JP2598596B2 - Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン

Info

Publication number
JP2598596B2
JP2598596B2 JP4502438A JP50243892A JP2598596B2 JP 2598596 B2 JP2598596 B2 JP 2598596B2 JP 4502438 A JP4502438 A JP 4502438A JP 50243892 A JP50243892 A JP 50243892A JP 2598596 B2 JP2598596 B2 JP 2598596B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
hepatitis
virus
protein
test kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP4502438A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH06502542A (ja
Inventor
フッフス，クラオス
モッツ，マンフレッド
ロッゲンドルフ，ミハエル
ソウシェック，エルヴィン
Original Assignee
ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6421107&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2598596(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー filed Critical ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
Publication of JPH06502542A publication Critical patent/JPH06502542A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2598596B2 publication Critical patent/JP2598596B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 Ａ型肝炎およびＢ型肝炎以外に、ウイルスによって伝
播される肝炎が存在することは、約15年前から知られて
いる。このものは、病原体が未知であるので、通常、非
Ａ−非Ｂ型肝炎と呼ばれた。そのうちに、上記非Ａ−非
Ｂ型肝炎の群が、Ｃ型肝炎またはＥ型肝炎と呼ばれる少
なくとも２種の異なるウイルスによって惹起されること
が示された。
Ｃ型肝炎ウイルスは、直径約50−60nmの一本鎖の、被
包RNAウイルスである。ゲノムは、約10,000個のヌクレ
オチドからなり、その場合、構造蛋白質（例えば、包皮
および核）をコードする遺伝子領域を区別できる。この
種の構造蛋白質は、Ｃまたはコア、Ｅまたはエンベロー
プおよびNSで示すことができる。更に、このゲノムは、
ウイルスの非構造構成成分例えば酵素等の遺伝子をも包
含する。これまで、ゲノムが各種の蛋白質を包含するこ
とは知られているが、各個のウイルス蛋白質は、殆ど知
られていない（Schweizer Medizinische Wochenschrift
（1990）、Vol.120、p.117−124）。
背景技術 Chiron社の欧州特許出願88.310922には、Ｃ型肝炎ウ
イルスの部分ヌクレオチド配列が開示されている。しか
しながら、上記ヌクレオチド配列は、いわゆる非構造蛋
白質をコードしているにすぎないと言うことが判った。
構造蛋白質をコードするヌクレオチド配列部分は、上記
出願には開示されていない。
欧州特許出願No.89.309261.9には、非Ａ−非Ｂ型肝炎
ウイルス抗原の別のDNA配列が開示されている。
Chiron社の欧州特許出願90.305421.1には、HCVウイル
スのDNA配列およびアミノ酸配列が開示されている。
各種のHCVウイルスペプチドの発現は、先行技術から
公知で、これらはもちろん、常に、いわゆる融合ペプチ
ドとして発現される。融合タンパク質としての発現の背
景は、Ｃ型肝炎ウイルスは、真核蛋白質生合成に適合
し、従って、一般に、この種のポリペプチドは、バクテ
リア系（例えば、E.coli系）において、いわゆる融合蛋
白質としてのみ発現されうるといえる。従って、融合し
た部分は、別の蛋白質（例えば、β−ガラクトシダーゼ
または過酸化物ディスムターゼ）に由来する。しかしな
がら、この種の融合蛋白質には、上記ポリペプチドを検
出反応に使用した場合、融合した蛋白質部分との交差反
応が現れる可能性があり、従って、誤って陽性結果を生
ずるという欠点がある。
発明の開示 従って、本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスに由来
し、融合成分を含まず、しかも、良い収率で発現されう
るポリペプチドを提供することにある。
本出願において、融合蛋白質とは、異種蛋白質（例え
ば、β−ガラクトシダーゼまたは過酸化物ディスムター
ゼ）の実質的部分を有するポリペプチドを意味する。
ここに開示の方法にもとづき、構造蛋白質Ｃ（コア）
