JPS63156729A - Ｅｎｖ／ｇａｇ−ポリペプチド - Google Patents

Ｅｎｖ／ｇａｇ−ポリペプチド

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JPS63156729A
JPS63156729A JP62307368A JP30736887A JPS63156729A JP S63156729 A JPS63156729 A JP S63156729A JP 62307368 A JP62307368 A JP 62307368A JP 30736887 A JP30736887 A JP 30736887A JP S63156729 A JPS63156729 A JP S63156729A
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JP
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polypeptide
polypeptide according
env
aids
gag
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JP62307368A
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ライナー　ジェンツ
スツアルト　レ　グリセ
ヤン　モウス
デイエトリッヒ　ステューバー
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Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質
のｅｎｖおよび０８ｇ蛋白の配列に対応する抗原決定因
子を含む新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコード
する発現ベクター、組換えＤＮＡ技術を用いた該ポリペ
プチドの生産、および該ペプチドの使用に基づくヒ］・
血液または他の生物試料中のＡＩＤＳ抗体またはウィル
スの存在の検出およびＡＩＤＳに対する人間の免疫予防
保護のための方法に関するものである。さらに、本発明
は患者血清試料中のＡＩＤＳ抗体測定のための長期間安
定な感度の高い試験キットに関する。
１９８５年にはおよそ８，０００人の人が後天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ＞と診断され、その数は着実に増加
している。１９８６年にはさらに１５０００人がそのよ
うに診断されるものと考えられ、１９８７年にはこの数
はまた２倍となると予想されている［ニューヨーク　タ
イムズマガジン、１９８６年３月２日、４２頁］。ＡＩ
ＤＳは体の免疫系への影響の二次的作用として重篤な日
和見感染がはじまることが特徴である［８．　Ｓ。
Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、　”Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　
Ｃａｒｉｎｉｉ　Ｐｒｅｕｍｏｎｉａａｎｄ　Ｈｕｃｏ
ｓａｌ　Ｃａｎｄｉｄａｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｒｅｖｉｏｕ
ｓｌｙ　ｈｅａｌｔｈｙｈｏｍｏｓｅｘｕａｌ　ｍｅｎ
：　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ａｃｑｕｉ
ｒｅｄｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ”、Ｎ、Ｅｎｇ、　Ｊ、Ｈｅｄ、　３０５巻、１
４２５−１４３１頁（１９８１年）］。
本疾患は男性同性愛者、血液製剤を投与した患者、静注
薬物常用者およびハイチおよび中央アフリカ出身の個人
に見られている［Ｐ、　ｐｒｏｔら、”Ａｃｑｕｉｒｅ
ｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　５ｙｎｃ＋ｒ
ｏｍｅ　ｉｎ　ａｈｅｔｅｒｏｓｅｘｕａｌ　ｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｚａｉｒｅ”　Ｌａｎｃｅｔｌ　
１巻、６５−６９頁（１９８４年）］。
原因物質としてはＡＩＤＳの流行病学的パターンが伝搬
性疾病と同じであることからウィルス性であると予想さ
れた。少なくとも３種のレトロウィルスが何人かのＡＩ
ＤＳ患者、或いは本疾患で致命的な患者の白血球から単
離されている。リンパ腺症−関連ウィルス（ＬＡＶ）と
呼ぶ新規なヒトレトロウィルスが発見され、その性状は
ＡＩＤＳの病因的役割と一致した。このウィルスはリン
パ腺症患者から単離され命名された［　Ｌ、　ＨＯｎｔ
ａｊＪｎｉｅｒら、”Ａ　ｎｅｗ　ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｉ
ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ；ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄｐｏｓｓｉｂｌ
ｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ｉｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ
　ａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄ　ｅｍｉｎｕｎｅ　’ｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ　ｉｎｈｕｍａｎ
　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏａ＋
ａ　ｖｉｒｕｓ”、Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　Ｈ，Ｅｓ５
ｅｘおよびり、　Ｇｒｏｓｓ編集（コールド・スプリン
グ・ハーバ−、ニューヨーク：Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｌ
ｌｌ　Ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８４
年）３６３−３７０頁］。
他のヒトレトロウィルス、具体的にはヒトＴ−細胞白血
病／リンパ腫／リンパ趨向性ウィルスの２）（Ｄ＋ｊブ
’Ｊループ、タイプ■［８，Ｊ、　Ｐｏ１ｅｓｚら、”
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　
ｏｆ　　ｔｙｐｅ　Ｃｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　　ｐａｒ
ｔｉｃｌｅｓ　　ｆｒｏｍ　　ｆ’ｒｅｓｈ　　ａｎｄ
　　ｃｕｌｔｕｒｅｄｌｙ＋ｎ面０ＣｙｔｅＳ　ｏｆ　
ａ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｔｔｈ　ｃｕｔａｎｅｏｕｓ丁
−ｃｅｌｌ　　Ｉｙｍｐｏｍａ”　　ＰＮＡＳ　　（Ｕ
ＳＡ）　　７　７　巻、　７４１５−７４１９頁（１９
８０年）］およびタイプＩＩＩ　　［８，Ｐｏｐｏｖｉ
ｃら、　”ｏｅｔｅｃｔ＋ｏｎ、　　１ｓｏｌａｔｉｏ
ｎａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ　（１−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ　　）ｆｒｏｍ
　　ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　ａｎｄ　ｐ
ｒｅ−ＡＩＤＳ”　、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４巻、４９
７−５００頁（１９８４年）］も単離された。
またＡＩＤＳ−関連レトロウィルス（ＡＲＶ）と呼ばれ
る他のウィルスも原因物質として提唱された［Ｊ、　　
Ａ、　　Ｌｅｖｙら、　”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　
　Ｉｙｍｐｈｏｃｙ−ｔｏｐａｔｈｉｃ　ｒｅｔｒｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｓａｎ　ｒｒａｎｃｉｓｃ。
ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ”　、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２２５巻、８４０−８４２頁（１９８４年）］
。
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩとＡＲＶの両レトロウィルス共
ＬＡＶと生物学的および血清−疫学的に類似した性質を
示す［Ｊ、八、　Ｌｅｖｙら、上述、Ｈ，Ｐｏｐｏｖｉ
ｃら、上述］。従って、少なくとも３種のレトロウィル
スがＡＩＤＳの病因物質として考えられている；ＬＡＶ
：ＡＲＶおよびＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩである。本出願
ではこれらのウィルスをまとめてＡＩＤＳウィルス／ヒ
ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）と呼ぶ。
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩがこのグループの原型ウィルス
であるので”ＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスの蛋白の配列に
対応する抗原性決定因子″という言葉は実際にどのＡＩ
ＤＳウィルスの蛋白質の配列をも指すことは理解される
ものである。
ＡＩＤＳの病因物質決定が困難である一つの理由は多く
のレトロウィルス抗原がＡＩＤＳ患者の血清試料と反応
性を示すことによる。例えば、ＡＩＤＳ患者の血清試料
はＨＴＬＶ−１［Ｈ。
ＥＳＳｅＸら、　”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｃｅ
１ｌ　ＭｅｍｂｒａｎｅＡｎｔｉｏｅｎｓ　Ａｓ５ｏｃ
ｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ＣｅｌｌＬｅ
ｔｌｋｅｌｌｌｉａ　ｖｔｒｕｓ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎ
ｔＳ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ”、５ｃｉｅｎｃｅ　２２０
巻、８５９−８６２頁（１９８３年）］およびＨＴ　Ｌ
　Ｖ　−ＩＩＩ　　［Ｈ，Ｇ、５ａｒｎｏａｄｈａｒａ
ｎら、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗ
ｉｔｈ　ＨｕｍａｎＴ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｒ
ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　　（ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ
）ｉｎ　　ｔｈｅ　Ｓｅｒｕｍ　　ｏｆ　　Ｐａｔｉｅ
ｎｔｓ　ｗｉｔｈ　　ＡＩＤＳ”　　、５ｃｉｅｎｃｅ
　２２４巻、５０６−５０８頁（１９８４年）］の両方
の抗原と反応することが示されている。ｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ
　Ｖのエンベロープ遺伝子産物は成人Ｔ−細胞白血病患
者の血清中の抗体と交叉反応性を有する抗原性を示した
［Ｔ、Ｋｉｙｏｋａｗら、”Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏ
ｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕ
ｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ：　ＥＸｐｒｅＳＳｉＯｎ　ｉｎ
　ＥＳＣｈＯｒｉＣｈｉａ　ｃｏｌｔ　ａｎｄｉｔｓ　
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ
　ｅｎｖ　ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、”　ＰＮＡＳ
　（ＬＩＳＡ＞　８１巻、６２０２−６２０６　（１９
８４年）］。成人Ｔ−細胞白血病（ＡＴＬ）　はＨＴＬ
Ｖ−ＩがＴ細胞の無制御生育を特徴とするＴｉ１ｌ胞の
悪性化を引き起す点で後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ
）と異なる。
ＡＩＤＳでは細胞生育の代りに細胞死滅が起る。
事実ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩの細胞毒性の特質のため本
疾患の特異的ウィルス原因を究極的に決定するのに問題
となった。
ＡＩＤＳの病因物質はＡＩＤＳに苦しんだ患者から単離
したＡＩＤＳに特有な細胞毒性レトロウイルスに感染し
た不滅化ヒト新生Ｔｌ１ｌ胞株（ＨＴ）を使用して単離
された。本ウィルスを用いた血清疫学的アッセイでＡＩ
ＤＳとＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原への抗体の存在と完全な相
関を示した［８．　Ｇ。
５ａｒｎｌｌｌａｄｈａｒａｎら、上述；　Ｊ、　５ｃ
ｈｊｐｂａｃｈら、後述］。
さらに、リンパ腺症候群の患者のほとんど８５％および
ＡＩＤＳｆｆｌＩＤＳｆｆｌ症病地域性愛男子のかなり
の割合がＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩに対する抗体を血液中
に保有していることがわかった。総合して、これらのデ
ータは全てＨＴ　Ｌ　Ｖ　ＩＩＩがＡＩＤＳの病因物質
であることを示す。
Ｈ−９細胞株［ＰＣＴ出願、公開番号、ＷＯ３５１０４
８９７］を用いてＡＩＤＳウィルスの培養に成功するま
では、ＡＩＤＳウィルスのｅｎｖ蛋白は単離され、性状
研究されまたは合成されることはなかった。これは主と
してウィルスが細胞毒性でウィルスの単離が出来なかっ
たためである［８．　ｐｏｐｏｖｉｃら、前述］。しか
し、本ウィルスの細胞毒性効果に耐性を示すヒトＴ細胞
株が発見されてからは、ＡＩＤＳプロウィルスＤＮＡの
分子クローニングが実施できた。
ヒト血液および他の生物試料のＡＩＤＳ診断のための感
度の高い迅速な方法およびワクチンによる本疾患予防の
方法の必要性は非常に大である。
現在使用できるアッセイおよび試験は事実上全て誤りを
伴なうものである。実際、疾患制御センター　（Ｃｅｎ
ｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ：　
ＣＤＣ）は現在使用されている試験はＨＴＬＶＩＩＩに
対する抗体の存在を血液について検索するためのみに使
用すべきと示した。ＣＤＣはさらに現在使用されている
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試験は危険の
高い集団の一般検索やＡＩＤＳの診断試験としては使用
すべきでないとまで述べている［Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅ
ｇｉｓｔｅｒ　　５０　（４８）　、９９０９頁、１９
８５年３月１２日］。
従来使用されてきたＡＩＤＳ試験の誤りはＡＩＤＳの病
因物質の特異的抗原蛋白を使用していない事に起因する
。従来使用した蛋白はウィルス溶解物に由来するもので
あった。この溶解物はウィルスに感染したヒト細胞、即
ち、ウィルスを生育させるのに使用した細胞、から調製
するので溶解物はウィルス蛋白の他にヒト由来の蛋白質
を含有する。従ってウィルス蛋白の純粋な抗原を調製す
るのは大変困難である。今まで使用した抗原は従って偽
陽性と偽陰性の結果を出した［Ｓ。
Ｂｕｄｉａｎｓｋｙ、　”ＡＩＤＳ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ、　Ｆａｌｓｅ　Ｔｅ５ｔＲｅｓｕｌｔｓ　Ｒａ１ｓ
ｅ　Ｄｏｕｂｔｓ”　Ｎａｔｕｒｅ　　３１２巻、５８
３頁（１９８４年）］。そのような溶解物蛋白／ペプチ
ドの使用により起る誤りは非ＡＩＤＳ特異蛋白質を実質
的に含有しない成分をＡＩＤＳ抗体との結合に使用する
ことで回避できる。実質的に純粋なＡＩＤＳエンベロー
