CZ85597A3

CZ85597A3 - Peptidy

Info

Publication number: CZ85597A3
Application number: CZ97855A
Authority: CZ
Inventors: Vernon L. Alvarez
Original assignee: Cytogen Corporation
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 1998-01-14
Also published as: DE69526665D1; WO1996009411A1; EP0789783A4; DE69526665T2; AU3719395A; CA2200684A1; US6015561A; IL115373A0; ATE217344T1; EP0789783B1; JPH10506463A; EP0789783A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká peptidů, schopných specifické vazby na dané ligandy (ve významu ligandy, které nás zajímají, ligands of interest). Předkládaný vynález se rovněž týká peptidů, schopných napodobit specifickou vazbu receptoru k jeho ligandu, protilátky k jejímu antigenu apod. Takové peptidy jsou známy jako „abtidy“. Abtidy se identifikují při prvním a druhém kroku třídění (screening) peptidových knihoven. První krok třídění používá protilátky io nebo receptoru jako prvního cílového ligandu a identifikuje peptidové sekvence („mimetopy“), které se specificky váží na protilátku nebo receptor. Mimetopy jsou potom vneseny do druhého cílového ligandu ve druhém kroku třídění, aby se identifikovaly abtidy, které se na mimetop váží. Abtidy napodobují vazebnou specificitu protilátky (na její antigen) nebo receptoru (na jeho ligand), které byly použity jako první cílový ligand v prvním kroku třídění. Vynález se dále týká použití abtidů v testech namísto protilátek. Vynález také poskytuje prostředky na bázi abtidů pro použití v léčení a diagnóze onemocnění.

2o Dosavadní stav techniky

Tato přihláška navazuje na US přihlášku No. 08/310,192, podanou 21. 9. 1994, jejíž obsah se zde udává jako referenční.

2.1. Peptidové knihovny

Použití peptidových knihoven je v oboru dobře známo. Takové peptidové knihovny byly obvykle vytvářeny jedním ze dvou přístupů.

Podle jednoho způsobu byly peptidy chemicky syntetizovány in vitro v několika formátech, například Fodor a další, 1991, Science 251: 767 ·· ····

-2773 popisují použití komplexního přístrojového vybavení, fotochemických reakcí a počítačového třídění pro syntézu známé skupiny (array) krátkých peptidů na jednotlivém mikroskopickém sklu. Houghten a další, 1991, Nátuře 354: 84 - 86 popisuje směsi volných hexapeptidů, ve kterých první a druhé zbytky v každém peptidů byly individuálně a specificky definovány. Lam a další, 1991, Nátuře 354: 82 - 84 popisuje přístup „jeden nosič, jeden peptid“, při kterém rozdělené schéma syntézy na pevné fázi vytvořilo knihovnu peptidů, ve které každý nosič ve sbírce měl na sobě zakotven (imobilizován) io jedinou náhodnou sekvenci aminokyselinových zbytků. Většinou byla schémata chemických syntéz zaměřena na vytvoření skupin peptidů s krátkou délkou, obvykle méně než přibližně deset aminokyselin, zvláště přibližně šest až osm aminokyselin. Pro využití těchto knihoven je nutno použít přímého sekvenování aminokyselin, buď samotného nebo v kombinaci s úplným záznamem schémat syntézy peptidů.

Podle druhého způsobu, který využívá technik rekombinantní DNA byly peptidy exprimovány v biologických systémech buď jako rozpustné fúzní proteiny nebo fúzní proteiny virových kapsid.

Velké množství peptidových knihoven vytvořených druhým způsobem používalo fága M13. M13 je vláknitý bakteriofág, který byl v posledních letech často využíván v molekulárně biologických laboratořích. Virové částice M13 sestávají ze šesti různých kapsidových proteinů a jedné kopie virového genomu ve formě jednořetězcové cirkulární molekuly DNA. Jakmile byla M13 DNA zavedena do hostitelské buňky, jako je E. coli, přemění se na dvouřetězcovou cirkulární DNA. Virová DNA obsahuje druhý počátek replikace, který se použije pro vytvoření jednořetězcové DNA, která se nalézá ve virových částicích. Během morfogeneze viru dojde k uspořádání jednořetězcové DNA a virových proteinů a virové částice se vytlačují z buněk způsobem připomínajícím sekreci. Virus M13 není • · · ί ! · · * • * * · ······ ······· ··· · · · φ « _t

- 3 lysogenní ani lytický jako jiné bakteriofágy (např. λ); buňky chronicky uvolňují virus, jakmile jsou jednou infikovány. Tento jev vede k vysokému titru viru v infikovaných kulturách, tj. 10¹² pfu/ml.

Genom fága M13 má délku přibližně 8000 nukleotidů a byl úplně sekvenován. Virový kapsidový protein, protein III (plil) je odpovědný za infekci bakterie. V E. coli interaguje pilinový protein, kódovaný F faktorem, s proteinem plil a je odpovědný za vniknutí fága. Všechny hostitelské buňky E. coli viru M13 jsou pokládány za F⁺ (male), protože nesou F faktor. Bylo již několikrát určeno analýzou mutací, že io plil kapsidový protein s délkou 406 aminokyselin má dvě domény. Ckonec ukotvuje protein k virovému obalu, zatímco části N-konce proteinu plil jsou nezbytné pro interakci s pilinovým proteinem E. coli (Crissman a Smith, 1984, Virology 132: 445 - 455). Ačkoliv se ukázalo, že N-konec proteinu plil je pro virovou infekci nezbytný, jeho is část nejblíže N-konci připouští záměny. V roce 1985 publikoval George Smith experimenty týkající se použití proteinu plil bakteriofága M13 jako experimentálního systému pro expresi heterologního proteinu na povrchu virového obalu (Smith, 1985, Science 228: 1315 1317). Ve dvou laboratořích bylo potom nezávisle zjištěno, že genový

2o expresní systém (gene display systém) plil fága M13 by mohl být použitelný pro mapování epitopů protilátek. De la Cruz a další, 1988, J. Biol. Chem. 263: 4318 - 4322 klonovali a exprimovali segmenty cDNA, kódující protein vnějšího obalu Plasmodium falciparum do genu plil a rekombinantní fág byl testován na imunologickou reaktivitu s polyklonální protilátkou. Parmley a Smith, 1988, Gene 73: 305 - 318 klonovali a exprimovali úseky β-galaktosidázového genu E. coli do genu plil a identifikovali rekombinanty, nesoucí epitop anti-βgalaktosidázové monoklonální protilátky. Druzí autoři také popsali způsob označovaný „biopanning“, při kterém byly směsi

3o rekombínantního fága inkubovány s biotinylovanými monoklonálními protilátkami a komplexy fág - protilátka mohly být specificky izolovány plastikovými destičkami pokrytými streptavidinem.

-4 V roce 1989 navrhli Parmley a Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215 - 218, že krátké syntetické úseky DNA, klonované do genu plil, by mohly představovat knihovnu epitopů. Autoři to zdůvodňovali tím, že protože lineární epitopy mají často délku přibližně šest aminokyselin, mělo by být možné používat náhodnou rekombinantní knihovnu DNA pro expresi všech možných hexapeptidů pro izolaci epitopů, které se vážou na protilátky.

