP6H 를 얻었다.

〈실시예 3〉 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소 유전자의 염기서열 결정

상기 실시예 2에서 클로닝된 발현 pET NS4aS7HCP6H의 유전자는 Taq 핵산 중합 효소를 이용하는 DNA 염기서열 분석 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Part # 402079, Perkin Elmer, U.S.A)를 이용하여 반응을 시키고 핵산 서열 자동 분석기(Automatied DNA Sequencer)를 이용하여 전체 핵산 염기 서열을 결정하였다.

〈실시예 4〉 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소 유전자를 생산하는 대장균 형질전환체의 제조

상기 발현벡터 pETNS4aS7HCP6H를 대장균 Bl21(DE3)균주 (Novagen Cat. # 69387-1)에 형질전환시켜 융합 HCV 단백질분해효소를 발현시킬 수 있는 재조합 균주를 얻었다. 이 균주를 M9 배지에서 배양하면서 IPTG로 발현을 유도하여 약 24 KDa 크기에서 원하는 단백질이 발현됨을 확인하였다.

〈실시예 5〉 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소의 발현·정제

상기 실시예4의 형질전환된 대장균 세포를 엠피실린이 100ul/ml첨가된 LB 배지에서 37℃에서 밤새 배양한 후, 그 배양액 10ml를 1리터의 LB배지에 넣어 주고 계속 배양한다. 37℃에서 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 600nm의 파장에서 약 1.0정도가 될 때 진탕 배양기의 온도를 20-25℃로 내려 준다. 30분후 최종농도 0.4mM가 되도록 아이소프로필씨오갈락토사이드(Isopropylthiogalactoside, 이후 IPTG로 칭함)를 첨가하였다. IPTG를 첨가한지 약 4시간 후에 배양을 멈추고, 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다.

정제에 앞서 세포를 -70℃에서 얼려서 세포의 파괴가 쉽게 일어나도록 하였다. 4리터 배양에서 얻어진 재조합 대장균 세포 침전물에 약 200ml의 완충용액 1(5mM imidazole, 1M NaCl, 10% glycerol, 0.1 % N-octyl glucopyranoside, 20mM tris,pH 8.0)을 가하여 현탁시킨 후, 얼음 중탕안에서 초음파 분쇄기(Ultrasonic homogenizer 4710:Cole-Parmer, USA)로 50%의 출력과 50%의 효율 싸이클(duty-cycle)에서 약 2분간 초음파 처리하여 세포를 파괴시켰다. 상기의 과정으로 얻은 세포 균질액을 고속 원심 분리기(Beckman J2-21M, Rotor JA-14)로 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 가용성 단백질이 녹아 있는 상층액을 얻었다.

상기에서 얻은 상층액에 동일 부피의 완충용액 1을 가한 후, 완충용액 1로 평형화한 니켈 아가로즈 칼럼(His bind metal chelation resin, Novagen, USA)에 넣은 후 분당 2ml의 속도로 통과시켰다. 이어서 50ml의 완충용액 1을 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거한 다음 0M 에서 1.0M 선형 농도 구배의 이미다졸(Imidazole)을 포함하는 400ml의 완충용액 1을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2ml의 속도로 용출시켜 각 10ml의 분획들을 수집하였다.

상기에서 수거한 시료를 한외여과기(Amicon Co, U.S.A., MW Cut-off:10000)에 넣어 단백질의 농도가 2mg/ml 이상이 되게 농축하고 농축된 단백질 시료를 수퍼덱스-200 FPLC 칼럼(Superdex-200 FPLC, Pharmacia, Sweden)에서 0.5ml/분의 속도로 젤 여과하여 1분당 1개의 분획으로 수거한 후 SDS-폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 수행하여 고순도의 단백질을 수거하였다(도 1 참조).

〈실시예 6〉 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소의 활성도 조사

상기 실시예 5에서 분리·정제한 융합 단백질분해효소의 분해활성도를 형광기질을 사용하여 확인하였다. 사용된 형광기질의 아미노산 서열은(DABCYL)-DEMEECASHD-(EDANS) 이고, 비구조3 단백질의 효소 분해 활성 효과에 의해 (DABCYL)-DEMEEC 와 ASHD-(EDANS)로 분해된다.

최적화된 활성도는 50 mM 트리스(Tris), 10 mM DTT, 2% CHAPS {3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane-sulfonate)}, 50% 글리세롤(Glycerol)을 포함하는 pH7.6의 완충용액, 형광기질 0.1-5μM, 융합 단백질분해효소 10nM, 1% DMSO를 포함하는 200μl용액에서 분해 반응속도를 30℃ 에서 5분동안 연속적으로 측정하였다. 형광 분광기는 아민코-보우만 시리즈 2 형광 분광기(AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)를 사용하였고, 사용된 기질에 대하여 여기(Excitation) 파장 351 nm, 방출(Emission) 파장 480mm를 사용하였다.

융합 단백질분해효소의 활성도에 대한 속도론적 테이터

	데이터	비구조 3 효소¹⁾	융합 단백질분해효소
4A/4B 형광기질	K_m(μM)²⁾	21.1	2.77
	K_cat(분^-1)²⁾	0.887	7.43
	K_cat/K_m(M^-1초^-1)²⁾	701	44700
1) 비구조단백질 3 전효소중 아미노산 번호 1-181 서열만으로 구성된 효소
2) 미카엘리스-멘텐 식을 만족시키는 라인위버-버크 플랏으로부터 얻은속도론적 값

상기 표 1에서 나타난 바와 같이 비구조 단백질 3 분해효소에 비하여 본 발명의 융합 단백질분해효소가 K_m값이 7.6배, K_cat값이 8.4배 향상되어 K_cat/K_m값이 63.8배나 향상된 결과를 보여준다.

