JP3439208B2 - Ｈｔｌｖ−▲ｉ▼及びｈｔｌｖ−▲ｉｉ▼ペプチド抗原及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、現在は放棄されているが、1986年12月31日
に出願された出願番号第948,270の“HTLV−Ｉペプチド
抗原及び方法”についてのアメリカ特許出願の一部継続
出願である、1989年６月13日に出願された出願番号第36
6,313号の“HTLV−Ｉペプチド抗原及び方法”について
のアメリカ特許出願の一部継続出願である、出願番号65
0,091号の“HTLV−Ｉペプチド抗原及び方法”について
のアメリカ特許出願に対する優先権を主張する。

1.発明の分野 本発明はHTLV−Ｉ特異的抗原、及びその抗原の調製方
法及び使用方法に関する。

2.参照文献 Cwirla,S.E.,et al.,Proc Nat Acad.Sci,USA,87:6378
（1990）． Huynh,T.V.,et al.,in“DNA Cloning,Volume 1,"ed.
D.M.Glover,Washington,D.C.:IRL Press,1985（Chapter
2）． Laemmli,U.K.,Nature,227:680（1970）． Lipka,J.J.,et al.,J Infect Dis,162:353（1990）． Lipka,J.J.,et al.,Proceedinsgs of the 43 Meeting
（1990）． Maniatis,T.,et al.,Molecular Cloning:A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1982）． Matsushita,S.,et al.,Proc Natl Acad Sci（USA），
83:2673（1986）． Miyoshi,I,et al.,Nature,294:770（1981）． Poiesz,B.J.,et al.,Proc Natl Acad Sci（USA），7
7:7415（1980）． Popovic,.M.,et al.,Science,29:856（1983）． Samuel,K.P.,et al.,Science,226:1094（1984）． Samuel,K.P.,Gene Anal Tech,2:60（1985） Scott,J.T.＜ et al.,Science,249:386（1990）． Seiki,M.,et al.,Proc Natl Acad Sci（USA），80:36
18（1983）． Shimotokno,K.,et al,Proc Nat Acad Sci,USA,82:310
1（1985）． 3.発明の背景 ヒトＴ−細胞白血病ウィルス（HTLV）は、３種の知ら
れているメンバーを有するＴ−細胞レトロウィルスの種
類を示す。HTLVタイプＩ（HTLV−Ｉ）はインビトロで形
質転換活性を有し、そして世界のいくつかの場所におい
て風土病であることが知られている、成人Ｔ−細胞白血
病に病因学的に結合される。HTLV−IIはインビトロで形
質転換能力を有するもう１つのレトロウィルスであり、
そして毛髪細胞白血病のＴ−細胞変異体を有する患者か
ら単離されて来た。リンパ節疾患−関連ウイルスともま
た呼ばれ、そして現在、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
としても知られるHTLV−IIIは、ある種類のＴ細胞に対
して溶菌性であり、そして後天性免疫不全症候群（AID
S）の病原に結合されて来た。HTLV−Ｉ及び−IIウイル
スとは異なって、HTLV−IIIはインビトロ形質転換活性
を有することは知られていない。

HTLV−Ｉ感染の診断は通常、HTLV−Ｉペプチド抗原に
対する血清抗体応答に基づかれる。これは通常、HTLV−
Ｉビオリンペプチドによる酵素イムノアッセイ（EIA）
に基づいて、HTLV−Ｉ抗体を固定するために初期スクリ
ーニングアッセイを包含する。血液スクリーニングのた
めに現在使用されるアッセイは、約0.5〜0.05％のHTLV
−Ｉ及びHTLV−II陽性を検出し；それらの中で、５個の
うち約４個が誤った陽性である。従って、陽性血清は、
特定のHTLV−Ｉペプチド抗原に対する抗原反応を検出す
る、ウェスターンブロット又はラジオイムノ沈殿アッセ
イを用いての確認アッセイでさらに試験されるべきであ
る。

現在の血液試験方法は、HTLV−I p24 gagタンパク質
及びエンベロープタンパク質gp46,gp21又はgp68の少な
くとも１つとの免疫反応に基づく確認試験を必要とす
る。試験抗原がビリオンタンパク質から調製される場
合、gp46のみが真のHTLV−Ｉ血清陽性体との高い抗体反
応率を与える。その時でさえ、gp46との反応はより感度
の高いラジオイムノ沈殿アッセイによる追加の抗原試験
によってのみ検出され得る。上記スクリーニング及び確
認試験はHTLV−Ｉ及びHTLV−II陽性体を固定するが、し
かしそれらの２種のHTLVウィルス間を区別することはで
きない。

従って、HTLV−Ｉ陽性血清を検出するための改良され
た方法を提供することが所望される。特に、改良された
試験は、最少数の誤った陽性を伴って、すべてのHTLV−
Ｉ及びHTLV−II陽性血清を検出することができ、そして
また、HTLV−II陽性血清とHTLV−Ｉとを区別できる。

4.発明の要約 従って、HTLV−Ｉ及びHTLV−II陽性ヒト血清を検出す
るための改良された方法及びキットを提供することが本
発明の１つの目的である。

本発明のもう１つの目的は、HTLV−Ｉ及びHTLV−II陽
性血清を区別できるような方法及びキットを提供するこ
とである。

“HTLV−Ｉペプチド抗原及びアッセイ”についての上
記で引用された特許出願においては、ATCC細胞系HB8755
（Matsushita）により生成された.5αモノクローナル抗
体（Mab）と免疫反応性であるHTLV−I gp46エンベロー
プタンパク質の領域から構成されるHTLV−Ｉペプチドが
開示されている。その領域は、MTA−1,MTA−４及びMTA
−５と命名された、３個のgp46ペプチド抗原の42個のア
ミノ酸配列オーバーラップに含まれる。その42個のアミ
ノ酸配列オーバーラップ領域は、配列:Ser−Leu−Leu−
Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−Ile−Trp−
Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−Leu−Pro−
Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−
Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−Serを含
み、そしてその42個のアミノ酸配列のＣ−末端Ser残基
で追加の残基Ile−Pro−Trp−Lys−Ser−Lysを含むこと
ができる。.5α Mabと免疫反応性である組換え及び合成
ペプチドにおける共通アミノ酸配列は、配列Thr−Ala−
Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−Asn−Leu−Asy−
His−Ile−Leu−Glu−Pro−Serである。

もう１つの観点においては、本発明は、ヒト血清にお
けるHTLV−Ｉ感染の存在を検出するためのキットを包含
する。そのキットは、gp46ペプチド抗原が担持される固
体支持体、及び前記ペプチド抗原に結合されるヒト抗体
の存在を検出するためのレポーターシステムを包含す
る。

もう１つの態様においては、キットはHTLV−Ｉ抗体に
ついてヒト血清をスクリーニングするためのEIA型に存
在する。もう１つの態様では、ペプチド抗原が、HTLV−
Ｉ血清抗体を確かめるためのウェスターンブロット型に
おいて、１又は複数の確認HTLV−Ｉ抗原と共に、ストリ
ップ上に固定される。

さらにもう１つの態様においては、キットは、HTLV−
II陽性血清からの抗体と特異的に反応することができ
る、上記で定義されたHTLV−II特異的抗原を包含する。
キットは、HTLV−Ｉ及びHTLV−II陽性血清の特異的検出
を可能にする。

HTLV−Ｉ陽性ヒト血清を検出する方法がまた、本発明
に包含される。この方法においては、試験血清は、.5α
Mabと命名された、ATCC細胞系HB8755に由来する抗−HT
LV−Ｉモノクローナル抗体（Mab）と免疫反応性である
ペプチド抗原と反応せしめられる。前記抗原に結合され
る抗−HTLV−Ｉ抗体の存在は、適切なレポーターラベル
された抗−ヒト抗体により検出される。

.5α Mab−反応性ペプチドは、好ましくは５〜10個の
アミノ酸残基をコードするランダム−配列ポリヌクレオ
チドの混合物が、ランダム配列ベクターのライブラリィ
ーを形成するために適切な発現ベクター中に導入される
ランダム配列選択方法により生成され得る。ライブラリ
ィーベクターの発現生成物は、.5α Mabと免疫反応性で
あるアミノ酸配列の存在についてスクリーンされる。次
に、そのような免疫反応性アミノ酸配列を発現するライ
ブラリィークローンが単離され、そして挿入された配列
によりコードされるポリペプチドを生成するために使用
される。

また、HTLV−IIエンベロープタンパク質gp46に由来す
る約50個以下のアミノ酸を含むHTLV−IIペプチド抗原が
開示され、そしてそれはアミノ酸配列Met−Thr−Leu−L
eu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−Leu−T
rp−Phe−Ile−Thr−Ser−Glu−Pro−Thr−Gln−Pro−P
ro−Pro−Thr−Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−S
er−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Ser−T
hr−Ser−Trp−Thr−Thr−Lysにより形成される免疫原
性領域を含む。HTLV−II抗血清と免疫反応性である組換
え及び合成ペプチドにおける共通するアミノ酸配列は、
配列Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser−Asp−L
eu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Ser又は、アミノ
酸配列Thr−Ser−Trp−Thr−Thr−LysによりSer C−末
端で拡張された前記同じ配列を有する。

前記ペプチド抗原は、ヒト血清におけるHTLV−II感染
の存在を検出するための試験キットに使用される。その
キットは、ペプチド抗原を担持する固体支持体、及びペ
プチド抗原に結合されるヒト抗体の存在を検出するため
のレポーターシステムを包含する。

本発明のそれらの及び他の目的及び特徴は、本発明の
次の詳細な記載が添付図面と共に読み取られる場合、よ
り十分に明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図1Aは、上方に、gp46エンベロープタンパク質コード
配列を含むHTLV−Ｉゲノムの一部及び下方に、本発明に
従って形成されたオーバーラッピングHTLV−Ｉペプチド
抗原をコードする配列を含むgp46コード領域の一部を示
し、そして図1Bは命名されたMTA−4,MTA−1,及びMTA−
５を示し； 図２は、HTLV−Ｉコード配列及びHTLV−Ｉエンベロー
プタンパク質の一部のための対応するアミノ酸配列を示
し； 図３は、本発明のペプチド抗原の領域におけるHTLV−
Ｉ及びHTLV−II gp46の相同領域のアミノ酸配列、及び
いくつかのHTLV−I gp46ペプチド抗原（上方）及び本発
明のHTLV−IIペプチド抗原（下方）のペプチド配列を示
し； 図4A及び4Bは、MTA−１ペプチド及び対応するHTLV−I
I gp46ペプチドについての抗原性プロットを示し； 図５は、本発明に従ってランダム−配列ペプチドを生
成し、そして選択するための組換え方法を示し； 図６は、本発明のHTLV−IIペプチドが由来するgp46エ
ンベロープタンパク質の領域におけるHTLV−IIコード配
列及び対応するアミノ酸配列を示し；そして 図７は、HTLV−Ｉウィルス溶解物及び組換えタンパク
質p21E及びMTA−４を含む改良されたウェスターンブロ
ットを示し、ここでレーンＡ−Ｆ及びＧ−Ｒはそれぞれ
HTLV−Ｉ及びHTLV−II抗血清である。