プおよびコア蛋白質の成分を抗原として使用できる。
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩのエンベロープおよびコアの肉
蛋白質がＡＩＤＳウィルスの検索、診断および／または
ＡＩＤＳウルイスに対するワクチンによる予防に使用で
きる抗原性決定因子を保存していた。
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩに露出された人々でＡＩＤＳ感
染の危険のある人、或いは疾患を有する人がその血液中
のウィルスのコア蛋白（ｇａ　Ｇ　）および／またはエ
ンベロープ蛋白（ｅｎｖ）に対する抗体の存在により確
定できる［　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら、前述］。
血液または他の生物試料中のＡＩＤＳウィルス自体また
はウィルス由来の粒子の存在を調べる信頼できる高感度
の試験の利用も重要である。
Ｇｒｏｏｐｌｌｌａｎら［Ｂｆｏｏｄ６６巻、７４２−
７４４頁）］はＡＩＤＳウＡＩＤＳ患者る抗体は必ずし
もＡＩＤＳ患者の血液中に存在するものではないと報告
している。Ｇｒｏｏｐｍａｎらは一人のＡＩＤＳ患者お
よびもう一人の関連疾患（ＡＲＣ）の患者を検査し、血
液を採取すると抗体は陰性であるがＨＴＬＶ−ＩＩＩを
その血液から培養できた事を観察した。
最近組換えＤＮＡ技術がＡＩＤＳの問題に応用されてい
る。ＬＡＶ、ＨＴ’ＬＶＩＩＩおよびＡＲＶ−ＩＩ遺伝
子が分子クローニングされた［Ｊ。
５ＣｈＵｐｂａＣｈら、”５ｅｒＯＩＯ（］１Ｃａｌ　
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ａ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ　ｏｆ　
ｈｕｍａｎ　Ｔ−１ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ　（ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ　）　ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ　　ＡＩＤＳ”、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　　２　２　４　巻、　５０３−５０５頁Ｃ１９
８４年）　；　Ｈ，Ａ１１ｚｏｎら、”ｓｏ＋ｅｃｕ＋
ａｒｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　　Ｉｙｍｐｈａｄｅｎｏｐ
ａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ”　　、Ｎ
ａｔｕｒｅ　　３１２巻、７５７−７６０頁（１９８４
年）］　、ＬＡＶ、ＡＲＶ、１５Ｊ：びＨＴ　Ｌ　Ｖ　
−ＩＩＩのプロウィルス遺伝子の完全塩基配列は決定さ
れている［　Ｌ、　Ｒａｔｎｅｒら、”ｃｏｍｐ＋ｅｔ
ｅｎｕｃｌｅｏＮｄｅ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ　　ｏｒ　
　ｔｈｅ　　ＡＩＤＳ　　ｖｔｒｕｓ　　。
ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　”　、Ｎａｔｕｒｅ　　３　ｌ　３
巻、２７７−２８４頁（１９８５年）　：　Ｒ，５ａｎ
ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　ｏｆ’ａｎ　ＡＩＤＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓ　（ＡＲＶ−２）”５ｃｉｅｎｃｅ　
２２７巻、’４８４−４９２頁（１９８５年）　　；　
Ｓ、　　Ｍａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎら、　”Ｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅＳｅＱｔｌｅｎＣｅ　Ｏｆ　ｔｈａ　ＡＩＤＳ
　Ｖｉｒｕｓ、　ＬＡＶ”　Ｃｅ１ｌ　　４０巻、９−
１７頁（１９８５年）］。ＨＴＬＶ−■ＩＩのｅｎｖ遺
伝子の分子クローニングおよび発現も報告された（ｃｒ
ｏｗｔら、”ＨＴＬＶ−ＩＩＩｅ　ｎ　Ｖ　　Ｑ　ｅ　
ｎ　ｅ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　５ｙｕｔｈｅｓｔｚｅｄ
ｉｎ　Ｅ。
ｃｏｌｉ　ａｒｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｂｙ　ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｐｒｅｓｅｎｔ　１ｎｔｈｅ　５Ｏ
ｒａ　Ｏｆ　ＡＩＤＳ　りａｔｉｅｎｔｓ、”　Ｃｅ１
ｌ　　４１巻、９７９−９８６頁（１９８５年）　：　
ｃｈａｎｇら、”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　　ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌｌ
ｙｌｌｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ−ＩＩＩ　　（
ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ　　）Ｗｉｔｈａｎ　ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ　ｅｍｐｏｌｙｉｎｇ　ａ　ｒｅｃＯｍ
ｂｉＵａｎｔｃ、　　ｃｏｌｉ　　−ｄｅｒｉｖｅｄ　
ｖｉｒａｌ　ａｎｔｔｇｅｎｔｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｕ
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３巻、９０５−９０９
頁（１９８５年）１そしＴ　ＤＯＷｂｅｎｋＯら［Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、　、８２巻、７７４８−７７５２頁（１９８５年）］
　はＨＴＬＶ−ＩＩＩ　コア？Ａ白をＥ。
Ｃ０１；で発現した。
このような遺伝子操作技術の利用により、安全で信頼性
があり生産コストのより低い精製ウィルス抗原が入手で
きるようになった。しかし、さらに有利なのはｅｎｖお
よびｇａｇの両蛋白質に存在する抗原性決定因子を有す
る蛋白質が入手できる事であろう。そのような蛋白質は
Ａ■Ｄｓ抗体の検出のため非常に有力な道具であり、種
々の診断テストのおよびＡＩＤＳウィルスに対するワク
チンの可能性の基本となる。
従って、ＡＩＤＳウィルスを検索し、診断し、そして／
またはワクチンにより予防することを可能にする本発明
のポリペプチドを合成した。
ＡＩＤＳウィルスとはＡＩＤＳの原因物質として言われ
ているＬＡＶ、ＡＲ１５Ｊ：びＨＴＬＶ−ＩＩＩなどの
全ての変異種を包含するものと理解される。
さらに正確には、本発明は次の式により代表されるアミ
ノ配列を有する新規なポリペプチド；＋１１１１１ １　ＨＲＧＳＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡ
ＲＩＬＡＶＥＲ３１ＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＫ
ＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡ］１ＩＳ６１　ＮＫＬＬＥＱＩ
ＷＮＮＨＴＩＨ４ＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＧＳＡＤＴＧ９
１　Ｈ８５ＱＶＳＱＮＹＰＩＶＱＮＩＱＧＱＨＶＨＱＡ
ＩＳＰＲＴＬＮ１２１　１ＶＫＶＶＥＥＫＡＦｓＰＥＶ
ＩＰ）ＩＦｓＡＬｓＥＧＡＴＰＯＤ１５１　　ＬＮＴＨ
ＬＮＴＶＧＧＨＱＡＡＨＱＨＬＫＥ丁ＩＮＥＥ八ＡＥＷ
Ｄ１８１　ＲＶＨＰＶＨＡＧＰＩへＰＧＱＨＲＥＰＲＧ
ＳＤＩＡＧＴＴＳＴＬ２１１　ＱＥＱＩＧＷ）ＩＴＮＮ
ＰＰＩＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩ２４１　Ｖ
　ｎ　ＨＹ　Ｓ　Ｐ　Ｔ　Ｓ　Ｉ　Ｌ　Ｄ　Ｉ　ＲＱ　
Ｇ　Ｐ　Ｋ　Ｅ　Ｐ　Ｆ　ＲＤ　Ｙ　Ｖ　Ｄ　ＲＦ　’
／　Ｋ　Ｔ２７１　　Ｌ　ＲＡ　Ｅ　Ｑ　Ａ　ＲＩ　Ｒ
ＲＰ　Ａ　Ａ　Ｋ　Ｌ　Ｇ　Ｅ　Ｉ　Ｆ　ＲＳ　（ＥＮ
Ｖ（８０）−ＧＡＧ−１５）またはその断片、或いはＡ
ＩＤＳウィルスのｅｎｖおよびｇａＣＪ蛋白の配列に対
応する少なくとも一つの抗原性および／または免疫原性
決定因子を有する上記ポリペプチドおよび断片関連のア
ミノ酸置換によるアナログ類を提供する。
ポリペプチドに置いてその生物活性を本質的に変えない
アミノ酸の置換は文献で知られており、記載されている
。例えばＨ，ＮｅｔｌＰａｔｈおよびＲ，Ｌ、　Ｈｉｌ
ｌ、”Ｔｈｅ　Ｐｒａｔｅｉｎｇ”　、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ。
ニューヨーク（１９７９年）、特に１４頁の第６′図に
記載されている。頻繁に観察されるアミノ装置としては
Ａ１ａ／Ｓｅｒ、Ｖａｊ！／ＩＪｅ。
Ａｓ１）／Ｇｊ！ｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｊ！ａ／Ｇｊ
！ｙ、ＡＪ！ａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ。
Ａｈａ／Ｖａｎ！　、Ｓｅｒ”／ＧＩＶ、ＴＶｒ／Ｐｈ
ｅ、Ａｊ！ａ／Ｐｒｏ、１−ＶＳ／Δｒｇ。
Ａｓｐ／Ａｓｎ、ＬｅＵ／Ｉ］ｅ、　　Ｌｅｕ／Ｖａ！
、Ａ１ａ／ＧＩＩＪ、ＡＳＤ／Ｇｊ！Ｕおよびこれらの
逆である。
本発明のｅｎｖ／Ｇａ（Ｊポリペプチドはその生途方法
のためにメチオニンをアミノ末端の第一番目のアミノ酸
として含有する。一方、微生物宿主がアミノ末端のメチ
オニンを削除するように翻訳産物を処理（完全にまたは
部分的に〉することもある。
本発明では断片はそのままのｅ　ｎ　ｖ７ｇ　ａ　ｇポ
リペプチドの選択領域より成る。好ましい断片は（ＥＮ
Ｖ　（８０）　　ＧＡＧ　　１５ポリペプチドの少なく
とも５−８４および８７−２７６のアミノ酸を含有する
ものである。
本発明はさらに本発明のｅ　ｎ　Ｖ／Ｃｌ　ａ　ｑポリ
ペプチドをコードする遺伝子、その遺伝子を含む発現ベ
クター、および本発明のｅ　ｎ　Ｖ／Ｑ　ａ　Ｑポリペ
プチドを組換えＤＮＡ技術を用いて生産するのに有用な
形質転換株を提供する。本発明のもう一つの目的は得ら
れるｅｎｖ／ｇａｇポリペプチドの単離および多くの重
要な免疫方法への利用である。
本発明のｅｎｖ／ｇａｇポリペプチドは診断薬としての
利用を通じてヒト血清または涙、精液、腟分泌物および
唾液などの生物試料中のＡＩＤＳウィルスに対する抗体
の存在を検出するのに使用できる。ｅｎＶ／ＱａＱポリ
ペプチドは均質に調製できるので、これまでの比較的粗
なＨＴＬＶ−１１１ウィルス蛋白分離物に基づく診断薬
を使用した時に起った非特異的反応を防ぐことができる
。
免疫原として使用するには、本発明のｅｎｖ／ｑａｑポ
リペプチドはそこに含まれる抗原性決定因子に対するポ
リ−および／またはモノクローナル抗体を生産するのに
応用される。そのような抗体は、適当に標識した本発明
のｅ　ｎ　ｖ　／　Ｑ　ａ　Ｑポリペプチドと合わせて
、ヒト血清または他の生物試料中のＡＩＤＳウィルスま
たはそれ由来の粒子の存在を検出するためのラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ
（ＥＬＩＳＡ＞に用いることができる。本発明の方法に
より検出することが出来る粒子は勿論ウィルスのコア（
ｑａｌおよび／またはエンベロープ（ｅｎｖ）蛋白質の
断片を含む。
しかし、本発明のｅｎＶ／（Ｊａｒ；Ｊボリペプ″チド
は診断用の道具としてのみでなく、また治療剤としても
使用される。従って、本発明の目的はざらにこれらのポ
リペプチドを適当なワクチン製剤に取り込ませてＡＩＤ
Ｓウィルスに対する予防免疫性を提供するために使用す
ることにある。
本発明はまたざらに、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の
存在についてヒト血液を検査する診断方法およびその方
法に有用な試験キットを提供する。
この診断方法は従来ＡＩＤＳの血液検査に使用された全
ての非特異性の問題を解決するものである。
本発明の方法は多くのステップを伴ない、理論的順序で
、（１）ｅｎｖおよびｑａｑ配列をコードする遺伝子の
調製、（２）ｅｎｖ／Ｑａｓ融合遺伝子配列を含む組換
えベクター調製のための上記遺伝子の適当なりローニン
グベクターへの挿入、（３）組換えクローニングベクタ
ーの適合性宿主への移入、（４）挿入遺伝子配列を発現
できる形質転換宿主株の選択と増殖、（５）遺伝子産物
の同定および精製、（６）　１−（ＴＬＶ−１１１また
は関連ウィルスに対する抗体を検出するため、或いはヒ
ト血清または他の生物試料中の１フィルス自体またはそ
れ由来の断片を検出するのに使用できる抗体を生産する
ための抗原としての遺伝子生産物の使用、および（７）
ＡＩＤＳに対する可能な免疫予防防御のためのワクチン
製剤へのｅｎＶｌＱａＱ蛋白の利用を含む。
単離されるＨＴＬＶ−１１１プロウイルスＤＮＡは本発
明のＯａＣ＋およびｅｎｖ両遺伝子配列の材料として使
用できた。その代りに、ＨＴＵＶ−１１１のプロウィル
ス遺伝子を組み込んだ細胞からの遺伝子ＤＮＡも遺伝子
の材料となる［　Ｓｋａｗら、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｈｕｍａｎ
　Ｔ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ　（Ｉｙｍｐｈｏｔｒ
ｏｐｉｃ）　ｖｉｒｕｓｔｙｐｃＩＩＩ　ｉｎ　ｔｈｅ
　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ”　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６巻、
１１６５−１１７１頁（ｊ、９８４年）］。
ｅｎｖおよびＱａＱＭ伝子配判子配列の代りとして、遺
伝子配列の化学合成およびｅｎｖおよび０８ｇ遺伝子か
ら生成するメツセンジャーＲＮＡに相補的ＤＮＡの調製
があるが、これらに限定されるものではない。
ｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子を同定し、単離すれば、それ
らをプラスミドまたはファージ由来のどんな便利な発現
ベクターにもそれ自体知られる方法により導入できる。
プラスミド或いはファージ由来の便利な発現ベクターは
、例えばＨａｎｉａｔｉｓらによる実験室マニュアル、
”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｃａｂＯｒａｔｏｒｙ　、
　１９８２年、に記載されている。
ｅｎｖまたはｑａＱ遺伝子配列のいずれかが適当な発現
ベクターに挿入されると、もう一方の遺伝子配列はその
ベクターにうまく制限エンドヌクレアーゼ切断して二つ
目の遺伝子を最初のものと並置されるように挿入し、融
合遺伝子を創製できる。
本発明の好ましい実ｔＮＭ様では、合成遺伝子ｅｎｖ　
（８０）を含むプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＤＨＦ
ＲからのＸｈｏ−ＢａｍＨＩ断片を大腸菌ファージＴ５
プロモーター７１ａｃオペレーター発現制御配列と機能
的に結合したものとＢａｍＨＩ断片のＣ＞ａａ配列とを
予めＸｈＯＩおよびＢａｍ１−１ｆで切断したプラスミ
ドｐＤｓ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａに結合してＥＮＶ
　（８０）−ＧＡＧ−１５ポリペプチドの合成を指示す
る発現ベクターｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５を構
築した。ＥＮＶ　（８０）　−ＧＡＧ−１５ポｌＪペア
’ヂドの発現を改良するためにプラスミドｐ−ＥＮＶ　
（８０）−ＧＡＧ−１５のｃａｔ遺伝子を部分的に削除
して発現ベクターｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５（
Δｃａｔ）を構築した。
この構築に関する詳細は実施例１から７に記載されてい
る。ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５３！伝子の核酸配
列［Ｓａｎｇｅｒらの鎖停止法；　ＰＮＡＳＵ、Ｓ、Ａ
、７４巻、５４６３頁（１９７７年）により決定］およ
