JPH06508503A

JPH06508503A - Ｈｔｌｖ−１及びｈｔｌｖ−２ペプチド抗原及び方法

Info

Publication number: JPH06508503A
Application number: JP4506440A
Authority: JP
Inventors: レイズ，グレゴリー　アール．; ハドロック，ケネス　ジー．
Original assignee: ジェネラブス　テクノロジイズ，インコーポレイティド
Priority date: 1991-02-08
Filing date: 1992-02-03
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: WO1992013946A1; US5614366A; CA2100586A1; US5763572A; AU1564492A; EP0570509A1; US5928861A; SG49843A1; US5814441A; US5871933A; CA2100586C; AU667189B2; JP3439208B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩペプチド抗原及び方法本出願は、現在は放棄されているが、１９８６年１２月３１日に出願された出願番号第９４８，２７０の “ＩＩＴＬＶ−１ペプチド抗原及び方法”についてのアメリカ特許出願の一部継続出願である、１９８９年６月１３日に出願された出願番号第３６６．３１３号の“ＨＴＬＶ−１ペプチド抗原及び方法”についてのアメリカ特許出願の一部継続出願である。

１、光更■公団本発明はＩ（ＴＬＶ−１特異的抗原、及びその抗原の調製方法及び使用方法に関する。

２・髪皿文献Ｃｗｉｒｌａ、　Ｓ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ＋υＳ＾、　８７：６３７８（１９９０）　。

Ｈｕｙｎｈ＋　Ｔ、Ｖ、、ｅｔ　ａｌ、＋ｉｎ　”ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ｖｏｌｕｍｅ　１　、　”　ｅｄ。

Ｄ、Ｍ、ＧＩｏｖｅｒ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，：　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　１９８５　（Ｃｈａｐｔｅｒ　２）　。

Ｌａｅｗ＋＋＊Ｉｉ、　Ｕ、に、、ＮａＬｕｒｅ、　２２７：６８０　（１９７０）。

Ｌｉｐｋａ、　Ｊ、Ｊ、＋ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、　１６２：３５３　（１９９０）　。

Ｌｉｐｋａ、　Ｊ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　４３　Ｍｅｅｔｉｎｇ　（１９９０）。

Ｍａｎｉａｔｉｓ＋　Ｔ、＋ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏ旦ｎ　二Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＬＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）。

Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ＋　５．＋ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）＋　８３：２６７２（１９８６）　。

Ｐｏ１ｅｓｚ、Ｂ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）、　ヱヱ：７４１５（１９８０）　。

Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｍ、＋ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２９：８５６　（１９８３）　。

Ｓａｍｕｅｌ、Ｋ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２６：１０９４　（１９８４）。

Ｓａｍｕｅｌ、Ｋ、Ｐ、、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ　Ｔｅｃｈ、２　：６０　（１９８５）Ｓｃｏｔｔ、Ｊ、Ｔ、＜　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６　（１９９０）　。

５ｅｉｋｉ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）＋　８０：３６１Ｂ（１９８３）。

Ｓｈｉｍｏｔｏｋｎｏ＋　に、＋ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８２：３１０１（１９８５）　。

３．３浬し１１最ヒトＴ−細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）は、３種の知られているメンバーを有するＴ−細胞レトロウィルスの種類を示す。ＨＴＬＶタイプｒ　（）ＩＴＬＶ− １）はインビトロで形質転換活性を有し、そして世界のいくつかの場所において風土病であることが知られている、成人Ｔ−細胞白血病に病因学的に結合される。ＨＴＬＶ−ＩＩはインビトロで形質転換能力を有するもう１つのレトロウィルスであり、そして毛髪細胞白血病のＴ−細胞変異体を有する患者から単離されて来た。リンパ節疾患−関連ウィルスともまた呼ばれ、そして現在、ヒト免疫不全ウィルス（）Ｉｎとしても知られるＨＴＬＶ−ＩＩＩは、ある種類のＴ細胞に対して溶菌性であり、そして後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原に結合されて来た。ＨＴＬＶ−ｒ及び−■ウィルスとは異なって、ＨＴＬＶ−ＩＩＩはインビトロ形質転換活性を有することは知られていない。

）ＩＴＬＶ−１感染の診断は通常、ＨＴＬＶ−１ペプチド抗原に対する血清抗体応答に基づかれる。これは通常、１（ＴＬＶ−１ピリオンペプチドによる酵素イムノアッセイ（Ｅｌ＾）に基づいて、ＨＴＬシー■抗体を固定するだめに初期スクリーニングアッセイを包含する。血液スクリーニングのために現在使用されるアッセイは、約０．５〜０．０５％ノＨＴＬＶ　−■及び１（ＴＬＶ−ｎ陽性を検出し；それらの中で、５個のうち約４個が誤った陽性である。従って、陽性血清は、特定のＨＴＬＶ−１ペプチド抗原に対する抗原反応を検出する、ウェスターンプロット又はラジオイムノ沈殿アッセイを用いての確認アッセイでさらに試験されるべきである。

現在の血液試験方法は、ＨＴＬＶ　−Ｉ　ｐ２４　ｇａｇタンパク質及びエンベロープタンパク質ｇｐ４６＋　ｇｐ２１又はｇｐ６８の少なくとも１つとの免疫反応に基づく確認試験を必要とする。試験抗原がピリオンタンパク質から調製される場合、ｇｐ４６のみが真の）ＩＴＬＶ　−１血清陽性体との高い抗体反応率を与える。その時でさえ、ｇｐ４６との反応はより感度の高いラジオイムノ沈殿アッセイによる追加の抗原試験によってのみ検出され得る。上記スクリーニング及び確認試験は）ＩＴＬＶ−１及びＩＩＴＬＶ−ｎ陽性体を固定するが、しかしそれらの２種のＨＴＬＶウィルス間を区別することはできない。

従って、ＨＴＬＶ−１陽性血清を検出するための改良された方法を提供することが所望される。特に、改良された試験は、最少数の誤った陽性を伴って、すべてのＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ　−Ｉｆ陽性血清を検出することができ、そしてまた、）ＩＴＬＶ−ＩＩ陽性血清と１（ＴＬＶ−１とを区別できる。

４、光更■！旌従って、Ｉ（ＴＬＶ−１及びＩ（ＴＬＶ−ＩＩ陽性ヒト血清を検出するための改良された方法及びキットを提供することが本発明の１つの目的である。

本発明のもう１つの目的は、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−Ｉｆ陽性血清を区別できるような方法及びキットを提供することである。

“）ＩＴＬＶ−１ペプチド抗原及びアッセイ”についての上記で引用された特許出願においては、ＡＴＣＣ細胞系ＨＢ８７５５　（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ）により生成された。５ｅモノクローナル抗体（Ｍａｂ）と免疫反応性であるＨＴＬＶ −Ｉｇｐ４６エンベローブタンパク質の領域から構成される）ＩＴＬシー■ペプチドが開示されている。その領域は、ｉτＡ−１，ＭＴ＾−４及びＭＴＡ−５と命名された、３個のｇｐ４６ペプチド抗原の４２個のアミノ酸配列オーバーラツプに含まれる。その４２個のアミノ酸配列オーバーラツプ領域は、配列：　５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−ＧＩｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ− Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− 旧ｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔを含み、そしてその４２個のアミノ酸配列のＣ−末端Ｓｅｒ残基で追加の残基１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ −８ｅｒ−Ｌｙｓを含むことができる。、５ｃｒ　Ｍａｂと免疫反応性である組換え及び合成ペプチドにおける共通アミノ酸配列は、配列Ｔｈｒ−Ａ　ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｈｉ　５−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ　−Ａｓｙ−）１ｉｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−３ｅｔである。

もう１つの観点においては、本発明は、ヒト血清における１（ＴＬＶ　−１感染の存在を検出するためのキットを包含する。そのキットは、ｇｐ４６ペプチド抗原が担持される固体支持体、及び前記ペプチド抗原に結合されるヒト抗体の存在を検出するためのレポーターシステムを包含する。

もう１つの態様においては、キットはＨＴＬＶ−１抗体についてヒト血・肩をスクリーニングするためのＥＩＡ型に存在する。もう１つの態様では、ペプチド抗原が、ＨＴＬＶ−１血清抗体を確かめるためのウェスターンプロット型において、１又は複数の確認ＨＴＬＶ−１抗原と共に、ストリップ上に固定される。

さらにもう１つの態様においては、キットは、ＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清からの抗体と特異的に反応することができる、上記で定義されたＨＴＬＶ−ｎ特異的抗原を包含する。キットは、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清の特異的検出を可能にする。

ＨＴＬＶ−１陽性ヒト血清を検出する方法がまた、本発明に包含される。この方法においては、試験血清は１．５ｅＭａｂと命名された、ＡＴＣＣｌｌ１胞系ＨＢ８７５５に由来する抗−）ＩＴＬＶ−Ｉモノクローナル抗体（Ｍａｂ）と免疫反応性であるペプチド抗原と反応せしめられる。前記抗原に結合される抗−ＨＴＬＶ−１抗体の存在は、適切なレポーターラベルされた抗−ヒト抗体により検出される。

、５ｅＭａｂ−反応性ペプチドは、好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基をコードするランダム−配列ポリヌクレオチドの混合物が、ランダム配列ベクターのライブラリィ−を形成するために適切な発現ベクター中に導入されるランダム配列選択方法により生成され得る。

ライブラリィ−ベクターの発現生成物は１．５ｅＭａｂと免疫反応性であるアミノ酸配列の存在についてスクリーンされる０次に、そのような免疫反応性アミノ酸配列を発現するライブラリィ−クローンが単離され、そして挿入された配列によりコードされるポリペプチドを生成するために使用される。

また、ＨＴＬＶ−Ｕエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約５０個以下のアミノ酸を含むＨＴＬＶ−ＩＩペプチド抗原が開示され、そしてそれはアミノ酸配列Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ−Ａｓｐ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ −Ｇ　Ｉｙ−ＴＶｒ４４ｓ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ｒｌｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＧＩｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−丁ｈｒ−３ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＶａＩ−Ｌｅｕ−丁ｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓにより形成される免疫原性領域を含む。Ｉ（ＴＬＶ−ＩＩ抗血清と免疫反応性である組換え及び合成ペプチドにおける共通するアミノ酸配列は、配列５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ｈｉｓ−Ａｓｐ−５ｅｒ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−旧５−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ又は、アミノ酸配列Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−ＬｙｓによりＳｅｒ　Ｃ−末端で拡張された前記同じ配列を有する。

前記ペプチド抗原は、ヒト血清における）ＩＴＬＶ−１１感染の存在を検出するための試験キットに使用される。そのキットは、ペプチド抗原を担持する固体支持体、及びペプチド抗原に結合されるヒト抗体の存在を検出するためのレポーターシステムを包含する。

本発明のそれらの及び他の目的及び特徴は、本発明の次の詳細な記載が添付図面と共に読み取られる場合、より十分に明らかになるであろう。

２７〜１哩図１＾は、上方に、ｇｐ４６エンベロープタンパク質コード配列を含むＨＴＬＶ −１ゲノムの一部及び下方に、本発明に従って形成されたオーバーラッピングＨＴＬシー■ペプチド抗原をコードする配列を含むｇｐ４６コード領域の一部を示し、そして図ＩＢは命名されたＭＴＡ−４、ＭＴＡ−１。

