KR100269801B1 - C형 간염 바이러스 항원 897 단백질의 주항체결합부위 단백질 및 그의 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가능한한 짧은 길이를 가지면서도 HCV의 897 단백질 항원의 항체 결합 부위를 포함함으로써 897 단백질의 면역학적 특이성을 유지하는 897 단백질 절편 및 이를 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 것이며, 또한 이를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 형질전환 미생물을 이용하여 상기 항체 결합부위를 포함하는 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 이 재조합 단백질을 이용하여 C형 간염을 기존의 방법보다 더 민감하고 경제적으로, 또한 정확하게 진단할 수 있다.

Description

C형 간염 바이러스 항원 897 단백질의 주항체결합부위 단백질 및 그의 발현

제1도는 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응을 위한 시발체들의 위치를 도시한 것이며,

제2도는 C형 간염 바이러스의 897 절편유전자의 발현벡터를 도시한 것이고,

제3(a)도는 897 유전자 절편들의 발현을 폴리 아크릴 아마이드 젤 전기 영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3(b)도는 897 유전자 절편 발현물을 C형 간염환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 도시한 것이고,

제4도는 C형 간염 바이러스의 V897 유전자 절편 (4348번에서 4713번 위치)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(표준 단일 문자로 나타냄)을 나타낸 것이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스(이하 “HCV”라 함)의 항원인 897 단백질의 주항체 결합부위를 유지하는 항원 단백질 절편에 관한 것이며, 좀 더 구체적으로는 HCV의 897 단백질 항원의 주항체결합부위(immunodominant epitope)를 밝혀냄으로써 가능한한 짧은 길이를 가지면서도 주항체 결합부위를 포함함으로써 897 단백질의 면역학적 특이성을 갖는 항원 단백질에 관한 것이다.

일반적으로 바이러스성 간염은 A형, B형 간염 바이러스, 델타 바이러스(HDV), 사이토메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으며, 1980년대에 이들 바이러스의 유전자가 규명됨으로써 진단 시약 및 백신들이 개발되어 바이러스성 간염의 진단과 예방에 큰 진전이 있었다.

그러나 상기의 간염과는 달리 수혈 후 발병되는 간염의 90%를 차지하는 비A비B형 간염 바이러스(NANBH)가 확인되었다(Alter, H. J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 이 비A비B형 간염 바이러스에 감염된 간염환자가 전세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, H. J., in A. J. Zuckerman(ed.), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss, New York(1988)), 이중 약 40-50%가 만성간염으로 진전되고 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다.(Dienstag, J. L., et al., Seminar Liver Dis. 6, 67-81 (1986)).

브래들리(Bradley) 등은 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고(Bradley, D. W. et al., Gastroenterology 88, 773-779(1985)), 그 후 츄(Choo)등은 상기한 침팬지 혈청을 대량으로 이용하여 NANBH 바이러스를 확보한 뒤 바이러스의 전 핵산을 추출하여 부분적인 cDNA를 클로닝하여 이 바이러스가 양성가닥 리보핵산(positive-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000 개의 염기로 이루어져 있음을 보고하였다(Choo, Q. L., et al, Science 244, 359-362 (1989).

C형 간염 바이러스의 유전자 구조는 플라비 바이러스(f1avivirus) 및 페스티 바이러스(pestivirus)와 유사성을 가지며, 이들의 유연관계로 미루어 C형 간염 바이러스의 다단백질(polyprotein)은 아미노 말단으로부터 핵(core)-외피 1(envelope 1)-외피 2/비구조 1(E2/NSl)-비구조 2(NS2)-비구조 3(NS3)-비구조 4(NS4)-비구조5(NS5) 순서로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(Choo, Q. L., et al., Proc. Natl. Aca. Sci USA 88, 2451-2475(1991); Takamizawa, A., et al, J. Virol. 65, 1105-1113(1991); Kato, N., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6524-6528(1990)).

