MXPA05013334A

MXPA05013334A - Glucoproteinas de envoltura de vih-1 que tienen estructuras de disulfuro inusuales.

Info

Publication number: MXPA05013334A
Application number: MXPA05013334A
Authority: MX
Inventors: David J Jobes
Original assignee: Vexgen Inc
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2006-05-19
Also published as: EP1633308A2; WO2004110384A3; EP1633308A4; CA2528005A1; AU2004247146A1; CN1809381A; WO2004110384A2; IL172273A0; KR20060041179A; US20050025779A1

Abstract

La presente invencion provee glucoproteinas de la envoltura de VIH-1 que tienen estructura de disulfuro inusual. En particular, la invencion incluye polipeptidos de gp1 20, y polinucleotidos que codifican para dichos polipeptidos, asi como vectores, celulas hospederas, y metodos de expresion relacionados. La invencion tambien abarca composiciones inmunogenicas que contienen polipeptidos o polinucleotidos de gp120 y su uso para inducir una respuesta inmune especifica de gp120. Los polipeptidos y polinucleotidos de gp120 de la invencion tambien son utiles en metodos de diagnostico de la invencion.

Description

GLÜCOPROTEINAS DE ENVOLTURA DE QUE TIENEN ESTRUCTURAS DE INUSUALES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en términos generales al área de composiciones útiles para inducir o para medir una respuesta inmune contra las glucoproteinas de envoltura del virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 gpl20 En la invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden un polipéptido que comprende una secuencia de gp un polinucleótido que codifica para o que codifica para dicho en la cual las composiciones inducen una respuesta inmune útil en la prevención o tratamiento de infección enfermedad por ANTECEDENTES DE LA INVENCION El síndrome de inmunodeficiencia adquirido es ocasionado por un retrovirus identificado como el virus de inmunodeficiencia de humano Se han hecho grandes esfuerzos para desarrollar una vacuna que induzca una respuesta inmune protectora basada en la inducción de anticuerpos o de respuestas Los esfuerzos recientes han utilizado vacunas de subunidades en las que se utiliza una proteína de en lugar de un virus atenuado o como el en la vacuna por cuestiones de Las vacunas de subunidad por lo general incluyen la porción de la proteína de envoltura de VIH que se encuentra desplegada sobre la superficie del virión y de células infectadas con el En este gpl20 media la infección de mediante viriones libres o mediante fusión célula a En ambas gpl20 inicia la infección de uniéndose a dos receptores celulares uno de ellos es CD4 y el otro es un receptor de quimiocina CCR5 o Se han ubicado distintos sitios de unión de alta afinidad para CD4 y para los receptores de quimiocina en la superficie de la molécula de La proteína de la envoltura de VIH ha sido descrita y se conocen las secuencias de aminoácido y de nucleótido para la envoltura de VIH provenientes de un gran número de cepas de La molécula de gpl20 consiste de un centro de polipéptido de el cual se modifica exhaustivamente mediante glucosilación ligada a para incrementar el peso molecular aparente de la molécula hasta Las proteínas maduras de la envoltura de y gp41 se derivan ambas a partir de un precursor El precursor gpl60 contiene una secuencia de señal terminal que instruye a que la proteína se sintetice en los ribosomas unidos a membrana y asegura la traslocación de los péptidos nacientes hacia el lumen del retículo endoplasmático En el retículo la secuencia de señal es removida por una señal y la proteína adquiere el tipo de carbohidrato ligado a N con alto contenido de mañosa en un proceso conjunto a la La proteína que contiene carbohidrato se transporta después hacia el Aparato de Golgi en el cual la mayor parte del carbohidrato con alto contenido de mañosa se convierte en un carbohidrato que contiene ácido siálico se convierte en el complejo mediante proteólisis por furina peptidasa o una peptidasa tipo en un sitio de procesamiento de glicoproteína El complejo se exporta después a la superficie celular en donde se cree que forma estructuras En las membranas celulares o de gpl20 se presenta como una proteína de membrana periférica que está asociada con gp41 mediante interacciones no En gp41 es una proteína de membrana la cual está anclada en la bicapa de membrana mediante un dominio de transmembrana hidrofóbico ubicado cerca del extremo carboxilo terminal La secuencia de aminoácido de contiene cinco dominios relativamente conservados intercalados con cinco dominios Las posiciones de 18 residuos de cisteína en la secuencia primaria de y las posiciones de 13 de los aproximadamente 24 sitios de glucosilación ligados a en la secuencia de gpl20 están conservados entre la mayoría de las secuencias de Los dominios hipervariables contienen inserciones y deleciones considerables Las variaciones de secuencia en estos dominios explican hasta el de la variabilidad total de secuencia entre las moléculas de gpl20 provenientes de varios aislados A pesar de esta todas las secuencias de gpl20 conservan la capacidad del virus para interactuar con gp41 y para unirse a los receptores CD4 y de quimiocina y para inducir la fusión de las membranas virales y de la célula BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención provee una composición que incluye un polipéptido o un polinucleótido y un vehículo farmacéuticamente El polipéptido aislado o el polinucleótido aislado codifica una primera secuencia de aminoácido de en la cual la primera secuencia de gpl20 incluye por lo menos los dominios y C4 de gpl20 la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos de cisteína en una o más de las siguientes y la primera secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos de cisteina adicionales en una posición diferente a las siguientes y según se enumeran a partir de la de gpl20 provenientes de la cepa de gpl20 de Sin la primera secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio VI o una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio En modalidades la primera secuencia de gpl20 comprende de manera adicional el dominio En una la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes o En otra la primera secuencia de gpl20 incluye uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes o con la condición que dichos uno o más residuos cisteína adicionales no estén presentes en el dominio VI de La primera secuencia de gpl20 puede incluir una secuencia de gpl20 que se presenta en forma natural y que de preferencia incluye una secuencia de gpl20 proveniente de un aislado primario de En las modalidades la primera secuencia de gpl20 tiene por lo menos aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y En modalidades más la primera secuencia de gpl20 incluye por lo menos los dominios V2 V3 y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y En una primera la primera secuencia de gpl20 comprende un número impar de cisternas En una variación de esta la composición inmunogénica incluye el polipéptido que comprende la primera secuencia de y una cisterna en la primera secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con otro de preferencia a través de un puente El otro polipéptido puede incluir una segunda secuencia de En casos en los que la segunda secuencia de gpl20 sea la misma que la primera secuencia de la primera y segunda secuencias de gpl20 forman un En casos en los cuales la segunda secuencia de gpl20 es diferente de la primera secuencia de la primera y la segunda secuencias de gpl20 forman un El otro polipéptido de manera adicional o como incluir una secuencia de aminoácido de La invención también provee composiciones inmunogénicas que incluye al polipéptido que comprende la primera secuencia de en la cual una cisteína en la secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una porción de unión específica de un 1 oligonucleótido y una proteína portadora En algunas la composición inmunogénica incluye un polipéptido que o el polipéptido que codifica un polipéptido de fusión que incluye la primera secuencia de La composición inmunogénica puede incluir de manera adicional un si se La invención también provee un polipéptido aislado que incluye una primera secuencia de aminoácido de en el cual la primera secuencia de gpl20 comprende por lo menos los dominios V3 y C4 de gpl20 la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes o la primera secuencia de gpl20 comprende úno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes o con la condición que dichos uno o más residuos cisteína adicionales no estén presentes en el dominio VI de según se enumeran desde la metionina de gpl20 proveniente de la cepa de gpl20 de Sin la primera secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio En las modalidades la primera secuencia de gpl20 comprende de manera adicional el dominio En una el polipéptido aislado incluye una primera secuencia de gpl20 que carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes o En otra el polipéptido aislado incluye una primera secuencia de gpl20 que incluye uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes o con la condición que dichos uno o más residuos cisteína adicionales no estén presentes en el dominio VI de En modalidades el polipéptido aislado incluye una primera secuencia de gpl20 que tiene por lo menos aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y En modalidades más la primera secuencia de gpl20 incluye por lo menos los dominios V3 y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y En una modalidad el polipéptido aislado incluye una primera secuencia de gpl20 que tiene un número impar de En una variación de esta una cisteína en la primera secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con otro de preferencia a través de un puente El otro polipéptido puede incluir una segunda secuencia de En casos en los que la segunda secuencia de gpl20 es la misma que la primera secuencia de la primera y segunda secuencias de gpl20 forman un En casos en los cuales la segunda secuencia de gpl20 es diferente de la primera secuencia de la primera y la segunda secuencias de gpl20 forman un El otro polipéptido de manera adicional o como incluir una secuencia de aminoácido de La invención también provee polipéptidos aislados en los cuales una cisteina en la secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una porción de unión específica de un un oligonucleótido y una proteína portadora inmunogénica En algunas el polipéptido aislado incluye un polipéptido de fusión que incluye la primera secuencia de El polipéptido de fusión puede incluir una secuencia de señal tal por la secuencia de señal de la glucoproteína D del virus de herpes simplex o la secuencia de señal del activador de plasminógeno de tejido de El polipéptido de fusión puede de manera o como incluir una marca de La invención también provee un polinucleótido aislado que codifica para cualquiera de los polipéptidos aislados de la Si se pretende para uso en la expresión del polipéptido el polinucleótido de preferencia está optimizado en cuanto al codón para expresión en una célula hospedera de una especie en En las modalidades el polinucleótido codifica para una secuencia de gpl20 que tiene por lo menos aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y En modalidades más el polinucleótido incluye una secuencia de nucleótido de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y 135 o una de las en la cual la codifica para por lo menos los dominios V3 y C4 de Otros aspectos de la invención incluyen un vector que incluye cualquiera de los polinucleótidos de la invención y una célula hospedera que incluye al Los vectores preferidos de la invención incluyen vectores de expresión y vectores virales Las células hospederas preferidas incluyen células de mamífero y bacterianas La invención también provee un método para producir un polipéptido que incluye una primera secuencia de aminoácido de En una el método introducir un vector de la invención dentro de una y expresar el La célula puede estar in vivo o en Si ésta en el método puede implicar de manera adicional recuperar el a partir del En otra el polipéptido se cultivando una célula hospedera de la en la cual la célula hospedera incluye un vector de y la célula hospedera se cultiva bajo condiciones adecuadas para expresión del y recuperar el polipéptido a partir del Otro aspecto de la invención es un método para inmunizar un animal con un polipéptido que incluye una primera secuencia de Este método implica administrar una composición inmunogénica de la invención al animal La invención también provee un método de diagnóstico que implica poner en contacto una muestra biológica proveniente de un individuo un polipéptido aislado que incluye una secuencia de aminoácido de y determinar si la muestra contiene o no anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido La secuencia de gpl20 incluye por lo menos los dominios V3 y C4 de gpl20 carece de uno o más residuos cisterna en una o más de las siguientes y incluye uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes ciento y según se enumera a partir de la metionina de gpl20 proveniente de la cepa de gpl20 de Sin la secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tenga una o más cisteina adicionales en el dominio VI o una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio V En las modalidades la secuencia de gpl20 incluye de manera adicional el dominio VI En una modalidad la invención provee un método de diagnóstico que implica analizar una muestra biológica proveniente de un individuo para determinar si la muestra incluye o no un polipéptido que o un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácido de gpl20 que tiene un número inusual de De manera más la muestra se analiza respecto a una secuencia de aminoácido de gpl20 carece de uno o más residuos cisteina en una o más de las siguientes y comprende uno o más residuos cisteina adicionales en una posición diferente a las siguientes y según se enumeran a partir de la metionina de gpl20 provenientes de la cepa de gpl20 de De la secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tiene una o más cisternas adicionales en el dominio VI o una secuencia de gpl20 subtipo E que tiene una o más cisternas adicionales en el dominio V En una variación de esta la prueba es una prueba inmunológica que implica poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se unen específicamente a la secuencia de gpl20 bajo condiciones apropiadas para la unión En otra variación de esta la prueba es una prueba basada en nucleótido que la cual los polinucleótidos de muestra se ponen en contacto con una molécula de ácido nucleico que sea híbrida específicamente a una secuencia de nucleótido que codifica para la secuencia de gpl20 bajo condiciones apropiadas para la En una modalidad la molécula de ácido nucleico puede ser una de un par de iniciadores de en cuyo caso la prueba se efectúa poniendo en contacto los polinucleótidos de muestra con ambos iniciadores de amplificación bajo condiciones apropiadas para la y después determinar si se produce o no un producto de En otra modalidad la molécula de ácido nucleico es una sonda de ácido nucleico que está fija a una fase y la prueba se efectúa determinando si los polinucleótidos de muestra se hibridan o no específicamente a la sonda de ácido nucleico BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras muestran diagramas esquemáticos de la secuencia de aminoácido de gpl20 de Para todas las la numeración para cada posición de residuo de aminoácido es relativa a la cepa de Las líneas indican el residuo de aminoácido real que experimenta en la que los residuos de aminoácido se marcan utilizando la abreviatura estándar de una sola Todas las mutaciones se designan en el siguiente formato para mostrar una sustitución de un residuo por en la posición Z en la cual X es el aminoácido y Y es el aminoácido de reemplazo Las cinco regiones variables y las cinco regiones conservadas se indican como y La figura 1 muestra que las posiciones 54 y 126 tienen sustituciones que alteran los residuos Cys a residuos Arg en la muestra El complemento de cisteína total es de 16 La figura 2 muestra que las posiciones 131 y 228 tienen sustituciones que alteran los residuos Cys hasta Arg y en la muestra El complemento de cisteina total es de 16 La figura 3 muestra las muestras de que tienen un complemento de cisteina total de 17 Los nombres de la muestra se indican en paréntesis después de cada La figura 4 muestra las muestras de que tienen un complemento de cisteina total de 19 Los nombres de la muestra se indican en paréntesis después de cada La figura muestra las muestras de que tienen un complemento de cisterna total de 20 Los nombres de la muestra se indican debajo de cada En esta figura únicamente se muestra la región que tiene residuos Cys adicionales En los paneles el número de residuos en el bucle los residuos se muestra en la porción derecha del El panel que muestra a 374cl y representa un conjunto de estructuras secundarias potenciales basadas en las cisteinas adicionales El panel muestra conformaciones diferentes para y basadas en distintos apareamientos de También se muestran los residuos Cys adicionales en V2 V4 y V5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee polipéptidos aislados que incluyen secuencias provenientes de gpl20 de Estas secuencias de gpl20 tienen estructuras de disulfuro En las secuencias de gpl20 de la invención contienen más o menos que los 18 residuos cisteína Las secuencias de gpl20 descritas en la presente invención se obtienen en una prueba clínica a gran escala de una vacuna de VIH efectuada en 61 sitios clínicos a lo largo de Puerto y los Países Durante el curso de estos se clona y determina la secuencia de moléculas de que codifican para gpl20 provenientes de 350 nuevas infecciones recientes por En estos se toman muestras de plasma dentro de los seis meses de la y se transcribe en forma inversa