及びＭＴＡ−５を示し；図２は、Ｉ（ＴＬＶ−１コ一ド配列及びＩＩＴＬＶ−１エンベロープタンパク質の一部のための対応するアミノ酸配列を示し；図３は、本発明のペプチド抗原の領域におけるＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ　ｇｐ４６の相同領域のアミノ酸配列、及びいくつかの１（ＴＬＶ−１ｇｐ４６ペプチド抗原（上方）及び本発明のＨＴＬＶ−１ペプチド抗原（下方）のペプチド配列を示し；図４＾及び４Ｂは、ＭＴＡ−１ペプチド及び対応するＨＴＬＶ　−ＩＩ　ｇｐ４６ペプチドについての抗原性プロットを示し；図５は、本発明に従ってランダム−配列ペプチドを生成し、そして選択するための組換え方法を示し；図６は、本発明のＨＴＬＶ−ＩＩペプチドが由来するｇｐ４６エンベロープタンパク質の領域におけるＨＴＬＶ−ｎコード配列及び対応するアミノ酸配列を示し；そして図７は、ＨＴＬＶ−１ウイルス溶解物及び組換えタンパク質ｐ２１Ｅ及びＭＴＡ −４を含む改良されたウェスターンプロットを示し、ここでレーン＾−Ｆ及びＧ −ＲはそれぞれＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−Ｉｔ抗血清である。

主五夏毘監久に藍ｒ、ＨＴＬＶ−１へ’；＃）’　（１’このセクションは、ＨＴＬＶ　−１関連Ｔ−細胞白血病を有する個人に見出される抗−ＨＴＬＶ−１抗体と免疫反応性であるＨＴＬＶ−１ペプチド抗原の調製を記載する。抗原は、適切な発現ベクターにクローンされた長さ１００〜３００塩基対のランダムＨＴＬＶ−１遺伝手配列を用いて調製され、次に免疫反応性ペプチドの発現のために抗体により選択ＨＴＬＶ−ｒのゲノムライブラリィ−を、ＨＴＬシー■プロウィルスゲノムを含む細胞ＤＮＡから従来のようにして調製する。複合ＤＮ＾をＨＴＬＶ−ｒ感染細胞から調製し、そして前記細胞は、１（ＴＬＶ−１ウイルス又は知られている細胞系、たとえばＨＵＴ　１０２−８２　（Ｐｏｉｅｓｚ）、　ＭＴ−２（旧ｙｏｓｈｉ）及び旧−腫瘍（Ｐｏｐｏｖｉｃ）細胞（それらのすべては１（ＴＬＶ　−■ ウィルスを生成することが示されている）により感染されていることが知られている患者から単離されたＴ−細胞を包含する。ウィルスゲノムは、それらの細胞において宿主ＤＮＡ中に組込まれる。

１（ＴＬＶ−１ゲノムを含む細胞系の調製方法は、上記文献に詳細される。

上記細胞系からの合計の宿主ゲノムＤＮ＾を、カッター、たとえばＨａｅ　ｍ又はＡｌｕ　Ｉにより、１２−２０に塩基サイズ範囲での部分的消化物フラグメントを生成する条件下で部分的に消化し、そして消化された材料を、１５−２０に塩基のフラグメントを単離するために、スクロースグラジェント遠心分離により分別する。次に、そのフラグメントを、適切なりローニングベクター、好ましくは、１５−２０に塩基の挿入体を効果的に組込むことができるファージクローニングベクター中にクローン化する。好ましい方法においては、単離されたフラグメントをＥｃｏ　Ｒ１メチラーゼにより処理し、そしてＥｃｏ　Ｒ１リンカ−を標準条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ）下でそれらの端に連結し、そして次に、ユニークＥｃｏ　Ｒ１挿入部位を有するファージベクター、たとえばλＣｈａｒｏｎ　４ａ中にクローン化する。

クローン化されたゲノムフラグメントを、完全−コピーのＨＴＬシー■ゲノムの選択された配列に対して相補的であるプローブによりスクリーンする。　ＨＴＬＶ−１配列は、選択された配列のための放射性ラベルされた合成オリゴヌクレオチドプローブを生成するための方法にように、知られている（Ｓｅｉｋｉ）。さらに、特定された配列の合成オリゴヌクレオチドは、たとえば５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　（ＳａｎＤｉｅｇｏ、　Ｃ＾）により供給される市販のサービスにより製造され得る。

そのようなオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＨＴＬＶ−１配列を含む分子クローンを、標準のハイブリダイゼーション方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

ｐ３２２　）によりライブラリィ−から単離する。クローンをまず、制限部位分析により分析し、組込まれたウィルスゲノムを端に有する直接的な長い末端反復体の存在により示されるように、十分なウィルスゲノム配列が存在することを確める。同定された分子クローンを、適切なエンドヌクレアーゼにより消化し、完全−コピーのウィルスゲノムを開放する。この目的のための好ましいエンドヌクレアーゼはＳａｃ　Ｉであり、これはウィルスコード配列のいづれかの端で長い末端反復体（ＬＴＲ）でのウィルスゲノムを切断するが、しかし内部切断は生成しない、クローン性）ＩＴＬＶ−１ゲノムが第３錘虹１部位を有する変異体である場合、適切な制限酵素が、完全な長さのゲノムを単離するために選択されるであろう。精製された完全−コピーの配列は約９．５に塩基のフラグメントである。他方、ｅｎｖ遺伝子配列のみを示すゲノムのフラグメントを、発現ライブラリィ−の生成のために精製する。

他方、完全−コピーのＨＴＬＶ−１複合ＤＮＡを含むクローニングベクターはすでに報告されており（Ｓｅｉｋｉ）、そして例１に示されるように、研究者から直接得られる。

所望するＨＴＬＶ−１ゲノムライブラリィ−を生成するために、完全−コピーの）ＩＴＬＶ−１挿入体を、上記クローニングベクターから、たとえばＳａｃ　Ｉによる完全な消化により切出し、そして例１に記載されるようにして、９．５に塩基のフラグメントとして単離する。その単離された完全−コピーのフラグメントを消化し、ＤＮＡフラグメント及び好ましくは約１００〜３００の塩基対を主に有するランダムフラグメントを生成する。例１は、ＤＮＡアーゼ消化によるそのようなフラグメントの調製を記載する。約３０〜１００個の間のアミノ酸の抗原を得ることが所望されるので、その消化フラグメントは好ましくは、たとえばゲル電気泳動によりサイズ分別され、約１００〜３００個の間の塩基対サイズ範囲でのフラグメントが選択される。

ゲノム消化フラグメントを、適切なりローニングベクター、好ましくは適切な宿主においてペプチドコード体の発現を可能にする発現ベクター中に挿入する。１つの好ましい発現ベクターはλｇｔｌｌであり、それはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳終結コドンの５３塩基対上流にユニークＥｃｏ　Ｒ１挿入部位を含む。従って、挿入された配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子として発現されるであろう。

従って、挿入された配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ−末端部分、非相同ペプチド及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＣ−末端領域の少なくとも一部のほとんどを含むβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現されるであろう。このベクターはまた、許容する温度、たとえば３２°Ｃでウィルス溶原性を引き起こし、そして高温、たとえば４２°Ｃでウィルス溶解を導びく感温性レセプター（ｃ１８５７）を生成する。このベクターの利点は、（１）ひじょうに効果的な組換え体の生成；（２）許容性であるが、しかし非許容性ではない温度での宿主細胞増殖に基づいて、溶原化された宿主細胞を選択する能力、及び（３）高レベルの組換え体融合タンパク質生成を包含する。さらに、非相同挿入体を含むファージは不活性β−ガラクトシダーゼ酵素を生成するので、挿入体を有するファージβ−ガラクトシダーゼ着色基質反応により容易に同定され得る。

発現ベクター中に挿入された消化物フラグメントは、従来の方法に従って、選択された制限部位リンカ−１たとえばＥｃｏ　Ｒ１リンカ−を含むように、必要により変性され得る。例１は、フラグメントをプラント末端化し、Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−を付加し、そしてＥｃｏ　Ｒ１により切断されたλｇｉｌｌ　と前記フラグメントとを連結する段階を包含する、消化フラグメントをλｇｔｌｌ中にクローン化するための方法を例示する。得られるウィルスゲノムライブラリィ−が調べられ、比較的大きな（代表的な）ライブラリィ−が生成されたことが確かめられ得る。これは、適切な細胞宿主を感染せしめ、その細菌をプレート化し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性の損失についてプラークを試験することによって、 λｇｔｌｌベクターの場合、行なわれ得る。例１に記載される方法を用いれば、約６０％のプラークが、例１に見されるように酵素活性の損失を示すバックグラウンドファージのレベルを比較して、酵素活性の損失を示した。

Ｂ、ペプチド　の上記で形成されたゲノムライブラリィ−を、対象のヒト抗−）ＩＴＬＶ−■抗体と免疫反応性であるペプチド抗原（融合タンパク質として発現される）の生成についてスクリーンする。ＨＴＬＶ−Ｉ感染を診断するための特定の興味ある１つの抗体は、上記に示されたように、ＨＴＬＶ−１感染に関連するＴ−細胞白血病を有する患者に存在する抗体と同じ特異性を有する。５αモノクローナル抗体（Ｍａｂ）である。前記抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＣ８７５５を有するＥＢＶ− 形質転換Ｂ−リンパ球細胞系により生成される（例２を参照のこと）。

好ましいスクリーニング方法においては、ファージライブラリィ−ベクターにより感染された宿主細胞が上記のようにして、プレート化され、そしてそのプレートがニトロセルロースフィルターによりプロットされ、そのフィルター上に細胞により生成される組換え抗原が移される。次にフィルターが抗−ＨＴＬＶ−１抗体と反応せしめられ、未結合抗体を除去するために洗浄され、そして抗−ＨＴＬＶ−１抗体を通して、サンドインチ態様でフィルターに結合されるようになる、レポーターラベルされた抗−ヒト抗体と反応せしめられる。

典型的には、対象の組換え抗原の生成により同定されるファージプラークを、抗体−反応性融合タンパク質の生成のために、比較的低い密度で再試験する。例２に記載されるスクリーニング方法が例証である。免疫反応性組換え抗原を生成するいくつかの組換えファージクローンを、その方法により同定した。

上記のようにして同定された１又は複数のライブラリィ−ベクターを好ましくは、核酸配列決定により分析し、）ＩＴＬＶ−１ゲノム内のペプチドコード領域の位置を決定する。選択されたライブラリィ−ベクターから非相同挿入体（所望により、融合タンパク質の隣接するコード配列を含む）を切出すための方法、及びその切出されたフラグメントを精製し、そして配列決定するための方法は、例３に概略されるように、一般的に知られた方法である。、５αＭａｂと免疫反応性であることが見出されている３種のペプチドのコード配列は図面に示されている。それらの３種の非相同配列は、ＨＴＬＶ−１の既知配列に適合する（Ｓｅｉｋｉ）、例３でより十分に論ぜられるように、すべての配列は、ＨＴＬＶ−ｒエンベロープタンパク質ｇｐ４６　（図面、パー）Ａ）をコードする遺伝子内のＨＴＬＶ−１ゲノムの塩基対５５６５〜５８９５内に存在し、そして塩基対５６６４〜５７９０　（図面、バー）Ｂ）間のオーバーラッピングコード配列（図面において２つの矢印により定義される）を有する０図面のパートＣに見られるように、オーバーラッピング配列は、次のアミノ酸配列を有する４２個のアミノ酸のペプチド抗原をコードする：　５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−八５ｐ−Ａｌａ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ４１ｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− ＾５ｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−旧５−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ、本発明を支持するために行なわれるスクリーニング研究は、ＭＴＡ−１ペプチドが、特に日本人祖先の対象の間で、最高百分率の）ＩＴＬＶ−１陽性血清を見いだすことを示す。図３に見られるように、ＭＴＡ−１ペプチドは、上記配列のＳｅｒ　Ｃ末端で追加のｌ１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ残基を含む。本発明の好ましいＢ欅においては、Ｉ（ＴＬＶ−１特異的ペプチドは２．５ αＭａｂと免疫反応性であるＣ−末端の４８個のアミノ酸ＭＴＡ−１配列の免疫原性領域を含む。