비구조3 단백질은 바이러스 단백질 분해효소로서 비구조 유전자가 코딩하는 비구조 단백질들을 절단하여 각각의 비구조 단백질들을 생성하는 것으로 추정되고 있으며(Bajan, J. F, m Virology 171, 637-639(1989)), 비구조5 단백질은 지금까지 알려진 바이러스 리보핵산 중합효소의 아미노산 서열과 상당히 유사하여 C형 간염 바이러스의 리보핵산 중합효소(RNA polymerase)로 추정되고 있다(Mita, E., et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 183, 925-930(1992)).

C형 간염 바이러스의 간염에 대한 진단방법은 초기에 미국 카이론사의 츄등이 부분적인 2개의 비구조 유전자 절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 효모에서 융합단백질 SOD-C100-3를 발현시키고 이를 사용하여 효소면역측정법에 의해 수혈성 간염 환자의 70% 이상이 이 항원에 대한 항체를 가지고 있음을 증명하였다(Kuo, G., et al., Science 244, 362-464(1989)).

최근에는 5′ 말단에 위치한 핵(core) 구조 유전자로부터 발현시킨 핵 단백질을 이용함으로써, C100를 이용한 항체 진단 방법보다 조기 진단이 가능한 진단 방법이 개발되었다(Muraiso, K. et. al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 172, 511-516(1990),; Hosein, B. et. al., Proc Acad. Sci. USA 88, 3647-3651(1991)).

미국의 UBI사는 핵 구조 유전자로부터 15 내지 65개 아미노산으로 구성된 합성폴리펩타이드를 이용하여 특이도가 더 높은 개선된 진단방법을 보고하였고(Wang, C. Y., EP 442394(1991)), 기존의 C100-3항원에 핵 구조유전자 유래 C22 및 비구조 3유전자 유래의 C33C를 첨가한 제2세대 진단방법을 개발하여 HCV 항체에 대한 민감도와 특이도를 더욱 증가시킬 수 있음을 보고하였다(Van der poel, C. L., et al. Lancet 337, 317-319(1991)).

본 발명자들은 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV와는 상이한 고유한 한국형 HCV가 존재함을 규명한 바 있으며 특히, 비구조3 유전자로 부터 KHCV UB897 단백질을 재조합 효모 및 대장균으로부터 발현시켜(선행 한국 특허출원 제92-10039호 참조), 이들 단백질들의 면역특이성을 확인한 다음 고순도로 대량 분리 및 정제할 수 있는 방법을 개발하였다(선행 한국 특허출원 제91-13595호 및 제92-10039호 참조).

또한, 이들 HCV특이항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소면역측정법(ELISA immunoassay, EIA) 원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 개선된 진단 방법을 개발하여 보고한 바 있다(선행 한국 특허 출원 제91-13601호 참조).

한편 C형 간염 환자의 혈청 내에 존재하는 항체들이 면역학적인 특이성을 가지고 반응하는 항체결합부위(epitope)는 C형 간염 진단과 간염환자의 면역반응 연구에 있어서 중요한 표지(marker)로 생각되어 왔으며, 상기의 HCV 항원들에 대해서도 역시 그 항체결합부위에 대한 연구가 계속되어 왔다. C100의 경우 많은 짧은 펩타이드들을 인공합성한 다음 C형 간염 환자 혈청과의 반응을 측정함으로써 그 항체결합부위가 HCV 염기서열 1690번-1731번 내에 존재하고 있음을 보고한 바 있다.(Bahl, C., et al., P 65-66, 제3회 국제 HCV 심포지움, Strasbourg, France, 1991). 또한 핵 단백질의 경우, 전체 유전자중 3개의 서로 다른 부위의 절편들을 재조합 대장균에서 발현시킨 다음 C형 간염 환자 혈청과의 반응을 측정함으로써 그 항체결합부위가 아미노 말단 222개 염기쌍내에 위치하고 있음이 밝혀졌다(Nasoff, N. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5462-5466(1991)).

