JPH03232491A - Ｈｔｌｖ―１の合成エンベロープペプチド - Google Patents
Ｈｔｌｖ―１の合成エンベロープペプチドInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＨＴＬＶ−Ｉ ｇｐ２１エンベロープタンパク
質の免疫優性保存領域からの少なくともひとつのエピト
ープをコードする合成遺伝子、並びにこの合成遺伝子を
ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質のｇｐ４６および
ｇｐ２１領域からのひとつまたはそれ以上のエピトープ
をコードする他のヌクレオチド配列と一緒に含有するハ
イブリッド遺伝子に関する。また、相当するポリペプチ
ド、前記遺伝子を含有する組換えベクター、かかるベク
ターを含有する単細胞宿主生物、該ペプチドを生産する
方法、および本発明のポリペプチドを使用するＨＴＬＶ
−Ｉに対する抗体の検出法も包含される。
質の免疫優性保存領域からの少なくともひとつのエピト
ープをコードする合成遺伝子、並びにこの合成遺伝子を
ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質のｇｐ４６および
ｇｐ２１領域からのひとつまたはそれ以上のエピトープ
をコードする他のヌクレオチド配列と一緒に含有するハ
イブリッド遺伝子に関する。また、相当するポリペプチ
ド、前記遺伝子を含有する組換えベクター、かかるベク
ターを含有する単細胞宿主生物、該ペプチドを生産する
方法、および本発明のポリペプチドを使用するＨＴＬＶ
−Ｉに対する抗体の検出法も包含される。
ヒトＴ細胞白血病つィルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ ）は、
日本のいくつかの地域、カリブ海、アフリカ、アメリカ
合衆国南東部、および南アメリカにおける地域流行性の
Ｃ型レトロウィルスである。日本では９００万人の献血
者のうち１％以上が血液スクリニング以前にウィルスに
感染していると考えられており、そして沖縄の人口の３
５％もが、感染している可能性がある（Ｓｗｉｎｂａｎ
ｋｓ、 Ｎａｔｕｒｅ ３２３゜３８４ ［１９８６］
）。ＨＴＬＶ−Ｉは、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴいの病因
で、Ｔ４ヘルパー細胞を主に冒す攻撃的白血病である。
日本のいくつかの地域、カリブ海、アフリカ、アメリカ
合衆国南東部、および南アメリカにおける地域流行性の
Ｃ型レトロウィルスである。日本では９００万人の献血
者のうち１％以上が血液スクリニング以前にウィルスに
感染していると考えられており、そして沖縄の人口の３
５％もが、感染している可能性がある（Ｓｗｉｎｂａｎ
ｋｓ、 Ｎａｔｕｒｅ ３２３゜３８４ ［１９８６］
）。ＨＴＬＶ−Ｉは、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴいの病因
で、Ｔ４ヘルパー細胞を主に冒す攻撃的白血病である。
ＡＴＬ患者は主要なウィルスタンパク質に対する抗体を
産生じ、そしてプロウィルスＤＮＡか白血病細胞のＤＮ
Ａに組み込まれて見出されつる。
産生じ、そしてプロウィルスＤＮＡか白血病細胞のＤＮ
Ａに組み込まれて見出されつる。
ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルスゲノムの数多くが分子クロニ
ングされており、そしてプロウィルスＤＮＡのひとつの
全ヌクレオチド配列が決定されている（Ｓｅｉｋｉら、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 ＬＩＳＡ、 ８０． ３６１８−３６２２ ［
１９８３］）。ＨＴＬＶ−Ｉ ｉ！、熱帯性痙性不全対
麻痺、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミニロバシーおよび多発性硬化
症を包含する数多くの神経障害と関連している。また、
ＨＴＬＶ−ＩはＢ細胞慢性リンパ性白血病の発病に間接
的役割を果たしている可能性がある。
ングされており、そしてプロウィルスＤＮＡのひとつの
全ヌクレオチド配列が決定されている（Ｓｅｉｋｉら、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 ＬＩＳＡ、 ８０． ３６１８−３６２２ ［
１９８３］）。ＨＴＬＶ−Ｉ ｉ！、熱帯性痙性不全対
麻痺、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミニロバシーおよび多発性硬化
症を包含する数多くの神経障害と関連している。また、
ＨＴＬＶ−ＩはＢ細胞慢性リンパ性白血病の発病に間接
的役割を果たしている可能性がある。
ＨＴＬＶ−Ｉの伝染様式はＡＩＤＳの病因であるヒト免
疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１’）のそれと類似する。Ｈ
ＴＬＶ−Ｉの伝染は性的接触、抗体陽性血液および血液
成分の輸血を通して、および麻薬乱用者の間で汚染され
た針を共用することにより起こりつる。このウィルスは
胎盤を通して、または母乳中の感染リンパ球の移行を通
して母から子へ移行しうる。
疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１’）のそれと類似する。Ｈ
ＴＬＶ−Ｉの伝染は性的接触、抗体陽性血液および血液
成分の輸血を通して、および麻薬乱用者の間で汚染され
た針を共用することにより起こりつる。このウィルスは
胎盤を通して、または母乳中の感染リンパ球の移行を通
して母から子へ移行しうる。
ｔ（（Ｖ−１およびＨＴＬＶ−Ｉの伝染様式における明
白な類似性は旧■−１感染のおそれのある人々はまたＨ
ＴＬＶ−Ｉ感染のおそれもあることを示していよう。
白な類似性は旧■−１感染のおそれのある人々はまたＨ
ＴＬＶ−Ｉ感染のおそれもあることを示していよう。
ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を有するエイズ患者に関する
多くの報告がある。その人々の中で）ＩＴＬＶ−Ｉ感染
の罹患率は、まだかなり低い（１％以下）が、このウィ
ルスは静脈注射を用いる麻薬使用者の間では表面化して
いる。さらに、この集団においてはヒトＴ細胞白血病つ
ィルス■型（ＨＴＬＶ−ＩＩ ）血清陽性の発生率か高
いことが報告されている。
多くの報告がある。その人々の中で）ＩＴＬＶ−Ｉ感染
の罹患率は、まだかなり低い（１％以下）が、このウィ
ルスは静脈注射を用いる麻薬使用者の間では表面化して
いる。さらに、この集団においてはヒトＴ細胞白血病つ
ィルス■型（ＨＴＬＶ−ＩＩ ）血清陽性の発生率か高
いことが報告されている。
ＨＴＬＶ−Ｉ［はＨＴＬＶ−Ｉと密接に関連しており（
交差反応抗原）、ヘアリーセル（ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ
）白血病患者から最初に単離された。アメリカ合衆国の
献血者中のＨＴＬＶ−Ｉ感染の血清罹患率に関するＷｉ
ｌｌｉａｍｓおよび共同研究者たち（１９８８）による
研究は、アメリカ合衆国の地理的に異なる８地域におけ
る無作為献血者の０．０２５％がＨＴＬＶ−Ｉ感染の血
清学的証拠を示したことを明らかにしている。ＨＴＬＶ
−Ｉ感染のこの罹患率に基づいて、研究者らは、毎年約
２、８００人の受血者の感染を予測している。
交差反応抗原）、ヘアリーセル（ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ
）白血病患者から最初に単離された。アメリカ合衆国の
献血者中のＨＴＬＶ−Ｉ感染の血清罹患率に関するＷｉ
ｌｌｉａｍｓおよび共同研究者たち（１９８８）による
研究は、アメリカ合衆国の地理的に異なる８地域におけ
る無作為献血者の０．０２５％がＨＴＬＶ−Ｉ感染の血
清学的証拠を示したことを明らかにしている。ＨＴＬＶ
−Ｉ感染のこの罹患率に基づいて、研究者らは、毎年約
２、８００人の受血者の感染を予測している。
アメリカ赤十字は、国の血液供給を防御し、そしてＨＴ
ＬＶ−Ｉ感染のまん延をくい止めるために１９８８年１
２月にＨＴＬＶ−Ｉに関し献血のスクリーニングを開始
した。この抗体スクリーニング検査は、ヒトＴ細胞系中
で増殖し、破壊されたウィルスの半精製物をイムノアッ
セイ法における試験抗原としてとり込んでいる。ＨＩＶ
−１スクリーニング検査のひとつに高率の偽陽性かある
ことにより証明されるように、ウィルス溶解物アッセイ
には固有の問題かある。
ＬＶ−Ｉ感染のまん延をくい止めるために１９８８年１
２月にＨＴＬＶ−Ｉに関し献血のスクリーニングを開始
した。この抗体スクリーニング検査は、ヒトＴ細胞系中
で増殖し、破壊されたウィルスの半精製物をイムノアッ
セイ法における試験抗原としてとり込んでいる。ＨＩＶ
−１スクリーニング検査のひとつに高率の偽陽性かある
ことにより証明されるように、ウィルス溶解物アッセイ
には固有の問題かある。
試験抗原として組換えタンパク質を使用することに関し
、ＨＴＬＶ−Ｉ抗体スクリーニングアッセイに組み込む
ためのＨＴＬＶ−Ｉ抗原を調製するのに組換えＤＮＡ技
法を利用することが望ましいゆえに、現在利用されてい
るウィルス溶解物検査より感度および特異性か高いイム
ノアッセイの設計に至るべきである。
、ＨＴＬＶ−Ｉ抗体スクリーニングアッセイに組み込む
ためのＨＴＬＶ−Ｉ抗原を調製するのに組換えＤＮＡ技
法を利用することが望ましいゆえに、現在利用されてい
るウィルス溶解物検査より感度および特異性か高いイム
ノアッセイの設計に至るべきである。
したがって本発明は、下記のことから成る、すなわち、
−ＨＴＬＶ−Ｉ エンベロープタンパク質（ＨＴＬＶ−
Ｉ ｅｎｖ）のｇｐ２１領域の免疫優性保存領域からの
少なくともひとつのエピトープを含有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列。
Ｉ ｅｎｖ）のｇｐ２１領域の免疫優性保存領域からの
少なくともひとつのエピトープを含有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列。
−ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ４６およびｌ？ｐ２１か
らの少なくともひとつのエピトープを含有するポリペプ
チドをコードする第２のヌクレオチド配列に融合された
、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ２１の免疫優性保存領域
からの少なくともひとつのニブトープを含有するポリペ
プチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含んでな
るハイブリッド遺伝子。
らの少なくともひとつのエピトープを含有するポリペプ
チドをコードする第２のヌクレオチド配列に融合された
、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ２１の免疫優性保存領域
からの少なくともひとつのニブトープを含有するポリペ
プチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含んでな
るハイブリッド遺伝子。
一本発明のヌクレオチド配列に相当するポリペプチド。
一本発明のヌクレオチド配列を含有する組換えベクター
。
。
一本発明のヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクタ
ーを含有する単細胞宿主生物。
ーを含有する単細胞宿主生物。
−相当するハイブリッドタンパク質を産生ずるに適切な
条件下で組換えベクターを含有する単細胞宿主を利用す
ることにより本発明のポリペプチドを生産する方法。
条件下で組換えベクターを含有する単細胞宿主を利用す
ることにより本発明のポリペプチドを生産する方法。
一抗原として本発明のポリペプチドを使用することを含
んでなるＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質に対する
抗体の検出法。
んでなるＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質に対する
抗体の検出法。
図面の説明
第１図： ＥＮＶ９３合成遺伝子のヌクレオチド配列
を示す。上のストランドはコード配列を示す。このアミ
ノ酸配列は［）２１膜貫通領域内の［（ＴＬＶ−１エン
ベロープポリペブチドのアミノ酸３４２−４３４に相当
する。高レベルで発現されるＥ、コリ遺伝子において優
先的に使用されるコドン中に転位された真正プロウィル
スＤＮＡ配列。Ｂａｍ旧付着端は、ｐＤＳ５６／ＲＢＳ
ＩＩ発現ベクターの唯一のＢａｍＨ１部位への挿入を
容易にするために構築物の５゛末端に組み込んだ。
を示す。上のストランドはコード配列を示す。このアミ
ノ酸配列は［）２１膜貫通領域内の［（ＴＬＶ−１エン
ベロープポリペブチドのアミノ酸３４２−４３４に相当
する。高レベルで発現されるＥ、コリ遺伝子において優
先的に使用されるコドン中に転位された真正プロウィル
スＤＮＡ配列。Ｂａｍ旧付着端は、ｐＤＳ５６／ＲＢＳ
ＩＩ発現ベクターの唯一のＢａｍＨ１部位への挿入を
容易にするために構築物の５゛末端に組み込んだ。
矢じりは最終産物に到達するために４ブロツクにアニー
リングされ連結されたオリゴヌクレオチド１−１４の輪
郭を表す。
リングされ連結されたオリゴヌクレオチド１−１４の輪
郭を表す。
第２図＝１４の重複するオリゴヌクレオチドフラグメン
トの段階的連結により構築されたＥＮＶ９３合成遺伝子
の組み立てを示す。遺伝子は４ブロツクに分割された。
トの段階的連結により構築されたＥＮＶ９３合成遺伝子
の組み立てを示す。遺伝子は４ブロツクに分割された。
すなわちブロックｌ；オリゴ１．２．８．９；ブロック
２：オリゴ３．４．１０、ｌｌ；ブロック３：オリゴ５
．６．１２．１３；ブロック４：オリゴ７．１４゜５′
末端フラグメントｌおよび１４を除く全てのオリゴヌク
レオチドの５゛末端部はリン酸化した。初めには、各ブ
ロックを含有するオリゴヌクレオチドをアニールおよび
連結した。次にブロックを相互にアニーリングおよび連
結させてＥＮＶ９３最終産物を生成させた。矢じりは、
ブロックを形成する１４オリゴヌクレオチドの境界を示
す。
２：オリゴ３．４．１０、ｌｌ；ブロック３：オリゴ５
．６．１２．１３；ブロック４：オリゴ７．１４゜５′
末端フラグメントｌおよび１４を除く全てのオリゴヌク
レオチドの５゛末端部はリン酸化した。初めには、各ブ
ロックを含有するオリゴヌクレオチドをアニールおよび
連結した。次にブロックを相互にアニーリングおよび連
結させてＥＮＶ９３最終産物を生成させた。矢じりは、
ブロックを形成する１４オリゴヌクレオチドの境界を示
す。
二本鎖の５′末端（オリゴ１および１４）は、所望のク
ローニングベクターへの挿入を容易にするためにリン酸
化した。
ローニングベクターへの挿入を容易にするためにリン酸
化した。
第３図： ｐＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩのＢａｍＨ１部
位へのＥＮＶ９３構築物の挿入を示す。ベクターｐＤＳ
５６／ＲＢＳ［（Ｓｔｕｅｂｅｒら、ＥＭＢＯＪ、 ３
．３１４３−３１４８ ［１９８４］）かＥ、コリ中で
外来遺伝子を発現させるために操作される。ポリリンカ
ークローニング領域は調節可能なプロモーター／オペレ
ーターエレメントＰ１０２ （コリファージＴ５プロモ
ーターおよびＥ、コリ ｌａＣオペレーターの融合物）
およびラムダｔｏターミネータ−によりはさまれている
。２つのＥ、コリ指示遺伝子が存在する、すなわち、そ
れ自身のプロモーターおよびアンピシリン耐性を付与す
るリポソーム結合部位を有するｂｌａ（ベーターラクタ
マーゼ）、およびその真正のリポソーム結合部位を有す
るｃａｔ（タロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）である。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドの複製
起点中へのｃａｔの読過し転写を阻止するために、ｃａ