より一般的には、本発明のＨＴＬＶ−［ペプチドは２．５αＭａｂと免疫反応性である上記アミノ酸配列の免疫原性領域を含む。ここで定義されるように、その特定された配列は１．５αＭａｂのためのペプチド抗原の免疫反応性をほとんど下げない重要でない中性アミノ置換を包含する。そのようなアミノＷｆ＊は、疎水性、サイズ、荷電、水素結合能力、及び既知のアミノ酸置換原理に従っての二次構造に対する効果の類似性に基づいて選択され得る。

選択されたクローンは、組換えタンパク質精製のための拡大生成のために使用される。拡大生成は、（ａ）選択されたλｇｔｌ１組換え体により適切な宿主、たとえば旦−ユユを溶原化し、（ｂ）高レベルの非相同ペプチドを生成する条件下で形質導入された細胞を培養し、そして（ｃ）溶解された細胞から組換え抗原を精製するために、種々の報告されている方法の１つを用いて行なわれる。

上記λｇｔｌｌクローニングベクターを包含する１つの好ましい方法においては、高率生成体旦−ａ宿主、ＢＮＮ１０３が、選択されたライブラリィ−ファージにより感染せしめられ、そして２つのプレート上にレプリカプレートされる。プレートの１つを、ウィルス溶原性が生じる３２°Ｃで増殖し、そして他の１つを、感染ファージが溶菌段階に存在し、そして従って細胞増殖を妨げる４２℃で増殖する。従って、低い温度で増殖するが、しかし高い温度では増殖しない細胞は、好都合良く溶菌化されたものとして推定される。

溶菌化された宿主細胞は次に、ウィルス挿入体を含む融合タンパク質の高い生成を好む液体培養条件下で増殖され、そして所望する融合タンパク質を開放するために急速な凍結により熔解される。これらの方法は、例４で詳細に説明される。

ペプチド抗原ＭＴＡ−１を発現する７ｇ【１１　クローンからのＨＴＬＶ−１コ一ド配列を、下記セクション■に記載されるようにして、ＰＣＲ増幅により調製し、そしてｐＧＥＸ−１発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）中にクローン化した。ρＧＥＸ−１中にクローン化された挿入体を、寄生体スキストソーマ　ジャポニカム（匙１ｕ匹叩り垣凹旦並畦からの２６にドルトンのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである、タンパク質５ｊ２６との融合タンパク質として発現した。ＨＴＬＶ−１又はＦＩＴＬＶ−ＩＩ惑感染人からの血清に対するｐＧＥＸ−ＭＴＡ−１の制限バネリングは、ｐＧＥＸ−ＭＴＡ−１対β−ｇａｌ−ＭＴＡ−１の反応性間に有意な差異は示さなかった。

Ｃ−ご１）」」創１組換えペプチドを、示差沈□殿法、分子Ｃ篩りロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気詠動及”びアフィニティークロマトグラフィーを包′含す名・■準のタンパク質精製方法により精製する、。、・融合タンパク質、たとえば上記のようにして調製されたβ−ガラク＋シダーゼ融合タンパク質の場合、使用されるタンパク譬単離技法は生来のタンパク質の単離に使用される技法から融合され得る。従って、ａ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の単離のためには、そのタンパク質は、表面融合抗−ガラクトシダーゼ抗体を有する固体支持体上に細胞溶解材料を通すことにより単純なアフィニティークロマトグラフィーにより容易に単離され得る。このアプローチは、例４で使用される。

■１．５αＭＡＲとのペプチド　０本発明はまた、もう１つの観点において、＾ＴＣＣ細胞系１（Ｂ８７５５により生成されるＨＴＬＶ　−Ｔ　Ｍａｂ、すなわち、５αＭａｂと免疫反応性であるペプチド抗原と血清とを反応せしめることによる、ＨＴＬシー■陽性ヒト血清の検出方法を包含する。血清におけるＨＴＬＶ−Ｉ特異的抗体の存在は、例７に記載されるように、レポーターラベルされた抗−ヒト抗体により検出される。

Ａ、　ＩＩＴＬＶ−１ジペプチド１つの態様において、ペプチドは、上記ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−４及びＭＴＡ−５ＨＴＬＶ−１ペプチドからの４２−アミノ酸オーバーランプ領域からの免疫原性領域を含む。これらのペプチド抗原は、４２個のアミノ酸配列のオーバーランプ領域における免疫反応性領域の位置を確かめるためにさらに特徴づけられた。オーバーラツプ領域のＣ−末端部分における免疫反応性領域の位置は、２つの証拠系により示唆された。第１に１．５αＭａｂはＨＴＬＶ−１エンベロープタンパク質と特異的に反Ｊ応し、すなわちＨＴＬＶ−ｎ又は１（ＴＬＶ　ｍ　（ＨＩＶ −Ｌ　）　Ｉ　７へｏ−プ汐ンバク”質との反応は観察されなかったことが報告された。上記のｇｐ４６　ペプチド抗原ＭＴＡ−１及びＭＴＡ−４は）ＩＴＩ、Ｖ−Ｉと反応性であるが、しかし）ＩＴＬシー■又はＦ［ＴＬＶ−１［抗血清（Ｌｉｐｋａ）とは反応性でないことが、出願者及び共同研究者により確かめられている。

第２に、ＭＴＡ−１ペプチドのアミノ酸配列とＨＴＬＶ　−ＩＩ　ｇｐ４６タンパク質におけるその対応する領域との比較（図３）は、Ｃ−末端半分におけるよりもペプチドのＮ−末端半分において実質的に高い相同性を示す（）ＩＴＬＶ− １及びＨＴＬＶ−Ｉｔ配列の中央領域は図３に見られる）。

これは、抗原性における最大の差異がペプチド領域のＣ−末端半分に見出されることを示す。

それは、それぞれＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩペプチドについて図４Ａ及び４Ｂに示される２つの対応するペプチド領域の抗原性プロットによりさらに確かめられた。抗原性プロットを、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｔｃｓ　（Ｐａｌ。

Ａｌｔｏ、　ＣＡ）からのＰＣＧｅｎｅにおいて標準の疎水性プログラム“Ａｎｔｉｇｅｎ”により生成した。見られるように、２つのプロットは残基３−２８において実質的にオーバーラツプするが、しかし残基２８−４０においては著しく逸脱する。その逸脱残基は、）ＩＴＬＶ−１配列しｅｕ−Ｐｒｏ−旧５−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−八５ｐ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｔを含む。

前記Ｃ−末端を含む多くのペプチド抗原を調製し、そして、５αＭａｂ及びＨＴＬＶ−１及び１（ＴＬＶ−１１抗血清への結合性について試験した。それらのペプチドのいくつかの配列は、上記肘へ−１，ＭＴＡ−４及びＭＴＡ−５ペプチド抗原の配列と共に、図３の上部に示されている。ペプチドを、標準の方法に従って、固相合成法により調製した。簡単に言及すれば、Ｎ−α−保護されたアミノ酸無水物を結晶化形で調製し、そしてＮ−末端での連続アミノ酸付加のために使用した。個々の残基付加で、成長するペプチド（固体支持体上の）を、酸処理し、Ｎ−α−保護基を除去し、数回、洗浄し、残留酸を除去し、そして反応媒体へのペプチド末端の接近能力を促進せしめた０次に、ペプチドを活性化されたＮ− 保護化アミノ酸対称無水物と反応せしめ、そして固体支持体を洗浄した。

個々の残基−付加段階で、アミノ酸付加反応を、合計２又は３個の別々の付加反応のためにくり返し、反応される成長ペプチド分子の百分率を高めることができる。典型的には、１〜２回の反応サイクルが初めの１２個の残基の付加のために使用され、そして２〜３回の反応サイクルが残る残基のために使用される。成長ペプチド鎖を完結した後、保護されたペプチド樹脂を液体弗化水素酸により処理し、ブロック解除し、そして支持体からペプチドを開放する。

例６に実質的に記載されるようにして、ペプチドを、結合競争研究により、５ａＭａｂとの特異的免疫反応性について試験した。肘＾−４又は？ＩＴ＾〜ｌの１８個のＣ−末端残基を含むに１６３ペプチドは、ＭＴＡ−４への、５ａＭａｂの結合を強く阻害する。しかしながら、結合障害は、ＭＴＡ−４の１１個のＣ−末端残基のみを含むペプチドに１６２に関しては観察されなかった。ＭＴＡ−４の６個のＣ−末端残基及び追加の１３個のＣ−末端残基を含むペプチドに１６４は１，５ａ　ＭａｂとＭＴＡ−４又はＭＴＡ−１との間の結合を弱く阻害した。

それらの結果は１．５ａＭａｂのためのｇｐ４６ペプチドにおける最っとも可能性ある免疫反応性領域が、ペプチドに１６３を含む領域に存在し、これは配列相同性及びこの領域におけるＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−Ｉｔ配列との間の抗原性プロットの逸脱性に合致することを示す。Ｋ１６４ペプチドへの、５ａＭａｂの弱い結合は、対象のエピトープかに１６３とに１６４との間のオーバーランプの旧ｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ｈ４ｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ領域に存在し、ここで隣接するＮ−末端又はＣ−末端配列が抗原表示のために必要とされることを示し、又はに１６４ペプチドが、５ａＭａｂと弱く免疫反応性である追加のエピトープ領域を含むことを示す。

ペプチドをまた、ＨＴＬＶ−［感染された患者がらの抗血清のＭＴＡ−４への結合を阻害するそれらの能力についても試験した。一般的に、ＭＴＡ−４への、５ａＭａｂの結合を阻害するいづれか特定のペプチドの能力は、ＥＬＩＳＡ結合手段（例６Ｂ）におけるＨＴＬＶ−１抗血清に結合するその能力又はウェスターンプロットアッセイ（例８Ｃ）における？ＩＴＡ−４又はＭＴＡ−１へのヒ）ＨＴＬＶ−１抗血清の結合を阻害するその能力に匹敵することが見出された。従って、ペプチドに１６２はＥＬＩＳＡ手段においてはいづれのＨＴＬＶ−Ｉ血清とも反応せず、そしてＭＴＡ−１又はＭＴＡ−４へのＪ−２５４血清の結合を阻害しなかった。

Ｂ、−ン゛ムー　１ペプチドもう１つの態様において、この方法に使用するための、５ａＭａｂ　−反応性ペプチドはランダム−配列ペプチドの選択により調製される。

最近、特定の短い（５〜１０個の残基）ペプチドに対して向けられた抗体が、免疫反応性種についてランダムに生成されたペプチドのライブラリィ−をスクリーンするために使用され得ることが示された（Ｓｃｏｔｔ　；　Ｃｗｉｒｌａなど）。そのような手段は１．５ａモノクローナル抗体と免疫反応性である新規配列を同定するために本発明において研究される。

好ましい方法においては、約１０８個の新規へブタペプチドを、ベクターとして線状ファージｆＵＳＥ５を用いてエピトープライブラリィ−の構成により生成する。他の線状ファージベクターは、そのようなライブラリィ−を開発することにおいて同等に効果的であるように思える。

図５は、ｆＵｓＥ５線状ファージエピトープライブラリィ−を生成し、そしてスクリーンするために必要な段階の順序を図的に示す。簡単に言及すれば、ｆＵｓＥ５　ＲＦ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ｆｉｌにょる消化にゆだね、外来性ＤＮＡの挿入のための挿入部位を創造する。

（ＮＮＫ）　ｍ形（ここでＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表わし；にはＧ又はＴを表わし；そしてｍは２〜１５である）で表わされる変性配列を含む、合成（１５＋３ｍ）塩基対（ｂｐ）　Ｂｇｌｌ　ＤＮＡフラグメントを調製する。

本発明の好ましい態様においては、ｍは５〜１０の範囲であり、そして塩基は１回の付加出来事において鋳型プライマーにランダムに付加される。２０個のアミノ酸をコードするコドンのランダム付加を達成するもう１つの方法は、鋳型プライマーに個々のアミノ酸を表わすトリヌクレオチドコドンをランダムに付加することである。