이에, 본 발명자들은 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)의 비구조 3부분 유전자로 부터 발현시킨 897 단백질의 항체결합부위를 찾아내기 위해 노력하던 중, 897 단백짙의 카르복실 말단에 그 항체결합부위들이 집중되어 있음을 밝혀 내는데 성공하게 되었다.

즉 본 발명은 897 유전자의 서로 중복되는 8개의 유전자 절편들을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 증폭시킨 다음 유비퀴틴(ubiquitin, 이하 UB) 유전자와 융합시켜 재조합 대장균에서 발현시키고 웨스턴 블롯팅을 통해 C형 간염 환자의 혈청과의 면역반응성을 측정함으로써 897 단백질의 카르복실 말단 HCV 염기서열 4348번-4713번에 해당하는 약 366개 염기쌍내에 주항체 결합부위가 존재함을 밝히게 되었다.

한편 본 발명에서 이용한 상기 유비퀴틴은 1975년에 발견된 분자량 5,500 달톤의 단백질로서 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고되었다(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 11 (1975)).

지금까지 동물세포로부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러 가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends Biochem. Sci., 10, 343(1985)). 또한 효모의 유비퀴틴 시스템에서 76개의 아미노산으로 구성된 유비퀴틴이 다른 형태의 유비퀴틴보다 세포 내에서 절단공정이 매우 빠르며 알지닌-글리신-글리신 다음에 아주 효율적으로 절단되는 것으로 알려져 있다(Oxkaynak, et al., Nature, 312, 663-666(1987)). 또한 세포내에 존재하는 효소가 유비퀴틴에 결합된 외래유전자를 알지닌-글리신-글리신 다음에 아주 정확하게 절단한다고 하였다(Bachmair, et al., Science, 234, 179-186(1986)). 대장균 내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴 융합단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포내에 측적된다. 이러한 융합단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 발현후 유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스 897 절편 유전자들을 유비퀴틴 유전자와 융합시켜 대장균에서 융합단백질로서 발현시킨 다음, C형 간염 환자의 혈청과의 면역반응성을 웨스턴블롯팅으로 측정하여 897 단백질의 항체 결합 부위를 찾아냄으로써 보다 민감하고 정확한 C형 간염 진단시약의 개발에 기여하는데 있다.

따라서 본 발명의 목적은 가능한한 짧은 길이를 가지면서도 HCV의 897 단백질 항원의 항체 결합 부위를 포함함으로써 897 단백질의 면역학적 특이성을 유지하는 897 단백질 절편 및 이를 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 것이며, 또한 이를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질 전환된 미생물, 형질전환 미생물을 이 용하여 상기 항체 결합부위를 포함하는 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에 있어서 897 단백질 절편이란 897 단백질의 아미노 말단 및/또는 카복시 말단으로부터 아미노산이 하나 이상 결실된 단백질을 가르킨다.

먼저 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA 단편들에 대한 서열 정보(본 출원인이 선출원한 한국특허 출원 제92-10039호 참조)로부터 각 897 절편 단백질들을 코딩하는 897 절편 유전자들의 5′ 말단과 3′ 말단에 대응되는 중합효소 연쇄반응용 프라이머를 고안 합성하였다. 5′에 대응되는 프라이머는 유비퀴틴 유전자의 3′ 말단과 접합이 가능하도록 5′ 말단에 제한효소 인식부위가 존재하며, 3′에 대응되는 프라이머에는 종료 코오돈과 제한효소의 인식 부위를 삽입하여 유비퀴틴의 시작 코오돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료 코오돈에서 단백질 합성이 완료되도록 함과 아울러 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 한다. 이들 프라이머를 이용하여 897 유전자(대장균 W3110(ptrpH UB-KHCV 897) ATCC 68640, 1991년 6월 27일 기탁)를 주형으로 하여 중합효소 연쇄 반응으로 897 절편 유전자들을 증폭하며, 이 증폭된 유전자들을 제한효소로 절단하여 얻은 각 유전자 단편들을 플라스미드 ptrpH-UB-KHCV(ATCC 68640, ATCC 68641, ATCC 68642, 본 출원인이 선출원한 한국 특허출원 제72-10039호 참조)의 KHCV 유전자와 치환하여 발현 벡터를 제조하였다.