およびENV（エンベロープ）からポリペプチドをクロー
ニングして配列決定することができた。上記ポリペプチ
ドは、表面または表面の近傍の範囲のウイルス粒子に現
れる構造蛋白質の部分であることが、重要である。それ
によって、上記ポリペプチドは、免疫系と接触して免疫
応答を惹起する。この免疫応答は、一方では、感染の検
出に重要であり、その場合、このウイルスに対する抗体
が存在するか否かを検知し、他方では、ウイルス感染に
対し防御するための免疫付与に重要である。
第１、４および６図に、本発明の好ましいポリペプチ
ドを示す。
ここに開示のアミノ酸配列によれば、ここに記載のポ
リペプチドと同一または同等の免疫性を有する短いポリ
ペプチドを大きな困難を伴うことなく調製できる。同様
に、ここに開示のアミノ酸配列は、少数のアミノ酸を置
換することにより、ポリペプチドの免疫性を保持したま
まわずかに変えることもできる。それゆえ本発明の範囲
内においては、開示のアミノ酸配列の部分配列をなす
か、または少数のアミノ酸置換ゆえに開示の配列と異な
るポリペプチドが好ましい。しかしながら、置換された
アミノ酸配列は、全アミノ酸の２％を越えてはならな
い。
更に、本発明の範囲内において、Ｃ型肝炎ウイルスの
ゲノムから異なる所定のポリペプチドを生成する３種の
クローンが提供される。
Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドを生成する各種クロ
ーンを調製するための出発材料は、ウイルスに感染した
患者の血清であった。
血清を公知の方法により前処理し、“ポリメラーゼ連
鎖反応”（PCR）によって個々のクローンを得た。
この間にドイツ微生物収集機関（DSM）に受託番号684
7の下に寄託されたクローンNS−３は、527アミノ酸のポ
リペプチドの遺伝情報を含有する。クローンNS−３から
生成されたポリペプチドのＮ末端には、クローニングに
よって生成しベクター（pUC）に由来する若干のアミノ
酸が存在する。しかしながら、これらの少数のナンセン
ス・アミノ酸は決して融合部分ではない。クローニング
されたポリペプチドは、部分的に配列決定されており、
Ｃ末端に下記の部分配列を有する。
クローンNS−４は、247個のアミノ酸のポリペプチド
の遺伝情報を含み、DSMに受託番号6848の下に寄託され
ている。クローンNS−４から調製できるＣ型肝炎ウイル
スのポリペプチドは、同じく、Ｎ末端に、ベクターpUC
に由来し、融合された異種蛋白質の意味での融合部分で
はない若干のアミノ酸を含有する。
クローンpIC19 Ｈ−N512は、DSMに受託番号6849の下
に寄託されている。クローンpIC19H−N512は、392アミ
ノ酸を有するＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドの情報を
含有する。この場合も、Ｎ末端には、ベクターpUCに由
来する少数のアミノ酸が存在する。このHCVに特異的な
ペプチドは、Ｎ末端に、同じく提示のDNA配列によって
コードされる下記のアミノ酸配列を有する。
本出願の範囲内で開示されたポリペプチドは、良い収
率（全蛋白質の約５％）で発現できること、およびポリ
ペプチドが異種蛋白質と融合することなくこの発現がで
きるという利点を有する。
更に、驚くべきことには、構造蛋白質（コア）に由来
する本発明に係るポリペプチドは生理的条件下に溶解性
であるということが判った。これに関連して、生理的条
件下とは、たとえば、約0.5MのNaClを含有するリン酸塩
緩衝液またはトリス・バッファーに可溶であることを意
味する。
抗抗体を固相に結合させ、被験血清を固相と反応さ
せ、次いで、抗原を溶解形で添加するいわゆる“捕捉テ
スト”にこれらポリペプチドを使用する場合に、ポリペ
プチドの溶解度は、重要な役割を演じる。この場合、抗
原は、通常、抗原に対する抗体の検出を可能にするマー
カーを有する。
本発明により調製せるポリペプチドは、特に、Ｃ型肝
炎ウイルスに対する抗体の検出に適するテストキットに
使用される。テストキットとは、必須成分として少なく
とも１つの本発明に係るポリペプチドを有する器具を意
味する。通常、ポリペプチドは、被験試料と接触される
固相に結合される。被験試料では、通常、血清試料が主
であるが、他の抗体含有生理的液体中で検出を行うこと
もできる。
本発明に係るポリペプチドとこれに対する抗体とから
形成された複合物が、指示成分によって検出される。そ
の場合、好ましくは、被検抗体に対する抗体が重要であ
る。この抗抗体は通常、検出を可能にするマーカーを有
する。マーカーは、例えば、放射性マーカーまたは発色
反応を触媒する酵素を有するマーカーがあげられうる。
図面について説明すると、 第１図は、HCV−コアコーディング領域（Ｃ−１）の
アミノ酸配列を示す。第２図は、HCV−コアコーディン
グ領域（Ｃ−１）の核酸配列を示す。第３図は、HCV−
コアコーディング領域の核酸配列とアミノ酸配列との関
係を示す。第４図は、アミノ酸配列１−123を有し、約1
5kDの発現生成物に相当する短縮されたHCV−コアコーデ
ィング領域の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。第５
図は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のENV（エンベロープ）