Scott a Smith, 1990, Science 249: 386 - 390 popisují konstrukci a expresi „epitopové knihovny“ hexapeptidů na povrchu M13. io Knihovna byla vytvořena vložením oligonukleotidu o délce 33 párů bází štěpeným Bgl I do fága fd-tet, štěpeného Sfi I, tj. fUSE5 RF. Fragment o délce 33 párů bází obsahuje náhodnou nebo „degenerovanou“ kódující sekvenci (NNK)₆, kde N představuje G, A, T nebo C a K představuje G nebo T. Autoři uvádějí, že knihovna sestává z 2 x 10⁸ rekombinantů, exprimujících 4 x 10⁷ různých hexapeptidů; teoreticky tato knihovna exprimovala 69 % z 6,4 x 10⁷možných peptidů (20⁶). Cwirla a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6378 - 6382 popisují také částečně podobnou knihovnu hexapeptidů, exprimovaných jako genové fúze plil fága M13 fd.

Zveřejnění PCT WO 91/19818 z 26. 12. 1991 (Dower a Cwirla) popisuje podobnou knihovnu pentamerních až oktamerních náhodných sekvencí aminokyselin.

Devlin a další, 1990, Science, 249: 404 - 406 popisuje peptidovou knihovnu s přibližně 15 zbytky, vytvořenou s použitím kódovacího schématu (NNS) pro syntézu oligonukleotidu, v němž S znamená G nebo C.

Christian se spolupracovníky popsali fágovou expresní knihovnu (phage display library), exprimující dekapeptidy (Christian a další,

1992, J. Mol. Biol. 227: 711 - 718). Výchozí DNA byla vytvořena pomocí oligonukleotidu obsahujícího degenerované kodony [NN (G/T)]io se samokomplementárním 3’ koncem. Tato sekvence při • · · · · · ·· · • ·· • · vytváření vlásenky vytváří samostatné (self-priming) replikační místo, které může být použito T 4 DNA polymerázou pro vytvoření komplementárního řetězce. Dvojřetězcová DNA byla štěpena pro klonování do vektoru fUSE5, popsaného výše (Scott a Smith) v místech Sfi I na 5’ konci a vlásence.

Další laboratoře používaly pro expresi nevirové DNA na povrchu fágových částic jiných virálních kapsidových proteinů. Hlavním kapsidovým proteinem viru M13 je protein pVIII, který interaguje na svém C-konci s jednořetězcovou DNA virových částic M13. Jeho délka io je 50 aminokyselin a v částici existuje přibližně v 2700 kopií. N-konec proteinu je přístupný a toleruje inzerce, ačkoliv jsou zprávy, že dlouhé inzerty přerušují uspořádání fúzních proteinů pVII do virových částic (Cesareni, 1992, FEBS Lett. 307: 66 - 70). Pro minimalizaci negativního vlivu fúzních proteinů pVII byl použit fágmidový systém (phagemid). Bakteriální buňky nesoucí fágmid jsou infikovány pomocným fágem a sekrenují virové částice, které obsahují směs kapsidových molekul jak divokého typu, tak i fůzní pVIII. PVIII rovněž sloužil jako místo pro expresi peptidů na povrchu virových částic M13. Sekvence čtyř a šesti aminokyselin odpovídající rozdílným částem

2o hlavního povrchového antigenu Plasmodium falciparum byly klonovány a exprimovány ve srovnatelném genu vláknitého bakteriofága fd (Greenwood a další, 1991, J. Mol. Biol. 220: 821 827).

Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149 - 157 popisuje vytváření knihovny obtížným způsobem, který zahrnuje navázání oligonukleotidů o délce 17 nebo 23 degenerovaných bází s paiindromickou sekvencí o délce 8 nukleotidů na jejich 3’ koncích. To vedlo k expresu náhodných hexa- nebo oktapeptidú jako fúzních proteinů s β-galaktosidázovým proteinem v bakteriálním expresním

3o vektoru. DNA pak byla přeměněna na dvojřetězcovou formu Klenowovou DNA polymerázou, tupými konci ligována do vektoru • · ·

* · · • · · • · · · • · • 9 9

-δα potom vyštěpena jako fragmenty Hind III. Fragmenty pak byly klonovány do expresního vektoru na C-konci šikmo seříznuté βgalaktosidázy za vytvoření 10⁷ rekombinantů. Kolonie potom byly lyžovány, blotovány na nitrocelulózových filtrech (10⁴/filtr) a testovány na imunologickou reaktivitu s různými monoklonálními protilátkami. Opakovaným testováním bylo izolováno velké množství klonů, které bylo sekvenováno.

Culí a další, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 1865 - 1869 popsali systém, ve kterém byly náhodné peptidy fúzovány do io karboxylového konce lac represoru. Fúzní proteiny obsahovaly intaktní aminokonec lac (který je odpovědný za specifickou vazbu lac represoru na sekvence DNA, tvořící operátorová místa lac). Nukleotidové sekvence kódující fúzní protein byly klonovány do plasmidů, obsahujícího kopie operátorového místa lac. Když byl tedy fúzní protein exprimován v bakterii, zůstal navázán na operátorová místa plasmidů, který ho kóduje. To poskytlo fyzické spojení mezi fúzním proteinem a genem, který ho kóduje. Když byla bakterie s plazmidem testována ligandy, pro které bylo třeba izolovat vazebné partnery, byly izolovány fúzní proteiny obsahující peptidy, které se

2o specificky váží k ligandu, nesoucí spolu geny, které kódovaly tyto fúzní proteiny.

Souhrnný přehled různých typů peptidových knihoven je možno nalézt v Gallop a další, 1994, J. Med. Chem. 37: 1233 - 1251.

2.2. Ligandy, používané pro třídění peptidových knihoven

Třídění (screening) peptidových knihoven bylo obecně omezováno použitím omezeného počtu ligandů. Nejběžněji byla ligandem protilátka (Parmley a Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215 - 218; Scott a Smith, 1990, Science 249: 386 - 390). V mnoha ao případech je cílem třídění identifikovat peptidy z knihovny, které napodobují epitopy, proti kterým jsou protilátky zaměřeny. Jestliže je

tedy dostupná protilátka, peptidové knihovny jsou výbornými zdroji pro identifikaci epitopů nebo epitopům podobných molekul této protilátky (Yayon a další, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10643 - 10647).

Zatímco předchozí studie byly úspěšné při identifikaci epitopů 5 a epitopům podobných molekul z peptidových knihoven, nikde ve stavu techniky nebylo použito toho přístupu, že by mohlo být použito identifikovaných epitopů v další sérii třídění peptidové knihovny pro identifikaci protilátkám podobných molekul.

Když bylo potřeba získat protilátkám podobné molekuly, io v dosavadním stavu techniky bylo používáno peptidových knihoven, které obsahují v přírodě se vyskytující sekvence protilátek. To bylo pravděpodobně kvůli tomu, že je známo, že specifická vazba protilátkami závisí na komplexní struktuře, včetně oblastí, určujících komplementaritu (CDR), často pocházejících z jak lehkého, tak i těžkého řetězce protilátky. Neočekávalo se, že krátké peptidy by mohly napodobit tyto struktury a delší peptidy byly považovány za nevhodné pro expresi ve většině běžných používaných knihoven.

McCafferty a další, 1990, Nátuře 348: 552 - 554 používal pro amplifikací genů imunoglobulinových proměnných (variable, V) oblastí

PCR a klonoval tyto geny do fágových expresních vektorů. Autory bylo navrhováno, že fágové knihovny oblastí V, D (diversity) a J (joining) by mohly být tříděny pomocí antigenu. Fág navázaný na antigen by mohl pak být mutován ve smyčkách genů protilátky vázajících antigen a znovu tříděn (rescreened). Tento postup by mohl být několikrát opakován, až by nakonec vznikl fág, který silně váže antigen.

Marks a další, 1991, J. Mol. Biol. 222: 581 - 597 rovněž používali PCR pro amplifikací genů imunoglobulinové proměnné (V) oblasti a klonovali tyto geny do fágových expresních vektorů.