상기의 발현 벡터로부터 발현된 각 897 절편 단백질들을 15% 폴리 아크릴 아마이드 젤에서 전기 영동한 후, 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린으로 웨스턴-블롯팅하여 일부 897 절편 단백질이 한국형 C형 간염 바이러스의 항체에 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지 않는다.

하기 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

[제한효소로 DNA의 절단]

사용된 제한효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs, MA, USA)사로부터 입수하였으며, 멸균된 1.5㎖ 에펜돌프튜브에서 보통 반응 부피가 50㎕에서 100㎕가 되도록 하였으며 반응 온도는 37℃에서 1시간 내지 2시간 반응시켰고, 반응이 완료된 후에는 65℃에서 15분간 열처리하거나, 또는 내열성인 제한효소는 페놀 추출과 에탄올 침전법을 사용하였다.

10배 완충용액 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1 : 100mM Bis Tris 프로판-HCl, 100mM HgCl_2,

10mM 디티오트레이톨, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2 : 100mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 500mM NaCl,

10mM 디티오트레이톨, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3 : 100mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 1000mM NaCl,

10mM 디티오트레이톨, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4 : 200mM Tris-아세트산, 100mM 아세트산 마그네슘,

500mM 아세트산 칼륨, 10mM DTT, pH 7.0

[참조예 2]

[페놀 추출과 에탄올 침전]

페놀은 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다. 페놀 추출은 시료와 페놀을 1:1(부피:부피)의 비율로 섞은후 강하게 흔들어 혼합시킨 다음 원심분리(15000×G 5분)시키고, 상층액을 새튜브로 옮긴후 동일 과정을 3번 반복하였다. 동일부피의 클로로 포름(클로로포름과 이소부탄올 비율이 24:1(v/v)) 용액으로 추출하여 0.1 부피의 3M 소디움 아세테이트와 2.5 부피의 100% 에탄올을 가하고 -70℃에서 38분간 혹은 -20℃에서 약 2시간 이상 정치한 후 원심분리(15000×G, 28분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3]

[접합 반응]

접합효소는 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England biolabs, Inc.)와 10배 접합 완충용액(0.5M Tris-HCl pH 7.8, 0.1M MaCl₂, 0.2M 디티오트레이톨 10mM ATP, 0.5mg/㎖ BSA)을 사용하였으며 보통 20㎕ 부피에서 10 단우체의 접합효소를 사용하였으며, 평활말단(blunt ends)을 갖는 DNA 접합은 100 단위체의 접합효소를 사용하였다. 반응조건은 보통 16℃에서 적어도 5시간 또는 4℃에서 14시간이상 반응시켰으며 반응이 완료된후에 65℃에서 15분간 가열하여 접합효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4]

[대장균 형질전환]

대장균 숙주세포로는 HB101, W3110 또는 JM185을 사용하였다. 숙주세포를 100㎖ 액체 LB 배지 (1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 8.5% 염화나트륨)에 접종한 후 37℃에서 650nm에서의 광학밀도값이 0.25에서 0.5에 달할 때까지 배양하였다. 원심분리기로 세포들을 분리한 후 50㎖ 0.1M MgCl₂를 가하여 세척한 후 다시 원심분리시키고 여기에 다시 50㎖의 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음위에서 30분간 정치시켰다.

이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일용액 5㎖에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 위에서 얻은 0.2㎖의 세포에 접합반응액 10㎕을 가하여 0℃에서 40분간 정치시킨후 42℃에서 1분동안 열처리한 다음 2.0㎖ 액체 LB 배지에 가하여 37℃에서 1시간동안 배양한 후 50㎍/㎖ 엠피실린을 함유하고 있는 고체 LB 배지가 있는 플레이트에 도포한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. M13 벡터 DNA는 열처리 후 100㎕의 JM105 세포, 15㎕의 100mM IPTC, 25㎕의 4% X-Gal 및 48℃로 미리 데워 놓은 3㎖의 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토 아가)를 가하고 잘 섞어준후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토 아가)위에 도포하였다.