コーディング領域の核酸配列を示し、図中小文字で示し
たヌクレオチドはベクターの配列に由来し、同時に翻訳
される。第６図は、Ｃ型肝炎ウイルスのENV（エンベロ
ープ）ポリペプチドのアミノ酸配列を示。第７図は、Ｃ
型肝炎ウイルスのENV（エンベロープ）ポリペプチド領
域の核酸配列とアミノ酸配列との関係を示し、図中小文
字で示したヌクレオチド配列はベクターの配列に由来
し、発現に際して同時に翻訳される。第８図は、実施例
２に記載のゲルを示す。
本発明を実施するための最良の態様 本発明の範囲内においては、テストキットの２つの実
施態様が特に好ましい。１つの実施態様は、ストリップ
−ELISAとも呼ばれ、テストストリップの形のテストキ
ットである。このテストストリップは、抗原として作用
する各種の蛋白質を有する。この場合、その配置は、ウ
ェスタンブロットの配置と同様である。ストリップは、
少なくとも１種の本発明に係るポリペプチドおよびそれ
に加え、抗原−抗体反応の強度判定に役立つ１種または
それ以上の対照蛋白質を含有する。
好ましい方法においては、ポリペプチドまたは蛋白質
を電気泳動法で分離してテストストリップに移す。特に
好ましい実施態様では、ポリペプチドまたは蛋白質をニ
トロセルロースフィルターに移し、次いで、これをスト
リップに截断する。
テストの実施および評価は、公知のELISAテストおよ
び公知のウェスタンブロットと同様に行う。
まず、テストストリップ上に、相当する蛋白質または
ポリペプチドを塗布し、固体表面に結合させる。次い
で、希釈緩衝液中で上記テストストリップを試料と一緒
にインキュベートする。十分なインキュベーション後、
テストストリップを洗浄し、指示成分を添加する。この
場合、通常、発色酵素を結合させた抗抗体が使用され
る。発色反応を触媒するこの種の酵素の例は、ペルオキ
シダーゼである。再び洗浄した後、基質、即ち、酵素に
よって反応し得る化合物を加え、インキュベートする。
この場合、発色反応の有無にもとづき、抗体が存在する
か否かを読みとり得る。
本発明に係るテストキットの別の好ましい態様は、EL
ISAテストキットである。このテストキットの場合、本
発明に係る少なくとも一種のポリペプチドを微小滴定板
の固相に結合させる。微小滴定板の各テスト区画を検出
すべき抗体を含有する液体とインキュベートする。次い
で、各洗浄工程後、指示成分を加え、再び洗浄する。基
質添加後、発色反応にもとづき、Ｃ型肝炎ウイルスに対
する抗体が存在するか否かを判定できる。
本発明に係るポリペプチドの別の使用分野は、ワクチ
ンの調製である。この場合、まず本発明に係るポリペプ
チドまたはこのポリペプチドから誘導されるより短いポ
リペプチドを遺伝子工学的に高純度で調製できる。次
に、ポリペプチドを、注射可能な液（溶液または懸濁液
でありうる）の形とする。この場合、ポリペプチドは乳
化させることもできるし、あるいは、ポリペプチドをリ
ポソーム中に封入することもできる。ワクチンの別の構
成成分は、例えば、水、塩溶液、グルコースまたはグリ
セリンである。更に、ワクチンは、少量の補助物質（例
えば、乳化剤、pH値緩衝剤、免疫応答を高めるアジュバ
ント）をも含有する。アジュバントとしては、水酸化ア
ルミニウム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−
Ｄ−イソグルタミンおよび公知の同様の化合物を挙げる
ことができる。ワクチンは、通常、注射、好ましくは、
皮下注射または筋肉注射によって非経口投与する。本発
明の範囲内において、有利なことには、請求のポリペプ
チドが高収率で発現されうるということが判った。この
場合、ポリペプチドが融合蛋白質でないことが重要であ
る。遺伝子工学的には容易に調製できない蛋白質は、通
常融合蛋白質の形で発現される。この場合、所望の蛋白
質またはポリペプチドは、良好に発現される、概ね細菌
性の他の蛋白質に融合される。その結果、融合された蛋
白質成分と所望のポリペプチドまたは蛋白質とを含有す
る、いわゆる、融合蛋白質が得られ、その截、双方の部
分は、相互に融合されていわゆる融合蛋白質を生成す
る。
しかしながら、特に、免疫学的検出法またはワクチン
の調製には、融合蛋白質としての所望のポリペプチドの
調製は望ましくない。なぜならば、免疫学的検出操作に
おいて、実際には、融合された蛋白質部分に対する抗体
が存在するに過ぎない場合も、ウイルス抗原に対する抗
体が存在すると誤認されるからである。
ワクチンの枠内の免疫付与の場合も、抗体に対する、
別の蛋白質を不純物として含む蛋白質またはポリペプチ
ドを生成させることは、望ましくない。なぜならば、こ
の場合、上記成分に対しても抗体が生成されるからであ
る。さて、本発明範囲内において、本発明に係るポリペ
プチドを純粋な形で調製できた。本発明に係るポリペプ
チドは、クローニングまたは発現の枠内において本発明
に係るポリペプチドの遺伝子が結合された別の遺伝子に
起因する最大15のアミノ酸を有する。しかしながら、本
発明に係るポリペプチドは、クローニングに起因の人工
物質から生ずる５つよりも少ないアミノ酸しか含まない
ことが特に好ましい。
実施例１ HCV−コアおよびENV−１をコーディングする配列の調製 公知の配列（欧州特許出願88310922）から出発して、