Kang a další, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4363 - 4366 3o vytvořili fágmidový vektor, který by mohl být použit pro expresi V a C (constant) oblastí těžkého a lehkého řetězce proti antigenu specifické • · ·

-8protilátky. V - C oblasti těžkého a lehkého řetězce byly vytvořeny tak, aby se v periplazmě spojily za vytvoření protilátce podobné molekuly s funkčním místem pro vazbu antigenu. Infekce buněk nesoucích tento fágmid s pomocným fágem měla za následek inkorporaci protilátce podobné molekuly na povrch fága, nesoucího fágmidovou DNA. To umožnilo identifikaci a obohacení těchto fágů screeningem pomocí antigenu. Bylo navrhováno, že obohacený fág by mohl být mutován a podroben dalšímu screeningu, což by vedlo k izolaci protilátkám podobných molekul, které by byly schopny ještě silnější vazby na antigen.

Hoogenboom a další, 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133 - 4137 navrhovali, že do fágových expresních knihoven by mohly být klonovány samostatné geny protilátky. Poté by následovala náhodná mutace klonovaných genů protilátky, aby se vytvořily varianty s is vysokou afinitou.

Dosud byl prováděn screening peptidových knihoven receptory pro identifikaci receptorových peptidů podobných ligandu, ale peptidové knihovny nebyly považovány za použitelné pro identifikaci peptidů vázajících se na ligandy jako jsou ty peptidy, které napodobují

2o receptory.

Bass a další, 1990, Proteins: Struct. Func. Genet. 8: 309 - 314 fúzovali lidský růstový hormon (hGH) do karboxylového konce genu III proteinu fága fd. Tento fúzní protein byl vestavěn do fágmidového vektoru. Když byly buňky nesoucí fágmid infikovány pomocným fágem, přibližně 10 % vyprodukovaných fágových částic mělo na svém povrchu fúzní protein. Tyto fágové částice byly obohaceny screeningem pomocí nosičů potažených hGH receptorem. Bylo navrhováno, že tento systém by mohl být použit pro vývoj mutantú hGH se změněnými vazebnými vlastnostmi receptoru.

Lowman a další, 1991, Biochemistry 30: 10832 - 10838 použil zlepšené verze systému podle Bass a další popsaného výše pro • · · · · ·

·♦ · · ·· • · · • · · * • · · ······· ·*

-9výběr mutantních proteinů hGH s výjimečně vysokou afinitou k receptoru hGH. Autoři náhodně mutovali fúzní proteiny hGH - plil v místech blízko koncovým 12 aminokyselinám hGH, které bylo předem identifikováno jako důležité pro vazbu receptoru.

Balass a další, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10638 10642 používali fágovou expresní knihovnu pro izolaci lineárních peptidú, které napodobovaly na konformaci závislý epitop kyselina nikotinová - acetylcholinového receptoru. Toho bylo dosaženo screeningem knihovny monoklonální protilátkou specifickou pro na io konformaci závislý epitop. Použitá monoklonální protilátka byla považována za specifickou vůči vazebnému místu acetylcholinového receptoru pro jeho přirozený ligand, acetylcholin.

Citace nebo uvedení jakékoliv reference by nemělo být považováno za označení této reference jako stavu techniky vzhledem k předkládanému vynálezu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká abtidů. Termín „abtidy“ označuje peptidy, které napodobují vazebnou specificitu větší molekuly, jako je protilátka nebo receptor. Abtidy se specificky váží k danému ligandu, který je specifickým vazebným partnerem větší molekuly (například protilátky nebo receptoru). Pro identifikaci abtidů podle předkládaného vynálezu se provádí screening peptidových knihoven ve dvou stupních. První krok screeningu používá jako cílový ligand protilátku (nebo její derivát, který se váže k antigenu) nebo receptor (nebo jeho derivát, který se váže k ligandu). V tomto kroku se identifikují peptidové sekvence označené jako „epitopy“ nebo „mimetopy“, které se specificky vážou na cílový ligand. V případě, že se jako první cílový ligand použije protilátky nebo jejího derivátu, mimetop často napodobuje buď svou funkcí nebo svou schopností vazby a/nebo

- 10 • · · φ · • ♦ • φ · φ · ••ΦΦΦΦΦ · strukturálně svou aminokyselinovou sekvencí, epitop rozpoznávaný použitou protilátkou jako první ligand. Epitop nebo mimetop se pak použije jako druhý cílový ligand ve druhém kroku screeningu pro identifikaci peptidové sekvence, která se specificky váže k epitopu nebo mimetopu. Takové peptidy jsou známy jako „abtidy“. Překvapivě bylo autory vynálezu zjištěno a v předkládané přihlášce ukázáno, že abtidy mají vazebné specifity nápadně podobné specificitám, které jsou vlastní prvním cílovým ligandům (obvykle protilátkám nebo receptorům) popsaným výše.

Užitečnost abtidů spočívá v tom, že napodobují vazebné specifity protilátek nebo receptoru. Může jich tedy proto být použito v mnoha případech, kde může být použito protilátek nebo receptorů. Předkládaný vynález se dále týká použití abtidů namísto protilátek v testech, jako je například mnoho typů v oboru známých imunologických testů. Abtidy mohou zastupovat protilátky v takových testech, jako jsou například ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) nebo sendvičové imunologické testy. Vynález také poskytuje abtidové prostředky pro použití při léčení a diagnostice. Ve specifickém příkladu bylo objeveno a ukázáno použití abtidů namísto protilátek v enzymových imunosorpčních testech a při lokalizaci karcinomu prostaty na xenograftovém modelu in vivo.

Použití abtidů má proti použití protilátek nebo receptorů mnoho potenciálních výhod: menší velikost abtidů dovoluje jejich snadnější výrobu s nižšími náklady, sníženou imunogenicitou a může umožnit jejich přenos na určité místo in vivo v případě potřeby; v případě potřeby je možno odstranit biologické reakce a funkce zprostředkované stále stejnými oblastmi protilátek, zesítění protiiátek/receptorů a výsledné biologické účinky.

Ve specifickém provedení protilátka nebo její derivát použité v prvním kroku screeningu rozpoznávají tumorový antigen, s výhodou antigen lidského tumoru, výhodněji tumoru maligního.

• · 4

I • · 4 «

4

Ve zvláštním provedení byly produkovány abtidy, u kterých byla prokázána schopnost zastupovat protilátky při testech ELISA a lokalizovat se in vivo do karcinomu prostaty v xenograftovém modelu.

Předkládaný vynález poskytuje způsob úspěšného screeningu 5 zaměřeného na velmi malé peptidové nebo proteinové cíle, například 5 až 40 aminokyselin, s výhodou 10 až 20 aminokyselin. Doposud nebyl screening zaměřený na tak malé cíle úspěšný. Způsoby podle předkládaného vynálezu zvyšují pravděpodobnost, že získaný abtid se bude vázat na svůj cíl komplexním nebo na struktuře závislým io způsobem.

Abtidy jsou užitečné, protože napodobují vazebnou specificitu protilátek nebo receptorů. Mohou být tedy použity v mnoha případech, kde lze použít protilátek nebo receptorů. Předkládaný vynález se dále týká použití abtidů v testech jako je mnoho typů v oboru známých is imunologických testů. Abtidy mohou zastupovat protilátky v takových testech, jako je například ELISA nebo sendvičové imunologické testy.

5.1. Peptidové knihovny pro použití při identifikaci abtidů

Abtidy podle předkládaného vynálezu mohou být identifikovány 2o z chemicky syntetizované peptidové knihovny nebo z biologicky exprimované peptidové knihovny. Jestliže je použita peptidová knihovna získaná biologickou expresí, může být izolována nukleová kyselina, která kóduje peptid, který se váže k danému ligandu a pak sekvenována pro určení její nukleotidové sekvence, čímž je možno z vyvodit sekvenci aminokyselin, která zprostředkuje vazbu. Alternativně může být aminokyselinová sekvence příslušné vazebné domény určena přímým stanovením sekvence aminokyselin peptidu, zvoleného z peptidové knihovny obsahující chemicky syntetizované peptidy. V méně výhodném aspektu může být také provedeno přímé sekvenování aminokyselin vazebného peptidu vybraného z knihovny peptidů získané biologickou expresí.

·· *···

- 12 Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou abtidy s výhodou identifikovány z knihoven náhodných peptidu. Typicky budou knihovny náhodných peptidú kódovány syntetickými oligonukleotidy s množstvím variant poloh nukleotidů, které jsou schopny kódovat všech dvacet v přírodě se vyskytujících aminokyselin. Sekvenci aminokyselin kódovanou těmito variantami nukleotidů není možno předpovědět a je v podstatě náhodná. Termíny „nebyla předpovězena“, „nelze předpovědět“ a „v podstatě náhodná“ je možno vzhledem ke kódovaným aminokyselinám libovolně iq zaměňovat a mají označovat, že různé nukleotidy v různých polohách mohou znamenat jakoukoliv z dvaceti v přírodě se vyskytujících aminokyselin. Tyto různé nukleotidy jsou produktem náhodné chemické syntézy. Biologické knihovny náhodných peptidú vhodné pro použití zahrnují i takové, ve kterých byl vytvořen posun náhodné is sekvence, který například znevýhodňuje použití stop-kodonu.

5.1.1 Chemicky syntetizované peptidové knihovny

Peptidové knihovny používané v předkládaném vynálezu mohou být knihovny, které jsou chemicky syntetizovány in vitro. Příklady

2o takových knihoven se popisují v Fodor a další, 1991, Science 251: 767 - 773, kde se popisuje syntéza známé skupiny krátkých peptidú na jednotlivém mikroskopickém sklu; Houghten a další, 1991, Nátuře 354: 84 - 86, kde se popisují směsi volných hexapeptidů, ve kterých jsou individuálně a specificky definovány první a druhé zbytky v každém peptidu. Lam a další, 1991, Nátuře 354: 82 - 84 popisuje rozštěpené schéma syntézy; Medynski, 1994, Bio/Technology 12: 709 - 710 popisuje rozštěpenou syntézu a způsoby syntézy T-bag. Další informace je možno nalézt v Gallop a další, 1994, J. Medicinal Chemistry 37: 1233 - 1251.

3o PCT zveřejněni WO 91/05058 z 18. 4. 1991 je zaměřena na náhodné knihovny, které obsahují semi-náhodné nukleotidové ·· ···· sekvence. Semi-náhodné nukleotidové sekvence se přepisují in vitro za takových podmínek, že se vytvářejí polyzomy. Polyzomy se pak testují na vazbu k dané látce. Izolují se takové polyzomy, které se k dané látce vážou. RNA z těchto polyzomů se použije pro konstrukci cDNA, jejíž expresí se získávají polypeptidy.

Screening za účelem identifikace peptidů, které se vážou k danému ligandu může být proveden v oboru známými způsoby.

Ve zvláštním provedení je celkový počet náhodných aminokyselin v peptidech chemické knihovny, která se používá pro screening větší nebo roven pěti a menší nebo roven dvaceti pěti; v dalších provedeních je celkový počet v rozmezí 5 až 15 nebo 5 až 10 aminokyselin, s výhodou blízkých aminokyselin.

I když může být vazebná doména identifikována z chemicky syntetizovaných peptidových knihoven, taková doména by byla malá is (tj. méně než 10 aminokyselin a pravděpodobněji 5 až 6 aminokyselin dlouhá). Proto je chemicky syntetizovaná peptidová knihovna pro druhý krok screeningu zaměřený na izolaci abtidů méně výhodná než při použití ve druhém kroku screeningu biologických peptidových knihoven obsahujících náhodné sekvence větší délky popsané níže.

5.1.2 Biologické peptidové knihovny

V dalším provedení se pro identifikaci abtidů používá biologických peptidových knihoven. Použito může být mnoha vhodných v oboru známých peptidových knihoven.

Podle tohoto druhého přístupu, který používá technik rekombinantní DNA byly peptidy exprimovány v biologických systémech buď jako rozpustné fúzní proteiny nebo fúzní proteiny virové kapsidy.

Velké množství peptidových knihoven podle tohoto způsobu využívalo fága M13. Ačkoliv N-konec virálního kapsidového proteinu,

4« 4444 • 4 • 4

4444 • · 4 • · 4

4 4

4 ·· 4 protein III (plil) se ukázal jako nutný pro virovou infekci, v jeho části nejbližší N-konci maturního proteinu jsou přípustné změny, jako například inzerce. V oboru jsou známy různé peptidové knihovny, ve kterých jsou jako fúzní proteiny plil exprimovány různé peptidy; těchto knihoven může být také použito pro identifikaci abtidů. Příklady takových knihoven se popisují níže.

Scott a Smith, 1990, Science 249: 386 - 390 popisují konstrukci a expresi „epitopové knihovny“ hexapeptidů na povrchu M13. Knihovna byla vytvořena vložením oligonukleotidu o délce 33 párů io bází štěpeným Bgl I do fága fd-tet, štěpeného Sfi I, tj. fUSE5 RF. Fragment o délce 33 párů bází obsahuje náhodnou nebo „degenerovanou“ kódující sekvenci (NNK)₆, kde N představuje G, A, T nebo C a K představuje G nebo T. Autoři uvádějí, že knihovna sestává z 2 χ 10⁸ rekombinantů, exprimujících 4 χ 10⁷ různých hexapeptidů; teoreticky tato knihovna exprimovala 69 % z 6,4 χ 10⁷možných peptidů (20⁶). Cwirla a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6378 - 6382 popisují také částečně podobnou knihovnu hexapeptidů, exprimovaných jako genové fúze p lil fága M13 fd. Zveřejnění PCT WO 91/19818 z 26. 12. 1991 (Dower a Cwirla)

2o popisuje podobnou knihovnu pentamerních až oktamerních náhodných sekvencí aminokyselin.

Devlin a další, 1990, Science, 249: 404 - 406 popisuje peptidovou knihovnu s přibližně 15 zbytky, vytvořenou s použitím kódovacího schématu (NNS) pro syntézu oligonukleotidů, v němž S znamená G nebo C.

Christian se spolupracovníky popsali fágovou knihovnu, exprimující dekapeptidy (Christian a další, 1992, J. Mol. Biol. 227: 711 - 718). Výchozí DNA byla vytvořena pomocí oligonukleotidu obsahujícího degenerované kodony [NN (G/T)]₁₀ se

3o samokomplementárním 3’ koncem. Tato sekvence ve tvaru jehlice vytváří samostatné (self-priming) replikační místo, které může být ·· ···· ·« · • · • · · ♦ * · · ··· ···· ··· e

- 15 použito T 4 DNA polymerázou pro vytvoření komplementárního řetězce. Dvojřetězcová DNA byla štěpena v místech Sfi I na 5’ konci a jehlici pro klonování do vektoru fUSE5, popsaného výše (Scott a Smith).

Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149 - 157 popisuje vytváření knihovny obtížným způsobem, který zahrnuje navázání oligonukleotidů o délce 17 nebo 23 degenerovaných bází s palindromickou sekvencí o délce 8 nukleotidů na jejich 3’ koncích. To vedlo k expresi náhodných hexa- nebo oktapeptidů jako fúzních io proteinů s β-galaktosidázovým proteinem v bakteriálním expresním vektoru. DNA pak byla přeměněna na dvojřetězcovou formu Klenowovou DNA polymerázou, tupými konci ligována do vektoru a potom vyštěpena jako fragmenty Hind III. Fragmenty pak byly klonovány do expresního vektoru na C-konci β-galaktosidázy za vytvoření 10⁷ rekombinantů.

Další biologické knihovny peptidů, které je možno použít, zahrnují knihovny popsané v US patentu No. 5,270,170 z 14. 12. 1993 a zveřejnění PCT No. WO 91/19818 z 26. 12. 1991. Vhodné jsou také knihovny popsané v US patentu No. 5,096,815, US patentu No.

2o 5,198,346 a US patentu No. 5,223,409, všechny Ladner a další.

Výše popsané biologické peptidové knihovny mají sloužit jako ilustrace a nemají být omezující. Odborníku v oboru bude jasné, že pro použití při provedení předkládaného vynálezu je možno použít mnoho dalších biologických peptídových knihoven, popisovaných v různých publikacích.

Protein pVIII je hlavním kapsidovým proteinem viru M13, který může také sloužit jako místo pro expresi peptidů na povrchu virových částic M13 při konstrukci náhodných peptídových knihoven.

Ačkoli odborníku v oboru je známo, že vazebnou doménu může 3o tvořit i jen 5 aminokyselin, průměrná funkční doména přítomná

* ··
	• ·	··
• ·
• · «
• ·
·· ····	·· «	··

·· · ·· ·· ····

- 16 v přirozeném proteinu má podle předpokladů délku přibližně 40 aminokyselin. Knihovny náhodných peptidů, ze kterých se s výhodou identifikují abtidy podle předkládaného vynálezu, tedy kódují peptidy o délce v rozmezí 5 až 200 různých aminokyselin. Ačkoliv se rozumí, že pro identifikaci abtidů podle vynálezu lze použít biologicky exprimované knihovny náhodných peptidů obsahující krátké náhodné inzerty (tj. o délce méně než 20 aminokyselin), nejvýhodnější biologicky exprimované knihovny náhodných peptidů pro použití v předkládaném vynálezu jsou takové, které obsahují peptidy s 20 nebo více náhodnými aminokyselinami, tj. s výhodou v rozmezí 20 až 100 a nejvýhodněji 20 až 50 aminokyselin, jejichž příklady jsou popsány jako knihovny TSAR v zveřejněných PCT WO 91/12328 z 22.

8. 1991 a PCT WO 94/18318 z 18. 8. 1994.

Pro identifikaci abtidů, zvláště ve druhém kroku screeningu, se ve vynálezu s výhodou používají knihovny o větší komplexnosti, než se běžně používají v oboru. Běžné knihovny náhodných peptidů známé v oboru používají vložených oligonukleotidů, jejichž délka by měla být krátká, kódující s výhodou méně než 15 a ještě výhodněji přibližně 6 až 8 aminokyselin. Knihovny peptidů o délce větší než přibližně 20 aminokyselin však mohou být nejen konstruovány, ale i úspěšně testovány pro identifikaci peptidů s vazebnou specificitou pro celou řadu ligandů. Takové knihovny s inzerty větších délek se uvádějí jako příklady v knihovnách TSAR ve zveřejněných PCT WO 91/12328 z 22. 8. 1991 a PCT WO 94/18318 z 18. 8. 1994.

Tyto zveřejněné PCT přihlášky ukazují, že použití knihoven složených z oligonukleotidů větších délek má mnoho výhod.

Knihovny složené z oligonukleotidů větších délek umožňují identifikovat peptidy, ve kterých je sekvence aminokyselin společná nebo sdílená větším počtem peptidů, které se váží na daný ligand, tj. položky knihovny sdílejí své vazebné motivy. Použití knihoven o větší délce také umožňuje identifikovat peptidy, které nesdílejí žádné ·

999 ··· 9999

- 17sekvence s jinými peptidy, ale které nicméně vykazují stejnou vazebnou specifitu pro stejný ligand.

Když se provádí screening způsobem podle předkládaného vynálezu, knihovny s delšími vloženými sekvencemi oligonukleotidů umožňují identifikovat nebo mapovat vazebná místa, která zahrnují nejen několik sousedících aminokyselinových zbytků, tj. jednoduchá vazebná místa, ale také vazebná místa, která zahrnují nespojitou řadu aminokyselin, tj. komplexní vazebná místa, a mohou poskytnout komplexní vazebné charakteristiky protilátek a molekul podobných io receptorům.

Navíc větší velikost vložených syntetizovaných oligonukleotidů určitých knihoven poskytuje příležitost pro vytvoření sekundární a/nebo terciární struktury u potenciálních vazebných peptidú a u sekvencí, obklopujících skutečné vazebné místo ve vazebné is doméně. Sekundární a terciární struktura často významně ovlivní schopnost sekvence zprostředkovat vazbu, stejně jako sílu a specificitu jakékoliv vytvořené vazby. Takové komplexní účinky struktury nejsou možné, pokud se v knihovnách používají pouze oligonukleotidy s malou délkou. Sekundární a terciární struktura může být také zvláště důležitá při identifikaci abtidů, protože abtidy napodobují vazbu větších molekul, jako jsou protilátky. Je dobře známo, že schopnost antigenu vázat protilátky ve většině případů závisí na několika rozdílných oblastech těžkého řetězce (oblastí určujících komplementaritu), stejně jako na oblastech, kterými přispívá lehký řetězec.

Předpokládá se proto, že nejvýhodnější vazebné domény pro identifikaci abtidů podle předkládaného vynálezu budou domény z biologicky exprimovaných knihoven náhodných peptidú, ve kterých má exprimovaný peptid délku 20 aminokyselin nebo více. Příklady

3o takových knihoven náhodných peptidú jsou knihovny TSAR, ·· ···· ·· · · ·· · • · · • · · · • · · ··· ···· ··· φ

- 18 popisované v publikovaných PCT přihláškách WO 91/12328 z 22. 8. 1991 a PCT WO 94/18318 z 18. 8. 1994.

V jednom provedení je knihovnou používanou v předkládaném vynálezu lineární, neomezená knihovna. Odborník v oboru bude rozumět, že v předkládaném vynálezu by mohly být ve způsobech pro identifikaci abtidů také použity „omezené“ (constrained), „strukturované“ nebo „semirigidní“ knihovny náhodných peptidů. Typicky exprimují tyto knihovny peptidy, které jsou v podstatě náhodné, ale obsahují malé procento pevných zbytků uvnitř io náhodných sekvencí nebo kolem nich, což má za následek propůjčení struktury s určitým stupněm konformační rigidity peptidů. U semirigidní peptidové knihovny exprimuje větší množství syntetických oligonukleotidů peptidy, které jsou všechny schopné nabýt pouze jednu nebo malý počet rozdílných konformaci, které jsou omezeny umístěním kodonů kódujících aminokyseliny s určitou strukturou uvnitř nebo obklopující syntetizovanou variantu náhodných oligonukleotidů. Narozdíl od lineárních, neomezených knihoven, ve kterých velké množství exprimovaných proteinů potenciálně nabývá tisíců různých konformaci s krátkou dobou života, v semirigidní peptidové knihovně může nabýt množství exprimovaných proteinů pouze jedinou nebo malé množství konformaci. Příklady takových knihoven jsou knihovny TSAR-13 a TSAR-14, popisované v publikovaných PCT přihláškách WO 94/18318 z 18. 8. 1994; knihovny náhodných sekvencí 6 aminokyselin, kde každá sekvence je obklopena neměnnými cysteinovými zbytky (O’Neil a další, 1992, Proteins 14: 509 - 515) a knihovny popisované ve zveřejněné PCT přihlášce WO 94/11496 z 26. 5. 1994 (Huse).

Ve výhodném provedení se pro identifikaci abtidů provádí screening biologické peptidové knihovny, která je knihovnou náhodných peptidů „TSAR“. TSAR je akronym pro „Totally Synthetic Affinity Reagents“ (zcela syntetické afinitní reagencie), jak se popisují

- 19 ve zveřejněné PCT přihlášce WO 91/12328 z 22. 8. 1991 a zveřejněné PCT přihlášce WO 94/18318 z 18. 8. 1994. V těchto zveřejněných PCT přihláškách se také detailně popisují knihovny TSAR, jejich konstrukce a použití i specifické příklady knihoven TSAR. Pro identifikaci abtidů podle předkládaného vynálezu mohou být použity nukleové kyseliny kódující TSAR nebo jejich část, které zprostředkují vazbu na ligand, použitý pro screening.

TSAR může být heterofunkční fúzní protein, kde uvedený fúzní protein obsahuje (a) vazebnou doménu kódovanou oligonukleotidem io obsahujícím náhodné nukleotidy, ve kterém jsou tyto náhodné nukleotidy uspořádány do jedné nebo více sousedících sekvencí, přičemž celkový počet náhodných nukleotidů je větší nebo roven přibližně 60 a menší nebo roven přibližně 600 a (b) efektorovou doménu, kódovanou oligonukleotidovou sekvencí, kterou je protein nebo peptid zvyšující expresi nebo detekci vazebné domény.

Alternativně může být TSAR heterofunkční fúzní protein jak je popsán výše, ale ve kterém jsou sousedící sekvence obklopeny neměnnými zbytky navrženými tak, aby kódovaly aminokyseliny propůjčující vazebné doméně exprimovaného heterofunkčního fúzního proteinu požadovanou strukturu.

Navíc ke knihovnám TSAR je možno použít v předkládaném vynálezu jiné knihovny, jako knihovny rekombinantních vektorů, exprimujících množství heterofunkčních fúzních proteinů, přičemž uvedené fúzní proteiny obsahují vazebnou doménu, kódovanou oligonukleotidem obsahujícím náhodné nukleotidy, ve kterém jsou náhodné nukleotidy uspořádány do jedné nebo více následných sekvencí, přičemž celkový počet náhodných nukleotidů je větší nebo roven přibližně 15 a menší nebo roven přibližně 600.

• ·· · ·· · · ·· • · · • · · · • · · ··· «··· ··· ·· ····

- 20 5.2. Abtidv

Abtid je typicky peptid, který co se týče vazebné specificity a po případě i dalších vlastností (například vazebná afinita, sekvence apod.) napodobuje velkou molekulu, jako je protilátka nebo receptor.

Abtid je však obecně mnohem menší než protilátka nebo receptor. Abtid je obecně peptid o délce přibližně 5 až 200 aminokyselin. S výhodou je abtidem peptid o délce přibližně 10 až 100 aminokyselin. Navíc k sekvencím aminokyselin, odpovědným za specifické vazebné vlastnosti abtidů, může být abtid připojen na další sekvence io aminokyselin nebo další neaminokyselinové sekvence. Takové dodatečné sekvence mohou napomáhat při identifikaci nebo izolaci abtidů. Mohou být také užitečné při biologické distribuci, zvýšení stability nebo diagnostické nebo terapeutické účinnosti abtidů v případě diagnostického nebo terapeutického použití abtidů.

Abtidy mohou být také připojeny k řadě nepeptidových skupin.

Takové skupiny mohou zahrnovat toxiny, léčiva, polysacharidy, nukleotidy, oligonukleotidy, markéry jako jsou radioaktivní látky, (například ¹¹¹ln, ¹²⁵l, ¹³¹l, ^99mTc, ²¹²B, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Rh), biotin, fluorescenční látky, zobrazující reagencie (například popisované v US patentu No.

4,741,900 a US patentu No. 5,326,856), uhlovodíkové propojovací řetězce (například alkylová skupina nebo její derivát) spojené se skupinou umožňující připojení na pevný substrát nebo se skupinou umožňující snadnou separaci (například hapten rozpoznávaný protilátkou navázanou na magnetickém nosiči) apod. Spojení peptidů s nepeptidovou skupinou může být provedeno některou z četných v oboru dobře známých metod.

Navíc mohou být v provedení, ve kterém má abtid volný amino nebo karboxylový konec tyto konce modifikovány známými metodami, například pro dosažení větší rezistence vůči degradaci, větší prostupnosti buněčnou membránou, větší rozpustnosti a podobně, například pomocí acetylace, biotinylace, acylace dlouhým ·· *··· • · * ^w · ····.·. ... ,J. ,,· J

-21 uhlovodíkovým řetězcem apod. na amino konci, pomocí amidace na karboxylovém konci, nebo může být abtid stabilizován zavedením D aminokyselin, v přírodě se nevyskytujících aminokyselin nebo glykosylovaných aminokyselin apod.

Abtidy podle vynálezu se s výhodou připravují v oboru známými metodami chemické syntézy, například jak se popisuje pomocí příkladů v části 5.6 a dále.

Alternativně mohou být abtidy nebo jejich části získány rekombinantní expresí nukleové kyseliny, kódující požadovaný abtid, ve vhodném hostiteli v oboru známými způsoby.

Příležitostně se může stát, že pro vazebnou funkci abtidů nejsou nutné všechny aminokyseliny v identifikovaném peptidů. Kde je žádoucí zmenšit velikost abtidů, je možno použít metod pro identifikaci částí určité syntetické aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence, které popřípadě ovlivňují vazbu nebo kódují sekvence, které ovlivňují vazbu, jak se popisuje v části 5.4 níže.

Ve specifickém provedení je abtidem molekula obsahující peptid o délce 17 až 50 aminokyselin, který se váže na buňky karcinomu prostaty, přičemž peptid obsahuje sekvenci WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6) a sekvenci LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7).

V dalším specifickém provedení je abtid molekula obsahující peptid o délce 19 až 50 aminokyselin, který se váže na buňky karcinomu prostaty, přičemž peptid obsahuje sekvenci aminokyselin představovanou vzorcem:

RiXR₂ kde:

Ri = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);

R₂ = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7);

X = sekvence jakýchkoliv 2 až 33 aminokyselin.

·· ···· • · ě . *·· · ······· ... ».· ·

-22V dalším specifickém provedení je abtid molekula obsahující peptid o délce 19 až 50 aminokyselin, který se váže na buňky karcinomu prostaty, přičemž peptid obsahuje sekvenci aminokyselin představovanou vzorcem:

R1XR2 kde:

R1 = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6), YNAYVPGFT (SEQ ID NO: 89), WFMSPYT (SEQ ID NO: 90), FPGVSTPY (SEQ ID NO: 91), WGISYPF (SEQ ID NO: 92) nebo FPS;

R₂ = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7), LVSNESG (SEQ ID NO: 93), LSRNLDFG (SEQ ID NO: 94), LSGNYNIFG (SEQ ID NO: 95), TNIRNDIL (SEQ ID NO: 96) nebo GSDPRL (SEQ ID NO: 97);

X = sekvence alespoň 2 aminokyselin.

R1XR2 kde:

R1 = sekvence 9 aminokyselin s homologií alespoň 50 % se sekvencí WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);

R₂ = sekvence 8 aminokyselin s homologií alespoň 50 % se sekvencí LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7);

X = sekvence jakýchkoliv 2 až 33 aminokyselin.