ｔ遺伝子の下流にｒｒｎＢオペロンのｔ１ターミネータ
−が続いている。ポリリンカ一部位のすぐ上流に、合成
リポソーム結合部位ＲＢＳ ＩＩといっしょにＡＴＧ開
始コドンが備えられている。ｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉｔ
発現系は、外来ＤＮＡの３個の読み取り枠金てが発現さ
れるのを可能にするＡＴＧコドンに隣接して、塩基の数
で相異する３種のベクターから成っている。これらのベ
クターは、適合するプラスミドｐＤＭＩ−１を収容する
Ｅ、コリ細胞中においてのみ安定して維持され得る。ｐ
ＤＭＩ−１はｌａｃリプレッサーを過剰生産し、そして
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を
通してカナマイシンへの耐性を付与する。
位へのＥＮＶ９３構築物の挿入を示す。ベクターｐＤＳ
５６／ＲＢＳ［（Ｓｔｕｅｂｅｒら、ＥＭＢＯＪ、 ３
．３１４３−３１４８ ［１９８４］）かＥ、コリ中で
外来遺伝子を発現させるために操作される。ポリリンカ
ークローニング領域は調節可能なプロモーター／オペレ
ーターエレメントＰ１０２ （コリファージＴ５プロモ
ーターおよびＥ、コリ ｌａＣオペレーターの融合物）
およびラムダｔｏターミネータ−によりはさまれている
。２つのＥ、コリ指示遺伝子が存在する、すなわち、そ
れ自身のプロモーターおよびアンピシリン耐性を付与す
るリポソーム結合部位を有するｂｌａ（ベーターラクタ
マーゼ）、およびその真正のリポソーム結合部位を有す
るｃａｔ（タロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）である。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドの複製
起点中へのｃａｔの読過し転写を阻止するために、ｃａ
ｔ遺伝子の下流にｒｒｎＢオペロンのｔ１ターミネータ
−が続いている。ポリリンカ一部位のすぐ上流に、合成
リポソーム結合部位ＲＢＳ ＩＩといっしょにＡＴＧ開
始コドンが備えられている。ｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉｔ
発現系は、外来ＤＮＡの３個の読み取り枠金てが発現さ
れるのを可能にするＡＴＧコドンに隣接して、塩基の数
で相異する３種のベクターから成っている。これらのベ
クターは、適合するプラスミドｐＤＭＩ−１を収容する
Ｅ、コリ細胞中においてのみ安定して維持され得る。ｐ
ＤＭＩ−１はｌａｃリプレッサーを過剰生産し、そして
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を
通してカナマイシンへの耐性を付与する。
第４図： ｐＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩベクターから発
現された組換えＥＮＶ９３タンパク質のヌクレオチドお
よび推定アミノ酸配列を示す。翻訳されたタンパク質は
１０６アミノ酸の長さである。アミノおよびカルボキシ
末端で下線したアミノ酸はベクター配列に由来する。タ
ンパク質の残りは、）ＩＴＬＶ−ＩウィルスのＩｇｐ２
１膜貫通エンベロープタンパク質のアミノ酸３４２−４
３４に相当する９３アミノ酸である。
現された組換えＥＮＶ９３タンパク質のヌクレオチドお
よび推定アミノ酸配列を示す。翻訳されたタンパク質は
１０６アミノ酸の長さである。アミノおよびカルボキシ
末端で下線したアミノ酸はベクター配列に由来する。タ
ンパク質の残りは、）ＩＴＬＶ−ＩウィルスのＩｇｐ２
１膜貫通エンベロープタンパク質のアミノ酸３４２−４
３４に相当する９３アミノ酸である。
第５図：Ｅ、コリ細胞Ｗ３１１０、ＪＥ５５０５、およ
びＪＥ５５０６中におけるＨＴＬＶ−Ｉ ＥＮＶ９３タ
ンパク質発現を示す。
びＪＥ５５０６中におけるＨＴＬＶ−Ｉ ＥＮＶ９３タ
ンパク質発現を示す。
Ｏ時間目、誘導２時間後、誘導４時間後および誘導なし
で４時間の細菌培養物由来の全細胞溶解物を１２％ポリ
アクリルアミド／ ＳＤＳて電気泳動しクーマーシーブ
ルーＲ２５０で染色した。矢じりはＩＰＴＧ誘導試料中
にのみ存在する約１２ＫｄのＥＮＶ９３タンパク質の位
置を示す。
で４時間の細菌培養物由来の全細胞溶解物を１２％ポリ
アクリルアミド／ ＳＤＳて電気泳動しクーマーシーブ
ルーＲ２５０で染色した。矢じりはＩＰＴＧ誘導試料中
にのみ存在する約１２ＫｄのＥＮＶ９３タンパク質の位
置を示す。
第６図： ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルスゲノムの構造を
概要約に示す。ゲノムの完全なヌクレオチド配列は上記
５ｅｉｋｉらにより決定された。エンベロープコード領
域を拡大して、ｇｐ４６およびｇｐ２１ドメイン内の制
限部位のヌクレオチドおよびアミノ酸位置を示す。ＥＮ
Ｖ９３合成遺伝子構築物の地図上の位置を示す。示した
制限部位は、コード領域のほぼ全体を包含するエンベロ
ープフラグメント■、ＩＡ。
概要約に示す。ゲノムの完全なヌクレオチド配列は上記
５ｅｉｋｉらにより決定された。エンベロープコード領
域を拡大して、ｇｐ４６およびｇｐ２１ドメイン内の制
限部位のヌクレオチドおよびアミノ酸位置を示す。ＥＮ
Ｖ９３合成遺伝子構築物の地図上の位置を示す。示した
制限部位は、コード領域のほぼ全体を包含するエンベロ
ープフラグメント■、ＩＡ。
ＩＢ’、■、Ｉ、およびＩＩ＋Ｉを生成させるのに使用
した。各フラグメント中のアミノ酸の数はフラグメント
のすぐ上に示す。これらのＤＮＡ断片は、コードされた
エピトープをＥＮＶ９３融合タンパク質として高レベル
で発現させるためにｐＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩベクター
中のＥＮＶ９３の下流にクローン化した。
した。各フラグメント中のアミノ酸の数はフラグメント
のすぐ上に示す。これらのＤＮＡ断片は、コードされた
エピトープをＥＮＶ９３融合タンパク質として高レベル
で発現させるためにｐＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩベクター
中のＥＮＶ９３の下流にクローン化した。
第７図： ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ発現タンパク質
を示す。エンベロープコード配列の種々の領域をｐＤＳ
５６／ＲＢＳ ＩＩベクター中のＥＮＶ９３合成遺伝子
の下流に連結した。組換え融合タンパク質がＥ、コリ中
で発現され、そしてＥｔＡ中で最大の反応性を有するこ
れらのタンパク質が示される。
を示す。エンベロープコード配列の種々の領域をｐＤＳ
５６／ＲＢＳ ＩＩベクター中のＥＮＶ９３合成遺伝子
の下流に連結した。組換え融合タンパク質がＥ、コリ中
で発現され、そしてＥｔＡ中で最大の反応性を有するこ
れらのタンパク質が示される。
第８図二発現されたＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ
Ｉ Ｂ’組換エタンバク質のヌクレオチドおよび推定ア
ミノ酸配列を示す。このタンパク質は１５８アミノ酸の
長さである。下線を付した残基は、構築物を生成させる
のに使用したベクター配列またはリンカ−配列から生じ
た。
Ｉ Ｂ’組換エタンバク質のヌクレオチドおよび推定ア
ミノ酸配列を示す。このタンパク質は１５８アミノ酸の
長さである。下線を付した残基は、構築物を生成させる
のに使用したベクター配列またはリンカ−配列から生じ
た。
第９図： ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ融合タンパ
ク質ノヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。こ
のポリペプチドは２４５アミノ酸である。下線したアミ
ノ酸残基は、ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ配列中には表わ
れない。これらの関連のない配列はベクター特異的であ
るかまたはこのＤＮＡ構築物を生成させるのに使用され
た合成リンカ−によりコードされたものである。
ク質ノヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。こ
のポリペプチドは２４５アミノ酸である。下線したアミ
ノ酸残基は、ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ配列中には表わ
れない。これらの関連のない配列はベクター特異的であ
るかまたはこのＤＮＡ構築物を生成させるのに使用され
た合成リンカ−によりコードされたものである。
第１Ｏ図： ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［＋ Ｉ
組換えエンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推
定アミノ酸配列を示す。このポリペプチドは３４４アミ
ノ酸の長さである。下線した非特異的残基はベクター配
列によりコードされる。
組換えエンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推
定アミノ酸配列を示す。このポリペプチドは３４４アミ
ノ酸の長さである。下線した非特異的残基はベクター配
列によりコードされる。
第１１図： ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ−Ｉ［組換えタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す
。二のタンパク質は２１７アミノ酸の長さである。下線
した基は、ベクター配列によるかまたは構築物を生成さ
せるのに使用された合成リンカ−によりコードされる。
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す
。二のタンパク質は２１７アミノ酸の長さである。下線
した基は、ベクター配列によるかまたは構築物を生成さ
せるのに使用された合成リンカ−によりコードされる。
第１２図： ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ−Ｉ［Ｉ融合タ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す
。このポリペプチドは３１５アミノ酸の長さである。下
線した非特異的残基はベクターまたは合成リンカ−配列
によりコードされる。
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す
。このポリペプチドは３１５アミノ酸の長さである。下
線した非特異的残基はベクターまたは合成リンカ−配列
によりコードされる。
第１３図： ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ−ＩＩＩＡ組換
えエンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推定ア
ミノ酸配列を示す。このタンパク質は２４９アミノ酸の
長さである。下線した残基はベクターまたは合成リンカ
−配列によるものである。
えエンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推定ア
ミノ酸配列を示す。このタンパク質は２４９アミノ酸の
長さである。下線した残基はベクターまたは合成リンカ
−配列によるものである。
第１４図：種々のＨＴＬＶ−Ｉ組換えタンパク質の免疫
反応性ヲ示ス。ｏＤ、、、（１ヲＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ
−Ｉ −Ｉ、ＥＮＶ９３／［（ＴＬＶ−１−■オヨＵ
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［＋ Ｉ Ｇｍツいて
示す。ＨＴＬＶ−Ｉ陽性標品はＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ。
反応性ヲ示ス。ｏＤ、、、（１ヲＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ
−Ｉ −Ｉ、ＥＮＶ９３／［（ＴＬＶ−１−■オヨＵ
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［＋ Ｉ Ｇｍツいて
示す。ＨＴＬＶ−Ｉ陽性標品はＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ。
Ｉｎｃ、 （ＢＢＩ）から得、そして陰性標品はＷｅｓ
ｔｅｒｎＳｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ
、 Ｉｎｃ、（ＷＳＰ）から購入した。
ｔｅｒｎＳｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ
、 Ｉｎｃ、（ＷＳＰ）から購入した。
標品番号６５９５および９１００は、反応性の高い陽性
対照である。
対照である。
本発明の方法は、論理的順序では下記を包含する多数の
工程を必要とする。すなわち（１）本発明の遺伝子構築
物をコードする遺伝子の調製、（２）遺伝子構築物を含
有する組換えベクターを生成させるのに適切なりローユ
ングビークル中へのこれら遺伝子の挿入、（３）適合す
る宿主生物への組換えクローニングビークルの移転、（
４）挿入された遺伝子配列を発現できる、かかる改変さ
れた宿主の選択および増殖、（５）遺伝子産物の同定お
よび精製、および（６） ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗原を
検出するための遺伝子産物の使用である。
工程を必要とする。すなわち（１）本発明の遺伝子構築
物をコードする遺伝子の調製、（２）遺伝子構築物を含
有する組換えベクターを生成させるのに適切なりローユ
ングビークル中へのこれら遺伝子の挿入、（３）適合す
る宿主生物への組換えクローニングビークルの移転、（
４）挿入された遺伝子配列を発現できる、かかる改変さ
れた宿主の選択および増殖、（５）遺伝子産物の同定お
よび精製、および（６） ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗原を
検出するための遺伝子産物の使用である。
１、遺伝子の調製
本発明の第１番目の遺伝子構築物は、ＨＴＬＶ−Ｉｅｎ
ｖのｇｐ２１領域の免疫優性保存領域からの少なくとも
ひとつのエピトープを含有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を構成する。ＨＴＬ Ｖ −ニゲツ
ムの全ヌクレオチド配列は決定されている（上記５ｅｉ
ｋｉら参照）。免疫優性保存領域からの少なくともひと
つのエピトープをコードするこの配列の任意の部分が本
発明の遺伝子構築物に好適であろう。しかしながら、本
発明の好ましい実施態様を構築するのに使用された、Ｅ
ｎｖ（９３）で示されるヌクレオチドがＨＴＬＶ−Ｉエ
ンベロープのアミノ酸３４２−４３４に相当する（Ｓｅ
ｉｋｉに従い番号を付けた）のか好ましい。このヌクレ
オチド配列はＤＮＡシンセサイザーを使用する化学合成
のような当業上よく知られた方法により構築できる（Ｃ
ｅｒｔａら、ＥＭＢＯＪ、 ５．３０５１−３０５６
［１９８６１）。また適切なヌクレオチド配列はＹｏｓ
ｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
ｖのｇｐ２１領域の免疫優性保存領域からの少なくとも
ひとつのエピトープを含有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を構成する。ＨＴＬ Ｖ −ニゲツ
ムの全ヌクレオチド配列は決定されている（上記５ｅｉ
ｋｉら参照）。免疫優性保存領域からの少なくともひと
つのエピトープをコードするこの配列の任意の部分が本
発明の遺伝子構築物に好適であろう。しかしながら、本
発明の好ましい実施態様を構築するのに使用された、Ｅ
ｎｖ（９３）で示されるヌクレオチドがＨＴＬＶ−Ｉエ
ンベロープのアミノ酸３４２−４３４に相当する（Ｓｅ