ｃ−DNA合成時にウイルス・ゲノムの５′末端の方向の
スタートとして用いられるDNAプライマーと、ｃ−DNAプ
ライマーの５′末端にありハイブリッド形成用プローブ
として使用するプライマーを合成した。
ｃ−DNA合成用プライマーは、下記の配列を有した。
５′−GGGAGTGAAGCAATATACCGGACC ハイブリッド形成用の配列を以下に示す。
５′−CCGATTTTGACCAGGGCTGGGGCCCTATCAGTTAT 慢性HCV感染患者の血清5mlを20％スクロース・クッシ
ョンに加え、100,000gで２時間遠心分離した。ペレット
をpH8.0の20mMトリス・HCl、200mM NaCl、10mM EDT
A、２％SDS、1mg/mlプロテイナーゼＫを含有する緩衝液
300μｌ中に再懸濁させ、55℃で1.5時間インキュベート
した。次いで、フェノール／クロロホルムで処理した
後、エタノールで核酸を沈殿させ、次いで、再び、水50
μｌにとった。
上記溶液のRNAを通常の方法により上述のプライマー
を用いて逆転写し、ラムダ gtll ファージ中に挿入し
た。HCV−DNA陽性クローンはハイブリッド形成性プライ
マーとのハイブリッド形成により見出された。これに
は、ジゴキシゲニン標識UTPおよび末端トランスフェラ
ーゼを用いて上記プライマーを末端で標識した。次い
で、結合されたプライマーの検出を市販のキット（Boeh
ringer Mannheim）によって実施した。
ハイブリッド形成陽性のファージのHCVインサートの
大きさについて制限消化によって調べた。約1.7kBのイ
ンサートを有するクローンをpUC8ベクター中にサブクロ
ーニングし、そして配列を決定した。その際、市販のpU
C配列決定プライマーから出発して、まず、インサート
末端の配列を決定し、次いで、あらたに決定された３′
端の配列を有するプライマーを合成し、このプライマー
を次の配列決定反応に利用した。このようにして決定さ
れた配列から、インサート始端から169個目のヌクレオ
チドで始まる連続する読取り枠が得られる。
HCVの場合、ポリ蛋白質の始端には、コアのコード範
囲またはカプシド蛋白質およびこれに続く２の膜蛋白質
範囲のコード領域が存在する。
コア蛋白質および直接続く膜蛋白質の領域を発現させ
るためE.coli中にサブクローニングした。これは、特異
的なDNAプライマーおよびPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）
によって行った。それにより、蛋白質をコーデイングす
るDNA範囲が増幅される。
次にクローニングされてコア蛋白質の発現をもたらす
DNA領域の増幅に使用されたプライマー配列を以下に示
す。
５′端には、５′−gagggatccatc ATG AGC ACA AAT C
CT AAA CC ３′端には、５′−gagaagctta GGA AGC GGG GAT GGT
TCA AGc 次にクローニングされてENV−１−蛋白質の発現をも
たらすDNA領域の増幅に使用されたプライマー配列を以
下に示す。
５′端についてgagggatcc GCT TAC GGA GTG CGC AAC ３′端についてgagGGATCC GGA CCA GCT TGA GCT ACT
AC 小文字のヌクレオチドは、HCVに特異的ではなく、続
くクローニングのための制限切断部位（GGATCC−BamH
I、AAGCTT−Hind III、TCATGA−BapH II） を得るためにプライマー中に使用した。
PCRから得られ、増幅されたDNAフラグメント（ENV−
１の463ヌクレオチド、コアの579ヌクレオチド）は、Ba
mH I（ENV−１）またはBamH IおよびHind III（コア）
で切断してPUC8に挿入された。
ENV−１のコーディング領域を含むプラスミドpUC8−E
NV−１を有するE.coliは、IPTG誘導により、通常の方法
（モレキュラー・シーブ、イオン交換クロマトグラフ
イ）により効率的に精製できる量の、約25kDalの大きさ
の蛋白質を発現する。コアコーディング領域を有するpU
C8−CIの生成量はより少ない。即ち、インサートを別の
発現ベクター（pDS、pKK233−２）に変換しても本質的
改善は得られない。しかしながら、インサートを３′端
から短縮した場合、E.coli細胞中で極めて良好な発現が
行われる。即ち、約15kDalの発現生成物は、アミノ酸１
〜124のコア配列に相当する。この抗原は、同じく、通
常の方法によって極めて効率的に精製できる。
実施例２ HCV蛋白質“コア”および“env1"の発現および免疫反応 相当する発現プラスミドを含むE.coli細胞を、液体培
地で増殖させ、光学濃度（600nm）が0.7に達したら、2m
M IPTG（イソプロピル−β−チオガラクトシド）を用
いて３時間誘導した。培養物1.5mlからの細胞ペレット
を次に２％SDS、５％メルカプトエタノール、20mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、２％ブロムフェノールブルーおよび
30％スクロースを含む液300μｌ中に再懸濁させ、100℃
で５分間インキュベートした。蛋白質の分離は、17.5％
SDS−ポリアクリルアミドゲル（DADT−交差架橋）中で
行った。ゲルを第８図に示す。