특히 k_cat/K_m값 44700 (M^-1초^-1)은 4A/4B 기질을 사용하여 보고된 결과 (C,Steinkuhle, et al., J. Virol. 70(1996)6694-6700)와 비교하면 약 80배나 향상된 값이다.

〈실시예 7〉 링커를 포함하지 않는 융합 단백질분해효소의 제조 및 활성도 조사

실시예 1에서 링커 아미노산을 없애기 위해서 링커 부분의 아미노산이 제거된 시발체 4를 합성한 바 있다. 링커를 포함하지 않는 융합 단백질분해효소의 유전자를 증폭하기 위하여, 시발체 4와 시발체 3인 HCP6HSal를 이용해 중합 효소 연쇄반응을 수행하였고 그 결과 약 600 염기쌍의 유전자가 증폭되었다. 이를 다시 주형으로 하고 시발체 1의 NS4aHCP-1과 시발체 3의 HCP6HSal을 이용하여 2번째 중합 효소연쇄반응을 수행함으로서 링커가 제거된 염기 서열을 갖는 전체 660 염기쌍의 핵산을 얻었다. 상기 핵산을 정제한 다음 Nde I, Sal I 제한 효소로 절단하고 그 절편을 순수 분리한 다음 이 절편을 pET11c (New England Biolab)의 Bam HI 인지 부위앞에 Sal I 인지 부위를 첨가시킨 변형벡터 pET 의 Nde I, Sal I부위에 클로닝하여 발현벡터 pET NS4aHCP6H를 제조하였다.

유전자의 염기서열은 Taq핵산 중합 효소를 이용하는 DNA 염기서열 분석 키트를 이용하여 결정하였다.

발현 벡터 pET NS4aHCP6H 를 대장균 BL21(DE3) 균주 (Novagen Cat. # 69387-1)에 형질전환시켜 링커가 제거된 융합 HCV 단백질분해효소 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 균주를 얻었다. 상기 균주를 M9 배지에서 배양하면서 IPTG로 발현을 유도하여 약 23 Kda크기에서 원하는 단백질이 발현됨을 확인하였다.

링커가 포함되지 않은 융합 단백질분해효소를 실시예 5에서와 동일한 방법으로 발현 정제하고 그 활성도를 측정하여 이 단백질도 동일한 활성도를 나타냄을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단백질분해효소는 결정구조상 비구조단백질 3 의 아미노 말단과 더욱 인접하게 존재하는 비구조단백질 4A 를 원래의 HCV 게놈서열과는 반대로 결합시켜 단백질 분해효소 활성이 탁월하게 증대되어 HCV의 증식 억제제 등을 탐색·선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.

[서열목록]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 72

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 65

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 60

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 4

서열의 길이 : 44

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 5

서열의 길이 : 645

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 유전자

[서열목록]

서열번호 : 6

서열의 길이 : 220

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 단백질

Claims

C형 간염 바이러스의 비구조단백질 4A 를 HCV 게놈서열과는 반대로 비구조단백질 3 의 아미노말단에 결합시킨 신규한 융합 단백질분해효소.
제 1항에 있어서, 비구조단백질 4A 는 그의 아미노산 번호 21-34 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질분해효소.
제 1항에 있어서, 비구조단백질 3 은 그의 아미노 말단의 아미노산 번호 1-300 서열을 포함하고 바람직하게는 1-170 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질분해효소.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 비구조단백질 3 의 아미노 말단 절편의 하류에 히스티딘 표지를 포함하는 융합 단백질분해효소.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 비구조단백질 4A와 비구조단백질 3의 아미노말단 절편 사이에 아미노산 링커를 포함하는 융합 단백질분해효소.
제 5항에 있어서, 아미노산 링커는 글라이신과 세린으로 구성된 7개의 아미노산 서열(글라이신-세린-글라이신-세린-글라이신-세린-글라이신 서열)인 융합 단백질분해효소.
제 6항에 있어서, 아미노 말단은 메티오닌-라이신-라이신 으로 시작하고 비구조단백질 4A 는 그의 아미노산 번호 24-41 서열을 포함하며 비구조단백질 3 은 그의 아미노산 번호 1-181 서열을 포함하는 서열5의 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질분해효소.
제 7항의 아미노산 서열에서 링커부분인 아미노산 번호 25-31 서열이 제거된 융합 단백질분해효소.
제 7항의 융합 단백질분해효소를 암호하는 서열 4의 cDNA 유전자.
제 9항의 cDNA 염기서열에서 염기번호 73-93 서열이 제거된 cDNA 유전자.
제 9항의 cDNA 유전자를 포함하는 발현 벡터 pET NS4aS7HCP6H
제 11항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체 DE3/pET NS4aS7HCP6H(수탁번호:KCTC 0397 BP).
제 10항의 cDNA 유전자를 포함하는 발현 벡터 pET NS4aHCP6H.
제 13항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체 DE3/pET NS4aHCP6H(수탁번호:KCTC 0396 BP)
제 12항 또는 제 14항의 대장균 형질전환체를 배양하여 융합 단백질분해효소의 발현을 유도하고 이로부터 조세포 용출액을 얻어 히스티딘 친화 크로마토그래피를 이미다졸 농도구배를 이용하여 용출시켜 제 6항 또는 제 7항의 융합 단백질 분해효소를 얻는 제조방법.