[참조예 5]

[올리고머의 합성]

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한후, 변성 폴리아크릴아마이드겔(2M 요소, 12% 아크릴아마이드; 50mM Tris 중의 Bis(29:1, w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리한후 Cl8 컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨후 아세토니트릴:물 50:50% 비율의 흔합액으로 용출하여 순수 정제하였고, 260nm 에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6]

[중합효소 연쇄반응]

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎕의 10ｘ taq 폴리머레이즈 완충용액(10mM Tris-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP′s 혼합용액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎍, 0.5㎕의 AmpliTaq DNA 폴리머레이즈(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기를 이용하였으며(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.) 순환 프로그램은 9S℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다.

[실시예 1]

[한국형 C형 간염 바이러스의 897 절편유전자의 증폭]

[단계 1]

본 출원인이 선출원한 한국형 HCV의 897 유전자(대장균 W3110(ptrpH UB-KHCV 897)대한민국 특허 출원 제92-10039호, ATCC 68640, 기탁일 1991년 6월 27일)의 각 절편 유전자들을 유비퀴틴이 결합된 trp 프로모터를 갖고 있는 대장균 발현 벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 프라이머를 합성하였다.

프라이머 P897T2 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCGTT-3′:

이 프라이머는 제한효소 Sac Ⅱ 인식 부위를 가지고 있으며 K897의 1번째 염기부터 21번째 염기를 포함한다.

프라이머 P518T2 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGTATCACCACAGGFCGCCCCTATC-3′:

이 프라이머는 제한효소 Sac Ⅱ 인식부위를 가지고 있으며 K897의 280번째 염 기부터 301번째 염기를 포함한다.

프라이머 P365T2 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGCGGAGACGGCTGGAGCGCGG-3′:

이 프라이머는 제한효소 Sac Ⅱ 인식 부위를 가지고 있으며 K897의 433번째 염 기부터 454번째 염기를 포함한다.

프라이머 P257T2 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTAACATTGGAGAGATTCCTTTC-3′:

이 프라이머는 제한효소 Sac Ⅱ 인식부위를 가지고 있으며 K897의 532번째 염기부터 553번째 염기를 포함한다.

프라이머 P150T2 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTTTGTCCCTCGGAGTCAATGCT-3′:

이 프라이머는 제한효소 Sac Ⅱ 인식부위를 가지고 있으며 K897의 649번째 염기부터 670번째 염기를 포함한다.

프라이머 P897SAL S′-GACTGGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′:

이 프라이머는 K897의 797번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal Ⅰ인식부위를 가지고 있다.

프라이머 P652SAL 5′-GACTGGACTATTACAGCTTTGCAGCGAGCTCGTC-3′:

이 프라이머는 K897의 647번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal Ⅰ 인식부위를 가지고 있다.

프라이머 P570SAL S′-GACTGGACTATTAGAGGGGGATGGCTTTGCCATA -3′:

이 프라이머는 K897의 572번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal Ⅰ 인식부위를 가지고 있다.

프라이머 P430SAL 5′-GACTGGACTATTATTGGTCCAGGACCGTGCCAAT-3′:

이 프라이머는 K897의 431번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal Ⅰ 인식부위를 가지고 있다.

프라이머 P290SAL S′-GACTGGACTATTAGGCGCCTGTGGTGATGGTCCT-3′:

이 프라이머는 K897의 293번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal Ⅰ 인식부위를 가지고 있다.