el ARN viral de se amplifican mediante la reacción en cadena de polimerasa y se determina la En forma aproximadamente el 20 por ciento de las secuencias de gpl20 obtenidas tienen estructuras de disulfuro Por lo este rasgo estructural se encuentra en un número significativo de virus exitosos poco después de la antes que se presente en el hospedero la mutación Por lo los virus con estructura de disulfuro inusuales pueden representar un de asociado con nuevas infecciones o una nueva variante importante de en circulación en En cualquier las vacunas diseñadas para prevenir la infección por deben estar dirigidas contra virus que contienen gpl20 con estructura de disulfuro inusual Las proteínas presentes en la naturaleza que contienen un número impar de cisteínas son poco comunes debido a que los grupos sulfhidrilo libres son bastante reactivos con otros grupos sulfhidrilo libres y por lo tanto tienden a formar puentes de disulfuro intramoleculares e intermoleculares Las secuencias de gpl20 de la invención que contienen un número impar de cisteínas son de interés debido a que el residuo cisteína no apareado puede formar un puente disulfuro Inter molecular o intermolecular adicional y pueden representar un mecanismo no descrita previamente utilizado por el virus para generar diversidad En dicha diversidad puede ser generada alterando la estructura de disulfuro Inter molecular o por mediación de un enlace covalente entre dos moléculas de gpl20 una con un residuo cisteína sin por mediación de un enlace covalente con un residuo cisteína en o por mediación de un enlace covalente con otra proteína viral o los desarrolladores de vacunas pueden hacer uso de proteínas de la envoltura de que contienen un residuo cisteína no apareado en la creación de antígenos novedosos que repliquen de manera más exacta la estructura de los complejos de que se presentan en la superficie de los viriones y de las células infectadas con el Por se cree que las puntas virales sobre la superficie de los viriones de y de células infectadas con el virus son oligómeros no covalentes lo general de complejos monoméricos de Debido a que estos complejos son frágiles y se no ha sido posible purificar complejos de monoméricos u Sin se cree que se pueden desarrollar vacunas de superiores si se pudiera desarrollar un método para producir complejos de oligoméricos En algunos investigadores han utilizado mutagénesis in vitro para manipular genéticamente residuos cisteína sin aparear dentro de las estructuras de gpl20 y gp41 con el de crear complejos de ligados en forma Aunque se obtuvieron complejos ligados las estructuras resultantes son estructuras que no se presentan en la naturaleza y por lo tanto no replican de manera exacta la estructura de los complejos de en la forma en la que existen en los viriones o células infectadas con el Debido a que muchas de las moléculas descritas en la presente solicitud se presentan naturalmente y tienen una cisteína sin aparear en regiones definidas que están alejadas de aquellas previamente utilizadas para la producción de complejos de estabilizados con estas moléculas ofrecen una oportunidad única para manipular genéticamente una variedad de estructuras unidas por puente disulfuro para incrementar el carácter inmunógeno de Las estructuras de ejemplo incluyen heterodímeros de moléculas de gpl20 ligadas covalentemente a otras proteínas de moléculas de gpl20 ligadas a proteínas de tipo no o moléculas de gpl20 y ligadas covalentemente a composiciones químicas no proteínicas Dichas estructuras pueden incrementar el carácter inmunógeno más allá de lo que se puedan lograr con monómeros Los complejos de gpl20 heterodiméricos son útiles para expandir el alcance de la respuesta Por se puede utilizar un heterodímero que contenga secuencias de gpl20 provenientes de dos subtipos diferentes de para inducir una respuesta inmune contra cada subtipo de En otras se pueden ligar secuencias de gpl20 que contengan un grupo sulfhidrilo libre a otras por para dirigir las secuencias de gpl20 hacia tipos celulares particulares células dendriticas o o para incrementar el carácter ligando secuencias de gpl20 a una proteína portadora altamente tal como la toxina de hemocianina de o seroalbúmina de Debido a que gpl20 se une con alta afinidad al antigeno de superficie celular las secuencias de gpl20 que contienen grupos sulfhidrilo se pueden ligar a un fármaco para direccionamiento a células que portan CD Definiciones Los términos utilizados en las reivindicaciones y en la descripción quedan definidos como se indican más adelante a menos que se especifique de otra Se dice que una secuencia de aminoácido de gpl20 de longitud completa tiene una o más si la secuencia contiene más de los 18 residuos de cisteína presentes en la mayoría de secuencias de gpl20 de longitud También se dice que un fragmento de gpl20 tiene si la secuencia de gpl20 de longitud completa a partir de la cual éste se obtiene contiene más de los 18 residuos de cisteínas y presentes una o más de adicional en el El término se refiere a cualquier composición que pueda inducir una respuesta Tal como se utiliza en la presente el término se refiere a una composición inmunogénica se reduce el riesgo o la infección por parte de un agente infeccioso o que en cualquier una infección existente Si una vacuna protege a un organismo contra exposiciones subsiguientes con el agente se dice que las vacunas son Tal como se utiliza en la presente el término de es una vacuna que contiene uno o más polinucleótidos que codifican para un en la cual la administración del polinucleótido a un organismo da como resultado la expresión del antígeno seguido por una respuesta inmune hacia dicho Tal como se utiliza en la presente el término obtenida de se refiere a una vacuna que contiene una partícula una partícula tipo virus alguna porción de una partícula viral o una célula infectadas con virus que despliega el antígeno sobre su en la cual la administración de la partícula o célula a un organismo induce una respuesta inmune hacia el antígeno El término obtenida de abarca partículas virales o VLP las cuales contienen componentes provenientes de dos o más fuentes los términos y se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para hacer referencia a un polímero de y a menos que se limite de otra incluyen aminoácidos atípicos que pueden funcionar en una manera similar a los aminoácidos que se presentan en la Tal como se utiliza con respecto a polipéptidos o polinucleótidos el término se refiere a un polipéptido o polinucleótido que se ha separado de por lo menos algún otro componente que típicamente está presente con el polipéptido o Por lo un polipéptido de origen natural está aislado si éste se ha purificado separándolo de por lo menos algún otro componente que se presente naturalmente con el polipéptido o Un polipéptido o polinucleótido recombinante está aislado si éste se ha purificado separándolo de por lo menos algún otro componente presente cuando se produce el polipéptido o Los términos o de incluyen o residuos que están presentes en la a menos que se indique específicamente lo En la presente invención se utilizan las abreviaturas de una y de tres letras para aminoácidos utilizadas comúnmente 2a págs Worth Los términos y de incluyen así como aminoácidos químicamente tales como análogos de aminoácidos presentes en la naturaleza que normalmente no están incorporados en las y compuestos químicamente sintetizados que tengan las propiedades características de los aminoácidos aminoácidos Por dentro de la definición de quedan incluidos análogos o imitadores de fenilalanina o los cuales permiten la misma restricción de conformación de los compuestos peptídicos que aquella de Phe o Pro naturales Los ejemplos de aminoácidos atípicos por aquellos descritos en la Publicación Internacional así como ácido adípico el cual puede sustituir a Glu y ácido para Glu y ácido butírico para y otros aminoácidos ácido para y otros aminoácidos ácido para ciclohexilalanina para e homoarginina para Arg y ácido diaminopropiónico para e etilglicina para y para Asn y para prolina para y para y para para y para norvalina para Met y otros aminoácidos alif norleucina para Met y otros aminoácidos ornitina para e citrulina y sulfóxido de metionina para y halógeno y y para Tal como se utiliza con referencia a un el término se refiere a un polipéptido que tiene la misma longitud que la del polipéptido de tipo silvestre El término se utiliza en la presente invención con referencia a un polipéptido o polinucleótido para describir una porción de una molécula más Por lo un fragmento de polipéptido puede carecer de una porción de la molécula más una porción o Los fragmentos de polipéptido también son referidos en la presente invención como Un fragmento de un polinucleótido puede carecer de una porción 5 de la molécula más una porción 3 o ambas En la presente invención también se hace referencia a fragmentos de polinucleótido como Los oligonucleótidos son moléculas de ácido nucleico relativamente por lo general más cortas de 200 de manera más más cortas de 100 de manera aún más más cortas de 50 los oligonucleótidos son moléculas de ADN de una sola Una de una secuencia de aminoácido o de nucleótido es una porción de una secuencia más grande Los términos o ciento de en el contexto de dos o más secuencias de aminoácido o se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son cuando se comparan y alinean respecto a correspondencia según se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual Para comparación de una secuencia típicamente actúa como una secuencia de con la cual se comparan las secuencias de Cuando se utiliza un algoritmo para comparación de las secuencias de prueba y de referencia se introduce en una se designan las coordenadas de si fueran y se designan los parámetros de programa de algoritmo de El algoritmo para comparación de secuencia calcular después el por ciento de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba con relación a la secuencia de tomando base de los parámetros de programa La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede ser por mediante el algoritmo de homología local de mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman mediante el método de búsqueda respecto a similitud de Pearson Lipman USA mediante implementaciones en computadora de estos algoritmos y TFASTA en el paquete de software de isconsin Genetics Computer 575 Science o mediante inspección visual en general Ausubel et al ejemplo de un algoritmo útil es PILEÜP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones por para mostrar la relación y por ciento de identidad de Este también gráfica un árbol o que mostrar las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng Doolittle El método utilizado es similar al método descrito por Higgins Sharp CABIOS El programa puede alinear hasta la 300 cada una de una longitud máxima de nucleótidos o aminoácidos el procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación por pares de las dos secuencias más lo que produce un grupo de dos secuencias Este grupo se alivia después con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más Dos grupos de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación por pares de dos secuencias La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones por El programa se corre designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácido o nucleótido para regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros del Por se puede comparar una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación de por ciento de identidad de secuencia utilizando los siguientes peso de espacio predeterminado peso de longitud de espacio predeterminado y espacios finales Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST para Investigación de Alineación Local Básica Local Search la cual se describe en Altschul et Biol El software para efectuar el análisis BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional para Información sobre Biotecnología Genter for Biotechnology Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencia de alta puntuación identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia en los cuales igualan o satisfacen alguna puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos se conoce como un valor umbral de puntuación de palabra circunvecina et Estos aciertos de palabra circunvecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que las Los aciertos de palabra se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde sea posible para incrementar la puntuación de alineación Las puntuaciones acumulativas se calculan para secuencias de los parámetros M de recompensa para un par de residuos que se siempre y de castigo para residuos no siempre Para las secuencias de se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando la puntuación de alineación acumulativa cae en una cantidad X fuera de su valor máximo la puntuación acumulativa va hasta cero o más debido a la acumulación de una más alineaciones de residuo con puntuación o a que se alcanza el final de cualquiera de las Los parámetros y X del algoritmo BLAST determinar la sensibilidad y velocidad de la El programa BLASTN secuencias de utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra de una expectativa de y una comparación de ambas Para secuencias de el programa BLASTP utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra de una expectativa de y la matriz de puntuación BLOSUM62 Henikoff Henikoff Proc USA Además de calcular el por ciento de identidad de el algoritmo BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias por Karlin Altschul Una medida de similitud suministrada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña la cual provee una indicación de la probabilidad mediante la cual se pueda presentar por azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótido o de Por se considera que una secuencia de ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de más preferido menor de 01 y más preferido aún menor de Se dice que los residuos en dos o más polipéptidos si éstos son homólogos que ocupan posiciones similares en cualquier estructura o o análogos que tienen capacidades funcionales iguales o Como es bien sabido en la los residuos homólogos se pueden determinar alineando las secuencias de polipéptido para correspondencia máxima como se describió anteriormente Las posiciones entre las secuencias de aminoácido de gpl20 descritas en la solicitud se identifican mediante números de en los cuales la numeración es a partir de la metionina de gpl20 proveniente de la cepa de VIH ID Se dice que una secuencia de aminoácido de gpl20 carece de una cisteína en una posición particular si otro residuo de aminoácido sustituye a la cisteína que normalmente está presente en dicha posición o si se ha suprimido la Tal como se utiliza con referencia a el término se refiere a cualquier polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido presente en un polipéptido proveniente de un organismo presente en la sin tomar en cuenta la fuente de la es el término se refiere a las características de la sin considerar si la molécula se purifica a partir de una fuente se expresa utilizando tecnología seguido por o se El término de secuencia de se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que difiere de una secuencia de aminoácido de tipo silvestre por la o sustitución de un El término de aminoácido se utiliza en la presente invención para referirse al reemplazo de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente Los aminoácidos funcionalmente equivalentes por lo general son similares en cuanto a tamaño carácter carga o carácter a los aminoácidos que éstos Los aminoácidos de carácter similar se pueden agrupar de la siguiente hidrofóbico carga carga residuos que influyen en la orientación de la y siguiente cuadro muestra sustituciones aminoácido conservadoras de ejemplo y Residuo Sustitución Sustitución original conservadora de ejemplo conservadora preferida Ala ile Val Arg asn Lys Asn Arg Gln Asp Glu Glu Cys Ser Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro Pro His Arg Asn Phe Leu Leu Phe Lys Asn Arg Met Leu Ala Leu Pro Gly Gly Ser Thr Thr Ser Ser Trp Tyr Tyr Tyr Ser Phe Val Ala Leu Una de es una secuencia de aminoácido que se encuentra en proteínas unidas a membrana y secretadas que dirige la síntesis de proteínas para ribosomas unidos a membrana y medía la traslocación de cadenas peptídicas nacientes al interior del lumen del retículo en el cual están disponibles una variedad de modificaciones posteriores a la traducción ejemplo que no están disponibles para las proteínas sintetizadas en el citoplasma en ribosomas Tal como se utiliza en expresión el polipéptidos se secreta desde una célula que expresan polipéptido al medio de cultivo para facilidad de Se dice que una secuencia de señal es si la secuencia de señal se obtiene a partir de un polipéptido diferente al polipéptido al cual ésta está fusionada para facilitar la expresión recombinante o la Una de es una secuencia de aminoácido que define un epítope para un Las marcas de epítopes se pueden manipular genéticamente como polipéptidos o péptidos de interés para facilitar la purificación o Tal como se utiliza en la presente un de es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido proveniente de un polipéptido ligado a una secuencia de aminoácido que normalmente no está presente en dicho Esta última puede ser una secuencia de aminoácido proveniente de un polipéptido diferente una secuencia de señal o una secuencia En términos los polipéptidos de se expresan utilizando tecnología que utiliza una construcción que contiene una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de polipéptido en a una secuencia de nucleótido que codifica para la otra secuencia de Tal como se utiliza con referencia a un polipéptido o fragmento de el término incluye variantes de secuencia de aminoácido así como