ｉｋｉに従い番号を付けた）のか好ましい。このヌクレ
オチド配列はＤＮＡシンセサイザーを使用する化学合成
のような当業上よく知られた方法により構築できる（Ｃ
ｅｒｔａら、ＥＭＢＯＪ、 ５．３０５１−３０５６
［１９８６１）。また適切なヌクレオチド配列はＹｏｓ
ｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７９．２０３１−２０３５ ［１
９８２］およびＰｏ１ｅｓｚら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７７、７４１５
−７４１９［１９８０］に記載されるＨＴＬＶ−Ｉピリ
オンによりウィルス形質転換されたヒトＴ細胞系からも
得られうる。次にＤＮＡフラグメントが当業上知られた
方法により単離され、ＣＤＮＡライブラリーが構築され
そしてｃＤＮＡライブラリーを探査することにより所望
のエンベロープ遺伝子フラグメントを得ることができる
。 ）ＩＴＬＶ−ＩエンベロープフラグメントはまたＭ
ａｎｚａｒｉら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＩＪＳＡ、 ８０゜１５７４−１５７８
［１９８３］およびヨーロッパ特許出願公開番号１８１
１０７に記載される、Ｉ（ＴＬＶ−ＩのＥｎｖ、 ｐＸ
。
９８２］およびＰｏ１ｅｓｚら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７７、７４１５
−７４１９［１９８０］に記載されるＨＴＬＶ−Ｉピリ
オンによりウィルス形質転換されたヒトＴ細胞系からも
得られうる。次にＤＮＡフラグメントが当業上知られた
方法により単離され、ＣＤＮＡライブラリーが構築され
そしてｃＤＮＡライブラリーを探査することにより所望
のエンベロープ遺伝子フラグメントを得ることができる
。 ）ＩＴＬＶ−ＩエンベロープフラグメントはまたＭ
ａｎｚａｒｉら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＩＪＳＡ、 ８０゜１５７４−１５７８
［１９８３］およびヨーロッパ特許出願公開番号１８１
１０７に記載される、Ｉ（ＴＬＶ−ＩのＥｎｖ、 ｐＸ
。
およびＬＴＲを含有するｄｃＲＸｌで示されるプラスミ
ドのようなプラスミドからも得ることかできる。
ドのようなプラスミドからも得ることかできる。
本発明の好ましい実施態様においては、）ＩＴＬＶ−■
エンベロープのアミノ酸３４２−４３４に相当するヌク
レオチド配列は化学的合成法により作られた。
エンベロープのアミノ酸３４２−４３４に相当するヌク
レオチド配列は化学的合成法により作られた。
合成を容易にするために、遺伝子配列をＤＮＡシンセサ
イザーで構築されたオリゴヌクレオチドフラグメントに
小分けする。次に一重鎖ＤＮＡフラグメントをポリアク
リルアミドゲル電気泳動の後ゲルから単離した。続いて
ヌクレオチド配列を段階的連結により組み立ててＥｎｖ
（９３）で示される遺伝子構築物を生成させた。
イザーで構築されたオリゴヌクレオチドフラグメントに
小分けする。次に一重鎖ＤＮＡフラグメントをポリアク
リルアミドゲル電気泳動の後ゲルから単離した。続いて
ヌクレオチド配列を段階的連結により組み立ててＥｎｖ
（９３）で示される遺伝子構築物を生成させた。
ＡＴＴｌｆｆ ＡＧＡ ＧＧＡ Ｔｆｆｌαｎ ＡＡＡ
ＴＣｒ Ｃ’１℃ｍ ＣＡＣＧＡＡ ＧＴＡ ＧＡＣ
ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＴＣＡＧＣＣＡＩ：ｉｃ”ｚへ〇Ｔ
ａＵ ＧＣＴ Ａ’！’ＣＧ’ｌ”ＩＰ ＡＭ ＡＩ’
ＬＣＣＪＩＩＣＩＩＩＡＧ ＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡ
ＡＴＣＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＣＧＣＴ ＧＣＡ ＣＡ
Ｇ ＡＡＣＣｏ’！’ ＣＯＣαπ０℃ＧＡＣ＋？！０
０ＡＴ Ｔ！’ＣＴＧＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＣＧＯ
Ｔ ＣＴＣＴ＆ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣＣＡＯ
ＣＡＡ ＣＡＧ ＴＧＣＣＧＴ ＴＴＣＣＣＧ
ＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＡＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＡαｎ
ＡＴＣＣＴ！１７ ＣＡＡ ＧＡＡ Ｑ７Ｔ ＣＣＧ
ＣＣＡ ＣＴＣＧＩＡ ＡＡＣαＸ： ＧＴＡ ＣＴ
ＣＡＣＣＣ＆ ＴＧＧ ＧＧＴＣＴＯＡＡＣＴＯＧ Ｇ
ＡＣＣＴＣＧＯＡ ＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ
ＣＣＡ ＡＧＯＴＴＡ ＡＴＴ ＡＧＣＴＧＡＥＮＶ（
９３）遺伝子構築物の有用性は、それを単独で、または
融合タンパク質としてＩＩＴＬＶ−Ｉの他のエピトープ
の高レベル発現のための便利なビークルとして使用でき
ることである。ＥＮＶ（９３）をビークルとして使用す
る場合、このものはＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク
質のｌｉ；ｐ４６およびｇｐ２ｉ領域からのひとつまた
はそれ以上のエピトープをコードするヌクレオチド配列
に融合されたＥｎｖ（９３）を含有するハイブリッド遺
伝子の一部分として使用される。例えば、本発明の好ま
しい実施態様においては、ＥＮＶ（９３）は第６および
７図に示されるｇｐ４６およびＩｇｐ２１領域内に該当
する種々のサブ配列に融合される。また本発明は、ＨＴ
ＬＶ−Ｉ ｅｎｖの下記の部分に融合されたＥＮＶ（９
３）からなるこれらハイブリッド遺伝子にも関する： ヌクレオチド６０９９−６４９６ （Ｉ ）ヌクレオチ
ド５７７８−６０９９ （、Ｉ［）ヌクレオチド５１７
９−５７７８ （ＩＩ［）ヌクレオチド５２５４−５６
７３ （ＩＩＩＡ）ヌクレオチド５７７８−６４９６
（ＩＩ ＋Ｉ ’）ヌクレオチド５６７３−５７７８
（ＩＢ’ ）生成するハイブリッド遺伝子（推定アミノ
酸配列は下に記載）は次のとおりである。
ＴＣｒ Ｃ’１℃ｍ ＣＡＣＧＡＡ ＧＴＡ ＧＡＣ
ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＴＣＡＧＣＣＡＩ：ｉｃ”ｚへ〇Ｔ
ａＵ ＧＣＴ Ａ’！’ＣＧ’ｌ”ＩＰ ＡＭ ＡＩ’
ＬＣＣＪＩＩＣＩＩＩＡＧ ＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡ
ＡＴＣＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＣＧＣＴ ＧＣＡ ＣＡ
Ｇ ＡＡＣＣｏ’！’ ＣＯＣαπ０℃ＧＡＣ＋？！０
０ＡＴ Ｔ！’ＣＴＧＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＣＧＯ
Ｔ ＣＴＣＴ＆ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣＣＡＯ
ＣＡＡ ＣＡＧ ＴＧＣＣＧＴ ＴＴＣＣＣＧ
ＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＡＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＡαｎ
ＡＴＣＣＴ！１７ ＣＡＡ ＧＡＡ Ｑ７Ｔ ＣＣＧ
ＣＣＡ ＣＴＣＧＩＡ ＡＡＣαＸ： ＧＴＡ ＣＴ
ＣＡＣＣＣ＆ ＴＧＧ ＧＧＴＣＴＯＡＡＣＴＯＧ Ｇ
ＡＣＣＴＣＧＯＡ ＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ
ＣＣＡ ＡＧＯＴＴＡ ＡＴＴ ＡＧＣＴＧＡＥＮＶ（
９３）遺伝子構築物の有用性は、それを単独で、または
融合タンパク質としてＩＩＴＬＶ−Ｉの他のエピトープ
の高レベル発現のための便利なビークルとして使用でき
ることである。ＥＮＶ（９３）をビークルとして使用す
る場合、このものはＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク
質のｌｉ；ｐ４６およびｇｐ２ｉ領域からのひとつまた
はそれ以上のエピトープをコードするヌクレオチド配列
に融合されたＥｎｖ（９３）を含有するハイブリッド遺
伝子の一部分として使用される。例えば、本発明の好ま
しい実施態様においては、ＥＮＶ（９３）は第６および
７図に示されるｇｐ４６およびＩｇｐ２１領域内に該当
する種々のサブ配列に融合される。また本発明は、ＨＴ
ＬＶ−Ｉ ｅｎｖの下記の部分に融合されたＥＮＶ（９
３）からなるこれらハイブリッド遺伝子にも関する： ヌクレオチド６０９９−６４９６ （Ｉ ）ヌクレオチ
ド５７７８−６０９９ （、Ｉ［）ヌクレオチド５１７
９−５７７８ （ＩＩ［）ヌクレオチド５２５４−５６
７３ （ＩＩＩＡ）ヌクレオチド５７７８−６４９６
（ＩＩ ＋Ｉ ’）ヌクレオチド５６７３−５７７８
（ＩＢ’ ）生成するハイブリッド遺伝子（推定アミノ
酸配列は下に記載）は次のとおりである。
ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ ：第９図に記載
ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｘ ：第１１図に記
載ＥＮＶ（９３）／）ＩＴＬＶ−Ｉ −ｎ ＋ Ｉ ：
第１０図に記載ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−１−Ｉ［：
第１２図に記載ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ−ＩＩＩ
Ａ・第１３図に記載ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ −
Ｉ［［Ｂ’ ：第８図に記載２、ポリペプチドの調製 本発明はまた、前記遺伝子構築物に相当するポリペプチ
ドをも包含する。これらポリペプチドは固相または液相
合成ならびに組換え生産のような当業者によく知られた
合成法により作られうる。
ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｘ ：第１１図に記
載ＥＮＶ（９３）／）ＩＴＬＶ−Ｉ −ｎ ＋ Ｉ ：
第１０図に記載ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−１−Ｉ［：
第１２図に記載ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ−ＩＩＩ
Ａ・第１３図に記載ＥＮＶ（９３）／ＨＴＬＶ−Ｉ −
Ｉ［［Ｂ’ ：第８図に記載２、ポリペプチドの調製 本発明はまた、前記遺伝子構築物に相当するポリペプチ
ドをも包含する。これらポリペプチドは固相または液相
合成ならびに組換え生産のような当業者によく知られた
合成法により作られうる。
組換え法では、遺伝子構築物はプラスミドまたはファー
ジ起源の適切なベクターに挿入される。プラスミドまた
はファージ起源の好都合な発現ベクターは、例えば実験
室マニュアル“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ″、
Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、 １９８２に記載され
テイル。
ジ起源の適切なベクターに挿入される。プラスミドまた
はファージ起源の好都合な発現ベクターは、例えば実験
室マニュアル“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ″、
Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、 １９８２に記載され
テイル。
本発明の好ましい実施態様においては、ポリペプチドは
ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ２１領域の免疫優性保存領
域からの少なくともひとつのエピトープ、好ましくは第
４図に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ ｅ
ｎｖのｇｐ２１領域のアミノ酸３４２−４３４ （Ｅｎ
ｖ９３）に相当する。
ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ２１領域の免疫優性保存領
域からの少なくともひとつのエピトープ、好ましくは第
４図に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ ｅ
ｎｖのｇｐ２１領域のアミノ酸３４２−４３４ （Ｅｎ
ｖ９３）に相当する。
ＥＮＶ９３ポリペプチドは単独でまたはハイブリッドポ
リペプチドまたは融合タンパク質の一部分として使用で
きる。ハイブリッドポリペプチドの一部分として使用さ
れる場合、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖの免疫優性保存領域か
らの少なくともひとつのエピトープに相当する第１の配
列をＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ４６およびｇｐ２１領
域からのひとつまたはそれ以上のエピトープをコードす
る第２のアミノ酸配列に融合させる。好ましい実施態様
においてはＥＮＶ９３は、下記に示されるｇ９４６およ
びｇｐ２１領域内に該当する種々のサブ配列に融合され
る： ａ）ｇｐ４６およびｇｐ２１（Ｉ）のアミノ酸３０８−
４４０ｂ） ｇｐ４６（ＩＩ）のアミノ酸２０１−３０
７ｃ）ｇｐ４６およびｇｐ２１（ＩＦ ＋ Ｉ ）のア
ミノ酸２０１−４４０ｄ） ｇｐ４ＫＩ［）のアミノ酸
１−２００ｅ） ｇｌ）４６（ＩＩ［Ａ）のアミノ酸２
６−１６５ｆ ） ｇｐ４６（Ｉ［［Ｂ’ ）のアミノ
酸１６６−２１にれら配列は第４．８．９．１０、ｔｉ
、 １２．１３図に示される。
リペプチドまたは融合タンパク質の一部分として使用で
きる。ハイブリッドポリペプチドの一部分として使用さ
れる場合、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖの免疫優性保存領域か
らの少なくともひとつのエピトープに相当する第１の配
列をＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖのｇｐ４６およびｇｐ２１領
域からのひとつまたはそれ以上のエピトープをコードす
る第２のアミノ酸配列に融合させる。好ましい実施態様
においてはＥＮＶ９３は、下記に示されるｇ９４６およ
びｇｐ２１領域内に該当する種々のサブ配列に融合され
る： ａ）ｇｐ４６およびｇｐ２１（Ｉ）のアミノ酸３０８−
４４０ｂ） ｇｐ４６（ＩＩ）のアミノ酸２０１−３０
７ｃ）ｇｐ４６およびｇｐ２１（ＩＦ ＋ Ｉ ）のア
ミノ酸２０１−４４０ｄ） ｇｐ４ＫＩ［）のアミノ酸
１−２００ｅ） ｇｌ）４６（ＩＩ［Ａ）のアミノ酸２
６−１６５ｆ ） ｇｐ４６（Ｉ［［Ｂ’ ）のアミノ
酸１６６−２１にれら配列は第４．８．９．１０、ｔｉ
、 １２．１３図に示される。
タンパク質の生物学的活性を実質的に変化させないアミ
ノ酸置換が当業上知られており、そして例えばＨ，Ｎｅ
ｕｒａｔｈおよびＲ，Ｌ、 Ｈｉｌｌの“ＴｈｅＰｒｏ
ｔｅｉｎｓ 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ ［１９７９］に記載されている。最も
高頻度に観察されるアミノＬｅｕ／Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ
／Ｖａｌ、 Ａｌａ／Ｇｌｕ、 Ａｓｐ／Ｇｌｙ。
ノ酸置換が当業上知られており、そして例えばＨ，Ｎｅ
ｕｒａｔｈおよびＲ，Ｌ、 Ｈｉｌｌの“ＴｈｅＰｒｏ
ｔｅｉｎｓ 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ ［１９７９］に記載されている。最も
高頻度に観察されるアミノＬｅｕ／Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ
／Ｖａｌ、 Ａｌａ／Ｇｌｕ、 Ａｓｐ／Ｇｌｙ。
およびそれらの逆である。かかる置換を含有する任意の
ポリペプチドは本発明の範囲内にあるものと考えられる
。
ポリペプチドは本発明の範囲内にあるものと考えられる
。
３、 ＥＮＶ（９３）構築物を含有する組換えベクター
の調製 本発明の好ましい実施態様においては、Ｅｎｖ（９３）
遺伝子構築物かＥ、コリ中に外来遺伝子を発現させるた
めに遺伝子工学的に作製されたベクター、すなわちベク
ターｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［（Ｓｔｕｅｂｅｒら、前
出）に挿入される。第３図およびその説明文はこの過程
を詳細に示している。しかしながら、他のベクター例え
ばプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ ＩＩまたはプラスミド
ｐＡ−ｅｎｖ−２０が好適でありうる。これらのプラス
ミドを含有するＥ。コリ株はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （
ＤＭＳ）から自由に入手可能であり、それらの受託番号
はそれぞれＤＳＭ３５１９およびＤＳ）ｉ１３５１６で
ある。種々の他の組換えベクターおよび単細胞宿主は、
それらか本発明のポリペプチドの発現を促進するかぎり
好適である。
の調製 本発明の好ましい実施態様においては、Ｅｎｖ（９３）
遺伝子構築物かＥ、コリ中に外来遺伝子を発現させるた
めに遺伝子工学的に作製されたベクター、すなわちベク
ターｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［（Ｓｔｕｅｂｅｒら、前
出）に挿入される。第３図およびその説明文はこの過程
を詳細に示している。しかしながら、他のベクター例え
ばプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ ＩＩまたはプラスミド
ｐＡ−ｅｎｖ−２０が好適でありうる。これらのプラス
ミドを含有するＥ。コリ株はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （
ＤＭＳ）から自由に入手可能であり、それらの受託番号
はそれぞれＤＳＭ３５１９およびＤＳ）ｉ１３５１６で
ある。種々の他の組換えベクターおよび単細胞宿主は、
それらか本発明のポリペプチドの発現を促進するかぎり
好適である。
４、本発明のペプチドを生産する方法
本発明のペプチドを生産する方法は、図面および実施例
において詳細に説明されており、そして一般に相当する
ハイブリッドタンパク質を生産するための適切な条件の
下で組換えベクターを含有する単細胞宿主を培養するこ
とからなる。
において詳細に説明されており、そして一般に相当する
ハイブリッドタンパク質を生産するための適切な条件の
下で組換えベクターを含有する単細胞宿主を培養するこ
とからなる。
５、 ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質に対する抗
体検出法 組換えウィルスタンパク質に基づ＜ ＨＴＬＶ−Ｉに対
する抗体スクリーニング検査の開発は、１）免疫優性で
ウィルス単離物中に保存されているエピトープ（類）の
選択；２）好適なベクター／宿主系におけるエピトープ
の高レベル発現；および３）組換えタンパク質を産生ず
る宿主からの均質で多量の組換えタンパク質の精製、を
必要とする。この目的を達成するために、ｇｐ２１領域
内のＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質のアミノ酸３
４２−４３４をコードするＥＮＶ（９３）を化学的およ
び酵素的方法により合成した。このエンベロープの領域
を選択したのは、ＨＩＶ−１エンベロープの対応する領
域（ｇｐ４１）か数多く保存され、免疫反応性のエピト
ープを含有するからである（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
体検出法 組換えウィルスタンパク質に基づ＜ ＨＴＬＶ−Ｉに対
する抗体スクリーニング検査の開発は、１）免疫優性で
ウィルス単離物中に保存されているエピトープ（類）の
選択；２）好適なベクター／宿主系におけるエピトープ
の高レベル発現；および３）組換えタンパク質を産生ず
る宿主からの均質で多量の組換えタンパク質の精製、を
必要とする。この目的を達成するために、ｇｐ２１領域
内のＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質のアミノ酸３
４２−４３４をコードするＥＮＶ（９３）を化学的およ
び酵素的方法により合成した。このエンベロープの領域
を選択したのは、ＨＩＶ−１エンベロープの対応する領
域（ｇｐ４１）か数多く保存され、免疫反応性のエピト
ープを含有するからである（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ｔｌｓＡ、 ８３． ６１５９−６１６
３ ［１９８６］； Ｇｎａｎｎ ら、Ｊ。
３ ［１９８６］； Ｇｎａｎｎ ら、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、、 ６１．２６３９−２６４１ ［１９８
７］およびＪ、 Ｉｎｆｅｃｔ。
７］およびＪ、 Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｄｉｓ、 １５６．２６１−２６７ ［１９８７］。さ
らに膜貫通ドメインにおけるＨＴＬＶ−ＩおよびＨＩＶ
−１工ンベローブボリベプチド両方のヒドロバシシティ
（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロフィールが類似
パターンを示し、このことはＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ
のこの領域か免疫反応において重要でありうることを示
している。エンベロープタンパク質のアミノ酸３４２−
４３４をコードする真正ヌクレオチド配列は、Ｅ、コリ
タンパク質の翻訳に時たま使用されるコドンかＥ、コリ
翻訳機構に好まれるコドンにより置換されるように変化
させた（Ｉｋｅｍｕｒａ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉａｌ
、 １４６．１−２１［１９８１］ ； Ｇｒｏｓｊ
ｅａｎおよびＦｉｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ １８． １９９
−２０９ ［１９８２］。この方法は細菌性宿主中にお
けるＥＮＶ９３エピトープの発現を最大にするという希
望から採用された。Ｅ、コリ中でコードされたエピトー
プの高レベル発現を生じる旧Ｖ−１合成遺伝子の構築に
類似の方法が採られた（Ｃｅｒｔａら、上記）。
らに膜貫通ドメインにおけるＨＴＬＶ−ＩおよびＨＩＶ
−１工ンベローブボリベプチド両方のヒドロバシシティ
（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロフィールが類似
パターンを示し、このことはＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ
のこの領域か免疫反応において重要でありうることを示
している。エンベロープタンパク質のアミノ酸３４２−
４３４をコードする真正ヌクレオチド配列は、Ｅ、コリ
タンパク質の翻訳に時たま使用されるコドンかＥ、コリ
翻訳機構に好まれるコドンにより置換されるように変化
させた（Ｉｋｅｍｕｒａ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉａｌ
、 １４６．１−２１［１９８１］ ； Ｇｒｏｓｊ
ｅａｎおよびＦｉｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ １８． １９９
−２０９ ［１９８２］。この方法は細菌性宿主中にお
けるＥＮＶ９３エピトープの発現を最大にするという希
望から採用された。Ｅ、コリ中でコードされたエピトー
プの高レベル発現を生じる旧Ｖ−１合成遺伝子の構築に
類似の方法が採られた（Ｃｅｒｔａら、上記）。
本発明のポリペプチドは、当業上よく知られた方法に従
いＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を検出するための診断試薬
として使用できる。
いＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を検出するための診断試薬
として使用できる。
例えばウェスタンプロット分析（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、
７６、４３５０−４３５４［１９７９］か好適であろ
う。この技術によれば、本発明のポリペプチドは５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙に電
気泳動て移される。
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、
７６、４３５０−４３５４［１９７９］か好適であろ
う。この技術によれば、本発明のポリペプチドは５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙に電
気泳動て移される。
このニトロセルロース紙を次に検査すべき血清で処理す
る。洗浄後、ニトロセルロース紙を続いてペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧで処理する。続いてペルオキシダ
ーゼを好適な基質例えばＯ−フェニレンジアミンを用い
て測定する。もちろん放射性または蛍光標識のような他
の標識も使用できる。
る。洗浄後、ニトロセルロース紙を続いてペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧで処理する。続いてペルオキシダ
ーゼを好適な基質例えばＯ−フェニレンジアミンを用い
て測定する。もちろん放射性または蛍光標識のような他
の標識も使用できる。
本発明のポリペプチドを使用するＨＴＬＶ−１に対する
抗体を測定するためのさらに好都合な技術は酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。かかる
アッセイは以下のことを含んでなる、すなわち （ａ） 本発明のポリペプチドを固形支持体に固定化
し、 （ｂ） ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を含有することか
疑われるヒト血清試料を工程（ａ）の固定化されたポリ
ペプチドと接触させ、そして固定化されたポリペプチド
−抗体複合体と形成させ、 （Ｃ） 工程（ｂｌの複合体からすへての未結合物質
を洗い去り、そして （ｄ） ヒト抗体を選択的に検出できる、標識した試
薬例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡま
たは抗ヒトＩｇＧを添加することによりかかる複合体を
検出し、それにより血清中におけるＨＴＬＶ−Ｉウィル
スに対する抗体の存在を示す。
抗体を測定するためのさらに好都合な技術は酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。かかる
アッセイは以下のことを含んでなる、すなわち （ａ） 本発明のポリペプチドを固形支持体に固定化
し、 （ｂ） ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を含有することか
疑われるヒト血清試料を工程（ａ）の固定化されたポリ
ペプチドと接触させ、そして固定化されたポリペプチド
−抗体複合体と形成させ、 （Ｃ） 工程（ｂｌの複合体からすへての未結合物質
を洗い去り、そして （ｄ） ヒト抗体を選択的に検出できる、標識した試
薬例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡま
たは抗ヒトＩｇＧを添加することによりかかる複合体を
検出し、それにより血清中におけるＨＴＬＶ−Ｉウィル
スに対する抗体の存在を示す。
好適な固形支持体は検査容器の内壁（試験管、タイター
プレート、キュベツトまたはガラスまたは人工物質）な
らびに固形物体の表面（ガラスおよび人工物質の棒、末
端か太くなっている棒、末端にたぶまたは薄板かついて
いる捧）である。ガラスまたは人工物質のビーズはとり
わけ好適な面相担体である。
プレート、キュベツトまたはガラスまたは人工物質）な
らびに固形物体の表面（ガラスおよび人工物質の棒、末
端か太くなっている棒、末端にたぶまたは薄板かついて
いる捧）である。ガラスまたは人工物質のビーズはとり
わけ好適な面相担体である。
有用な標識は試薬とその結合相手との結合を妨害しない
任意の検出可能な官能物である。多数の標識がＥＬＩＳ
Ａアッセイおよび他のイムノアッセイでの使用に知られ
ている。例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、１４
ｃおよび１３１１のような放射性同位体、希土類キレー
トまたはフルオレセインのような発蛍光団、スピンラベ
ル等である。
任意の検出可能な官能物である。多数の標識がＥＬＩＳ
Ａアッセイおよび他のイムノアッセイでの使用に知られ
ている。例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、１４
ｃおよび１３１１のような放射性同位体、希土類キレー
トまたはフルオレセインのような発蛍光団、スピンラベ
ル等である。
本発明の好ましい実施態様においては、ＥＬｒＳＡ（Ｅ
ＩＡ）アッセイは実施例９に記載されるようにビーズ上
に固定化された本発明のポリペプチドを用いて操作する
。
ＩＡ）アッセイは実施例９に記載されるようにビーズ上
に固定化された本発明のポリペプチドを用いて操作する
。
本発明のポリペプチドを用いるＨＴＬＶ−Ｉに対する抗
体のもうひとつの好適な測定法は、いわゆる“二重抗原
サンドイツチ法”による酵素免疫学的ｌ査である。この
方法はＭａｉｏｌｉｎｉのｒｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０．２５−３４ ［１９７８］の研
究に基ついている。
体のもうひとつの好適な測定法は、いわゆる“二重抗原
サンドイツチ法”による酵素免疫学的ｌ査である。この
方法はＭａｉｏｌｉｎｉのｒｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０．２５−３４ ［１９７８］の研
究に基ついている。
この方法によると、検査すべき血清を本発明のポリペプ
チドが被覆されている前記定義した固形支持体、および
ペルオキシダーゼで標識された本発明のポリペプチドと
接触させる。この免疫学的反応はｌ工程または２工程で
行うことができる。もし免疫学的反応が２工程で行なわ
れる場合は、洗浄工程はその２回のインキュベーション
の間に行なわれる。免疫学的反応（類）の後、洗浄工程
を行う。そのあとペルオキシダーゼを０−フエニＩ／ン
ジアミンのような基質を用いて測定する。本発明を、説
明目的でのみ記載されている下記の実施例と関連して、
さらに記載する。
チドが被覆されている前記定義した固形支持体、および
ペルオキシダーゼで標識された本発明のポリペプチドと
接触させる。この免疫学的反応はｌ工程または２工程で
行うことができる。もし免疫学的反応が２工程で行なわ
れる場合は、洗浄工程はその２回のインキュベーション
の間に行なわれる。免疫学的反応（類）の後、洗浄工程
を行う。そのあとペルオキシダーゼを０−フエニＩ／ン
ジアミンのような基質を用いて測定する。本発明を、説
明目的でのみ記載されている下記の実施例と関連して、
さらに記載する。
前記した）ＩＴＬＶ−Ｉに対する抗体の測定方法は、容
器中に本発明のポリペプチドを含有する好適な検査キッ
トで行うことができる。
器中に本発明のポリペプチドを含有する好適な検査キッ
トで行うことができる。
実施例１
ＥＮＶ９３オリゴヌクレオチドの合成