発明の詳細な記載 I.HTLV−Ｉペプチド抗原の調製 このセクションは、HTLV−Ｉ関連Ｔ−細胞白血病を有
する個人に見出される抗−HTLV−Ｉ抗体と免疫反応性で
あるHTLV−Ｉペプチド抗原の調製を記載する。抗原は、
適切な発現ベクターにクローンされた長さ100〜300塩基
対のランダムHTLV−Ｉ遺伝子配列を用いて調製され、次
に免疫反応性ペプチドの発現のために抗体により選択さ
れる。

A.HTLV−Ｉゲノムライブラリィー HTLV−Ｉのゲノムライブラリィーを、HTLV−Ｉプロウ
ィルスゲノムを含む細胞DNAから従来のようにして調製
する。複合DNAをHTLV−Ｉ感染細胞から調製し、そして
前記細胞は、HTLV−Ｉウィルス又は知られている細胞
系、たとえばHUT 102−2B（Poiesz）,MT−２（Miyosh
i）及びMJ−腫瘍（Popovic）細胞（それらのすべてはHT
LV−Ｉウィルスを生成することが示されている）により
感染されていることが知られている患者から単離された
Ｔ−細胞を包含する。ウィルスゲノムは、それらの細胞
において宿主DNA中に組込まれる。HTLV−Ｉゲノムを含
む細胞系の調製方法は、上記文献に詳細される。

上記細胞系からの合計の宿主ゲノムDNAを、カッタ
ー、たとえばHae III又はAlu Iにより、12−20K塩基サ
イズ範囲での部分的消化物フラグメントを生成する条件
下で部分的に消化し、そして消化された材料を、15−20
K塩基のフラグメントを単離するために、スクロースグ
ラジェント遠心分離により分別する。次に、そのフラグ
メントを、適切なクローニングベクター、好ましくは、
15−20K塩基の挿入体を効果的に組込むことができるフ
ァージクローニングベクター中にクローン化する。好ま
しい方法においては、単離されたフラグメントをEco R
Iメチラーゼにより処理し、そしてEco R Iリンカーを標
準条件（Maniatis）下でそれらの端に連結し、そして次
に、ユニークEcoo R I挿入部位を有するファージベクタ
ー、たとえばλ Charon 4a中にクローン化する。

クローン化されたゲノムフラグメントを、完全−コピ
ーのHTLV−Ｉゲノムの選択された配列に対して相補的で
あるプローブによりスクリーンする。HTLV−Ｉ配列は、
選択された配列のための放射性ラベルされた合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを生成するための方法にように、
知られている（Seiki）。さらに、特定された配列の合
成オリゴヌクレオチドは、たとえばSynthetic Genetic
s,Inc.（San Diego,CA）により供給される市販のサービ
スにより製造され得る。そのようなオリゴヌクレオチド
プローブを用いて、HTLV−Ｉ配列を含む分子クローン
を、標準のハイブリダイゼーション方法（Maniatis,p32
2）によりライブラリィーから単離する。クローンをま
ず、制限部位分析により分析し、組込まれたウィルスゲ
ノムを端に有する直接的な長い末端反復体の存在により
示されるように、十分なウィルスゲノム配列が存在する
ことを確める。同定された分子クローンを、適切なエン
ドヌクレアーゼにより消化し、完全−コピーのウィルス
ゲノムを開放する。この目的のための好ましいエンドヌ
クレアーゼはSac Iであり、これはウィルスコード配列
のいづれかの端で長い末端反復体（LTR）でのウィルス
ゲノムを切断するが、しかし内部切断は生成しない。ク
ローン性HTLV−Ｉゲノムが第3Sac I部位を有する変異体
である場合、適切な制限酵素が、完全な長さのゲノムを
単離するために選択されるであろう。精製された完全−
コピーの配列は約9.5K塩基のフラグメントである。他
方、env遺伝子配列のみを示すゲノムのフラグメント
を、発現ライブラリィーの生成のために精製する。

他方、完全−コピーのHTLV−Ｉ複合DNAを含むクロー
ニングベクターはすでに報告されており（Seiki）、そ
して例１に示されるように、研究者から直接得られる。

所望するHTLV−Ｉゲノムライブラリィーを生成するた
めに、完全−コピーのHTLV−Ｉ挿入体を、上記クローニ
ングベクターから、たとえばSac Iによる完全な消化に
より切出し、そして例１に記載されるようにして、9.5K
塩基のフラグメントとして単離する。その単離された完
全−コピーのフラグメントを消化し、DNAフラグメント
及び好ましくは約100〜300の塩基対を主に有するランダ
ムフラグメントを生成する。例１は、DNAアーゼ消化に
よるそのようなフラグメントの調製を記載する。約30〜
100個の間のアミノ酸の抗原を得ることが所望されるの
で、その消化フラグメントは好ましくは、たとえばゲル
電気泳動によりサイズ分別され、約100〜300個の間の塩
基対サイズ範囲でのフラグメントが選択される。

ゲノム消化フラグメントを、適切なクローニングベク
ター、好ましくは適切な宿主においてペプチドコード体
の発現を可能にする発現ベクター中に挿入する。１つの
好ましい発現ベクターはλ gt11であり、それはβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の翻訳終結コドンの53塩基対上流
にユニークEco R I挿入部位を含む。従って、挿入され
た配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子として発現され
るであろう。従って、挿入された配列は、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子のＮ−末端部分、非相同ペプチド及びβ
−ガラクタシダーゼ遺伝子のＣ−末端領域の少なくとも
一部のほとんどを含むβ−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質として発現されるであろう。このベクターはまた、
許容する温度、たとえば32℃でウィルス溶原性を引き起
こし、そして高温、たとえば42℃でウィルス溶解を導び
く感温性レセプター（cI857）を生成する。このベクタ
ーの利点は、（１）ひじょうに効果的な組換え体の生
成；（２）許容性であるが、しかし非許容性ではない温
度での宿主細胞増殖に基づいて、溶原化された宿主細胞
を選択する能力、及び（３）高レベルの組換え体融合タ
ンパク質生成を包含する。さらに、非相同挿入体を含む
ファージは不活性β−ガラクトシダーゼ酵素を生成する
ので、挿入体を有するファージβ−ガラクトシダーゼ着
色基質反応により容易に同定され得る。

発現ベクター中に挿入された消化物フラグメントは、
従来の方法に従って、選択された制限部位リンカー、た
とえばEco R Iリンカーを含むように、必要により変性
され得る。例１は、フラグメントをブラント末端化し、
Eco R Iリンカーを付加し、そいてEco R Iにより切断さ
れたλ gt11と前記フラグメントとを連結する段階を包
含する、消化フラグメントをλ gt11中にクローン化す
るための方法を例示する。得られるウィルスゲノムライ
ブラリィーが調べられ、比較的大きな（代表的な）ライ
ブラリィーが生成されたことが確かめられ得る。これ
は、適切な細胞宿主を感染せしめ、その細菌をプレート
化し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性の損失について
プラークを試験することによって、λ gt11ベクターの
場合、行なわれ得る。例１に記載される方法を用いれ
ば、約60％のプラークが、例１に見されるように酵素活
性の損失を示すバックグラウンドファージのレベルを比
較して、酵素活性の損失を示した。

B.ペプチド抗原の発現 上記で形成されたゲノムライブラリィーを、対象のヒ
ト抗−HTLV−Ｉ抗体と免疫反応性であるペプチド抗原
（融合タンパク質として発現される）の生成についてス
クリーンする。HTLV−Ｉ感染を診断するための特定の興
味ある１つの抗体は、上記に示されたように、HTLV−Ｉ
感染に関連するＴ−細胞白血病を有する患者に存在する
抗体と同じ特異性を有する.5αモノクローナル抗体（Ma
b）である。前記抗体は、ATCC寄託番号HC8755を有するE
BV−形質転換Ｂ−リンパ球細胞系により生成される（例
２を参照のこと）。

好ましいスクリーニング方法においては、ファージラ
イブラリィーベクターにより感染された宿主細胞が上記
のようにして、プレート化され、そしてそのプレートが
ニトロセルロースフィルターによりブロットされ、その
フィルター上に細胞により生成される組換え抗原が移さ
れる。次にフィルターが抗−HTLV−Ｉ抗体と反応せしめ
られ、末結合抗体を除去するために洗浄され、そして抗
−HTLV−Ｉ抗体を通して、サンドイッチ態様でフィルタ
ーに結合されるようになる。レポーターラベルされた抗
−ヒト抗体と反応せしめられる。

典型的には、対象の組換え抗原の生成により同定され
るファージプラークを、抗体−反応性融合タンパク質の
生成のために、比較的低い密度で再試験する。例２に記
載されるスクリーニング方法が例証である。免疫反応性
組換え抗原を生成するいくつかの組換えファージクロー
ンを、その方法により同定した。

上記のようにして同定された１又は複数のライブラリ
ィーベクターを好ましくは、核酸配列決定により分析
し、HTLV−Ｉゲノム内のペプチドコード領域の位置を決
定する。選択されたライブラリィーベクターから非相同
挿入体（所望により、融合タンパク質の隣接するコード
配列を含む）を切出すための方法、及びその切出された
フラグメントを精製し、そして配列決定するための方法
は、例３に概略されるように、一般的に知られた方法で
ある。.5α Mabと免疫反応性であることが見出されてい
る３種のペプチドのコード配列は図面に示されている。
それらの３種の非相同配列は、HTLV−Ｉの既知配列に適
合する（Seiki）。例３でより十分に論ぜられるよう
に、すべての配列は、HTLV−Ｉエンベロープタンパク質
gp46（図面、パートＡ）をコードする遺伝子内のHTLV−
Ｉゲノムの塩基対5565〜5895内に存在し、そして塩基対
5664〜5790（図面、パートＢ）間のオーバーラッピング
コード配列（図面において２つの矢印により定義され
る）を有する。図面のパートＣに見られるように、オー
バーラッピング配列は、次のアミノ酸配列を有する42個
のアミノ酸のペプチド抗原をコードする:Ser−Leu−Leu
−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−Ile−Trp
−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−Leu−Pro
−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser
−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−Ser.本発
明を支持するために行なわれるスクリーニング研究は、
MTA−１ペプチドが、特に日本人祖先の対象の間で、最
高百分率のHTLV−Ｉ陽性血清を見いだすことを示す。図
３に見られるように、MTA−１ペプチドは、上記配列のS
er C未満で追加のIle−Pro−Trp−Lys−Ser−Lys残基を
含む。本発明の好ましい態様においては、HTLV−Ｉ特異
的ペプチドは、.5α Mabと免疫反応性であるＣ−末端の
48個のアミノ酸MTA−１配列の免疫原性領域を含む。

