ES2222453T3 - Polipeptidos derivados de las proteinas del virus de la hepatitis c. - Google Patents
Polipeptidos derivados de las proteinas del virus de la hepatitis c.Info
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Abstract
SE OFRECE LA CLONACION Y SECUENCIACION DE POLIPEPTIDOS DIFERENTES A PARTIR DEL GENONA DE UNOS VIRUS DE LA HEPATITIS C. LOS POLIPEPTIDOS, QUE SE OBTIENEN COMO UNA PROTEINA NO FUSIONADA Y CON BUEN RENDIMIENTO. LOS POLIPEPETIDOS QUE PROCEDEN DE LA ESTRUCTURA BASICA DE LAS PROTEINAS, SE DILUYEN BAJO CONDICIONES FISIOLOGICAS. LOS POLIPEPTIDOS NO PRESENTAN NINGUNA FRACCION DE PROTEINA AFIN Y SE EMPLEAN COMO VACUNAS Y EN PRUEBAS DE ENSAYOS.
Description
Polipéptidos derivados de las proteínas del virus
de la hepatitis C.
Desde hace aproximadamente 15 años, se sabe que
además de la hepatitis A y de la hepatitis B existen otros hepátidos
transmitidos por virus, los cuales por desconocimiento del agente
patógeno fueron designados habitualmente como
hepatitis-no-A-hepatitis-no-B.
Posteriormente se ha llegado a la conclusión de que este grupo de
los
hepátidos-no-A-no-B
están causados por lo menos por dos diferentes virus, los cuales se
designan como hepatitis C o hepatitis E.
En el caso del virus de la hepatitis C, se trata
de un virus de ARN monocatenario encapsulado, con un diámetro de
aproximadamente 50-60 nm. El genoma se compone de
aproximadamente 10.000 nucleótidos, en donde pueden diferenciarse
varias regiones génicas, las cuales codifican proteínas
estructurales como de recubrimiento y núcleo. Esta clase de
proteínas estructurales pueden designarse como C o "Core"
("núcleo"), E o "Envelope" ("recubrimiento") y NS.
Además, el genoma comprende los genes para los componentes no
estructurales del virus como pueden ser las enzimas, etc. Hasta
ahora es sabido que el genoma comprende varias proteínas que son
proteínas víricas individuales aunque poco conocidas (Schweizer
Medizinische Wochenschrift ("Revista semanal Suiza de
Medicina") (1990), Vol. 120, pp. 117-124).
En la solicitud de patente europea 88.310922 de
la Chiron Corporation, se dio a conocer una secuencia parcial de
nucleótidos del virus de la hepatitis C. Se descubrió que la
secuencia de nucleótidos allí publicada codificaba solamente las
llamadas proteínas-no-estructurales.
La parte de la secuencia de nucleótidos que codificaba las proteínas
estructurarales no está publicada en este lugar de la
literatura.
En la solicitud de patente europea nº 89.309261.9
se dan a conocer otras secuencias de ADN del antígeno virus de la
hepatitis-no A-no B.
La solicitud de patente europea 90.305421.1 de la
Chiron Corporation da a conocer la secuencia de ADN y aminoácidos de
un virus HCV.
A partir del estado actual de la técnica se
conoce la expresión de diferentes péptidos del virus HCV, los cuales
se expresan siempre como los así llamados, péptidos de fusión. En el
fondo de la expresión en forma de proteína de fusión está que el
virus de la hepatitis C se adapta a la biosíntesis eucariótica de
proteínas, de lo cual se desprende en general que dichos
polipéptidos pueden expresarse en sistemas bacterianos como el
sistema E. coli, solamente en forma de las así llamadas,
proteínas de fusión. La parte unida por fusión procede de otras
proteínas, como de la \beta-galactosidasa o de la
superóxido-dismutasa. Es desfavorable en tales
fusiones de proteínas el que cuando se emplean estos polipéptidos
para reacciones de comprobación, pueden tener lugar reacciones
cruzadas con la parte de la proteína unida por fusión, lo cual
conduce a resultados falsamente positivos.
Por lo tanto es objeto de la presente invención
el poder disponer de dichos polipéptidos derivados del virus de la
hepatitis C, los cuales constan por lo menos de uno o menos de 15
aminoácidos, proceden de proteínas extrañas y pueden ser expresados
con buenos rendimientos.