[단계 2]

멸균된 8개의 반응류브 A 내지 H를 준비하고,

반응튜브 A에 프라이머 P897T2 2㎍ 및 프라이머 P652SAL 2㎍,

반응튜브 B에 프라이머 P897T2 2㎍ 및 프라이머 P570SAL 2㎍,

반응튜브 C에 프라이머 P897T2 2㎍ 및 프라이머 P430SAL 2㎍,

반응튜브 D에 프라이머 P879T2 2㎍ 및 프라이머 P290SAL 2㎍,

반응튜브 E에 프라이머 P150T2 2㎍ 및 프라이머 P897SAL 2㎍,

반응튜브 F에 프라이머 P257T2 2㎍ 및 프라이머 P897SAL 2㎍,

반응튜브 G에 프라이머 P365T2 2㎍ 및 프라이머 P897SAL 2㎍,

반응튜브 H에 프라이머 P518T2 2㎍ 및 프라이머 P897SAL 2㎍을 넣고 각각의 튜브에 주형으로 897 유전자를 50ng 넣은 다음 10㎕의 10배 농도 중합완충용액, 10㎕ 10mM dNTP(10mM dGTP, 10mM dATP, 10mM dTTP, 10mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6과 같이 중합 효소 연쇄 반응을 25회 실시하였다.

[단계 3]

상기 단계 2에서 얻은 각각의 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 반응튜브 A에서 약 650 염기쌍의 DNA가, 튜브 B에서는 약 580 염기쌍의 DNA가, 튜브 C에서는 약 440 염기쌍의 DNA가, 튜브 D에서는 약 300염기쌍의 DNA가, 튜브 E에서는 약 160염기쌍의 DNA가, 튜브 F에서는 약 260염기쌍의 DNA가, 튜브 G에서는 약 370염기쌍의 DNA가, 튜브 H에서는 약 520염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일 조건의 폴리아크릴 아마이드 젤로 분리정제하였다. 이들 각각의 DNA 단편을 단편 652, 단편 570, 단편 430, 단편 290, 단편 150, 단편 257, 단편 365, 단편 518이라 명명하였다.

[실시예 2]

[발현벡터의 제조]

[단계 1]

실시예 1에서 얻은 각각의 DNA 단편 2㎍을 제한효소 Sac Ⅱ와 제한효소 Sal Ⅰ으로 NEB 완충액 3의 조건하에서 참조예 1과 같이 완전절단 반응을 실시하였다. 절단된 각각의 DNA 단편들은 각각 단편 652-T2/L, 단편 570-T2/L, 단편 430-T2/L, 단편 290-T2/L, 단편 150-T2/L, 단편 257-T2/L, 단편 365-T2/L, 단편 518-T2/L이라 명명하였다.

[단계 2]

본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(본 출원인의 대한민국 특허출원 제92-10039호, ATCC 68642 1991년 7월 1일 기탁) 2㎍을 제한효소 Sac Ⅱ와 제한효소 Sal Ⅰ으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1과 같이 완전절단 반응을 실시한 후 0.7% 아가로스 젤에서 분리하여 약 2.7Kb 단편을 분리 정제하였다. 이 단편을 ptrpH-UB-T2/L이라 명명하였다.

[단계 3]

상기 단계 1,2에서 얻은 단편들을 다음과 같이 접합반응을 실시하였다.

멸균된 8개의 접합반응 튜브 A 내지 H를 준비하고,

접합반응 튜브 A에 100ng의 단편 652-T2/L,

접합반응 튜브 B에 100ng의 단편 570-T2/L,

접합반응 튜브 C에 100ng의 단편 430-T2/L,

접합반응 튜브 D에 100ng의 단편 290-T2/L,

접합반응 튜브 E에 100ng의 단편 150-T2/L,

접합반응 튜브 F에 100ng의 단편 257-T2/L,

접합반응 튜브 G에 100ng의 단편 365-T2/L,

접합반응 튜브 H에 100ng의 단편 518-T2/L을 넣고 각각의 튜브에 단계 2에서 얻은 50ng의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕의 10배 농도 접합반응 용액, 10 단위의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 이를 사용하여 대장균 HB 101(ATCC 33694)을 형질전환시켜 단편 652를 함유하고 있는 ptrpH-UB-652, 단편 570를 함유하고 있는 ptrpH-UB-570, 단편 430를 함유하고 있는 ptrpH-UB-430, 단편 290를 함유하고 있는 ptrpH-UB-290, 단편 150를 함유하고 있는 ptrpH-UB-150, 단편 257를 함유하고 있는 ptrpH-UB-257, 단편 365를 함유하고 있는 ptrpH-UB-365, 단편 518를 함유하고 있는 ptrpH-UB-518을 각각 얻었다.