より一般的には、本発明のHTLV−Ｉペプチドは、.5α
Mabと免疫反応性である上記アミノ酸配列の免疫原性領
域を含む。ここで定義されるように、その特定された配
列は、.5α Mabのためのペプチド抗原の免疫反応性をほ
とんど下げない重要でない中性アミノ置換を包含する。
そのようなアミノ置換は、疎水性、サイズ、荷電、水素
結合能力、及び既知のアミノ酸置換原理に従っての二次
構造に対する効果の類似性に基づいて選択され得る。

選択されたクローンは、組換えタンパク質精製のため
の拡大生成のために使用される。拡大生成は、（ａ）選
択されたλ gt11組換え体により適切な宿主、たとえば
E.コリを溶原化し、（ｂ）高レベルの非相同ペプチドを
生成する条件下で形質導入された細胞を培養し、そして
（ｃ）溶解された細胞から組換え抗原を精製するため
に、種々の報告されている方法の１つを用いて行なわれ
る。

上記λ gt11クローニングベクターを包含する１つの
好ましい方法においては、高率生成体E.コリ宿主、BNN1
03が、選択されたライブラリィーファージにより感染せ
しめられ、そして２つのプレート上にレプリカプレート
される。プレートの１つを、ウィルス溶原性が生じる32
℃で増殖し、そして他の１つを、感染ファージが溶菌段
階に存在し、そして従って細胞増殖を妨げる42℃で増殖
する。従って、低い温度で増殖するが、しかし高い温度
では増殖しない細胞は、好都合良く溶菌化されたものと
して推定される。

溶菌化された宿主細胞は次に、ウィルス挿入体を含む
融合タンパク質の高い生成を好む液体培養条件下で増殖
され、そして所望する融合タンパク質を開放するために
急速な凍結により溶解される。これらの方法は、例４で
詳細に説明される。

ペプチド抗原MTA−１を発現するλ gt11クローンから
のHTLV−Ｉコード配列を、下記セクションIIに記載され
るようにして、PCR増幅により調製し、そしてpGEX−１
発現ベクター（Pharmacia,Piscataway,NJ）中にクロー
ン化した。pGEX−１中にクローン化された挿入体を、寄
生体スキストソーマ ジャポニカム（Schistosoma japo
nicum）からの26KドルトンのグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼである、タンパク質Sj26との融合タンパク質
として発現した。HTLV−Ｉ又はHTLV−II感染個人からの
血清に対するpGEX−MTA−１の制限パネリングは、pGEX
−MTA−１対β−gal−MTA−１の反応性間に有意な差異
は示さなかった。

C.ペプチド精製 組換えペプチドを、示差沈殿法、分子篩クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳
動、ゲル電気泳動及びアフィニティークロマトグラフィ
ーを包含する標準のタンパク質精製方法により精製す
る。融合タンパク質、たとえば上記のようにして調製さ
れたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の場合、使用
されるタンパク質単離技法は生来のタンパク質の単離に
使用される技法から融合され得る。従って、ａ−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質の単離のためには、そのタン
パク質は、表面融合抗−ガラクトシダーゼ抗体を有する
固体支持体上に細胞融解材料を通すことにより単純なア
フィニティークロマトグラフィーにより容易に単離され
得る。このアプローチは、例４で使用される。

II..5α MABとのペプチド免疫反応性 本発明はまた、もう１つの観点において、ATCC細胞系
HB8755により生成されるHTLV−I Mab、すなわち.5α Ma
bと免疫反応性であるペプチド抗原と血清とを反応せし
めることによる、HTLV−Ｉ陽性ヒト血清の検出方法を包
含する。血清におけるHTLV−Ｉ特異的抗体の存在は、例
７に記載されるように、レポーターラベルされた抗−ヒ
ト抗体により検出される。

A.HTLV−Ｉ由来のペプチド １つの態様において、ペプチドは、上記MTA−1,MTA−
４及びMTA−５ HTLV−Ｉペプチドからの42−アミノ酸
オーバーラップ領域からの免疫原性領域を含む。これら
のペプチド抗原は、42個のアミノ酸配列のオーバーラッ
プ領域における免疫反応性領域の位置を確かめるために
さらに特徴づけられた。オーバーラップ領域のＣ−末端
部分における免疫反応性領域の位置は、２つの証拠系に
より示唆された。第１に、.5α MabはHTLV−Ｉエンベロ
ープタンパク質と特異的に反応し、すなわちHTLV−II又
はHTLV−III（HIV−１）エンベロープタンパク質との反
応は観察されなかったことが報告された。上記のgp46ペ
プチド抗原MTA−１及便MTA−４はHTLV−Ｉと反応性であ
るが、しかしHTLV−II又はHTLV−III抗血清（Lipka）と
は反応性でないことが、出願者及び共同研究者により確
かめられている。

第２に、MTA−１ペプチドのアミノ酸配列とHTLV−II
gp46タンパク質におけるその対応する領域との比較（図
３）は、Ｃ−末端半分におけるよりもペプチドのＮ−末
端半分において実質的に高い相同性を示す（HTLV−Ｉ及
びHTLV−II配列の中央領域は図３に見られる）。これ
は、抗原性における最大の差異がペプチド領域のＣ−末
端半分に見出されることを示す。

それは、それぞれHTLV−Ｉ及びHTLV−IIペプチドにつ
いて図4A及び4Bに示される２つの対応するペプチド領域
の抗原性プロットによりさらに確かめられた。抗原性プ
ロットを、Intelligenetics（Palo Alto,CA）からのPC
Geneにおいて標準の疎水性プログラム“Antigen"により
生成した。見られるように、２つのプロットは残基３−
28において実質的にオーバーラップするが、しかし残基
28−40においては著しく逸脱する。その逸脱残基は、HT
LV−Ｉ配列Leu−Pro−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−
Ile−Leu−Glu−Pro−Serを含む。

前記Ｃ−末端を含む多くのペプチド抗原を調製し、そ
して.5α Mab及びHTLV−Ｉ及びHTLV−II抗血清への結合
性について試験した。それらのペプチドのいくつかの配
列は、上記MTA−1,MTA−４及びMTA−５ペプチド抗原の
配列と共に、図３の上部に示されている。ペプチドを、
標準の方法に従って、固相合成法により調製した。簡単
に言及すれば、Ｎ−α−保護されたアミノ酸無水物を結
晶化形で調製し、そしてＮ−末端での連続アミノ酸付加
のために使用した。個々の残基付加で、成長するペプチ
ド（固体支持体上の）を、酸処理し、Ｎ−α−保護基を
除去し、数回、洗浄し、残留酸を除去し、そして反応媒
体へのペプチド末端の接近能力を促進せしめた。次に、
ペプチドを活性化されたＮ−保護化アミノ酸対称無水物
と反応せしめ、そして固体支持体を洗浄した。

個々の残基−付加段階で、アミノ酸付加反応を、合計
２又は３個の別々の付加反応のためにくり返し、反応さ
れる成長ペプチド分子の百分率を高めることができる。
典型的には、１〜２回の反応サイクルが初めの12個の残
基の付加のために使用され、そして２〜３回の反応サイ
クルが残る残基のために使用される。成長ペプチド鎖を
完結した後、保護されたペプチド樹脂を液体弗化水素酸
により処理し、ブロック解除し、そして支持体からペプ
チドを開放する。

例６に実質的に記載されるようにして、ペプチドを、
結合競争研究により.5α Mabとの特異的免疫反応性につ
いて試験した。MTA−４又はMTA−１の18個のＣ−末端残
基を含むK163ペプチドは、MTA−４への.5α Mabの結合
を強く阻害する。しかしながら、結合障害は、MTA−４
の11個のＣ−末端残基のみを含むペプチドK162に関して
は観察されなかった。MTA−４の６個のＣ−末端残基及
び追加の13個のＣ−末端残基を含むペプチドK164は、.5
α MabとMTA−４又はMTA−１との間の結合を弱く阻害し
た。

それらの結果は、.5α Mabのためのgp46ペプチドにお
ける最っとも可能性ある免疫反応性領域が、ペプチドK1
63を含む領域に存在し、これは配列相同性及びこの領域
におけるHTLV−ＩとHTLV−II配列との間の抗原性プロッ
トの逸脱性に合致することを示す。K164ペプチドへの.5
α Mabの弱い結合は、対象のエピトープがK163とK164と
の間のオーバーラップのHis−Ile−Leu−Glu−Pro−Ser
−His−Ile−Leu領域に存在し、ここで隣接するＮ−末
端又はＣ−末端配列が抗原表示のために必要とされるこ
とを示し、又はK164ペプチドが.5α Mabと弱く免疫反応
性である追加のエピトープ領域を含むことを示す。

ペプチドをまた、HTLV−Ｉ感染された患者からの抗血
清のMTA−４への結合を阻害するそれらの能力について
も試験した。一般的に、MTA−４への.5α Mabの結合を
阻害するいづれか特定のペプチドの能力は、ELISA結合
手段（例6B）におけるHTLV−Ｉ抗血清に結合するその能
力又はウェスターンブロットアッセイ（例8C）における
MTA−４又はMTA−１へのヒトHTLV−Ｉ抗血清の結合を阻
害するその能力に匹敵することが見出された。従って、
ペプチドK162はELISA手段においてはいづれのHTLV−Ｉ
血清とも反応せず、そしてMTA−１又はMTA−４へのＪ−
254血清の結合を阻害しなかった。

B.ランダム−配列ペプチド もう１つの態様において、この方法に使用するため
の.5α Mab−反応性ペプチドはランダム−配列ペプチド
の選択により調製される。最近、特定の短い（５〜10個
の残基）ペプチドに対して向けられた抗体が、免疫反応
性種についてランダムに生成されたペプチドのライブラ
リィーをスクリーンするために使用され得ることが示さ
れた（Scott;Cwirlaなど）。そのような手段は、.5αモ
ノクローナル抗体と免疫反応性である新規配列を同定す
るために本発明において研究される。

好ましい方法においては、約10⁸個の新規ヘプタペプ
チドを、ベクターとして線状ファージfUSE5を用いてエ
ピトープライブラリィーの構成により生成する。他の線
状ファージベクターは、そのようなライブラリィーを開
発することにおいて同等に効果的であるように思える。