Con la denominación de proteínas de fusión se
comprenden en la presente solicitud aquellos polipéptidos que
presentan en una parte esencial una proteína extraña, como la
\beta-galactosidasa o la
superóxido-dismutasa.
De acuerdo con el procedimiento que se da aquí a
conocer, pueden clonarse y secuenciarse polipéptidos de las
proteínas estructurales C (núcleo) y ENV (cubierta). Es fundamental
que estos polipéptidos sean parte de proteínas estructurales, en las
cuales pueden distinguirse regiones en la superficie o cerca de la
superficie de la partícula vírica. Por ello entran en contacto con
el sistema inmunológico y de esta forma provocan una respuesta
inmunológica. Esta respuesta inmunológica es por una parte esencial
para la comprobación de una infección en la cual se comprueba si
existen anticuerpos contra el virus, y por otra parte para la
inmunización para la protección contra infecciones virales.
Tomando como base la secuencia de aminoácidos
dada a conocer, pueden obtenerse sin mayores dificultades
polipétidos acortados, que presentan las mismas o similares
propiedades inmunológicas que los polipéptidos aquí descritos.
Igualmente, las secuencias de aminoácidos dadas a conocer pueden
cambiarse de forma insignificante mediante el intercambio de unos
pocos aminoácidos, de manera que las propiedades inmunológicas de
los polipéptidos permanecen inalterables. En el marco de la presente
invención se prefieren aquellos polipéptidos que representan
secuencias parciales de las secuencias de aminoácidos dadas a
conocer, o bien se diferencian de las secuencias dadas a conocer,
por intercambio de tan solo unos pocos aminoácidos. Sin embargo,
estas secuencias de aminoácidos intercambiados no deben sobrepasar
el 2% del total de aminoácidos.
Además, en el marco de la presente invención se
ha dispuesto de tres clones, que suministran diferentes polipéptidos
definidos, a partir del genoma del virus de la hepatitis C.
Como material de partida para la obtención de
diferentes clones suministradores de polipéptidos del virus de la
hepatitis C, se tomó el suero de un paciente infectado por el
virus.
El suero se trató según un procedimiento de por
sí ya conocido, y con ayuda de la "reacción en cadena de la
polimerasa" (PCR) se obtuvieron los clones individuales.
El clon NS-3 depositado
entretanto con el número 6847 en la Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen ("Colección alemana de microorganismos"), (DSM)
contiene la información genética para un polipéptido de 527
aminoácidos. En el extremo N del polipéptido obtenido a partir del
clon NS-3 existen unos aminoácidos que han aparecido
en la clonación y que proceden del vector (pUC). Estos pocos
aminoácidos "sin sentido" ("non-sens") no
constituyen sin embargo ningun componente de la fusión. El
polipéptido clonado fue entretanto secuenciado parcialmente y
presenta en el extremo C la siguiente secuencia parcial:
El clon NS-4 contiene la
información genética para un polipéptido de 247 aminoácidos y fué
depositado en la DSM con el número 6848. El polipéptido del virus de
la hepatitis C obtenible mediante el clon NS-4,
contiene igualmente en el extremo N algunos aminoácidos que
provienen del vector pUC y tampoco constituyen un componente de la
fusión en el sentido de una proteína extraña unida al mismo por
fusión.
El clon pIC19 H-N512 fue
depositado en la DSM con el número 6849. El clon
pIC19H-N512 contiene la información para un
polipéptido del virus de la hepatitis C, el cual tiene 392
aminoácidos. También aquí existen en el extremo N algunos pocos
aminoácidos que derivan del vector pUC. Este péptido específico del
HCV presenta en el extremo N la siguiente secuencia de aminoácidos,
codificada por la secuencia de ADN igualmente indicada:
Los polipéptidos dados a conocer en el marco de
la presente solicitud presentan la ventaja de que pueden expresarse
con un buen rendimiento (aproximadamente el 5% de la proteína
total).
Sorprendentemente se comprobó además que el
polipéptido derivado de la proteína estructural (núcleo) según la
invención, es soluble en condiciones fisiológicas. Con la expresión
"en condiciones fisiológicas" se entiende por ejemplo, soluble
en tampón de tris o tampón de fosfato que contiene aproximadamente
NaCl 0,5 N.
La solubilidad de los polipéptidos juega pues un
papel esencial cuando se emplean los polipéptidos en los así
llamados, "tests de captura" en los cuales un anticuerpo se une
a una fase sólida, el suero que se analiza reacciona con la fase
sólida y a continuación se añade el antígeno en forma disuelta. El
antígeno presenta habitualmente una marca que permite la
comprobación de los anticuerpos, que están inducidos contra el
antígeno.
Los polipéptidos obtenidos según la invención
encuentran aplicación principalmente en los kits de ensayo, que son
apropiados para la comprobación de los anticuerpos inducidos contra
el virus de la hepatitis C. Con el nombre de kit de ensayo se
entiende un conjunto de elementos que como componente esencial
presenta por lo menos un polipéptido según la invención.
Habitualmente el polipéptido está unido a una fase sólida que se
pone en contacto con la muestra que se investiga. En cuanto a la
muestra que se investiga, se trata habitualmente de muestras de
suero aunque se puede también efectuar la comprobación en otros
líquidos biológicos que contengan anticuerpos.
Mediante un componente señalizador se comprueba
el complejo formado por el polipéptido según la invención y el
anticuerpo inducido contra el mismo. De preferencia se trata de un
anticuerpo, el cual está inducido contra el anticuerpo que se
investiga. Este anti-anticuerpo presenta
habitualmente una marca que hace posible la comprobación. Respecto a
las marcas puede tratarse por ejemplo de una marca radioactiva o de
una marca con una enzima que cataliza una reacción coloreada.
En el marco de la presente invención se prefieren
particularmente dos versiones de kits de ensayo. En una de las
versiones, la cual se conoce también con el nombre de ELISA de tira,
se trata de un kit de ensayo en forma de una tira de ensayo. Esta
tira de ensayo presenta diferentes proteínas que actúan como
antígeno. Su disposición tiene lugar de manera semejante a un
Western-Blot. Las tiras contienen por lo menos un
polipéptido según la invención y adicionalmente una o varias
proteínas de control, que contribuyen a la evaluación de la
intensidad de la reacción antígeno-anticuerpo.
De preferencia, los polipéptidos o
respectivamente las proteínas, se separan electroforéticamente y a
continuación son transferidos sobre tiras de ensayo. En una versión
particularmente preferida, los péptidos o respectivamente las
proteínas, se transfieren sobre un filtro de nitrocelulosa, el cual
se corta a continuación en tiras.
La realización del ensayo y la evaluación tiene
lugar de forma análoga a los ya conocidos ensayos ELISA y a los
también ya conocidos Western-Blots.
En primer lugar se aplican sobre una tira de
ensayo las correspondientes proteínas o respectivamente
polipéptidos, y se unen a la superficie sólida. Estas tiras de
ensayo se incuban a continuación en un tampón de dilución con la
muestra. Después de una suficiente incubación se lavan las tiras de
ensayo y se añaden los componentes indicados en las instrucciones.
Respecto a éstos, se trata habitualmente de un
anti-anticuerpo al cual se ha acoplado una enzima
para colorear. Un ejemplo de una enzima catalizadora de una reacción
coloreada de esta clase, es la peroxidasa. Después de un lavado
repetido varias veces, se añade un substrato, es decir, un compuesto
transformable mediante la enzima, y a continuación se incuba. En
base a la reacción coloreada formada o no formada, puede deducirse
si el anticuerpo está presente o no.
En otra versión preferida del kit de ensayo según
la invención, se trata del kit de ensayo ELISA. En estos kits de
ensayo hay por lo menos un polipéptido según la invención unido a la
fase sólida de las placas de microtitulación. Los compartimentos de
ensayo individuales de la placa de microtitulación se incuban con el
líquido que contiene los anticuerpos que se analizan. Después de
varios pasos de lavado se añaden los componentes indicados en las
instrucciones y se lavan repetidas veces. Después de añadir el
substrato se puede dictaminar a la vista de la reacción coloreada si
existen anticuerpos contra los virus de la hepatitis C.
Otro campo de aplicación de los polipéptidos de
la invención es la obtención de vacunas. A este respecto los
polipéptidos según la invención o los polipéptidos más cortos
derivados de los mismos deben, en primer lugar, obtenerse con una
alta pureza mediante ingeniería genética. A continuación los
polipéptidos se convierten en una forma de líquidos inyectables los
cuales pueden ser o bien soluciones o bien suspensiones. A este
respecto los polipéptidos pueden también emulsionarse o bien los
polipéptidos pueden encerrarse en liposomas. Otros componentes de
las vacunas son por ejemplo, el agua, soluciones salinas, glucosa o
glicerina. Además las vacunas contienen también pequeñas cantidades
de agentes auxiliares como emulsionantes, agentes para tamponar el
valor del pH y eventualmente coadyuvantes que aumentan la respuesta
inmunológica. Como coadyuvantes pueden citarse el hidróxido de
aluminio, la
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
y compuestos similares de por sí ya conocidos. Las vacunas se
aplican por lo general parenteralmente por inyección, y de
preferencia, subcutánea o intramuscularmente.
En el marco de la presente invención se ha
descubierto ventajosamente que los polipéptidos reivindicados pueden
expresarse con altos rendimientos. De forma habitual se expresan
proteínas en forma de proteínas de fusión, que no se pueden obtener
sin más por tecnología génica. A este respecto, las proteínas o
respectivamente los polipéptidos deseados se fusionan con otras
proteínas, la mayor parte de ellas proteínas bacterianas, que se
expresan sin dificultad. Se obtiene una, así llamada proteína de
fusión, la cual contiene una parte de proteína fusionada y el
polipéptido o respectivamente la proteína deseados, fundiéndose
ambas partes entre sí para dar una, así llamada proteína de
fusión.
En particular, para el procedimiento de
comprobación inmunológica o para la obtención de vacunas, la
expresión de los polipéptidos deseados en forma de proteínas de
fusión, no es deseable sin embargo, como proteína de fusión, puesto
que no hay que excluir que también los anticuerpos actúen contra la
parte de proteína fusionada, los cuales en los procedimientos de
comprobación inmunológica, aparentan ser anticuerpos contra el
antígeno vírico, cuando en verdad existen únicamente anticuerpos
contra la parte de proteína fusionada.
También, en el caso de la inmunización en el
marco de las vacunas, no es deseable que la proteína o el
polipéptido contra el anticuerpo que tenga que obtenerse, presente
una impurificación con otra proteína o respectivamente una parte de
proteína, puesto que en este caso también se forman anticuerpos
contra esta parte componente. En el marco de la presente invención
se ha logrado ahora que los polipéptidos según la invención se
obtengan en una forma más pura. Los polipéptidos según la invención
presentan por lo menos uno y como máximo 15 aminoácidos, que se
derivan de otros genes con los cuales se unió el gen para los
polipéptidos según la invención en el marco de la clonación o
respectivamente expresión. De forma particularmente preferida, los
polipéptidos según la invención presentan sin embargo menos de 5
aminoácidos que derivan de la clonación de artefactos
retrógrados.
A partir de la secuencia conocida (solicitud de
patente europea 88310922) se sintetizaron los cebadores de ADN, los
cuales en una síntesis de ADN-c sirven como comienzo
en la dirección del extremo 5' del genoma vírico, así como un
cebador el cual está en el extremo 5' del cebador de
ADN-c, y el cual se emplea como sonda de
hibridación.
El cebador para la síntesis del
ADN-c tiene la siguiente secuencia:
5'-GGGAGTGAAGCAATATACCGGACC
y para la hibridación:
5'-CCGATTTTGACCAGGGCTGGGGCCCTATCAGTTAT
Se añadieron 5 ml de plasma de un paciente
crónico infectado con HCV, sobre una almohada de sucrosa al 20%, y
se centrifugó durante 2 horas a 100.000 g. El sedimento en forma de
bolita se resuspendió en 300 \mul de tampón con 20 mM de
Tris-HCl de pH 8,0, 200 mM de NaCl, 10 mM de EDTA,
2% de SDS, 1 mg/ml de proteinasa K, y se incubó durante 1,5 horas a
55ºC. Los ácidos nucleicos después de un tratamiento con
fenol/cloroformo, se precipitaron a continuación con etanol y
seguidamente se trataron de nuevo con 50 \mul de agua.
El ARN de esta solución se sometió a
transcripción inversa de acuerdo con los métodos convencionales con
el cebador mencionado más arriba, y se introdujo en un fago landa
gt11. Se encontraron clones positivos HCV-ADN
mediante hibridación con el cebador de hibridación. Para ello había
sido marcado este cebador con UTP marcado con digoxigenina y la
transferasa terminal en los extremos. La comprobación del cebador
unido se efectuó a continuación con un kit comercial (Boehringer
Mannheim).
Los fagos de hibridación positiva se analizaron
para saber el tamaño de su inserto de HCV mediante digestión con
enzimas de restricción. Un clon con un inserto de aproximadamente
1,7 kB se subclonó en un vector pUC8 y se determinó la secuencia. A
partir de cebadores de secuenciación de pUC comerciales se determinó
en primer lugar la secuencia de los extremos del inserto, a
continuación se sintetizó el cebador con las secuencias de los
extremos 3' recién determinados, y éstos fueron utilizados
seguidamente para la próxima reacción de secuenciación. A partir de
la secuencia así determinada se deduce un marco de lectura contínuo
el cual empieza los 169 nucleótidos del principio del inserto.
En el HCV están al principio de la poliproteína
las regiones codificadoras de la proteína del núcleo o de la
cápsula así como dos regiones subsiguientes a las mismas para las
proteínas de la membrana.
La región de la proteína del núcleo así como la
proteína de la membrana inmediatamente siguiente fue subclonada para
una expresión en E. coli. Esto se realizó mediante un cebador
de ADN específico y una PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
Con ello se amplificó la región de ADN codificadora de la
proteína.
Las secuencias del cebador, que sirvieron para la
amplificación de la región de ADN, la cual se clonó a continuación y
condujeron a la expresión de la proteína del núcleo, fueron:
5'-gagggatccatc ATG AGC ACA AAT
CCT AAA CC
para el extremo 5'
5'-gagaagctta GGA AGC GGG GAT GGT
TCA Agc
para el extremo 3'
Las secuencias del cebador, que sirvieron para la
amplificación de la región de ADN, la cual se clonó a continuación y
condujeron a la expresión de la proteína de la
ENV-1, fueron:
gagggatcc GCT TAC GGA GTG CGC AAC
para el extremo 5'
gagGGATCC GGA CCA GCT TGA GCT ACT AC
para el extremo 3'
Los nucleótidos escritos en letra minúscula son
no específicos para el HCV, y se emplearon en los cebadores para los
puntos de corte de la restricción (GGATCC -BamHI, AAGCTT -HindIII,
TCATGA -BspHII) para tener a disposición la subsiguiente
clonación.
Los fragmentos de ADN amplificados, obtenidos a
partir de la PCR (463 nucleótidos para la ENV-1, 579
nucleótidos para el núcleo) fueron cortados con BamHI
(ENV-1) o respectivamente BamHI y HindIII (núcleo)
e insertados en el pUC8.
Un clon de E. coli con el plásmido
pUC8-ENV-1 con la región
codificadora de la ENV-1 expresó después de la
inducción con IPTG una proteína con el tamaño de aproximadamente 25
kDaltons, en una cantidad que permite una eficiente purificación
por métodos convencionales (tamices moleculares, cromatografía de
intercambio iónico). El pUC8-C1 con la región
codificadora del núcleo se produce en pequeña cantidad; una
transformación del inserto en otros vectores de expresión (pDS,
pKK233-2) no aporta ninguna mejora importante. Sin
embargo, después de un acortamiento del inserto a partir del
extremo 3', se consiguió una muy buena expresión en las células de
E. coli; el producto de expresión con aproximadamente 15
kDaltons corresponde a la secuencia del núcleo de aminoácidos 1 al
124. Este antígeno se puede purificar también con mucha eficiencia
con métodos convencionales.
Se cultivaron células de Escherichia coli con los
correspondientes plásmidos de expresión en un líquido de cultivo y
cuando se alcanzó una densidad óptica (600 nm) de 0,7 se indujeron
con 2 mM de IPTG
(isopropil-\beta-tio-galactósido)
durante tres horas. El sedimento en forma de bolita de células de
1,5 ml de cultivo se resuspendió a continuación en 300 \mul de SDS
2%, mercaptoetanol 5%, Tris-HCl 20 mM de pH 7,5,
azul bromofenol 2%, sucrosa 30%, y se incubó a 100ºC durante 5
minutos. Se efectuó una separación de las proteínas en un gel de
17,5% de SDS-poliacrilamida (reticulado
transversalmente con DADT). Los geles están representados en la
figura 8.
La imagen de la izquierda muestra este gel
después de la tintura de las proteínas con azul Coomassie, y la de
la derecha después de una tintura Immun. Para ello las proteínas
separadas fueron transferidas mediante "Western Blotting" sobre
una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó a continuación
con un suero positivo al HCV en una dilución de 1:100 con TTBS (146
g de NaCl, 100 ml de Tris-HCl 1M pH 7,5, 0,5 ml de
Tween-20) durante cuatro horas, y los anticuerpos
sin unir se eliminaron mediante un lavado de 5 minutos por tres
veces con TTBS. Los anticuerpos unidos se conjugaron mediante una
incubación de 1 hora con una peroxidasa, y se comprobaron con
anticuerpos anti IgG humana, de conejo, un lavado con TTBS y una
tintura con diaminobencidina y peróxido. Las bandas más débiles que
aparecieron en cada huella, fueron el resultado de los anticuerpos
anti E. coli del suero HCV empleado.
Entre las dos figuras están colocados como
estándares de pesos moleculares los recorridos de las proteínas con
un tamaño de 45 o respectivamente 30 kDaltons.
Las huellas individuales del gel se cargaron
con:
Huella 1: pUCS, control
Huella 2:
pDS-ENV-1, expresión del
HCV-ENV-1 con un tamaño de
aproximadamente 25 kDaltons.
Huella 3: pUC8-C1,
expresión del núcleo, aminoácidos 1-190, con un
tamaño de aproximadamente 26 kDaltons, condicionado por los pasos
de clonación hay todavía 20 aminoácidos fusionados.
Huella 4: pDS-C1, igual
que huella 3, pero el producto es más pequeño dado que se han
fusionado menos aminoácidos extraños.
Huella 5: pKK-C1, igual
que huella 3 y 4, el producto consta aquí solamente de aminoácidos
específicos al HCV, la secuencia viene dada en las figuras.
\newpage
Huella 6: pDS-C1Cla,
producto del núcleo acortado, del aminoácido 1 hasta el 124, en el
terminal N hay todavía 2 aminoácidos extraños fusionados y en el
terminal C uno.
Huella 7:
pKK-C1-Cla, igual que huella 6,
aunque con el terminal N de HCV auténtico, un aminoácido extraño en
el terminal C, la secuencia viene dada en las figuras.
El producto ENV-1 se expresa en
una medida relativamente alta, aunque reacciona con el suero aquí
ensayado de un infectado crónico únicamente de forma muy débil en el
inmunoblot. Los productos del núcleo reaccionan todos muy
fuertemente, se puede obtener un rendimiento de la expresión mucho
más alto mediante el acortamiento del marco de lectura a partir del
terminal C hasta el aminoácido 124.
Para la determinación de la reactividad de los
anticuerpos en los sueros de los pacientes con estas proteínas se
separaron los dos antígenos purificados uno junto al otro, sobre
geles con el 17,5% de SDS-poliacrilamida y se
transfirieron sobre nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se
cortó entonces en tiras estrechas, de forma que ambas huellas con
ENV-1 y el núcleo se encontraran siempre sobre una
tira. Las tiras se incubaron a continuación con diferentes sueros de
pacientes y se comprobaron los anticuerpos específicos mediante
tintura Immun:
1^{er}
ensayo
22 sueros de pacientes con valores elevados de
las transaminasas, todos los HCV-ELISA con proteínas
no estructurales, negativos,
1 suero reactivo con el núcleo.
2º
ensayo
9 sueros de pacientes con valores elevados de las
transaminasas, HCV-ELISA con proteínas no
estructurales, con valores límite
2 sueros reactivos con el núcleo
3^{er}
ensayo
4 sueros de pacientes con hepatitis con
reactividad autoinmunológica, todos los HCV-ELISA
con proteínas no estructurales, positivos
3 sueros reactivos con el núcleo.
El ejemplo muestra que los kits de ensayo con los
polipéptidos según la invención, tanto los sensibles (ensayos 1 y 2)
como también los específicos (ensayo 3) son kits de ensayo en los
cuales se emplean proteínas no estructurales.
El polipéptido que se muestra en la figura 4
(antígeno del núcleo) se acortó de nuevo en los terminales C. Esto
tuvo lugar mediante la PCR del plásmido que codifica el núcleo
(ejemplo 1), la PCR del cebador 5' del núcleo del ejemplo 1, así
como un cebador 3' con la siguiente secuencia:
c gga agc tta CCT ACG CCG GGG GTC TGT GGG.
Este cebador híbrida sobre el plásmido que
codifica el núcleo hasta una sucesión de ácidos nucleicos, que
corresponde al aminoácido 115 del péptido de núcleo. A continuación
está un codon para el final de la transcripción así como un sitio
HindIII para la clonación en pUC8/pKK233-2,
análogamente al ejemplo 1.
El polipéptido presenta la secuencia de
aminoácidos que muestra la figura 4, la cual de todas maneras a
diferencia de la figura 4 termina después de tres radicales de
arginina en la penúltima línea de la figura 4.
Este polipéptido se puede expresar y purificar
particularmente bien.
Puede efectuarse una purificación de este
polipéptido de modo que en primer lugar se espera hasta que se
forman los llamados cuerpos de inclusión y a continuación se lisan
las células. El sedimento en forma de bolita se trata con 8M de urea
y se aplica a una columna de DEAE (urea 8 M; pH 8,8). La elución de
la columna de DEAE tiene lugar con un gradiente de sal, de donde las
fracciones positivas se conducen a una columna de
Q-sefarosa (pH 8,0). Las fracciones activas se
encuentran en el eluato, el cual se conduce además sobre una columna
de sefarosa S (pH 7,7). Una elución del polipéptido tiene lugar a
continuación con una concentración de sal de aproximadamente 0,4 M
de NaCl. El polipéptido obtenido puede ser dializado a continuación
frente a un tampón de Tris, que contiene 0,5 M de NaCl.
Se obtuvo el clon pIC19 H-N512
depositado en la DSM con el número 6849, de la siguiente manera.
Como se ha descrito más arriba, se trató el suero de un paciente
infectado con el virus de la hepatitis C, y el ARN vírico se
amplificó con ayuda del método PCR. En primer lugar se obtuvo un
primer pre-clon, el cual presentaba un inserto de
aproximadamente 617 nucleótidos. Para la síntesis se emplearon los
siguientes cebadores:
Cebador 5':
CTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCC y
Cebador 3':
GGAAAGCTTAAGCGGATAGCTGGCTAGCCGAGGAG.
Se clonó con las enzimas de restricción
BamHI/HindIII. El extremo 3' de este clon contiene antes del sitio
de corte de HindIII un sitio de corte de NheI (GCT AGC).
De análoga manera se sintetizó otro
pre-clon, el cual contenía un inserto de
aproximadamente 615 nucleótidos. En este caso se emplearon los
siguientes cebadores:
Cebador 5':
GAGGGATCCAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCC;
Cebador 3':
GAGAAGCTTGAATTCTATGTGACTTTCTTCTGCCTTTGGCAAG.
El extremo 5' de este clon (clonado con
BamHI/HindIII) está solapado con el 1^{er} preclon y contiene
igualmente el sitio de corte NheI.
El inserto de los dos pre-clones
se montó por reclonación empleando el sitio de corte NheI con lo que
se obtuvo el clon antes citado pIC19H-N512. El
inserto de ADN específico de la hepatitis C se secuenció y se
identificó en el terminal N la siguiente secuencia parcial (ADN y
aminoácidos):
El clon NS-3, el cual codifica un
polipéptido vírico de 527 aminoácidos, se depositó en la DSM con el
número 6847. En el terminal N el polipéptido presenta todavía
algunos aminoácidos que derivan del vector de clonación pUC, y que
constituyen los así llamados, aminoácidos sin sentido.
De manera análoga al ejemplo 5 se obtuvieron
también aquí dos pre-clones solapados, combinándose
a continuación entre sí los insertos clonados. Para la obtención de
uno de los pre-clones que presentaba un inserto de
815 nucleótidos, se emplearon los siguientes cebadores:
Cebador 5':
AAGGGATCCGGCCGGGAGATACTGCTCGGG;
Cebador 3':
GGCAAGCTTGAATTCAGATGTTAGGATCGATCCCATGAG.