クローニングベクターへの挿入体の連結に続いて、線状ファージベクターの増幅を、Ｅ、コリ細胞のトランスフェクションにより達成する。好結果をもたらすトランスフェクションを、ベクター担持マーカーの存在により測定する。本発明の好ましい態様においては、このマーカーは耐テトラサイクリン性である。次に、形質転換ファージを細菌細胞から単離する。対象のファージ担持配列を抗体パンニング方法により単翻し、ここでファージは、５ａＭａｂ又はそのＦａｂフラグメントと共にインキュベートされる。次にビオチニル化された第２抗体（ヤギ抗 −ヒトＩｇＧ）を添加し、そしてビオチニル化された第２抗体を含む複合体１．５ａＭａｂ及び免疫反応性ペプチド担持ファージを、ストレプトアビジン被覆されたプレート上への付着により未反応抗体及びファージから分離する。次に、ファージ担持免疫反応性配列を溶離し、そしてそれらのＤＮＡ配列を決定する。

線状ファージ融合タンパク’Ｋｐｍに存在する外来性ＤＮＡ配列は、免疫反応性ペプチドの配列を決定する。次に、この方法を通して免疫反応性であることが発見されたペプチドは、標準のペプチド合成法により合成され得、そして適切なペプチドキャリヤーへの接合により免疫原として調製され得る。

ＩＩｌ、　ＨＴＬシー■ペプチドこのセクションは、ＨＴＬＶ−ＩＩ抗血清と特異的に免疫反応するＨＴＬＶ−■ ペプチドの同定及びクローニングを説明する。ペプチドは、ＨＴＬＶ　−１ｇｐ４６ｅＪＩ域からの上記？ＩＴＡ−１ペプチドに対して相同性であるＨＴＬＶ− ｎ　ｇｐ４６エンヘローブタンパク質領域に由来する。

ＨＴＬＶ−１ペプチドＭＴＡ−１ニ対応するＧＨ２−に１５（図３）と命名されたＨＴＬＶ−Ｉｔペプチドを、所望するペプチド配列に対応するＨＴＬＶ−ＩＩコード配列のクローニングにより調製した。ＨＴＬＶ−Ｉｆゲノム（図６）のヌクレオチド５６４８−５７９４に対応する１４７塩基対（ｂｐ）　（７）ＨＴＬＶ　ｎＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐｃｔ？）法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｎｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ａ＋ＩＰキット）の使用により、ＨＴＬＶ−ＩｆクローンｐＭＯ４（プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍ旧部位中にクローン化されたＨＴＬＶ　−ＩＩゲノムのｔｈｅ大部分を含む）から最初に増幅した。

前方及び逆方向プライマーは図６に示されている。増幅されたＤＮＡをλｇｔｌｌファージベクターのＥｃｏ　Ｒｒ部位中に連結し、λｇｔｌｌのガラクトシダーゼ遺伝子中に１４７　ＨＴＬＶ−ＩＩ　ＤＮＡ挿入体を含むクローンａｓ３に１５を得た。組換えファージを用いて、Ｅ、コリ株ＢＮＮ１０３をトランスフェクトした。詳細は例５に示される。

予備実験において、ＰＣＲ−確証ＨＴＬＶ−Ｔ又は１（ＴＬＶ−Ｉｆ感染の約２００人の個人からの血清、及び約１５０人の未感染個人からの血清を、ＧＨ２− に１５抗原に対してパネルした。　ＨＴＬＶ−ＩＩ感染された個人からの血清の９８％がＧＨ２−に１５と反応した。ＨＴＬＶ−１感染された血清又は末感染血清のいづれもＧＨ２−に１５と反応しなかった。スクリーニング結果は、ＧＨ２ −に１５ペプチドが、ＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清と特異的に免疫反応することを示す。

ＧＨ２−に１５アミノ酸配列を含むいくつかの小さなペプチドを、セクションＩに概略されているようにして、組換え法により調製した。

簡単に言及すれば、ペプチドを、例５に記載されているようにして、示されている配列の増幅を促進するように企画されたＰＣＲプライマーを用いて、）ＩＴＬＶ−ＩＩゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により調製した。（Ｇｌ２−　）Ｋ１４．に１６．　Ｋ２４．　Ｋ３５及びに３４と命名されたそれらの５種のペプチドは、図３に示される配列を有する。

上記ｍｅえＨＴＬＶ−ＩＩペプチドを、例８に記載されているようにして、ＥＬＩＳＡ型においていくつかのＨＴＬＶ−ＩＩ及びＨＴＬＶ−１に対して免疫スクリーンした。Ｇｌ２−に１６を除くすべてのλｇｉｌｌ　ＨＴＬＶ−Ｉｔクローンを、試験される６種のＨＴＬシー■血清からの少なくとも１種のものにより認識した。　ＧＩＩ２４１６．すなわち単独の非反応性クローンは、Ｇ）１２−Ｋ１５に含まれるカルボキシル末端の２２個のアミノ酸を欠いている。試験されたすべての他のクローンは、ペプチドに１２５に存在する少なくとも１７個のアミノ酸５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈ４ｓ−八５ｐ−５ｅｒ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−）１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−丁ｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｔを含む。

表１に見られるように、試験されたペプチドは、ＨＴＬＶ−１血清又は、５αＭａｂのいづれとも反応しなかった。

元（７）ＩＩＴＬＶ　−ＩＩ　クロー　７５７）　３種、すなわちＧ）１２−に１５．　Ｇｌ２−に３５及びＧ１（２−に１６を、ｐ［；ＥＸ−１発現ベクター中にクローンした。３種（７）ｐＧＥＸ−１゜ＨＴＬシー■クローン、すなわちＧｌ（２−に１５．　Ｇ１（２−に２５及びＧｌ２−に３５により発現される組換えタンパク質は、Ｊ−３１７ＨＴＬＶ−ｎ血清によりすべて認識された。

、表−」− に１５配列内のアミノ酸配列を含む多くのペプチド抗原を、上記セクション■に概略されているようにして、固相法により調製した。

（Ｇｌ２−）　Ｋ１６９．　Ｋ１７０．　Ｋ１２５．　Ｋ１２６及びに１２８と称するそれらの５種のペプチドの配列は、図３に示される。ペプチドを、ＨＬＩＳＡ法により、いくつかのＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−１１陽性血清との免疫反応性について試験し、そしてそれらのペプチドのいくつかをまた、Ｋ１５抗原に結合するＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を阻害するそれらの能力について試験した。

Ｋ１２５ペプチドは、ＥＬＩＳ＾によりアッセイされる場合、複数の１（ＴＬＶ −ｎ血清により認識された。１つの実験において、１２個のうち６個のＨＴＬＶ −ｎ血清かに１２５に効果的に結合できた。同じ実験において、７個のＨＴＬＶ　−ｎ血清のうち１つもペプチドに１２５を結合しなかった。

Ｋ１２５ペプチドはまた、ウェスターンプロットされたＧ）１２４１５への強く反応性のＨＴＬＶ−Ｉｔ血清、すなわちＪ−３１７の結合を阻害した。Ｇｌ２− に１５を結合する血清Ｊ−３１７１７１能力は、ＨＴＬＶ−１ヘプテｌ’に１６３又はＨＴＬＶ−ＩＩペプチドに１２８と共にインキュベーションすることによって影響されない。

ＦＩＴＬＶ−Ｉｆペプチドに１７０は、ＥＬＩＳＡ基礎のアッセイにおいて複数の１（ＴＬシー■血清により認識され、そして同じアッセイにおいて）ＩＴＬＶ　−■血清により認識されない。Ｋ１６９ペプチドは、ＥＬＩＳＡ基礎のアッセイにおいてＨＴＬシー■血清により認識されない。

ＨＴＬＶ−ＩＩ　Ｉｌｌえ抗原及び合成）ＩＴ［、Ｖ−ＩＩペプチドの再分析からのデータは、ＨＴＬＶ−ｎ特異的エピトープが１７個のアミノ酸配列５ｅｔ− Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｈ１ｓ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇ　Ｉｕ−ｔｌ　ｉｓ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅ■ に含まれることを示す。上記で論ぜられた、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原ＭＴ＾−１及び１丁Ａ−４の集中的バネリングにより得られたデータは、Ｇｌ（２−に１５の６個の最後のアミノ酸、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓがまた、ＨＴＬＶ　−■抗血清により認識されるエピトープに寄与することを示プする。

ＩＶ、　ＨＴＬＶ−１びＨＴＬｖ−■−゛本発明のＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ− ＩＩペプチド抗原の診断用途の３種の基本的タイプが記載されるであろう。最初のものは、ペプチドによる補体介在の抗体依存性細胞熔解の阻害に基づかれている。この方法においては、試験個体からの血清が補体の存在下でＨＴＬシー■又はＨＴＬＶ−ＩＩ感感染−細胞クローンと反応せしめられる。抗−ＨＴＬＶ−１又は抗−ＨＴＬシー■抗体の存在は、たとえばトリパンブルー色素排除により判断されるように細胞溶解により明白にされる。

細胞溶解が観察される場合、ＨＴＬＶ−１ペプチドに対する抗−ＨＴＬＶ−１抗体の特異性が、まず初めに、過剰のＨＴＬＶｉ又は）ＩＴＬＶ−１１ペプチドと血清とを反応せしめ、次に前記血清と細胞とを補体の存在下で混合することによって示される。）ＩＴＬＶ−Ｉ又は）ＩＴＬＶ−ＩＩ抗体の存在は、細胞溶解の実質的な低下により示される。この方法は例６Ａに記載される。

その方法はまた、上昇する量のペプチドにより血清を滴定し、そして細胞溶解の程度に対する目だった効果が最初に観察されるペプチド濃度を決定することによって、分析物血清における抗体力価を定量化するためにも使用され得る。

第２の一般的アッセイクイプは、ＨＴＬＶ−１又は）ＩＴＬＶ−Ｉｔ惑感染ついてヒト血清をスクリーンするための酵素−免疫アッセイである。

このアッセイ型においては、表面結合のＨＴＬＶ−ｒ又はＨＴＬＶ　−ＩＩ　ｇｐ４６ペプチド抗原を有する固相試薬が、その試薬上でのペプチドへの抗体結合を可能にする条件下で分析物血清と反応せしめられる。未結合血清成分を除去するために試薬を洗浄した後、その試薬を酵素ラベルされた抗−ヒト抗体と反応せしめ、固体支持体上での結合された抗−ＨＴｌ、Ｖ−１抗体の量に比例して試薬に酵素を結合せしめる。試薬を再び洗浄し、未結合抗体を除去し、そして試薬に関連する酵素の量を決定する。アルカリホスファターゼによりラベルされた抗− ヒト抗体を使用する１つの典型的な方法は、直接的なＨＴＬＶ−１スクリーニングアツセイについて例７に記載される。酵素ラベルされた抗体、及び酵素検出のために必要とされる試薬はまた、固体支持体上でのペプチド抗原に結合されるヒト抗体の存在を検出するためのレポータ一手段として本明細書において言及される。

上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料、たとえばポリマービーズ、浸漬角棒、又はフィルター材料にタンパク質材料を結合せしめるための既知の技法により調製される。それらの結合方法は一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着（例８に記載されるフィルター支持体におけるように）又は、典型的には、遊離アミン基を通して、固体支持体上での化学的反応性基、たとえば活性化されたカルボキシル、ヒドロキシル又はアルデヒド基へのタンパク質の共有結合を包含する。