同図の左半部に、クーマシー・ブルーで蛋白質を染色
した後のゲルを示し、右半部に、免疫染色後のゲルを示
した。これには、分離せる蛋白質を“ウェスタン・ブロ
ッティング”によってニトロセルロース膜に移した。次
に膜をTTBS（146gNaCl、100ml 1Mトリス・HCl（pH7.
5）、0.5ml Tween−20）で1:100に希釈したHCV陽性の
血清と４時間インキュベートし、未結合の抗体をTTBSで
５分間ずつ３回洗浄して除去した。結合された抗体はペ
ルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGウサギ抗体と１時間イン
キュベートし、TTBSで洗浄し、そしてジアミノベンジジ
ンおよびペルオキシドで染色することにより検出した。
各トラックに現れる弱いスジは、使用したHCV血清の抗
−E.coli−抗体に起因する。
両図面間に、分子量標準として、蛋白質の45kDalおよ
び30kDalの走行巾を示した。
ゲルの各トラックには、下記のものが負荷された。
トラック1:pUC8、対照。
トラック2:pDS−ENV−１、約25kDalの大きさのHCV−ENV
−１の発現。
トラック3:pUC8−Cl。コアの発現、アミノ酸１〜190、
大きさ約26kDal、クローニング工程に起因して、更に20
のアミノ酸が融合された。
トラック4:pDS−Cl。トラック３と同様であるが、少数
の異種アミノ酸が融合されるので、生成物はより小さ
い。
トラック5:pKK−Cl、トラック３、４と同様。ここでは
生成物は、HCV特異的アミノ酸のみからなる。配列を図
面に示した。
トラック6:pDS−ClCla、アミノ酸１〜124の短縮された
コア生成物、Ｎ末端には、更に２つの異種アミノ酸が融
合され、Ｃ末端には、更に１つの異種アミノ酸が融合さ
れた。
トラック7:pKK−Cl−Cla、トレース６と同様であるが、
真正のHCV−Ｎ末端と、Ｃ末端の異種アミノ酸とを含
む。配列は図面に示す。
ENV−１生成物は、比較的多量に発現されるが、慢性
感染者の被験血清とは免疫ブロットでは極めて弱くしか
反応しない。コア生成物はすべて非常に強く反応し、Ｃ
末端の読取り枠をアミノ酸124までに短縮することによ
り発現収率を顕著に改善できる。
実施例３ コアおよびENV−１の反応性のテスト 上記蛋白質と患者血清中の抗体との反応性を測定する
ため、双方の精製せる抗原を17.5％SDS−ポリアクリル
アミドゲル上で平行して分離してニトロセルロース上に
移した。ここで、ENV−１およびコアを含む双方のトラ
ックが１つのストリップ上にあるよう、ニトロセルロー
ス膜を細いストリップに切断した。次いで、ストリップ
の各種の患者血清とインキュベートし、特異的抗体を免
疫染色によって検出した。
1.テスト トランスアミナーゼ値の高い22人の患者血清、非構造
蛋白質を用いるすべてのHCV−ELISAは陰性:1つの血清が
コアと反応。
2.テスト トランスアミナーゼ値の高い患者の９個の血清、非構
造蛋白質を用いるHCV−ELISAは限界値にある:2つの血清
がコアと反応。
3.テスト 自己免疫反応性を有する肝炎患者血清４種、非構造蛋
白質を用いるすべてのHCV−ELISA陽性:3つの血清がコア
と反応。
実施例から明らかな如く、本発明に係るポリペプチド
を用いるテストキットは、非構造蛋白質を使用したテス
トキットよりも感度が高く（テスト１、２）、かつまた
特異的である（テスト３）。
実施例４ 第４図に示したポリペプチド（コア抗原）を、更に、
Ｃ末端で短縮した。これは、コアをコーディングするプ
ラスミド（実施例１）、実施例１からの５′−PCR−コ
ア−プライマーおよび下記配列を有する３′−プライマ
ーからなるPCRを用いて実施した。
c gga agc tta CCT ACG CCG GGG GTC TGT GGG このプライマーはコアをコードするプラスミド上で、
コア−ペプチドのアミノ酸115に相当する核酸配列がえ
られるまでハイブリッド形成する。続く翻訳停止のコド
ンおよびpUC8/pKK233−２中にクローニングするためのH
ind III部位は、実施例１と同様である。
このポリペプチドは、第４図に示すアミノ酸配列を有
するが、この配列は、もちろん、第４図とは異なり、第
４図の最後から２番目の行の３つのアルギニン残基の後
ろで終わる。
このポリペプチドは、特に良好に発現および精製でき
る。
上記ポリペプチドの精製は、まず、いわゆる封入体の
生成を待ち、ついで、細胞を溶解させることによって実
施できる。ペレットを8M尿素にとり、DEAEカラムに加え
る（8M尿素;pH8.8）。DEAEカラムからの溶離は、塩の勾
配によって行い、その際陽性フラクションは、Ｑ−スフ
ァロース・カラム（pH8.0）を通して導く。この場合、
活性フラクションは、溶出液中にあり、さらにＳ−セフ
ァロース・カラム（pH7.7）に通す。ポリペプチドの溶
離は、約0.4M NaClの塩濃度で行う。得られたポリペプ
チドは、0.5M NaCl含有トリス緩衝液で透析できる。
実施例５ DSM6849として寄託されたクローンpICI9H−N512は、
下記の如く調製した。上述の如く、Ｃ型肝炎ウイルスに
感染した患者の血清を処理し、PCR法によってウイルスR
NAを増幅させた。次いで、まず、約617ヌクレオチドの
インサートを有する第１プレクローンを調製した。この