cualquier otra molécula que difiere de una secuencia de aminoácido de tipo silvestre por la o sustitución de uno o más grupos Los conservan por lo menos una propiedad biológica o inmunológica de un polipéptido o fragmento de polipéptido de tipo tal por la propiedad biológica de unión específica a un receptor y la propiedad inmunológica de unión específica a un Una de unión específica de se refiere a una porción que se une específicamente a un compañero de unión encontrado en uno o en varios tipos celulares Una porción de unión específica de células se puede ligar a un polipéptido o por para dirigir el polipéptido o polinucleótido hacia un tipo de célula Una portadora es un polipéptido que está ligado a un antígeno que por sí mismo no induce una respuesta inmune un El conjugado resultante puede inducir una respuesta inmune contra el El término se definen la presente invención como la unión preferente de los compañeros unión a otro dos polipéptidos un polipéptido y una molécula de ácido o dos moléculas de ácido en sitios El término une indica que la preferencia de unión para la objetivo es de por lo menos 2 más preferido por lo menos 5 y más preferido aún 10 o 20 veces con respecto a una molécula objetivo no específica ejemplo una molécula generada en forma aleatoria que carece del sitio o sitios reconocidos Tal como se utiliza en la presente un se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante y así como una miríada de genes de la región variable de Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o Las cadenas pesadas se clasifican como o lo que a su vez define las clases de e Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina típica comprende un Cada tetrámero está constituido por dos pares idénticos de cadenas de cada par tiene una cadena y una cadena kD El extremo de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de Los términos ligera variable y pesada variable se refieren a estas cadenas ligera y pesada Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas Por lo por la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los puentes disulfuro en la región de gozne para producir un dímero de el cual por sí mismo es una cadena ligera unida a mediante un puente El se puede reducir bajo condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de gozne con lo cual se convierte el dímero 2 en un monómero El monómero es esencialmente un Fab con parte de la región de gozne Fundamental Raven para una descripción más detallada de los otros fragmentos de Aunque varios fragmentos de anticuerpo se definen en termino de la digestión de un anticuerpo el experto en la técnica apreciará que dichos fragmentos se pueden sintetizar de novo ya sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante Por lo el término tal como se utiliza en la presente invención también incluye fragmentos de anticuerpo que se producen ya sea por la modificación de anticuerpos enteros o se sintetizan de novo utilizando metodologías de ADN Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena individual que existen como una cadena peptídica de manera más preferida anticuerpos Fv de cadena individual o en los cuales están unidas entre sí una cadena pesada variable y una cadena ligera variable o a través de un enlazador para formar un polipéptido El anticuerpo Fv de cadena individual es un heterodímero ligado en forma el cual se puede expresar a partir de un ácido nucleico que incluya secuencias codificadoras de y unidas ya sea directamente o unidas mediante un enlazador que codifica para et Aunque las y VL están conectadas para formar una cadena de polipéptido los dominios de VH y VL se asocian en forma no Los anticuerpos scFv y un número de otras estructuras que convierten las cadenas de polipéptido ligera y pesada agregadas en forma pero químicamente separadas de una región V de anticuerpo en una molécula que se pliega en una estructura tridimensional sustancialmente similar al estructura de un sitio de unión a antígeno son conocidos por los expertos en la técnica por patentes y Las frases cantidad y cantidad suficiente se refieren a cantidades de un agente biológicamente activo que produce una actividad biológica El término se refiere a cualquier agente que sea lo suficientemente no tóxico a las células individuos para permitir el uso farmacéutico del El término se refiere a un compuesto o mezcla que incrementa la respuesta inmune hacia un Un de VIH es un aislado de VIH obtenido a partir de un individuo infectado con VIH sin hacerlo pasar por cultivo El término se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o y a menos que se limite de otra incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar en una manera similar a la de los nucleótidos que se presentan en la El término se refiere a cualquier forma de ADN o por ADN complementario el cual es una representación de ADN de normalmente obtenida mediante transcripción inversa o amplificación del mensajero moléculas de ADN que se produce sintéticamente o mediante y El término abarca moléculas de ácido nucleico de doble asi como moléculas de una sola En los polinucleótidos de doble las cadenas de polinucleótido no necesitan ser un polinucleótido de doble cadena no necesita ser de doble cadena a lo largo de la longitud completa de ambas El término se utiliza en la presente invención para describir una construcción de ADN que contiene un Los vectores preferidos se pueden propagar de manera estable o transitoria en una célula El vector puede por un cromosoma bacteriano artificial cromosoma artificial de levadura o un vector Una vez que se introduce dentro de un hospedero el vector se puede replicar y funcionar independientemente del del o en algunos integrarse en el genoma del Tal como se utiliza en la presente el término en forma se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control un y la secuencia Por un promotor está ligado en forma operable a una secuencia si el promotor puede iniciar la transcripción de la secuencia de se refiere a una construcción de AUN que contiene un que está ligado de manera operable a una secuencia de control que puede efectuar la expresión del polinucleótido en un hospedero Las secuencias de control de ejemplo incluyen un promotor para efectuar la una secuencia de operador opcional para controlar la una secuencia que codifica para el de los sitios de unión a y secuencias que controlen la terminación de la transcripción y El término se refiere a una célula que puede mantener un vector ya sea en forma transitoria o estable Las células hospedera de la invención pero no se limitan células células de células de células vegetales y células de También son apropiadas para uso en la invención otras células hospederas conocidas en la o que se lleguen a conocer posteriormente Una célula hospedera puede estar presente en un cultivo celular de manera Una célula hospedera está cuando esta está presente en un organismo Tal como se utiliza en la presente el término se refiere a la capacidad para apareamiento preciso entre dos Es si un nucleotxdo en una posición dada de una molécula de ácido nucleico puede unirse mediante puentes de hidrógeno con un nucleótido de otra molécula de ácido entonces se considera que las dos moléculas de ácido nucleico son complementarias una con respecto a la otra en dicha El término describe secuencias que son lo suficientemente complementarias entre sí para permitir la hibridación específica bajo condiciones de hibridación La frase de hibridación se refiere en términos generales a una temperatura aproximadamente 5 más baja que la temperatura de fusión para una secuencia específica a una fuerza iónica y pH Los ejemplos de condiciones astringentes apropiadas para lograr la hibridación específica de la mayoría de las secuencias son una temperatura de por lo menos 60 aproximadamente y una concentración de sal de aproximadamente molar a un pH de se refiere a la unión de una molécula de ácido nucleico a una secuencia de nucleótido objetivo en ausencia de unión sustancial a otras secuencias de nucleótido presentes en la mezcla de hibridación bajo condiciones de astringencia Los expertos en la técnica reconocen que la relajación de la astringencia de las condiciones de hibridación permite que se puedan tolerar no apareamientos de Polipéptidos de aislados que tienen estructura de disulfuro inusual La presente invención provee un polipéptido aislado que incluye una primera secuencia de aminoácido de El polipéptido aislado puede incluir una o más secuencias y por lo tanto el polipéptido aislado puede incluir una secuencia de gpl60 de longitud completa o un fragmento de gpl60 que contenga la secuencia de La primera secuencia de puede ser una secuencia de gpl20 de longitud completa un fragmento de la Un fragmento de gpl20 útil en la invención incluye por lo menos los dominios y C4 de En las modalidades el fragmento de gpl20 también incluye el dominio La secuencia de g carece de uno o más de los 18 residuos de cisterna presentes en la mayoría de las secuencias de o incluye o más cisternas Los polipéptidos de gpl20 de la invención se pueden utilizar como componentes de las composiciones inmunogénicas de la invención para inducir una respuesta inmune especifica de En las modalidades los polipéptidos de gpl20 se utilizan como antígenos de Los polipéptidos pueden estar incluidos en una vacuna en una variedad de por en forma unidos covalentemente a una porción especifica de célula o a una proteína portadora o pueden estar desplegados sobre la superficie de una partícula viral en una vacuna obtenida de los polipéptidos de gpl20 que portan un fármaco se pueden utilizar para dirigir el fármaco a células que tienen CD4 o receptor de Los polipéptidos de gpl20 de la invención también son útiles en un método de diagnóstico para determinar si una muestra contiene o no un anticuerpo específico para un polipéptido de gpl20 determinado con un estructura de disulfuro los polipéptidos apropiados de la invención se pueden utilizar como patrones de referencia en pruebas inmunológicas de De manera más se puede utilizar como un control cualquier polipéptido de la invención que presente reacción cruzada con el anticuerpo lo cual se puede comparar con los resultados observados cuando se analiza una muestra respecto a la presencia de Tipos de polipéptidos de en una primera la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos de cisteína en una o más de las siguientes y según se enumeran a partir de la metionina de gpl20 proveniente de la cepa de gpl20 de En una variación preferida de esta la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos de cisteína en una o más de las siguientes y En una segunda la primera secuencia de gpl20 incluye uno o más residuos de cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes y según se enumera tomando como base gpl20 de Sin la primera secuencia de gpl20 de la invención no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tenga una o más cisternas adicionales en el dominio ni tampoco es una secuencia de gpl20 subtipo E gpl20 que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio En una variación preferida de esta la primera secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos de cisterna adicionales en una posición diferente a las siguientes y con la condición que dicho uno o más residuos de cisteína adicionales no están presentes en el dominio VI de La invención también incluye combinaciones de estas dos es en las cuales la primera secuencia de gpl20 carece de una o más cisteínas en una posición o posiciones indicadas anteriormente para la primera modalidad e incluye una o más cisteínas adicionales en una posición o posiciones indicadas anteriormente para la segunda En las modalidades la primera secuencia de gpl20 tiene por lo menos o aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios V2 V3 y C4 de una secuencia de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y Estas secuencias de gpl20 se obtiene en una prueba clínica a gran escala de una vacuna de VIH efectuada en 61 sitios clínicos a través de Puerto y los Países El siguiente cuadro muestra la correspondencia entre SEQ ID NO y la designación de muestra de gpl20 para la La secuencia de aminoácido para gpl20 proveniente de la cepa de es SEQ ID En modalidades más la primera secuencia de gpl20 tiene por lo menos o aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios V2 V3 y C4 de una secuencia de gpl20 que se selecciona a partir de una de estas secuencias Este requerimiento se cumple cuando el por ciento de identidad para cada uno de estos dominios es de or lo menos o aproximadamente o Los puntos finales de estos según se enumeran a partir de la metionina de son los residuos 131 a residuos 157 a residuos 296 a C4 residuos 418 a En ejemplos particulares de dichas la primera secuencia de gpl20 incluye por lo menos los dominios y C4 de una secuencia de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y CUADRO 1 Números de ID de secuencia para ADN de de y secuencias de proteína CUADRO 1 CUADRO 1 CUADRO 1 CUADRO 1 CUADRO 1 La secuencia de aminoácido de gpl20 puede ser una secuencia de aminoácido presente en la naturaleza de tipo o una variante de secuencia de aminoácido de la región correspondiente de un polipéptido de tipo En una la secuencia de aminoácido de gpl20 proviene de un aislado primario de Los polipéptidos preferidos de la invención incluyen por lo general una secuencia de aminoácido de gpl20 de tipo silvestre o una secuencia de aminoácido de gpl20 que contiene sustituciones de aminoácido como se definió anteriormente Los polipéptidos del invención puede incluir otras secuencias de además de las secuencias de aminoácido de es decir secuencias de aminoácido provenientes de proteínas Por la invención abarca polipéptidos de fusión en los cuales esta fusionada la secuencia de aminoácido de en cualquiera o en ambos a la secuencia o secuencias de aminoácido provenientes de una o más proteínas Los ejemplos de secuencias de aminoácido adicionales con frecuencia incorporadas en proteínas de interés incluyen una secuencia de la cual facilita la secreción de la y una marca de la cual se puede utilizar para la detección inmunológica o purificación por Las secuencias de señal preferidas para ser utilizadas en la invención pero no se limitan la secuencia de señal de la glucoproteína D del virus herpes simplex de y la secuencia de señal del activador de plasminógeno de tejido de Los ejemplos de marcas de epítope incluyen las marcas de epítope de la proteína fluorescente o y marcas de hexahistidina o de afinidad de metal Una secuencia de de VHS se emplea de manera conveniente como una marca de epítope cuando se utiliza la secuencia de señal de de VES para facilitarla Los polipéptidos de la invención se pueden modificar de otra manera para producir derivados que conserven la capacidad para inducir una respuesta inmune especifica de Por los expertos en la técnica reconocen que está disponible una variedad de técnicas para construir los denominados de con la misma actividad biológica deseada o con actividad biológica similar que la del compuesto peptídico pero con actividad más favorable que la del péptido con respecto por y susceptibilidad a hidrólisis y por et Por los polipéptidos de la invención incluyen imitadores de péptido que por modificados en el grupo el grupo carboxilo en los cuales uno o más de los enlazadores amido en el péptido convertidos en un enlace de tipo no En modalidades los polipéptidos de la invención incluyen una primera secuencia de gpl20 que tiene un número impar de residuos Dichas secuencie tiene por lo menos una cisteína una que no forma un puente disulfuro La cisteína libre puede estar unida con otro Por la cisteína libre puede formar un puente disulfuro con una cisteína libre en otro Una cisteína libre se puede insertar en forma conveniente en cualquier polipéptido de interés utilizando mutagénesis dirigida a por El otro polipéptido puede incluir una segunda secuencia de la cual puede ser igual o diferente la primera secuencia de La formación de puentes disulfuro entre dos secuencias de gpl20 idénticas produce un La formación de puentes disulfuro entre dos secuencias de gpl20 diferentes produce un heterodímero En una variación de esta una cisteína libre en la primera secuencia de gpl20 está unida covalentemente a otro polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de De la primera secuencia de gpl20 está unida mediante puentes disulfuro a una cisteína libre en la secuencia de gp41 para producir un complejo Dichos complejos son útiles como antxgenos debido a que éstos pueden imitar los complejos de encontrados en las puntas virales sobre la superficie de las partículas virales de o de células infectadas con el virus En otras una cisteína libre en la secuencia de gpl20 está unida covalentemente con una porción de unión específica de un un oligonucleótido o una proteína portadora El direccionamiento de las moléculas de gpl20 convertidas en derivado hacia células que presenten como células o de esta manera puede ser útil para modular la potencia y calidad de la respuesta inmune respuestas inmunes de TH1 o Las porciones de unión específicas de célula útiles en la invención incluyen cualquier porción ejemplo un ligando o fragmento del que pueda unirse a los sitios de unión de ligando específicos ubicados en las célula o células objetivo y no se encuentran en cantidades significativas en células no objetivo células hepáticas o de En términos las porciones de unión específicas de célula se unen a una proteína de superficie celular unida a o Por lo los ejemplos de porciones de unión específicas de célula pueden por tales como hormonas o dominios de unión a receptor de hormonas o moléculas de y Los portadores inmunogénicos comúnmente utilizados apropiados para ser utilizados en la invención incluyen toxina de hemocianina de lapa seroalbúmina de bovino y toxoide de B Producción de polipéptidos de Técnicas de síntesis Los polipéptidos