合成遺伝子を、１２−１４ヌクレオチドの一本鎖重複が
得られるような方法で１４個のオリゴヌクレオチドフラ
グメント（第１および２図）に小分けした。生成するフ
ラグメントは３０−４６塩基の長さであった。個々のオ
リゴヌクレオチドは、誘導体化された調節された細孔ガ
ラスを固形支持体として使用してＭｉｌｌｉＧｅｎ ７
５００およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３８０ ＤＮＡシンセサイザーで構築した。−木組ＤＮ
Ａフラグメントを７Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリ
ルアミドゲルから単離し、そして５ｅｐ−ＰａｋＣ１８
カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ／
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱塩した。ＤＮＡ濃度は分光光
度計で２６０ｎｍでのＵ■吸収を計測することにより測
定した。
得られるような方法で１４個のオリゴヌクレオチドフラ
グメント（第１および２図）に小分けした。生成するフ
ラグメントは３０−４６塩基の長さであった。個々のオ
リゴヌクレオチドは、誘導体化された調節された細孔ガ
ラスを固形支持体として使用してＭｉｌｌｉＧｅｎ ７
５００およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３８０ ＤＮＡシンセサイザーで構築した。−木組ＤＮ
Ａフラグメントを７Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリ
ルアミドゲルから単離し、そして５ｅｐ−ＰａｋＣ１８
カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ／
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱塩した。ＤＮＡ濃度は分光光
度計で２６０ｎｍでのＵ■吸収を計測することにより測
定した。
実施例２
ＥＭＶ９３遺伝子の組立て
オリゴヌクレオチド２−１３の２マイクログラム（１５
０ｐモル）ずつを１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、５ ｍＭ Ｄ
ＴＴ、 ０．１［１１Ｍスペルミジン、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、Ｏ，ｌ ｍＭ ＡＴＰ、 ０．２１ｐモルー３
”Ｐ−ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍモル）を含有する５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ５ｐ８７．５およびＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼの５単位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）からなる別々の５０μｆ反応物中でキ
ナーゼ処理した。反応物を３７°Ｃで４０分間、続いて
キナーゼを不活性化するために７０°Ｃで１０分間イン
キュベートした。各反応物中においてとり込まれなかっ
た放射能をＧ−５０セフアデツクスカラムクロマトグラ
フイーにより除去した。５′末端フラグメントであるオ
リゴヌクレオチド１および１４は続くアニーリングおよ
び連結反応中にポリマーが形成されるのを防ぐためにリ
ン酸化しなかった。リン酸化したオリゴヌクレオチド２
−１３を真空下で乾燥しそしてＤＴＴおよびＡＴＰを含
まない連結緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣＬを含有する５０
ｍＭ ）リス−〇ＣＩ、 ｐＨ７，５） ２０μｌ中に
再懸濁した。実際の遺伝子構築には１０μｆ（ｌμｌ）
を取った。末端フラグメント１および１４の１Ｍｇを凍
結乾燥しそして同じ連結緩衝液の１０μｌ中に再懸濁し
た。
０ｐモル）ずつを１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、５ ｍＭ Ｄ
ＴＴ、 ０．１［１１Ｍスペルミジン、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、Ｏ，ｌ ｍＭ ＡＴＰ、 ０．２１ｐモルー３
”Ｐ−ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍモル）を含有する５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ５ｐ８７．５およびＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼの５単位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）からなる別々の５０μｆ反応物中でキ
ナーゼ処理した。反応物を３７°Ｃで４０分間、続いて
キナーゼを不活性化するために７０°Ｃで１０分間イン
キュベートした。各反応物中においてとり込まれなかっ
た放射能をＧ−５０セフアデツクスカラムクロマトグラ
フイーにより除去した。５′末端フラグメントであるオ
リゴヌクレオチド１および１４は続くアニーリングおよ
び連結反応中にポリマーが形成されるのを防ぐためにリ
ン酸化しなかった。リン酸化したオリゴヌクレオチド２
−１３を真空下で乾燥しそしてＤＴＴおよびＡＴＰを含
まない連結緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣＬを含有する５０
ｍＭ ）リス−〇ＣＩ、 ｐＨ７，５） ２０μｌ中に
再懸濁した。実際の遺伝子構築には１０μｆ（ｌμｌ）
を取った。末端フラグメント１および１４の１Ｍｇを凍
結乾燥しそして同じ連結緩衝液の１０μｌ中に再懸濁し
た。
ＥＮＶ９３合成遺伝子を段階的連結により組立てた。
オリゴヌクレオチドを２分間煮沸し、エッペンドルフ微
量遠心管で遠心沈降しそして室温で５分間さました。続
いて１０μｌの試料を第２図に示されるように結合させ
てブロックｌ−４を形成させた。
量遠心管で遠心沈降しそして室温で５分間さました。続
いて１０μｌの試料を第２図に示されるように結合させ
てブロックｌ−４を形成させた。
これらブロックを２分間煮沸し、微量遠心管で遠心しそ
して室温で５分間さました。これらブロックを３７°Ｃ
て５分間インキュベートしそして室温で１０分間さまし
た。２×連結緩衝液（ｌｏｍＭ ＭｇＣｌ２．２０ｍＭ
ＤＤＴおよび２ｍＭＡＴＰを含有する５０ｍＭ トリ
スＨＣＩ、ｐＨ７，５）の同量を、アニールしたオリゴ
ヌクレオチドを含有する各ブロックに添加した。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）の４００−８００単位を各ブロック連結物に添加し
、反応物（連結反応第１）を１４°Ｃで１６時間インキ
ュベートした。
して室温で５分間さました。これらブロックを３７°Ｃ
て５分間インキュベートしそして室温で１０分間さまし
た。２×連結緩衝液（ｌｏｍＭ ＭｇＣｌ２．２０ｍＭ
ＤＤＴおよび２ｍＭＡＴＰを含有する５０ｍＭ トリ
スＨＣＩ、ｐＨ７，５）の同量を、アニールしたオリゴ
ヌクレオチドを含有する各ブロックに添加した。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）の４００−８００単位を各ブロック連結物に添加し
、反応物（連結反応第１）を１４°Ｃで１６時間インキ
ュベートした。
リガーゼはＥＤＴＡが最終濃度１０ｍＭになるまで添加
することにより不活性化させた。
することにより不活性化させた。
各連結反応物の１／１０をとり出して７Ｍ尿素を含有す
る１０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。
る１０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。
連結反応物を０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃ、 ｐＨ５，２を含
有するように調整しそして同量のフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２５： ２４ ： １）
で抽出した。
有するように調整しそして同量のフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２５： ２４ ： １）
で抽出した。
エーテル抽出につづいて、ＭｇＣ１２を１０ｍＭになる
ように添加し、連結産物を２倍量の１００％エタノール
で沈降させた。エタノールペレットを遠心により回収し
、７０％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥しそして１
０ｍＭ ＭｇＣ１ｘを含有する５０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，５の１０μＥ中に再懸濁した。次の工程は
１２−１４塩基対の重複を用いて４ブロツクをアニール
させることであった（第２図）。ブロックを３７°Ｃで
１０分間インキュベートし、室温にて５分間さました。
ように添加し、連結産物を２倍量の１００％エタノール
で沈降させた。エタノールペレットを遠心により回収し
、７０％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥しそして１
０ｍＭ ＭｇＣ１ｘを含有する５０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，５の１０μＥ中に再懸濁した。次の工程は
１２−１４塩基対の重複を用いて４ブロツクをアニール
させることであった（第２図）。ブロックを３７°Ｃで
１０分間インキュベートし、室温にて５分間さました。
ブロックは単一のチューブ中で混合し、３７°Ｃで１０
分間インキュベートした。チューブを１４°Ｃになるま
で３０分間ゆっくりとさました。２×連連結台物の同量
およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ） ８００単位を添加しそして反応を１
４℃にて１６時間維持した（連結反応第２）。リガーゼ
を不活性化するためにＥＤＴＡをｌｏｍＭとなるまで添
加した。
分間インキュベートした。チューブを１４°Ｃになるま
で３０分間ゆっくりとさました。２×連連結台物の同量
およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ） ８００単位を添加しそして反応を１
４℃にて１６時間維持した（連結反応第２）。リガーゼ
を不活性化するためにＥＤＴＡをｌｏｍＭとなるまで添
加した。
２８３ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントを０．５μｇ／ｍ
１７のエチジウムブロマイドを含有する４％Ｎｕｓｉｅ
ｖｅ ＧＴＧアガロース／ＴＡＢ ミニゲルでの電気泳
動により精製した。一番上のバンドを切り出し、アガロ
ースを６５℃にて融解させた後、フラグメントをフェノ
ールおよびエーテル抽出した。ＤＮＡをエタノール沈降
させ、回収したベレットを７０％エタノールで洗浄しそ
して真空下で乾燥した。
１７のエチジウムブロマイドを含有する４％Ｎｕｓｉｅ
ｖｅ ＧＴＧアガロース／ＴＡＢ ミニゲルでの電気泳
動により精製した。一番上のバンドを切り出し、アガロ
ースを６５℃にて融解させた後、フラグメントをフェノ
ールおよびエーテル抽出した。ＤＮＡをエタノール沈降
させ、回収したベレットを７０％エタノールで洗浄しそ
して真空下で乾燥した。
実施例３
ＥＮＶ９３のｐＵｃ１８中へのクローニングＥＮＶ９３
構築物の配列を証明するために、フラグメントを最初に
ｐＬＩｃ１８配列決定ベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ ３３．１０３−１１９ ［１９
８５］）のただひとつしかないＢａｍ旧部位にクローン
化した。
構築物の配列を証明するために、フラグメントを最初に
ｐＬＩｃ１８配列決定ベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ ３３．１０３−１１９ ［１９
８５］）のただひとつしかないＢａｍ旧部位にクローン
化した。
ＥＮＶ９３ ＤＮＡペレット（２５０℃ｇ）を蒸留水中
に再懸濁し、５０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５（
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．５ｍＭ ＤＴＴ、 ０．１ｍＭ
スペルミジン、２０℃Ｍ ＡＴＰ）および９単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０℃１反応物中
でキナーゼ処理した。キナーゼ反応物を３７°Ｃにて４
０分間インキュベートした。キナーゼ酵素を７０°Ｃて
１５分間熱不活性化した。ＥＮＶ９３ＤＮＡを含有する
反応物を蒸留水中１・５に希釈した。ＥＮＶ９３ ＤＮ
Ａ ５ ｎｇを脱リン酸化したベクターの５０℃ｇ（１
： １モル比率）と１４°Ｃて１６時間連結した。
に再懸濁し、５０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５（
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．５ｍＭ ＤＴＴ、 ０．１ｍＭ
スペルミジン、２０℃Ｍ ＡＴＰ）および９単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０℃１反応物中
でキナーゼ処理した。キナーゼ反応物を３７°Ｃにて４
０分間インキュベートした。キナーゼ酵素を７０°Ｃて
１５分間熱不活性化した。ＥＮＶ９３ＤＮＡを含有する
反応物を蒸留水中１・５に希釈した。ＥＮＶ９３ ＤＮ
Ａ ５ ｎｇを脱リン酸化したベクターの５０℃ｇ（１
： １モル比率）と１４°Ｃて１６時間連結した。
反応物を１０ｍＭ ＥＤＴＡに調整し７０°Ｃて１５分
間加熱した。コンピテントなＥ、コリＲＲＩ細胞（ＡＴ
ＣＣＮｏ、 ３１３４３）をこの混合物で形質転換しそ
してアンピシリン耐性コロニーを得た。Ｂａｍ旧消化に
基づけばＥＮＶ９３構築物を含有すると思われる形質転
換体をジデオキシ配列決定にかけた。ポリリンカークロ
ーニング部位のすぐ外側の、ベクターの反対側ストラン
ドにハイブリッド形成するＭ１３ユニバーサル配列決定
ブライマーをＰｒｏｍｅｇａジデオキシ配列決定系と配
列決定−使用して挿入物の両ストランドに関する配列情
報を生成させた。ＥＮＶ９３特異的な付加的な１７マー
ブライマーか、ＥＮＶ９３二本鎖の両ストランドの配列
を完成させるのに必要であった。
間加熱した。コンピテントなＥ、コリＲＲＩ細胞（ＡＴ
ＣＣＮｏ、 ３１３４３）をこの混合物で形質転換しそ
してアンピシリン耐性コロニーを得た。Ｂａｍ旧消化に
基づけばＥＮＶ９３構築物を含有すると思われる形質転
換体をジデオキシ配列決定にかけた。ポリリンカークロ
ーニング部位のすぐ外側の、ベクターの反対側ストラン
ドにハイブリッド形成するＭ１３ユニバーサル配列決定
ブライマーをＰｒｏｍｅｇａジデオキシ配列決定系と配
列決定−使用して挿入物の両ストランドに関する配列情
報を生成させた。ＥＮＶ９３特異的な付加的な１７マー
ブライマーか、ＥＮＶ９３二本鎖の両ストランドの配列
を完成させるのに必要であった。
正しいεＮＶ９３構築物を有するクローンの挿入物を発
現ベクター中に連結用にゲル精製した。
現ベクター中に連結用にゲル精製した。
実施例４
ＥＮＶ９３ノｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［中ヘノクローニ
ングＥＮＶ９３合成遺伝子を第３図に概略して示すよう
にしてｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［発現ベクター（Ｓｔｕ
ｅｂｅｒら、上記）の適切な読み取り枠のＢａｍＨＩ部