場合、合成には下記プライマーが使用された。
５′−プライマー： CTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCC および ３′−プライマー： GGAAAGCTTAAGCGGATAGCTGGCTAGCCGAGGAG その際、制限酵素BamH I/Hind IIIを用いてクローニ
ングした。このクローンの３′末端は、Hind III−切断
部位の前にNhel−切断部位を含有した（GCT−AGC）。
同様な方法で、約615のヌクレオチドのインサートを
含有するもう一つのプレクローンを合成した。ここで
は、下記プライマーを使用した。
５′−プライマー： GAGGGATCCAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCC ３′−プライマー： GAGAAGCTTGAATTCTATGTGACTTTCTTCTGCCTTTGGCAAG このクローン（BamH I/Hind lllでクローニング）の
５′末端は、第１プレクローンとオーバーラップしてお
り、同じく、Nhel切断部位を含有する。
双方のプレクローンのインサートを、Nhel−切断部位
の使用により再クローニングすることによって組み立
て、この際、上述のクローンpICI9H−N512が得られた。
Ｃ型肝炎特異的DNAインサートを配列決定し、Ｎ末端に
下記の部分配列（DNAおよびアミノ酸）が確認された。
実施例６ 527アミノ酸のウイルスポリペプチドをコーディング
するクローンNS−３は受託番号6847の下にDSMに寄託さ
れた。このポリペプチドは、Ｎ末端に、更に、クローニ
ングベクターpUCから誘導されるが、いわゆるナンセン
ス・アミノ酸である若干のアミノ酸を有する。
この場合も、実施例５と同様、２つのオーバーラップ
するプレクローンを調製し、次にクローニングせるイン
サートを相互に組合わせた。815ヌクレオチドのインサ
ートを有する１つのプレクローンを調製するには下記プ
ライマーが使用された。
５′−プライマー： AAGGGATCCGGCCGGGAGATACTGCTCGGG ３′−プライマー： GGCAAGCTTGAATTCAGATGTTAGGATCGATCCCATGAG ここでは制限エンドヌクレアーゼBamH I/Hind lllを
用いてクローニングされた。第２プレクローンは、791
ヌクレオチドのインサートを有する。このクローンは、
下記プライマーを使用して調製した。
５′−プライマー： GGAGGATCCGCTCATGGGATCGATCCTAAC および ３′−プライマー： GGAAGCTTGAATTCACTCGGCGGGCGTGAGCTCATACCAAG この場合も、制限エンドヌクレアーゼ切断部位BamH I
/Hind lllを使用してクローニングを行った。第１プレ
クローンでは３′末端に、および第２プレクローンでは
５′末端に存在する１個のCla I切断部位CATC GATを介
して双方のクローンを統合した。このクローンについ
て、ウイルス特異的ポリペプチドのＣ末端から出発して
部分配列を決定し、下記のDNAおよびアミノ酸配列が確
認された。
実施例７ DSM No.6848として寄託されたクローンNS−４は、ウ
イルス蛋白質に由来する247アミノ酸のポリペプチドを
コーディングする。このポリペプチドも、Ｎ末端にベク
ターpUCに由来し、いわゆるナンセンス・アミノ酸をコ
ーディングする若干のアミノ酸を有する。このクローン
は、前出の方法により調製した。その際、下記プライマ
ーが使用された。
５′−プライマー： GGAGGATCCCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCC ３′−プライマー： GGGAAGCTTGAATTCAAAGAGCTCCCGCCACGCCCGC このPCRフラグメントは、pUC8中でBamH I（５′末
端）およびHind lll（３′末端）を用いてクローニング
した。
図面の簡単な説明 第１図 HCV−コアコーディング領域（Ｃ−１）のア
ミノ酸配列 第２図 HCV−コアコーディング領域（Ｃ−１）の核
酸配列 第３図 HCV−コアコーディング領域（Ｃ−１）の核
酸配列およびアミノ酸配列 第４図 短縮されたHCV−コアコーディング領域（Ｃ
−１）の核酸配列およびアミノ酸配列 第５図 HCV−ENV−１コーディング領域の核酸配列。
小文字で示したヌクレオチドは、ベクター配列に由来
し、同時に翻訳される。
第６図 HCV−ENV−１ポリペプチドのアミノ酸配列 第７図 HCV−ENV−１ポリペプチド領域の核酸配列お
よびアミノ酸配列。小文字で示したヌクレオチドは、ベ
クター配列に由来し、発現時、同時に翻訳される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 モッツ，マンフレッド ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 90 シューレンシュトラーセ 16 (72)発明者 ロッゲンドルフ，ミハエル ドイツ連邦共和国 4300 エッセン ブ ルッカー ホルト 53 (72)発明者 ソウシェック，エルヴィン ドイツ連邦共和国 8137 ベルク エン ツィアンウェク 49 (56)参考文献 特開 平３−139282（ＪＰ，Ａ) 欧州公開318216（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開388232（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開450931（ＥＰ，Ａ１)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有することを特徴と