Pro účely výše popsaného specifického provedení znamená homologie mezi zbytky aminokyselin to, že aminokyselina je vzhledem ke druhé aminokyselině identická nebo je konzervativně • · · · · · • · · · 444444

4 4 · · ·

44····· ··· ··· ·· ·

-23 substituována. Konzervativní substituce jsou takové substituce, kdy je aminokyselina nahrazena jinou aminokyselinou stejné třídy. Například třída nepolárních (hydrofobních) aminokyselin zahrnuje alanin, Ieucin, izoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bázické) aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. Negativně nabyté (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu aspargovou a glutamovou.

ío 5.3. Screening peptidových knihoven pro izolaci abtidů

Postup identifikace abtidů z peptidové knihovny zahrnuje dva rozdílné kroky screeningu. První krok je navržen tak, aby identifikoval epitopy nebo ligandy s vazebnou specificitou pro větší molekulu, o kterou se zajímáme, například napodobující antigen, receptor 15 ligand apod. V tomto prvním kroku se provádí screening knihovny ligandem, který obsahuje specifické, často komplexní vazebné místo, o které se zajímáme. Ty peptidy v knihovně, které jsou specifickými vazebnými partnery ligandu se na ligand naváží a díky této specifické vazbě se dají snadno izolovat. Příkladem ligandu vhodného pro použití v tomto prvním kroku screeningu může být protilátka, která inherentně obsahuje vazebné místo pro antigen nebo její derivát, který se váže na antigen. Dalším příkladem může být receptor, například receptor epidermálního růstového faktoru nebo růstového faktoru odvozeného z destiček. Tyto receptory mají specifická vazebná místa pro epidermální růstový faktor a popřípadě růstový faktor odvozený z destiček. V oboru jsou známy další receptory, které mohou být také potenciálními ligandy, například estrogenový receptor, různé acetylcholinové receptory, receptor lidského růstového hormonu apod.

Molekuly obsahující ty peptidové sekvence knihoven, které byly identifikovány prvním krokem screeningu, zde budou označovány jako epitopy nebo mimetopy. Například v případě, když prvním • · · · · ·

-24 ligandem je protilátka, budou peptidy knihovny, identifikované jako specifické vazebné protějšky protilátky, označované epitopy nebo mimetopy antigenu.

Peptidy izolované v prvním kroku screeningu jsou potom s výhodou analyzovány například DNA sekvenováním vazebných domén fága kódujícího tyto peptidy, pokud použitou knihovnou byla knihovna fágová. Sekvence DNA vazebné domény kóduje sekvenci aminokyselin epitopového nebo mimetopového peptidů. Díky známému vztahu mezi sekvencemi DNA a jimi kódovanými sekvencemi aminokyselin dovolí získání sekvence DNA epitopů nebo mimetopu určení sekvence aminokyselin epitopů nebo mimetopu. Pokud je použitá knihovna knihovnou chemickou, může být v oboru dobře známými způsoby provedeno také přímé sekvenování aminokyselin epitopového nebo mimetopového peptidů.

Ve zvláštním provedení mohou být sekvence různých peptidových mimetopů, identifikované v prvním kroku screeningu, porovnány pro určení shodné mimetopové sekvence.

Jakmile je známa sekvence epitopů nebo mimetopu (nebo jejich části, která zprostředkuje vazbu), vyrobí se molekula, s výhodou peptid, která obsahuje sekvenci aminokyselin zprostředkující vazbu. Tento peptid může být syntetizován chemicky nebo může být alternativně vyroben způsoby s použitím rekombinantní DNA. Tento peptid může obsahovat pouze aminokyseliny epitopů nebo mimetopu, nebo může s výhodou obsahovat další aminokyseliny nebo neaminokyselinové skupiny pro usnadnění identifikace nebo izolace epitopového nebo mimetopového peptidů a jakékoliv nové látky schopné vázat se na peptid, nalezené v následujícím kroku screeningu diskutovaném níže.

Ve druhém kroku screeningu se použije epitop nebo mimetop, který byl identifikován v prvním kroku screeningu, jako ligand pro druhý krok screeningu. Druhý krok screeningu identifikuje peptidy ·· ··»·

-25 s vazebnou specificitou pro epitop nebo mimetop, které překvapivě napodobují vazebnou specifitu protilátky nebo receptorů, které byly použity jako ligand v prvním kroku screeningu. Jinými slovy, ve druhém kroku se získají peptidy s vazebnou aktivitou podobnou protilátce nebo receptorů vůči antigenům nebo receptorovým ligandům, které jsou známé jako abtidy.

Obrázek 1 schematicky znázorňuje příklad dvoustupňového screeningu, používaného pro identifikaci abtidů.

Při konkrétním provedení vynálezu může nastat případ, že io epitop, ke kterému se protilátka specificky váže, je znám. Například monoklonální protilátka SM-3, která specificky váže polymorfní epiteliální mucin (PEM), který se nalézá na buňkách lidského karcinomu prsu, se ukázala jako specifická pro epitop, definovaný sekvencí aminokyselin VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (SEQ

ID NO: 9) (Burchell a další, 1989, Int. J. Cancer 44: 691 - 696). V takovém případě může být první krok screeningu popisovaný výše prováděn s ní. Peptid, obsahující sekvenci epitopu, pro kterou je protilátka specifická, může být syntetizován a použit ve druhém kroku screeningu popsaném výše, aby bylo možno identifikovat abtidy

2o protilátky.

Může také nastat případ, že je známa část „receptorového ligandů“ (tj. ligandů, který se specificky váže na receptor), ke kterému se receptor specificky váže. Bylo například ukázáno, že faktor stimulující granulocytové/makrofágové kolonie (granulocyte/ macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) se váže na receptor pro GM-CSF aminokyselinami 88 až 121 (HCPPTPETSCATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDC (SEQ ID NO: 22)) faktoru GM-CSF. Mělo by být možné syntetizovat peptid, který odpovídá části receptorů - ligandů, která se ukázala jako odpovědná

3o za specifickou vazbu na receptor, a použít takový peptid ve druhém • · · · 4 444444

444 4 44 44 4 4 4

4 4 4 4 4 4

44 4 444444

4 4 4 4 4

444 4444 444 444 4· 4

-26 kroku screeningu způsobu podle předkládaného vynálezu, aby bylo umožněno identifikovat abtid receptoru.

Ve významu podle předkládaného vynálezu je ligandem látka, pro kterou je třeba izolovat specifického vazebného partnera z peptidové knihovny. Ligand může fungovat jako zámek, tj. velký polypeptid nebo protein analogický k zámku, do kterého menší specifický vazebný protějšek zapadá jako klíč; nebo jako klíč, který zapadá do a specificky se váže na větší vazebný protějšek nebo zámek.

V tomto vynálezu je epitop nebo mimetop typicky peptid, který vystupuje ve funkci klíče; je identifikován screeningem peptidové knihovny zaměřeným na nalezení peptidů, které zapadnou do a navážou se na specifické vazebné místo větší molekuly, která vystupuje jako zámek, například protilátky nebo receptoru. Jestliže je větší molekulou protilátka a identifikovaný peptid obsahuje část sekvence aminokyselin přirozeného antigenu, odpovědného za specifickou vazbu antigenu na protilátku, pak se tento identifikovaný peptid označuje jako epitop; jestliže identifikovaný peptid sekvenci přirozeného antigenu neobsahuje, pak se označuje jako mimetop.