位に直接連結した。ベクターをＢａｍＨＩで直線状とな
し、脱リン酸化し、０．７％アガロース／ＴＡＢミニゲ
ルでの電気泳動によりｐＤＭＩ−１適合プラスミドから
単離した。
ングＥＮＶ９３合成遺伝子を第３図に概略して示すよう
にしてｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［発現ベクター（Ｓｔｕ
ｅｂｅｒら、上記）の適切な読み取り枠のＢａｍＨＩ部
位に直接連結した。ベクターをＢａｍＨＩで直線状とな
し、脱リン酸化し、０．７％アガロース／ＴＡＢミニゲ
ルでの電気泳動によりｐＤＭＩ−１適合プラスミドから
単離した。
ＤＮＡをアガロースから精製した。挿入物の５μｇを２
θμ！反応物中の６０℃ｇのベクター（ｊ：１モル比）
に連結し、１４°Ｃで１６時間維持した。連結混合物の
半分を用いてコンピテントなＥ、コリＷ３１１０細胞（
ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）を形質転換した。アンピシ
リン／カナマイシン耐性クローンのＤＮＡを、タンパク
質発現にとって正しい方向で発現ベクター中に連結され
たＥＮＶ９３挿入物の存在に関して制限酵素消化により
スクリーニングした。多数の陽性クローンを同定しそし
てそれらのうちのひとつのＤＮＡを、Ｅ、）り株ＪＥ５
５０５およびＪＥ５５０６ （Ｈｉｒｏｔａら、Ｐｒｏ
ｃ。
θμ！反応物中の６０℃ｇのベクター（ｊ：１モル比）
に連結し、１４°Ｃで１６時間維持した。連結混合物の
半分を用いてコンピテントなＥ、コリＷ３１１０細胞（
ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）を形質転換した。アンピシ
リン／カナマイシン耐性クローンのＤＮＡを、タンパク
質発現にとって正しい方向で発現ベクター中に連結され
たＥＮＶ９３挿入物の存在に関して制限酵素消化により
スクリーニングした。多数の陽性クローンを同定しそし
てそれらのうちのひとつのＤＮＡを、Ｅ、）り株ＪＥ５
５０５およびＪＥ５５０６ （Ｈｉｒｏｔａら、Ｐｒｏ
ｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、
７４． １４１７−１４２０ ［１９７７］）の形
質転換に使用した。
７４． １４１７−１４２０ ［１９７７］）の形
質転換に使用した。
ＥＮＶ９３エピトープをｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［ベク
ター中に挿入すると１０６アミノ酸の組換えタンパク質
か翻訳される。推定アミノ酸配列およびＥＮＶ９３構築
物から発現された実際のタンパク質をコードするヌクレ
オチドを第４図に示す。ＨＴＬＶ−Ｉゲノムにより特定
されていないタンパク質のＮ末端の３アミノ酸およびＣ
末端のＩＯアミノ酸はベクター配列からのものである。
ター中に挿入すると１０６アミノ酸の組換えタンパク質
か翻訳される。推定アミノ酸配列およびＥＮＶ９３構築
物から発現された実際のタンパク質をコードするヌクレ
オチドを第４図に示す。ＨＴＬＶ−Ｉゲノムにより特定
されていないタンパク質のＮ末端の３アミノ酸およびＣ
末端のＩＯアミノ酸はベクター配列からのものである。
実施例５
ＥＮＶ９３エピトープのＥ、コリ中における発現組換え
タンパク質の発現は上記Ｃｅｒｔａらにより記載されて
いるものを改変し、活発に増殖している細菌培養物をイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で
誘導することにより達成した。
タンパク質の発現は上記Ｃｅｒｔａらにより記載されて
いるものを改変し、活発に増殖している細菌培養物をイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で
誘導することにより達成した。
Ｅ、コリ培養物を３７°ＣにてＯＤ、。。が０．６−０
．７になるまで増殖させた（時間０）。この時点におい
て１−の部分量を採取した。培養物を２個のフラスコお
よび１個のフラスコに分割し、＋ＰＴＧを０．５ ｍＭ
になるまで添加した。培養物を３７”Ｃでインキユベー
トシそして誘導２時間後および４時間後に１ｒＩＬｌず
つ部分量を採取した。細菌細胞を遠心分離により収集し
溶菌緩衝液（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、 ０．
１％ＢＰＢＳ１．２５％２−メルカプトエタノールを含
有する１２５ｎ＋Ｍ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨｅ、 ８
）中に懸濁した。Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ
２７７、６８０−６８５ ［１９７０］）に記載の不連
続緩衝液系を使用して、同量の全細胞溶解物を１２％ポ
リアクリルアミド／ＳＤＳゲルて電気泳動した。ゲルに
負荷する前に、煮沸により試料を変性させた。タンパク
質をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０て染色する
ことにより可視化した。第５図はプラスミドｐＤＳ５６
／ＲＢＳ ＩＩ ＥＮＶ９３を収容する３種のＥ、コリ
宿主株中のＥＮＶ９３組換えタンパク質の発現を示す。
．７になるまで増殖させた（時間０）。この時点におい
て１−の部分量を採取した。培養物を２個のフラスコお
よび１個のフラスコに分割し、＋ＰＴＧを０．５ ｍＭ
になるまで添加した。培養物を３７”Ｃでインキユベー
トシそして誘導２時間後および４時間後に１ｒＩＬｌず
つ部分量を採取した。細菌細胞を遠心分離により収集し
溶菌緩衝液（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、 ０．
１％ＢＰＢＳ１．２５％２−メルカプトエタノールを含
有する１２５ｎ＋Ｍ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨｅ、 ８
）中に懸濁した。Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ
２７７、６８０−６８５ ［１９７０］）に記載の不連
続緩衝液系を使用して、同量の全細胞溶解物を１２％ポ
リアクリルアミド／ＳＤＳゲルて電気泳動した。ゲルに
負荷する前に、煮沸により試料を変性させた。タンパク
質をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０て染色する
ことにより可視化した。第５図はプラスミドｐＤＳ５６
／ＲＢＳ ＩＩ ＥＮＶ９３を収容する３種のＥ、コリ
宿主株中のＥＮＶ９３組換えタンパク質の発現を示す。
１２ＫｄのＥＮＶ９３のポリペプチドは検査したＥ、コ
リ株中に種々のレベルで発現される。ＪＥ５５０６宿主
は最高レベルのＥＮＶ９３を生産するが、Ｗ３１１０宿
主中ではＥＮＶ９３はクマシー染色によっては、はとん
ど検出されない。
リ株中に種々のレベルで発現される。ＪＥ５５０６宿主
は最高レベルのＥＮＶ９３を生産するが、Ｗ３１１０宿
主中ではＥＮＶ９３はクマシー染色によっては、はとん
ど検出されない。
実施例６
組換えＥＮＶ９３タンパク質の精製
組換えタンパク質はＭａｎｎｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。
。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８２．３７６−３８
０ ［１９８５］の改変法に従い精製した。５００ｍ１
細菌培養物の誘導された細胞ペレットを緩衝液１ （２
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴを含有する１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８） ２Ｗ中に再懸濁した。こ
の溶液を４°Ｃで１０分間、１２．０ＯＯＸｇで遠心分
離した。ペレットを緩衝液１の１０ｍ１中に再懸濁した
。リゾチームを０．７５■／イとなるまで添加しそして
懸濁物を３７℃で１５分間インキュベートした。
０ ［１９８５］の改変法に従い精製した。５００ｍ１
細菌培養物の誘導された細胞ペレットを緩衝液１ （２
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴを含有する１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８） ２Ｗ中に再懸濁した。こ
の溶液を４°Ｃで１０分間、１２．０ＯＯＸｇで遠心分
離した。ペレットを緩衝液１の１０ｍ１中に再懸濁した
。リゾチームを０．７５■／イとなるまで添加しそして
懸濁物を３７℃で１５分間インキュベートした。
ＭｇＣ１，を２３ｍＭとなるまで添加し、４．５■のＤ
Ｎアーゼエを添加した。この懸濁物を３７°Ｃて３０分
間維持した。２５ｒｎｌの緩衝液２（１ｍＭＤＴＴを含
有する１０ｍ！ｉｆトリスーＨＣｌ、ｐＨ８）を添加し
、溶解物を１２．０ＯＯＸ ｇで４°Ｃで１０分間遠心
分離した。ペレットを緩衝液２ノ２５ｙｎｔ７テ洗浄し
そして４°Ｃにて１０分間、１２．０ＯＯＸｇで遠心分
離した。ペレットを２５−の緩衝液３（１ｍＭ ＤＴＴ
、 ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１０
０を含有する１０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ、 ｐＨ８）中
に再懸濁した。この溶液を０°Ｃて１５分間、３７°Ｃ
で３０分間そして０°Ｃて１５分間保持した。この試料
を４℃にて１０分間、１２，０ＯＯＸｇで遠心分離した
。ペレットを２５ｍ１の緩衝液２で洗浄し、遠心分離に
より収集した。
Ｎアーゼエを添加した。この懸濁物を３７°Ｃて３０分
間維持した。２５ｒｎｌの緩衝液２（１ｍＭＤＴＴを含
有する１０ｍ！ｉｆトリスーＨＣｌ、ｐＨ８）を添加し
、溶解物を１２．０ＯＯＸ ｇで４°Ｃで１０分間遠心
分離した。ペレットを緩衝液２ノ２５ｙｎｔ７テ洗浄し
そして４°Ｃにて１０分間、１２．０ＯＯＸｇで遠心分
離した。ペレットを２５−の緩衝液３（１ｍＭ ＤＴＴ
、 ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１０
０を含有する１０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ、 ｐＨ８）中
に再懸濁した。この溶液を０°Ｃて１５分間、３７°Ｃ
で３０分間そして０°Ｃて１５分間保持した。この試料
を４℃にて１０分間、１２，０ＯＯＸｇで遠心分離した
。ペレットを２５ｍ１の緩衝液２で洗浄し、遠心分離に
より収集した。
ペレットを０．２−の緩衝液２中に再懸濁しそして３．
８−の緩衝液４ （７Ｍ ＧｕＨＣｌ、５ｍＭＤＴＴを
含有する１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）を添加す
ることにより可溶化した。不溶性物質を遠心分離により
取り除いた。上清を緩衝液６ （５ｍＭ ＤＴＴを含有
する１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐ）１８）で１＝１５
に希釈し、室温にて１０分間インキュベートしてタンパ
ク質を沈降させた。
８−の緩衝液４ （７Ｍ ＧｕＨＣｌ、５ｍＭＤＴＴを
含有する１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）を添加す
ることにより可溶化した。不溶性物質を遠心分離により
取り除いた。上清を緩衝液６ （５ｍＭ ＤＴＴを含有
する１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐ）１８）で１＝１５
に希釈し、室温にて１０分間インキュベートしてタンパ
ク質を沈降させた。
タンパク質を４°Ｃにて１０分間、１２．０ＯＯＸｇで
遠心分離することにより収集した。ペレットを２０ｍ１
の緩衝液６て洗浄し遠心分離により収集した。生じたペ
レットを３ｍｌの緩衝液５（４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、
５ｍＭ ＤＴＴ、０．０２％ＮａＮ ３を含有する１２
５ｍＭ トリス−）１ｃＩ。
遠心分離することにより収集した。ペレットを２０ｍ１
の緩衝液６て洗浄し遠心分離により収集した。生じたペ
レットを３ｍｌの緩衝液５（４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、
５ｍＭ ＤＴＴ、０．０２％ＮａＮ ３を含有する１２
５ｍＭ トリス−）１ｃＩ。
ｐＨ６，８）中にゆっくりと溶解させた。５ｍＭＤＴＴ
、０．１％ＳＤＳ、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
ＮａＣ１および０．０２％ＮａＮ３を含有する２５ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８で平衡化した５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） １．６
Ｘ９５ａｎカラムでクロマトグラフィーすることによ
りさらに精製した。フラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。
、０．１％ＳＤＳ、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
ＮａＣ１および０．０２％ＮａＮ３を含有する２５ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８で平衡化した５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） １．６
Ｘ９５ａｎカラムでクロマトグラフィーすることによ
りさらに精製した。フラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。
関心のあるタンパク質を含有するフラクションをプール
し、タンパク質濃度を２８０ｎｍてのＵＶ吸収により測
定した。プールした物質はエンザイムイムノアッセイに
おけるポリスチレンビーズを被覆するのに用いた。
し、タンパク質濃度を２８０ｎｍてのＵＶ吸収により測
定した。プールした物質はエンザイムイムノアッセイに
おけるポリスチレンビーズを被覆するのに用いた。
実施例７
ＥＮＶ９３融合タンパク質としてのエンベロープエピト
ープの発現 ＥＮＶ９３構築物はＨＴＬＶ−Ｉゲノムの他の領域を効
率的に発現させるための好都合なビークルとして使用さ
れようとしている。この系は抗体スクリーニングアッセ
イにおける試験抗原として評価するのに必要な十分量の
ＨＴＬＶ−Ｉ組換えタンパク質を入手可能にすべきであ
る。
ープの発現 ＥＮＶ９３構築物はＨＴＬＶ−Ｉゲノムの他の領域を効
率的に発現させるための好都合なビークルとして使用さ
れようとしている。この系は抗体スクリーニングアッセ
イにおける試験抗原として評価するのに必要な十分量の
ＨＴＬＶ−Ｉ組換えタンパク質を入手可能にすべきであ
る。
ＨＴＬＶ−ＩエンベロープＤＮＡの起源はプラスミドｐ
Ｈ２ＥＸである。このプラスミドは本来ＨＴＬＶ−Ｉの
ｅｎｖ 、 ｐｘおよび３ ’ ＬＴＲを含有するファ
ージλＣＲＩからサブクローンされた（Ｍａｎｚａｒｉ
ら、上記：ヨーロツバ特許出願、公開番号１８１１０７
）。エンベロープコード領域の地図は第６図に示される
。示されている制限部位を用いて下記のＤＮＡフラグメ
ントを生成させた。すなわち、■、Ｉ［Ａ、Ｉ［ＩＢ’
、■、■およびＩＩＩＩ、これらＤＮＡはエンベロープ
コード配列のほぼ全体を表わす。各フラグメントをプラ
スミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩのＥＮＶ９３の下流に
挿入しそして第７図に示される組換え融合タンパク質を
前記のようにＥ、コリ中で発現させ精製した。
Ｈ２ＥＸである。このプラスミドは本来ＨＴＬＶ−Ｉの
ｅｎｖ 、 ｐｘおよび３ ’ ＬＴＲを含有するファ
ージλＣＲＩからサブクローンされた（Ｍａｎｚａｒｉ