[실시예 3]

[897 유전자절편들의 발현]

상기 실시예 2에서 얻은 C형 간염 바이러스의 897 절편 유전자들을 함유하고 있는 플라스미드로 대장균 W3110(ATCC 37339)을 형질 전환시켰다.

재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria)배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트튬)에서 12시간동안 진탕배양한 다음, 이 중 3㎖씩을 각기 300㎖의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.lmM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. B1, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옳겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 박테리아의 홉광도가 650nm의 파장에서 약 0.3 정도가 될때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 5시간후에 650nm 파장에서 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 대장균 세포침전물을 수거하였다.

[실시예 4]

[주항체 결합부위의 확인]

실시예 3의 세포침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature, 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동하였다. 겔상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4750(1979))에 따라 니트로셀룰로스 필터(Bio-Rad Lab., pore size 0.22㎛, CA, USA)로 전달시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈(Tween) 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간동안 약하게 흔들면서 폐쇄시켰다.

이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 C형 간염환자들의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린(IgG)을 최종 농도 16㎍/㎖이 되게 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 필터를 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항 사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, anti-human IgG-HRP, 0.01mg/ml, CA, USA)를 1:500으로 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액 (pH7.0)으로 2회 세척하였다. 이 필터를 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 발색시켰다. 그 결과는 제3도에 나타냈다.

제3(a)도에서 M열은 표준 단백질 분자량, 1열은 표준 세포균질액, 2열은 UB 897 세포균질액, 3열은 K290 세포균질액, 4열은 K430 세포균질액, 5열은 K57O 세포균질액, 5열은 K652 세포균질액, 7열은 K5l8 세포균질액, 8열은 K365 세포균질액, 9열은 K257 세포균질액, 10열은 K150 세포균질액을 나타낸다.

제3(b)도에서 보이는 바와 같이, 한국형 C형 간염 환자의 혈청을 이용한 웨스턴 블롯팅에서, 897 단백질의 절편인 단편 K652, K570, K5l8, K365, K257 및 K150(미약)은 양성으로 나타났으나 그외의 유전자 부분을 포함하는 K290 및 K430은 음성으로 나타났다.

따라서 제1도 및 제3도의 결과로부터, 897 단백질의 주항체결합부위는 897 단백질의 C 말단, 즉 HCV 염기서열 4348번-4713번에 해당하는 366개의 염기쌍내에 존재하고 있음을 알 수 있다.

본 발명을 통해서, 항체 결합부위가 집중되어 있는 HCV 염기서열 4348번-4713번의 부위만을 사용함으로써 897 유전자 전체를 사용하는 항체 진단방법보다 더 경제적이고 정확하고, 민감하게 C형 간염을 진단할 수 있을 것이다.

Claims (7)

1. 한국형 C형 간염 바이러스의 897 항원 단백질의 면역학적 특이성을 유지하며 하기 아미노산 서열을 갖는 897 항원 단백질 절편, 또는 이를 포함하는 재조합 단백질:
2. 제1항에 있어서, 유비퀴틴에 상기 897 단백질 절편이 융합된 재조합 단백질.
3. 제1항 또는 제2항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
4. 제3항에 있어서, 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
5. 제3항의 DNA를 포함하는 발현벡터인 ptrpH-UB-652, ptrpH-UB-570, ptrpH-UB-518, ptrpH-UB-365, ptrpH-UB-257 또는 ptrpH-UB-150.
6. 제5항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
7. 제6항의 대장균을 배양함을 포함하는, 한국형 C형 간염 바이러스 897 항원 단백질의 면역학적 특이성을 유지하는 897 항원 단백질 절편 또는 이를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.