de conformidad con la invención se pueden sinterizar utilizando métodos conocidos en la tales como por ejemplo síntesis en fase sólida síntesis en fase sólida condensación de y síntesis clásica en por Se prefieren las técnicas de fase sólida y se por en John Morrow Stewart y Janis Diílla Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical En una fase la síntesis típicamente comienza desde el extremo del péptido utilizando una resina protegida con Un material de partida apropiado se puede por uniendo el aminoácido requerido a una resina una resina de o una resina de Se pueden conseguir sintetizadores de péptidos al igual que los servicios que hacen que se ordenen los péptidos Técnicas recombinantes Los polipéptidos de conformidad con la invención también se puede producir utilizando técnicas Los polinucleótidos de gpl20 se pueden producir en forma amplificar amplificación en círculo giratorio u otro método de a partir de ADNc transcrito en forma inversa a partir del ADN o un polinucleótido de gpl20 clonado o aislado de o de otra manera clonado a partir de un aislado de Con un polinucleótido de gpl20 dado en se puede generar un polinucleótido que codifique una secuencia de aminoácido de gpl20 mediante cualquiera de una variedad de técnicas de clonación y por ejemplo y in Molecular A Laboratory Second Cold Spring Los ejemplos de técnica de mutagénesis utilizadas incluyen mutagénesis dirigida a sitio et Methods Enzymol et Acids mutagénesis de cassette et Gene Gene mutagénesis por selección de restricción et Trans London En una modalidad preferida de la la secuencia de una región codificadora de gpl20 se utiliza como una guía para diseñar un polinucleótido sintético que codifique para una secuencia de gpl20 deseada que se puede incorporar en un vector de la presente Los métodos para construir genes sintéticos son bien conocidos por los expertos en la por y Los métodos de expresión y purificación se describen con mayor detalle más adelante en conexión con los ácidos vectores y células hospederas de la Complejos y conjugados Los polipéptidos de gpl20 de la invención se pueden modificar utilizando técnicas comúnmente empleadas para producir complejos de polipéptido y Se puede producir complejos oligoméricos unidos por puentes de disulfuro que incluyen uno o más polipéptidos de por mezclando los polipéptidos que se van a complejar en una solución que contiene un agente reductor tal como ditiotreitol o de manera un tal como urea o clorhidrato de El agente reductor y el desnaturalizante opcional se pueden eliminar mediante Los puentes de disulfuro se forman durante la renaturalización en presencia de lo cual oxida los grupos sulfhidrilo Los puentes de disulfuro producen los Si la solución contiene únicamente un tipo de polipéptido de los oligómeros formados contendrán dichas Si la solución contiene polipéptidos de gpl20 diferentes o un polipéptido de gpl20 en combinación con otro polipéptido los oligómeros formados pueden contener especies De manera se pueden producir complejos oligoméricos que incluyan uno o más polipéptidos de gpl20 de la invención por agentes para entrelazamiento bifuncionales Dichos agentes se pueden emplear para producir conjugados de polipéptidos de gpl20 con una porción de unión específica de un un oligonucleótido o una proteína portadora Para algunas tales como los métodos de diagnóstico descritos más es deseable unir una marca detectable a uno de los polipéptidos de gpl20 de la Las marcas detectables apropiadas para ser utilizadas en la presente invención incluyen cualquier composición que pueda ser detectada mediante medios fotoquímicos ópticos o Los ejemplos incluyen biotina para tinsión con un conjugado de estreptavidina glóbulos magnéticos colorantes fluorescentes rojo de proteína fluorescente y por Molecular radiomarcas o enzimas peroxidasa de fosfatasa alcalina y otras utilizadas comúnmente en una prueba y marcas colorimétricas tales como oro coloidal partículas de oro en el intervalo de tamaño de diámetro de MI dispersan la luz verde con una alta o glóbulos de vidrio o plástico con color Las patentes que enseñan el uso de dichas marcas incluyen las patentes y Polinucleótidos aislados que codifican para polipéptidos de que tienen estructuras de disulfuro vectores y células hospederas La invención también provee un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de la Por los polinucleótidos de la invención incluyen una porción de o que codifica para una secuencia de aminoácido de Los polinucleótidos de la invención son útiles para producción recom inante de los polipéptidos de la invención in vivo en un o in vitro en cultivo de En modalidades descritas con mayor detalle más los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar en composiciones tales como vacunas de vacunas de virus o vacunas derivadas de virus como componentes de partículas los polinucleótidos de gpl20 de la invención se puede utilizar en un método de diagnóstico para determinar si una muestra contiene o no un polinucleótido que codifique para un polipéptido de gpl20 con una estructura de disulfuro Polinucleótidos En algunas el polinucleótido codifica para una secuencia de gpl20 que tiene por lo menos o alrededor de de identidad con cada uno de los dominios VI V2 V3 y C4 de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID y En modalidades el polinucleótido incluye una secuencia de de gpl20 que se selecciona á partir del grupo que consiste de SEQ ID 135 o una de las en las cuales la codifica para por lo menos los dominios V3 y C4 de el cuadro muestra la correspondencia entre la SEQ ID y la designación de muestra de gpl20 proveniente de la prueba clínica discutida La secuencia de nucleótido para gpl20 proveniente de la cepa de es SEQ ID Como se indicó la secuencia de aminoácido de gpl20 codificada puede ser una secuencia de tipo silvestre o una secuencia En casos en que la secuencia de aminoácido de gpl20 sea una secuencia de tipo la secuencia de nucleótido que codifica para esta secuencia puede ser una secuencia de nucleótido de tipo silvestre o una que contenga una o más mutaciones que no alteren la secuencia de aminoácido debido a la degeneración del código Por si el polinucleótido está diseñado para uso en expresar el polipéptido se pueden introducir mutaciones silenciosas mediante técnicas de mutagénesis estándar para optimizar los codones a aquellos preferidos por la célula De manera se puede diseñar un polinucleótido que contenga mutaciones silenciosas y De manera más como es entendido por los expertos en la los usos de codón son altamente no aleatorios y difieren entre especies Se ha demostrado que los patrones de utilización de codón se relacionan con la abundancia relativa de los de A En el caso de se ha demostrado que los cambios en la frecuencia de codón incrementan la producción recombinante de gpl20 en células de J et Curr Biol Andre et J 72 Las secuencias que codifican para gpl20 nativas por lo general son más de mientras que los genes que son altamente expresados en sistemas de mamífero tienden a ser aproximadamente de Por en casos en los que los polinucleótidos de la invención se pretendan para ser utilizados en la expresión de polxpéptidos de la invención en células de los polinucleótidos de preferencia están en cuanto a de manera tal que las frecuencias de codón coindican más cercanamente con las frecuencias de codón encontradas en genes de mamífero de manera más en los genes de mamífero expresados en forma relativamente Los polinucleótidos optimizados en cuanto a codón de la invención típicamente difieren en la secuencia de nucleótido de sus contrapartes no optimizadas en un a Por lo los polinucleótidos optimizados en cuanto a codón de la invención pueden compartir aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente o aproximadamente de identidad de secuencia con el polinucleótido no optimizado En modalidades los polinucleótidos de la invención están optimizados en cuanto a codón para la expresión en células de De interés particular son las células de roedor células de de y de y las células de primate células de mono o de En una modalidad preferida de los polinucleótidos de la invención se optimizan en cuanto a codón para la expresión en células de ovario de hámster chino Los polinucleótidos de la invención se pueden optimizar en cuanto a codón tomando como base cualquier gen proveniente de la especie en la cual se desea la pero la optimización de codón de preferencia se efectúa cambiando la frecuencia de codón a que se aproxime a aquella de los genes expresados en forma relativamente Por los polinucleótidos de la invención pueden tener frecuencias de codón que se aproximen a aquellas de los genes de Por lo se pueden determinar las frecuencias de codón por los genes de la región constante Kappa y Mu de de y se puede diseñar polinucleótidos de manera tal que tengan frecuencias de codón que se aproximen a las frecuencias de codón combinadas de los genes de la región constate Kappa y Mu de En las secuencias de estos genes se pueden descargar de GenBank o de una base de datos La región C Kappa de Ig está designada como locus en y la secuencia de la región C de Mu de Ig está designada como locus Estas secuencias después se pueden traducir y determinar la utilización de La información de utilización de codón se puede combinar y calcular las frecuencias de codón Un polinucleótido optimizado en cuanto a codón de la invención que tiene frecuencias de codón que coinciden sustancialmente con las frecuencias de codón combinadas para los genes de Ig se producen después mediante síntesis en forma En algunas es conveniente estabilizar los polinucleótidos descritos en la presente o producir polinucleotidos que estén modificados para que se adapten de manera más adecuada a las aplicaciones Para este los polinucleótidos de la invención pueden contener enlaces tipo fosfonatos de alquílicos o cicloalquílicos de cadena corta o enlaces heteroatómico o eterocíclico de cadena corta Los más preferidos son los fósforotioatos y aquellos con estructuras base como la estructura base de o y y la cual el fosfodiéster es También se prefieren polinucleótidos que tengan estructuras base de tipo y patente Otras modalidades preferidas utilizan una estructura base de ácido o nucleico en la cual la estructura base de fosfodiéster del polinucleótido se reemplaza con una estructura base de quedando las bases unidas directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la estructura base de Science Los polinucleótidos de la invención pueden contener porciones azúcar sustituidas con alquilo y halógeno pueden tener imitadores de azúcar tales como ciclobutilos lugar del grupo En otras modalidades los polinucleotidos pueden incluir por lo menos una forma de base modificada o tal como Si se los polinucleotidos pueden incluir un grupo cortador de un grupo un grupo un un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas del un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas del los polinucleotidos de la invención se pueden modificar para que incluyan cualquiera de una amplia variedad de marcas disponibles para uso en pruebas de Las marcas apropiadas incluyen aquellas discutidas anteriormente con respecto al marcado de polipéptidos de gpl20 de la Las moléculas fluorescentes se utilizan de manera conveniente para marcar polinucleotidos para uso en métodos de Las marcas fluorescentes que se pueden unir al polinucleótido pero no se limitan rojo de proteína fluorescente verde Los expertos en la técnica entienden que los polinucleotidos que son complementarios o sustancialmente complementarios para la cadena codificadora de los de la invención se pueden emplear para inhibir la expresión de los polipeptidos de la lo cual puede ser de interés para propósitos de investigación o Por los ácidos nucleicos de la invención incluyen dichos y la frase que codifica para un polipéptido de la pretende incluir dichas moléculas Los polinucleótidos antisentido pueden ser o ARN y son útiles en aplicaciones de investigación o terapéuticas de antisentido o de interferencia de ARN Los polinucleótidos de la invención se pueden producir en forma amplificar a partir de un polinucleótido de gpl20 o de un aislado o de alguna otra manera obtener a partir de un aislado de Si fuera la secuencia de nucleótido del polinucleótido obtenido de esta manera se puede alterar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas de clonación y mutagénesis para llegar a la secuencia de nucleótido por y in Molecular A Laboratory Second Cold Spring B Vectores Se puede incorporar un polinucleótido de la presente invención en un vector para propagación expresión en una célula Dichos vectores típicamente contienen una secuencia de replicación un origen de que puede efectuar la replicación del vector en una célula hospedera apropiada células de ovario de hámster chino así como secuencias que codifiquen para un marcador que se puede tal como un gen de resistencia a Después de la de un hospedero el vector se puede replicar y funcionar independientemente del del hospedero o se puede integrar en el genoma del El diseño del vector entre otras el uso pretendido y de la célula hospedera para el y el diseño de un vector de la invención para un uso particular y la célula hospedera está dentro del nivel de habilidad en la Si el vector está pretendido para expresión un el vector incluye una más secuencias de control que pueden efectuar incrementar la expresión de una secuencia codificadora de polipéptido ligada en forma Las secuencias de control que son apropiadas para expresión en por pueden incluir una secuencia de una secuencia de y un sitio de unión a Las secuencias de control para expresión en células eucariotas puede incluir una secuencia de una secuencia de y una secuencia de terminación de transcripción una señal de Los vectores de expresión de la invención son útiles para expresar polipéptidos de la invención in vivo en aplicaciones de vacunas de ADN u obtenidas a partir de o in vitro cultivo Un vector de expresión de conformidad con la invención también puede incluir otras tales por secuencias de ácido nucleico que codifican para una secuencia de señal o un gen que puede ser Una secuencia de señal puede dirigir la secreción de un polipéptido fusionado a la misma a partir de una célula que exprese la En el vector de el ácido nucleico que codifica para una secuencia de señal está ligado a una secuencia codificadora para preservar el marco de lectura de la secuencia la inclusión en un vector de un gen que complemente una deficiencia auxotrófica en la célula hospedera elegida permite la selección de células hospederas transformadas con el Los vectores virales son de interés particular para uso en el suministro de polinucleótidos de la invención a una célula u seguido por la expresión de la proteína Los vectores virales han sido estudiados exhaustivamente como medios para suministrar polipéptidos a un organismo para aliviar una condición es de Para una revisión de los procedimientos de terapia de véase por Science y Felgner TIBTECH Mitani y TIBTECH Mulligan Dillon TIBTECH Mi11er Nature Van Brunt Biotechnology Vigne Restorative Neurology and Neuroscience y Perricaudet British Medical Bulletin Haddada et in Current Topics in Microbiology and Doerfler y Bóhm Heidelberg y Yu et Gene Los sistemas de vector viral ampliamente utilizados pero no se limitan a virus virus virus de varicela de virus y diversos sistemas de expresión retrovirales El uso de vectores adenovirales es bien conocido por los expertos en la técnica y se describe con mayor por en el documento Los vectores adenovirales particularmente preferidos son descritos por et Gene Los vectores adenovirales apropiados para uso en la invención también se pueden conseguir comercialmente Por el sistema de expresión de gen vendido por provee medios eficientes para introducir genes heterólogos inducibles en la mayoría de células de Los vectores basados en virus utilizados para transducir células con ácidos nucleico por en la producción in vitro de polinucleótidos y y en los procedimientos de terapia de gen in vivo y ex vivo se en West et Virology Cárter et patente Cárter et WO otin Human Gene T erapy patente Tratschin et 5 et y Muzyczka Proc McLaughlin et y et Las líneas celulares que se pueden transformar mediante rAAV incluyen aquellas descritas en Lebkowski et Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de leucemia de múrido virus de leucemia del simio gibbon virus de inmunodeficiencia de simio virus de de humano y combinaciones de los mismos por Buchscher et Virol Johann et 66 Sommerfelt et et iller et et y Rosenburg y Fauci in Fundamental Third Edition Paul Raven Nueva York y las referencias en las Yu et Gene patente y Otros vectores virales adecuados pero no se limitan a vectores obtenidos a partir de virus herpes simples virus de virus de Epstein Barr y En una un vector de conformidad con la invención es un plásmido que puede servir como una vacuna de ADN y un vector viral recombinante La inyección directa del ADN del vector purificado en un es como una vacuna de ADN induce una respuesta inmune al polipéptido el vector también se puede utilizar para producir virus recombinantes para uso en vacunas obtenidas de Dicho vector incluye una secuencia de nucleótido que codifica para un polipéptido de la invención ligado en forma operativa a dos promotores un promotor de origen animal uso del vector en una vacuna de y un promotor viral uso en una vacuna obtenida de ün vector de la presente invención se produce ligando los elementos deseados mediante ligación en sitios de restricción Si dichos sitios no se pueden introducir sitios adecuados mediante mutagénesis estándar mutagénesis dirigida a sitio o de o se pueden utilizar adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de conformidad con la práctica Células hospederas La presente invención también provee una célula hospedera que contiene un vector de la Se dispone de una amplia