びそれから推定されるＥＮＶ（８０）　−ＧＡＧ−１５
ポリペプチドのアミノ酸配列は第９図に示す。
これらのＭ４築に有用なプラスミドを含むＥ、ｃｏｌ　
＋菌株（１）ＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａ、ｐＤＭ
Ｉ、１　：　ｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩ、ｐＤＭＩ、１で形
質転換したＥ、ｃｏｊ！ｉ　　Ｍｌ５およびプラスミド
ｐＡ−ｅｎＶ−２０で形質転換したＥ、ｃｏＪｉ　　Ｔ
ｅ１）は１９８５年１０月３日にゲッチンゲンのＤｅｕ
ｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ旧ｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ　　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に、それぞれＤＳ
Ｍ３５１７．０３Ｍ３５１９およびＤＳＭ３５１６の番
号で寄託された。
勿論、発現ベクターの選択部位に挿入されたｅｎｖおよ
びｑａｑ遺伝子配列は実際の遺伝子の部分↑ないＤＮＡ
配列と融合し、或いは完全遺伝子の一部分のみをコード
することもできるのは自明である。挿入した遺伝子配列
が、宿主中で、ＡＩＤＳウィルスのｅｎｖおよびＱａＯ
蛋白の配列に対応する少な（とも一つの抗原性および／
または免疫性決定因子を有するポリペプチド（ＥＮＶ　
（８０）−ＧＡＧ−１５またはその断片、或いはアミノ
Ｍ置換により得られるアナログ）を生産することだけが
必要である。
本発明のｅｎＶ／Ｑａｌ；Ｊポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列の発現方法は、例えばＮａｎ１ａｔｉＳら、
上述、からＪ：＜知られている。該ＤＮＡ配列がベクタ
ー中の発現調節配列と機能的に結合して保有する発現ベ
クターで適当な宿主を形質転換し、適当な生育条件下で
その宿主株を培養し、目的のポリペプチドを抽出して単
離するものである。本技術の熟練者はこれらの公知の方
法から目的の遺伝子発現に最も有効なものを、本発明の
範囲から逸脱することなく選択できる。
本発明に使用する特有の宿主の選択は本技術で認識され
る多くの要因に依存する。例えば、選択した発現ベクタ
ーとの適合性、ハイブリッドプラスミドによりコードさ
れる蛋白質の毒性、目的蛋白質の回収の難易性、発現特
性、生物安全性および費用などがある。これらの一般的
指針内で有効なバクテリア宿主の例はグラム−陰性およ
びグラム−陽性細菌、特にＥ、ｃｏｊ！　ｉおよびＢ、
　５ｕｂｔｉｌｉｓの菌株である。本発明で最も好まし
い宿主細胞はＥ、　ｃｏｌ　ｉ　　Ｍｌ　５　（Ｈ，Ｒ
。
ＶｉｌｌａｒｅｊＯら、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓ
ｅ　ｆｒｏｍｔｅｒｍ＋ｎａｔｒｏｎ　ａｎｄ　ｄｅ＋
ｅｔ＋ｏｎ　１ｌｌｔｌｔａｌ’ｌｔ　５ｔｒａｉｎｅ
”Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２０巻、４６６−４７４頁（
１９７４年）でＤＺ２９１として記載されている］であ
る。しかし、他のＥ、ｃｏ！＋菌株、例えばＥ。
ｃｏｌｉ　２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）、Ｅ
。
ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ（△ＴＣＣＮｏ、３１３４３）およ
びＥ、ｃｏＪｉ　　Ｗ３１１０（ＡＴＣＣＮｏ、２７３
２５）も使用できる。
本発明のｅｎＶ／ＧａＧポリペプチドはＥ。
ｃｏＩｔ中で生産されると大部分はバクテリアの不溶性
凝集物に封入され、このことは本ポリペプチドの精製を
多大に助ける。本発明のｅｎＶ／ｇａｇポリペブチ′ド
を単離するにはバクテリア細胞を破壊するか溶解して不
溶性ポリペプチドを遠心分離により回収する。次に緩衝
液、界面活性剤および塩溶液で沈でんを順次洗い、標準
的な蛋白精製技術を使用して実質的な精製を行なう。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のための試料のよ
うに少量の場合は、細胞をドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）のような界面活性剤で処理して破砕できる。より
多量の蛋白は音波処理またはフレンチプレスのような物
理的破壊手段で回収することが出来る。好ましくは細胞
をＥＤＴＡ。
ＥＧＴＡおよびリゾチームのような化学的および酵素的
処理で溶解する。
好ましくは不溶性ポリペプチド沈でん物は三回の別のス
テップで洗滌するが、これらのステップのどれかを合わ
せ、組みかえ、省略することもできる。沈でん洗滌の第
一ステップは緩衝溶液、好ましくは１０ＩｌｌＨトリス
、ｐＨ８，０で行なう。第ニステップでは沈でんを界面
活性剤溶液、好ましくは０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
１４で洗滌する。第三の最後の洗滌は塩溶液、好ましく
は７Ｍグアニジン−ＨＣｌで行なう。
最後の洗滌溶液から得られるｅｎ■／ｇａｇポリペプチ
ド沈でんはさらにゲル濾過、クロマトグラフィー、調製
用平板等重点電気泳動、ゲル電気泳動、高速液体クロマ
トグラフィー（以後ＨＰＬＧと呼ぶ；イオン交換、ゲル
濾過および逆相クロマトグラフィーを含む）およびアフ
ィニティークロマトグラフィー、例えば色素結合担体ま
たは該ｅ　ｎ　Ｖ／ｇａ　ｇポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体と結合したセファロース、などを含む公
知の蛋白精製技術によりさらに精製されるが、これらの
技術に限定されるものではない。好ましくは、ｅｎｖ７
ｇａｇポリペプチド沈でんはさらに５ｕｐｅｒｏｓｅ　
１２または５ｅｐｈａｃｒｙｌ　ｓ　−２００ゲルを用
いた限外濾過クロマトグラフィーで精製される。
本発明による好ましいｅ　ｎ　ｖ／ｇ　ａ　ｇボリペプ
　゛チド（ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５＞の精製の
詳細は実施例７に記載されている。
本発明のｅｎＶ／ｇａｇポリペプチドはこのｅ　ｎ　Ｖ
／Ｑ　ａ　ｑポリペプチドおよび適合した医薬担体とか
ら成るワクチン製剤に使用できる。ポリペプチドは精製
してワクチン製剤に使用でき、或いは技術で公知の修飾
によりさらに免疫原性を高めることもできる。例えば、
ｅ　ｎ　Ｖ／Ｑ　ａ　Ｇポリペプチド１，３−ジシクロ
へキシルカルボジイミドのような架橋剤と反応させて高
免疫原性マトリックスに変換できる。またｅｎｖ／ｇａ
ｇポリペプチドを高免疫原性蛋白担体分子と直接または
適当なリンカ−分子を介して共有結合させることもでき
る。使用できる担体分子としては例えばスカシガイのヘ
モシアニンおよびジフテリア毒素のような種々の細菌ト
キソイド（不活化毒素）などがある。ｅ　ｎ　ｖ／ｇ　
ａ　（Ｊポリペプチドを細菌トキソイドど結合する場合
には、ＡＩＤＳと共にそのトキソイドが由来するバクテ
リアに対して予防を示す二価性ワクチン製剤を生産でき
る。さらに、ワクチン製剤はＡＩＤＳに加えて他の疾患
に対しても免疫性を提供する他の抗原を含むこともでき
る。
投与方法、抗原量、注射の頻度は全て通常の技術熟練の
範囲である。
さらに、本発明のｅｎＶ／ＱａＣＪポリペプチドは技術
でよく知られる方法によってＡＩＤＳ−関連抗体の検出
のための診断試薬として使用できる。
ＡＩＤＳに対する抗体の測定に於けるこのｅｎｖ／ｇａ
ａポリペプチドの主たる利点は今まで使用されたきた公
知の抗原と比較しての特異性にある。
ＡＩＤＳウィルスに対する抗体測定の−っの方法による
と、いわゆるゝ゛ウエスタンブロツテイング分析使用す
る［Ｔｏｗｂｔｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。
Ａｃａｄ、　ＵＳＡ　７６巻、４３５０−４３５４頁（
１９７９年）〕。この方法では本発明のポリペプチドを
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから電気泳動的にニト
ロセルロース濾紙に移動する。次にこのニトロセルロー
ス紙を検査する血清で処理する。
洗滌の後に、ニトロセルロース紙をペルオキシダーゼで
標識した抗−ヒトＩｏで処理する。次にペルオキシダー
ゼ活性を適当な基質、例えば０−フェニレンジアミンで
測定する。勿論放射能または蛍光標識のような他゛の標
識も使用できる。
本発明のｅ　ｎ　ＶｌＱ　ａ　（Ｊポリペプチドを用い
たＡＩＤＳウィルスに対する抗体測定のためのより便宜
的方法は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であ
る。本アッセイは以下より成る： ■　本発明のｅｎｖ／ｇａｇポリペプチドの固体支持体
への固定； （へ）　ＡＩＤＳウィルスに対する抗体を含有すると予
想されるヒト−血清試料のステップ（２）の固定ポリペ
プチドとの接触； （へ）　ステップ０の複合体からの未結合物質の洗滌；
および （へ）　標識したスタフィロコッカス・アウレウスプロ
ティンΔまたは抗−ヒト■ｑのようなヒト抗体を選択的
に検出できる標識試薬の添加による複合体の検出。
適当な固体支持体としては試験容器の内壁（ガラス製ま
たは人工材料の試験管、タイタープレートまたはキュベ
ツト）および固体の表面（ガラス製゛または人工材料の
棒、端を厚くした棒、先端を丸く突出させた、または薄
い層にした棒）がある。
ガラスまたは人工材料製のビーズは特に適した固体担体
である。
有効な標識は試薬とその相手との結合を阻害しない検出
機能を右するものなら何でもよい。
ＦＩＩＳＡアッセイおよび他の免疫アッセイ使用できる
多くの標識が知られており、例えば西洋ワサビのペルオ
キシダーゼ、　Ｃおよび　　■のような放射同位体、赤
土キレート剤またはフルオレセインのような蛍光体、ス
ピン標識などがある。
本発明の好ましい実ｍ態様ではＥＬＩＳＡ（ＥＩＡ）ア
ッセイを本発明のｅｎｖ／（Ｊａ（Ｊポリペプチド、好
ましくはＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５をビーズに固
定して用いた以下に述べる検査キットで行なう。そのよ
うなアッセイ方法の代表的な実施態様では試料を三速で
アッセイする。
被覆した球体に患者血清、陽性および陰性の対照を添加
して３７℃で１時間インキュベートする。
未結合抗体を除去するためにビーズを洗滌した後、西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗−ヒト
Ｉｑを添加する。ＨＲＰ結合体を３７゜℃で１時間反応
させてからビーズを洗滌して未結合ＨＲＰ結合物を除去
する。ＨＲＰ基質であるＯ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）をビーズに添加し、室温で３０分間反応させる。酵
素反応はＨＳ０４の添加により停止し、トＩＲＰが生成
する黄褐色を分光光度計で測定する。４９２　ｎｌｌの
吸光度はプレートの抗原に結合したヒｔ−１（７Ｇと結
合したＨＲＰ＝結合体の存在を示す。本発明のＦＬＩＳ
Ａアッセイの詳細は全て実施例８に示す。
本発明のｅ　ｎ　ＶｌＱ　ａ　Ｑポリペプチドを用いた
ＡＩＤＳウィルスに対する抗体測定の他の方法はいわゆ
る゛二重抗原サンドウィッチ法“による酵素免疫テスト
である。水沫はＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）４ｅｔｈ
ＯｄＳ　２０巻、２５−３４頁（１９７８年）に記載さ
れるＲ、　Ｌ　ＨａｉＯＩｉｎｉの研究に基づいている
。
この方法では、検査する血清を本発明のポリペプチドを
被覆した上述の固体支持体およびペルオキシダーゼで標
識した本発明のポリペプチドと接触させる。免疫反応は
一つまたは二つのステップで行なうことができる。免疫
反応を二つのステップで行なう場合には二回のインキュ
ベーションの間に洗滌ステップを入れる。その後でペル
オキシダーゼを基質、Ｏ−フェニレンジアミンで測定す
る。
本発明によるｅ　ｎ　ＶｌＱ　ａ　ＱポリペプチドはＡ
ＩＤＳウィルスに対する抗体測定に有用なばかりでなく
、これらのポリペプチドがＡＩＤ’Ｓウィルスに対する
抗体を誘導するのに有用であるためにＡＩＤＳウィルス
自体またはそれに由来する断片の測定にも有用である。
抗体はｅｎ■／ｑａｇポリペプチドおよび適合性医薬担
体より成るワクチン製剤をその蛋白に対する抗体生産を
誘発するのに十分な量哺乳動物または鳥類に注射して生
産できる。必要とされるポリペプチドの適量は技術熟練
者には公知であり、また決まった実験により決定できる
。本発明に関連して使用する際、「医薬担体」という用
語はヒト投与に適した標準成分または動物の予防接種で
使用する典型的アジュバントを意味する。
動物の予防接種に適したアジュバントにはフロイント完
全または不完全アジュバント（ヒトまたは家畜には適さ
ない）、アジュバンｈ６５（ピーナツ油、マニトールモ
ノオレートおよびアルミニウムモノステアレー１・を含
む）、水酸化アルミニウム、りん酸アルミニウムおよび
ミョウバンなどの金属ゲル；ヘキサデシルアミン、オク
タデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシ
ル臭化アンモニウム、Ｎ１−Ｎ−ジオクタデジルーＮ’
−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン
）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニ
ックポリオール類のような表面活性剤；ピラン、硫酸デ
キストラン、ポリ■Ｃ１ポリアクリル酸、カルボボール
のようなポリアニオン類；ムラミルジペプヂド、ジメチ
ルグリシン、タフツシンのようなペプチド類；および油
脂乳化液がある。ｅ’ｎＶ／ＦａＱポリペプチドはまた
リポソーム或いは他の微小担体に取り込ませてから、或
いは多糖類、他の蛋白や伯のポリマーと結合して、或い
は’Ｉｓｃｏｍｓ”　　（免疫促進複合体）［Ｈｏｒｅ
ｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３０８巻、４５７頁（１９８４年
）］を生成させるためＱｕｉｔ−八と組合せて投与する
ことも出来る。
典型的には、第一回目の接種後数週間目に一回またはそ
れ以上の追加免疫を行なうが、総合効果としてｅｎｖ／
ｇａｇポリペプチドに対する高い抗体価を得るためであ
る。抗体は通常の方法で回収される。
伯の方法はモノクローナル抗体を生産するためのよく知
られるＫｏｅｈｌｅｒおよび旧１ｓｔｅｉｎ法を用いる
。同じ抗原の異なるエピトープに対して生成した異なる
抗体を見つけるためには５ｔｊｈｌｉらの方法［Ｊ、　
Ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ（ｌｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ
　３２巻、２９７−３０４頁（１９８０年）］を使用で
きる。
本発明の使用により得られる抗−ｅｎｖ／ｑａｇポリペ
プチド抗体はＡＩＤＳウィルスまたはその断片のための
各種診断テストの調製に利用できる。診断系としては遊
離溶液または固体状態でのラジオイムノアッセイの形態
でよい。また酵素結合免疫吸着アッセイも免疫プロット
分析に基づくアッセイと共に考えられる。これらのアッ
セイは直接法でも間接法でもよく、抗−ｅｎｖ／ｑａｃ
＋ポリペプチド抗体に対して生成した第二抗体の応用を
伴なう。多くの酵素活性も抗体と結合でき、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼおよびアルカリフォスファターゼが可能性のある例の
いくつかである。
これらのテストの多く、に通じる基本的原狸はＡＩＤＳ
ウィルスまたはその断片を含有すると考えられるヒト血
清または他の生物試料をｅｎｖ／ｑａｑポリペプチドに
対する抗体の既知量と反応して抗原−抗体複合体を形成
する。このようにして生成した複合体を適当な方法で検
出するものである。
技術熟練者には抗−ｅｎｖｌＱａＱポリペプチド抗血清
を、多くの凝集テストの一つのように診断分野で利用す
る数多くの方法があることが理解されよう。凝集アッセ
イでは、抗体とＡＩＤＳウィルスまたはウィルス断片と
の相互反応は粒子を抗−ｅ　ｎ　Ｖｌｏ　ａ　（Ｊポリ
ペプチド抗体で被覆した系を用いて検出できる。粒子と
してはラテックスビーズ、リポソーム、赤血球、ポリア
クリルアミドゲル、または多くの適当なポリマーなどが
ある。