図５は、fUSE5線状ファージエピトープライブラリィ
ーを生成し、そしてスクリーンするために必要な段階の
順序を図的に示す。簡単に言及すれば、fUSE5 RF DNAを
制限エンドヌクレアーゼSfi Iによる消化にゆだね、外
来性DNAの挿入のための挿入部位を創造する。（NNK）ｍ
形（ここでＮはA,G,C又はＴを表わし;KはＧ又はＴを表
わし；そしてｍは２〜15である）で表わされる変性配列
を含む、合成（15＋3m）塩基対（bp）Bgl I DNAフラグ
メントを調製する。本発明の好ましい態様においては、
ｍは５〜10の範囲であり、そして塩基は１回の付加出来
事において鋳型プライマーにランダムに付加される。20
個のアミノ酸をコードするコドンのランダム付加を達成
するもう１つの方法は、鋳型プライマーに個々のアミノ
酸を表わすトリヌクレオチドコドンをランダムに付加す
ることである。

クローニングベクターへの挿入体の連結に続いて、線
状ファージベクターの増幅を、E.コリ細胞のトランスフ
ェクションにより達成する。好結果をもたらすトランス
フェクションを、ベクター担持マーカーの存在により測
定する。本発明の好ましい態様においては、このマーカ
ーは耐テトラサイクリン性である。次に、形質転換ファ
ージを細菌細胞から単離する。対象のファージ担持配列
を抗体パンニング方法により単離し、ここでファージ
は.5α Mab又はそのFabフラグメントと共にインキュベ
ートされる。次にビオチニル化された第２抗体（ヤギ抗
−ヒトIgG）を添加し、そしてビオチニル化された第２
抗体を含む複合体、.5α Mab及び免疫反応性ペプチド担
持ファージを、ストレプトアビジン被覆されたプレート
上への付着により未反応抗体及びファージから分離す
る。次に、ファージ担持免疫反応性配列を溶離し、そし
てそれらのDNA配列を決定する。

線状ファージ融合タンパク質p IIIに存在する外来性D
NA配列は、免疫反応性ペプチドの配列を決定する。次
に、この方法を通して免疫反応性であることが発見され
たペプチドは、標準のペプチド合成法により合成され
得、そして適切なペプチドキャリヤーへの接合により免
疫原として調製され得る。

III.HTLV−IIペプチド抗原 このセクションは、HTLV−II抗血清と特異的に免疫反
応するHTLV−IIペプチドの同定及びクローニングを説明
する。ペプチドは、HTLV−I gp46領域からの上記MTA−
１ペプチドに対して相同性であるHTLV−II gp46エンベ
ロープタンパク質領域に由来する。

HTLV−ＩペプチドMTA−１に対応するGH2−K15（図
３）と命名されたHTLV−IIペプチドを、所望するペプチ
ド配列に対応するHTLV−IIコード配列のクローニングに
より調製した。HTLV−IIゲノム（図６）のヌクレオチド
5648−5794に対応する147塩基対（bp）のHTLV−II DNA
フラグメントを、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）法（Perki
n−Elner/Cetus Gene Ampキット）の使用により、HTLV
−IIクローンpM04（プラスミドpBR322のBam H I部位中
にクローン化されたHTLV−IIゲノムのthe大部分を含
む）から最初に増幅した。

前方及び逆方向プライマーは図６に示されている。増
幅されたDNAをλ gt11ファージベクターのEco R I部位
中に連結し、λ gt11のガラクトシダーゼ遺伝子中に147
HTLV−II DNA挿入体を含むクローンas3K15を得た。組
換えファージを用いて、E.コリ株BNN103をトランスフェ
クトした。詳細は例５に示される。

予備実験において、PCR−確証HTLV−Ｉ又はHTLV−II
感染の約200人の個人からの血清、及び約150人の末感染
個人からの血清を、GH2−K15抗原に対してパネルした。
HTLV−II感染された個人からの血清の98％がGH2−K15と
反応した。HTLV−Ｉ感染された血清又は末感染血清のい
づれもGH2−K15と反応しなかった。スクリーニング結果
は、GH2−K15ペプチドが、HTLV−II陽性血清の特異的に
免疫反応することを示す。

GH2−K15アミノ酸配列を含むいくつかの小さなペプチ
ドを、セクションＩに概略されているようにして、組換
え法により調製した。簡単に言及すれば、ペプチドを、
例５に記載されているようにして、示されている配列の
増幅を促進するように企画されたPCRプライマーを用い
て、HTLV−IIゲノムDNAのPCR増幅により調製した。（GH
2−）K14,K16,K24,K35及びK34と命名されたそれらの５
種のペプチドは、図３に示される配列を有する。

上記組換えHTLV−IIペプチドを、例８に記載されてい
るようにして、ELISA型においていくつかのHTLV−II及
びHTLV−Ｉに対して免疫スクリーンした。GH2−K16を除
くすべてのλ gt11 HTLV−IIクローンを、試験される６
種のHTLV−II血清からの少なくとも１種のものにより確
認した。GH2−K16,すなわち単独の非反応性クローン
は、GH2−K15に含まれるカルボキシル末端の22個のアミ
ノ酸を欠いている。試験されたすべての他のクローン
は、ペプチドK125に存在する少なくとも17個のアミノ酸
Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser−Asp−Leu−
Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Serを含む。

表１に見られるように、試験されたペプチドは、HTLV
−Ｉ血清又は.5α Mabのいづれとも反応しなかった。

元のHTLV−IIクローンの３種、すなわちGH2−K15,GH2
−K35及びGH2−K16を、pGEX−１発現ベクター中にクロ
ーンした。３種のpGEX−1,HTLV−IIクローン、すなわち
GH2−K15,GH2−K25及びGH2−K35により発現される組換
えタンパク質は、Ｊ−317 HTLV−II血清によりすべて認
識された。

K15配列内のアミノ酸配列を含む多くのペプチド抗原
を、上記セクションIIIに概略されているようにして、
固相法により調製した。（GH2−）K169,K170,K125,K126
及びK128と称するそれらの５種のペプチドの配列は、図
３に示される。ペプチドを、ELISA法により、いくつか
のHTLV−Ｉ及びHTLV−II陽性血清との免疫反応性につい
て試験し、そしてそれのペプチドのいくつかをまた、K1
5抗原に結合するHTLV−II抗体を阻害するそれらの能力
について試験した。

K125ペプチドは、ELISAによりアッセイされる場合、
複数のHTLV−II血清により認識された。１つの実験にお
いて、12個のうち６個のHTLV−II血清がK125に効果的に
結合できた。同じ実験において、７個のHTLV−Ｉ血清の
うちつもペプチドK125を結合しなかった。K125ペプチド
はまた、ウェスターンブロットされたGH2−K15への強く
反応性のHTLV−II血清、すなわちＪ−317の結合を阻害
した。GH2−K15を結合する血清Ｊ−317の能力は、HTLV
−ＩペプチドK163又はHTLV−IIペプチドK128と共にイン
キュベーションすることによって影響されない。

HTLV−IIペプチドK170は、ELISA基礎のアッセイにお
いて複数のHTLV−II血清により認識され、そして同じア
ッセイにおいてHTLV−Ｉ血清により認識されない。K169
ペプチドは、ELISA基礎のアッセイにおいてHTLV−II血
清により認識されない。

HTLV−II組換え抗原及び合成HTLV−IIペプチドの両分
析からのデータは、HTLV−II特異的エピトープが17個の
アミノ酸配列Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser
−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Serに含
まれることを示す。上記で論ぜられた、HTLV−Ｉ抗原MT
A−１及びMTA−４の集中的パネリングにより得られたデ
ータは、GH2−K15の６個の最後のアミノ酸、Thr−Ser−
Trp−Thr−Thr−Lysがまた、HTLV−II抗血清により認識
されるエピトープに寄与することを示唆する。

IV.HTLV−Ｉ及びHTLV−II診断方法 本発明のHTLV−Ｉ及びHTLV−IIペプチド抗原の診断用
途の３種の基本的タイプが記載されるであろう。最初の
ものは、ペプチドによる補体介在の抗体依存性細胞溶解
の阻害に基づかれている。この方法においては、試験個
体からの血清が補体の存在下でHTLV−Ｉ又はHTLV−II感
染Ｔ−細胞クローンと反応せしめられる。抗−HTLV−Ｉ
又は抗−HTLV−II抗体の存在は、たとえばトリパンブル
ー色素排除により診断されるように細胞溶解により明白
にされる。

細胞溶解が観察される場合、HTLV−Ｉペプチドに対す
る抗−HTLV−Ｉ抗体の特異性が、まず初めに、過剰のHT
LV−Ｉ又はHTLV−IIペプチドと血清とを反応せしめ、次
に前記血清と細胞とを補体の存在下で混合することによ
って示される。HTLV−Ｉ又はHTLV−II抗体の存在は、細
胞溶解の実質的な低下により示される。この方法は例6A
に記載される。

その方法はまた、上昇する量のペプチドにより血清を
滴定し、そして細胞溶解の程度に対する目だった効果が
最初に観察されるペプチド濃度を決定することによっ
て、分析物血清における抗体力価を定量化するためにも
使用され得る。

第２の一般的アッセイタイプは、HTLV−Ｉ又はHTLV−
II感染についてヒト血清をスクリーンするための酵素−
免疫アッセイである。このアッセイ型においては、表面
結合のHTLV−Ｉ又はHTLV−II gp46ペプチド抗原を有す
る固相試薬が、その試薬上でのペプチドへの抗体結合を
可能にする条件下で分析物血清と反応せしめられる。末
結合血清成分を除去するために試薬を洗浄した後、その
試薬を酵素ラベルされた抗−ヒト抗体と反応せしめ、固
体支持体上での結合された抗−HTLV−Ｉ抗体の量に比例
して試薬に酵素を結合せしめる。試薬を再び洗浄し、末
結合抗体を除去し、そして試薬に関連する酵素の量を決
定する。アルカリホスファターゼによりラベルされた抗
−ヒト抗体を使用する１つの典型的な方法は、直接的な
HTLV−Ｉスクリーニングアッセイについて例７に記載さ
れる。酵素ラベルされた抗体、及び酵素検出のために必
要とされる試薬はまた、固体支持体上でのペプチド抗原
に結合されるヒト抗体の存在を検出するためのレポータ
ー手段として本明細書において言及される。

上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材
料、たとえばポリマービーズ、浸漬用棒、又はフィルタ
ー材料にタンパク質材料を結合せしめるための既知の技
法により調製される。それらの結合方法は一般的に、支
持体へのタンパク質の非特異的吸着（例８に記載される
フィルター支持体におけるように）又は、典型的には、
遊離アミン基を通して、固体支持体上での化学的反応性
基、たとえば活性化されたカルボキシル、ヒドロキシル
又はアルデヒド基へのタンパク質の共有結合を包含す
る。