variedad de células hospederas para propagación expresión de Los ejemplos incluyen células procariotas como coli y cepas de y otras levaduras u otras célula fúngicas cerevesiae y células de células y así como células eucariotas incluyendo células de mamífero como las células de ovario de hámster en células de humano como células de riñon embrionario de Las células hospederas de conformidad con la invención incluyen células en cultivo y células presentes en organismos tales como plantas o animales transgénicos o células dentro de las cuales se ha introducido una vacuna de ADN o un vector viral Un vector de la presente invención se introduce dentro de una célula hospedera utilizando cualquier método el cual puede variar dependiendo del sistema En términos un vector se introduce dentro de una célula hospedera mediante transformación conocida como o infección con un virus que porta el Si la célula hospedera es una célula procariota otra célula que tenga un pared los métodos de transformación convenientes incluyen el método de tratamiento con calcio descrito por Si se utiliza una célula procariota como el hospedero y el vector es un vector el vector se puede introducir dentro de la célula mediante Las células de levadura se pueden transformar utilizando polietilenglicol por en la forma enseñada por Las célula se mamífero se transforman de manera conveniente utilizando el método de precipitación con fosfato de calcio descrito por Graham et y por et DNA y Prot Sin también son aceptables para uso en la invención otros métodos conocidos para introducir ADN dentro de células tales como inyección y fusión de protoplastos La invención incluye la introducción de vectores de la invención dentro de células in así como dentro de células in es en cultivo Las técnicas para introducir vectores dentro de células presentes en un organismo vivo son bien conocidas y se describen detalle más adelante con respecto a los usos de las composiciones inmunogénicas de la En modalidades se introducen vectores de la invención dentro de un individuo en vacunas de ADN u obtenidas de virus Métodos de producción Se pueden utilizar células hospederas transformadas con vectores de expresión para expresar los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la La expresión implica cultivar las células hospederas bajo condiciones adecuadas para crecimiento celular y expresión y recuperación de los polipéptidos expresados a partir de un lisado celular si los polipéptidos se a partir del medio de En el medio de cultivo contiene nutrientes y factores de crecimiento apropiados para la célula hospedera Los nutrientes y factores de crecimiento en muchos bien conocidos o los expertos en la técnica los pueden determinar fácilmente en forma Las condiciones de cultivo apropiadas para células hospederas de por se describen en Mammalian Culture Plenum Press and in Barnes y Sato Cell las condiciones de cultivo deben permitir la y transporte de proteína entre compartimientos Los factores que afectan estos procesos son bien conocidos e por el número de copias de factores que estabilizan al e inductores o represores de transcripción presentes en el medio de pH y osmolalidad del y densidad El ajuste de estos para promover la expresión en un sistema hospedera particular está dentro del nivel de habilidad en la Los principios técnicas prácticas para llevar al máximo la productividad de cultivos de célula de mamífero ín por se puede encontrar en ammalian Cell a Practical Press Se puede empelar cualquiera de un número de técnicas bien conocidas para la producción de proteínas a gran escala o escala pequeña en la expresión de los polipéptidos de la Estos pero no se limitan el uso de un matraz un bioreactor con lecho un sistema de cultivo con botella y un sistema de bioreactor con tanque El cultivo celular se puede efectuar por por lote alimentado o en modo Los métodos para la recuperación de proteínas recombinantes producidas como se describe anteriormente son bien conocidos y varían en función del sistema de expresión Se puede recuperar un polipéptido que incluya una secuencia de señal a partir del medio de cultivo o del Los polipéptidos también se pueden expresar en forma intracelular recuperar de los Usados Los polipéptidos expresados se pueden purificar a partir del medio de cultivo o de un lisado celular utilizando cualquier método que pueda separar el polipéptido de uno o más componentes de la célula hospedera o medio de el polipéptido se separa de los componentes de la célula hospedera medio de cultivo que pudieran interferir con el uso pretendido del Como un primer el medio de cultivo o el lisado celular normalmente se centrifuga o se filtra para eliminar los desechos celulares Después típicamente se concentra el sobrenadante o se diluye hasta un volumen deseado o se somete a diafiltración en una solución adecuada para acondicionar la preparación para purificación posterior El polipéptido después se puede purificar adicionalmente utilizando técnicas bien conocidas La técnica elegida puede variar en función de las propiedades del polipéptido por el polipéptido de expresa como una proteina de fusión que contiene una marca de epítope u otro dominio de la purificación típicamente incluye el uso de una columna de afinidad que contenga el compañero de unión Por los polipéptidos fusionados con proteína fluorescente o marcas de epítope FLAG o con marcas de hexahistidina o marcas de afinidad de metal similares se pueden purificar mediante fraccionamiento en una columna de Tipos de composiciones inmunogénicas Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir un polipéptido aislado o un polinucleótido aislado de la invención o Un polipéptido de gpl20 aislado de la invención está presente en la composición en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune después de la administración de una dosis apropiada a un ün polinucleótido de asilado de la invención está presente en la composición inmunogénica en una cantidad suficiente para que la administración de una dosis apropiada a un individuo dé como resultado la expresión de un polipéptido de gpl20 el cual estimula una respuesta inmune En modalidades las composiciones inmunogénicas son suministrando por lo menos dos secuencias de gpl20 antigénicas Por lo las composiciones basadas en polipéptido pueden contener uno o más polipéptidos que incluyan secuencias de gpl20 derivadas a partir de por lo menos dos aislados de VIH Las composiciones basadas en polinucleótido puede contener uno más polinucleótidos que codifican para secuencias de gpl20 derivadas a partir de por lo menos dos aislados de VIH De manera las composiciones inmunogenicas de la invención pueden contener por lo menos un polipéptido que incluye una secuencia de derivada a partir de un aislado de VIH y por lo menos un polinucleótido que codifica para una secuencia de gpl20 derivada a partir de un aislado de VIH Las variaciones de esta modalidad pueden proveer tantas secuencias de gpl20 antigénicas diferentes como sean por ó 100 o más secuencias de gpl20 antigénicas Composiciones inmunogénicas que contienen polipéptidos La invención provee composiciones inmunogénicas que contienen un polipéptido aislado de la Las composiciones contienen opcionalmente otros por una solución de tal como una solución reguladora por una solución reguladora En una modalidad el otro componente es un vehículo tal como los descritos en emington Pharmaceutical Sciences 16th La composición puede incluir uno más polipéptidos de la invención en forma libre sin conjugar a otra o unido covalentemente a una porción de unión especifica de un oligonucleótido o una proteína portadora En una una composición inmunogénica de la invención incluye células que expresan un polipéptido de la un lisado o una fracción del que contiene al tal por una fracción de En otra una composición inmunogénica incluye partículas virales células infectadas con virus que despliegan uno o más polipéptidos de la La inmunización de individuos con partículas virales manipuladas genéticamente células infectadas es bien conocida en la técnica y las composiciones utilizadas para inmunización por lo general se denominan obtenidas de Las vacunas obtenidas de virus pueden ser convenientes debido a que el componente de infección viral puede promover una respuesta inmune vigorosa que activa los linfocitos los linfocitos T y los linfocitos T Se pueden utilizar numerosas especies virales para producir virus recombinantes útiles en vacunas obtenidas de Los ejemplos incluyen virus vaccinia de patente internacional O 22 de octubre de by Cooney et USA Graham et et Infec y virus de varicela canario et AIDS Retroviruses erratum in AIDS Retroviruses Anderson et Fries et Vaccine Gonczol et Vaccine Las vacunas obtenidas de virus se han preparado utilizando adenovirus defectuoso o adenovirus et Virol Prevec eü Lubeck USA Xiang et Virology Otros virus que se pueden manipular genéticamente para producir virus recombinantes útiles en vacunas incluyen retrovirus que están empacados en células con un intervalo de hospedero anfotrópico Human Gene 14 Ausubel efc Current Protocols in Molecular y virus de defectuosos o tales pero sin limitarse virus herpes simples por Kaplitt efc papilomavirus virus de Epstein Barr virus por efc Samulski et y similares Un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado para ser utilizado en la invención es no tóxico para las o individuos a las dosis y puede incluir una solución reguladora como una solución reguladora de solución reguladora de y soluciones reguladoras elaboradas a partir de otros ácidos un antioxidante ácido un péptido de bajo peso molecular de 10 residuos un polipéptido como y una un polímero hidrofílico como un aminoácido como arginina un un u otros carbohidratos y un agente quelante ácido etilendiamintetraacético un alcohol de azúcar como manitol y un n formador de sal un agente tensioactivo aniónico como y En una el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa con pH Las modalidades preferidas incluyen composiciones de liberación Una composición de liberación sostenida de ejemplo tiene una matriz de un polímero sólido hidrofóbico al cual se fija el polipéptido o en el cual se encapsula el Los ejemplos de polímeros apropiados incluyen un un un un copolímero de ácido y vinilacetato de etileno no un copolímero de ácido glicólico y ácido Dichas matrices están en forma de artículos tales como o microcápsulas Las composiciones de liberación sostenida de ejemplo incluyen típicamente a través de grupos a un polialquilenglicol polietilenglicol La unión de PEG a las proteínas son medios bien conocidos para extender el tiempo de vida media in vivo por et Se puede emplear cualquier método convencional de con con la condición que la variante con conserve la función o funciones En otra una composición de liberación sostenida incluye un polipéptido atrapado en liposomas Los liposomas son vesículas pequeñas constituidas por diversos tipos de agentes Estos componentes típicamente están arreglados en una formación de similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas Los liposomas que contienen polipéptidos se preparan utilizando métodos tales por aquellos descritos en et PNAS USA y Hwang et PNAS los liposomas en dichas preparaciones son del tipo unilaminar 800 en los cuales el contenido del lípido es mayor de 30 por ciento molar aproximadamente de colesterol ajustándose el porcentaje específico para proveer la terapia Se pueden generar liposomas útiles mediante el método de evaporación de fase utilizando una composición de lípido que por y convertida en derivado con PEG Si se los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas de un diámetro Las composiciones de la invención también pueden incluir un polipéptido que se absorbe sobre una tal como una membrana la cual se puede como se describe en la publicación internacional Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden almacenar en cualquier forma por una solución acuosa o una torta Dichas composiciones típicamente son estériles cuando se administran a los La esterilización de una solución acuosa se logra fácilmente mediante filtración a través de una membrana para esterilización por Si la composición se almacena en forma la composición se puede filtrar antes o después de la liofilización y Composiciones que contienen polinucleótidos La invención provee composiciones inmunogénicas que contienen un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de la Dichas composiciones incluyen de manera opcional otros tales como por una solución de tal como una solución reguladora por una solución reguladora En una modalidad el otro componente es un vehículo farmacéuticamente aceptable como los descritos Una alternativa para la inmunización tradicional con un antígeno de tipo polipéptido implica la introducción directa in vivo de un polinucleótido que codifica para el antígeno dentro de los tejidos de un individuo para expresión del antígeno por parte de las células del tejido del Las composiciones basadas en polinucleótido utilizadas para vacunar un individuo se denominan de o basadas en ácido Las vacunas de se describe en la publicación de patente internacional WO y en la publicación de patente internacional WO La capacidad de inyectar directamente ADN que codifique para una proteína viral para inducir una respuesta inmune ha sido demostrada en numerosos sistemas experimentales et Cox et Davis et Gene Sedegah et 9870 Montgomery et DNA Cell et Wang et Xiang et Los estudios para evaluar esta estrategia en la neutralización del virus de influenza han utilizado proteínas tanto envoltura como internar del virus para inducir la producción de pero en particular se han enfocado en la proteína viral et DNA Fynan et Robinson et Webster et La vacunación a través de introducir directamente el ADN que codifique para una proteína de envoltura de VIH para inducir una respuesta inmune protectora produce respuestas tanto mediadas por célula como humorales que son análogas a aquellas obtenidas con virus vivos et Sci se han reportado respuestas inmunes reproducibles hacia ADN que codifica para nucleoproteína que perdura ésencxalmente durante el tiempo de vida del animal en ratones et DNA Cell Biol Se pueden diseñar vacunas de ADN para estimular diferentes brazos del sistema Por las respuestas del antigeno clase I del complejo de histocompatibilidad mayor se estimulan de manera más adecuada mediante la expresión intracelular de antígenos Con el fin de lograr las secuencias que codifican para la secuencia de señal de gpl20 se suprimen y reemplazan con un codón para un residuo de metionina Los genes de gpl20 que carecen de las secuencia de señal son sintetizados en los ribosomas libres en el no adquieren carbohidrato ligado a se procesan proteolxticamente dentro de las y puede estimular respuestas inmunes restringidas a Se cree que las respuestas de son particularmente efectivas para promover las respuestas de célula T citotóxica mediadas por células T que portan En cuando los genes de gpl20 que contienen una secuencia de señal se expresen en células de la secuencia de señal dirige la síntesis en ribosomas unidos a membrana y la translocación hacia el interior del ruta en la cual las proteínas destinadas para exportación a la superficie celular o al compartimiento extracelular adquieren un número de modificaciones posteriores a la traducción y se presentan al sistema inmune en conjunto con proteínas de clase II de antígenos de mayor Los antígenos proteínicos presentados en asociación con antígenos de II son particularmente efectivos para promover respuestas de anticuerpo y respuestas de células T mediadas por pero no son efectivas para estimular las respuestas inmunes dependientes de CD8 linfocitos T citotóxicos Como es bien sabido en la un número grande de factores puede influir en la eficiencia de expresión de genes de antígeno el carácter inmunogénico de las vacunas de Los ejemplos de dichos factores incluyen el el promotor utilizado para controlar la expresión del gen del y la estabilidad del gen insertado en el Dependiendo de su los promotores difieren en la especificidad de tejido y en la eficiencia para iniciar la síntesis de et Chapman et Muchas vacunas ADN en sistemas de mamífero se han basado en promotores virales obtenidos a partir de citomegalovirus Estos tienen una eficiencia adecuada en la inoculación tanto en músculo como en piel en un número de especies de Para uso los polinucleótidos de la invención se formulan en una manera apropiada para la indicación La patente to Bennett et describe un número de composiciones y formulaciones farmacéuticas adecuadas para uso con un oligonucleótido terapéutico así como a métodos de administración de dichos En una modalidad las composiciones terapéuticas de la invención incluyen polinucleótidos combinados con como se describió Las composiciones que contienen polinucleótidos se pueden almacenar en cualquier forma por una solución acuosa o una torta Dichas composiciones típicamente son estériles cuando se administran a las células o La esterilización de una solución acuosa se logra fácilmente mediante filtración a través de una membrana para esterilización por Si la composición se almacena en forma la composición se puede filtrar antes o después de la liofilización y Otros componentes Además de los componentes descritos las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir uno o más coadyuvantes Los coadyuvantes de ejemplo pero no se limitan coadyuvante de Freund coadyuvante de Freund geles minerales tales como hidróxido de sustancias de superficie activa tales como polioles emulsiones de aceite o de hemocianinas de y BCG y Corynebacterium En años se ha descrito una nueva clase de los oligonucleótidos inmunoestimuladores Estos tienden a ser oligonucleótidos pequeños que se sintetizan ricos en guanina y citocina en En algunos casos antígenos en partículas tales como antígeno de superficie de hepatitis estos oligonucleótidos