ら、上記：ヨーロツバ特許出願、公開番号１８１１０７
）。エンベロープコード領域の地図は第６図に示される
。示されている制限部位を用いて下記のＤＮＡフラグメ
ントを生成させた。すなわち、■、Ｉ［Ａ、Ｉ［ＩＢ’
、■、■およびＩＩＩＩ、これらＤＮＡはエンベロープ
コード配列のほぼ全体を表わす。各フラグメントをプラ
スミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩのＥＮＶ９３の下流に
挿入しそして第７図に示される組換え融合タンパク質を
前記のようにＥ、コリ中で発現させ精製した。
実施例８
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩＩ Ｂ’の構築１５
４ｂｐのＳａｌ １／）ｌｐａｌルミｌフラグメントｓ
５６７３−５８２７）をｐＨ２Ｅｘから単離した（第６
図）。このＩＩ［Ｂ’ ＤＮＡはｇｐ４６エンベローブ
ドメインのアミノ酸１６６−２１６に相当する５２アミ
ノ酸をコードする。Ｓａｌ１合成８７−リンカ−をフラ
グメントに添加しそしてＩＩＩＢ’をプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳＩＩ ＢＮＶ９３のＳａｌ１部位に連結し
た。構築物から発現された融合タンパク質のヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列を第８図に示す。１７．８Ｋ
ｄのタンパク質である１５８アミノ酸はＪＥ５５０６細
胞中で最高レベルの発現を示す。
４ｂｐのＳａｌ １／）ｌｐａｌルミｌフラグメントｓ
５６７３−５８２７）をｐＨ２Ｅｘから単離した（第６
図）。このＩＩ［Ｂ’ ＤＮＡはｇｐ４６エンベローブ
ドメインのアミノ酸１６６−２１６に相当する５２アミ
ノ酸をコードする。Ｓａｌ１合成８７−リンカ−をフラ
グメントに添加しそしてＩＩＩＢ’をプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳＩＩ ＢＮＶ９３のＳａｌ１部位に連結し
た。構築物から発現された融合タンパク質のヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列を第８図に示す。１７．８Ｋ
ｄのタンパク質である１５８アミノ酸はＪＥ５５０６細
胞中で最高レベルの発現を示す。
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ ＋７）構築７１８ｂ
ｌ） Ｘｈｏ１フラグメント（ｎｔｓ５７７８−６４９
６ 、第６図）をｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［のＳａｌ１
部位にサブクローンしてｐＢｓＥＮＶ構築物を生成させ
た。このＤＮＡを４１３ｂｐＩフラグメントをはずすた
めにＢａｍ１−ＩＩ／ＨｉｎｄＩ［［て消化した。その
■フラグメントはエンベロープポリベプチドのアミノ酸
３０８−４４０に相当する１３３アミノ酸をコードする
。大部分のｇｐ２１ドメインと共にｇｐ４６のＣ末端か
フラグメントエに包含される。１゜マーＨｉｎｄＩ［［
リンカ−を添加することかプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢ
Ｓ Ｉ［ＥＮＶ９３のＨｉｎｄＩＩＩ部位に１フラグメ
ントを挿入するのに必要であった。発現した融合タンパ
ク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を第９図に
示す。２４５アミノ酸のこのポリペプチドは２７Ｋｄ（
７）分子量を有する。ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ
構築物はＥＮＶ９３エピトープの２倍量の発現を指示す
る。全ＥＮＶ９３配列かエフラグメント内に包含される
。
ｌ） Ｘｈｏ１フラグメント（ｎｔｓ５７７８−６４９
６ 、第６図）をｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［のＳａｌ１
部位にサブクローンしてｐＢｓＥＮＶ構築物を生成させ
た。このＤＮＡを４１３ｂｐＩフラグメントをはずすた
めにＢａｍ１−ＩＩ／ＨｉｎｄＩ［［て消化した。その
■フラグメントはエンベロープポリベプチドのアミノ酸
３０８−４４０に相当する１３３アミノ酸をコードする
。大部分のｇｐ２１ドメインと共にｇｐ４６のＣ末端か
フラグメントエに包含される。１゜マーＨｉｎｄＩ［［
リンカ−を添加することかプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢ
Ｓ Ｉ［ＥＮＶ９３のＨｉｎｄＩＩＩ部位に１フラグメ
ントを挿入するのに必要であった。発現した融合タンパ
ク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を第９図に
示す。２４５アミノ酸のこのポリペプチドは２７Ｋｄ（
７）分子量を有する。ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ
構築物はＥＮＶ９３エピトープの２倍量の発現を指示す
る。全ＥＮＶ９３配列かエフラグメント内に包含される
。
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ ＋Ｉの構築７１８
ｂｐ Ｘｈｏｌフラグメント（ｎｔｓ５７７８−６４９
６）を１）Ｈ２ＥＸから単離しそしてプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳＩＩ ＥＮＶ９３の適合するＳａｌ１部位
に直接連結した。このｎ＋ＩフラグメントはＨＴＬＶ−
Ｉエンベロープポリベブチドの残基２０１−４４０に相
当する２４０アミノ酸をコードする。ｇｐ４６およびｇ
ｐ２１由来のエピトープか■＋■フラグメント中に示さ
れる。この構築物から発現される組換え融合タンパク質
は分子量３７．９Ｋｄに翻訳される３４４アミノ酸であ
る。ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ｎ＋Ｉタンパク質の
ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を第１０図に示す
。
ｂｐ Ｘｈｏｌフラグメント（ｎｔｓ５７７８−６４９
６）を１）Ｈ２ＥＸから単離しそしてプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳＩＩ ＥＮＶ９３の適合するＳａｌ１部位
に直接連結した。このｎ＋ＩフラグメントはＨＴＬＶ−
Ｉエンベロープポリベブチドの残基２０１−４４０に相
当する２４０アミノ酸をコードする。ｇｐ４６およびｇ
ｐ２１由来のエピトープか■＋■フラグメント中に示さ
れる。この構築物から発現される組換え融合タンパク質
は分子量３７．９Ｋｄに翻訳される３４４アミノ酸であ
る。ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ｎ＋Ｉタンパク質の
ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を第１０図に示す
。
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｈの構築ｐｂｓＥＮＶ
ＤＮＡを３２８ｂｐＩＩフラグメントをはずすためにＢ
ａｍ旧で消化した。この■フラグメントはｇｐ４６エン
ベロープタンパク質のＣ末端のアミノ酸２０１−３０７
をコードする （第６図）。５°Ｂａｍ旧粘着末端をフ
レノウ酵素で充填しそして１０マーＨｉｎｄＩ［Ｉリン
カ−を、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［ＥＮＶ９
３のＨｉｎｄ■部位への挿入を容易にするためにＤＮＡ
に連結した。発現された融合タンパク質のヌクレオチド
および推定アミノ酸配列を第１１図に示す。２１７アミ
ノ酸のＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ｎタンパク質は分
子量２４Ｋｄを有する。
ＤＮＡを３２８ｂｐＩＩフラグメントをはずすためにＢ
ａｍ旧で消化した。この■フラグメントはｇｐ４６エン
ベロープタンパク質のＣ末端のアミノ酸２０１−３０７
をコードする （第６図）。５°Ｂａｍ旧粘着末端をフ
レノウ酵素で充填しそして１０マーＨｉｎｄＩ［Ｉリン
カ−を、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［ＥＮＶ９
３のＨｉｎｄ■部位への挿入を容易にするためにＤＮＡ
に連結した。発現された融合タンパク質のヌクレオチド
および推定アミノ酸配列を第１１図に示す。２１７アミ
ノ酸のＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ｎタンパク質は分
子量２４Ｋｄを有する。
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［の構築■フラグメン
トはｇｐ４６のＮ末端のアミノ酸１−２００を表わす。
トはｇｐ４６のＮ末端のアミノ酸１−２００を表わす。
この■フラグメントはＮｃｏ［／Ｘｈｏｌ消化によりｐ
Ｈ２ＥＸから単離しく第６図）そして５９９ｂｐＤＮＡ
を、合成ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−の連結を経由してｐＥ
ＮＶ５９のＨｉｎｄＩ［部位にサブクローンした。■フ
ラグメントを６１３ｂｐ ＨｉｎｄＩ［フラグメントと
してｐＥＮＶ５９／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［ＤＮＡ構築物
から精製した。５’Ｈｉｎｄ■粘着末端をフレノウ酵素
で充填しそして１０マーＨｉｎｄｌＩＩリンカ−を平滑
末端ＤＮＡに連結した。挿入物をプラスミドｐＤＳ５６
／ＲＢＳ ＩＩ ＥＮＶ９３のＨｉ口ｄＩＩＩ部位に連
結した。発現された組換えタンパク質のヌクレオチドお
よび推定アミノ酸配列を第１２図に示す。
Ｈ２ＥＸから単離しく第６図）そして５９９ｂｐＤＮＡ
を、合成ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−の連結を経由してｐＥ
ＮＶ５９のＨｉｎｄＩ［部位にサブクローンした。■フ
ラグメントを６１３ｂｐ ＨｉｎｄＩ［フラグメントと
してｐＥＮＶ５９／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［ＤＮＡ構築物
から精製した。５’Ｈｉｎｄ■粘着末端をフレノウ酵素
で充填しそして１０マーＨｉｎｄｌＩＩリンカ−を平滑
末端ＤＮＡに連結した。挿入物をプラスミドｐＤＳ５６
／ＲＢＳ ＩＩ ＥＮＶ９３のＨｉ口ｄＩＩＩ部位に連
結した。発現された組換えタンパク質のヌクレオチドお
よび推定アミノ酸配列を第１２図に示す。
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ−Ｉ［ポリヘブチドハ分子ｆ
ｉ３５Ｋｄヲ有し、３１５アミノ酸から成る。
ｉ３５Ｋｄヲ有し、３１５アミノ酸から成る。
ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ［Ａ）構築Ｉ［Ａフ
ラグメントはＰｖｕＩ［／Ａｓ１ｌ消化によりプラスミ
ドＥＮＶ５９／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［Ａから得られる（
第６図）。
ラグメントはＰｖｕＩ［／Ａｓ１ｌ消化によりプラスミ
ドＥＮＶ５９／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［Ａから得られる（
第６図）。
Ｉ［Ａフラグメントはｇｐ４６タンパク質のアミノ酸２
６−１６５をコードする。４１９ｂｐフラグメントの５
’５ａｌｌ末端をフレノウ酵素を用いて充填しそしてプ
ラスミド５）ＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩ ＥＮＶ９３のた
だ１つしかない５ａｌＩ部位に挿入するためにｌＯママ
−ａｌｌリンカ−を連結した。発現されたＥＮＶ９３／
）ＩＴＬＶ−Ｉ−Ｉ［［Ａ融合タンパク質のヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列を第１３図に示す。２８Ｋｄ
のポリペプチドは２４９アミノ酸の長さである。
６−１６５をコードする。４１９ｂｐフラグメントの５
’５ａｌｌ末端をフレノウ酵素を用いて充填しそしてプ
ラスミド５）ＤＳ５６／ＲＢＳ ＩＩ ＥＮＶ９３のた
だ１つしかない５ａｌＩ部位に挿入するためにｌＯママ
−ａｌｌリンカ−を連結した。発現されたＥＮＶ９３／
）ＩＴＬＶ−Ｉ−Ｉ［［Ａ融合タンパク質のヌクレオチ
ドおよび推定アミノ酸配列を第１３図に示す。２８Ｋｄ
のポリペプチドは２４９アミノ酸の長さである。
実施例９
エンザイムイムノアッセイ （ＥＩＡ）精製ＨＴＬＶ−
Ｉ組換えタンパク質を０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝
液、ｐＨ９，５中で最終濃度１０μｇ／ｍｌでポリスチ
レンビーズ［直径ｈインチ（０，６３５センチメートル
）］に被覆した。被覆物を３７℃にて１８時間インキュ
ベートした。未結合タンパク質を脱イオン水で洗浄する
ことにより除去し、ビーズは３７°Ｃで乾燥させそして
４°Ｃにて乾燥保存した。ＨＴＬＶ−■陽性および陰性
血清は、４００μｌの試料希釈液（０，０２Ｍリン酸緩
衝食塩水、ｐＨ７，０中に２０％新生ウシ血清、０．５
％ツイーン２０．０．０１％ヤギＩｇＧ、０．０１％チ
メロサール、５ ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて１０μ！の
血清を反応チューブ中に分配することによりあらかじめ
希釈した。１個の被覆ビーズをチューブに添加しそして
３７℃で３０分間振盪器／インキュベーター中てインキ
ュベートした。未結合抗体を自動ビーズ洗浄機を用いて
脱イオン化水て洗浄することにより取り除いた。セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）て標識したヤギ抗ヒＩ□ ＩｇＧ ２
５０μｌを接合体希釈液（２０％ウシ胎児血清、０．０
４％４−アミノアンチピリン、ｌ ｏｔツイーン２０、
ｏ、 ｉ％（ｖ／ｖ） Ｋａｔｈｏｎを含有する０、１
Ｍ＋−リス−アセテート、ｐＨ７，３）でｌ ： ９０
００に希釈し、反応チューブに添加した。振盪器／イン
キュベーターで３７°Ｃにて１５分間インキュベートシ
た。遊離の接合体は脱イオン水で洗浄することにより除
去した。２５０μ！の基質溶液（０，０２％過酸化水素
、０．０１％Ｋａｔｈｏｎを含有する０゜１Ｍクエン酸
カリウムｐＨ５，２５中の２■／ ｍｌ ｏ−フェニレ
ンジアミン）を各チューブに添加し、室温で１５分間イ
ンキュベートシた。反応はＩＮ硫酸１ ｍｌを添加する
ことにより停止させた。４９２ｎｍての光学濃度をＣ０
ＢＡＳ ＲＥＳＡ光度計により測定した。ＨＴＬＶ−Ｉ
組換え融合タンパク質に関するＥＩＡ結果を第１４図に
示す。ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［＋ Ｉタンパ
ク質は検査した陽性血清試料で最大の反応性を示す。
Ｉ組換えタンパク質を０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝
液、ｐＨ９，５中で最終濃度１０μｇ／ｍｌでポリスチ
レンビーズ［直径ｈインチ（０，６３５センチメートル
）］に被覆した。被覆物を３７℃にて１８時間インキュ
ベートした。未結合タンパク質を脱イオン水で洗浄する
ことにより除去し、ビーズは３７°Ｃで乾燥させそして
４°Ｃにて乾燥保存した。ＨＴＬＶ−■陽性および陰性
血清は、４００μｌの試料希釈液（０，０２Ｍリン酸緩
衝食塩水、ｐＨ７，０中に２０％新生ウシ血清、０．５
％ツイーン２０．０．０１％ヤギＩｇＧ、０．０１％チ
メロサール、５ ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて１０μ！の
血清を反応チューブ中に分配することによりあらかじめ