第３の一般的アソセイタイプは、ＨＴＬＶ−１又は）ＩＴＬＶ−ＩＩＩ血清を確かめることに使用するためのウェスターンプロットアッセイである。このアッセイ型は、本発明のｇｐ４６ペプチド抗原の他に、ＨＴＬＶ　−■又は）ＩＴＬＶ −Ｉｔ抗血清を検出するのに効果的である１又は複数の確認）ＩＴＬＶ　−１又はＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を含む。１つの好ましい型においては、その確認ペプチドは、ＩＩＴＬＶ−１ウイルス溶解物からの１１２４　ｇａｇタンパク質、及びＨＴＬＶ　−１ｇｐ２１エンベロープタンパク質の大部分を含むｐ２１１ＪＩｌ換えエンベロープタンパク質（Ｓａｍｕｅｌ、　１９８４．１９８５）を含む。

ｐ２４　溶解物タンパク質はほとんどではあるが、しかしすべてではないＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１１陽性血清をピックアップする。ｐ２１Ｅ組換えペプチドは、実質的にすべてのＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩをピックアップするが、しかしいくつかの誤った陽性も付与する。この改良されたウェスターンプロットアッセイは、本出願者及び共同研究者により報告されている（Ｌｉｐｋａ）、このプロットアッセイ法の詳細は例８に与えられる。

前記に記載されたように、及び例８に詳細されるように、改良されたウェスターンプロット型は、ウィルス溶解物タンパク質ｐ２４及びＩＩ換えタンパク質９２１Ｅとの免疫反応により明らかなように、試験されるすべてのＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清をピックアップした（９５のパネル）。さらに、ＭＴ＾ −４ペプチドは、確認されたＨＴＬＶ−［血清のみと免疫反応性である。従って、改良されたプロットアッセイは、ＨＴＬＶ−Ｉ又は）ＩＴＬシー■抗血清を確認するために、及び本発明のペプチドとの選択的免疫反応により２種のタイプのＨＴＬＶウィルスを区別するために使用され得る。

ウェスターンプロットアッセイのもう１つの態様においては、ＨＴＬＶ−１ペプチド抗原がセクション■に記載されるＨＴＬＶ　−Ｉｆ　ｇｐペプチド抗原により選択される。この型においては、ＨＴＬＶ−１ウイルス溶解物タンパク質及びｐ２１Ｅ組換えタンパク質が上記のようにＨＴＬＶ　−１又は）ＩＴＬＶ−１１抗血清のｒ＋ｉ　ｖ！、を提供する。ＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチドはＨＴＬＶ −■をピックアップするが、しかしＨＴＬＶ−１抗血清をピックアップせず、そして従って、ＨＴＬＶ−ｎ抗血清の陽性確認を提供する。

前記２種の型は、いづれかのＨＴＬＶ抗血清の陽性確認を付与するために）ＩＴＬＶ　−１及びＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチド抗原の両者を含むように組合され得る。

Ｖ、Ｚり汗ユ１■え實ＨＴＬＶ　−１ｇｐ４６ペプチド及び抗原ペプチドが組合される抗原キャリヤー、たとえば免疫原タンパク質を含むワクチン組成物もまた本発明に包含される。

前記ペプチドは、抗−〇ＴＬＶ−１，５αＭａｂ、すなわちＡＴＣＣ細胞系ＨＢ８７５５に由来する抗体と免疫反応性である、セイションＩに記載されるＭＴＡ −１，ＭＴＡ−４及びＭＴＡ−５ペプチドの上記４２−又は４７−アミノ酸オーバーラツプにより形成される免疫原領域を含む。

より特定には、ペプチドは、ペプチド配列Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−旧５−３ｅｒ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−３ｅｔの免疫原領域を含む。、５αＭａｂは中和抗体であるので、ペプチドにより生ぜしめられる抗体は、中和抗体であることが予測される。

ワクチン組成物は他方、アミノ酸配列、　Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−八ｓｐ−＾１ａ−Ｐｒｏ−ＧＩｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−ＧＩｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｎ　 −Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ−旧Ｓ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−■５−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅｕ −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓにより形成される、及び好ましくはアミノ酸配列、　５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｖａｌ−旧Ｓ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−八５ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−旧５−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、又は５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−旧Ｓ−＾５ｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｔにより形成される）ＩＴＬＶ−Ｉ［特異的免疫原領域を含むＨＴＬＶ−ＩＩ　ｇρ４６ペプチドを含むことができる。

ペプチドのための特に有用なタンパク質キャリヤーは、キーホールリンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉ＋ｗｐｅｔ）　ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風菌トキソイド、ポリ−Ｌ　−（Ｌｙｓ　：　Ｇｌｕ）　；ピーナツツアグルチニン、ポリーＤ−リシン、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン、タイズアグルチニン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン及び同様のものを包含する。

免疫原ペプチドは、種々の既知方法、たとえば化学的誘導体化法及び遺伝子工学技法によりキャリヤーに接合され得る。そのような後者の技法は、Ｇｅｒａｌｄ　Ｑｕｉｎｎａｎ、”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ａ　Ｗｏｒｋ　５ｈｏｐ、”Ｎｏνｅ＋ｍｂｅｒ　１３−１４．１９８４により詳細に開示されている。

本発明のワクチン及び接種物は、注射、通常筋肉内又は皮下注射により、腸カプセル又は錠剤により経口的に、半割として、算用スプレーとして、及び他の適切な経口路により投与され得る。ヒト患者のためには、ポリペプチドの適切な用量は、選択された投与路及び多くの他の要因に一部依存する。それらの要因の中には、免疫化される哺乳類の体重、使用される場合、そのキャリヤー、使用される場合のアジュバント、及び使用されることが所望される接種の回数が包含される。

ヒト患者のための個々の接種は典型的には、約１０μｇ〜約１００■のポリペプチドの単位用量を含み、ここでポリペプチドが結合されるキャリヤーは含まない。所望には、一連の用量が、最適な免疫性のために一定期間にわたって投与され得る。所望には、ポリペプチドの前記量を含む、ワクチンの単位用量形がまた供給され得る。

いずれにせよ、ワクチン又は接種物に含まれる免疫原は、“有効量°゛で存在し、その量は免疫業界において良く知られているような種々の要因、たとえば免疫化される哺乳類の体重、使用されるキャリヤー成分、使用されるアジュバント、保護の持続時間及び所望する免疫化手段に存在する。

次の例は、本発明の種々の観点を例示するが、しか、し本発明の範囲を制限するものではない。

せ且次の例で使用される材料は次の通りであった：酵素：　ＤＮＡアーゼＩ及びアルカリホスファターゼをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ＋＊　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（ＢＭＢ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）により得；肛ＬＲ１，Ｅｃｏ　Ｒ１メチラーゼ、ＤＮＡ　リガーゼ及びポリメラーゼＩをＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（ＮＥＢ＋　Ｂｅｖｅｒｌｙ＋　Ｍ＾）から得；そしてＩＩＮアーゼをＳｉｇ＋ｍａ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＯ）から得た。

他の試薬：　Ｅｃｏ　ＲＩリンカ−をＮＥＢから得；そしてニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、５−ブロモー４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣｒＰ）　、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）及びイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をＳｉｇｍａから得た。

［ゲノム　゛のＨＴＬＶ−１ゲノムライブラリィ−゛の１　′ＨＴＬＶ−１ゲノムの由来する完全コピーＤＮＡ挿入体を含むバクテリオファージを、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＯ）の叶ｓ、　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　ａｎｄ　Ｆ。

Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌから得た。バクテリオファージを消化し、Ｓｃａ　ｌにより完結し、ウィルスゲノム挿入体を開放した。消化された材料を標準の１％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエレクトロエルニージョンにより得られた９、５に塩基のフラグメントをフェノール／クロロホルムにより抽出し、その後、エタノール沈殿せしめた。

精製されたゲノムＤＮＡを、標準の消化緩衝液（０，５ＭのトリスＨＣＩ。

ｐＨ７，５ｉ　１　ｍｇ／−のＢＳＡ；　１０＋ｎＭのＭｎＣ１ｇ　）に懸濁し、そして室温で約５分間、ＤＮ＾アーゼにより消化した。それらの反応条件は、従来の検量研究から決定され、ここで１００〜３００塩基対のフラグメントを主に生成するために必要とされるインキュベーション時間が決定された。材料をフェノール／クロロホルムにより抽出し、その後、エタノール沈殿せしめた。

上記からのゲノムフラグメントを、標準条件（）ｌｕｙｎｈ）下で［１８＾ポリ【によりプラント末端化し、次にフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。プラント末端化された材料を、標準条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　３９６−３９７ページ）下でＥｃｏ　ＲＩリンカにより連結し、次にＥｃｏ　Ｒ１により消化し、冗長性リンカ一端を除去した。次にその材料をアガロースゲル分別し、非連結リンカ−を除去し、そしてサイズ選択した（下記を参照のこと）。

前記段階からの得られたフラグメントを、Ｘ１７４／Ｈａｅ　ｍｌ及び／）１ｉｎｄｌ［Ｉサイズマーカーを用いて１．２％アガロースゲル上で電気泳動（５− １０Ｖ／ｃｍ）　ニより分析シタ。１００〜３００ｂｐ　（７）Ｍ分ｔ−ＮＡ４５ス）リップ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｃｈｕｅｌｌ）上に溶出し、次にそれを溶離溶液（ＩＭのＮａＣｌ、　５０ｍＭのアグリニン、ｐＨ９，０）を含む１．５ｄのマイクロチューブ中に置き、そして６７°Ｃで３０〜６０分間、インキュベートした。現在、溶液で存在するＤＮＡをフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。ペレットを２０μｍのＴＥ　（０，０１ＭのトリスＨＣＩ、ｐＨ７，５，０，００１ＭのＥＤＴ八）に再懸濁した。

ｇｔｌｌファージベクター（Ｈｕｙｎｈ）を、Ｐｒｏｓｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ　（Ｍａｄｉｓｏｎ。

−１）から得た。このクローニングベクターは、β−ガラクトシダーゼ翻訳終結コドンから５３塩基対上流にユニークＥｃｏ　Ｒ１部位を有する。

上記からのゲノムフラグメントを、０．５〜１．０ＭｇのＥｃｏ　Ｒ１−切断ｇｔｌｌ、　０．５〜３　／７１の上記ＨＴＬＶ−１ゲノムフラグメント、０．５　ｔｔ　ｌの１０Ｘ連結緩衝液（上記）、０．５μｍのリガーゼ（２００単位）及び渾留水５μｌまでを混合することによってＥｃｏ旧部位中に導入した。

前記混合物を１４゛Ｃで一晩インキュベートし、次に標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

２５６〜２６８ページ）に従って、インビトロパッケージングした。

パッケージされたファージを用いて、Ｄｒｏ　Ｋｅｖｉｎ　Ｍｏｏｒｅ＋　ＤＮＡＸ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）から得られたＥ、コリ株ＫＭ３９２を感染せしめた。

他方、＾＋５ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ１３７１９７）から入手できるＥ、コリ株Ｙ１０９０も使用され得る。感染された細菌をプレート化し、そしてその得られたコロニーを、標準のＸ −ｇａｌ基質プラークアッセイ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）を用いてＸ−ｇａｌの存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性の損失について調べた（透明なプラーク）。

下記表２は、Ｅｃｏ　Ｒ１−末端化１１ＴＬＶ−１フラグメント（第１列）の挿入により得られた組換え（透明）プラークの数を示す。Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ一対照（第２列）及びベクターのみ（第３列）をまた試験した。見られるように、約５０％のファージプラークが酵素の損失を示した（＆ｌｉ換え）。

Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−の存在又は不在下でのバックグラウンドレベルは１５％以下であり、これはＨＴＬＶ−１エピトープライブラリィ−の好ましい生成を示す。ファージライブラリィ−は約１０６個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｄを含んだ。