se pueden mezclar simplemente con antígenos virales con el fin de tener un En otros casos se logra una actividad superior mediante copulación química de los oligonucleótidos a la Las moléculas de gpl20 descritas en esta solicitud están particularmente bien adaptadas para su conversión en derivados con oligonucleótidos inmunoestimuladores debido a una cisteina no apareada que está disponible para copulación química a los La selección de un coadyuvante depende del individuo que será De se utiliza un coadyuvante farmacéuticamente coadyuvante preferido para individuos humanos es el alumbre de Se pueden incluir en las composiciones inmunogénicos de la invención otros tales por otros polipéptidos de ejemplo Las composiciones inmunogénicas pueden incluir otros polipéptidos que incrementen la respuesta inmune hacia los polipéptidos de la invención o provean otros Por podría ser en modalidades incluir uno o más miembros de la familia de tales como interferones o en las composiciones inmunogénicas de la En modalidades las composiciones que contienen un polinucleótido aislado de la invención también incluyen un componente qua facilite la entrada del polinucleótido al interior de una Los componentes que facilitan el suministro intracelular de polinucleótidos son bien conocidos e por emulsiones agua en polietileniminas y cualquiera de los cuales se puede utilizar en las composiciones de conformidad con la Los lípidos están entre los componentes más ampliamente utilizados de este y se puede utilizar cualquiera de los lipidos o formulaciones de lípido disponibles con los polinucleótidos de la se prefieren lípidos Los lípidos catiónicos preferidos incluyen cloruro de trimetilamonio dioleiol fosfatidiletanolamina dioleoil fostatidilcolina Los polinucleótidos también se puede atrapar en como se describió anteriormente para los polipéptidos En otra los polinucleótidos se con los cuales se pueden utilizar para transfectar Los policationes de dendrímeros son compuestos altamente ordenados oligoméricos polímeros que se forman típicamente sobre una molécula central o un iniciador diseñado mediante secuencias de reacción reiterativas agregando los oligómeros polímeros y suministrando una superficie externa que esté cargada Los dendrímeros apropiados pero no se limitan dendrímeros de tipo y diversos policationes de Los métodos para la preparación y uso de dendrímeros para introducir polinucleótidos al interior de células in vivo son bien conocidos por el experto en la técnica y se describen con por en el documento y las patentes y B Usos de composiciones inmunogénicas Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para generar una respuesta inmune especifica de gpl20 en un Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar al animal utilizando cualquier vía de administración como se describe con mayor detalle más En una se administra una composición inmunogénica a un animal para generar anticuerpos por anticuerpos útiles en investigación sobre En términos el animal es uno que típicamente se emplea para producción de Se prefieren mamíferos Los anticuerpos policlonales se crean inyectando ejemplo inyección subcutánea o polipéptidos antigénicos en un animal apropiado un ratón o un Los anticuerpos se obtienen después a partir de muestras de sangre tomadas del animal Las técnicas utilizadas para producir anticuerpos policlonales se describen exhaustivamente en la literatura por Methods of of Antisera Small Doses of Múltiple Intradermal et Los anticuerpos policlonales producidos por los animales se pueden purificar de manera por mediante unión a y elución desde una matriz a la cual se une el polipéptido para el cual se crearon los anticuerpos Los expertos en la técnica conocen diversas técnicas normales para purificación concentración de anticuerpos asi como por et Unit Current Protocols in Wiley Para muchas se prefieren anticuerpos monoclonales El método general utilizado para la producción hibridomas que secretan mAbs es bien conocido y Milstein En como se describe por Kohler y la técnica implica aislar linfocitos a partir de nodulos linfáticos drenantes regionales de cinco pacientes de cáncer mezclar las y fusionar las células con Los hibridomas se seleccionan respecto a la producción de anticuerpos que se unen a las líneas de célula de La confirmación de especificidad entre los se puede lograr utilizando técnicas de evaluación de rutina como la prueba ligada a o para determinar el patrón de reacción elemental del de interés De manera se pueden utilizar las composiciones inmunogénicas de la invención como vacunas para administración a individuos En las composiciones se pueden administrar a individuos que no están infectados con para reducir el riesgo o la infección de Individuos tales como profesionales de la oficiales de y bomberos se pueden beneficiar de la administración profiláctica de las vacunas de la Las composiciones también se pueden administrar a individuos que de antemano ya están infectados con pero que aún pueden generar una respuesta inmune por Nature y Salk Science Una denominada puede aliviar la infección existente mejorando la condición del individuo o desacelerando o evitando el avance de la puede proveer profilaxis contra infección con cepas de Composiciones inmunogénicas que contienen polipéptidos La composición inmunogénica basada en polipéptido se administran en forma conveniente mediante inyección aunque también se contempla el suministro a través de catéter u otra tubería Las vías de administración alternativas incluyen administración por vía oral y e inhalación utilizando nebulizadores comercialmente disponibles para formulaciones líquidas o liofilizadas o formulaciones en Las composiciones de polipéptido también se pueden administrar a través de complejos u otros sistemas de suministro en micropartículas o formulaciones de liberación sostenida introducidas en tejidos apropiados como La dosis de vacunación de polipéptido gpl20 administrado en la composición inmunogénica depende de las propiedades de la composición por el carácter inmunógeno de una formulación vía de administración régimen de condición del individuo y y la determinación de una dosis adecuada para un conjunto particular de circunstancias está dentro del nivel de habilidad del experto en la En términos las dosis de 300 de polipéptido gpl20 por administración son las más aunque las dosis preferidas pueden variar desde 10 aproximadamente por y pueden ser útiles dosis fuera de este intervalo dependiendo de la formulación vía de administración intramuscular contra régimen de Se pueden utilizar dosificaciones diferentes en una serie de inoculaciones secuenciales Por lo el practicante puede administrar una dosis relativamente grande en una inoculación primaria y después reforzar con dosis relativamente más pequeñas de polipéptido Composiciones inmunogénicas que contienen se pueden emplear composiciones inmunogénicas basadas en polxnucleótido de la invención para expresar un polipéptido codificado in en un con lo cual se induce una respuesta inmune contra el polipéptido y Res demostraron que se puede expresar ADN precipitado con introducido en ratones por intraperitoneal intravenosa o intramuscular La inyección de los vectores de expresión de ADN en ratones da como resultado la absorción de ADN por parte de las células musculares y la expresión de la proteína codificada por el Los se mantienen en forma episómica y no se se ha observado la expresión persistente después de la inyección en músculo esquelético de y y en cardiaco de El documento WO de octubre de describe el uso de desnudos para vacunar vertebrados Se disponen de varios métodos para introducir polinucleótidos en y la selección de un método adecuado para introducir un polinucleótido particular dentro de un animal está dentro del nivel de habilidad en la Por la introducción de proyectiles de oro revestidos con ADN que codifican para la hormona del crecimiento de bovino dentro de la piel de ratones ha demostrado que induce anticuerpos en el Se utiliza un inyector a chorro para tranfectar tejidos de y mamario de animales Zhu et de julio de han demostrado que la inyección intravenosa de un complejo de liposoma catiónico da como resultado la expresión sistémica de un transgen Ulmer et han reportado sobre la protección heteróloga contra infección por virus de influenza mediante inyección intramuscular de ADN que codifica para proteínas del virus de la El documento WO describe un método para vacunar un animal contra un en el cual se revisten partículas portadoras con una construcción de gen y las partículas revestidas se aceleran al interior de las células de un La inoculación a alta velocidad de utilizando una de incrementa las respuestas inmunes de ratones Eisenbraun DNA Cell posiblemente debido a una mayor eficiencia de transfección de ADN y una presentación de antígeno más efectiva por parte de células Los polinucleótidos de la invención también se pueden introducir en un individuo mediante cualesquiera otros métodos conocidos en la por fusión DEAE precipitación con fosfato de lipofección de o un transportador de vector de ADN por et Wu y Hartmut et Ganadian Patent Application filed La dosis de vacunación del polinucleótido de gpl20 administrado en la composición inmunogénica depende de las propiedades de la composición por el carácter inmunógeno de una formulación la vía de el régimen de la condición del individuo y y la determinación de una dosis apropiada para un conjunto particular de circunstancias está dentro del nivel de habilidad en la En términos se prefieren dosis de aproximadamente 1 a 100 mg aproximadamente del polipéptido de gpl20 por Se pueden utilizar dosificaciones diferentes en una serie de inoculaciones secuenciales Por lo el practicante puede administrar una dosis relativamente grande en una inoculación primaria y después reforzarla con dosis relativamente más pequeñas del polinucleótido de Régimen de inmunización La respuesta inmune específica de gpl20 se puede generar mediante una o más inoculaciones de un individuo con una composición inmunogénica de la Una primera inoculación se denomina una y las inmunizaciones posteriores se denominan de Las inoculaciones de refuerzo por lo general incrementan la respuesta se prefieren los regímenes de inmunización que incluyen por lo menos una inoculación de Se puede utilizar cualquier tipo de composición inmunogénica descrita anteriormente para una inmunización primaria o de Por lo por una composición inmunogénica que contiene polinucleótidos ejemplo o una vacuna obtenida a partir de de la invención se puede utilizar para una inmunización seguido por refuerzo con una composición inmunogénica que contenga polipéptidos de la o una inmunización primaria y una o más inmunizaciones de refuerzo pueden proveer las mismas secuencias de gpl20 antigénicas secuencias de gpl20 antigénicas En una modalidad de un régimen de inmunización apropiado incluye por lo menos tres inoculaciones separadas con una o más composiciones inmunogénicas de la en la que una segunda inoculación se administra más de de preferencia tres a y de manera más preferida aproximadamente cuatro semanas después de la primera En términos la tercera inoculación se administra varios meses después de la segunda y de preferencia más de cinco meses aproximadamente después de la primera más preferido seis meses aproximadamente hasta dos años aproximadamente después de la primera e incluso más preferido ocho meses hasta un año aproximadamente después de la primera También son deseables inoculaciones periódicas más allá de la tercera para incrementar la del Véase Anderson et Infectious Diseases 160 La idoneidad de los parámetros de vacunación por régimen y se puede determinar tomando alícuotas de suero a partir del individuo y analizando los títulos de anticuerpo durante el curso del programa de De manera las poblaciones de célula T se pueden monitorear utilizando métodos se monitorean la condición clínica del individuo respecto al efecto por prevención de infección por o avance de mejoras en el estado patológico reducción en carga o reducción en la frecuencia de transmisión hacia un compañero o compañeros no Si dicho monitoreo índica que la vacunación es se puede reforzar al individuo con una dosis adicional de composición y se pueden modificar los parámetros de vacunación en un modo esperado para potenciar la respuesta Por lo por se puede incrementar la dosis de polipéptido o polinucleótido de gpl20 de se puede unir o formar un complejo de polipéptido gpl20 con una proteína portadora o se puede cambiar la vía de METODOS DE DIAGNOSTICO Detección de anticuerpos específicos para polipéptidos de con estructura de disulfuro inusual La invención provee un método de diagnóstico para determinar si un individuo ha producido o no anticuerpos específicos para un polipéptido de gpl20 de la El método implica poner en contacto una muestra biológica proveniente de un individuo con el polipéptido de gpl20 de interés y determinar si la muestra contiene o no un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido la muestra empleada puede incluir cualquier tejido que contenga pero de manera más conveniente es sangre o una fracción sanguínea suero o Los anticuerpos se pueden detectar cuantificar en la muestra utilizando cualquiera de un número de bien conocidas por patentes y Para una revisión general de las véase in Cell Biology Antibodies in Cell Academic York Basic and Clinical Immunology 7th Stites En un formato en fase sólida se puede fijar un polipéptido de gpl20 de interés a una fase sólida para que actúe como un agente de captura que inmovilice cualquier anticuerpo en la muestra que sea específico para el polipéptido de Después se puede separar el anticuerpo unido del anticuerpo libre en la muestra mediante un paso de lavado Las típicamente emplean un agente de marcado para que se una de manera y el complejo de unión formado por el polipéptido de gpl20 y cualquier anticuerpo en la muestra que sea específico para el polipéptido de Se puede emplear cualquier sistema de marcación directo o Por se puede utilizar un anticuerpo marcado específico para las especies del individuo que está siendo analizado para marcar cualquier anticuerpo unido a una fase También se pueden como el agente de marcado otros polipéptidos capaces de unirse específicamente a las regiones constantes de tales como un polipéptido A o un polipéptido Estos polipéptidos son constituyentes normales de las paredes celulares de bacterias de tipo estreptococo Estas presentan una reactividad no inmunogénica fuerte con las regiones constantes de inmunoglobulina proveniente de una variedad de especies en general et y Las marcas apropiadas incluyen aquellas discutidas anteriormente con respecto a la marcación de polipéptido de gpl20 de la invención Las pruebas de esta invención se califican positivas o negativas o cantidad de anticuerpo de conformidad con métodos estándar bien conocidos por los expertos en la El método particular de calificación dependerá del formato de la prueba y elección de la Por se puede calificar una prueba Western Blot mediante visualización del producto con color que se produce por la marca Una banda con color claramente visible o mancha en el peso molecular correcto se califica como un resultado mientras que la ausencia de una mancha o banda claramente visible se califica como un La intensidad de la banda o mancha puede proveer una medida cuantitativa de la concentración de anticuerpo En modalidades se efectúa pruebas de conformidad con la invención utilizando un sistema microelectromecánico Los MEMS son estructuras microscópicas integradas sobre silicio que combinan elementos de fluido con componentes lo que permite la detección conveniente de un analito de Un dispositivo de de ejemplo apropiado para uso en la invención es el arreglo de de Este arreglo se basa en el accionamiento de de silicio especialmente diseñados y la detección óptica subsiguiente de las deflexiones del Cuando se reviste por un lado con una antígeno o segmento de un se dobla cuando éste se expone a una solución que contiene la molécula Este doblez es ocasionado por el cambio en la energía de superficie debido al suceso de La detección óptica del grado de doblez permite la medición de la cantidad de molécula complementaria unida al B Detección de secuencias de con estructura de disulfuro inusual La invención también provee un método de diagnostico para determinar si una muestra biológica proveniente de un individuo contiene o no un polipéptido un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácido de gpl20 caracterizada por estructura de disulfuro La estructura de disulfuro inusual puede representar un de asociado con infecciones novedosas o una nueva variante importante de en circulación en El método implica analizar la muestra respecto a un polipéptido que o a un polinucleótido que codifica una secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes 418 y incluye uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes y según se enumera a partir de la metionina de gpl20 proveniente de la cepa de gpl20 de En las modalidades la secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tenga una o más disteínas adicionales en el dominio o una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisternas adicionales en el dominio V El método de diagnóstico de la invención se puede efectuar utilizando cualquier prueba que pueda detectar la presencia y cuantificar un polipéptido un polinucleótido que codifica una secuencia de gpl20 con estructura disulfuro La muestra empleada puede incluir cualquier tejido del que se espera contenga un polipéptido que o un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácido de De manera para la muestra se toman muestras de sangre o de una fracción de sangre suero o Pruebas basadas en polipéptido de En términos las son más convenientes para la detección de polipéptidos de gpl20 caracterizados por estructura de disulfuro