    するＣ型肝炎ウイルスのコア蛋白質のポリペプチド。
  2. 【請求項２】下記のアミノ酸配列を有することを特徴と
    するポリペプチド。
  3. 【請求項３】請求項１または２記載のポリペプチドを含
    有することを特徴とする試料中のＣ型肝炎ウイルス抗原
    に対する抗体を検出するためのテストキット。
  4. 【請求項４】ポリペプチドが、固相に結合されているこ
    とを特徴とする請求項３記載のテストキット。
  5. 【請求項５】更に、ポリペプチドと検出すべき抗体とか
    ら形成された複合物に関する指示成分を有することを特
    徴とする請求項３又は４記載のテストキット。
  6. 【請求項６】請求項１または２記載の少なくとも１種の
    ポリペプチドが塗布され、更に抗原−抗体反応の強度判
    定用に少なくとも１種の対照蛋白質を含有するテストス
    トリップであることを特徴とする請求項３〜５のいずれ
    か１項に記載のテストキット。
  7. 【請求項７】ELISAテストキットであることを特徴とす
    る請求項３〜６のいずれか１項に記載のテストキット。
  8. 【請求項８】以下の配列を有することを特徴とするＣ型
    肝炎ウイルスのコア蛋白質のポリペプチドをコードする
    ヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】請求項１または２記載のポリペプチドを使
    用することを特徴とする試料中のＣ型肝炎ウイルス抗原
    に対する抗体の検出法。
JP4502438A 1990-12-21 1991-12-20 Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン Expired - Fee Related JP2598596B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4041304A DE4041304A1 (de) 1990-12-21 1990-12-21 Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren
DE4041304.7 1990-12-21
PCT/DE1991/001020 WO1992011370A2 (de) 1990-12-21 1991-12-20 Von proteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide und deren verwendung

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7274510A Division JPH08275781A (ja) 1990-12-21 1995-10-23 Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06502542A JPH06502542A (ja) 1994-03-24
JP2598596B2 true JP2598596B2 (ja) 1997-04-09

Family

ID=6421107

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4502438A Expired - Fee Related JP2598596B2 (ja) 1990-12-21 1991-12-20 Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン
JP7274510A Pending JPH08275781A (ja) 1990-12-21 1995-10-23 Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7274510A Pending JPH08275781A (ja) 1990-12-21 1995-10-23 Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6136527A (ja)
EP (1) EP0564532B1 (ja)
JP (2) JP2598596B2 (ja)
AT (1) ATE270333T1 (ja)
DE (2) DE4041304A1 (ja)
ES (1) ES2222453T3 (ja)
WO (1) WO1992011370A2 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1249684B (it) * 1991-07-19 1995-03-09 Sorin Biomedica Spa Epitopi della proteina env del virus dell'epatite c.