第３の一般的アッセイタイプは、HTLV−Ｉ又はHTLV−
II抗血清を確かめることに使用するためのウェスターン
ブロットアッセイである。このアッセイ型は、本発明の
gp46ペプチド抗原の他に、HTLV−Ｉ又はHTLV−II抗血清
を検出するのに効果的である１又は複数の確認HTLV−Ｉ
又はHTLV−II抗原を含む。１つの好ましい型において
は、その確認ペプチドは、HTLV−Ｉウィルス溶解物から
のp24 gagタンパク質、及びHTLV−I gp21エンベロープ
タンパク質の大部分を含むp21E組換えエンベロープタン
パク質（Samuel,1984,1985）を含む。p24溶解物タンパ
ク質はほとんどではあるが、しかしすべてではないHTLV
−Ｉ及びHTLV−II陽性血清をピックアップする。p21E組
換えペプチドは、実質的にすべてのHTLV−Ｉ及びHTLV−
IIをピックアップするが、しかしいくつかの誤った陽性
も付与する。この改良されたウェスターンブロットアッ
セイは、本出願者及び共同研究者により報告されている
（Lipka）。このブロットアッセイ法の詳細は例８に与
えられる。

前記に記載されたように、及び例８に詳細されるよう
に、改良されたウェスターンブロット型は、ウィルス溶
解物タンパク質p24及び組換えタンパク質p21Eとの免疫
反応により明らかなように、試験されるすべてのHTLV−
Ｉ及びHTLV−II陽性血清をピックアップした（95のパネ
ル）。さらに、MTA−４ペプチドは、確認されたHTLV−
Ｉ血清のみと免疫反応性である。従って、改良されたブ
ロットアッセイは、HTLV−Ｉ又はHTLV−II抗血清を確認
するために、及び本発明のペプチドとの選択的免疫反応
により２種のタイプのHTLVウィルスを区別するために使
用され得る。

ウェスターンブロットアッセイのもう１つの態様にお
いては、HTLV−Ｉペプチド抗原がセクションIIIに記載
されるHTLV−II gpペプチド抗原により選択される。こ
の型においては、HTLV−Ｉウィルス溶解物タンパク質及
びp21E組換えタンパク質が上記のようにHTLV−Ｉ又はHT
LV−II抗血清の確認を提供する。HTLV−II特異的ペプチ
ドはHTLV−IIをピックアップするが、しかしHTLV−Ｉ抗
血清をピックアップせず、そして従って、HTLV−II抗血
清の陽性確認を提供する。

前記２種の型は、いづれかのHTLV抗血清の陽性確認を
付与するためにHTLV−Ｉ及びHTLV−II特異的ペプチド抗
原の両者を含むように組合され得る。

V.ワクチン組成物 HTLV−I gp46ペプチド及び抗原ペプチドが組合される
抗原キャリヤー、たとえば免疫原タンパク質を含むワク
チン組成物もまた本発明に包含される。前記ペプチド
は、抗−HTLV−I .5α Mab、すなわちATCC細胞系HB8755
に由来する抗体と免疫反応性である、セイションＩに記
載されるMTA−1,MTA−４及びMTA−５ペプチドの上記42
−又は47−アミノ酸オーバーラップにより形成される免
疫原領域を含む。より特定には、ペプチドは、ペプチド
配列Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−A
sn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−Serの免疫原
領域を含む。.5α Mabは中和抗体であるので、ペプチド
により生ぜしめられる抗体は、中和抗体であることが予
測される。

ワクチン組成物は他方、アミノ酸配列,Met−Thr−Leu
−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−Leu
−Trp−Phe−Ile−Thr−Ser−Glu−Pro−Thr−Gln−Pro
−Pro−Pro−Thr−Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp
−Ser−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Ser
−Thr−Ser−Trp−Thr−Thr−Lysにより形成される、及
び好ましくはアミノ酸配列,Ser−Pro−Pro−Leu−Val−
His−Asp−Ser−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Thr−
Pro−Ser−Thr−Ser−Trp−Thr−Thr−Lys,又はSer−Pr
o−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser−Asp−Leu−Glu−Hi
s−Val−Leu−Thr−Pro−Serにより形成されるHTLV−II
特異的免疫原領域を含むHTLV−II gp46ペプチドを含む
ことができる。

ペプチドのための特に有用なタンパク質キャリヤー
は、キーホールリンペット（Keyhole limpet）ヘモシア
ニン（KLH）、破傷風菌トキソイド、ポリ−Ｌ−（Lys:G
lu）；ピーナッツアグルチニン、ポリ−Ｄ−リシン、ジ
フテリアトキソイド、オボアルブミン、タイズアグルチ
ニン、ウシ血清アルブミン（BSA）、ヒト血清アルブミ
ン及び同様のものを包含する。

免疫原ペプチドは、種々の既知方法、たとえば化学的
誘導体化法及び遺伝子工学技法によりキャリヤーに接合
され得る。そのような後者の技法は、Gerald Quinna,
“Proceedings of a Work shop,"November 13−14,1984
により詳細に開示されている。本発明のワクチン及び接
種物は、注射、通常筋肉内又は皮下注射により、腸カプ
セル又は錠剤により経口的に、坐剤として、鼻用スプレ
ーとして、及び他の適切な経口路により投与され得る。
ヒト患者のためには、ポリペプチドの適切な用量は、選
択された投与路及び多くの他の要因に一部依存する。そ
れらの要因の中には、免疫化される哺乳類の体重、使用
される場合、そのキャリヤー、使用される場合のアジュ
バント、及び使用されることが所望される接種の回数が
包含される。

ヒト患者のための個々の接種は典型的には、約10μｇ
〜約100mgのポリペプチドの単位用量を含み、ここでポ
リペプチドが結合されるキャリヤーは含まない。所望に
は、一連の用量が、最適な免疫性のために一定期間にわ
たって投与され得る。所望には、ポリペプチドの前記量
を含む、ワクチンの単位用量形がまた供給され得る。

いずれにせよ、ワクチン又は接種物に含まれる免疫原
は、“有効量”で存在し、その量は免疫業界において良
く知られているような種々の要因、たとえば免疫化され
る哺乳類の体重、使用されるキャリヤー成分、使用され
るアジュバント、保護の持続時間及び所望する免疫化手
段に存在する。

次の例は、本発明の種々の観点を例示するが、しかし
本発明の範囲を制限するものではない。

材料 次の例で使用される材料は次の通りであった： 酵素:DNAアーゼＩ及びアルカリホスファターゼをBoeh
ringer Mannheim Biochemicals（BMB,Indianapolis,I
（Ｎにより得;Eco R I,Eco R Iメチラーゼ、DNAリガー
ゼ及びポリメラーゼＩをNew England Biolabs（NEB,Bev
erly,MA）から得；そしてRNアーゼをSigma（St.Louis,M
O）から得た。

他の試薬:Eco R IリンカーをNEBから得；そしてニト
ロブルーテトラゾリウム（NBT）,5−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルホスフェート（BCIP）,5−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド
（Ｘ−gal）及びイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（IPTG）をSigmaから得た。

例１ ゲノム材料のHTLV−Ｉゲノムライブラリィー源の調製 HTLV−Ｉゲノムの由来する完全コピーDNA挿入体を含
むバクテリオファージを、Laboratory of Tumor Cell B
iology,National Institute of Health（Bethesda,MD）
のDrs.R.C.Gallo and F.Wong−Staalから得た。バクテ
リオファージを消化し、Sca Iにより完結し、ウィルス
ゲノム挿入体を開放した。消化された材料を標準の１％
アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエレクトロエル
ューションにより得られた9.5K塩基のフラグメントをフ
ェノール／クロロホルムにより抽出し、その後、エタノ
ールを沈殿せしめた。

精製されたゲノムDNAを、標準の消化緩衝液（0.5Mの
トリスHCl,pH7.5;1mg/mのBSA;10mMのMnCl₂）に懸濁
し、そして室温で約５分間、DNAアーゼにより消化し
た。それらの反応条件は、従来の検量研究から決定さ
れ、ここで100〜300塩基対のフラグメントを主に生成す
るために必要とされるインキュベーション時間が決定さ
れた。材料をフェノール／クロロホルムにより抽出し、
その後、エタノール沈殿せしめた。

上記からのゲノムフラグメントを、標準条件（Huyn
h）下でDNAポリＩによりブラント末端化し、次にフェノ
ール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールに
より沈殿せしめた。ブラント末端化された材料を、標準
条件（Maniatis,396−397ページ）下でEco R Iリンカに
より連結し、次にEco R Iにより消化し、冗長性リンカ
ー端を除去した。次にその材料をアガロースゲル分別
し、非連結リンカーを除去し、そしてサイズ選択した
（下記を参照のこと）。

前記段階からの得られたフラグメントを、X174/Hae I
II及び/Hind IIIサイズマーカーを用いて1.2％アガロー
スゲル上で電気泳動（５−10V/cm）により分析した。10
0〜300bpの画分をNA45ストリップ（Schleicher and Scc
huell）上に溶出し、次にそれを溶離溶液（1MのNaCl,50
mMのアグリニン、pH9.0）を含む1.5mのマイクロチュ
ーブ中に置き、そして67℃で30〜60分間、インキュベー
トした。現在、溶液で存在するDNAをフェノール／クロ
ロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せ
しめた。ペレットを20μｌのTE（0.01MのトリスHCl,pH
7.5,0.001MのEDTA）に再懸濁した。

gt11ファージベクター（Huynh）を、promega Biotec
（Madison,WI）から得た。このクローニングベクター
は、β−ガラクトシダーゼ翻訳終結コドンから53塩基対
上流にユニークEco R I部位を有する。上記からのゲノ
ムフラグメントを、0.5〜1.0μｇのEco R I−切断gt11,
0.5〜３μｌの上記HTLV−Ｉゲノムフラグメント、0.5μ
ｌの10X連結緩衝液（上記）、0.5μｌのリガーゼ（200
単位）及び蒸留水５μｌまでを混合することによってEc
o R I部位中に導入した。前記混合物を14℃で一晩イン
キュベートし、次に標準方法（Maniatis,256〜268ペー
ジ）に従って、インビトロパッケージングした。

パッケージされたファージを用いて、Dro Kevin Moor
e,DNAX（Palo Alto,CA）から得られたE.コリ株KM392を
感染せしめた。他方、American Type culture Collecti
on（ATCC ＃37197）から入手できるE.コリ株Y1090も使
用され得る。感染された細菌をプレート化し、そしてそ
の得られたコロニーを、標準のＸ−gal基質プラークア
ッセイ法（Maniatis）を用いてＸ−galの存在下でβ−
ガラクトシダーゼ活性の損失について調べた（透明なプ
ラーク）。下記表２は、Eco R I−末端化HTLV−Ｉフラ
グメント（第１列）の挿入により得られた組換え（透
明）プラークの数を示す。Eco R Iリンカー対照（第２
列）及びベクターのみ（第３列）をまた試験した。見ら
れるように、約50％のファージプラークが酵素の損失を
示した（組換え）。Eco R Iリンカーの存在又は不在下
でのバックグラウンドレベルは15％以下であり、これは
HTLV−Ｉエピトープライブラリィーの好ましい生成を示
す。ファージライブラリィーは約10⁶個のプラーク形成
単位（pfu）/mを含んだ。

例２ gp46コード挿入体についてのスクリーニング ヒト細胞系（ATCC ＃C8755）に由来する精製された.5
抗体は、National Can or Institute,National Institu
tes of Health（Bethesda,MD）のDr.Samuel Broderによ
り提供された。アルカリホスファターゼにより共有的に
誘導されたマウス抗−ヒトIgG抗体は、promega Biotec
（Madison,WI）から得た。

例１からの約10⁴pfuのファージストックにより感染さ
れたKM392細胞のローンを、150mmのプレート上に調製
し、37℃で５〜８時間、時々逆にしながらインキュベー
トした。ローンをニトロセルロースシートにより被覆
し、プラークからのHTLV−Ｉ組換えタンパク質を紙に移
した。プレート及びフィルターを、対応するプレート及
びフィルター位置を適合するために印を付けた。

フィルターを、TBST緩衝液（10mMのトリス,pH8.0,150
mMのNaCl,0.5％のTween20）により２度洗浄し、AIB（１
％ゼラチンを含むTBST緩衝液）によりブロックし、TBST
により再び洗浄し、そして.5モノクローナル抗体（AIB
により１〜２μg/mに希釈された、12−15m／プレー
ト）の添加の後、一晩インキュベートした。シートをTB
STにより２度洗浄し、次に酵素ラベルされた抗−ヒト抗
体と接触せしめ、.5抗体により認識される抗原を含むフ
ィルター部位で、ラベルされた抗体を結合した。最終洗
浄の後、フィルターを、アルカリホスファターゼ緩衝液
（100mMのトリス,pH9.5,100mMのNaCl,5mMのMgCl₂）5m
中、NBT（５℃で維持されている50mg/mのストック溶
液）33μｌを含む基質媒体中で展開せしめた。反応した
基質は、0.5α Mabにより認識される場合、抗原生成の
点で現われた。

前段階で決定された抗原生成の領域を、82mmプレート
上に約100〜200pfuで再プレートした。NBT/BCIPを通し
て５〜８時間のインキュベーションで始まる上記段階を
くり返し、.5α Mabと反応できる抗原を分泌するプラー
クを同定した。その同定されたプラークを取り、そして
ファージ緩衝液（Maniatis,443ページ）により溶離し
た。抗体反応性ペプチドを分泌する３種の組換えファー
ジプラークを、例３の方法に従って、配列決定分析のた
めに選択した。その対応する感染されたファージを、MT
A−4,MTA−１及びMTA−５と命名した。

例３ ファージ精製及びDNA抽出 ファージMTA−4,MTA−１及びMTA−５を、感染された
E.コリ Y1088細菌のプレート培養物から単離した。それ
らの細胞はATCC（ATCC ＃31195）から入手できる。ファ
ージをファージ−希釈緩衝液（maniatis）の添加により
集め、その材料を低速度遠心分離により細菌残骸から精
製し、そして上清液をSW27管中に注いだ。RNアーゼ及び
DNアーゼを、1mg/mのストック溶液から１μl/mの濃
度の個々に添加した。サンプルを37℃で30分間インキュ
ベートし、そして同体積のポリエチレングリコール（PE
G）,5.8gのNaCl,2.0gのMgSO₄・7H₂O,1MのトリスHCl,pH
7.5及び２％のゼラチンを添加した。サンプルを水浴中
に１時間配置し、ファージ粒子の沈殿を引き起こし、次
にそれを４℃で約20分間の遠心分離により単離した。

上清液をデカントし、そしてペレットをPDB緩衝液
（5.8gのNaCl,2.0gのMgSO₄・7H₂O,1MのトリスCl50m,p
H7.4及び２％のゼラチン5m）0.6mに再懸濁し、そし
て0.5mのポリプロピレンマイクロ管に移した。10％の
SDS5μl,0.5MのEDTA5μｌ及びプロライナーゼＫ（20mg/
m）2.5μｌを添加し、そしてサンプルを50℃で15分間
インキュベートした。

界面活性剤及び酵素−処理された材料を、同体積のフ
ェノール／クロロホルムにより抽出し、そして遠心分離
し、相の分離を確保した。水性相を新しい管に移し、そ
して抽出／遠心分離工程を、クロロホルム及びイソアミ
ルアルコールの混合物によりくり返した。同体積のイソ
プロパノールを添加し、そしてそれを数回返転し、混合
せしめ、そして20分間にたって−70℃に冷却した。サン
プルを５分間、遠心分離し、そして上清液をデカントし
た。ペレットを70％エタノールにより洗浄し、すぐに37
℃の熱ブロックで乾燥せしめ、そして100μｌのTE緩衝
液（pH7.5）に再懸濁した。

単離されたファージDNAをKpn I及びSac Iにより消化
し、そして次に、Kpn I/Sac Iにより切断されたプラス
ミドベクターpGEM−３（Promega Biotec）と共に組合
し、対象の挿入体を含むプラスミド組換え体を単離し
た。次に、HTLV−Ｉ挿入体を、標準のジデオキシ配列決
定法及びEco R I挿入部位を端に有するλ gt1配列のた
めの前方及び逆方向プライマーを用いて配列決定した。

図は、試験される３種の融合ペプチドの個々に関し、
上記方法により形成された融合タンパク質の一部のコー
ド配列及び対応するアミノ酸配列を示す。β−gal遺伝
子の末端Ｇ塩基及び３種々挿入体配列の個々により寄与
されるenv遺伝子の隣接するCC塩基は、GCC（Ala）コド
ンを生成し、すべての３種のenv挿入体のそのコドン位
置で通常存在するSerコドンを置換する。示されるよう
に、MTA−４における挿入体は、HTLV−Ｉコード領域の
塩基5564から5790に延長する225個の塩基対配列を含
む。MTA5ファージの挿入体は、塩基5664で始まり、そし
て塩基5895まで拡張する。231個の塩基対配列は、gp46
タンパク質のアミノ酸162〜240を包含する。

5664〜5790の挿入体オーバーラップの領域は、生来の
gp46タンパク質のアミノ酸162〜203の42個のアミノ酸配
列を含む。

例４ HTLV−Ｉペプチド抗原の単離 A.容原体の構成 Eco R I株C600は、Stanford University（Stanford,C
A）のDr.R.Davisから得られた。他方、Eco R I Y1089
（ATCC ＃37196）も使用され得る。細胞の飽和された一
晩の培養物1mを、例３からの３種のファージの１つに
より、一晩の細菌培養物50μｌに溶離されたプラークス
トック10μｌを吸着することによって感染せしめた。感
染された細菌を、LB寒天プレート（Maniatis,440ペー
ジ）のみに広げ、そして32℃でインキュベートした。個
々のコロニーを、殺菌したつまようじにより、２種の別
々のプレート上の対応するグリッド上に取った。プレー
トの１つを、32℃でインキュベートし、そして他を42℃
でインキュベートした。低温で増殖する（ファージレプ
レッサータンパク質の存在により生成された溶原性状態
を示す）が、しかし高温で増殖しない（細胞溶解のため
に）細胞は、溶原性であることが仮定された。３種のフ
ァージタイプの個々からの多くの容原体コロニーが見出
された。

B.容原体からの組換え抗原誘発 この例は、MTA−４ファージにより例４において調製
されたλ gt11容原体からのHTLV−Ｉエピトープを含む
組換えタンパク質の誘発を記載する。上記のように、抗
原は、ファージ−galタンパク質のＮ−末端部分も含む
α−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の形で生成され
る。１のdHO中、バクト−トリプトン35g,バクト−酵
母抽出物2g,NaCl5g及び1NのNaOH5mを含む超ブイヨン
を調製した。その超ブイヨン500mを、前の例で調製さ
れたEco R I λ gt11溶原体の飽和された一晩の培養物
により1:100で接種した。その培養物を、激しい空気供
給を伴ってA600 0.4〜0.5にインキュベートした。

タンパク質生成を最大にするために、培養物の温度を
43〜44℃に上げ、それによって感温性α−ガラクトシダ
ーゼリプレッサー遺伝子を不活性化した。温度を、空気
供給しながら、15分間の65℃の水浴により43℃で維持し
た。α−ガラクトシダーゼリプレッサーに競争的に結合
することによってα−ガラクトシダーゼ発現を誘発する
IPTGを、2mMまで前記ブイヨンに添加し、タンパク質生
成をさらに高めた。培養物を38℃のシェーカーに約１時
間、戻した。次に、細胞を、37℃で15分間、6,000xgで
ペレット化し、溶解緩衝液（10mMのトリス,pH7.4,2％の
Triton X−100,1％のアプロチニン及び50μｇのPMSF）
に再懸濁し、そしてすぐに液体N₂中にパージした。溶解
を、凍結サンプルの融解に基づいて完結した。

C.融合タンパク質の精製 前の例で得られた細胞溶解物を融解し、そして37℃に
暖めた。10μｌのDNアーゼ（１μg/m）を添加し、そ
してその混合物を、粘度が低下するまで、インキュベー
トした。溶解物をすばやく、氷上で急冷し、マイクロフ
ェージにおいて４℃で５分間、透明にし、そしてSephar
ose 4B（Pharmacia）に結合された抗−α−ガラクトシ
ダーゼの6mカラム上に負荷した。カラムを１〜２時
間、平衡化し、そして７体積（カラム体積）のTX緩衝液
（10mMのトリス,pH8.0,2％のTriton X−100,50μg/m
のPMSF）、続いて２体積の、TX緩衝液中、5mMの3,5−ジ
ョードサリチル酸溶液により洗浄した。次に、融合タン
パク質を、TX緩衝液中、35mMの3,5−ジョードサリチル
酸溶液によりカラムから溶出した。大部分のタンパク質
が最初の３〜４体積に溶出され、そして残りは７体積の
後、実質的に完結した。

溶出されたサンプルを脱塩し、そしてAmiconフィルタ
ー（Danvers,MA）を用いて濃縮した。

例５ HTLV−II抗原の調製 A.HTLV−II DNA配列の合成及びクローニング ポリメラーゼ鎖反応（PCR）方法を用いて、クローニ
ングのためのHTLV−II DNA配列を生成した。６個の30bp
のDNAプライマーを合成した。すべての６個のプライマ
ーは、3bpのgt11配列、続いてそれらの５′端でEco R I
部位を有した。この後、それらの５′端でEco R I部位
が存在した。この後に、21bpのHTLV−II配列が存在し
た。３個の前方向プライマーーは、ヌクレオチド5648−
5668,5687−5707及び5726−5745に対応するHTLV−II配
列を含んだ。３個の逆方向プライマーは、ヌクレオチド
5794−5774,5776−5756,及び5728−5708に対応するHTLV
−II配列を含んだ。