Las consideraciones para efectuar para detectar polipéptidos de por sistemas de son esencialmente como las descritas anteriormente con respecto a la detección de anticuerpos Las preferidas para detectar polipéptidos de gpl20 pueden ser competitivas o no Las no competitivas son pruebas en las cuales la cantidad de polipéptido gpl20 unido a un anticuerpo específico se miden En las pruebas la cantidad de polipéptido de gpl20 en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un polipéptido agregado desplazado eliminado por del anticuerpo Los anticuerpos útiles en estas incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales los cuales se pueden por como se describió anteriormente Pruebas basadas en polinucleótido de Los de gpl20 que codifican para secuencias de gpl20 caracterizados por estructura de disulfuro inusual se detectan generalmente tomando como base la hibridación específica de una molécula de ácido nucleico apropiada a los polinucleótidos de La molécula de ácido nucleico se híbrida específicamente con una secuencia de nucleótido objetivo que está presente en el polinucleótido de gpl20 que se va a detectar y que no está presente en otros polinucleótidos en los polinucleótidos de En las modalidades la molécula de ácido nucleico es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótido Se pueden preparar polinucleótidos a partir de una muestra de conformidad con cualquiera de un número de métodos bien conocidos por los expertos en la Los métodos generales para aislamiento y purificación de polinucleótidos se describen con mayor detalle por Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Hybridization Nucleic Acid Parfc Theory and Nucleic Acid y Tijssen En modalidades los polinucleótidos de gpl20 se pueden obtener a partir de una muestra que contenga viral de mediante transcripción seguido por Pruebas basadas en amplificación En una se pueden utilizar pruebas basadas en amplificación para y opcionalmente un polipéptido de gpl20 de En dichas pruebas basadas en los polinucleó idos de gpl20 en la muestra actúan como una plantilla o plantillas en una reacción de amplificación efectuada con un iniciador de ácido nucleico que contiene una marca o componente detectable de un sistema de Los métodos de amplificación apropiados pero no se limitan reacción en cadena de polimerasa PCR de transcripción inversa reacción en cadena de ligasa Wu y Wallace Landegren et Science y Barringer et Gene transcription et USA replicación de secuencia et USA PCR de y PCR de adaptador de Si fuera deseable determinar el nivel del polinucleótido de se puede emplear cualquiera de un número de métodos de amplificación bien conocidos La PCR cuantitativa por lo general implica la simultáneamente de una cantidad conocida de una secuencia de control utilizando los mismos Esto provee un de referencia interno que se puede utilizar para calibrar la reacción de Los protocolos detallados para PCR cuantitativa se proveen en PCR A Guide to ethods and et Academic Pruebas basadas en hibridación La hibridación de ácido nucleico simplemente implica poner en contacto una sonda de ácido nucleico con polinucleótidos de muestra bajo condiciones en las cuales la sonda y su secuencia de nucleótido objetivo complementaria puedan formar dúplexes híbridos estables a través de apareamiento de bases Los ácidos nucleicos que no forman dúplexes híbridos se lavan después dejando los ácidos nucleicos hibridados que serán típicamente a través de la detección de una marca detectable unida o componente de un sistema de Los métodos para detectar cuantificar polinucleótidos utilizando técnicas de de ácido nucleico son conocidas por los expertos en la técnica Las técnicas de hibridación se describe en términos generales en Hames y Higgins Nucleic Acid Practical Gall y Pardue USA y John et Los métodos para optimizar las condiciones de hibridación se por en Tijssen Techniques in Biochemistry and Molecular Hybridization with Nucleic Acid Las sondas de ácido nucleico utilizadas en la presente invención para detección de los polinucleótidos de gpl20 puede ser de longitud completa o menos de la longitud completa de estos Las sondas más cortas por lo general se evalúan empíricamente respecto a la De las sondas de ácido nucleico son de por lo menos 15 y más preferido 20 bases aproximadamente o más en Sambrook et al para métodos de selección de secuencias de sonda de ácido nucleico para uso en hibridación de ácido La visualización de las sondas hibridadas permite la determinación cualitativa de la presencia o ausencia del polinucleótido de gpl20 de y los métodos estándar por densitometría en la cual la sonda de ácido nucleico se marca en forma se pueden utilizar para cuantificar el nivel del polinucleótido de Los expertos en la técnica conocen una variedad de formatos de hibridación de ácido nucleico Los formatos normales incluyen pruebas de emparedado y pruebas de competición o Las pruebas de emparedado son pruebas de hibridación comercialmente útiles para detectar o aislar polinucleótidos Dichas pruebas utilizan un ácido nucleico inmovilizado en forma covalente a un soporte sólido y un ácido nucleico marcado en La muestra provee el polinucleótido El ácido nucleico de captura y el ácido nucleico de señal se hibridan cada uno con el polinucleótido objetivo para formar un complejo de hibridación En una los métodos de la invención se puede utilizar en formatos de hibridación basados en En el formato en se puede correr esencialmente un gran número de reacciones de hibridación Esto provee la evaluación esencialmente simultánea de un número de hibridaciones en un solo Los métodos para efectuar las reacciones de hibridación en formatos basados en arreglos con bien conocidos por los expertos en la técnica por Pastinen iVature Biotechnology Chee Science WO Pinkel Nature Genética Los en particular arreglos de ácido nucleico se pueden producir de conformidad con una amplia variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la Por en una modalidad los arreglos de se pueden producir simplemente aplicando por puntos utilizando una ácidos nucleicos diferentes en sitios diferentes en un soporte sólido una superficie de una Esta estrategia de aplicación por manchas sencillo ha sido automatizado para producir microarregíos aplicados por manchas de alta Por la patente describe el uso de un sistema automatizado que golpea suavemente un contra una superficie para depositar un volumen pequeño de una muestra El procedimiento se repite para generar arreglos de alta También se pueden producir arreglos utilizando tecnología de síntesis de oligonucleótido Por lo por la patente y las publicaciones de patente del PCT y enseñan el uso de síntesis de combinación dirigida por luz de microarreglos de oligonucleótido de alta La síntesis de arreglos de alta densidad también se describe en las patentes y En una modalidad los arreglos utilizados en esta invención contienen ácidos nucleicos de Estas sondas se hibridan después respectivamente con su secuencia o secuencias de nucleótido presentes en los polinucleótidos obtenidos a partir de una muestra De manera el formato se puede de manera tal que los polinucleótidos provenientes de muestras diferentes se dispongan en un arreglo y este arreglo se someta después a sondeo con una o más las cuales pueden estar marcadas en forma diferencial En la técnica se conocen muchos métodos para inmovilizar ácidos nucleicos sobre una variedad de superficies Se pueden emplear una amplia variedad de polímeros orgánicos e así como otros tanto naturales como como el material para la superficie Las superficies sólidas ilustrativas por membranas diazotizadas o y acetato de se pueden utilizar plásticos tales como y Otros materiales que se pueden utilizar incluyen materiales materiales y se pueden utilizar sustancias que formen Dichos materiales por proteínas agarosa y poliacrilamidas En casos en los que la superficie sólida sea se pueden emplear diversos tamaños de dependiendo de la naturaleza del En la preparación de la se puede emplear una pluralidad de materiales particularmente como materiales para obtener diversas Por se pueden emplear proteínas Seroalbúmina de o mezclas de macromoléculas solución de para evitar la unión no simplificar la conjugación incrementar la detección de la Si se desea la unión covalente entre un compuesto y la la superficie por lo general será polifuncional o tendrá capacidad de ser Los grupos funcionales que pueden estar presentes en la superficie y utilizar para enlazamiento pueden incluir ácidos grupos grupos grupos grupos grupos mercapto y similares La manera de enlazamiento de una amplia variedad de compuestos a diversas superficies es bien conocida y es ampliamente ilustrada en la Los arreglos pueden estar constituidos de elementos objetivo de diversos que varían desde 1 mm de diámetro aproximadamente hasta 1 Se han descrito estrategias relativamente sencillas que pueden formar imágenes fluorescentes cuantitativas de áreas de 1 cm2 que permiten la adquisición de datos provenientes de un número grande de elementos objetivo en una imagen individual por Wittrup Cytometry et Nature Genetics Se puede efectuar pruebas de hibridación de conformidad con la invención utilizando un sistema microelectromecánico tal como el arreglo de voladizo de iii Detección de polinucleótidos de Los polinucleótidos de gpl20 se detectan en las pruebas basadas en polinucleótido descritas anteriormente por medio de una marca Se puede utilizar cualquiera de las marcas discutidas anteriormente en las pruebas basadas en polinucleótido de la La marca se puede agregar a una sonda o iniciador o polinucleótidos de muestra antes o después de la hibridación o Las denominadas son marcas detectables que se unen directamente o se incorporan en el polinucleótido marcado antes de efectuar la En las denominadas se unen al dúplex híbrido después de la En el marcado uno de los polinucleótidos en el dúplex híbrido porta un componente al cual se une la marca Por lo por una sonda o iniciador se puede modificar con biotina antes de la Después de la un fluoróforo conjugado con avidina puede unirse a los dúplexes híbridos que contienen para proveer una marca que se pueda detectar Para una revisión detallada de los métodos de marcación y detección de véase Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Vol Hybridization with Nuclelc Acid La sensibilidad de las pruebas de hibridación se puede incrementar a través del uso de un sistema de amplificación de polinucleótido que multiplique el polinucleótido objetivo que está siendo Los ejemplos de dichos sistemas incluyen el sistema de reacción en cadena de polimerasa y el sistema de reacción en cadena de ligasa Otros métodos descritos recientemente en la técnica son la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico y los sistemas de Replicasa Q En una modalidad adecuado para uso en pruebas basadas en amplificación de la un iniciador contiene dos colorantes un y un de Cuando está el iniciador produce niveles muy bajos de fluorescencia debido al efecto del colorante de Cuando el iniciador se disocia o degrada mediante actividad de exonucleasa de una véase más el colorante reportero fluoresce y es detectado mediante un sistema de detección fluorescente La amplificación mediante un número de técnicas u otro método de se efectúa utilizando una ADN polimerasa apropiada con actividad tanto de polimerasa como de exonucleasa ADN polimerasa Esta polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN en el degrada el iniciador dando como resultado un incremento en Los sistemas de detección fluorescentes comercialmente disponibles de este tipo incluyen los sistemas o 7900 de Applied Biosystems o el sistema de Los siguientes ejemplos se proveen a de ilustración y no pretenden limitar la EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión de polipéptidos de Las secuencias de gpl20 de de preferencia se expresan como proteínas de fusión que contienen una secuencia de señal heteróloga y una marca de Las secuencias de señal de incluyen aquellas provenientes de la glucoproteína gD del virus de herpes y el activador de plasminógeno de tejido de humano Los primeros 29 aminoácidos de la gD de HSV1 sirve como una marca de la cual está unida al residuo 42 de gpl20 de según se enumera desde la metionina de la cepa HXB2 de gpl20 12 de la contiene una unidad de transcripción de mamífero y un estructura base de vector de pUC vector de expresión de mamífero el cual se puede conseguir a partir de Promega Madison La unidad de transcripción contiene un promotor inicial inmediato de citomegalovirus y un intrón seguido por la región codificadora para la secuencia de señal y los primeros 29 aminoácidos de la glucoproteína gD de HSV1 madura fusionada al residuo 42 de gpl20 de en un sitio La secuencia de gpl20 termina con un codón de detención y un sitio de restricción como se indicó Esto es en el por una secuencia de SV40 y el terminador de transcripción también contiene una unidad de transcripción de mamífero y un estructura base de vector püC vector de expresión de mamífero el cual se puede conseguir a partir de Promega Madison La unidad de transcripción contiene un promotor temprano inmediato de CMV y un intrón seguido por la región que codifica para los primeros 36 aminoácidos de la secuencia de tPA y los primeros 29 aminoácidos de la gD de HSV1 madura fusionada al residuo 42 de gpl20 de en un sitio La secuencia de gpl20 la cual termina con un codón de detención y un sitio de restricción es seguida por una secuencia de SV40 y un de transcripción Las secuencias que codifican para polip ptidos de gpl20 de la invención se amplifican mediante reacción en cadena de para generar fragmentos de que se extienden desde el residuo de aminoácido hasta el residuo de aminoácido 529 18 de Los fragmentos tienen un sitio de restricción en el extremo y un codón de detención seguido por un sitio de restricción en el extremo 3 Estos sitios de restricción facilitan la clonación en vector o el vector Los productos de amplificación de gpl20 se disocian con las enzimas de restricción y X y los fragmentos de gpl20 de se aislan utilizando un estuche comercialmente tal como el estuche de purificación de PCR QIAquick o se cortan con y y el fragmento del vector de kb se aisla mediante un estuche comercialmente disponible tal como el estuche de extracción en gel QIAquick Los fragmentos de gpl20 se ligan en cualquier Los productos de ligación se transforman en coli El ADN se prepara y digiere con y y se somete a electroforesis en gel para confirmar que los transformantes contienen la construcción Después se evalúa la expresión del gen mediante transfección transitoria en la línea de células de riñon de humano embrionarias et utilizando una técnica con de calcio efc Virology y prueba subsiguiente del medio acondicionado mediante Western Blot utilizando un antisuero de conejo EJEMPLO 2 Capacidad de infección del virus y prueba de Debido a que el cultivo in vitro de inevitablemente impone condiciones una representación exacta de los virus que circulan en pacientes infectados con únicamente se puede obtener examinando secuencias virales desde el punto de vista molecular clonadas a partir de materiales fuente del paciente sin un paso de cultivo in Las moléculas de ADN complementarias resultantes obtenidas a partir de genomas de ARN retrovxrales se pueden insertar después en sistemas de expresión basados en ADN estables para análisis Uno de dichos sistemas de expresión es la prueba de neutralización de VIH con mayor detalle en Richman et En la prueba crea virus de pseudo tipo que expresan proteínas de la envoltura de y después utiliza estos virus para estudios de capacidad de infección viral Esta prueba se ha utilizado para determinar el fenotipo de glucoproteínas de envoltura de VIH clonados con respecto a la utilización de receptor de quimiocina o y sensibilidad a CD4 y anticuerpos neutralizantes del Esta prueba también ha demostrado que se correlaciona con las pruebas de neutralización de virus convencionales en las cuales se mide la capacidad de los anticuerpos para inhibir las células mononucleadas de sangre periférica activadas La prueba tiene ventajas sobre métodos convencionales en el sentido que éste es más más y utiliza virus Esto evita los artefactos potenciales que surgen de la selección del virus in La prueba utiliza amplificación de ácido nucleico para obtener secuencias de envoltura de VIH a partir de muestras de plasma de paciente VIH Las secuencias de envoltura amplificadas se incorporan en un vector de expresión utilizando métodos de clonación Los vectores de expresión se pueden preparar a partir de clones moleculares aislados individuales o a partir de mezclas grandes de secuencias que representan de manera exacta la miríada de cuasiespecies virales en el paciente al momento de la recolección de la Se preparan soluciones de reserva de que expresan las proteínas de envoltura de virus del paciente mezcladas o mediante de células con un vector viral genómico de defectuoso que carece de la proteína de envoltura de y un segundo vector de expresión que contiene la proteína de envoltura de VIH de El vector genómico de es defectuoso en cuanto a la replicación y contiene un cassette de expresión de luciferasa dentro de una región suprimida del gen de envoltura de Los virus recombinantes pseudo tipificados con proteínas de envoltura de virus del paciente así como los virus de control dependientes de CXCR4 y CCR5 y el control de virus de leucemia anfotrópico de múrido se cosechan 48 horas después de la transfección y se incuban durante 1 hora a con diluciones de 4 veces en serie de los anticuerpos monoclonales control de Las células U87 que expresan y las células que expresan se inoculan con diluciones de anticuerpo del La capacidad de infección del virus se determina 72 horas después de la inoculación midiendo la cantidad de actividad de luciferasa expresada en células infectadas y registradas como unidades