前述の記載のような△ＩＩ）Ｓウィルスまたはその断片
或いはＡＩＤＳウィルスに対する抗体測定の方法は容器
中に本発明によるポリペプチド或いは本発明によるポリ
ペプチドで誘発したＡＩＤＳウィルスに対する抗体を含
む適当な検査キット中で実施できる。
本発明によるＡＩＤＳウィルスに対する抗体の測定のた
めの検査キットは以下より成る：（２）本発明のポリペ
プチド、好ましくはＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５ポリ
ペプチドを吸着させたビーズの一つの容器； （へ）　ヒト血清のテスト試料中のＡＩＤＳ抗体の量を
測定するための酵素−抗体結合物、好ましくは西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗−ヒトＩＱ
の一つの容器； （９既知量のＡＩＤＳ抗体を含有し、陽性対照として用
いるヒト血清の一つの容器； Ｉ　　ＡＩＤＳ抗体を含有しない陰性対照として用いる
ヒト血清の一つの容器： （ｅ）　　酵素−基質錠剤、好ましくは０−フェニレン
ジアミン錠剤の一つの容器； （０試験緩衝液の一つの容器： ＠　酵素−基質緩衝液の一つの容器；および０　Ｗ素反
応を停止するＨ　Ｓ０４の一つの容器。
本発明のテストではビーズの使用のみを記載ずるが、本
発明のポリペプチドを吸着させるのに適したどんな固体
支持体、例えばマルチ−ウェルマイクロタイタープレー
トまたは試験管などもビーズの代わりに使用できる。
本発明の検査キットおよびＡＩＤＳウィルスに対する抗
体測定のための使用に関する詳細は実施例８に示しであ
る。
本発明は次の図と関連して以下の実施例を基にさらによ
く理解されるが、これらの実施例に限定されるものでは
ない。
使用した記号および略号は： Ａ、Ｂ、ＢＧ、Ｅ、Ｈ，Ｐ、ＰＶ、Ｓ、ＳＣ，Ｘおよび
ｘｂはそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＡ　ａ　ｔ　Ｉ
Ｉ、ＢａｍＨ■、Ｂｇｊ！、１１ＥＣＯＲ１１Ｈｉ　ｎ
ｄｌＩＩ　、ＰＳ　ｔ　１１ＰＶｕｌＩ、ｓａｚ　Ｉ、
Ｓｃａ　Ｌ　Ｘｈｏ　ｌおよびＸｂａ　Ｉを示す。
区はｂｊ！ａ１ｊ！ａＣＩおよびｎｅｏ遺伝子のプロモ
−ターを；巨はｂｌａ、Ｃａｔ、ｎｅｏおよび！ａｃｒ
のりボゾーム結合部位を二二はｔｏおよびＴ１ターミネ
ータ−を；口は１ｌｉｌＪ御可能なプロモーター／オペ
レーター成分ＰＮ２．＊／。
を：口はりボゾーム結合部位ＲＢＳＩ■およびＲＢＳＩ
Ｉ、３Ａ＋５Ａを；→はこれらのりボゾーム結合部位の
制御下にあるコード領域を；＃はＤＮＡ複製（ｒｅｐｌ
）に必要な領域を；−卜はジヒドロ葉酸、レダクターゼ
（ｄｈｆｒ）、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（ｃａｔ）、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、
１ａＣレプレツサーおよびネオマイシンフォスフオドラ
ンスフェラーゼ（ｎｅｏ）のコード領域を：％はｅｎｖ
　（８０）−遺伝子を：そして口はｑａｃｔ遺伝子を示
す。
第１図は合成ｅｎｖ　（８０）−遺伝子を構成する合成
オリゴヌクレオチド断片を示す。
第２図はプラスミドｐＡ−ＥＮＶ−２０の構築の概略を
図示したものである。図の左上の部分には合成オリゴヌ
クレオチドの４つのユニットへの集合とこれらの遺伝子
ブロックのｐＵＣプラスミドへのサブクローニングを示
す。左下および右はこれらのブロックの集合とｅｎｖ　
（８０）−遺伝子を ｓａｍｔ−＋ｒ−断片として含有するプラスミドｐＡ−
ＥＮＶ−２０を示す。
第３図ａ）はプラスミドｐＤｓ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋
５　Ａを図示したものである。
ｂ）には制御可能なプロモーター／オペレーター成分Ｐ
　　才　、リボゾーム結合部位Ｎ２５　１０ ＲＢＳＩｒ、３Ａ＋５Ａ、ｃａｔ遺伝子およびターミネ
ータ−Ｔ１を含有するＸｈｏ　１／ＸｂａＩ断片のヌク
レオチド配列を示す。
ここではａ）で示した制限エンドヌクレアーゼ部位を上
線で、ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａの制御下にあるクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼとそのＮ末端
の余分の２１個のアミノ酸をコードする領域を下線で示
す。さらにｐＤＳ５／ＲＢＳＮ、３Ａ＋５ＡのｐＢＲ３
２２の位置を図示する。
数字はｐＢＲ３２２のヌクレオチド配列を示す［Ｊ、　
Ｇ、　５ｕｔＣｌｉｆｆｅ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ（
１ｔｌａｒｂｏｒ　５ｙＩｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏ
ｌ、　４３巻、７７−９０頁（１９７９年）］。
Ｌ４Ｊａ）はプラスミド１）ＤＳ８／ＲＢＳＩＩの図示
である。
ｂ）およびＣ）には制御可能なプロモーター／オペレー
ター成分ＰＮ２５　”　１０’リボゾ一ム結合部位Ｒ１
３ＳＩＩ、　ｄ　ｈ　ｆ　ｒ−３１伝子、ターミネータ
−ｔｏ、ｃａｔ遺伝子およびターミネータ−Ｔ１のヌク
レオチド配列を示す。ここではａ）に示した制限エンド
ヌクレアーゼ部位を上線で、ＲＢ　Ｓ　ＩＩ制御下のジ
■ドロ葉酸レダクターゼとそのＮ末端のさらに６個の′
アミノ酸（ＤＨＦＲ”　）をコードする領域を下線で示
す。ざらにｐａｓｓ／ＲＢＳＩＩのｐＢＲ３２２の位置
を図示し、数字はｐＢＲ３２２のヌクレオチド配列を表
わず［Ｊ、　Ｇ、　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ　、前述］。
第５図ａ）はプラスミドｐＤｔｖｌ１１１の図示である
。
ｂＬ　ｃ）およびｄ）に本プラスミドの全ＤＮＡ配列を
示す。ａ）に示した制限エンドヌクレ、１ アーゼ部位は上線で、ネオマイシンフォスフォトランス
フェラーゼ（ｎｅｏ）および１８Ｃレプレツサー（ｊ！
ａｃＩ）を下線で示す。
第６図はプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−Ｄ）−ＩＦＲ
の構築の概要を図示したものである。
第７図はプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５
の構築の概要を図示したものである。
ａ）、ｂ）およびＣ）はそれぞれ断片１．２、および３
の単離を表わす。さらにｂ）はｇａｇ遺伝子のＳｓｔか
らＢ　Ｑ　Ｉ　ＩＩまでの断片のヌクレオチド配列を示
す。制限エンドヌクレオチド部位Ｓｓｔ　Ｉ、ＰｖｕＩ
Ｉ、ＨｉｎｄｌＩＩおよびＢ　ａ　Ｉ　ＩＩは上線で示
す。
ｄ）は断片１．２および３の集合とプラスミドｐＥＮＶ
　（８０）−ＧＡＧ−１５の形成を示す。ＥＮＶ　（８
０）−ＧＡＧ−１５のコード領域は矢印で示す。
第８図はプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５
（Δｃａｔ）の構築の概要を図示したものである。ＥＮ
Ｖ　（８０）−ＧＡＧ−１−４８艷 ５のコード領域は矢印で示す。
［ｌはＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５遺伝子ノ全ヌク
レオチド配列およびそれから予想されるＥＮＶ　（８０
）−ＧＡＧ−１５ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
ｇはバクテリア抽出物を含むＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ
−１５ポリペプチドの５ｅｐｈａｃｒｙ＋Ｓ−２００ス
ーパーフアインのカラムからの典型的な溶出プロフィル
を示す。
匙土ユＩは５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００スーパー
フアインのくり返しクロマトグラフィーで得られるＥＮ
Ｖ　（８０）−ＧＡＧ−１５の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を
示す。第１列：バクテリア抽出物を含むＥＮＶ　（８０
）−ＧＡＧ−１５のカラムにのせたもの；２列から１０
列：　ＥＮＶ　（８０）　−〇ＡＧ−１５の異なるプー
ル。
第１２図は同時オリゴヌクレオチド合成の装置を示す。
本発明のポリペプチドＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５
を発現するプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１
５（Δｃａｔ）（７）構築、本ホリヘフチドのＥ、ｃｏ
ｌｔでの生産およびその精製についてはさらに詳細に以
下の実施例で説明する。
〈実施例１〉 合成オリゴヌクレオチド断片は添付の第１図に示す。オ
リゴヌクレオチド断片自体は調節ボアガラス（ＣＰＧ）
を支持材料として用い［Ｂ、　Ｓ。
５ｐｒｏａｔおよびＷ、　Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、　Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒ　、　Ｌｅｔｔ。
２４巻、５７７１−５７７４頁（１９８３年）；Ｓ、　
Ｚ、　ＡｄａｍＳら、Ｊ、八ｍｅｒ、　ｃｈｅｍ、　Ｓ
ｏＣ，１０５巻、６６１−６６３頁（１９８３年）］、
同時に調製した。この目的のため作製した装置を第１２
図に示す。原理的には、中央シャフトに多数のディスク
が重ねられ、各ディスクが別々に回転できるようになっ
ている。中央シャフトの穴の他に各ディスクには４個の
小さい穴と互いに７２６に位置する１つの大きい穴とを
有する。大きい方の穴は反応槽を表わし、その下部と上
部にフリットを持つ。
ディスク１および１４は金属板でばねつきのナツトから
均等な圧力がかかるようにし・である。ディスク２およ
び１３は、反応槽を持たず、溶媒および試薬の注入と排
出のための管の部分として機能する。
同時合成を開始する前に合成しようとするＤＮＡ断片の
対応する３′−ヌクレオチドを有する官能化した支持体
の適当量を各桁に入れる。次に全てのディスクを官能化
支持体につなげていく延長単位に対応したそれぞれの位
置、即ち、次の塩基としてＡが必要な反応槽はＡの位置
（第１２ａ図のディスク３．４．７および１０）に、Ｃ
を必要とするディスクをＣの位置（第１２ａ図のディス
ク８）に、という具合にまわす。可能な位置の全てで小
さい穴と反応槽とがディスクの層を通してカラムの様な
系を作る。ここで４種の異なる延長単位に対応する４つ
の位置のそれぞれにＡ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかを適
当量注入すると全ての配列が同時に伸長する。全ての反
応および伸長サイクル間の洗滌は同様にして同時に行な
う。
液の漏れはディスクの各穴の下にゴムのリングをつけて
防ぐ。
次の伸長サイクルではディスクを新しい位置にまねさね
ばならない。これはばねつきナツト（第１２ａ図）をゆ
るめて行ない、ディスクを新しい位置にしてから再びし
める。一つのディスクでの合成が終了する度に反応槽を
空の位置にまわして他のディスクの合成を続ける。事実
上背圧はかからないので、ディスクの数は制限されない
。
ＤＮＡ断片の合成に用いるＣＰＧ−支持体は３′−サク
シニル化ヌクレオチドをメシチルスルボニル−゛ニトロ
トリアゾール（ＭＳＮＴ）または−クロリド（ＭＳＣＬ
）およびＮ−メチル−イミダゾールを用いて支持体に直
接結合して官能化した。この操作は非常に速くて効率が
よく、２５から３３μｍｏｌ／ｇのＣＰＧ−支持体で結
合する。
未反応のアミノ基はアシル化により保護する。
長鎖アルキルアミン官能基を有するＰｉｅｒｃｅにより
製造されたＣＰＧ５ｇと２．５ｍｍ０１のスクシニル化
ヌクレオチド５０ＲＩ！の無水ピリジンおよび２ｄのト
リエチルアミンに添加し、後に溶媒を蒸発させる。この
操作をくり返えし、残留物を３０−の無水ピリジンに入
れ、１２．０ｍｍｏｌ（３，６ｇ＞のＭＳＮＴおよび１
．４ｄのＮ−メチル−イミダゾールを添加した。混合液
を時々振りながら室温で１時間反応させる。次に反応液
をガラス濾過器で濾過し、ピリジンおよびエーテルで洗
滌後真空で乾燥する。支持体を他のフラスコに移し、Ｔ
Ｉ−（Ｆ中６．５％（Ｗ／Ｖ）のジメチルアミノピリジ
ン（ＤＭＡＰ＞溶液１５−および無水酢酸／ルチジン（
１／１　：　ｖ／ｖ）１５ｍを添加して未反応のアミノ
基を保護する。１時間の反応後に反応液を再び濾過し、
支持体をピリジンとエーテルで洗滌後真空で乾燥する。
結合量は遊離するジメトキシトリチル陽イオンをＵｖ測
測定て計算し、通常２５−３３０　ｍｏｌｅｓ／　ｇ支
持体である。ＭＳＮＴの代わりにＭＳＣＩを用いても同
じ範囲の官能化ができる。
ＤＮＡ断片の合成はそれぞれ１μｎ＋ｏｌｅの官能化Ｃ
ＰＧ−支持体で開始した。伸長単位としてはデオキシヌ
クレオシド−３′−β−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソ
プロビルアミノアミジト［Ｎ、　Ｄ、　５ｉｎｈａら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２巻、４５
３９−４５５７頁（１９８４年）］を用い、これを縮合
反応のためテトラゾールで活性化した。
一つの単位を添加するための伸長サイクルを次の表に示
す： ３％のジクロロ酢酸　チル化 ２）　　　アセトニトリル　　　洗　滌　　　４３）　
　　活性化アミジット　　伸　長　　５４）　　　アセ
トニトリル　　　洗　滌　　　０．５６）　　　アセト
ニトリル　　　洗　滌　　　Ｏ，Ｓ７）　　　　　Ｉ２
−溶液　　　　　　　　酸　　化　　　　３８）　　　
アセトニトリル　　　洗　滌　　　２脱トリチル化のス
テップはジクロロ酢酸で行ない［３，Ｚ、　Ａｄａｍｓ
ら、前述］、コレハ脱フリン化に関する限り非常に安全
で切断時間はＺｎＢｒ２を切断試薬として使用する時の
ように鎖の長さに依存しない。洗滌ステップは全てアセ
トニトリルで行なう。配列の各伸長（一つのディスクで
）には２０塔のアミジットおよび７■テトラゾールをア
セトニトリル中に含む溶液２００μｍを用いた。
反応を完全に行なうために伸長サイクルの異なる反応の
時間は必要であろうと思われるよりわずかに長くした。
溶媒および試薬は全てアルゴンの加圧（０，０２バール
）で分配し、系は連続の流れのように進行する。活性化
した伸長単位は同時合成開始前に調製した保存溶液から
取った。伸長単位は四個の塩基に対応する４つのチャネ
ル中に注射針で注入し、無水アセトニトリルを置換した
。
各伸長ステップ後のアミノ基保護のステップは無水酢酸
／ルチジン／ＴＨＦ　（１／１／８　：　ｖ／ｖ）とＴ
　Ｉ−Ｉ　Ｆ中６．５％のジメチルアミノピリジン（Ｄ
ＭＡＰ）とを１／２　（ｖ／ｖ）の割合で混合した混合
液で行なった。酸化ステップは各伸長反応の後にＴＨＦ
／ルチジン／Ｈ２０（７８／２０／２：ｖ／ｖｌ中０．
２Ｍの沃素溶液で行なった。
Ｂ、　処理、精製および単離 異なるディスクの全ての配列の合成を終了した後、支持
体を除去して個々の配列を同時に処理した。ねじぶたつ
ぎの１．５ｄエツペンドルフ管で支持体を濃アンモニア
で一回処理してりん酸保護基と塩基保護基を切断して支
持体から除去した。
この目的には管を閉じてエツペンドルフ加熱ブロックに
て５６℃−晩保持した。冷却後、各エツペンドルフ管の
底に小さい穴をあけ、管を再び閉じると圧がかかつてア
ンモニア溶液が支持体から遊離して弛のエツペンドルフ
に移行する。加速真空濃縮機で濃縮後ＤＭＴ基を除去す
るために８０％酢酸で処理する。再度濃縮して（真空濃
縮１）各残留物を調製用２０％ポリアクリルアミドゲル
で精製した。バンドはＵＶにより検出し、抽出後逆相（
ＲＰ）小カラムで脱塩した（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ、
Ｃｈｅｍ、　Ｃ０ｒｐ、ニューシャーシー州フィリッブ
スバーグ）。各ＤＮＡ断片の実際の重量を測定後、その
純度を３２Ｐで標識して分析用ポリアクリルアミドで検
査した。
それぞれの保護オリゴヌクレオチド断片を含む各合成の
ＣＰＧの全量の１／１００をねじぶた付きの１．！Ｍエ
ツペンドルフ管に入れる。７００μｌのアンモニア（ｍ
ｉｎ、２５％）を添加し、管をねじぶたで閉めてエツペ
ンドルフ加熱ブロックにて５６℃で１６時間保持する。
後に管を冷却して管の底に小さい穴をあける。ふたを閉
じてかかる圧によりアンモニア溶液を他の管に移して集
める。
支持体を２００μｌのアンモニアで洗って合わせたアン
モニア溶液をドライアイスで５分間冷却後加速真空濃縮
機で蒸発させる。残留物を８０％酢酸３００μｌに入れ
て室温で９０分保持する。次におよそ９００μｌのエー
テルを添加し、得られる沈でんを室温で遠心分離にて集
める。上澄を除去してペレットを水に溶解し、尿素色素
を加えて９５℃に力旧熱してからポリアクリルアミドゲ
ル（４０Ｘ　２０　Ｘ　０　、２　ｃｍ　）にかりる。
電気泳動の後、バンドをＵＶ照射で検出し、ゲルから切
り出してＤＮＡ断片を水で溶出し、小ＲＰ−カラム（Ｊ
、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｒｐ、　）を
用いて同時に脱塩する。得られた各オリゴヌクレ第チド
断片の量をＵＶ吸収で測定し、　Ｐで標識後分析用ポリ
アクリルアミドゲルで純度を確認した。
〈実施例２〉 ｐＡ’−ＥＮＶ−２０の構築 Ａ、原理 合成オリゴヌクレオチドを両端が特有の制限部位を有す
る４つの遺伝子ブロックに分りる。これらのブロックを
ｐＵＣプラスミドにサブクローンできる。サブクローン
をプラスミドの特有なＡ　ａ　ｔ　ＩＩ制限部位を用い
て比較的容易に集められ、その結果ザブクローン間のハ
イブリッドプラスミドを構築できた。その戦略の概要を
第２図に図示する。
Ｂ、　合成オリゴヌクレオチドの各「遺伝子ブロック」
との結合 凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを室温１時間水に溶解
してＤＮＡ１１度を１０　ｎｍｏｌｅ　／ｄとする。
各オリゴヌクレオチドの１００　ｐｍｏｌｅｓを１μｌ
のγ””’　−ＡＴＰ　（２ｐｍｏｌｅｓ：　５０００
Ｃｉ／ｍＨｏ１）　、５０ｕｌｔの５０ｍＨトリス塩酸
、ｐＨ８，０、に溶解した０、５ＵのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ＢＲＬ、バーゼル）、１０ｍＨＭＱＣｊ
！を用いて３７℃５分間でりん酸化した。各遺伝子ブロ
ックの最後の断片以外の各反応は６μｍの０゜５０１Ｈ
ＡＴＰの添加でチェースした。反応は試料を６５℃５分
間加熱して終結させた。各反応液の１０μｌを遺伝子ブ
ロックに対応する４つのエツペンドルフ管にとる。５μ
ｍの１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７，８，１μｌのＩＭ　　Ｍ
ｑＣｊ！　　、２μｍの５Ｍ　　ＮａＣｆおよび３２μ
ノの１−１２０を添加接、試料を５分間煮沸する。次に
管を２リツトルの沸とう水の入ったビーカーに入れる。
ビーカーを低温室におよそ４ｖｊ間放置して試料を徐々
に４℃まで冷却する。結合反応は１０μｍのＩＭＤＴＴ
（ジチオスライトール）、１μｍの１００ｍＨＡＴＰお
よび５μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（５Ｗｅｉｓｓユニ
ツト、ファルマシア、ウプサラ）を加えて１２℃２４時
間で行なった。次に試料に１２μｌの５Ｍ酢酸リチウム
および２０μｌイソプロパツールをドライアイス上で添
加して沈でんさせる。管を１２．０００ｒｐｍ　１０分
間遠心分離する。
上澄液をマイクロピペットで除去してからペレットを７
ｄの８０％エタノールで洗滌後真空乾燥する。ＤＮＡペ
レットを１０μｌのゲル試料緩衝液（０，０５％ブロモ
フェノールブルー、０．０５％キシレンシアツール、１
０ｍＨＥＤＴＡ（エチレンジアミン−テトラ酸１１ｔ）
、ｐＨ８，０）に溶解した。試料を次にＩＸＴＢＥ　［
０，’０８９Ｍトリスー硼酸、０．０８９Ｍ硼酸、０．
００２ＥＤＴＡ、■、）ｌａｎｉａｔｉｓら、）（ｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　。
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　（１９８２年
）］を含有する１０％ポリアクリルアミドゲル（５０Ｘ
５０Ｘ１Ｍ）でバイオラッドミニスラブゲル系を用いて
４００Ｖ２０分間電気泳動を行なった。電気泳動後ゲル
をエチジウムプロミド（１０μ’Ｊ／ｒｄ”）で５分間
染色を行なう。ＤＮＡのバンドを３００　ｎｍのＵＶ下
で検出する。目的の大きさのバンドをメスを用いて切り
出す。マーカーＤＮＡとしては１（ａｅＩＩＩ　　（Ｂ
ＲＬ、バーゼル）で消化したファージψＸを用いた。ゲ
ルの接片を４Ｘ４ｍのウェル中の０．７％アガロースゲ
ルに入れて１×ＴＢＥ中０．７％アガロース液で封じて
均質な電場を得る。各試料の先端にＮＡ４５メンブレン
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　、ダ
ツセル）を挿入してＤＮＡをメンブレン上３００Ｖで５
分間電気泳動する。ＤＮＡの接片を水で洗ってから２５
０μｍの１．５Ｍ酢酸リチウム、５０ｎ＋Ｈトリス−塩
酸、ｐＨ８，０および１０ｍＨＥＤＴＡを含有するエツ
ベンドルフ管に入れる。ＤＮＡを６５℃で２０分間、時
々攪拌しながら溶出した。メンブレン片を管から除き、
試料を１ＭトリスｐＨ８，０で飽和した２００μｍのフ
ェノールで一回抽出する。
試料をミクロ遠心分離機で１２．　ＯＯＯｒｐｍ　１０
分間遠心分離後上澄液を除去する。ＤＮＡをドライアイ
ス上２０μｌの５Ｍ酢酸リすュムおよび４４０μｍのイ
ソプロパツールを添加後１０分間沈でんさせた。ＤＮＡ
をミクロ遠心分離機で１２゜００Ｏｒｐｍ１０分間遠心
分離してペレット化する。
ペレットを８０％エタノールで洗い、真空下で乾燥する
。ペレットは１０μｌの水に溶解した。
Ｃ１合成遺伝子断片のｐＵＣベクターでのサブクローニ
ング プラスミドｐＵＣ１８およびｐＵｃ１９はファルマシア
（ウプサラ）よりＤＮＡ１度０．４μグ／ｄで入手した
。２μｌのプラスミドＤＮＡを１ＸＴ４ポリメラーゼ緩
衝液（ｒ、　ＨａｎｉａｔｉＳら、前述］中で１０Ｕの
適当な酵素を用い、全量５０μｌで３７℃１時間消化し
た。ｐＵＣ１８はサブクローン１では３ａｍＨＩとＥＣ
０ＲＩで、サブクローン４では３ａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化した。ｐＵｃ１９はサブクローン２ではＥｃ
ｏＲＩとｐｓｔｌで、サブクローン３はｐｓｔｉとＨｉ
ｎｄｌｌＩで消化した（第２図参照）。消化後ＤＮＡを
前述のように一回フエノール抽出し、沈でんさ°Ｕて乾
燥する。ペレットを１Ｏμｌのゲル添加用緩衝液に溶解
し１ＸＴＢＥおよび１μ９／ｒｄのエチジウムプロミド
含有の０．７％アガロースゲルで電気泳動にかけた。ベ
クターのバンドを３００ｎｍ　　ＵＶ下で検出する。
各バンドの先端に切れ目を入れてＮＡ４５メンブレンを
挿入する。ＤＮＡをメンブレン上３００Ｖ１０分間電気
泳動させる。ＤＮＡを上述のように溶出し、精製する。
最終ペレットは３０μｌの水に溶解して終濃度を０．１
μｇ／−とする。１μｌのベクターＤＮＡに１μｍの１
０×リガーゼ緩衝液（０，５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７，
８，１０ｎ＋ＨＭＱｃｔ！　　、１００ｍＨＤＴＴ、５
０ｍＭＮａＣｊりおよび１μｍのＤＮＡリガーゼ（１Ｗ
ｅｉＳＳユニツト、ファルマシア、ウプサラ）を添加し
、全量１０μｍで２μｌの挿入ＤＮＡとライゲーション
する。ライゲーションは２０℃で１時間行なう。同時に
挿入ＤＮＡなしの対照反応も行なった。
Ｅ、ｃｏｊ！ｉ　　Ｋ１２　　ＴＢ−１株はＢＲＬ（Ｍ
ｅｓｓ　ｉ　ｎｇ菌株キット〉から入手した。コンビ−
テント細胞は王Ｂ−１の単一コロニーをＬＢ培地［１リ
ットル当り１０ｇバクトートリプトン、５びバクトー酵
母エキス、１０ｇＮａＣ１゜ｒ、　Ｈａｎｉａｔｉｓら
、前述］中で３７℃−晩回転振どう機で増殖させて調製
した。この−晩培養液の５００μｌを１ｏｏｔｙのＬＢ
培地で希釈してさらに２時間３７°Ｃで増殖させる。細
胞を４℃で９０００ｒｐｍｌＯ分間遠心分離して集める
。ペレットを２０ｍの５０ｍＭ　　ＣａＣｊ！２に注意
深くけん濁し、３０分間氷上に置く。細胞を再び遠心分
離し、ペレットを２０％グリセロール（Ｖ／Ｖ）を含む
５０ＩＩＩＨＣａＣｌ２１０ｄに溶解する。細胞は３０
０μｌずつ一８０℃で凍結保存し、少なくとも３ケ月間
形質転換能の低下は認められなかった。
形質転換には１０μｌの０．５Ｍ　　ＭｇＣＪ２および
０．ＩＭ　　ＣａＣ１，１０ｕｌの３０％ポリエチレン
グリコール、ＤＮＡおよび水を混ぜて全量１００μｌと
する。融解したコンピーテント細胞１ｏＯμｍを添加し
て２０分間氷上に置き、次に室温で１０分間インキュベ
ートする。１１１！ｉ！のＬＢ培地添加後、試料を３７
℃の水槽中で１時間インキュベートする。次に細胞をミ
クロ遠心分離機で１２．ＯＯＯｒｌ）ｍ　３分間遠心分
離する。上澄液を除去してペレットを１００μ矛の１８
培地にけん濁し、８０μｇ／Ｉｄのアンピシリン含有Ｌ
Ｂ寒天培地上にプレートする。
サブクローン１−４のライゲーション液を形質転換して
ライゲーション当りおよそ２００個の転換株を得た。対
照ライゲーションでは転換株は得られなかった。単一コ
ロニーを棲枝でとって８０μｇ／〆のアンピシリン加Ｌ
Ｂ培地を含有する管に移し、３７℃で６時間激しく振と
うして増殖させる。細胞はｓ、ｏｏｏｒｐｍで１０分間
遠心分離する。ペレットを５００μｍの５０１１１Ｎト
リス−塩酸、１）Ｈ８，Ｏｌおよびｌ０ＩＩＩＨＥＤＴ
Ａに再審プん濁する。リゾチームを終濃度１１／１ｇ／
μＡで添加して室温で５分間インキュベートする。２５
μｌの１０％ＳＤＳ　（硫酸ドデシルナトリウム）およ
び５０μノの５Ｍ酢酸カリを添加後、氷上に１５分間放
置する。次に染色体ＤＮ’Ａをミクロ遠心分離器中１２
．　ＯＯＯｒｐｍ　１５分間でペレットにする。
上澄液を新しい管に移して１μｌのＲＮａＳｅＡ（１０
■／ｄ）を添加して３７℃１０分間インキュベートする
。ＤＮＡは等量のＩＭｔ−リス−塩酸ｐｌ（８，０飽和
のフェノールを添加して抽出した。
１２．００Ｏｒｐｍ　５分間遠心分離して相を分離した
。上澄液を新しい管にとり、等量のクロロホルムを添加
した。遠心分離により相を分離して上層を新しい管に移
し、０．６容のイソプロパツールおよび０．１容の５Ｍ
酢酸リチウムを添加して室温１０分間ＤＮＡを沈でんさ
せた。次に試料をミクロ遠心分離機で１２．０００ｒｐ
ｍ　１０分間遠心分離した。ペレットを８０％エタノー
ルで洗滌して真空下で乾燥した。ペレットは５０μｌの
水に溶解する。前述のようにして１０μｌを適当な制限
酵素（１０単位）を用いて全ｆｆ１１００μｌで滴化し
、挿入を遊離した。次にＤＮＡを沈でんさせ、８０％エ
タノールで洗滌して真空乾燥する。ペレットを１０μｌ
のゲル試料用緩衝液に溶解し、前述のとおりに６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ファージψＸ　
　ＤＮＡを分子６マーカーとした。４つのサブクローン
全ての挿入が予想どおりそれぞれ６４．５５．５８およ
び６９塩基対の大きさであった。サブクローンをｐＡｌ
、ｐＡ２．１）Ａ３およびｐＡ４と命名した。
Ｄ、　　ｐＡ２−３の構築 ０．２μびの１）Ａ２およびｐＡ３をＡ　ａ　ｔ　ＩＩ
／Ｐｓｔｌのそれぞれ５単位を用いて全量１００μ矛に
て３７℃１時間消化した。試料を前述のように沈でんさ
せ、８０％エタノールで洗滌して乾燥した。ペレットを
１０μｌのゲル添加用緩衝液（上記参照）に溶解′し、
ＩＸＴＢＥおよび１μＵ／ｄのエチジウムプロミド添加
の０．８％アガロースゲルの電気泳動にかける。５００
　ｂｐのＩ）Ａ２および２ｋｂ断片の１）Ａ３をＮＡ４
５メンブレンを用いて単離し、前述のようにさらに精製
した。
最終ペレットは５μｌの水に溶解した。断片各２μノに
１μｌの１０Ｘリガーゼ緩衝液（０，５Ｍトリス−塩酸
、１）Ｈ７，８，０，１Ｍ　ＭｇＣｌ２．０．２Ｍ　　
ＤＴＴ、１０ｍＨＡＴＰ）、１．ｃｌのＴ４−ＤＮＡ−
リガーゼ（１Ｗｅｉｓｓ　ユニット、ファルマシア、ウ
プサラ）および４μｌの水を添加した。ライゲーション
は室温で１時間行なった。
続いて試料で７ｙＪ述のとおり丁Ｂ−１を形質転換した
。形質転換株はざらに前述の「ミニライゼート」法によ
り分析した。組換えプラスミドの挿入物をＥｃｏＲＩお
よびｌ−１ｉｎｄｌＩｒで遊離して８％ポリアクリルア
ミドゲルでのゲル電気泳動により予想どおり１１４塩基
対の大きさを確認した。
ｅｎｖ−遺伝子断片のブロック２および３を含有する新
しい組換えプラスミドをｐＡ　２−３と命名した。
Ｅ、　　ｐＡｌ−２−３の構築 ０．２μりのｐＡｌおよびｐＡ２−３を全量１００μｆ
でＡａｔＩＩ／ＥｃｏＲＩの各５ユニツトを用いて３７
℃１時間消化した。その後のＤＮＡの処理はｐＡ２−３
の構築と同じである（第２図も参照）。新しいＩＩｉ換
えプラスミドの挿入はｐＵｃ１８のポリリンカーにさら
にＨｉｎｄｌＩＩ部位があるためにｔ−１ｔｎｄＩＩＩ
により３１１１１される。
挿入は予想どおりおよそ２００塩基対の大ぎさであった
。遺伝子ブロック１，２および３を有する新しいプラス
ミドをｐＡｌ　−２−３を命名した。
Ｆ、　　１）Ａ−ＥＮＶ−２０の構築と配列解析２μｌ
のｐＡｌ−２−３を２０単位のトｆｉｎｄＨ１を用い、
全が３００μｍで３７℃１時間消化した。ＤＮＡを前述
のとおり沈でんし、１％アガロースゲルの電気泳動にか
けたａＮＡ４５メンブレンを用いて２００塩基対の断片
を単離し、さらに精製した。最終ペレットは１０μｌの
水に溶解した。プラスミドｐＡ４（０，５μｇ）を１０
単位のＨｉｎｄＩｌｌを用い、１００μｍ中で３７℃１
詩間消化した。次に末端を１０単位の細菌アルカリフォ
スファターゼ、４０μｌのＩＭｔ−リス−塩酸、ｐＨ８
，０、おＪ：び１６０μｍの水を添加して６５℃２時間
で脱りん酸した。試料をＩＭ−トリス−塩酸、ｐｌ（８
，０、飽和フェノール４００μｌで３回抽出した。上述
のように遠心分離により相分離を行なった。三回目のフ
ェノール抽出の後、４０μ）の５Ｍｆｆ酸リチウムおよ
び８００μｌイソプロパツールを添加してＤＮＡを沈で
んさせた。試料をミクロ遠心分離機で１２．００Ｏｒｐ
ｍ　１０分間遠心分離し、上澄液を除いてからペレット
を８０％エタノールで３回洗滌した後、スピード−バッ
ク真空遠心分離機で１５分間乾燥する。ペレットを５μ
ｍの水に溶解する。ＨｉｎｄＩＩＩで消化して脱りん酸
したｐＡ−４ＤＮＡ２μｌをＤＡｌ−２−３のＨｉｎｄ
ＩＩＩ断片１μノと１μｊ！Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ（
１Ｗｅｉｓｓ　ユニット、ファルマシア、ウプサラ）、
１μｍの１０×リガーゼ緩衝液および５μｌの水を用い
て室温で１時間ライゲーションする。同時にＩ）Ａ１−
１−３のＤＮＡ挿入物を添加しない対照反応も行なった
。ライゲーション反応液を用いてＴＢ−１を形質転換し
た。Ｈｉｎｄｌｌｌ挿入物を含んだ試料はおよそ５００
個の粗換えコロニーを生成し、ＨｉｎｄＩＩＩを加えな
い対照は２０個のコロニーを形成した。前述の１ミニラ
イゼート法」により１２個の組換えプラスミドを単離し
た。
ＢａｍＨＩで切断して８％のポリアクリルアミド−７Ｃ
）− ゲル電気法８後、１２個のプラスミド中１０個から２４
６塩基対の挿入物が遊離された。
Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ　、　Ｐｓｔ　ＩおよびＥｃｏＲＩで
試験消化を行なったところ、この最終プラスミドｐＡ−
ＥＮＶ−２０にこれらの制限部位が存在することがわか
った。
１）Ａ−ＥＮＶ−２０で形質添加した Ｅ、ｃｏｊ！ｉ　　ＴＢ−１株は１９８５年１０月３日
にゲッチンゲンのＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ
　ｖｏｎＨｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｗｅｎ　（Ｄ　Ｓ　
Ｍ　）にＤＳＭ３５１６として寄託された。
Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＩ　ＤＮＡはファルマシア（ウプナ
ラ）より０．１Ｍｇ／７！の濃度で入手した。１０μＪ
（１Ｍｇ）を１００μ！中で１０　ＬＪのＢａｍＨＩで
３７℃１時間消化した。１０Ｕの細菌アルカリフォスフ
ァターゼ、４０μｌの１Ｍトリス−塩酸、ｐｉ（８，０
，および２４０μｌの水を添加して６５℃２時間でＤＮ
Ａを脱りん酸した。
試料を前述のとおりにフェノール抽出し、沈でんさせる
。ペレツｌ−を２０μｌの水に溶解する。２μグのｐＡ
−ＥＮＶ−２０ＤＮＡを反応液２００μ矛中でＢａｍＨ
Ｉ　（２０単位）で消化した。前述のとおり１％アガロ
ースゲルから挿入物を単離した。最終ペレットを１０μ
ｌの水に溶解した。
ＢａｍＨＩで切断して脱りん酸したＭ１３ｍｐ１８ＲＦ
Ｉ　　ＤＮＡ１μｍとｐＡ−ＥＮＶ−２０のＢａｍＨＴ
挿入物３μｍとに５μｌの水、１１１１の７４−ＤＮＡ
リガーゼ（Ｉ　Ｗｅｉｓｓ　ユニット、ファルマシア、
ウプサラ）および１μｍの１０×リガーゼ緩衝液を添加
して１時間室温にてライゲーションを行なう。次に反応
液を用いて Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０５株（Ｂ　Ｒｌ−、バーゼル
、菌株キット）を前述のプロトコールを用いて形質転換
する。形質転換後の１時間のインキュベーションは省略
し、ＢＲＬ（バーゼル）からのシーフェンス用キットに
添付されるＭ１３マニュアルに記載されるとおりに細胞
を直接に指示菌、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド）およびＸ−Ｇａ４　（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
）を含有する軟寒天中ＬＢプレートにプレートする。
同時に挿入ＤＮＡなしの対照反応も行なった。３７℃で
一晩のインキュベーション後、対照プレートは２０個の
青色プラークを形成した。挿入物のあるプレートでは２
３個の青色プラークとさらに１８０個の挿入を持つ白色
プラークを形成した。
３個の白色プラークを棲枝で取り、指示菌（ＪＭ１０５
、ＢＲＬ、バーゼル、菌株キット）の新しい一晩培養物
１０μＡを含む３−のＬＢ培地中で３７℃５時間激しく
振とうしながら増殖させる。
ＢＲＬ−Ｍ１３マニュアルに記載されるようにして一本
鎖ＤＮＡ鋳型をファージ上澄液から調製した。鋳型を１
７マーのユニヴアーサルプライマー（ファルマシア、ウ
プサラ）を用いてサンガーのジデオキシ法によりシーフ
ェンスした。反応は０．４Ｍの厚さのゲルでの電気泳動
を含め、ＢＲＬのＭ１３マニュアルに記載されているよ
うに行なった。ガラス板をとってからゲルを１０％メタ
ノール、１０％酢酸および８０％水の中で１５分間固定
した。次にゲルをウアットマン３履濾紙に移し、ゲル乾
燥機で乾燥した。ゲルをＫＯｄａｋ−ＸＡＲフィルムに
室温で一晩、増幅スクリーンなしで露出した。配列決定
した全ての鋳型は合成遺伝子ｅｎｖ（８０）の予想配列
どおりの正しいものであった。
〈実施例３〉 Ａ−阪貫 プラスミドＤＥＮＶ　（８０）−ＤＨＦＲの構築のため
ｐＤｓ８／ＲＢＳＩＩ（第４図）を選び、前者をｐＤＳ
５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａ　（第３図）および適当な
ｑａｑ断片と共に用いてプラスミド１）ＥＮＶ　（８０
）−ＧＡＧ−１５を構築した。
ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５の発現を改良するため
にｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５のｃａｔ、　　遺
伝子の一部分を欠失させてプラスミドｐＥＮＶ（８０）
−ＧＡＧ−１５（Δｃａｔ）を構築した。
効率よい発現のために上記ベクターは調節可能なプロモ
ーター／オペレーター成分 Ｐ　Ｎ２５　”　７ｏ［Ｄ、５ｔｉｉｂｅｒら、Ｔｈｅ
　　ＥＭＢＯＪ、３巻、３１４３−３１４８頁（１９８
４年）］およびリボゾーム結合部位ＲＢ　Ｓ　ＩＩまた
はＲＢ　Ｓ　ＩＩ、３Ａ＋５Ａを含有する。これらのり
ボゾーム結合部位はＥ、ｃｏ１ｉファージ７５プロモー
ターＰ６２５［Ｒ，Ｇｅｎｔｚ、　Ｐｈ、Ｄ　、論文、
ハイデルベルグ大学、西独（１９８４年）］の制御下の
りボゾーム結合部位にマツチするＤＮＡ合成に由来して
いる。これらの発現シグナルが高効率のために上記ベク
ターはプロモーター／オペレーター成分がオペレーター
のＰ　　＊　部位に１ａｃレプレツ勺−が結Ｎ２５　１
０ 合することにより抑制されている時のみＥ、ｃｏｉｉ中
で安定に維持される。１ａＣレプレツサーはｊ！ａｃＩ
遺伝子によりコードされる。
ＰＮ２５　”　１０は十分量のレプレッサー分子が存在
する時のみ有効に抑制されるので、Ｊａｃｌｑアレルを
変異プロモーターとして使用し、その結果遺伝子の転写
を高めて十分なレプレッサー分子を得る。１ａＣＩｑア
レルは上記プラスミドと適合性を有するプラスミドｐＤ
Ｍ１　（第５図）の一部で、さらに選択マーカーとして
カナマイシン耐性を示すｎｅｏ遺伝子を保有する。
ｐＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａ１ｐＤｓ８／ＲＢ　
Ｓ　ＩＩまたはこれらプラスミドのＨＴＬＶ−１１１遺
伝子を保有する誘導体で形質転換しようとするＥ、ＣＯ
，ｉ＋ｉ細胞は、これらのベクターを安定に維持するた
めにｐＤＭＩ、１を含有していなければならない。この
系での発現の誘導は望む細胞濃度で培地にＩ　ＰＴＧを
添加することにより容易に達成できる。
Ｂ、プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、５Ａ＋３ＡｐＤ
ｓ５／ＲＢＳＩＩ、５Ａ＋３Ａ　（第３図）の中でＤＮ
Ａ複製およびプラスミドの細胞内での維持に必要な領域
およびアンピシリンに耐性を示すβ−ラクタマーゼの全
遺伝子を含む制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏ１部位の間
はｐＢＲ３２２由来［Ｆ、　Ｂｏｌ　１ｖａｒら、Ｇｅ
ｎｅ、　２巻、９５−１１３頁（１９７７年）　；　Ｊ
、Ｇ、　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ　、前述］。
本プラスミドのその他の部分はｌｌｔＩＩｗＪ可能なプ
ロモーター／オペレーター成分ｐ　　　＊　　　（Ｄ、
５ｔｊｂｅｒＮ２５　１０ ら、前述）、続いｒＥＣＯＲＩ／ＢａｍＨＩ断片の一部
であるリボゾーム結合部位ＲＢＳＩＩ、５Ａ＋３Ａ１制
限酵素部位Ｓａｊ！　Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉおよび１（ｉｎｄ
ｌｌＩ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼのプロモーターなしの遺伝子［Ｒ，Ｈａｒｃｏｌｉ
ら、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、　　１１０巻、１
１−１４頁（１９８０年）］およびＥ。
Ｃｏｊ！ｉ　　ｒｒｎＢオペロンのＴ１ターミネータ−
［Ｊ、　　Ｂｒｏｓｉｕｓら、Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂ
ｉｏｌ、　　、１４８巻、１０７−１２７頁（１９８１
年）］である。
Ｃ，プラスプラスミド８／ＲＢＳＩｒ プラスミドＩ）ＤＳ８／ＲＢＳＩＩ（第４図）は１）Ｄ
Ｓ５／ＲＢＳＩＬ　３Ａ＋５Ａ　（第３図）に対応し、
但し、ＰＮ２５　＊１０とｃａｔ遺伝子の間にリボゾー
ム結合部位ＲＢ　Ｓ　ＩＩと続いてマウスＡＴ−３００
１１胞株のジヒドロ葉酸レダクターゼをコ一部する領域
［八、　Ｃ，Ｙ、　Ｃｈａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、　２
７５巻、６１７−６２４頁（１９７８年）：Ｊ、Ｎ。
ＨａＳｔｅｒＳおよびＧ、　Ａｔｔａｒｄｉ、Ｇｅｎｅ
、２１巻、５９−６３頁（１９８３年）］およびＥ、ｃ
ａ１＋ラムダファージのターミネータ−ｔｏ　　［Ｅ、
　Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ、　２７２巻、４１
０−４１４頁（１９７８年）］を含む。
Ｏｌ　プラスミドｐＤＭＩ、１ プラスミドｐＤＭＩ、１（第５図）は Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ　／５ａＩＩ断片上にトランスボゾン
Ｔｎ５からのカナマイシン耐性を示ずネオマイシンフォ
スフオドランスフェラーゼの遺伝子［［。
Ｂｅｃｋら、Ｇｅｎｅ、　１９巻、３２７−３３６頁（
１９８２年）］、続いてプロモーター変異Ｉ（Ｉ　［Ｈ
。
Ｐ、　Ｃａ１ｏｓ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７４巻、７６
２−７６５頁（１９７８年）］を有するｊ！ａｃ−レプ
レッサーをコードするｊ！ａｃＩ遺伝子［Ｐ、　Ｊ、　
Ｆａｒａｂａｕｇｈ。
Ｎａｔｕｒｅ２７４巻、７６５−７６９頁（１９７８年
）］を有する。ざらにｐＤＭＩ、１はプラスミドｐＡＣ
ＹＣ１８４［Ａ、　Ｃ，Ｙ、　ＣｈａｎｇおよびＳ。
Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１
３４巻、１１４”１１１５６頁（１９７８年）］のＥ、
ｃｏＩｉ中での複製および安定維持に必要な情報を有す
る領域を含有している。
〈実施例４〉 プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＤＨＦＲの構築へ、原
理 プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＤＨＦＲはｅｎｖ（８
０）−遺伝子を有するｐＡ−ＥＮＶ−２０のＢａｍＨＩ
断片をプラスミドｐＤＳ８／ＲＢ　Ｓ　ＩＩに挿入して
構築された（第６図）。
ｅｎｖ　（８０）−遺伝子を保有するｐＡ−ＥＮＶ−２
０の３ａｍＨＩ断片の１ｐｍｏｌｅを前述のように単１
し、１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＨトリスー塩酸、ｐ
Ｈ７，６、および１ｍＨＥＤＴＡ＞に再けん濁した。
Ｃ３プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩの調製３　ｐｍｏ
ｌｅのプラスミド１）ＤＳ８／ＲＢＳＩＩを制限エンド
ヌクレアーゼ３ａｍＨＩで完全消化した。
６５℃に７分間インキュベートして酵素を不活化してか
らフェノール抽出およびエーテル処理により蛋白除去し
、ＤＮＡをエタノールで沈でんさせた。ＤＮＡを５０ｍ
）４トリス−塩酸および仔ウシ小腸フォスファターゼ＜
ａｒｐ、ベーリンガー、マンハイム）の１単位を含有す
るｐＨ８の緩衝液４２μｌに再けん濁し、３７℃で１時
間インキュベートする。酵素を加熱失活（上記参照）さ
せ、蛋白除去（上記参照）した後、ＤＮＡをエタノール
で沈でんさせる。ＤＮＡを再けん濁してから１％アガロ
ース電気泳動、ＮＡ４５メンブレンへの電気泳動転移、
溶出、エタノール沈でんおよび１００μｌのＴＥＩ！ｉ
液（上記参照）への再けん濁により鎖状プラスミドＤＮ
Ａを単離した。およそ１ｐｍｏｌｅの鎖状の脱りん酸し
たプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩＤＮＡを得た。
０、　プラスミドｐＥＮＶ　（８０−ＤＨＦＲの集金 プラスミド１）ＤＳ８／ＲＢＳＩＩの単１１１ＤＮＡの
０．０２５μｍｏｌｅをライゲーション緩衝液２４μｌ
容捲中で０　、０５　ｐｍｏｌｅの単離ｅｎｖ（８０）
−遺伝子と１．８単位の７４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリ
ンガー、マンハイム）と２０℃で６時間インキュベート
してから酵素を６５℃７分間加熱して失活された。
ｐＤＭＩ、１を保有するＥ、ｃｏｌｉ　　Ｍ１５（Ｃａ
Ｃ１２コンピーテント）を適当な条件下で結合ＤＮＡで
形質転換する。１００μｇ／ｍｅのアンピシリンおよび
２５μｇ／ｄのカナマイシン含有ＬＢ−平板上３７℃で
形質転換株を選択し、菌株を１００μ９７ｍｅのアンピ
シリンおよび２５μｇ／ｌ＋１１！のカナマイシン含有
ＬＢ培地中で増殖させる。これらの培養物からのＤＮＡ
を標準法で単離し、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　Ｉ
および１−（ｉｎｄＩＩＩを用いた制限分析によりｅｎ
ｖ（８０）−遺伝子の存在並びにその方向性を解析した
。
ｅｎｖ（８０）−遺伝子を正しい方向で含有するプラス
ミドｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩをｐＥＮＶ　（８０）−ＤＨ
ＦＲ（第６図）と命名した。
く１胤ｆ’ｆｉＪ　５　＞ プラスミ゛　ＥＮＶ　　８０　−ＧＡＧ−１５の至 Ａ、　凰■ プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５は３つの
異なるＤＮＡ断片を用いて構築した（第７図）：１）制
御可能なプロモーター／オペレーター成分ＰＮ２５　＊
１０．　ＲＢ　Ｓ　ＩＩおよびｅｎｖ　（８０）−遺伝
子を含有するｐＥＮＶ　（８０）−ＤＨＦＲからのＸｈ
ｏ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（断片１　’）　、２）ＨＩＶ
のｑａｇ−領域の部分を含むＢａｍＨＩ断片（断片２）
、および３）プラスミドｐＤｓ５／ＲＢ　Ｓ　ＩＩ、３
Ａ＋５Ａのポリリンカー領域、ｃａｔ遺伝子、ターミネ
ータ−Ｔ１、複製領域およびｂｌａ−遺伝子を含むＢａ
ｍＨＩ−Ｘｈｏ断片（断片３）。
Ｂ、　　ｐＥＮＶ（８０）−ＤＨＦＲからの　　１の要
員 ２ＤＩＩｏｌｅのプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＤＨ
ＦＲを制限エンドヌクレアーゼ３ａｍＨＩの制限量で消
化しておよそ５０％のＤＮＡ分子を鎖状化する。酵素を
６５℃で７分間インキュベートして失活させ、フェノー
ル抽出とエーテル処理による除蛋白した後、ＤＮＡをエ
タノールで沈でんさせる。ＤＮＡは５０ｍＮトリス−塩
酸および２．５単位のＣＩＰを含む５０μｌのｐ１１８
の緩衝液に再けん濁し、３７℃で１時間イン４：ユベー
トする。酵素の加熱失活および蛋白の除去後、ＤＮＡを
エタノールで沈でんさせる。ＤＮＡを再けん濁して制限
酵素Ｘｈｏ　Ｉで完全消化する。酵素を加熱失活後除去
し、ＤＮＡをエタノールで沈でんする。ＤＮＡを再けん
濁後断片１（第７ａ図）を１％アガロースゲルの電気泳
動、ＮＡ４５メンブレンへの電気泳動転移、続く抽出、
エタノール沈でんおよびＴＥ−緩衝液（上記参照）への
再（プん濁により単離した。およそ０　、１５　ｐｍｏ
ｌｅの断片１が１２０１１１．の容量で得られた。
Ｃ０断片２の単離 ＨＩ　Ｖのｇａｇ遺伝子領域であり、第７ｂ図に配列を
示した３ｓｔ）から８ｇ矛ＩＩまでの制限量片を有する
プラスミドρｔＪｃ１９であるプラスミドｐＵｃ−ＧＡ
Ｇの１　ｐｍｏｌを適当な緩衝液（Ｔ、　Ｈａｎｉａｔ
ｉＳら、前述）中１２単位の１−１　ｉ　ｎ　ｄＩＩＩ
で３７℃、１時間消化し、６５℃で１０分加熱後１４℃
に冷却してから５０ＩＩＩＭトリスー塩酸、ｐＨ７，６
に溶解したＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼのフレ
ナラ断片（ベーリンガー）１単位、１０１　ＭｇＣｌ　
、１１ＩＩＨＤＤＴおよび４種のｄＮＴＰの各２　ｎｍ
ｏｌｅで４５分間処理する。次に反応液をフェノール／
クロロホルム（１：１）で−回、クロロホルムで一回抽
出する。水層を酢酸ナトリウム、ｐＨ７，２で０．３Ｍ
とし、２容量のエタノールで一２０℃−晩沈でんさせる
。ＤＮＡベレツｌ〜を１０ｍＭトリス−塩酸、ｐｌ＋７
．６．１０ｔｎＨＭＣＪＣＩ　　、５０ｍＨＮａＣＪ！
の１０ｕｌにとす、１５単位のｐ　ｖ　ｕ　ＩＩを用い
て３７℃ＩＦＲ間消化する。反応液５μＡを４５μｌの
５０ｍＮトリス−塩酸、ｐｌ＋７．６．１０ｍＨＭＱＧ
！　　、１０ｍＨＤ　Ｔ　Ｔ　、　０　、５　ｍＨＡ　
Ｔ　Ｐ、２　Ｑ　ｐｍｏｌｅの５′−りん酸化８ｖ−Ｂ
ａｍＨＩリンカ−５′−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’　　（
ＰＬ−バイオケミカルズ）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（
ファルマシア）１単位と７４℃で一晩インキユベートす
る。ライゲーション反応液を６５℃で１０分間加熱し、
適当な制限消化緩衝液で１００μｌとし、１００単位の
Ｂａｍ）−ＩＩを添加して３７℃で２時間インキュベー
トした。フェノール／クロロホルム抽出の後、ＤＮＡを
エタノール沈でんし、下ＡＥＭ衝液Ｃ４０ｍＨｔ−リス
−酢酸、Ｉ　ＩＮ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）中２．５％ア
ガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ−アガロース、ＦＭＣ）
で電気泳動した。５００　ｂｐのＢａｍＨｒ制限断片（
断片２）（第７ｂ図参照）をゲルから切り出し、フェノ
ールで２回、クロロホルムで１回抽出してエタノール沈
でんで回収する。このＤＮＡ断片の核酸配列は第９図に
示す（ヌクレオチド２５３−８３５）。
プラスミドｐＵｃ１９はファルマシア、ウプサラ、より
市販されている。
Ｄ、　　ｐＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａから断　３
の単離 ３ｐｍｏｌｅのプラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、３Ａ