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
US5514539A (en) * 1993-06-29 1996-05-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
DE4428705A1 (de) 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
GB9513261D0 (en) * 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
JP5250179B2 (ja) * 2002-11-08 2013-07-31 ザ アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド フラビウイルス融合インヒビター
EP2121991A2 (en) * 2006-10-20 2009-11-25 Innogenetics N.V. Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
HU225068B1 (en) * 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
HU217025B (hu) * 1990-04-04 1999-11-29 Chiron Corp. Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben
EP0464287A1 (en) * 1990-06-25 1992-01-08 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University Non-A, non-B hepatitis virus genomic cDNA and antigen polypeptide
EP0468657A3 (en) * 1990-07-09 1992-02-05 Tonen Corporation Non-a non b hepatitis-specific antigen and its use in hepatitus diagnosis

Also Published As

Publication number Publication date
DE59109261D1 (de) 2004-08-05
JPH08275781A (ja) 1996-10-22
JPH06502542A (ja) 1994-03-24
EP0564532B1 (de) 2004-06-30
WO1992011370A3 (de) 1992-10-29
EP0564532A1 (de) 1993-10-13
US6136527A (en) 2000-10-24
DE4041304A1 (de) 1992-06-25
WO1992011370A2 (de) 1992-07-09
ES2222453T3 (es) 2005-02-01
ATE270333T1 (de) 2004-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4710463A (en) Recombinant DNA molecules capable of expressing HBV core and surface antigens
US5750350A (en) Hepatitis δ diagnostics
US4563423A (en) Products displaying the antigenicity of hepatitis B virus e antigens and methods of producing those antigens
JP3475183B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原
JP2598596B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルスの蛋白質に由来するポリペプチド、該ポリペプチドを含有するテストキットおよびｃ型肝炎ウイルス感染予防ワクチン
EP0638122B1 (en) Cdna sequence of dengue virus serotype 1 (singapore strain)
US6514690B1 (en) Immunoreactive antigens of Hepatitis E Virus
EP0182442B1 (en) Recombinant dna molecules and their method of production
KR100498117B1 (ko) 백신-유도 ｂ형 간염 바이러스 균주 및 그 용도
EP0154587B1 (en) Fragments of dna which encode peptides capable of inducing in vivo the synthesis of anti-hepatitis a virus antibodies
US6268122B1 (en) Recombinant DNA molecules and their method of production
US5693497A (en) Process for expressing the hepatitis B virus antigen using a Saccharomyces cerevisiae transformant
JPH02500245A (ja) 発現マーカーとしてＨＢｘＡｇを含有するＳＶ４０発現ベクター
KR100498118B1 (ko) 하나의 돌연변이 인체 ｂ형 간염 바이러스 균주 및 그용도
KR100269801B1 (ko) C형 간염 바이러스 항원 897 단백질의 주항체결합부위 단백질 및 그의 발현
KR940005586B1 (ko) 플라비 비루스 항원
KR100269803B1 (ko) C형 간염 바이러스의 외피 단백질의 항원 결정부위 융합단백질의 발현
CA1341644C (en) Recombinant dna molecules and their method of production
KR100285585B1 (ko) 씨(c)형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 단백질의 제조방법
KR100269802B1 (ko) C형 간염 바이러스의 핵 구조단백질의 항원 결정부위와 khcv897 단백질의 항원 결정부위를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현
JPH09206076A (ja) Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼに対するモノクローナル抗体
WO1998029747A1 (en) Reagents and methods for detecting hepatitis gb virus antigen
MXPA02010880A (es) Virus centinela ii.
NZ528350A (en) A vaccine-induced hepatitis B viral strain and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees