JP2637278B2 - Ｈｔｌｖ―▲ｉ▼の合成エンベロープペプチド - Google Patents

Ｈｔｌｖ―▲ｉ▼の合成エンベロープペプチド

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JP2637278B2
JP2637278B2 JP2283591A JP28359190A JP2637278B2 JP 2637278 B2 JP2637278 B2 JP 2637278B2 JP 2283591 A JP2283591 A JP 2283591A JP 28359190 A JP28359190 A JP 28359190A JP 2637278 B2 JP2637278 B2 JP 2637278B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はHTLV−I gp21エンベロープタンパク質の免疫
優性保存領域からの少なくともひとつのエピトープをコ
ードする合成遺伝子、並びにこの合成遺伝子をHTLV−Ｉ
エンベロープタンパク質のgp46およびgp21領域からのひ
とつまたはそれ以上のエピトープをコードする他のヌク
レオチド配列と一緒に含有するハイブリッド遺伝子に関
する。また、相当するポリペプチド、前記遺伝子を含有
する組換えベクター、かかるベクターを含有する単細胞
宿主生物、該ペプチドを生産する方法、および本発明の
ポリペプチドを使用するHTLV−Ｉに対する抗体の検出法
も包含される。
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（HTLV−Ｉ）は、日本
のいくつかの地域、カリブ海、アフリカ、アメリカ合衆
国南東部、および南アメリカにおける地域流行性のＣ型
レトロウイルスである。日本では900万人の献血者のう
ち１％以上が血液スクリーニング以前にウイルスに感染
していると考えられており、そして沖縄の人口の35％も
が、感染している可能性がある（Swinbanks,Nature 32
3,384［1986］）。HTLV−Ｉは、成人Ｔ細胞白血病（AT
L）の病因で、T4ヘルパー細胞を主に冒す攻撃的白血病
である。ATL患者は主要なウイルスタンパク質に対する
抗体を産生し、そしてプロウイルスDNAが白血病細胞のD
NAに組み込まれて見出されうる。HTLV−Ｉプロウイルス
ゲノムの数多くが分子クローニングされており、そして
プロウイルスDNAのひとつの全ヌクレオチド配列が決定
されている（Seikiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80,3618
−3622［1983］）。HTLV−Ｉは、熱帯性痙性不全対麻
痺、HTLV−Ｉ関連ミエロパシーおよび多発性硬化症を包
含する数多くの神経障害と関連している。また、HTLV−
ＩはＢ細胞慢性リンパ性白血病の発病に間接的役割を果
たしている可能性がある。
HTLV−Ｉの伝染様式はAIDSの病院であるヒト免疫不全
ウイルス（HIV−１）のそれと類似する。HTLV−Ｉの伝
染は性的接触、抗体陽性血液および血液成分の輸血を通
して、および麻薬乱用者の間で汚染された針を共用する
ことにより起こりうる。このウイルスは胎盤を通して、
または母乳中の感染リンパ球の移行を通して母から子へ
移行しうる。HIV−１およびHTLV−Ｉの伝染様式におけ
る明白な類似性はHIV−１感染のおそれのある人々はま
たHTLV−Ｉ感染のおそれもあることを示していよう。HT
LV−Ｉに対する抗体を有するエイズ患者に関する多くの
報告がある。その人々の中でHTLV−Ｉ感染の罹患率は、
またかなり低い（１％以下）が、このウイルスは静脈注
射を用いる麻薬使用者の間では表面化している。さら
に、この集団においてはヒトＴ細胞白血病ウイルスII型
（HTLV−II）血清陽性の発生率が高いことが報告されて
いる。
HTLI−IIはHTLV−Ｉと密接に関連しており（交差反応
抗原）、ヘアリーセル（hairy cell）白血病患者から最
初に単離された。アメリカ合衆国の献血者中のHTLV−Ｉ
感染の血清罹患率に関するWilliamsおよび共同研究者た
ち（1988）による研究は、アメリカ合衆国の地理的に異
なる８地域における無作為献血者の0.025％がHTLV−Ｉ
感染の血清学的証拠を示したことを明らかにしている。
HTLV−Ｉ感染のこの罹患率に基づいて、研究者らは、毎
年約2,800人の受血者の感染を予測している。
アメリカ赤十字は、国の血液供給を防御し、そしてHT
LV−Ｉ感染のまん延をくい止めるために1988年12月にHT
LV−Ｉに関し献血のスクリーニングを開始した。この抗
体スクリーニング検査は、ヒトＴ細胞系中で増殖し、破
壊されたウイルスの半精製物をイムノアッセイ法におけ
る試験抗原としてとり込んでいる。HIV−１スクリーニ
ング検査のひとつに高率の偽陽性があることにより証明
されるように、ウイルス溶解物アッセイには固有の問題
がある。
試験抗原として組換えタンパク質を使用することに関
し、HTLV−Ｉ抗体スクリーニングアッセイに組み込むた
めにHTLV−Ｉ抗原を調製するのに組換えDNA技法を利用
することが望ましいゆえに、現在利用されているウイル
ス溶解物検査より感度および特異性が高いイムノアッセ
イの設計に至るべきである。
したがって本発明は、下記のことから成る、すなわ
ち、 −HTLV−Ｉエンベロープタンパク質（HTLV−I env）のg
p21領域の免疫優性保存領域からの少なくともひとつの
エピトープを含有するポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列。
−HTLV−I envのgp46およびgp21からの少なくともひと
つのエピトープを含有するポリペプチドをコードする第
２のヌクレオチド配列に融合された、HTLV−I envのgp2
1の免疫優性保存領域からの少なくともひとつのエプト
ープを含有するポリペプチドをコードする第１のヌクレ
オチド配列を含んでなるハイブリッド遺伝子。
−本発明のヌクレオチド配列に相当するポリペプチド。
−本発明のヌクレオチド配列を含有する組換えベクタ
ー。
−本発明のヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクタ
ーを含有する単細胞宿主生物。
−相当するハイブリッドタンパク質を産生するに適切な
条件下で組換えベクターを含有する単細胞宿主を利用す
ることにより本発明のポリペプチドを生産する方法。
−抗原として本発明のポリペプチドを使用することを含
んでなるHTLV−Ｉエンベロープタンパク質に対する抗体
の検出法。
図面の説明 第１図:ENV93合成遺伝子のヌクレオチド配列を示す。上
のストランドはコード配列を示す。このアミノ酸配列は
gp21膜貫通領域内のHTLV−Ｉエンベロープポリペプチド
のアミノ酸342−434に相当する。高レベルで発現される
E.コリ遺伝子において優先的に使用されるコドン中に転
位された真正プロウイルスDNA配列。BamH I付着端は、p
DS56/RBS II発現ベクターの唯一のBamH I部位への挿入
を容易にするために構築物の５′末端に組み込んだ。矢
じりは最終産物に到達するために４ブロックにアニーリ
ングされ連結されたオリゴヌクレオチド１−14の輪郭を
表す。
第２図:14の重複するオリゴヌクレオチドフラグメント
の段階的連結により構築されたENV93合成遺伝子の組み
立てを示す。遺伝子は４ブロックに分割された。すなわ
ちブロック1:オリゴ１、２、８、9;ブロック2:オリゴ
３、４、10、11;ブロック3:オリゴ５、６、12、13;ブロ
ック4:オリゴ７、14。５′末端フラグメント１および14
を除く全てのオリゴヌクレオチドの５′末端部はリン酸
化した。初めには、各ブロックを含有するオリゴヌクレ
オチドをアニールおよび連結した。次にブロックを相互
にアニーリングおよび連結させてENV93最終産物を生成
させた。矢じりは、ブロックを形成する14オリゴヌクレ
オチドの境界を示す。二本鎖の５′末端（オリゴ１およ
び14）は、所望のクローニングベクターへの挿入を容易
にするためにリン酸化した。
第３図:pDS56/RBS IIのBamH I部位へのENV93構築物の挿
入を示す。ベクターpDS56/RBS II（Stueberら、EMBO J.
3,3143−3148［1984］）がE.コリ中で外来遺伝子を発現
させるために操作される。ポリリンカークローニング領
域は調節可能なプロモーター／オペレーターエレメント
P/02（コリファージT5プロモーターおよびE.コリ lacオ
ペレーターの融合物）およびラムダtoターミネーターに
よりはさまれている。２つのE.コリ指示遺伝子が存在す
る、すなわち、それ自身のプロモーターおよびアンピシ
リン耐性を付与するリボソーム結合部位を有するbla
（ベーターラクタマーゼ）、およびその真正のリボソー
ム結合部位を有するcat（クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ）である。pBR322由来のプラスミ
ドの複製起点中へのcatの読過し転写を阻止するため
に、cat遺伝子の下流にrrnBオペロンのt1ターミネータ
ーが続いている。ポリリンカー部位のすぐ上流に、合成
リボソーム結合部位RBS IIといっしょにATG開始コドン
が備えられている。pDS56/RBS II発現系は、外来DNAの
３個の読み取り枠全てが発現されるのを可能にするATG
コドンに隣接して、塩基の数で相異する３種のベクター
から成っている。これらのベクターは、適合するプラス
ミドpDMI−１を収容するE.コリ細胞中においてのみ安定
して維持され得る。pDMI−１はlacリプレッサーを過剰
生産し、そしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
遺伝子の発現を通してカナマイシンへの耐性を付与す
る。
第４図:pDS56/RBS IIベクターから発現された組換えENV
93タンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を
示す。翻訳されたタンパク質は106アミノ酸の長さであ
る。アミノおよびカルボキシ末端で下線したアミノ酸は
ベクター配列に由来する。タンパク質の残りは、HTLV−
Ｉウイルスのgp21膜貫通エンベロープタンパク質のアミ
ノ酸342−434に相当する93アミノ酸である。
第５図:E.コリ細胞W3110、JE5505、およびJE5506中にお
けるHTLV−I ENV93タンパク質発現を示す。０時間目、
誘導２時間後、誘導４時間後および誘導なしで４時間の
細菌培養物由来の全細胞溶解物を12％ポリアクリルアミ
ド/SDSで電気泳動しクーマーシーブルーR250で染色し
た。矢じりはIPTG誘導試料中にのみ存在する約12KdのEN
V93タンパク質の位置を示す。
第６図:HTLV−Ｉプロウイルスゲノムの構造を概要的に
示す。ゲノムの完全なヌクレオチド配列は上記Seikiら
により決定された。エンベロープコード領域を拡大し
て、gp46およびgp21ドメイン内の制限部位のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸位置を示す。ENV93合成遺伝子構築物
の地図上の位置を示す。示した制限部位は、コード領域
のほぼ全体を包含するエンペロープフラグメントIII、I
II A、III B′、II、Ｉ、およびII＋Ｉを生成させるの
に使用した。各フラグメント中のアミノ酸の数はフラグ
メントのすぐ上に示す。これらのDNA断片は、コードさ
れたエピトープをENV93融合タンパク質として高レベル
で発現させるためにpDS56/RBS IIベクター中のENV93の
下流にクローン化した。
第７図:HTLV−Ｉエンベロープ発現タンパク質を示す。
エンベロープコードの配列の種々の領域をpDS56/RBS II
発現ベクター中のENV93合成遺伝子の下流に連結した。
組換え融合タンパク質がE.コリ中で発現され、そしてEI
A中で最大の反応性を有するこれらのタンパク質が示さ
れる。
第８図：発現されたENV93/HTLV−Ｉ−III B′組換えタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。このタンパク質は158アミノ酸の長さである。下線
を付した残基は、構築物を生成させるのに使用したベク
ター配列またはリンカー配列から生じた。
第９図:ENV93/HTLV−Ｉ−Ｉ融合タンパク質のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列を示す。このポリペプチド
は245アミノ酸である。下線したアミノ酸残基は、HTLV
−Ｉエンベロープ配列中には表われない。これらの関連
のない配列はベクター特異的であるかまたはこのDNA構
築物を生成させるのに使用された合成リンカーによりコ
ードされたものである。
第10図:ENV93/HTLV−Ｉ−II＋Ｉ組換えエンベロープタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。このポリペプチドは344アミノ酸の長さである。下
線した非特異的残基はベクター配列によりコードされ
る。
第11図:ENV93/HTLV−Ｉ−II組換えタンパク質のヌクレ
オチドおよび推定アミノ酸配列を示す。このタンパク質
は217アミノ酸の長さである。下線した基は、ベクター
配列によるかまたは構築物を生成させるのに使用された
合成リンカーによりコードされる。
第12図:ENV93/HTLV−Ｉ−III融合タンパク質のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列を示す。このポリペプチド
は315アミノ酸の長さである。下線した非特異的残基は
ベクターまたは合成リンカー配列によりコードされる。
第13図:ENV93/HTLV−Ｉ−III A組換えエンベロープタン
パク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
このタンパク質は249アミノ酸の長さである。下線した
残基はベクターまたは合成リンカー配列によるものであ
る。
第14図：種々のHTLV−Ｉ組換えタンパク質の免疫反応性
を示す。OD492値をENV93/HTLV−Ｉ−Ｉ、ENV93/HTLV−
Ｉ−IIおよびENV93/HTLV−Ｉ−II＋Ｉについて示す。HT
LV−Ｉ陽性標品はBoston Biomedical,Inc.（BBI）から
得、そして陰性製品はWestern States Plasma Company,
Inc（WSP）から購入した。標品番号6595および9100は、
反応性の高い陽性対照である。
本発明の方法は、論理的順序では下記を包含する多数
の工程を必要とする。すなわち（１）本発明の遺伝子構
築物をコードする遺伝子の調製、（２）遺伝子構築物を
含有する組換えベクターを生成させるのに適切なクロー
ニングビークル中へのこれら遺伝子の挿入、（３）適合
する宿主生物への組換えクローニングビークルの移転、
（４）挿入された遺伝子配列を発現できる、かかる改変
された宿主の選択および増殖、（５）遺伝子産物の同定
および精製、および（６）HTLV−に対する抗原を検出す
るための遺伝子産物の使用である。
1.遺伝子の調製 本発明の第１番目の遺伝子構築物は、HTLV−I envのg
p21領域の免疫優性保存領域からの少なくともひとつの
エピトープを含有するポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を構成する。HTLV−Ｉゲノムの全ヌクレオチ
ド配列は決定されている（上記Seikiら）。免疫優性保
存領域からの少なくともひとつのエピトープをコードす
るこの配列の任意の部分が本発明の遺伝子構築物に好適
であろう。しかしながら、本発明の好ましい実施態様を
構築するのに使用された、Env（93）で示されるヌクレ
オチドがHTLV−Ｉエンベロープのアミノ酸342−434に相
当する（Seikiに従い番号を付けた）のが好ましい。こ
のヌクレオチド配列はDNAシンセサイザーを使用する化
学合成のような当業上よく知られた方法により構築でき
る（Certaら、EMBO J.5,3051−3056［1986］）。また適
切なヌクレオチド配列はYoshidaら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.79,2031−2035［1982］およびPoieszら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA.77,7415−7419［1980］に記載されるH
TLV−Ｉビリオンによりウイルス形質転換されたヒトＴ
細胞系からも得られうる。次にDNAフラグメントが当業
上知られた方法により単離され、cDNAライブラリーが構
築されそしてcDNAライブラリーを探査することにより所
望のエンベロープ遺伝子フラグメントを得ることができ
る。HTLV−ＩエンベロープフラグメントはまたManzari
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80,1574−1578［1983］お
よびヨーロッパ特許出願公開番号181 107に記載され
る、HTLV−ＩのEnv.pX.およびLTRを含有するdCRXlで示
されるプラスミドのようなプラスミドからも得ることが
できる。
本発明の好ましい実施態様においては、HTLV−Ｉエン
ベロープのアミノ酸342−434に相当するヌクレオチド配
列は化学的合成法により作られた。合成を容易にするた
めに、遺伝子配列をDNAシンセサイザーで構築されたオ
リゴヌクレオチドフラグメントに小分けする。次に一本
鎖DNAフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動
の後ゲルから単離した。続いてヌクレオチド配列を段階
的連結により組み立ててEnv（93）で示される遺伝子構
築物を生成させた。
ENV（93）遺伝子構築物の有用性は、それを単独で、
または融合タンパク質としてHTLV−Ｉの他のエピトープ
の高レベル発現のための便利なビークルとして使用でき
ることである。ENV（93）をビークルとして使用する場
合、このものはHTLV−Ｉエンベロープタンパク質のgp46
およびgp21領域からのひとつまたはそれ以上のエピトー
プをコードするヌクレオチド配列に融合されたEnv（9
3）を含有するハイブリッド遺伝子の一部分として使用
される。例えば、本発明の好ましい実施態様において
は、ENV（93）は第６および第７図に示されるgp46およ
びgp21領域内に該当する種々のサブ配列に融合される。
また本発明は、HTLV−I envの下記の部分に融合されたE
NV（93）からなるこれらハイブリッド遺伝子にも関す
る： ヌクレオチド6099−6496（Ｉ） ヌクレオチド5778−6099（II） ヌクレオチド5179−5778（III） ヌクレオチド5254−5673（III A） ヌクレオチド5778−6496（II＋Ｉ） ヌクレオチド5673−5778（III B′） 生成するハイブリッド遺伝子（推定アミノ酸配列は下
に記載）は次のとおりである。
ENV（93）HTLV−Ｉ−I:第９図に記載 ENV（93）HTLV−Ｉ−II:第11図に記載 ENV（93）HTLV−Ｉ−II＋I:第10図に記載 ENV（93）HTLV−Ｉ−III:第12図に記載 ENV（93）HTLV−Ｉ−III A:第13図に記載 ENV（93）HTLV−Ｉ−III B′：第８図に記載 2.ポリペプチドの調製 本発明はまた、前記遺伝子構築物に相当するポリペプ
チドをも包含する。これらポリペプチドは固相または液
相合成ならびに組換え生産のような当業者によく知られ
た合成法により作られうる。組換え法では、遺伝子構築
物はプラスミドまたはファージ起源の適切なベクターに
挿入される。プラスミドまたはファージ起源の好都合な
発現ベクターは、例えば実験室マニュアル“Molecular
Cloning",Maniatisら、Cold Spring Harbor Labo−rato
ry,1982に記載されている。
本発明の好ましい実施態様においては、ポリペプチド
はHTLV−I envのgp21領域の免疫優性保存領域からの少
なくもひとつのエピトープ、好ましくは第４図に示され
るアミノ酸配列を有するHTLV−I envのgp21領域のアミ
ノ酸342−434（Env93）に相当する。
ENV93ポリペプチドは単独でまたはハイブリッドポリ
ペプチドまたは融合タンパク質の一部分として使用でき
る。ハイブリッドポリペプチドの一部分として使用され
る場合、HTLV−I envの免疫優性保存領域からの少なく
ともひとつのエピトープに相当する第１の配列をHTLV−
I envのgp46およびgp21領域からのひとつまたはそれ以
上のエピトープをコードする第２のアミノ酸配列に融合
させる。好ましい実施態様においてはENV93は、下記に
示されるgp46およびgp21領域内に該当する種々のサブ配
列に融合される； ａ）gp46およびgp21（Ｉ）のアミノ酸308−440 ｂ）gp46（II）のアミノ酸201−307 ｃ）gp46およびgp21（II＋Ｉ）のアミノ酸201−440 ｄ）gp46（III）のアミノ酸１−200 ｅ）gp46（III A）のアミノ酸26−165 ｆ）gp46（III B′）のアミノ酸166−216 これらの配列は第４、８、９、10、11、12、13図に示
される。
タンパク質の生物学的活性を実質的に変化させないア
ミノ酸置換が当業上知られており、そして例えばH.Neur
athおよびR.L.Hillの“The Proteins",Academic Press,
New York［1979］に記載されている。最も高頻度に観察
されるアミノ酸置換は、Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/
Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Ph
e,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,
Asp/Gly, およびそれらの逆である。かかる置換を含有する任意
のポリペプチドは本発明の範囲内にあるものと考えられ
る。
3.ENV（93）構築物を含有する組換えベクターの調製 本発明の好ましい実施態様においては、Env（93）遺
伝子構築物がE.コリ中に外来遺伝子を発現させるために
遺伝子工学的に作製されたベクター、すなわちベクター
pDS56/RBS II（Stueberら、前出）に挿入される。第３
図およびその説明文はこの過程を詳細に示している。し
かしながら、他のベクター例えばプラスミドpDS8/RBS I
IまたはプラスミドpA−env−20が好適でありうる。これ
らのプラスミドを含有するE.コリ株はDeutsche Sammlun
gvon Microorganisms（DMS）から自由に入手可能であ
り、それらの受託番号はそれぞれDSM3519およびDSM3516
である。種々の他の組換えベクターおよび単細胞宿主
は、それらが本発明のポリペプチドの発現を促進するか
ぎり好適である。
4.本発明のペプチドを生産する方法 本発明のペプチドを生産する方法は、図面および実施
例において詳細に説明されており、そして一般に相当す
るハイブリッドタンパク質を生産するための適切な条件
の下で組換えベクターを含有する単細胞宿主を培養する
ことからなる。
5.HTLV−Ｉエンベロープタンパク質に対する抗体検出法 組換えウイルスタンパク質に基づくHTLV−Ｉに対する
抗体スクリーニング検査の開発は、１）免疫優性でウイ
ルス単離物中に保存されているエピトープ（類）の選
択;2）好適なベクター／宿主系におけるエピトープの高
レベル発現；および３）組換えタンパク質を産生する宿
主からの均質で多量の組換えタンパク質の精製、を必要
とする。この目的を達成するために、gp21領域内のHTLV
−Ｉエンベロープタンパク質のアミノ酸342−434をコー
ドするENV（93）を化学的および酵素的方法により合成
した。このエンベロープの領域を選択したのは、HIV−
１エンベロープの対応する領域（gp41）が数多く保存さ
れ、免疫反応性のエピトープを含有するからである（Wa
ngら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83,6159−6163［198
6］;Gnannら、J.Virol.,61,2639−2641［1987］および
J.Infect.Dis.156,261−267［1987］。さらに膜貫通ド
メインにおけるHTLV−ＩおよびHIV−１エンベロープポ
リペプチド両方のヒドロパシシティ（hydropathicity）
プロフィールが類似パターンを示し、このことはHTLV−
Ｉエンベロープのこの領域が免疫反応において重量であ
りうることを示している。エンベロープタンパク質のア
ミノ酸342−434をコードする真正ヌクレオチド配列は、
E.コリタンパク質の翻訳に時たま使用されるコドンがE.
コリ翻訳機構に好まれるコドンにより置換されるように
変化させた（Ikemura,J.Mol.Biol.146,1−21［1981］;G
rosjeanおよびFiers,Gene 18,199−209［1982］。この
方法は細菌性宿主中におけるENV93エピトープの発現を
最大にするという希望から採用された。E.コリ中でコー
ドされたエピトープの高レベル発現を生じるHIV−１合
成遺伝子の構築に類似の方法が採られた（Certaら、上
記）。
本発明のポリペプチドは、当業上よく知られた方法に
従いHTLV−Ｉに対する抗体を検出するための診断試薬と
して使用できる。
例えばウェスタンブロット分析（Towbinら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.76,4350−4354［1979］が好適であろ
う。この技術によれば、本発明のポリペプチドはSDS−
ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙に電気
泳動で移される。このニトロセルロース紙を次に検査す
べき血清で処理する。洗浄後、ニトロセルロース紙を続
いてペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgGで処理する。続い
てペルオキシダーゼを好適な基質例えばｏ−フェニレン
ジアミンを用いて測定する。もちろん放射性または蛍光
標識のような他の標識も使用できる。
本発明のポリペプチドを使用するHTLV−Ｉに対する抗
体を測定するためのさらに好都合な技術は酵素結合イム
ノソルベントアッセイ（ELISA）である。かかるアッセ
イは以下のことを含んでなる、すなわち （ａ） 本発明のポリペプチドを固形支持体に固定化
し、 （ｂ） HTLV−Ｉに対する抗体を含有することが疑われ
るヒト血清試料を工程（ａ）の固定化されたポリペプチ
ドと接触させ、そして固定化されたポリペプチド−抗体
複合体と形成させ、 （ｃ） 工程（ｂ）の複合体からすべての未結合物質を
洗い去り、そして （ｄ） ヒト抗体を選択的に検出できる、標識した試薬
例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco
ccus aureus）プロテインＡまたは抗ヒトIgGを添加する
ことによりかかる複合体を検出し、それにより血清中に
おけるHTLV−Ｉウイルスに対する抗体の存在を示す。
好適な固形支持体は検査容器の内壁（試験管、タイタ
ープレート、キュベットまたはガラスまたは人工物質）
ならびに固形物体の表面（ガラスおよび人工物質の棒、
末端が太くなっている棒、末端にたぶまたは薄板がつい
てくる棒）である。ガラスまたは人工物質のビーズはと
りわけ好適な固相担体である。
有用な標識は試薬とその結合相手との結合を妨害しな
い任意の検出可能な官能物である。多数の標識がELISA
アッセイおよび他のイムノアッセイでの使用に知られて
いる。例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、14Cお
よび131Iのような放射性同位体、希土類キレートまたは
フルオレセインのような発蛍光団、スピンラベル等であ
る。
本発明の好ましい実施態様においては、ELISA（EIA）
アッセイは実施例９に記載されるようにビーズ上に固定
化された本発明のポリペプチドを用いて操作する。
本発明のポリペプチドを用いるHTLV−Ｉに対する抗体
のもうひとつの好適な測定法は、いわゆる“二重抗原サ
ンドイッチ法”による酵素免疫学的１査である。この方
法はMaioliniのImmunological Methods 20,25−34［197
8］の研究に基づいている。この方法によると、検査す
べき血清を本発明のポリペプチドが被覆されている前記
定義した固形支持体、およびペルオキシダーゼで標識さ
れた本発明のポリペプチドと接触させる。この免疫学的
反応は１工程または２工程で行うことができる。もし免
疫学的反応が２工程で行なわれる場合は、洗浄工程はそ
の２回のインキュベーションの間に行なわれる。免疫学
的反応（類）の後、洗浄工程を行う。そのあとペルオキ
シダーゼをｏ−フェニレンジアミンのような基質を用い
て測定する。本発明を、説明目的でのみ記載されている
下記の実施例と関連して、さらに記載する。
前記したHTLV−Ｉに対する抗体の測定方法は、容器中
に本発明のポリペプチドを含有する好適な検査キットで
行うことができる。
実施例１ ENV93オリゴヌクレオチドの合成 合成遺伝子を、12−14ヌクレオチドの一本鎖重複が得
られるような方法で14個のオリゴヌクレオチドフラグメ
ント（第１および２図）に小分けした。生成するフラメ
ントは30−46塩基の長さであった。個々のオリゴヌクレ
オチドは、誘導体化された調節された細孔ガラスを固形
支持体として使用してMilliGen 7500およびApplied Bio
systems 380 DNAシンセサイザーで構築した。一本鎖DNA
フラグメントを7M尿素を含有する12％ポリアクリルアミ
ドゲルから単離し、そしてSep−Pak C18カートリッジ
（Waters Associates/Millipore）で脱塩した。DNA濃度
は分光光度計で260nmでのUV吸収を計測することにより
測定した。
実施例２ EMV93遺伝子の組立て オリゴヌクレオチド２−13の２マイクログラム（150p
モル）ずつを10mM MgCl2、5mM DTT、0.1mMスペルミジ
ン、0.1mM EDTA、0.1mM ATP、0.21pモル−32P−ATP（3,
000Ci/mモル）を含有する50mMトリス−HCl、pH7.5およ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼの５単位（New England
Biolabs）からなる別々の50μ反応物中でキナーゼ処
理した。反応物を37℃で40分間、続いてキナーゼを不活
性化するために70℃で10分間インキュベートした。各反
応物中においてとり込まれなかった放射能をＧ−50セフ
ァデックスカラムクロマトグラフィーにより除去した。
５′末端フラグメントであるオリゴヌクレオチド１およ
び14は続くアニーリングおよび連結反応中にポリマーが
形成されるのを防ぐためにリン酸化しなかった。リン酸
化したオリゴヌクレオチド２−13を真空下で乾燥しそし
てDTTおよびATPを含まない連結緩衝液（10mM MgCl2を含
有する50mM トリス−HCl、pH7.5）20μ中に再懸濁し
た。実際の遺伝子構築には10μ（１μ）を取った。
末端フラグメント１および14の１μｇを凍結乾燥しそし
て同じ連結緩衝液の10μ中に再懸濁した。
ENV93合成遺伝子を段階的連結により組立てた。オリ
ゴヌクレオチドを２分間煮沸し、エッペンドルフ微量遠
心管で遠心沈降しそして室温で５分間さました。続いて
10μの試料を第２図に示されるように結合させてブロ
ック１−４を形成させた。これらブロックを２分間煮
沸、微量遠心管で遠心しそして室温で５分間さました。
これらブロックを37℃で５分間インキュベートしそして
室温で10分間さました。２×連結緩衝液（10mM MgCl2、
20mM DDTおよび2mM ATPを含有する50mM トリス−HCl、p
H7.5）の同量を、アニールしたオリゴヌクレオチドを含
有する各ブロックに添加した。T4DNAリガーゼ（New Eng
land Biolabs）の400−800単位を各ブロック連結物に添
加し、反応物（連結反応第１）を14℃で16時間インキュ
ベートした。リガーゼはEDTAが最終濃度10mMになるまで
添加することにより不活性化させた。
各連結反応物の1/10をとり出して7M尿素を含有する10
％ポリアクリルアミドゲルで分析した。連結反応物を0.
3M NaOAc、pH5.2を含有するように調整しそして同量の
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（2
5:24:1）で抽出した。エーテル抽出につづいて、MgCl2
を10mMになるように添加し、連結産物を２倍量の100％
エタノールで沈降させた。エタノールペレットを遠心に
より回収し、70％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥し
そして10mM MgCl2を含有する50mMトリス−HCl、pH7.5の
10μ中に再懸濁した。次の工程は12−14塩基対の重複
を用いて４ブロックをアニールさせることであった（第
２図）。ブロックを37℃で10分間インキュベートし、室
温にて５分間さました。ブロックは単一のチューブ中で
混合し、37℃で10分間インキュベートした。チューブを
14℃になるまで30分間ゆっくりとさました。２×連結混
合物の同量およびT4 DNAリガーゼ（New England Biolab
s）800単位を添加しそして反応を14℃にて16時間維持し
た（連結反応第２）。リガーゼを不活性化するためにED
TAを10mMとなるまで添加した。283bp BamH Iフラグメン
トを0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する４％N
usieve GTGアガロース/TAEミニゲルでの電気泳動により
精製した。一番上のバンドを切り出し、アガロースを65
℃にて融解させた後、フラグメントをフェノールおよび
エーテル抽出した。DNAをエタノール沈降させ、回収し
たペレットを70％エタノールで洗浄しそして真空下で乾
燥した。
実施例３ ENV93のpUC18中へのクローニング ENV93構築物の配列を証明するために、フラグメント
を最初にpUC18配列決定ベクター（Yanisch−Perronら、
Gene33,103−119［1985］）のただひとつしかないBamH
I部位にクローン化した。
ENV93DNAペレット（250ng）を蒸留水中に再懸濁し、5
0mMトリス−HCl、pH7.5（10mM MgCl2、5mM DTT、0.1mM
スペルミジン、20μM ATP）および９単位のT4ポリヌク
レオチドキナーゼを含有する20μ反応物中でキナーゼ
処理した。キナーゼ反応物を37℃にて40分間インキュベ
ートした。キナーゼ酵素を70℃で15分間熱不活性化し
た。ENV93DNAを含有する反応物を蒸留水中1:5に希釈し
た。ENV93DNA5ngを脱リン酸化したベクターの50ng（1:1
モル比率）と14℃で16時間連結した。反応物を10mM EDT
Aに調整し70℃で15分間加熱した。コンピテントなE.コ
リRR1細胞（ATCC No.31343）をこの混合物で形質転換し
そしてアンピシリン耐性コロニーを得た。BamH I消化に
基づけばENV93構築物を含有すると思われる形質転換体
をジデオキシ配列決定にかけた。ポリリンカークローニ
ング部位のすぐ外側の、ベクターの反対側ストランドに
ハイブリッド形成するM13ユニバーサル配列決定プライ
マーをPromegaジデオキシ配列決定系と共に最初に使用
して挿入物の両ストランドに関する配列情報を生成させ
た。ENV93特異的な付加的な17マー プライマーが、ENV
93二本鎖の両ストランドの配列を完成させるのに必要で
あった。正しいENV93構築物を有するクローンの挿入物
を発現ベクター中に連結用にゲル精製した。
実施例４ ENV93のpDS56/RBS II中へのクローニング ENV93合成遺伝子を第３図に概略して示すようにしてp
DS56/RBS II発現ベクター（Stueberら、上記）の適切な
読み取り枠のBamH I部位に直接連結した。ベクターをBa
mH Iで直線状となし、脱リン酸化し、0.7％アガロース/
TAEミニゲルでの電気泳動によりpDMI−１適合プラスミ
ドから単離した。DNAをアガロースから精製した。挿入
物の5ngを20μ反応物中の60ngのベクター（1:1モル
比）に連結し、14℃で16時間維持した。連結混合物の半
分を用いてコンピテントなE.コリW3110細胞（ATCC No.2
7325）を形質転換した。アンピシリン／カナマイシン耐
性クローンのDNAを、タンパク質発現にとって正しい方
向で発現ベクター中に連結されたENV93挿入物の存在に
関して制限酵素消化によりスクリーニングした。多数の
陽性クローンを同定しそしてそれらのうちのひとつのDN
Aを、E.コリ株JE5505およびJE5506（Hirotaら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA.74,1417−1420［1977］）の形質転換
に使用した。
ENV93エピトープをpDS56/RBS IIベクター中に挿入す
ると106アミノ酸の組換えタンパク質が翻訳される。推
定アミノ酸配列およびENV93構築物から発現された実際
のタンパク質をコードするヌクレオチドを第４図に示
す。HTLV−Ｉゲノムにより特定されていないタンパク質
のＮ末端の３アミノ酸およびＣ末端の10アミノ酸はベク
ター配列からのものである。
実施例５ ENV93エピトープのE.コリ中における発現 組換えタンパク質の発現は上記Certaらにより記載さ
れているものを改変し、活発に増殖している細菌培養物
をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）で
誘導することにより達成した。E.コリ培養物を37℃にて
0D600が0.6−0.7になるまで増殖させた（時間０）。こ
の時点において1mlの部分量を採取した。培養物を２個
のフラスコおよび１個のフラスコに分割し、IPTGを0.5m
Mになるまで添加した。培養物を37℃でインキュベート
しそして誘導２時間後および４時間後に1mlずつ部分量
を採取した。細菌細胞を遠心分離により収集し溶菌緩衝
液（10％グリセロール、２％SDS、0.1％BPB、1.25％ 2
−メルカプトエタノールを含有する125mMトリス−HCl、
pH6.8）中に懸濁した。Laemmli,Nature277,680−685［1
970］）に記載の不連続緩衝液系を使用して、同量の全
細胞溶解物を12％ポリアクリルアミド/SDSゲルで電気泳
動した。ゲルに負荷する前に、煮沸により試料を変性さ
せた。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーR250
で染色することにより可視化した。第５図はプラスミド
pDS56/RBS II ENV93を収容する３種のE.コリ宿主株中の
ENV93組換えタンパク質の発現を示す。12KdのENV93のポ
リペプチドは検査したE.コリ株中に種々のレベルで発現
される。JE5506宿主は最高レベルのENV93を生産する
が、W3110宿主中ではENV93はクマシー染色によっては、
ほとんど検出されない。
実施例６ 組換えENV93タンパク質の精製 組換えタンパク質はManneら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.82,376−380［1985］の改変法に従い精製した。500ml
細菌培養物の誘導された細胞ペレットを緩衝液１（2mM
EDTA、1mM DTTを含有する10mMトリス−HCl、pH8）25ml
中に再懸濁した。この溶液を４℃で10分間、12,000×ｇ
で遠心分離した。ペレットを緩衝液１の10ml中に再懸濁
した。リゾチームを0.75mg/mlとなるまで添加しそして
懸濁物を37℃で15分間インキューベートした。MgCl2を2
3mMとなるまで添加し、4.5mgのDNアーゼＩを添加した。
この懸濁物を37℃で30分間維持した。25mlの緩衝液２
（1mM DTTを含有する10mMトリス−HCl、pH8）を添加
し、溶解物を12,000×ｇで４℃で10分間遠心分離した。
ペレットを緩衝液２の25mlで洗浄しそして４℃にて10分
間、12,000×ｇで遠心分離した。ペレットを25mlの緩衝
液３（1mM DTT、0.15M NaCl、0.5％トリトンＸ−100を
含有する10mMトリス−HCl、pH8）中に再懸濁した。この
溶液を０℃で15分間、37℃で30分間そして０℃で15分間
保持した。この試料を４℃にて10分間、12,000×ｇで遠
心分離した。ペレットを25mlの緩衝液２で洗浄し、遠心
分離により収集した。ペレットを0.2mlの緩衝液２中に
再懸濁しそして3.8mlの緩衝液４（7M GuHCl、5mM DTTを
含有する10mMトリス−HCl、pH8）を添加することにより
可溶化した。不溶性物質を遠心分離により取り除いた。
上清を緩衝液６（5mM DTTを含有する10mMトリス−HCl、
pH8）で1:15に希釈し、室温にて10分間インキュベート
してタンパク質を沈降させた。タンパク質を４℃にて10
分間、12,000×ｇで遠心分離することにより収集した。
ペレットを20mlの緩衝液６で洗浄し遠心分離により収集
した。生じたペレットを3mlの緩衝液５（４％（w/v）SD
S、5mM DTT、0.02％NaN3を含有する125mMトリス−HCl、
pH6.8）中にゆっくりと溶解させた。5mM DTT、0.1％SD
S、1mM EDTA、0.1M NaClおよび0.02％NaN3を含有する25
mMトリス−HCl、pH8で平衡化したSephacryl S−200（Ph
armacia）1.6×95cmカラムでクロマトグラフィーするこ
とによりさらに精製した。フラクションをSDS−PAGEに
より分析した。関心のあるタンパク質を含有するフラク
ションをプールし、タンパク質濃度を280nmでのUV吸収
により測定した。プールした物質はエンザイムイムノア
ッセイにおけるポリスチレンビーズを被覆するのに用い
た。
実施例７ ENV93融合タンパク質としてのエンベロープエピトープ
の発現 ENV93構築物はHTLV−Ｉゲノムの他の領域を効率的に
発現させるための好都合なビークルとして使用されよう
としている。この系は抗体スクリーニングアッセイにお
ける試験抗原として評価するのに必要な十分量のHTLV−
Ｉ組換えタンパク質を入手可能にすべきである。
HTLV−ＩエンベロープDNAの起源はプラスミドpH2Exで
ある。このプラスミドは本来HTLV−Ｉのenv、pXおよび
３′LTRを含有するファージλCR1からサブクローンされ
た（Manzariら、上記：ヨーロッパ特許出願、公開番号1
81 107）。エンベロープコード領域の地図は第６図に示
される。示されている制限部位を用いて下記のDNAフラ
グメントを生成させた。すなわち、III、III A、III
B′、II、ＩおよびII＋Ｉ。これらDNAはエンベロープコ
ード配列のほぼ全体を表わす。各フラグメントをプラス
ミドpDS56/RBS IIのENV93の下流に挿入しそして第７図
に示される組換え融合タンパク質を前記のようにE.コリ
中で発現させ精製した。
実施例８ ENV93/HTLV−Ｉ−III B′の構築 154bpのSal I/Hpa Iフラグメント（nts5673−5827）
をpH2Exから単離した（第６図）。このIII B′DNAはgp4
6エンベロープドメインのアミノ酸166−216に相当する5
2アミノ酸をコードする。Sal I合成８マーリンカーをフ
ラグメントに添加しそしてIII B′をプラスミドpDS56/R
BS II ENV93のSal I部位に連結した。構築物から発現さ
れた融合タンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸
配列を第８図に示す。17.8Kdのタンパク質である158ア
ミノ酸はJE5506細胞中で最高レベルの発現を示す。
ENV93/HTLV−Ｉ−Ｉの構築 718bp Xho Iフラグメント（nts5778−6496、第６図）
をpDS56/RBS IIのSal I部位にサブクローンしてpBSENV
構築物を生成させた。このDNAを413bp Iフラグメントを
はずすためにBamH I/Hind IIIで消化した。そのＩフラ
グメントはエンベロープポリペプチドのアミノ酸308−4
40に相当する133アミノ酸をコードする。大部分のgp21
ドメインと共にgp46のＣ末端がフラグメントＩに包含さ
れる。10マーHind IIIリンカーを添加することがプラス
ミドpDS56/RBS II ENV93のHind III部位にＩフラグメン
トを挿入するのに必要であった。発現した融合タンパク
質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を第９図に示
す。245アミノ酸のこのポリペプチドは27Kdの分子量を
有する。ENV93/HTLV−Ｉ−Ｉ構築物はENV93エピトープ
の２倍量の発現を指示する。全ENV93配列がＩフラグメ
ント内に包含される。
ENV93/HTLV−Ｉ−II＋Ｉの構築 718bp Xho Iフラグメント（nts5778−6496）をpH2Ex
から単離しそしてプラスミドpDS56/RBS II ENV93の適合
するSal I部位に直接連結した。このII＋Ｉフラグメン
トはHTLV−Ｉエンベロープポリペプチドの残基201−440
に相当する240アミノ酸をコードする。gp46およびgp21
由来のエピトープがII＋Ｉフラグメント中に示される。
この構築物から発現される組換え融合タンパク質は分子
量37.9Kdに翻訳される344アミノ酸である。ENV93/HTLV
−Ｉ−II＋Ｉタンパク質のヌクレオチドおよび推定アミ
ノ酸配列を第10図に示す。
ENV93/HTLV−Ｉ−IIの構築 pbsENV DNAを328bp IIフラグメントをはずすためにBa
mH Iで消化した。このIIフラグメントはgp46エンベロー
プタンパク質のＣ末端のアミノ酸201−307をコードする
（第６図）。５′BamH I粘着末端をクレノウ酵素で充填
しそして10マーHind IIIリンカーを、プラスミドpDS56/
RBS II ENV93のHind III部位への挿入を容易にするため
にDNAに連結した。発現された融合タンパク質のヌクレ
オチドおよび推定アミノ酸配列を第11図に示す。217ア
ミノ酸のENV93/HTLV−Ｉ−IIタンパク質は分子量24Kdを
有する。
ENV93/HTLV−Ｉ−IIIの構築 IIIフラグメントはgp46のＮ末端のアミノ酸１−200を
表わす。このIIIフラグメントはNco I/Xho I消化により
pH2Exから単離し（第６図）そして599bpDNAを、合成Hin
d IIIリンカーの連結を経由してpENV59のHind III部位
にサブクローンした。IIIフラグメントを613bp Hind II
IフラグメントとしてpENV59/HTLV−Ｉ−III DNA構築物
から精製した。５′Hind III粘着末端をクレノウ酵素で
充填しそして10マーHind IIIリンカーを平滑末端DNAに
連結した。挿入物をプラスミドpDS56/RBS II ENV93のHi
nd III部位に連結した。発現された組換えタンパク質の
ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を第12図に示す。
ENV93/HTLV−Ｉ−IIIポリペプチドは分子量35Kdを有
し、315アミノ酸から成る。
ENV93/HTLV−Ｉ−III Aの構築 III AフラグメントはPvu II/Asl I消化によりプラス
ミドENV59/HTLV−Ｉ−III Aから得られる（第６図）。I
II Aフラグメントはgp46タンパク質のアミノ酸26−165
をコードする。419bpフラグメントの５′Sal I末端をク
レノウ酵素を用いて充填しそしてプラスミドpDS56/RBS
II ENV93のただ１つしかないSal I部位に挿入するため
に10マーSal Iリンカーを連結した。発現されたENV93/H
TLV−Ｉ−III A融合タンパク質のヌクレオチドおよび推
定アミノ酸配列を第13図に示す。28Kdのポリペプチドは
249アミノ酸の長さである。
実施例９ エンザイムイムノアッセイ（EIA） 精製HTLV−Ｉ組換えタンパク質を0.05M炭酸塩−重炭
酸塩緩衝液、pH9.5中で最終濃度10μg/mlでポリスチレ
ンビーズ［直径1/4インチ（0.635センチメートル）］に
被覆した。被覆物を37℃にて18時間インキュベートし
た。未結合タンパク質を脱イオン水で洗浄することによ
り除去し、ビーズは37℃で乾燥させそして４℃にて乾燥
保存した。HTLV−Ｉ陽性および陰性血清は、400μの
試料希釈液（0.02Mリン酸緩衝食塩水、pH7.0中に20％新
生ウシ血清、0.5％ツイーン20、0.01％ヤギIgG、0.01％
チメロサール、5mM EDTA）を用いて10μの血清を反応
チューブ中に分配することによりあらかじめ希釈した。
１個の被覆ビーズをチューブに添加しそして37℃で30分
間振盪器／インキュベーター中でインキュベートした。
未結合抗体を自動ビーズ洗浄機を用いて脱イオン化水で
洗浄することにより取り除いた。セイヨウワサビペルオ
キシダーゼ（Boehringer Mannheim）で標識したヤギ抗
ヒトIgG250μを接合体希釈液（20％ウシ胎児血清、0.
04％４−アミノアンチピリン、１％ツイーン20、0.1％
（v/v）Kathonを含有する0.1Mトリス−アセテート、pH
7.3）で1:9000に希釈し、反応チューブに添加した。振
盪器／インキュベーターで37℃にて15分間インキュベー
トした。遊離の接合体は脱イオン水で洗浄することによ
り除去した。250μの基質溶液（0.02％過酸化水素、
0.01％Kathonを含有する0.1Mクエン酸カリウムpH5.25中
の2mg/ml o−フェニレンジアミン）を各チューブに添加
し、室温で15分間インキュベートした。反応は1N硫酸1m
lを添加することにより停止させた。492nmでの光学濃度
をCOBAS RESA光度計により測定した。HTLV−Ｉ組換え融
合タンパク質に関するEIA結果を第14図に示す。ENV93/H
TLV−Ｉ−II＋Ｉタンパク質は検査した陽性血清試料で
最大の反応性を示す。
【図面の簡単な説明】
第１図はENV93合成遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 第２図は14の重複するオリゴヌクレオチドフラグメント
の段階的連結により構築されたENV93合成遺伝子の組み
立てを示す。 第３図はpDS56/RBS IIのBamH I部位へのENV93構築物の
挿入を示す。 第４図はpDS56/RBS IIベクターから発現された組換えEN
V93タンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
を示す。 第５図はE.コリ細胞W3110、JE5505、およびJE5506中に
おけるHTLV−I ENV93タンパク質発現を示す。 第６図はHTLV−Ｉプロウイルスゲノムの構造を概要的に
示す。 第７図はHTLV−Ｉエンベロープ発現タンパク質を示す。 第８図は発現されたENV93/HTLV−Ｉ−III B′組換えタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。 第９図はENV93/HTLV−Ｉ−Ｉ融合タンパク質のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列を示す。 第10図はENV93/HTLV−Ｉ−II＋Ｉ組換えエンベロープタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。 第11図はENV93/HTLV−Ｉ−II組換えタンパク質のヌクレ
オチドおよび推定アミノ酸配列を示す。 第12図はENV93/HTLV−Ｉ−III融合タンパク質のヌクレ
オチドおよび推定アミノ酸配列を示す。 第13図はENV93/HTLV−Ｉ−III A組換えエンベロープタ
ンパク質のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。 第14図は種々のHTLV−Ｉ組換えタンパク質の免疫反応性
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭63−301896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−244393（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502028（ＪＰ，Ａ)

Claims (30)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HTLV−I envのgp21領域の免疫優性保存領
    域からのひとつのエピトープを含有するポリペプチドで
    あって、該ポリペプチド中の該HTLV−ＩエピトープがHT
    LV−I envのgp21領域のアミノ酸342−434からなるポリ
    ペプチド。但し、該ポリペプチドは天然env gp21タンパ
    ク質ではないものとする。
  2. 【請求項２】下記アミノ酸配列： を有する請求項１記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】請求項１または２記載のポリペプチドをコ
    ードするヌクレオチド配列。
  4. 【請求項４】ヌクレオチド配列が合成遺伝子である請求
    項３記載のヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】合成遺伝子がE.コリ内で優先的に用いられ
    るコドンからなる請求項４記載のヌクレオチド配列。
  6. 【請求項６】下記配列： を有する請求項４または５記載のヌクレオチド配列。
  7. 【請求項７】HTLV−I env gp46、gp21またはgp46とgp21
    からのひとつのエピトープを含有する第２のアミノ酸配
    列に融合されたHTLV−I env gp21の免疫優性保存領域の
    ひとつのエピトープを含有する第１のアミノ酸配列を含
    んでなるハイブリッドポリペプチド。
  8. 【請求項８】第１のアミノ酸配列中のエピトープがgp21
    領域のアミノ酸342−434からなる請求項７記載のハイブ
    リッドポリペプチド。
  9. 【請求項９】第２のアミノ酸配列が下記： gp46およびgp21のアミノ酸308−440（Ｉ）、 gp46のアミノ酸201−308（II）、 gp46およびgp21のアミノ酸201−440（II＋Ｉ）、 gp46のアミノ酸１−200（III）、 gp46のアミノ酸26−166（III A） gp46のアミノ酸165−216（III B′） から成る群から選択されるアミノ酸に相当する請求項７
    または８記載のハイブリッドポリペプチド。
  10. 【請求項１０】第２のアミノ酸配列がgp46とgp21のアミ
    ノ酸308−440に相当し、前記ハイブリッドポリペプチド
    が下式（Ｉ）： を有する請求項７〜９のいずれか１項に記載のハイブリ
    ッドポリペプチド。
  11. 【請求項１１】第２のアミノ酸配列がgp46のアミノ酸20
    1−308に相当し、前記ハイブリッドポリペプチドが下式
    （II）： を有する請求項７〜９のいずれか１項に記載のハイブリ
    ッドポリペプチド。
  12. 【請求項１２】第２のアミノ酸配列がgp46とgp21のアミ
    ノ酸201−440に相当し、前記ハイブリッドポリペプチド
    が下式（II＋Ｉ）： を有する請求項７〜９のいずれか１項に記載のハイブリ
    ッドポリペプチド。
  13. 【請求項１３】第２のアミノ酸配列がgp46のアミノ酸１
    −200に相当し、前記ハイブリッドポリペプチドが下式
    （III）： を有する請求項７〜９のいずれか１項に記載のハイブリ
    ッドポリペプチド。
  14. 【請求項１４】第２のアミノ酸配列がgp46のアミノ酸25
    −165に相当し、前記ハイブリッドポリペチドが下式（I
    II A）： を有する請求項７〜９のいずれか１項に記載のハイブリ
    ッドポリペプチド。
  15. 【請求項１５】第２のアミノ酸配列がgp46のアミノ酸16
    5〜216に相当し、前記ハイブリッドポリペペチドが下式
    （III B′）： を有する請求項７〜９のいずれか１項に記載のハイブリ
    ッドポリペプチド。
  16. 【請求項１６】請求項７〜15のいずれか１項に記載のハ
    イブリッドポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝
    子。
  17. 【請求項１７】HTLV−I env gp21の免疫優性保存領域の
    ひとつのエピトープを含有するポリペプチドをコードす
    る第１のヌクレオチド配列が請求項３〜６のいずれか１
    項に記載のヌクレオチド配列である請求項16記載のハイ
    ブリッド遺伝子。
  18. 【請求項１８】HTLV−I env gp46、gp21またはgp46とgp
    21のポリペプチドサブ配列をコードする第２のヌクレオ
    チド配列が gp46およびgp21のアミノ酸308−440（Ｉ）、 gp46のアミノ酸201〜308（II）、 gp46およびgp21のアミノ酸201−440（II＋Ｉ）、 gp46のアミノ酸１−200（III）、 gp46のアミノ酸26−166（III A） gp46のアミノ酸165−216（III B′） から成る群から選択される請求項16または17記載のハイ
    ブリッド遺伝子。
  19. 【請求項１９】HTLV−I envの第２のヌクレオチド配列
    が gp46およびgp21のヌクレオチド6101−6499（Ｉ）、 gp46のヌクレオチド5780−6103（II）、 gp46およびgp21のヌクレオチド5780−6499（II＋Ｉ）、 gp46のヌクレオチド5180−5779（III）、 gp46のヌクレオチド5255−5677（III A） gp46のヌクレオチド5672−5827（III B′） から成る群から選択される請求項18記載のハイブリッド
    遺伝子。
  20. 【請求項２０】下記のものから成る群から選択されるヌ
    クレオチド配列を有する遺伝子。 ａ）請求項３〜６のいずれか１項に記載のヌクレオチド
    配列、または ｂ）請求項16〜19のいずれか１項に記載のハイブリッド
    遺伝子およびベクターを含んでなる組換えベクター。
  21. 【請求項２１】単細胞宿主中で複製可能なプラスミドで
    ある請求項20記載のベクター。
  22. 【請求項２２】E.コリ株中で複製可能な請求項20又は21
    記載の組換えベクター。
  23. 【請求項２３】組換えベクターを含有する請求項20〜22
    のいずれか１項に記載単細胞宿主。
  24. 【請求項２４】E.コリ細菌である請求項23記載の宿主。
  25. 【請求項２５】請求項１、２又は７〜15のいずれか１項
    に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポ
    リペプチドが発現されるような適切な増殖条件下で前記
    ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する
    組換えベクターを含有する単細胞宿主を培養しそして前
    記ポリペプチドを単離することを含んでなる方法。
  26. 【請求項２６】試験試料を請求項１、２又は７〜15のい
    ずれか１項に記載のポリペプチドと接触させてタンパク
    質／抗体複合体を形成させそして該複合体を検出するこ
    とを含んでなる、哺乳動物の体液中のHTLV−Ｉに対する
    抗体の検出法。
  27. 【請求項２７】イムノアッセイである請求項26記載の方
    法。
  28. 【請求項２８】エンザイムイムノアッセイである請求項
    27記載の方法。
  29. 【請求項２９】請求項１、２又は７〜15のいずれか１項
    に記載のポリペプチドを用いて、哺乳動物の体液中のHT
    LV−Ｉに対する抗体を検出する方法。
  30. 【請求項３０】請求項１、２又は７〜15のいずれか１項
    に記載のポリペプチドを容器中に含有する、哺乳動物の
    体液中におけるHTLV−Ｉに対する抗体を検出するための
    試験キット。
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