de luz relativas balanceadas La actividad neutralizante se representa como el por ciento de inhibición de replicación viral de en cada una de las concentraciones de anticuerpo en comparación con un control negativo de La IC50 se define como la concentración de anticuerpo monoclonal requerido para inhibir la capacidad de infección del virus en un Un virus se clasifica como susceptible a neutralización si la es de por lo menos 3 veces más alta que la del mismo reactivo con el virus de control de Resultados experimentales Se someten tres de los imitantes de 099 19 residuos 19 residuos de y 20 residuos de a la prueba de capacidad de infección y neutralización y los resultados se presentan en el cuadro Cada uno de los virus se une a e infecta células que expresan a CD4 y al receptor de quimiocina pero no a las células U87 que expresan a CD4 y al lo que indica que estos virus mutantes son exclusivamente del fenotipo Los virus se neutralizan en forma diferencial utilizando anticuerpos monoclonales que eligen como blanco a gp41 y y gpl20 El imitante con 19 cisternas es veces más resistente a los MAb de pero se neutraliza exactamente en la misma manera que los otros mutantes utilizando el MAb de gpl20 Como un aspecto no es neutralizado por un MAb que se cree que neutraliza ampliamente en forma cruzada contra aislados de VIH primarios Trkola et Sin debido a que la unión de 2G12 es sensible a mutaciones en V4 y 210 tiene dos residuos de cisteína adicionales en esta el escape a la neutralización se puede mediar por estas mutaciones de Los resultados de este estudio demuestran que los aislados de VIH que poseen 19 y 20 residuos de en vez de los 18 residuos de cisteína son funcionales y pueden mediar la infección de células que contienen a CD4 y al receptor de quimiocina CUADRO 2 Valores de se definen como la concentración de anticuerpo monoclonal requerida para inhibir la capacidad de infección del virus en un Los MAb 4E10 y 2F5 eligen como blanco regiones en gp41 mientras que el MAb 2G12 reconoce epítopes en 92HT594 es un control de virus JRCSF y son controles para tropismo de R5 y es un control de tipo no VIH que infecta cualquier tipo de célula o pero no es inhibid por los MAb de no aplicable CUADRO 2 Referencias Richman Little Petropoulos Rapid evolution of the neutralizing antibody response to type 1 Proceedings of the National Academy of Sciences S Purtscher uster Ballaun Buchacher Sullivan Srinivasan Sodroski Moore y Katinger Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epítope on the gpl20 glycoprotein of Human Inununodeficiency Virus Type Journal of Virology 70 Todas las publicaciones y patentes mencionadas en esta descripción se incorporan en la misma para referencia en el mismo grado que si cada publicación o patente individual se indicará específica e individualmente para ser incorporada para GGAGAAAT GAGAGA AAATGTGACAGAAAGCCTTAACATATGGAAAAATAACATGGTAGAACAAATGCATGAGGATATAATCAGT OTGTGGGATCA GCCrAAAGCCATGTGTAAAATOAACCCCACTCTGCGTTACTTTAAACT c TACAGGACAATTGTGGGTTACAGTCTATTAT CA CTTGGGAGCAGCAGGAAGCACT TGTACAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAA AGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGG GCAGAGAGAAAAAaGAGCAGTGGGACTAGGAGCT GAA GC AAGGGACAAAT AGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGAAGGAGATCAAGAAGAATTGTCAGCGCTTGTGGAGATG OTCCTTGGGCTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACT C AGCAGCAGGAAGCACT AGAAAGAGGAGAAGACAGTGGCAAXGAGAGTGACGGGGATGAGGAACAAOTATCCGCACTTATGGAAAGA GAGATGGTGGGGTC 5cl 5 10 GGGAGCAGCAGGAAGC SAAEQL A ACT j GAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGGGCT AGAAAGACAGAAGACAGTGGCAATGAGAGCGAAGGGGACCAGGAAGAATTGTCAGCACTTGTGGTGGAGA A C CA AC AACTGCTGTTCAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGATCTGCCAA C SG C A GAGAGAAA C C S AGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGAGGGGGACCAGGAAG GCACATGAAATAATAGGGGASATAAGACAAGCACATTGTACCCTTAACAGAACACAATGGAATAA AA ACT 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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. - Una composición inmunogénica que comprende (a) un polipéptido aislado que comprende, o un polinucleótido aislado que codifica para, una primera secuencia de aminoácido de gpl20, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende por lo menos los dominios V2 , V3 y C4 de gpl20 y: (i) la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína o una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, y 445; y/o (ii) la primera secuencia de gpl20 que comprende una o más residuos cisteina adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 24, 29, 34, 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, 445, 493, 495, 499-501, 503-508, y 510; según se enumera desde la metionina N-terminal de gpl20 proveniente de la cepa HXB-2 de gpl20 de VIH; y porque la primera la secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio VI o una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio V4 ; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 2. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende de manera adicional el dominio VI. 3. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición inmunogénica comprende de manera adicional un adyuvante . . - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende la secuencia de gpl20 que se encuentra presente en la naturaleza. 5. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende una secuencia de gpl20 proveniente de un aislado primario de VIH. 6. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende al polipéptido que comprende la primera secuencia de gpl20. 7.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende el polinucleótido que codifica para la primera secuencia de gpl20. 5 8. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 0 418 y 445. 9. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en x una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 157, 205, 218, 228, 239, 247, 331, 378 ó 385. 10. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos cisterna adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 24, 29, 34, 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, 445, 493, 495, 499-501, 503-508, y 510. 11. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, ó 445, con la condición que uno o más residuos cisteína adicionales no estén presentes en el dominio VI de gpl20. 12. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende un número impar de cisternas . 13. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la composición comprende al polipéptido que comprende la primera secuencia de gpl20, y una cisteína en la primera secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con otro polipéptido. 14. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque él enlace covalente comprende un puente disulfuro. 15. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el otro polipéptido comprende una segunda secuencia de gpl20. 16. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la segunda secuencia de gpl20 sea la misma que la primera secuencia de gpl20, dichas secuencias de gpl20 forman un homodimero. 17.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la segunda secuencia de gpl20 es diferente de la primera secuencia de gpl20, dichas secuencias de gpl20 forman un heterodímero. 18. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el otro polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de gp41. 19. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque las composiciones comprenden al polipéptido que comprende la primera secuencia de gpl20, y una cisteína en la secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una porción de unión específica de célula, un fármaco, un oligonucleótido inmunoestimulador, y una proteína portadora inmunogénica. 20.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido comprende, o el polinucleó ido codifica, un polipéptido de fusión que comprende la primera secuencia de gpl20. 21.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 tiene por lo menos 99% aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios VI, V2, V3, y C4 de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, y 136. 22. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la primera secuencia de gpl20 comprende por lo menos los dominios VI, V2, V3, y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,100,102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, y 136. 23. - Un polipéptido aislado que comprende una primera secuencia de aminoácido de gpl20, caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 comprende por lo menos los dominios V2, V3 y C4 de gpl20 y: (a) la primera secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 157, 205, 218, 228, 239, 247, 331, 378, o 385; y/o (b) la primera secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, o 445, con la condición que uno o más residuos cisteína adicionales no estén presentes en el dominio VI de gpl20, según se enumeran desde la metionina N-terminal de gpl20 proveniente de la cepa HXB-2 de gpl20 de VIH y porque la primera secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio V4. 24. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23 , caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 comprende de manera adicional un dominio VI. 25. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 que carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 157, 205, 218, 228, 239, 247, 331, 378, o 385. 26. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, ó 445, con la condición que uno o más residuos cisteína adicionales no estén presentes en el dominio VI de gpl20. 27.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 comprende un número impar de cisteínas. 28.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque una cisteína en la secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con otro polipéptido . 29.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el enlace covalente comprende un puente disulfuro. 30.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el otro polipéptido comprende una segunda secuencia de gpl20. 31.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda secuencia de gpl20 es la misma que la primera secuencia de gpl20, dichas secuencias de gpl20 forman un homodímero. 32.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda secuencia de gpl20 es diferente de la primera secuencia de gpl20, dichas secuencias de gpl20 forman un heterodímero. 33.- El polipéptido de conformidad' con la reivindicación 28, caracterizado porque el otro polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de gp41. 34. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la cisteína en la secuencia de gpl20 está unida en forma covalente con un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una porción de unión específica de célula, un fármaco, un oligonucleótido inmunoestimulador, y una proteína portadora inmunogénica . 35. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porgue el polipéptido comprende un polipéptido de fusión que comprende la primera secuencia de gpl20. 36. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el polipéptido de fusión comprende una secuencia de señal heterologa. 37. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la secuencia de señal heterologa, se selecciona a partir de la secuencia de señal de la glucoproteína D del virus de herpes simplex (gD-1) o la secuencia de señal del activador de plasminógeno de tejido de humano. 38. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado porque polipéptido de fusión comprende una marca de epítope. 39.- Un polipéptido aislado que comprende la primera secuencia de aminoácido de gpl20, caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 que tiene por lo menos 99% aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios VI, V2, V3, y C4 de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 y 136. 40.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la primera secuencia de gpl20 comprende por lo menos los dominios VI, V2, V3, y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,100,102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 y 136. 41. - Un polinucleótido aislado que codifica al polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-27 y 35-40. 42. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el polinucleótido está optimizado al codón para expresión en una célula hospedera de una especie en particular. 43. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el polinucleótido codifica para una secuencia de gpl20 que tiene por lo menos 99% aproximadamente de identidad con cada uno de los dominios VI, V2, V3, y C4 de una gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 y 136. 4 . - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido de gpl20 que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135 o una sub-secuencia de las mismas, Y porque la sub-secuencia codifica por lo menos los dominios VI, V2, V3 y C4 de gpl20. 45.- Un vector caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 41. 46. - El vector de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el vector comprende un vector de expresión. 47. - El vector de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el vector comprende un vector viral . 48. - ün célula hospedera caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 45. 49. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula hospedera se selecciona a partir de una célula de mamífero y una célula bacteriana. 50. - ün método para producir un polipéptido caracterizada porque comprende una primera secuencia de aminoácido de gpl20, dicho método comprende: (a) introducir el vector de conformidad con la reivindicación 45 dentro de una célula; y (b) expresar el polipéptido. 51. - El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la célula está in vivo. 52. - El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la célula está en cultivo . 53. - El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque comprende de manera adicional recuperar el polipéptido a partir del cultivo. 5 . - Un método para producir un polipéptido que comprende la primera secuencia de aminoácido, dicho método comprende : (a) cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula hospedera comprende un vector de expresión, y la célula hospedera se cultiva bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido a partir del cultivo . 55. - Un método para inmunizar un animal con un polipéptido que comprende una primera secuencia de gpl20 que comprende administrar una composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 al animal . 56. - Un método para diagnostico que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica proveniente de un individuo con un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido de gpl20, en donde la secuencia de gpl20 comprende por lo menos los dominios V2, V3, y C4 de gpl20 y: (i) la secuencia de gpl20 carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, y 445; y/o (ii) la secuencia de gpl20 comprende uno o más residuos cisteína adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 24, 29, 34, 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196,205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, 445, 493, 495, 499-501, 503-508 y 510; según se enumera a partir de la metionina N-terminal de gpl20 proveniente de la cepa HXB-2 de gpl20 de VIH; caracterizado porque la secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio VI o una secuencia de gpl20 subtipo E que tenga una o más cisteínas adicionales en el dominio V4 ; y (b) determinar si la muestra biológica comprende o no un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido aislado. 57. - El método de diagnostico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la secuencia de gpl20 comprende de manera adicional el dominio VI. 58. - Un método de diagnóstico que comprende analizar una muestra biológica proveniente de un individuo para determinar si la muestra comprende o no un polipéptido que comprende, o un polinucleótido que codifica para, una secuencia de aminoácido de gpl20 que: (a) carece de uno o más residuos cisteína en una o más de las siguientes posiciones: 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, y 445; y/o (b) comprende uno o más residuos cisteina adicionales en una posición diferente a las siguientes posiciones: 24, 29, 34, 54, 74, 119, 126, 131, 157, 196, 205, 218, 228, 239, 247, 296, 331, 378, 385, 418, 445, 493, 495, 499-501, 503-508 y 510; según se enumeran a partir de la metionina N-terminal de gpl20 provenientes de la cepa HXB-2 de gpl20 de VIH. 59.- El método de diagnostico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la secuencia de gpl20 no es una secuencia de gpl20 subtipo G que tiene una o más cisteínas adicionales en el dominio VI o una secuencia de gpl20 subtipo E que tiene una o más cisteínas adicionales en el dominio V4. 60.- El método de diagnostico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque dicha prueba comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de gpl20 bajo condiciones apropiadas para la unión. 61. - El método de diagnostico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque dicha prueba comprende poner en contacto polinucleótidos de muestra con una molécula de ácido nucleico que se híbrida específicamente a una secuencia de nucleótido que codifica para la secuencia de gpl20 bajo condiciones adecuadas para la hibridación. 62. - El método de diagnostico de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es una de un par de iniciadores de amplificación, dicha prueba comprende poner en contacto los polinucleótidos de muestra con ambos iniciadores de amplificación bajo condiciones apropiadas para la amplificación, y determinar si se produce o no un producto de amplificación. 63. - El método de diagnostico de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es una sonda de ácido nucleico fija a una fase sólida.