Se clonó aquí también con las endonucleasas de
restricción BamHI/HindIII. El segundo pre-clon
presentó un inserto de 791 nucleótidos. Este clon se obtuvo
empleando los siguientes cebadores:
Cebador 5':
GGAGGATCCGCTCATGGGATCGATCCTAAC y
Cebador 3':
GGAAGCTTGAATTCACTCGGCGGGCGTGAGCTCATACCAAG
Se clonó aquí también con los sitios de corte de
las endonucleasas de restricción BamHI/HindIII. Los dos clones
fueron ensamblados por un sitio de corte singular CLAI (ATC GAT), el
cual se localiza en el primer pre-clon en el extremo
3' y en el segundo pre-clon en el extremo 5'. De
este clon se identificó una secuencia parcial a partir del extremo C
del polipéptido específico del virus, en donde se identificó el
siguiente ADN y la siguiente secuencia de aminoácidos:
El clon NS-4, el cual había sido
depositado entretanto en la DSM con el número 6848, codifica un
polipéptido de 247 aminoácidos, el cual deriva de una proteína
vírica. También este polipéptido presenta en el terminal N algunos
aminoácidos los cuales derivan del vector pUC que codifica estos
así llamados, aminoácidos sin sentido. Este clon se obtuvo según los
métodos descritos previamente. Se utilizaron los siguientes
cebadores:
Cebador 5':
GGAGGATCCCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCC;
Cebador 3':
GGGAAGCTTGAATTCAAAGAGCTCCCGCCACGCCCGC.
Se clonó este fragmento de PCR mediante BamHI
(extremo 5') y HindIII (extremo 3') en pUC8.
Figura
1
Representa la secuencia de aminoácidos de la
región que codifica el núcleo del HCV (C-1).
Figura
2
Representa la secuencia de ácidos nucleicos de la
región que codifica el núcleo del HCV (C-1).
Figura
3
Representa la correlación entre la secuencia de
ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de la región que
codifica el núcleo del HCV (C-1).
Figura
4
Representa la secuencia de ácidos nucleicos y la
secuencia de aminoácidos de la región acortada que codifica el
núcleo del HCV, la cual presenta la secuencia de aminoácidos
1-123 y corresponde a un producto de expresión con
aproximadamente 15 kD.
Figura
5
Representa la secuencia de ácidos nucleicos de la
región que codifica la ENV (cubierta) del virus de la hepatitis C
(HCV), en donde los nucleótidos escritos con minúsculas proceden de
las secuencias del vector y son traducidos conjuntamente.
Figura
6
Representa la secuencia de aminoácidos del
polipéptido del ENV (cubierta) del virus de la hepatitis C.
Figura
7
Representa la correlación entre la secuencia de
ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de la región de
polipétidos del ENV (cubierta) del virus de la hepatitis C. Las
secuencias de nucleótidos escritas en letras minúsculas proceden de
las secuencia del vector y son traducidos conjuntamente en la
expresión.
Figura
8
Representa los geles descritos en el ejemplo
2.
Claims (8)
1. Polipéptido obtenido por ingeniería genética
a partir de la proteína del núcleo (C) del virus de la hepatitis C,
caracterizado porque la proteína del núcleo (C) presenta la
secuencia de aminoácidos.
o secuencias parciales de la misma,
en donde las secuencias parciales pueden ser acortadas en los
extremos terminales C hasta el aminoácido 115 y el polipéptido
obtenido por ingeniería genética presenta por lo menos uno pero
siempre menos de 15 aminoácidos que derivan de las proteínas
extrañas fusionadas con el mismo, o del vector de
clonación.
2. Kit de ensayo para la comprobación de los
anticuerpos inducidos contra el antígeno virus de la hepatitis C en
una muestra, caracterizado porque el kit de ensayo contiene
un polipéptido según la reivindicación 1.
3. Kit de ensayo según la reivindicación 2,
caracterizado porque el polipéptido está unido a una fase
sólida.
4. Kit de ensayo según una de las
reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque contiene además
un componente señalizador para el complejo formado por el
polipéptido y los anticuerpos que se comprueban.
5. Kit de ensayo según una de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque se trata de una
tira de ensayo a la que se ha aplicado por lo menos 1 polipéptido
según la reivindicación 1, y que contiene además por lo menos una
proteína de control para dictaminar la intensidad de la reacción
antígeno-anticuerpo.
6. Kit de ensayo según una de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque se trata de un
kit de ensayo ELISA.
7. Secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido del núcleo del HCV, caracterizada porque presenta
la siguiente secuencia de ADN:
8. Procedimiento para la comprobación de los
anticuerpos inducidos contra el antígeno virus de la hepatitis C en
una muestra de análisis, caracterizado porque en el
procedimiento se emplean polipéptidos según la reivindicación
1.
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