＋５△を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで完全消化
した。酵素を加熱失活後蛋白除去し、ＤＮＡをエタノー
ルで沈でんさせる。ＤＮＡを５０ｍＨトリスー塩酸およ
び２．５単位のＣＩＰを含有する緩衝液、Ｉ）Ｈ８、の
５０μｌに再けん濁し、３７°Ｃで１時間インキュベー
１・する。酵素を加熱失活および除蛋白した後、ＤＮＡ
をエタノールで沈でんざぜる。１ＤＮＡを再（プん濁後
、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌで完全消化した。酵
素を加熱失活および除去した後ＤＮＡをエタノールで沈
でんさせる。ＤＮＡを再けん濁後、１％アガロースゲル
電気泳動、ＮＡ４５メンブレンへの電気移動、溶出、エ
タノール沈でんおよびＴＥ−緩衝液（上記参照）への再
けん濁ににり断片３（第７Ｃ図参照）を単離した。４０
μ夕の容母におよそｏ、　４ｐｍｏｌｅの断片３が得ら
れた。
［プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５の集合 ０．０１　ｐｍ０１８の断片１．０．０２　ｐｍｏｌｅ
の断片２および０　、０１　ｐｍｏｌｅの断片３を２４
１１１のライゲーション緩衝液中で０．５単位の−「４
−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー、マンハイム）と１５
℃１時間インキュベートし、酵素を６５℃で７分加熱し
て失活させた。
プラスミドｌ）ＤＭＩ、１を保有する Ｅ、Ｇｏ、ｉ！　ｉ　　Ｍｌ５　（ＣａＣｊ！、２フン
ピーテント）を適当な条件下で結合したＤＮＡを用いて
形質転換する。１００μｇ／ａｉ！のアンピシリンおよ
び２５μｇ／ｍ１．のカナマイシン含＠　Ｌ　［３平板
上で形質転換株を選択し、菌株を１００μ’Ｊ／ｄのア
ンピシリンおよび２５μｇ／ｄのカナマイシンを含むＬ
Ｂ培地で増殖させる。これらの培養からＤＮＡを標準法
を用いて単離し、０．７％アガロースゲルで大きさを分
析した。予想した大きさのＤＮＡは続いてＥＮＶ　（８
０）およびＧＡＧ遺伝子の存在と方向性について制限酵
素Ａｊ！ＵＩ。
ＢａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ　、Ｐｓ　ｔ　Ｉおよび
Ｘｈｏ　Ｉを用いて解した。目的の切断パターンを持つ
プラスミドをｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５と命名
した（第７ｄ図参照）。
〈支胤璽ヱ〉 八、原理 プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５（Δｃａ
ｔ）はプラスミド１）ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５
よりそのｃａｔ遺伝子を部分的に削除して構築した（第
８図参照）。これはｐＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５の
２つの別の領域を集めて行なった（第８図参照）：１）
ｂｌａ−遺伝子、Ｐ　　　＊　　　ＲＢＳＩＩ、ｅｎｖ
　（８０）−遺伝子、Ｎ２５　１０） ポリリンカー領域およびｃａｔ遺伝子の制限エンドヌク
レアーゼｐ　Ｖ　ＩＪ　ＩＩ部位で区切られた部分（断
片４）および２）ｃ　ａ　を遺伝子の部分、ターミネー
タ−Ｔ１、複製領域およびｂｉａ遺伝子の部分を有する
５ａｃＩ−Ｂｏｊ！ＩＩ断片（断片５）である。
Ｂ、　　ｐＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５から断片４の
単離 ４μｍｏｌｅのプラスミド１）ＥＮＶ　（８０）　−〇
ＡＧ−１５を制限エンドヌクレアーゼＢ　ｇＩ　ＩＩで
完全消化する。酵素を加熱失活後、蛋白除去し、ＤＮＡ
をエタノールで沈でんさせる。ＤＮＡを再けん濁し、そ
の１／３を制限エンドヌクレアーゼｐ　ｖ　ｕ　ＩＩで
完全消化する。酵素を加熱失活、除去してからＤＮＡを
エタノールで沈でんさせる。
ＤＮＡを再けん濁した後、１％アガロースゲルの電気泳
動、ＮＡ４５メンブレンへの電気移動、溶出、エタノー
ル沈でんおよびＴＥ−緩衝液（上記参照）へ再けん濁し
て断片４を単離した。５０μｌの容量におよそ１　ｐｍ
ｏｌｅの断片４が得られた。
Ｃ，ＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５から断片５の単離 ｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５の制限エンドヌクレ
アーゼＢ　Ｇ　ｊ！　ＩＩ消化で得られた試料（上記参
照）の１／３を制限エンドヌクレアーゼ３ｃａ■で完全
消化する。蛋白を加熱失活させて除去した後、ＤＮＡを
エタノール沈でんする。ＤＮＡを再けん濁してから１％
アガロースゲル電気泳動、ＮＡ４５メンブレンへの電気
移動、溶出、エタノール沈でんおよびＴＥ−緩衝液（上
記参照）への再けん濁により断片５を単離した。５０μ
ｌ容最におよそｌ　ｐｍｏｌｅの断片５を得た。
断片４および５の各０．００２ｐｍｏｌｅを２０μｌの
ライゲーション緩衝液中で２単位の７４−ＤＮＡリガー
ゼ（ベーリンガー、マンハイム）と２２℃４時間インキ
ュベートした後、酵素を６５℃７分間インキュベートし
て失活させた。
プラスミドｐＤＭＩ、１を保有する Ｅ、ＣＯｊ！　ｉ　　Ｍｌ　５　（Ｃａ（１，、ｍｌン
ピーテント）を適当な条件下で結合したＤＮＡを用いて
形質転換する。１００μｇ／ｒＲ１！アンピシリンおよ
び２５μ９／−カナマイシン含有１Ｂ平板上で形質転換
株を選択し、菌株を１００μｇ／−のアンピシリンと２
５μｇ／Ｉｒ１．のカナマイシン含有ＬＢ培地で増殖さ
せる。これらの培養物からＤＮＡを標準法を用いて単離
し、大ぎざを０．７％アガロ−スグルで分析した。予想
される大きさのＤＮＡはざらにｃａｔ遺伝子が部分的に
削除されていることを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
ＩＩＩおよびｂａ ■を用いて分析した。目的の切断パターンを有するプラ
スミドをｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５（Δｃａｔ
）と命名した。
〈実施例７〉 ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５の生産と精製へ、　　
■ プラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５（Δｃａ
ｔ）を用いて本発明のポリペプチドＥＮＶ　（８０）−
ＧＡＧ−１５をＥ、ｃｏｌ　ｉ中で生産し、細胞を破壊
後均質まで精製した。
Ｂ、Ｅ、ｃｏｊ！ｉ中でのＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−
１５の生産 プラスミドｐＤＭＩ、１を保有する ［、ｃｏｊ！ｉ　　ｗ３１１０細胞（Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ
、　２７３２５）をプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−Ｇ
ＡＧ−１５（Δｃａｔ）で形質転換し、続いて１００μ
ｇ／〆のアンピシリンおよび２５μｇ／ｒｎ１．のカナ
マイシン含有の２ＸＴＹ培地（１リットル当り１６ｇの
バタトトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇＮａＣｊ
り中３７℃で増殖させる。６００　ｎｍの吸光瓜がおよ
そ１．０でＩ　ＰＴＧを終濃度２ｍＭとなるよう添加す
る。さらに３７℃で６時間培養後、細胞を遠心分離で集
めた。
Ｃ，＠胞の破砕 １リツトルの生育培養からのペレットを５０−の１０ｍ
Ｈトリスー塩酸、ｐＨ８，０１２ｍＭＥＤＴＡ、ＩｍＨ
ＤＴＴ中にけん渇する。細胞を遠心分離で集菌後（１３
，ＯＯＯｒｐｍ　、　１０分間）、２０ｔｅの同じ緩衝
液にけん渇する。１ｄの水に溶解した１０■のリゾチー
ムを添加し、３７℃で１５分間インキュベーション後、
４００μｌのＩＭ　　ＭにＪＣ１２および耳かき１さじ
の固体ＤＮａｓｅｌ　（ＳｅｒｖａＮｏ、１８５２５）
を添加して３７℃でさらに３０分間インキュベートする
。
１０ｍ）Ｉトリス−塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＨＤＴＴで
６０ｄに希釈後、溶液を上述のとおり遠心分離してペレ
ットを１０１１１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＨ
ＤＴＴで一回洗滌する。ペレットを６０ｍの１０ｍ）Ｈ
−リス−塩酸、ｐＨ８，０，１５０ｍＨＮａＣｊ！、１
ｍＨＤＴＴｌｏ、５％ｒｒ＋ｔｏｎｘ　−１１４（ｗ／
ｖ）に再けん濁し、０℃で１５分間、３７℃で１０分間
、そして再び０℃で１５分間インキュベートする。Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ　−１１４で可溶化されない物質は遠心分離
（１３，０００ｒｐｍ　１１０分間）で集めて２０ｄの
１０１１１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＨＤＴＴ
で一回洗滌する。ペレットを２ｄの１０１１１Ｈトリス
−塩酸、ｐＨ３，ｏ、　１ｍＨＤＴＴに再けん濁し、次
に１０ｍの１０ｍＭトリス−塩酸、ｐ１１８．０１７Ｍ
−グアニジン塩酸、１１１１ＨＤＴＴに溶解する。不溶
物質を遠心分離で除去し、必要なら０．４５μｍフィル
ターで濾過する。清澄溶液を１０ｍＭトリス−塩酸、ｐ
ｌ（８，０，１ｍＨＤＴＴで１＝１５に希釈し、室温で
１０分間攪拌する。白色法でんを遠心分離で集めて１０
ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＨＤＴＴで一回洗
滌する。
最終ペレットを５−の１２５＋１１Ｈトリス−塩酸、ｐ
Ｈ６，８，４％ＳＤＳ、５ｍＨＤＴＴ、０．０２％Ｎａ
Ｎ　　に溶解して２０−５０　０Ｄ２□８ｎｍ単位／ｄ
の濃縮し、０．４５μｍのフィルターで濾過する。
分子限外クロマトグラフィーは５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ
−２００スーパーフアイン（ファルマシア、ウプサラ）
を用いた１２０Ｘ５ｃｍのガラスカラムで行なった。
２．３リツトルの５ｅｌｌｈａＣｒＶＩ　８−２００ス
ーパーフアインを１２５１Ｎトリス−塩酸、ｐＨ６，８
、（真空殺菌濾過により脱気）で十分洗滌する。次にゲ
ルを製造元の指示に従ってカラムに移す。充填は同じ緩
衝液を用いて３００ｄ／ｈの流速で下降で行なう。ゲル
の高さが安定したら充填槽をはずして流液アダプターを
つける。流す方向を反対にして３００ｄ／ｈの充填を数
時間続ける。
ゲルは１０１の緩衝液（１２５ｉＨｔ−リス−塩酸、ｐ
Ｈ６，８，０，１％５ＤＳ）を１５０ｄ／ｈの流速で流
して平衡化する。次に流速を１００Ｉｎｌ／ｈに下げる
。分離の際、１０００Ｄ２７８単位の細菌由来ＥＮＶ　
（８０）−ＧＡＧ−１５抽出物をカラムにのせ、蛋白の
溶出を２７８０ｍで追跡した。
第１０図に細菌抽出物を含むＥＮＶ（８０）−〇ＡＧ−
１５ポリペプチドの上記５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２
００スーパーフアインカラムからの典型的溶出パターン
を示す。ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５溶出プロフイ
ルからの分画を第１０図に示すように集め、５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で５分析
した（第１１図）。
〈実施例８〉 患者血清試料中のＡＩＤＳ抗体測定のための酵素灸交ヱ
又土イ Ａ、　　ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５被覆ビーズの
調製方法 実施例７からのＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５ポリペ
プチドをおよそ１５１の０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液
、ｐＨ９，５、に溶解して最終蛋白部　９５一 度を１．４ｍ　００２□８／−とする。この溶液に１１
０．０００個のポリスチロールビーズ（５ｐｅｒＯｔｅ
ＣｈまたはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｂａ１ｌ　Ｐｌａｓｔ
ｉｃｓ　）を添加して室温で２時間インキュベートする
。続いてビーズをおよそ２０ｊ！のＰＢＳＴ溶液（０，
０５％のＴｗｅｅｎ　２０含有のりん酸緩衝塩溶液）で
洗い、約１５１の新しいＰＢＳＴ溶液中で室温３０分イ
ンキュベートする。ＰＢＳＴ溶液を除去してからビーズ
を０．０５ＭＴｗｅｅｎ　２０　（メルク社）、１％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％Ｋａｔｈｏｎ　
（Ｃｈｒｉｓｔ）および１０％蔗糖（Ｆｌｕｋａ　）を
含む１５１のりん酸緩衝塩溶液中で４５℃にて１２−２
４時間インキュベートして非特異結合を低下させる。上
記インキュベーション溶液を除去後ビーズをウアットマ
ン３ＭＭ１ｌ１紙に移して３７℃でおよそ１時間乾燥す
る。
Ｂ、対照血清試料の調製方法 陽性対照血清（ＩＱＧ画分をりん酸緩衝塩溶液に溶解）
は”Ｈｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ　Ａｎｔｉｋｊｒｐｅｒ。
Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ　ｕｎｄ　Ｃｈａｒａｋｔｅｒ
ｉｓｉｅｒｕｎｇ”、Ｐｅｔｅｒｓら編集、Ｓ’ｐｒｉ
ｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａａ　、ベルリン、１９２−１９６
頁（１９８５年）に記載されているように陽性量のＡＩ
ＤＳ抗体を含有することがわかっているヒト血液血清か
ら得られた。安全のため、さらに処理する前に血液血清
中の感染性物質を５６℃で３０分加熱して失活させた。
陰性対照血清（５６℃２時間加熱失活させてから滅菌濾
過）はＡＩＤＳ抗体を含有せず、Ｂ型肝炎表層抗体陰性
の正常ヒト血清から得られた。
Ｃ１検査キットの成分 本発明のキットには一般的に次の試験用成分を備えてい
る。
１、ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５ポリペプチドで被
覆したビーズ１００個。
２．２５ｍｅの抗−ヒトーＩａ西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ溶液（ペルオキシダーゼ＞２Ｕ／ｄ、トリス０．１
　　ｍｏｌ／Ｊり。
３、陽性対照として使用するＡＩＤＳ抗体を含有するヒ
ト血清０．３ｄ。
４、陰性対照として使用するＡＩＤＳ抗体を含有しない
と１・血清０．３ｍ。
５．０−フェニレンジアミン錠剤（１錠当り２００μｍ
ｏｌ、２４％）１０錠。
６．０．０５％ｒｗｃｃｎ　２０および０．１％Ｋａｔ
ｌ】ｏｎ含有のりん酸緩衝塩溶液中２０％新生仔ウシ血
清（５６℃で３０分分熱熱失活後菌濾過）を含む試験用
緩衝液１００ｍ。
７、６Ｉｌｎ＋ｏｌ　／１（１）水素ｔ’、、ルオキ’
：、ｔターセ、０゜１　　ｍｏｌ／ｊ！クエン酸、ｐＨ
１５，２（２５℃）を含有する基質用緩衝溶液５０ｍ。
８、硫酸溶液（０，５ｍｏｌ／ｊ！、４．９％）１１０
〆。
９、各ラック２５本人りの５ラツクの試験管１２５本。
１０、ピンセット１本。
開封前の試薬は２−８℃で包装に記載される有効期限ま
で安定である。
以下の物はキットには備えられていないが、本発明の検
査キットを用いる方法には必要である。
１．３７℃の水槽。
２、吸光度の範囲がＯから２．５の分光光度計（波長４
９２ｎｍ）。自動測定にはＥＩＡ分光光度計＜Ｒｏｃｈ
ｅ　＞カタログ番号１，０２８．００６が特に適してい
る。
３、ビーズを洗滌する道具（例えば、並べたぴんと水噴
射式真空ポンプ、またはＥＩＡウオッシャ−＜Ｒｏｃｈ
ｅ　＞、自動型カタログ番号１，０２８．００６、或い
は標準型カタログ番号１．０２８．０４９）。
４、攪拌機。
５、精密ピペット：０．０１ｍ、０．２５ｄ、１ｄおよ
び５ｄ。
６、試験管を封入またはふたするためのアルミフォイル
、パラフィルムまたは栓。
Ｄ、検査キットの使用方法 本発明による検査キットを使用した好ましい方法の一つ
は以下のステップより成る： （ａ）少なくとも２本の試験管に該陽性対照血清を０．
０１威ずつ入れる； （ｂ）少なくとも３本の試験管に該陰性対照血清を０．