１、　Ｓａｃ　Ｉｉ　１　ｐ　＋　１００／２００　５０’ＪＴＨμ１２、　Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−１ｕ　Ｉ　２５／１７８　１４「πμｍ３、対照　１μ＋　５０／４００　１３肛４６コード　についてのスクリーニングヒト細胞系（ＡＴＣＣＩＣ８７５５）に由来する精製された。５抗体は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎ　ｏｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ＋　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＯ）のＤｒ、　Ｓａｗｕｅｌ　Ｂｒｏｄｅｒにより提供された。アルカリホスファターゼにより共有的に誘導されたマウス抗−ヒトＩｇＧ抗体は、Ｐｒｏ蒙ｅｇａ　ＢｔｏＬｅｃ　（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）から得た。

例１からの約１０’　ｐｆｕのファージストックにより感染されたＫＭ３９２細胞のローンを、１５０　ｔｒａのプレート上に調製し、３７°Ｃで５〜８時間、時々逆にしながらインキュベートした。ローンをニトロセルロースシートにより被覆し、プラークからのＩＩＴＬＶ−Ｉ組換えタンパク質を気に移した。プレート及びフィルターを、対応するプレート及びフィルター位置を適合するために印を付けた。

フィルターを、ＴＢＳＴＩｌ街液（１０ｍＭのトリス、　ＰＨ８，０、１５０ｍＭのＭａｃｅ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０）により２度洗浄し、八ＩＢ（１％ゼラチンを含むＴｕｓＴｉｌ衝液）によりブロックし、ＴＢＳＴにより再び洗浄し、そして、５モノクローナル抗体（ＡＩＢにより１〜２μｇ／ａｉ！に希釈された、１２−１５ｄ／プレート）の添加の後、−晩インキユベートした。シートをＴＢＳＴにより２度洗浄し、次に酵素ラベルされた抗−ヒト抗体と接触せしめ１，５抗体により認識される抗原を含むフィルター部位で、ラベルされた抗体を結合した。最終洗浄の後、フィルターを、アルカリホスファターゼ緩衝液（ｌｏｏａ＋Ｍのトリス、ｐＨ９，５、１００ｍＭのＮａ（：Ｉ、５ｍＭのＭｇＣＩｚ　）　５ｕｒＲ中、ＮＢＴ（５°Ｃで維持されている５０ｍｇ／ｍｆｆ１のストック溶液）３３ＩＪｌを含む基質媒体中で展開せしめた。反応した基質は、０．５ αＭａｂにより認識される場合、抗原生成の点で現われた。

前段階で決定された抗原生成の領域を、８２閣プレート上に約１００〜２００ｐｆｕで再プレートした。ＮＢＴ／ＢＣｒＰを通して５〜８時間のインキュベーションで始まる上記段階をくり返し２．５αＭａｂと反応できる抗原を分泌するプラークを同定した。その同定されたプラークを取り、そしてファージ緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　４４３ページ）により溶離した。抗体反応性ペプチドを分泌する３種の組換えファージプラークを、例３の方法に従って、配列決定分析のために選択した。その対応する感染されたファージを、ＭＴＡ−４、ＭＴＡ−１及びＭＴＡ−５と命名した。

班主ファージ　びＤＮＡファージＭＴＡ−４，ＭＴＡ−１及びＭＴ＾−５を、感染された一旦エエ１」− Ｙ１０８Ｂ細菌のプレート培養物から単離した。それらの細胞はＡＴＣＣ（＾ＴＣＣ１１３１１９５）から入手できる。ファージをファージ−希釈緩衝液（ｍａｎｉａｔｉｓ）の添加により集め、その材料を低速度遠心分離により細菌残骸から精製し、そして上清液を５−２７管中に注いだ。ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼを、１■／−のストック溶液から１μｌ／ｌｄの濃度の個々に添加した。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートし、そして同体積のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、　５．８　ｇのＮａＣｌ、２．０　ｇのｎｇｓｏ、・７ＬＯ，ＬＭのトリス）ＩＣＩ、ｐＨ７，５及び２％のゼラチンを添加した。サンプルを水浴中に１時間配置し、ファージ粒子の沈殿を引き起こし、次にそれを４°Ｃで約２０分間の遠心分離により単離した。

上清液をデカントし、そしてペレットをＰＩＩＢ　緩衝液（５，８ｇのＮａＣｌ、２．０　ｇのＭｇ５Ｏａ　・７ＨｔＯ，Ｉ　ＭのトリスＣ１５０ｄ、　ｐＨ７，４及び２％のゼラチン５ｄ）０．６ｄに再懸濁し、そして０．５　ｄのポリプロピレンマイクロ管に移した。１０％のＳＯ３５μｍ、０．５ＭのＥ［ｌＴＡ　５μｍ及びプロライナーゼＫ　（２０１１１ｇ／ｌｄ）　２．５μｌを添加し、そしてサンプルを５０°Ｃで１５分間インキュベートした。

界面活性剤及び酵素−処理された材料を、同体積のフェノール／クロロホルムにより抽出し、そして遠心分離し、相の分離を確保した。水性相を新しい管に移し、そして抽出／遠心分離工程を、クロロホルム及びイソアミルアルコールの混合物によりくり返した。同体積のイソプロパツールを添加し、そしてそれを数回返転し、混合せしめ、そして２０分間にわたって一７０°Ｃに冷却した。サンプルを５分間、遠心分離し、そして上清液をデカントした。ペレットを７０％エタノールにより洗浄し、すぐに３７°Ｃの熱ブロックで乾燥せしめ、＋Ｌ７１００　ｕ　Ｉ　（７）ＴＥｕ衝液（ｐ）１７．５　）　ニ再懸濁シタ。

単離されたファージＤＮＡを柱Ｌ■及びＳａｃユＩにより消化し、そして次に、 ■ｎ　Ｉ　／Ｓａｃ　Ｉにより切断されたプラスミドベクターｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｓｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）と共に組合し、対象の挿入体を含むプラスミド組換え体を単離した。次に、ＨＴＬＶ−１挿入体を、標準のジデオキシ配列決定法及びＥｃｏ　Ｒ１挿入部位を端に有するλｇｔｌ配列のための前方及び逆方向プライマーを用いて配列決定した。

図は、試験される３種の融合ペプチドの個々に関し、上記方法により形成された融合タンパク質の一部のコード配列及び対応するアミノ酸配列を示す。β−ｇａ＋遺伝子の末端Ｇ塩基及び３種々挿入体配列の個々により寄与されるｅｎｖ遺伝子の隣接するＣＣ塩基は、ＣＣＣ（Ａｌａ）コドンを生成し、すべての３種のｅｎｖ挿入体のそのコドン位置で通常存在するＳｅｒコドンを置換する。示されるように、ＭＴＡ−４における挿入体は、ＨＴＬＶ−１コード領域の塩基５５６４から５７９０に延長する２２５個の塩基対配列を含む。ＭＴＡ５ファージの挿入体は、塩基５６６４で始まり、そして塩基５８９５まで拡張する。２３１個の塩基対配列は、ｇｐ４６タンパク質のアミノ酸１６２〜２４０を包含する。

５６６４〜５７９０の挿入体オーバーラツプの領域は、生来のｇｐ４６タンパク質のアミノ酸１６２〜２０３の４２個のアミノ酸配列を含む。

肛ＨＴＬＶ−１ペプチド　のＡ、容原体の構成Ｅｃｏ　ＲＩ株Ｃ６００は、５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（Ｓｔａｎｆｏｒｄ、　ＣＡ）のＤｒ、　Ｒ。

Ｄａｖｉｓから得られた。他方、Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｙ１０８９　（ＡＴＣＣ１１３７１９６）も使用され得る。細胞の飽和された一晩の培養物１ｄを、例３がらの３種のファージの１つにより、−晩の細菌培養物５０μｍに溶離されたプラークストック１０μＩを吸着することによって感染せしめた。感染された細菌を、ＬＢ寒天プレート（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　４４０ページ）のみに広げ、そして３２ °Ｃでインキュベートした。個々のコロニーを、殺菌したつまようじにより、２種の別々のプレート上の対応するグリノド上に取った。プレートの１つを、３２ °Ｃでインキュベートし、そして他を４２°Ｃでインキュヘ−）シタ。低温で増殖する（ファージレプレンサータンパク質の存在により生成された溶原性状態を示す）が、しかし高温で増殖しない（細胞溶解のために）細胞は、溶原性であることが仮定された。３種のファージタイプの個々からの多くの容原体コロニーが見出された。

Ｂ、容原体からの組換え抗原誘発この例は、ｉτＡ−４フアージにより例４において調製されたλｇｔｌｌ容原体からのＨＴＬＶ−１エピトープを含む組換えタンパク質の誘発を記載する。上記のように、抗原は、ファージ−ｇａｌタンパク質のＮ−末端部分も含むα−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の形で生成される。ｌｌのｄ）１０中、バクトートリプトン３５ｇ、バクトー酵母抽出物２　ｇ、　ＮａＣｌ３　ｇ及びＩＮのＮａＯＨ５ｄを含む超ブイヨンを調製した。その超ブイヨン５００　ｄを、前の例で調製きれたＥｃｏ　Ｒ１λｇｔｌｌ溶原体の飽和された一晩の培養物により１：１００で接種した。その培養物を、激しい空気供給を伴ってＡ６００　０．４〜０．５にインキュベートした。

タンパク譬生成を最大にするために、培養物の温度を４３〜４４°Ｃに上げ、それによって感温性α−ガラクトシダーゼリプレッサー遺伝子を不活性化した。温度を、空気供給しながら、１５分間の６５°Ｃの水浴により４３°Ｃで維持した。α−ガラクトシダーゼリプレッサーに競争的に結合することによってα−ガラクトシダーゼ発現を誘発するｒＰＴＧを、２ｍＭまで前記ブイヨンに添加し、タンパク質生成をさらに高めた。培養物を３８°Ｃのシェーカーに約１時間、戻した。次に、細胞を、３７°Ｃで１５分間、６．ＯＯＯｘｇでペレット化し、溶解緩衝液（１０１のトリス、ｐＨ７，４，２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１％のアプロチニン及び５０μｇのＰＭＳＦ　＞に再懸濁し、そしてすぐに液体Ｎ２中にパージした。

溶解を、凍結サンプルの融解に基づいて完結した。

Ｃ１融合タンパク質の精製前の例で得られた細胞熔解物を融解し、そして３７°Ｃに暖めた。１０μｍのＤＮアーゼ（１μｇ／ｄ）を添加し、そしてその混合物を、粘度が低下するまで、インキュベートした。溶解物をすばやく、氷上で急冷し、マイクロッエージにおいて４°Ｃで５分間、透明にし、そして５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合された抗−α−ガラクトシダーゼの６ｄカラム上に負荷した。カラムを１〜２時間、平衡化し、そして７体積（カラム体積）のＴＸ緩衝液（１０ＩａＭのトリス、ｐＨ８，０゜２％のＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１００，５０μｇ　／ｌｌｄのＰＭＳＦ）　、続いて２体積の、ＴＸＩＩ衝液中、５ｍＭの３．５ −ショートサリチル酸溶液により洗浄した。

次に、融合タンパク質を、ＴＸ緩衝液中、３５ｍＭの３，５−ショートサリチル酸溶液によりカラムから溶出した。大部分のタンパク質が最初の３〜４体積に溶出され、そして残りは７体積の後、実質的に完結した。

溶出されたサンプルを脱塩し、そしてＡｍ１ｃｏｎフイルター（Ｄａｎｖｅｒｓ＋ＭＡ）を用いて濃縮した。

斑工）ＩＴＬＶ二１Ｌ亙亘握製Ａ、　ＨＴＬＶ−ＴＩＤＮ＾配列の合成及びクローニングポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて、クローニングのためのＨＴＬＶ　−ＩＩ　ＯＮ＾配列を生成した。６個の３０ｂｐのＤＩＩＡプライマーを合成した。すべての６個のプライマーは、３ｂｐのｇｔｌｌ配列、続いてそれらの５′端でＥｃｏ　Ｒ［部位を有した。この後、それらの５′端でＥｃｏ　Ｒ１部位が存在した。この後に、２１ｂｐのＨＴＬＶ−ＩＩｎ配列存在した。３個の前方向プライマー−は、ヌクレオチド５６４８−５６６８．５６８７−５７０７及び５７２６−５７４５に対応する）ＩＴＬＶ−ｎ配列を含んだ。３個の逆方向プライマーは、ヌクレオチド５７９４−５７７４．５７７６−５７５６．及び５７２Ｂ　−５７０８に対応するＨＴＬＶ　−ｎ配列を含んだ。

ＰＣＲを、製造業者の指示（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）に従って行ない、そしてすべてのＰＣＲ反応は鋳型として２ｎｇの上記ＨＴＬＶクローン及び１１ＩＭの適切なＰＣＩ＋プライマーを含んだ。ＰＣＲ増幅を２５サイクル行なった。個々のサイクルは、９４°Ｃでの１分間の鋳型変性、５０″Ｃでの２分間の鋳型へのプライマーのアニーリング、続いて、７２°Ｃでの２分間のプライマー拡張を包含した。その後、増幅されたＤＮＡを精製し、そして次に、Ｅｃｏ　ＲＴにより完全に消化した。次に、消化された［ＩＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏ　Ｒ１部位中に連結した。次に、組換えファージＤＮＡをパッケージし、そして非組換えファージの頻度を、５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−β− Ｄ−ガラクトピラノシドの存在下でプレートすることによって決定した。

組換えファージ：非組換えファージの比は、約５ｏ／１であった。

６個の組換えファージクローンの個々からの複数の単離されたプラークを取り、そして続いて、λｇｔｌｌ　フランキングプライマー１１Ｆ及びＩｌｌ？、及び／又は上記ＨＴＩ、Ｖ−ＩｔプラークによりＰＣＲを用いてスクリーンした。次に、正しいサイズで且つ配向された挿入体を含むクローンを増幅し、そして続くイムノスクリーニングアッセイに使用した。３種のクローンＧ１（２−に１５．ＧＨ２−Ｋ１６及びＧＨ２−に３５がらのＥｃｏ　Ｒ１フラグメントを、ρＧＥＸ−１プラスミドにサブクローンし、そしてＤｌｉＡを配列決定した。得られた配列は、ＨＴＬＶ−Ｕ　（Ｓｈｉｍｏｔｏｋｎｏ）の所望する領域についての報告された配列と完全に一致した。

Ｂ、　）ＩＴＬＶ−■クローンの免疫学的分析組換えファージを、野生型ｇｔｌｌと共に１／１で混合し、そしてそれを用いて、旦工且ユ株ＫＭ−３９２を感染せしめた。約５時間、そのファージを増殖した後、発現されたタンパク質をニトロセルロースフィルターに一晩結合せしめた。続いて、フィルターをＴＢＳ（０，５ＭのＮａＣｌ、　２０ｍＭのトリス、ｐＨ８，０）により３度洗浄し、断片に切断し、そしてＴＢＳ＋　１％のＧｅ１ａｔｉｎを用いてブロックした０次に、フィルター断片を、第１段階の抗体、通常、ＴＢＳ＋ゼラチンに１／１００で希釈された、）ＩＴｌ、Ｖ−１又はＨＴＬＶ−Ｉｔ感染個人からの血清と共に一晩インキユベートした。ＴＢＳにより洗浄した後、フィルターを、アルカリホスファターゼ接合のヤギ抗ヒト血清と共に少なくとも１時間インキュベートした。

フィルターをＴＢＳにより洗浄し、そして結合された抗体を、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートの溶液に前記フィルターをインキュベートすることによって検出した。特定の血清を、組換えファージに由来するプラークが野生型ｇｔｌｌのプラークから明白に区別され得る場合に、陽性であるとして評価した。

Ｃ，＆［ｌ換え抗原の発現及び精製 β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を、まず溶加棒を生成することによって発現した。組換えｇｔｌｌファージを用いて、Ｅ、コリ株ＢＮＮ１０３を感染せしめ、そして溶加棒を３２°Ｃ及び４２°Ｃで２重反復プレートを増殖することによって同定した。融合タンパク質の生成を、溶加棒の対数相培養物の温度を４２ °Ｃに１５分間、上昇せしめることによって誘発した。次に、イソプロピルチオガラクトシドを添加し、１．６Ｍｍの最終濃度にし、そして培養物を３７°Ｃでさらに１時間増殖せしめた。次に、細胞を、５００Ｑｘｇ　”？：　１５分間の遠心分離によりペレット化し、そして溶解緩衝液（２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００＋　１％のアプロチニン、　１０＋＊Ｍのトリス、ｐＨ７，４）の１１５０番目の元の培養物体積に再懸濁した。次に、前記溶液を、ドライアイス／エタノール浴における含浸により凍結し、そして次に融解した。ＤＮアーゼＩを添加し、１Ｍｇ／ｄの最終濃度にし、そして次に溶解物を室温で５分間インキュベートした。次に、不溶性残骸を、１０，０００ｘｇで１０分間、遠心分離によりペレット化した。次に、上清液を前記のようにして遠心分離した。前記ペレット及び上清法画分のアリコートのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ＋　Ｌａｍｍｅｌｉ）分析は、Ｇｌ（２４１５が上清法画分に主として見出されたことを示した。

次に、上清法画分を、２＋ｄのＰｒｏｔｏｓｏｒｂ　ＬａｃＺ吸着剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に組合し、そして２５°Ｃで２時間、撹拌しながらインキュベートした。次に、カラム樹脂を使い捨てカラム中に注ぎ、そして１０ｄのＴＸ緩衝液（１％のアプロチニン、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４）により２度洗浄した。

結合されたタンパク質を、ｐ）１１０．８の炭酸塩緩衝液１４ｍにより溶出し、そして２ｄの両分を、２Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７，５）１１ｄをすでに含む管中に集めた０次に、両分を、製造業者の指示に従ってＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０ｓ　（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。百分を２１ｄのＭＴＢＳ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ　、４４１ＭのＮａＨｚＰＯ４＋　Ｉｆ）ＩＭのＮａｚＨＰＯ４＋　ｐＨ７，３）により洗浄し、そして次に再び濃縮した。

精製された融合タンパク質の位置、収率及び純度を、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定した。イムノアフィニティーカラムＧ）１２−に１５を通しての１回の通過後、組換え抗原は約７０％の純度であった。融合タンパク質を含む両分をプールし、そしてそのプールのアリコートを続くウェスターンプロット実験に用いた。

ウェスターンプロット分析を上記のようにして（Ｌｉｐｋａ）行なった。滴定実験は、精製されたＧｌ２−に１５抗原の最適負荷が３μｇのタンパクＸ／ｃｍニトロセルロースであることを決定した。ペプチド競争実験は、例６Ｃに記載される。次に、プロットされた抗原を含むニトロセルロースストリップを、血清サンプルに添加し、そしてインキュベートし、そして通常のようにして進展せしめた。

Ｄ、ＨＴＬＶ抗血清血清サンプルを、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−Ｉｔ又はＥＬＩＳＡ反応性−ＨＴＬＶ陰性個人から得た。それらのサンプルは、複数の異なった源及び地理的領域からであった。多くの血清陽性血清サンプルを、株特異的ＤＮ＾プライマーによるＰＣＲを用いてＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−Ｉ［感染について類型に分けた。Ｈ τしＶ−１血清サンプルは、ジャマイカ人の食品調理人からの４５個のサンプル、ニューオリンズ領域からの２人の静脈薬物ユーザー（ＩＶＤＵ）及び１１人の北カルホルニア血液ドナーからのサンプルから成る５８種のＰＣＲ証明サンプルを包含した。さらに、合計２３８個のＨＴＬＶ　−１血清サンプルを日本から得た。日本人のサンプルに関しては、ＰＣＲデータは利用できず、そして感染は前記基準（Ｌｉｐｋａなど、　ＪＩＤ）を用いてＨＴＬシーＩ抗原に対する血清サンプルのウェスターンプロット分析により分類された。　Ｉ（ＴＬシー■血清サンプルは、ニューオリンズ領域からの６人のｒＶＤＵ、北カリホルニア領域からの２４人のｒＶＤＵ及び北カリホルニア領域からの２７人の血液ドナーから成る５７種のＰＣＲ証明サンプルを包含した。　ＨＴＬν陰性血清は、１人のジャマイカ人食品調理人、１５人のカリホルニア血液ドナー及び日本人からの２９種のサンプルを包含した。血清サンプルのＰＣＢ分析は、前記のようにして行なわれた（Ｌｉｐｋａ）。

撚旦ペプチド　心　の Δ、細胞熔解の阻害ＨＵＴ　１０２−８２細胞を、Ｏｒ、　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　ＬＴＣＢ、　ＮＩＨから得た。これは、）ＩＴＬＶ−１を生成することが知られている長期培養されたＴ−細胞系である。

、５重抗体（約５μｇ／ｌｌのＩｇＧ）又は対照のイソタイプ化された適合性ヒ）ＴｇＧを、ＭＴＡ−４組換えペプチド又は不適切な組換え体と共に室温で３０分間ブレインキュベートした。次に、それらの混合物５０μＩを、９６−ウェルマイクロタイタープレートにおける５Ｘ１０’個の１（ＵＴ　０２Ｂ２細胞に添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。

ウェル当たり３０μＩのウサギ補体を添加し、そして３７°Ｃで１時間インキュベートした。細胞生存率を、顕微鏡試験により決定した。細胞溶解は、ＭＴＡ− ４ペプチド抗原の添加により明らかに阻害されるが、しかし不適切な組換えペプチド抗原と共にブレインキュベートすることによっては阻害されなかった。組換え抗原又は不適切な組換えペプチド抗原のいづれかと共にブレインキュベートした後、イソタイプ化された適合性ヒト■ｇＧは、１（ＵＴ　１０２−８２生存率に対して効果を有さなかった。

Ｂ、　ＥＬｒＳＡ　アッセイＨＴＬＶ−１及びＩＩＴＬＶ−１１ペプチドをＥＬＩＳＡアッセイで試験し、上記合成ペプチドに結合する、ＨＴＬＶ感染された個人からの血清の能力を決定した。簡単に言及すれば、ＥＬＩＳＡアッセイは、マイクロタイタープレートへの一定量の合成ペプチドの結合、続く、ＨＴＬＶ感染された個人からの血清の添加を包含した。次に、未結合血清を洗浄により除去し、そしてペプチドに結合された抗体を第２抗体により検出した。第２抗体は、着色された生成物に無色基質を転換する酵素に接合される。生成された着色生成物の量は、ペプチドを結合した直情抗体の量を示す。結合したペプチドに対する特定の血清から得られたシグナルを、いづれのペプチドも含まないウェルからの血清により得られたシグナルから引き算した。負のペプチドバックグラウンドの引き算の後に得られた値は、陽性と思われるバノクグラウンド値の２．５倍であるべきであった。

Ｃ５抗体結合阻害阻害アッセイは、その上にプロットされるＨＴＬＶ−１又はＨＴＬＶ−ｎ組換え抗原を含むじトロセルロースのストリップを配置する前、ＨＴＬＶ感染された個人からの血清と共に高い過剰量の合成ペプチドのインキュベージジンを包含する。血清がペプチドに結合できる場合、抗体を含むばく大な過剰量のペプチド溶液は、ニトロセルロースストリップ上に存在する比較的少量の抗原への抗体の有意な結合を妨げるであろう。ニトロセルロースストリップ上での組換え抗原に結合される抗体の量を、ＥＬＩＳＡアッセイについて上記で述べた態様に類似する態様で、酵素接合された第２抗体を用いて決定する。対照実験は、ＨＴＬＶ−ｎペプチドに１２５と共にＩＩＴＬＶ　−１血清のインキュベージジン又は１（ＴＬＶ−ｎペプチドと共にＨＴＬＶ−ＩＩ血清のインキュベーション、及び次に、適切な＆［ｌ換え抗原を認識するための血清の能力の決定を包含する。

汎ＩＥＩＡ　アッセイ精製されたＭＴＡ−４ペプチド抗原を例４におけるようにして調製し、そしてニトロセルロースフィルター上にドツトプロットし、次に、Ｔ−細胞白血病を有する患者（ＨＴＬＶ−１感染を有する６人の患者）における血清抗体の決定について固相アッセイに使用した。個々の場合、試験個人からの１：１００〜１　：　５０．０００の範囲の種々の血清希釈溶液０．１１を、フィルターに添加し、そして室温で３０分間そのままに保持した。次に、フィルターをＴＢＳＴ緩衝液（例２）により２度洗浄し、そして例２におけるようにして、アルカリホスファターゼにより接合される抗−ヒト抗体と共にインキュベートした。抗体の存在を、例２におけるようにしてＮＢＴ及びＢＣＩＰにおける色の展開により決定した。

肛ＨＴＬＶ−１血゛かめるための・　されたウェス　−ンプロヱ上組換えＭＴＡ−１を、例４におけるようにして調製した。組換えｐ２１Ｅを、前記（Ｓａ＋＊ｕｅｌ、　１９８４．１９８５）のようにして調製した。　ＨＴＬＶ−ｎウィルス溶解物を、慢性的に感染された細胞系ＭＴ−２（ｌ（ｉｌｌｃｒｅｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｃｙｐｒｅｓｓ、　ＧＡ）から調製した。それらのＨτＬＶＩ抗原を組合し、そして次に、１１．５％のアクリルアミドＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（Ｌａｅｓｍｌｉ）上で還元条件下で分離した。識別されたタンパク質を、ニトロセルロース上で〔プロット−（１００ｍＭのトリス−１１ｃＩ　（ｐ）１７．４）中、５％ノンファツトドライミルク、２．５％の正常なりギ血清）によりブロックされたニトロセルロース膜上で〕電気プロットし、空気乾燥せしめ、そして３１ｍｍの幅のストリップに切断した。

アッセイにおいては、上記からの試験ストリップをまず、ＴＢＳ　ｆｉ衝液において再水和化し、そしてストリップをプロット−にｌ：５０の比で希釈されたヒト試験血清と共に一晩インキユベートした。ストリップを洗浄用緩衝液により数回洗浄し、次にアルカリホスファターゼに接合されたヤギ抗−ヒトＩｇＧ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＋　Ｒｉｃｈｓｏｎｄ＋　Ｃ＾）と共に１時間インキュベートした。洗浄の後、色の展開を、１００　ｍＭのトリス−ＭＣＩ緩衝液（ｐＦ１９．５　）及び５０＋ｗＭのＭｇ（：１２中、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロプルテトラゾリウムを含む基質溶液においてストリップをインキュベートすることによって達成した。色の展開を、均質のバックグラウンドがストリップ上で成長するまで続け、そして脱イオン水により２度ストリップをすすぐことによって一旦停止せしめた。

１１ＴＬＶ−１又はＨＴＬＶ−１１陽性血清のパネルを試験した。それらは、ＰＣＲ分析によりＨＴＬシーＩ又はＨＴＬＶ−ＩＩ陽性として前もって確認された（Ｌｉｐｋａ）。その結果は、図６に示され、ここで）ｉネル１−ＧＬよｔｌＴＬＶ−１抗血清であり、そしてパネルＨ−５は）ＩＴＬＶ−■抗血清である。ウィルス溶解物タンパク質ｇｐ２４は、組換えペプチドｇｐ２１Ｅと同じように、あらゆる血清サンプルと免疫反応性であった。ＭＴＡ−４は、ＨＴＬシー１血清サンプルのみと免疫反応性であった。

本発明は特定の態様、構成方法及び使用方法に関して記載されて来たが、種々の他の使用法、配合及び実施方法は本発明の範囲内にあることが当業者に明らかであろう。

Ｆｉｇ、ＬＡ！ＩＴＬＶ−工５５６５　５６６４　５フ９Ｑ　５８９５Ｍ’Ｉ’ＡＬｒｉｇ、ＩＢ＋ＮＵ、−Ａ　Ｄ　Ｇ　Ａ　Ｘ、Ｇ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｅ　Ｔ　Ｖ　Ｅ−、、。

ＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＭＧＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡ５５８１　５５９１　５６０１　５６１１　５６２１、　５６３１τＧＴＡＡＡＴＴＴＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＴＧＣＧＧＭＴＬＬＶＤＡＰＧＹＤＰＬＷＦ　工　ＴＳＶＬＴＰＳ　丁　ＳＷＴＴＫＦｉｇ、５パ：″、Ｌ５４席Ｍ、・イ纏預■は協嘉１ｉ１・・曹９、・　“【望＝１．．− 　シー’！ｆｆ１ｉ￥ｆ−’、”、１−”Ｉｌ、１、　０１１１’ｌｌｌ　曹　ｉ　Ｈ・４１−■■−■■■ｍ■■１■■■■■　頴Ｉｆ　ｙ　［ＩＩＩＩＩｉＷｓ　１１１１１　署−１ｗ　Ｏｌ　重：　電　日ｔ、ｉ、薯）【１１　厘１１　杭− １し　ム　０≦ 曹　Ｊ　■　−ｋ　ｇｌＱ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年８月２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．４ＴＣＣ細胞系ＨＢ８７５５に由来する抗−ＨＴＬＶ−Ｉモノクローナル抗体と免疫反応性であるアミノ酸配列、【配列があります】により形成される免疫原領域を含む、ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約７７個以下のアミノ酸を含んで成るペプチド抗原。
２．前記免疫原領域が、前記請求の範囲第１項記載の配列のＳｅｒ端から拡張するアミノ酸配列【配列があります】をさらに含むアミノ酸配列により形成される請求の範囲第１項記載の抗原。
３．前記免疫原領域がアミノ酸配列【配列があります】により形成される請求の範囲第１項記載の抗原。
４．ヒト血清におけるＨＴＬＶ−Ｉ感染を検出するためのキットであって、ＡＴＣＣ細胞系ＨＢ８７５５に由来する抗−ＨＴＬＶ−Ｉモノクローナル抗体と免疫反応性であるアミノ酸配列【配列があります】により形成される免疫原領域を含む、ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約７７個以下のアミノ酸を含んで成る固定されたｇｐ４６ペプチド抗原を有し、そして前記ペプチド抗原と血清抗体との接触を可能にするように構成されている固体支持体（そのような血清が固体支持体に適用される）、及び前記支持体に結合されるヒト抗体の存在を検出するためのレポーター手段を含んで成るキット。
５．前記ｇｐ４６抗原の免疫原領域が、前記請求の範囲第１項記載の配列のＳｅｒ端から拡張するアミノ酸配列【配列があります】をさらに含む請求の範囲第４項記載のキット。
６．前記免疫原領域がアミノ酸配列【配列があります】により形成される請求の範囲第４項記載のキット。
７．前記固体支持体が、ストリップ上の１つの位置で固定された前記ｇｐ４６ペプチド抗原を有するストリップ、及び前記ｇｐ４６抗原の位置から離れた位置に置かれたストリップ上の１つの又は複数の位置で固定された、すべてのＨＴＬＶ −Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清を明確に確かめるのに有効な１又は複数のウィルス抗原を含む、そのようなＨＴＬＶ−Ｉ感染の存在を確かめるための請求の範囲第４項記載のキット。
８．ＨＴＬＶ−ＩＩ陽性血清からの抗体と特異的に反応することができるＨＴＬＶ−ＩＩ特異的抗原をさらに含む請求の範囲第４項記載のキット。
９．前記ＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチドがアミノ酸配列、【配列があります】により形成されるＨＴＬＶ−ＩＩ特異的免疫原領域を有する請求の範囲第８項記載のキット。
１０．前記ＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチド免疫原領域が、アミノ酸配列【配列があります】により形成される請求の範囲第９項記載のキット。
１１．前記ＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチド免疫原領域が、アミノ酸配列【配列があります】により形成される請求の範囲第９項記載のキット。
１２．ＨＴＬＶ−Ｉ陽性ヒト血清の検出方法であって、ＡＴＣＣ細胞系ＨＢ８７５５に由来する抗−ＨＴＬＶ−Ｉモノクローナル抗体と免疫反応性であるペプチド抗原と前記血清とを反応せしめ、そして前記ペプチドに結合されるヒト抗体の存在を検出することを含んでなる方法。
１３．前記ペプチドがＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約７７個以下のアミノ酸を含み、そしてアミノ酸配列【配列があります】により形成される免疫原領域を含む請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．ＨＴＬＶ−Ｉ陽性ヒト血清の検出に使用するためのペプチドの生成方法であって、（ｉ）（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）ｍ〔式中、Ｎ１Ｎ２Ｎ３は実質的に個々の天然Ｌ−アミノ酸に対応する異なったトリヌクレオチドコドンを表わし、そしてｍは５〜１０である〕で表わされるランダムー配列ポリヌクレオチドの混合物を生成し、（ｉｉ）挿入された配列を発現できるベクター中に前記ポリヌクレオチドを挿入することによってランダムー配列ベクターのライブラリィーを形成し、（ｉｉｉ）ランダムアミノ酸配列としてランダムー配列ポリヌクレオチドを発現するために前記ライブラリィーベクターを操作し；（ｉｖ）ＡＴＣＣ細胞系ＨＢ８７５５に由来する抗−ＨＴＬＶ−Ｉモノクローナル抗体と免疫反応性であるアミノ酸配列の存在について前記ライブラリィーベクターをスクリーニングし、（ｖ）そのような免疫反応性アミノ酸配列を発現するライブラリィーベクターを単離し、そして（ｖｉ）単離されたベクターにおいて挿入された配列によりコードされるポリペプチドを生成することを含んで成る方法。
１５．アミノ酸配列【配列があります】により形成される免疫原領域を含む、ＨＴＬＶ−ＩＩエンロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約５０個以下のアミノ酸を含んで成るペプチド抗原。
１６．前記ＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチド免疫原領域がアミノ酸配列【配列があります】により形成される請求の範囲第１５項記載のペプチド。
１７．前記ＨＴＬＶ−ＩＩ特異的ペプチド免疫原領域がアミノ酸配列【配列があります】により形成される請求の範囲第１５項記載のペプチド。
１８．ヒト血清におけるＨＴＬＶ−ＩＩ感染の存在を検出するためのキットであって、アミノ酸配列【配列があります】により形成される免疫原領域を含む、ＨＴＬＶ −ＩＩエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約５０個以下のアミノ酸を含んで成る固定されたペプチド抗原を有する固体支持体、及び前記ペプチドに結合されるヒト抗体の存在を検出するためのレポーター手段を含んで成るキット。
１９．ＨＴＬＶ−Ｉによる感染に対するワクチンとして使用するための組成物であって、ＡＴＣＣ細胞系Ｈ８８７５５に由来する抗−ＨＴＬＶ−Ｉモノクローナル抗体と免疫反応性であるアミノ酸配列、【配列があります】により形成される免疫原領域を含む、ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約７７個以下のアミノ酸を含んで成るペプチド抗原；及び前記ペプチドが結合されるキャリヤーを含んで成る組成物。
２０．アミノ酸配列【配列があります】により形成される免疫原領域を含む、ＨＴＬＶ−ＩＩエンベロープタンパク質ｇｐ４６に由来する約５０個以下のアミノ酸を含んで成る、前記免疫原キャリヤーに結合されたペプチド抗原をさらに含む、ＨＴＬＶ−ＩＩによる感染に対するワクチンとしても使用するための請求の範囲第１９項記載のワクチン。