PCRを、製造業者の指示（Perkin Elmer/Cetus）に従
って行ない、そしてすべてのPCR反応は鋳型として2ngの
上記HTLVクローン及び１μＭの適切なPCRプライマーを
含んだ。PCR増幅を25サイクル行なった。個々のサイク
ルは、94℃での１分間の鋳型変性、50℃での２分間の鋳
型へのプライマーのアニーリング、続いて、72℃での２
分間のプライマー拡張を包含した。その後、増幅された
DNAを精製し、そして次に、Eco R Iにより完全に消化し
た。次に、消化されたDNAをλ gt11のEco R I部位に連
結した。次に、組換えファージDNAをパッケージし、そ
して非組換えファージの頻度を、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの存
在下でプレートすることによって決定した。

組換えファージ：非組換えファージの比は、約50/1で
あった。６個の組換えファージクローンの個々からの複
数の単離されたプラークを取り、そして続いて、λ gt1
1フランキングプライマー11F及び11R,及び／又は上記HT
LV−IIプラークによりPCRを用いてスクリーンした。次
に、正しいサイズで且つ配向された挿入体を含むクロー
ンを増幅し、そして続くイムノスクリーニングアッセイ
に使用した。３種のクローンGH2−K15,GH2−K16及びGH2
−K35からのEco R Iフラグメントを、pGEX−１プラスミ
ドにサブクローンし、そしてDNAを配列決定した。得ら
れた配列は、HTLV−II（Shimotokno）の所望する領域に
ついての報告された配列と完全に一致した。

B.HTLV−IIクローンの免疫学的分析 組換えファージを、野生型gt11と共に1/1で混合し、
そしてそれを用いて、E.コリ株KM−392を感染せしめ
た。約５時間、そのファージを増殖した後、発現された
タンパク質をニトロセルロースフィルターに一晩結合せ
しめた。続いて、フィルターをTBS（0.5MのNaCl,20mMの
トリス,pH8.0）により３度洗浄し、断片に切断し、そし
てTBS＋１％のGelatinを用いてブロックした。次に、フ
ィルター断片を、第１段階の抗体、通常、TBS＋ゼラチ
ンに1/100で希釈された、HTLV−Ｉ又はHTLV−II感染個
人からの血清と共に一晩インキュベートした。TBSによ
り洗浄した後、フィルターを、アルカリホスファターゼ
接合のヤギ抗ヒト血清と共に少なくとも１時間インキュ
ベートした。フィルターをTBSにより洗浄し、そして結
合された抗体を、ニトロブル−テトラゾリウムクロリド
及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ートの溶液に前記フィルターをインキュベートすること
によって検出した。特定の血清を、組換えファージに由
来するプラークが野生型gt11のプラークから明白に区別
され得る場合に、陽性であるとして評価した。

C.組換え抗原の発現及び精製 β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を、まず溶原体
を生成することによって発現した。組換えgt11ファージ
を用いて、E.コリ株BNN103を感染せしめ、そして溶原体
を32℃及び42℃で２重反復プレートを増殖することによ
って同定した。融合タンパク質の生成を、溶原体の対数
相培養物の温度を42℃に15分間、上昇せしめることによ
って誘発した。次に、イソプロピルチオガラクトシドを
添加し、1.6Mmの最終濃度にし、そして培養物を37℃で
さらに１時間増殖せしめた。次に、細胞を、5000xgで15
分間の遠心分離によりペレット化し、そして溶解緩衝液
（２％のTriton X−100,1％のアプロチニン,10mMのトリ
ス,pH7.4）の1/50番目の元の培養物体積に再懸濁した。
次に、前記溶液を、ドライアイス／エタノール浴におけ
る含浸により凍結し、そして次に融解した。DNアーゼＩ
を添加し、１μg/mの最終濃度にし、そして次に溶解
物を室温で５分間インキュベートした。次に、不溶性残
骸を、10,000xgで10分間、遠心分離によりペレット化し
た。次に、上清液を前記のようにして遠心分離した。前
記ペレット及び上清液画分のアリコートのドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−P
AGE,Lammeli）分析は、GH2−K15が上清液画分に主とし
て見出されたことを示した。

次に、上清液画分を、2mのProtosorb LacZ吸着剤
（Promega）と共に組合し、そして25℃で２時間、撹拌
しながらインキュベートした。次に、カラム樹脂を使い
捨てカラム中に注ぎ、そして10mのTX緩衝液（１％の
アプロチニン、10mMのトリス,pH7.4）により２度洗浄し
た。結合されたタンパク質を、pH10.8の炭酸塩緩衝液14
mにより溶出し、そして2mの画分を、2Mのトリス緩
衝液（pH7.5）1mをすでに含む管中に集めた。次に、
画分を、製造業者の指示に従ってCentricon 30s（Amico
n）を用いて濃縮した。画分を2mのMTBS緩衝液（150mM
のNaCl,4mMのNaH₂PO₄,16mMのNa₂HPO₄,pH7.3）により洗
浄し、そして次に再び濃縮した。

精製された融合タンパク質の位置、収率及び純度を、
SDS−PAGEを用いて決定した。イムノアフィニティーカ
ラムGH2−K15を通しての１回の通過後、組換え抗原は約
70％の純度であった。融合タンパク質を含む画分をプー
ルし、そしてそのプールのアリコートを続くウェスター
ンブロット実験に用いた。ウェスターンブロット分析を
上記のようにして（Lipka）を行なった。滴定実験は、
精製されたGH2−K15抗原の最適負荷が３μｇのタンパク
質/cmニトロセルロースであることを決定した。ペプチ
ド競争実験は、例6Cに記載される。次に、ブロットされ
た抗原を含むニトロセルロースストリップを、血清サン
プルに添加し、そしてインキュベートし、そして通常の
ようにして進展せしめた。

D.HTLV抗血清 血清サンプルを、HTLV−I,HTLV−II又はELISA反応性
−HTLV陰性個人から得た。それらのサンプルは、複数の
異なった源及び地理的領域からであった。多くの血清陽
性血清サンプルを、株特異的DNAプライマーによるPCRを
用いてHTLV−Ｉ又はHTLV−II感染について類型に分け
た。HTLV−Ｉ血清サンプルは、ジャマイカ人の食品調理
人からの45個のサンプル、ニューオリンズ領域からの２
人の静脈薬物ユーザー（IVDU）及び11人の北カリホルニ
ア血液ドナーからのサンプルから成る58種のPCR証明サ
ンプルを包含した。さらに、合計238個のHTLV−Ｉ血清
サンプルを日本から得た。日本人のサンプルに関して
は、PCRデータは利用できず、そして感染は前記基準（L
ipkaなど.JID）を用いてHTLV−Ｉ抗原に対する血清サン
プルのウェスターンブロット分析により分類された。HT
LV−II血清サンプルは、ニューオリンズ領域からの６人
のIVDU、北カリホルニア領域からの24人のIVDU及び北カ
リホルニア領域からの27人の血液ドナーから成る57種の
PCR証明サンプルを包含した。HTLV陰性血清は、１人の
ジャマイカ人食品調理人、15人のカリホルニア血液ドナ
ー及び日本人からの29種のサンプルを包含した。血清サ
ンプルのPCR分析は、前記のようにして行なわれた（Lip
ka）。

例６ ペプチド抗原免疫反応性の検出 A.細胞溶解の阻害 HUT 102−B2細胞を、Dr.R.C.Gallo,LTCB,NIHから得
た。これは、HTLV−Ｉを生成することが知られている長
期培養されたＴ−細胞系である。

.5α抗体（約５μg/mlのIgG）又は対照のイソタイプ
化された適合性ヒトIgGを、MTA−４組換えペプチド又は
不適切な組換え体と共に室温で30分間プレインキュベー
トした。次に、それらの混合物50μｌを、96−ウェルマ
イクロタイタープレートにおける５×10⁵個のHUt O2B2
細胞に添加し、そして室温で30分間インキュベートし
た。ウェル当たり30μｌのウサギ補体を添加し、そして
37℃で１時間インキュベートした。細胞生存率を、顕微
鏡試験により決定した。細胞溶解は、MTA−４ペプチド
抗原の添加により明らかに阻害されるが、しかし不適切
な組換えペプチド抗原と共にプレインキュベートするこ
とによっては阻害されなかった。組換え抗原又は不適切
な組換えペプチド抗原のいづれかと共にプレインキュベ
ートした後、イソタイプ化された適合性ヒトIgGは、HUT
102−B2生存率に対して効果を有さなかった。

B.ELISAアッセイ HTLV−Ｉ及びHTLV−IIペプチドをELISAアッセイで試
験し、上記合成ペプチドに結合する、HTLV感染された個
人からの血清の能力を決定した。簡単に言及すれば、EL
ISAアッセイは、マイクロタイタープレートへの一定量
の合成ペプチドの結合、続く、HTLV感染された個人から
の血清の添加を包含した。次に、未結合血清を洗浄によ
り除去し、そしてペプチドに結合された抗体を第２抗体
により検出した。第２抗体は、着色された生成物に無色
基質を転換する酵素に接合される。生成された着色生成
物の量は、ペプチドを結合した血清抗体の量を示す。結
合したペプチドに対する特定の血清から得られたシグナ
ルを、いづれのペプチドも含まないウェルからの血清に
より得られたシグナルから引き算した。負のペプチドバ
ックグラウンドの引き算の後に得られた値は、陽性と思
われるバックグラウンド値の2.5倍であるべきであっ
た。

C.抗体結合阻害 阻害アッセイは、その上にブロットされるHTLV−Ｉ又
はHTLV−II組換え抗原を含むニトロセルロースのストリ
ップを配置する前、HTLV感染された個人からの血清と共
に高い過剰量の合成ペプチドのインキュベーションを包
含する。血清がペプチドに結合できる場合、抗体を含む
ばく大な過剰量のペプチド溶液は、ニトロセルロースス
トリップ上に存在する比較的少量の抗原への抗体の有意
な結合を妨げるであろう。ニトロセルロースストリップ
上での組換え抗原に結合される抗体の量を、ELISAアッ
セイについて上記で述べた態様に類似する態様で、酵素
接合された第２抗体を用いて決定する。対照実験は、HT
LV−IIペプチドK125と共にHTLV−Ｉ血清のインキュベー
ション又はHTLV−Ｉペプチドと共にHTLV−II血清のイン
キュベーション、及び次に、適切な組換え抗原を認識す
るための血清の能力の決定を包含する。

例７ EIAアッセイ 精製されたMTA−４ペプチド抗原を例４におけるよう
にして調製し、そしてニトロセルロースフィルター上に
ドットブロットし、次に、Ｔ−細胞白血病を有する患者
（HTLV−Ｉ感染を有する６人の患者）における血清抗体
の決定について固相アッセイに使用した。個々の場合、
試験個人からの1:100〜1:50,000の範囲の種々の血清希
釈溶液0.1mlを、フィルターに添加し、そして室温で30
分間そのままに保持した。次に、フィルターをTBST緩衝
液（例２）により２度洗浄し、そして例２におけるよう
にして、アルカリホスファターゼにより接合される抗−
ヒト抗体と共にインキュベートした。抗体の存在を、例
２におけるようにしてNBT及びBCIPにおける色の展開に
より決定した。

例８ HTLV−Ｉ陽性血清を確かめるための変性されたウェスタ
ーンブロット 組換えMTA−１を、例４におけるようにして調製し
た。組換えp21Eを、前記（Samuel,1984,1985）のように
して調製した。HTLV−IIウィルス溶解物を、慢性的に感
染された細胞系MT−２（Hillcrest Biologicals,Cypres
s,CA）から調製した。それらのHTLV−Ｉ抗原を組合し、
そして次に、11.5％のアクリルアミドSDS/PAGEゲル（La
emmli）上で還元条件下で分離した。識別されたタンパ
ク質を、ニトロセルロース上で〔ブロット−（100mMの
トリス−HCl（pH7.4）中、５％ノンファットドライミル
ク、2.5％の正常なヤギ血清）によりブロックされたニ
トロセルロース膜上で〕電気ブロットし、空気乾燥せし
め、そして3mmの幅のストリップに切断した。

アッセイにおいては、上記からの試験ストリップをま
ず、TBS緩衝液において再水和化し、そしてストリップ
をブロット−に1:50の比で希釈されたヒト試験血清と共
に一晩インキュベートした。ストリップを洗浄用緩衝液
により数回洗浄し、次にアルカリホスファターゼに接合
されたヤギ抗−ヒトIgG（Bio−Rad,Richmond,CA）と共
に１時間インキュベートした。洗浄の後、色の展開を、
100mMのトリス−HCl緩衝液（pH9.5）及び50mMのMgCl
₂中、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフ
ェート及びニトロブルテトラゾリウムを含む基質溶液に
おいてストリップをインキュベートすることによって達
成した。色の展開を、均質のバックグラウンドがストリ
ップ上で成長するまで続け、そして脱イオン水により２
度ストリップをすすぐことによって一旦停止せしめた。

HTLV−Ｉ又はHTLV−II陽性血清のパネルを試験した。
それらは、PCR分析によりHTLV−Ｉ又はHTLV−II陽性と
して前もって確認された（Lipka）。その結果は、図６
に示され、ここでパネルＡ−ＧはHTLV−Ｉ抗血清であ
り、そしてパネルＨ−ＳはHTLV−II抗血清である。ウィ
ルス溶解物タンパク質gp24は、組換えペプチドgp21Eと
同じように、あらゆる血清サンプルと免疫反応性であっ
た。MTA−４は、HTLV−Ｉ血清サンプルのみと免疫反応
性であった。

本発明は特定の態様、構成方法及び使用方法に関して
記載されて来たが、種々の他の使用法、配合及び実施方
法は本発明の範囲内にあることが当業者に明らかであろ
う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ハドロック，ケネス ジー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94541，ヘイワード，＃501，バーモント ストリート 22815 (56)参考文献 国際公開90／10231（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 7/08 C07K 14/15 G01N 33/574 G01N 33/577 C12P 21/00 - 21/02 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】HTLV−Ｉエンベロープタンパク質gp46に由
   来する免疫反応性ペプチド抗原であって、該抗原は、以
   下： ａ）Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−A
   sn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−Serで表され
   るアミノ酸配列； ｂ）Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−P
   ro−Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−G
   ln−Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−P
   ro−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−P
   ro−Serで表されるアミノ酸配列； ｃ）Ser−Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−A
   sp−Pro−Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−S
   er−Gln−Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−L
   eu−Pro−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−G
   lu−Pro−Ser−Ile−Pro−Trp−Lys−Ser−Lysで表され
   るアミノ酸配列；または ｄ）Ser−Pro−Tyr−Trp−Lys−Phe−Gln−His−Asp−V
   al−Asn−Phe−Thr−Gln−Glu−Val−Ser−Arg−Leu−A
   sn−Ile−Asn−Leu−His−Phe−Ser−Lys−Cys−Gly−P
   he−Pro−Phe−Ser−Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−G
   ly−Tyr−Asp−Pro−Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−G
   lu−Pro−Ser−Gln−Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−P
   ro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−I
   le−Leu−Glu−Pro−Serで表されるアミノ酸配列、 からなる抗原であって、 ここで、該抗原は、抗HTLV−Ｉ抗血清と結合するが、抗
   HTLV−II抗血清と交差反応しない、抗原。
2. 【請求項２】HTLV−Ｉエンベロープタンパク質gp46に由
   来する免疫反応性ペプチド抗原であって、該抗原は、Se
   r−Pro−Tyr−Trp−Lys−Phe−Gln−His−Asp−Val−As
   n−Phe−Thr−Gln−Glu−Val−Ser−Arg−Leu−Asn−Il
   e−Asn−Leu−His−Phe−Ser−Lys−Cys−Gly−Phe−Pr
   o−Phe−Ser−Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Ty
   r−Asp−Pro−Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pr
   o−Ser−Gln−Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Le
   u−Leu−Pro−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Le
   u−Glu−Pro−Serで表されるアミノ酸配列のフラグメン
   トからなる抗原であって、 ここで、該抗原は、Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pr
   o−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pr
   o−Serで表されるアミノ酸配列を含み、 ここで、該抗原は、抗HTLV−Ｉ抗血清と結合するが、抗
   HTLV−II抗血清と交差反応しない、抗原。
3. 【請求項３】HTLV−Ｉエンベロープタンパク質gp46に由
   来する免疫反応性ペプチド抗原であって、該抗原は、Se
   r−Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pr
   o−Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gl
   n−Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pr
   o−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pr
   o−Ser−Ile−Pro−Trp−Lys−Ser−Lysで表されるアミ
   ノ酸配列のフラグメントからなる抗原であって、 ここで、該抗原は、Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pr
   o−His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pr
   o−Serで表されるアミノ酸配列を含み、 ここで、該抗原は、抗HTLV−Ｉ抗血清と結合するが、抗
   HTLV−II抗血清と交差反応しない、抗原。
4. 【請求項４】HTLV−IIエンベロープタンパク質gp46に由
   来する免疫反応性ペプチド抗原であって、該抗原が、Me
   t−Thr−Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−As
   p−Pro−Leu−Trp−Phe−Ile−Thr−Ser−Glu−Pro−Th
   r−Gln−Pro−Pro−Pro−Thr−Ser−Pro−Pro−Leu−Va
   l−His−Asp−Ser−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Th
   r−Pro−Ser−Thr−Ser−Trp−Thr−Thr−Lysで表され
   るアミノ酸配列のフラグメントからなる抗原であって、 ここで、該抗原は、Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−As
   p−Ser−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Se
   rで表されるアミノ酸配列を含み、 ここで、該抗原は、抗HTLV−II抗血清と結合するが、抗
   HTLV−Ｉ抗血清と交差反応しない、抗原。
5. 【請求項５】HTLV−IIエンベロープタンパク質gp46に由
   来する免疫反応性ペプチド抗原であって、該抗原が、Se
   r−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser−Asp−Leu−Gl
   u−His−Val−Leu−Thr−Pro−Ser−Thr−Ser−Trp−Th
   r−Thrで表されるアミノ酸配列のフラグメントからなる
   抗原であって、 ここで、該抗原は、Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−As
   p−Ser−Asp−Leu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Se
   rで表されるアミノ酸配列を含み、 ここで、該抗原は、抗HTLV−II抗血清と結合するが、AT
   CC HB8755に由来する抗HTLV−Ｉモノクローナル抗体と
   交差反応しない、抗原。
6. 【請求項６】HTLV−IIエンベロープタンパク質gp46に由
   来する免疫反応性ペプチド抗原であって、該抗原は、以
   下： ａ）Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser−Asp−L
   eu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Serで表されるア
   ミノ酸配列； ｂ）Ser−Pro−Pro−Leu−Val−His−Asp−Ser−Asp−L
   eu−Glu−His−Val−Leu−Thr−Pro−Ser−Thr−Ser−T
   rp−Thr−Thrで表されるアミノ酸配列；または ｃ）Met−Thr−Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−T
   yr−Asp−Pro−Leu−Trp−Phe−Ile−Thr−Ser−Glu−P
   ro−Thr−Gln−Pro−Pro−Pro−Thr−Ser−Pro−Pro−L
   eu−Val−His−Asp−Ser−Asp−Leu−Glu−His−Val−L
   eu−Thr−Pro−Ser−Thr−Ser−Trp−Thr−Thr−Lysで
   表されるアミノ酸配列、 からなる抗原であって、 ここで、該抗原は、抗HTLV−II抗血清と結合するが、AT
   CCHB8755に由来する抗HTLV−Ｉモノクローナル抗体と交
   差反応しない、抗原。
7. 【請求項７】HTLV−Ｉでの感染およびHTLV−IIでの感染
   を検出し、そしてHTLV−Ｉでの感染とHTLV−IIでの感染
   とを区別するためのキットであって、該キットは、請求
   項１〜６に記載のペプチド抗原の少なくとも１つを含
   む、キット。
8. 【請求項８】請求項１〜３に記載のペプチド抗原の少な
   くとも１つを含む、請求項７に記載のキット。
9. 【請求項９】請求項４〜６に記載のペプチド抗原の少な
   くとも１つを含む、請求項７に記載のキット。
10. 【請求項１０】請求項４〜６に記載のペプチド抗原の少
    なくとも１つを、請求項１〜３に記載のペプチド抗原の
    少なくとも１つとともに含む、請求項７に記載のキッ
    ト。
11. 【請求項１１】前記ペプチド抗原は、固体支持体上に固
    定化されている、請求項７〜10のいずれか１項に記載の
    キット。
12. 【請求項１２】請求項10に記載のキットであって、該キ
    ットは、以下： （ａ）請求項４〜６に記載のペプチド抗原の少なくとも
    １つを含む抗原；および （ｂ）請求項１〜３に記載のペプチド抗原の少なくとも
    １つを含む抗原、 を含み、 ここで、該抗原（ａ）は、該抗原（ｂ）から間隔を空け
    て固体支持体上の１つ以上の位置に固定化されている、
    キット。