０１〆ずつ入れる： （Ｃ）少なくとも２木の試験管に患者試料を０．０１ａ
ｆｔずつ入れる： （ｄ）各試験管に１ｄの該試験用緩衝液およびＦＮＶ　
（８０）−ＧＡＧ−１５ポリペプチドで被覆したビーズ
１個を加える； （ｅ）試験管を振とうまたは攪拌して３７℃に約１時間
インキュベ−１〜する； （ｆ）インキュベート後の試験管から液体を除去しく水
噴出真空ポンプ）、試験管のビーズを蒸溜水または脱イ
オン水（３−５，ａｉりで３回洗う＝（（＋）洗滌後の
各試験管に該抗−ヒトＩｏ−ペルオキシダーゼ溶液０．
２５ＩＲ１を加える：（ｈ）試験管を振どうまたは攪拌
し、３７℃でおよそ１時間インキュベートする： （ｉ）インキュベートした試験管より液体を除去しく水
噴出式真空ポンプ）、試験管のビーズを蒸溜水または脱
イオン水（３−５ｍ）で３回洗滌する； （ｊ）該Ｏ−フェニレンジアミン錠剤１個を５−の該基
質用緩衝液（１９本の試験管用に十分量）に溶解して酵
素基質緩衝液を調製し、１本は試薬ブランク（ＲＢ）と
する。上記酵素基質緩衝液は光を遮断しておく限り１時
間安定である；（ｋ）該酵素−基質緩衝液を各洗滌試験
管と試薬ブランク試験管に０．２５−ずつ入れる＝（１
）試験管を振とうまたは攪拌し、室温（１８−２６℃）
で３０分間インキュベートする。ＲＢも同様にする。
（＃ｌ）反応を停止ＦするためにＲＢを含む各試験管に
１−の硫酸を添加する； （ｎ）試験管を振とうまたは攪拌する；（０）分光光度
計を用いて４９２　ｎｍで対照および患者試料をＲＢに
対して測定する。測定を試験管のままで行なう際は光度
計に入れる前に試験管の外側をふく： （ｐ）次の方法によって患者試料中のＡＩＤＳ抗体の量
を計算する； 陽性対照血清を含む試験管の平均、陰性対照血清を含む
試験管の平均、および患者試料を含−１ｎ　　１　　　
− む試験管の平均を別々に計算する。患者試料の平均値を
本試験の切り捨て値である約０．２５０Ｄ４９２と比較
する。陽性と考えるには患者試料の値が上記切り捨て値
と同じがそれ以上でなければならない。
陰性および陽性対照血清は平均吸光度がそれぞれ０．０
２か’３０．１５０おｃ［Ｆｏ、６００から’１．１０
０の間でなければならない。もしそうでなければ試験を
もう一回くり返さねばならない。
Ｅ・　級ヌ 感度および特異性をウェスタンブロッティング（ＷＢ）
−分析を参考法として比較した。危険群として知られる
ものからの試料を除いて明かに陰性の血清についてはＷ
Ｂ−分析を行なっていない。
結果は：（ａ）ＷＢで陽性を確認した１７３試料（コノ
中に：ハＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　オ
ｃＬヒ０ｒ（７ａｎＯｎにより提供される同相抗原とし
て失活全一　　　１０２　　− ウィルスを用いた２つの市販トＩＴＬＶ−１１１／ＬＡ
Ｖ　　ＥＩＡで反応しなかった２血清が含まれている）
で感度９８．８％；（ｂ）１６７４の陰性試料で特異性
９９．８％であった。
無作為抽出正常ヒト献血試」の　か 通常条件下の血液銀行で行なった試験の結果は以下のと
おりである： ａ　ＷＢではｐ２４Ｑａ（Ｊ蛋白のみ検出される危険群
の反応性 比較のため３６４個のヒト血清試料をＥＮＶ（８０）−
ＧＡＧ−１５Ｅ　ＩＡおよび市販のＡｂｂｏｔｔ抗体）
ＩＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ　　ＥＩＡで検査した。血清
は麻薬常用者、同性愛者、血友病患者、ＡＩＤＳ兆候の
患者、アフリカ人（肝疾患のあるタンプニアからの人々
）および輸血を受けた人から採取した。両テストで得た
結果はウェスタンブロッティング（Ｗｅ＞および／また
は市販のｏｒｇａｎｏｎ　ＥＩＡで確認した。両・テス
トの比較を以下に示す： １”ＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５ＥＩＡ＋十／−一 ＋　　　　　１５８　　　０　　　６ ＡＩ）ｂｏｔｔＥＩＡ　　＋／　−８１２４４−５５１
２に の比較かられかるとおり、両テストで１５８の陽性血清
試料（１５７が陽性と確認、１つがＷＢ陰性）および１
２６の陰性血清試料（１２４が陰性と確認され、２個が
ＷＢ陽性）が検出された。ＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１
５ＥＩＡで陽性であった８血清試料がＡｂｂＯｔｔ　　
Ｅ　Ｉ　Ａで疑わしい（＋／−）とされた（ＷＢで７個
が陽性で１つが陰性）。ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１
５ＥＩＡで陽性であった５試料はＡｂｂｏｔｔ　　Ｅ　
Ｉ　Ａで陰性であった（３個は陽性、２つは疑わしい）
。
両テストで１２試料が疑わしいと判定された（９試料は
陰性、３つは疑わしい）。ＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１
５ＥＩＡで疑わしいと判定された５血清試料はＡｂｂｏ
ｔｔ　　Ｅ　Ｉ　Ａで陰性であった（全て陰性と確認）
。ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５ＥＩＡで陰性であっ
た６血清試料がＡｂｂｏｔｔＥＩＡで陽性と判定された
（全て陰性と確認）。
ＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５ＥＩＡで陰性であった４
４血清試料がＡｂｂｏｔｔ　　Ｅ　Ｉ　Ａで疑わしいと
判定された（全て陰性と確認）。
まとめると、ＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５ＥＩＡｆ
７）方力市販（７）　Ａｂｂｏｔｔ抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
／ＬＡＶ　　ＥＩＡよりも明確な陽性と陰性の結果を示
す。Ａｂｂｏｔｔ　　Ｅ　Ｉ　Ａは少なくとも２個のウ
ェスタンプロットで陽性と確認されたものを見逃してイ
ル。ＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５ＥＩＡｒも２試料が
間違った陰性であったが、これらの試料は市販のＡｂｂ
ｏｔｔおよびＯｒｇａｎｏｎ　　Ｅ　Ｉ　Ａでも陰性で
あった。
【図面の簡単な説明】
第１図はｅｎｖ　（８０）遺伝子の合成オリゴヌクレオ
チドの配列を示す構造模式図である。第２図はプラスミ
ドｐＡ−ＥＮＶ−２０の構築の概要を示す模式図である
。第３ａ図はｐＤｓ５／ＲＢ　Ｓ　ＩＩ、３Ａ＋５Ａの
模式図である。第３ｂ図ｔ、ｔｐＤｓ５／ＲＢＳＩＩ、
３Ａ＋５Ａ（７）Ｘｈｏ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ断片のヌクレ
オチド配列を示す構造模式図である。第４ａ図はプラス
ミドｐＤｓ８／ＲＢ　Ｓ　ＩＩの模式図であり、第４ｂ
図および４０図にはその部分塩基配列を示す模式図であ
る。第５ａ図はプラスミドｐＤＭＩ、１の模式図であり
、第５ｂ、５Ｃおよび５ａ図は本プラスミドの全ＤＮＡ
配列を示す模式図である。第６図はプラスミドｐＥＮＶ
　（８０）−ＤＩ−ＩＦＲの構築の概要を示す模式図で
ある。第７図はプラスミドｐＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−
１５の構築の概要を示す模式図であって、第７ａ、ｐ＝
７Ｃ図はそれぞれ断片１−３の単離を示す模式図であり
、第７ｄ図はそれらの集合と本プラスミドの構築を示す
模式図である。 第８図はプラスミドｐＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５
（Δｃａｔ）の構築の概要を示す模式図である。第９図
はＥＮＶ　（８０）　−ＧＡＧ−１５遺伝子の全ヌクレ
オチド配列とそれから推定されるＥＮＶ　（８０）−Ｇ
ＡＧ−１５ポリペプチドのアミノ酸配列を示す構造図で
ある。第１０図はＥＮＶ　（８０）−ＧＡＧ−１５ポリ
ペプチドの画の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すクロ
マトグラムである。第１２図はオリゴヌクレオチドの同
時合成装置を示す横断面図および正面図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）次の式で示されるアミノ酸配列より成るポリペプチ
    ド； 【アミノ酸配列があります】 I またはその断片、或いはＡＩＤＳウィルスのｅｎｖおよ
    びｇａｇ蛋白質の配列に対応する少なくとも一つの抗原
    性および／または免疫原性決定因子を有する上記ポリペ
    プチドおよび断片関連のアミノ酸置換によるアナログ類
    。 ２） I 式のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１
    ）項記載のポリペプチド。 ３） I 式の少なくとも５−８４および８７−２７６の
    アミノ酸を含有する特許請求の範囲第４）項記載のポリ
    ペプチド。 ４）特許請求の範囲第２）項および３）項のポリペプチ
    ドとアミノ酸置換により類似する特許請求の範囲第（１
    ）項記載のポリペプチド。 ５）アミノ末端にさらにメチオニン残基を有する特許請
    求の範囲第５）項から４）項のいずれか記載のポリペプ
    チド。 ６）バクテリアにより生産される特許請求の範囲第１）
    項から５）項のいずれか記載のポリペプチド。 ７）Ｅ．ｃｏｌｉに生産される特許請求の範囲第１）項
    から６）項のいずれか記載のポリペプチド。 ８）本質的に純粋な特許請求の範囲第１）項から７）項
    のいずれか記載のポリペプチド。 ９）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれかで請
    求されるポリペプチドをコードする遺伝子。 １０）特許請求の範囲第９）項記載の遺伝子が発現用Ｄ
    ＮＡ配列に機能的に結合して成る発現ベクター。 １１）グラム陰性および／またはグラム陽性細菌中で複
    製可能なプラスミドである特許請求の範囲第１１）項記
    載の発現ベクター。 １２）Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中で複製可能な特許請求の範囲
    第１１）項記載の発現ベクター。 １３）ｐＥＮＶ（８０）−ＧＡＧ−１５またはｐＥＮＶ
    （８０）−ＧＡＧ−１５（Δｃａｔ）である特許請求の
    範囲第１１）項または１２）項記載の発現ベクター。 １４）特許請求の範囲第１０）項から１３）項のいずれ
    か記載の発現ベクターを保有する細菌形質転換株。 １５）Ｅ．ｃｏｌｉ菌株である特許請求の範囲第１４）
    項記載の形質転換株。 １６）Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５株である特許請求の範囲第１
    ５）項記載の形質転換株。 １７）ワクチンの成分としての特許請求の範囲第１）項
    から８）項のいずれか記載のポリペプチド。 １８）抗原としての特許請求の範囲第１）項から８）項
    のいずれか記載のポリペプチド。 １９）バクテリア宿主を特許請求の範囲第１０）項から
    １３）項のいずれか記載の発現ベクターで形質転換し、
    形質転換株を生育に適した条件下で培養してポリペプチ
    ドを発現させ、該ペプチドを単離することより成る特許
    請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記載のポリペ
    プチドの製造方法。 ２０）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドの該ポリペプチドに対する抗体を誘導
    するのに十分量を哺乳動物または鳥類に注射し、該動物
    の血清から該抗体を回収することより成るＡＩＤＳウィ
    ルスに対す抗体の調製方法。 ２１）以下より成るＡＩＤＳウィルスに対する抗体の測
    定方法。 （ａ）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドを固体支持体に固定し； （ｂ）ステップ（ａ）の固定化ポリペプチドとヒト血清
    試料を接触させて固定化ポリペプチド−抗体複合体を形
    成させ； （ｃ）ステップ（ｂ）の複合体から非結合物質を洗い流
    し；そして （ｄ）標識したスタフイロコツカス・アウレウスプロテ
    インＡまたは抗−ヒトＩｇＩのようなヒト抗体を選択的
    に検出できる標識試薬の添加により複合体を検出する。 ２２）固体支持体がビーズであつてヒト抗体を選択的に
    検出できる標識試薬がペルオキシダーゼ存在下で変色す
    るＯ−フェニレンジアミンと反応させた西洋ワサビペル
    オキシダーゼで標識した抗−ヒトＩｇである特許請求の
    範囲第２１）項記載の方法。 ２３）特許請求の範囲第２）項記載のポリペプチドを用
    いた特許請求の範囲第２１）項または２２）項記載の方
    法。 ２４）以下より成るヒト血清または他の生物液中のＡＩ
    ＤＳウィルスまたはその断片の測定方法： （ａ）ヒト血清または他の生物液試料を特許請求の範囲
    第１）項から８）項のいずれか記載のポリペプチドに対
    して形成させた抗体の既知抗体価と反応させ； （ｂ）抗体と試料を相互反応させて反応液中で抗原−抗
    体複合体を形成させ； （ｃ）ステップ（ｂ）の抗原−抗体複合体を検出する。 ２５）抗体を酵素標識し、反応液中に生成する抗原−抗
    体複合体を酵素結合免疫吸着アツセイにより検出する特
    許請求の範囲第２４）項記載の方法。 ２６）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドを生理的に容認される担体と混合する
    ことより成るワクチン製剤の調製方法。 ２７）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドおよび生理的に容認される担体を含有
    するワクチン製剤。 ２８）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドに対して形成させた抗体。 ２９）モノクローナル抗体である特許請求の範囲第２８
    ）項記載の抗体。 ３０）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドの予防免疫処理用ワクチンへの使用。 ３１）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドのＡＩＤＳウィルスに対する抗体調製
    のための使用。 ３２）特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドのヒト血液または他の生物試料中ＡＩ
    ＤＳウィルス存在の試験への使用。 ３３）特許請求の範囲第８）項から８）項のいずれか記
    載のポリペプチドのヒト血液中ＡＩＤＳ抗体存在の試験
    への使用。 ３４）特許請求の範囲第１９）項記載の方法で調製した
    特許請求の範囲第１）項から８）項のいずれか記載のポ
    リペプチド。 ３５）上記第２０）項記載の方法により調製した特許請
    求の範囲第２８）項または２９）項記載の抗体。 ３６）上記第２６）項記載の方法により調製した特許請
    求の範囲第２７）項記載のワクチン製剤。 ３７）容器中に上記第２８）項または２９）項記載の抗
    体を含むＡＩＤＳウィルスまたはそれ由来の粒子の測定
    のための試験キット。 ３８）以下より成るＡＩＤＳウィルスに対する抗体の測
    定のための試験キット。 （ａ）上記第１）項から８）項のいずれかに記載のポリ
    ペプチドを吸着させてあるビーズの容器； （ｂ）酵素−抗体結合体の容器； （ｃ）ＡＩＤＳ抗体を含有するヒト血清の容器； （ｄ）ＡＩＤＳ抗体を含有しないヒト血清の容器； （ｅ）酵素−基質錠剤の容器； （ｆ）試験緩衝液の容器； （ｇ）基質緩衝液の容器；および （ｈ）酵素反応を停止させるＨ＿２ＳＯ＿４の容器。 ３９）酵素−抗体結合体が西洋ワサビペルオキシダーゼ
    に結合した抗−ヒトＩｇであつて酵素基質錠剤がＯ−フ
    ェニレンジアミン錠剤である特許請求第３８）項記載の
    試験キット。 ４０）ビーズが上記第２）項記載のポリペプチドで被覆
    されている特許請求の範囲第３８）項または３９）項記
    載の試験キット。
JP62307368A 1986-12-05 1987-12-04 Ｅｎｖ／ｇａｇ−ポリペプチド Pending JPS63156729A (ja)

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