希釈した。１個の被覆ビーズをチューブに添加しそして
３７℃で３０分間振盪器／インキュベーター中てインキ
ュベートした。未結合抗体を自動ビーズ洗浄機を用いて
脱イオン化水て洗浄することにより取り除いた。セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）て標識したヤギ抗ヒＩ□ ＩｇＧ ２
５０μｌを接合体希釈液（２０％ウシ胎児血清、０．０
４％４−アミノアンチピリン、ｌ ｏｔツイーン２０、
ｏ、 ｉ％（ｖ／ｖ） Ｋａｔｈｏｎを含有する０、１
Ｍ＋−リス−アセテート、ｐＨ７，３）でｌ ： ９０
００に希釈し、反応チューブに添加した。振盪器／イン
キュベーターで３７°Ｃにて１５分間インキュベートシ
た。遊離の接合体は脱イオン水で洗浄することにより除
去した。２５０μ！の基質溶液（０，０２％過酸化水素
、０．０１％Ｋａｔｈｏｎを含有する０゜１Ｍクエン酸
カリウムｐＨ５，２５中の２■／ ｍｌ ｏ−フェニレ
ンジアミン）を各チューブに添加し、室温で１５分間イ
ンキュベートシた。反応はＩＮ硫酸１ ｍｌを添加する
ことにより停止させた。４９２ｎｍての光学濃度をＣ０
ＢＡＳ ＲＥＳＡ光度計により測定した。ＨＴＬＶ−Ｉ
組換え融合タンパク質に関するＥＩＡ結果を第１４図に
示す。ＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ［＋ Ｉタンパ
ク質は検査した陽性血清試料で最大の反応性を示す。
第１図はＥＮＶ９３合成遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。 第２図はｌ、１の重複するオリゴヌクレオチドフラグメ
ントの段階的連結により構築されたＥＮＶ９３合成遺伝
子の組み立てを示す。 第３図はｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［のＢａｍ旧部位への
ＥＮＶ９３構築物の挿入を示す。 第４図はｐＤＳ５６．’ＲＢＳ Ｉｎベクターから発現
された組換えＥ＼Ｖ９３タンパク質のヌクレオチドおよ
び推定アミノ酸配列を示す。 第５図はＥ、コリ細胞Ｗ３１１０１．ＪＥ５５０５、お
よびＪＥ５５０６中におけるＨＴＬＶ−Ｉ ＥＮＶ９３
タンパク質発現を示す。 第６図はＨＴＬＶ−Ｉプロウィルスゲノムの構造を概要
的に示す。 第７図はＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ発現タンパク質を示
す。 第８図は発現されたＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ
Ｂ’組換えタンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列を示す。 第９図ハＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ融合タンパク
質ノヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。 第１Ｏ図＋ｔＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ ＋
Ｉ組換エンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推
定アミノ酸配列を示す。 第１１図はＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ組換えタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す
。 第１２図ハＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩＩ Ｍ合
タンハク質ノヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。 第１３図はＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＡ組換えエ
ンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列を示す。 第１４図は種々の１（ＴＬＶ−Ｉ組換えタンパク質の免
疫反応性を示す。
す。 第２図はｌ、１の重複するオリゴヌクレオチドフラグメ
ントの段階的連結により構築されたＥＮＶ９３合成遺伝
子の組み立てを示す。 第３図はｐＤＳ５６／ＲＢＳ Ｉ［のＢａｍ旧部位への
ＥＮＶ９３構築物の挿入を示す。 第４図はｐＤＳ５６．’ＲＢＳ Ｉｎベクターから発現
された組換えＥ＼Ｖ９３タンパク質のヌクレオチドおよ
び推定アミノ酸配列を示す。 第５図はＥ、コリ細胞Ｗ３１１０１．ＪＥ５５０５、お
よびＪＥ５５０６中におけるＨＴＬＶ−Ｉ ＥＮＶ９３
タンパク質発現を示す。 第６図はＨＴＬＶ−Ｉプロウィルスゲノムの構造を概要
的に示す。 第７図はＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ発現タンパク質を示
す。 第８図は発現されたＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ
Ｂ’組換えタンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列を示す。 第９図ハＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −Ｉ融合タンパク
質ノヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。 第１Ｏ図＋ｔＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ ＋
Ｉ組換エンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推
定アミノ酸配列を示す。 第１１図はＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩ組換えタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す
。 第１２図ハＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＩＩ Ｍ合
タンハク質ノヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。 第１３図はＥＮＶ９３／ＨＴＬＶ−Ｉ −ＩＡ組換えエ
ンベロープタンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列を示す。 第１４図は種々の１（ＴＬＶ−Ｉ組換えタンパク質の免
疫反応性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の免疫優性保存領域
からの少なくともひとつのエピトープを含有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列。 ２）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１のアミノ酸およそ３
４２−４３４に相当するポリペプチドをコードする請求
項１記載のヌクレオチド配列。 ３）下記式すなわち 【遺伝子配列が有ります】 を有する請求項２記載のヌクレオチド配列。 ４）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ４６およびｇｐ２１の少
なくともひとつのエピトープを含有するポリペプチドを
コードする第２のヌクレオチド配列に融合された、ＨＴ
ＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の免疫優性保存領域の少なく
ともひとつのエピトープを含有するポリペプチドをコー
ドする第１のヌクレオチド配列を含んでなるハイブリッ
ド遺伝子。 ５）第１のヌクレオチド配列がＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇ
ｐ２１のアミノ酸およそ３４２−４３４に相当するポリ
ペプチドをコードする請求項４記載の遺伝子。 ６）第２のヌクレオチド配列が下記： ｇｐ４６およびｇｐ２１（ I ）のアミノ酸３０８−４
４０、ｇｐ４６（II）のアミノ酸２０１−３０７、ｇｐ
４６およびｇｐ２１（II＋ I ）のアミノ酸２０１−４
４０、ｇｐ４６（III）のアミノ酸１−２００、 ｇｐ４６（IIIＡ）のアミノ酸２６−１６５、ｇｐ４６
（IIIＢ′）のアミノ酸１６６−２１６から成る群から
選択されたＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ４６およびｇｐ２
１ポリペプチドサブ配列をコードする請求項５記載の遺
伝子。 ７）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖの第２のヌクレオチド配列が下
記： ｇｐ４６およびｇｐ２１（ I ）のヌクレオチド６０９
９−６４９６、ｇｐ４６（II）のヌクレオチド５７７８
−６０９９、ｇｐ４６およびｇｐ２１（II＋ I ）のヌ
クレオチド５７７８−６４９６、ｇｐ４６（III）のヌ
クレオチド５１７９−５７７８、ｇｐ４６（IIIＡ）の
ヌクレオチド５２５４−５６７３、ｇｐ４６（IIIＢ′
）のヌクレオチド５６７３−５８２７から成る群から選
択される請求項６記載の遺伝子。 ８）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖのｇｐ２１領域の免疫優性保存
領域からの少なくともひとつのエピトープを含有するポ
リペプチド。 ９）エピトープがＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖのｇｐ２１領域の
アミノ酸３４２−４３４を含んで成る請求項８記載のポ
リペプチド。 １０）下記アミノ酸配列： 【遺伝子配列が有ります】 を有する請求項９記載のポリペプチド。 １１）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ４６およびｇｐ２１か
らの少なくともひとつのエピトープを含有する第２のア
ミノ酸配列に融合されたＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１
の免疫優性保存領域の少なくともひとつのエピトープを
含有する第１のアミノ酸配列を含んでなるハイブリッド
ポリペプチド。 １２）第２のアミノ酸配列が下記： ｇｐ４６およびｇｐ２１（ I ）のアミノ酸３０８−４
４０、ｇｐ４６（II）のアミノ酸２０１−３０７、ｇｐ
４６およびｇｐ２１（II＋ I ）のアミノ酸２０１−４
４０、ｇｐ４６（III）のアミノ酸１−２００、 ｇｐ４６（IIIＡ）のアミノ酸２０６−１６５、ｇｐ４
６（IIIＢ′）のアミノ酸１６６−２１６から成る群か
ら選択されるアミノ酸に相当する請求項１１記載のポリ
ペプチド。 １３）第２のアミノ酸配列がｇｐ４６およびｇｐ２１の
アミノ酸３０８−４４０に相当し、前記ポリペプチドが
下記式（ I ）： 【遺伝子配列が有ります】 を有する請求項１２記載のポリペプチド。 １４）第２のアミノ酸配列がｇｐ４６のアミノ酸２０１
−３０７に相当し、前記ポリペプチドが下記式（II）：
を有する請求項１２記載のポリペプチド。 １５）第２のアミノ酸配列がｇｐ４６およびｇｐ２１の
アミノ酸２０１−４４０に相当し、前記ポリペプチドが
下記式（II＋ I ）： 【遺伝子配列が有ります】 を有する請求項１２記載のポリペプチド。 １６）第２のアミノ酸配列がｇｐ４６のアミノ酸１−２
００に相当し、前記ポリペプチドが下記式（III）：【
遺伝子配列が有ります】 １７）第２のアミノ酸配列がｄｐ４６のアミノ酸２５−
１６５に相当し、前記ポリペプチドが下記式（IIIＡ）
：【遺伝子配列が有ります】 １８）第２のアミノ酸配列がｇｐ４６のアミノ酸１６６
−２１６に相当し、前記ポリペプチドが下記式（IIIＢ
′）：【遺伝子配列が有ります】 を有する請求項１２記載のポリペプチド。 １９） ａ）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の免疫優性保存領域
からの少なくともひとつのエピトープを含有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列、または ｂ）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ４６およびｇｐ２１から
の少なくともひとつのエピトープを含有するポリペプチ
ドをコードする第２のヌクレオチド配列に融合されたＨ
ＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の免疫優性保存領域からの
少なくともひとつのエピトープを含有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列、 から成る群から選択されたヌクレオチド配列を有する遺
伝子およびベクターを含んでなる組換えベクター。 ２０）単細胞宿主中で複製可能なプラスミドである請求
項１９記載のベクター。 ２１）Ｅ．コリ株中で複製可能な組換えベクター。 ２２） ａ）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の免疫優性保存領域
からの少なくともひとつのエピトープを含有するポリペ
プチド、または ｂ）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ４６およびｇｐ２１から
の少なくともひとつのエピトープを含有する第２のアミ
ノ酸配列に融合されたＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の
免疫優性保存領域からの少なくともひとつのエピトープ
を含有するアミノ酸配列を含んでなるハイブリッドポリ
ペプチド、 から成る群から選択されたポリペプチドをコードする遺
伝子およびベクターを含んでなる組換えベクターを含有
する単細胞宿主。 ２３）Ｅ．コリ細菌である請求項２２記載の宿主。 ２４） ａ）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の免疫優性保存領域
からの少なくともひとつのエピトープを含有するポリペ
プチド、 ｂ）ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ４６およびｇｐ２１から
の少なくともひとつのエピトープを含有する第２のアミ
ノ酸配列に融合されたＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ ｇｐ２１の
免疫優性保存領域からの少なくともひとつのエピトープ
を含有する第１のアミノ酸配列を含んでなるハイブリッ
ドポリペプチド、 から成る群から選択されたポリペプチドを生産する方法
であって、 前記のポリペプチドが発現されるような適切な増殖条件
下で前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含有する組換えベクターを含有する単細胞宿主を培養し
そして前記ポリペプチドを単離することを含んでなる方
法。 ２５）試験試料を本発明のポリペプチドと接触させてタ
ンパク質／抗体複合体を形成させそしてその複合体を検
出することを含んでなる、哺乳動物の体液中におけるＨ
ＴＬＶ−Ｉに対する抗体の検出法。 ２６）イムノアッセイである請求項２５記載の方法。 ２７）エンザイムイムノアッセイである請求項２６記載
の方法。 ２８）哺乳動物の体液中のＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を
検出することへの請求項８−１８のいずれかに記載のポ
リペプチドの使用。 ２９）請求項８−１８のいずれかに記載のポリペプチド
を容器中に含有する、哺乳動物の体液中におけるＨＴＬ
Ｖ−Ｉに対する抗体を検出するための試験キット。
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