Ve zvláštním provedení se mimetop identifikuje screeningem peptidové knihovny protilátkou nebo fragmentem protilátky. Takto identifikované mimetopy funkčně napodobují antigen, ke kterému se váže protilátka tak, že se mimetop také specificky váže na protilátku. V některých případech, pokud je antigenem protein nebo polypeptid, mohou mimetopy sdílet s antigenem motivy aminokyselinové sekvence. V dalším provedení se mimetop identifikuje screeningem peptidové knihovny pomocí receptoru nebo fragmentu receptoru. Takto identifikované mimetopy funkčně napodobují přirozený ligand nebo receptor.

Peptidové knihovny používané v prvním a druhém kroku screeningu mohou být stejné nebo různé. V jednom provedení se • · · · · · • · · Β · · Β * Β · Β • · Β Β · · · • · · Β ······ • · · Β Β Β . 27 - ................

v prvním kroku screeningu používá peptidová knihovna, obsahující malé náhodné inzerty (od přibližně 6 do přibližně 15 aminokyselin).

Ve druhém kroku screeningu může být žádoucí použít knihovny větších peptidů. Takové větší knihovny s výhodou exprimují peptidy s přibližně 20 až 200 náhodnými aminokyselinami. Příklady takových větších knihoven jsou knihovny TSAR, popsané ve zveřejněných patentových přihláškách WO 91/12328 z 22. 8. 1991 a WO 94/18318 z 18. 8. 1994.

V prvním nebo druhém kroku screeningu je možno použít io biologických nebo chemicky syntetizovaných peptidových knihoven. Peptidové knihovny používané v předkládaném vynálezu mohou mít množství zbytků, které jsou náhodné, například zbytků, u kterých nelze předem předpovědět aminokyselinu, která se v uvedeném zbytku vyskytne. Takové knihovny se nazývají knihovny náhodných peptidů (random peptide libraries).

Výhodný způsob pro identifikaci abtidů zahrnuje screening knihovny rekombinantních vektorů, která exprimuje větší počet heterofunkčních fúzních proteinů, přičemž uvedené fůzní proteiny obsahují (a) vazebnou doménu kódovanou oligonukleotidem obsahující náhodné nukleotidy, ve které jsou náhodné nukleotidy uspořádány v jedné nebo více po sobě následujících sekvencích, přičemž celkový počet náhodných nukleotidů je větší nebo roven přibližně 15 a menší nebo roven přibližně 600 a (b) efektorovou doménu, kódovanou oligonukleotidovou sekvencí, kde uvedená doména je protein nebo peptid, který zvyšuje expresi nebo detekci na vazebné domény. Screening se provádí uvedením většího počtu heterofunkčních fúzních proteinů do styku s ligandem za podmínek vedoucích k vazbě ligandu a následující izolací fúzních proteinů, které se vážou na ligand. Způsoby podle vynálezu dále s výhodou zahrnují určení sekvence nukleotidů, která kóduje vazebnou doménu heterofunkčního fúzního proteinu, který byl identifikován, aby bylo

-28 možno určit sekvenci DNA, která kóduje vazebnou doménu a současně odvodit sekvenci aminokyselin mimetopu, použitého ve druhém kroku screeningu. Analýza nukleotidové sekvence může být provedena v oboru známou metodou, včetně ale ne výlučně metodou podle Maxama a Gilberta (1980, Meth. Enzymol. 65: 499 - 560), Sangerovou dideoxy metodou (Sanger a další, 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463), použitím T7 DNA polymerázy (Tábor a Richardson, US patent No. 4,795,699; Sequenase™, US Biochemical Corp.), nebo Taq polymerázy nebo použitím automatického io sekvenátoru DNA (například Applied Biosystems, Foster City, CA).

Alternativně mají knihovny používané pro screening mimetopů a abtidů podle vynálezu náhodné nukleotidy uspořádány v jedné nebo více za sebou následujících sekvencích, které jsou obklopeny neměnnými zbytky, navrženými tak, aby kódovaly kyseliny propůjčující vazebné doméně exprimovaného heterofunkčního fúzního proteinu požadovanou strukturu.

Jakmile byla vytvořena (nebo jinak získána) vhodná peptidová knihovna, provádí se její screening pro identifikaci peptidú s vazebnou afinitou pro zvolený ligand. Screening knihoven je možno uskutečnit některou z řady v oboru známých metod. Touto problematikou se například zabývají následující prameny: Parmlay a Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215 - 218; Scott a Smith, 1990, Science 249: 386 - 390; Fowlkes a další, 1992, BioTechniques 13: 422 - 427; Oldenburg a další, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5393 - 5397; Yu a další,

1994, Cell 76: 933 - 945; Staudt a další, 1988, Science 241: 577 580; Bock a další, 1992, Nátuře 355: 564 - 566; Tuerk a další, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6988 - 6992; Elington a další, 1992, Nátuře 355: 850 - 852; US patent No. 5,096,815, US patent No. 5,223,409 a US patent No. 5,198,346, všechny Ladner a další;

a Rebar a Pabo, 1993, Science 263: 671 - 673. Viz též PCT zveřejnění WO 94/18318 z 18. 8. 1994.

• · • · · ·

Jestliže se knihovny exprimují jako fúzní proteiny s molekulou buněčného povrchu, screening se výhodně provádí přivedením vektoru do styku s imobiiizovaným cílovým ligandem a oddělením vektorů, které se na uvedený ligand navážou. Tyto způsoby screeningu, označované jako techniky „panning“ se popisují v Fowlkes a další, 1992, BioTechniques 13: 422 - 427. U metod „panning“ používaných pro screening knihoven může být cílový ligand imobilizován na destičkách, nosičích, jako jsou magnetické nosiče, sepharóza apod. nebo na nosičích v kolonách. Ve zvláštních io provedeních může být imobilizovaný cílový ligand označen „tagged“, například použitím biotinu nebo 2-fluorochromu například pro třídění

FACS.

V jednom z provedení, které je uváděno jako neomezující příklad, se provádí screening knihovny fágových expresních náhodných peptidů na fágové nebo fágmidové vektory s použitím magnetických nosičů, jak se popisuje v publikované PCT přihlášce WO 94/18318 z 18. 8. 1994.

Alternativně je v dalším neomezujícím příkladu ukázán screening knihovny fágových expresních náhodných peptidů technikou

2o „panning“ s použitím mikrotitračních destiček. Ve výhodném způsobu pro zpětné získání fága navázaného k jamkám mikrotitračních destiček se používá změny pH.

V dalším příkladu se provádí screening knihoven, exprimujících náhodné peptidy jako povrchový protein buď vektoru nebo hostitelské buňky, například fága nebo bakteriální buňky, protlačováním roztoku knihovny kolonou s ligandem, imobiiizovaným na pevném nosiči, jako je sepharóza, oxid křemičitý a podobně a zpětným získáním fága, který se na kolonu navázal, po předchozím důkladném promytí a eluci.

V ještě dalším příkladu je možno ty proteiny knihovny, které se slabě vážou izolovány pomocí jejich zpoždění při chromatografií.

Podle jednoho způsobu tohoto provedení screeningu se jímají frakce ·· ··»·

- 30 tak jak vycházejí z kolony, a uchovávají se frakce, které se opožďují (trailing fractions) (tj. uchovávají se látky, které mají sníženou pohyblivost vzhledem ke hlavní (peak) frakci). Tyto látky se pak koncentrují a nechávají projít kolonou podruhé, přičemž se znovu uchovají opožděné frakce. Následnými chromatografickými cykly je možné izolovat látky, které mají určitou afinitu, i když pouze slabou, k imobilizovanému ligandů. Látky z knihoven se zpomalují ve svém pohybu z důvodů miliónů možných interakcí s ligandem při průchodu kolonou. Tímto způsobem se dosáhne výběru těch látek, které mají velmi slabou afinitu k cílové látce a které mají také rychlé disociační doby.

V případě potřeby je možno tímto způsobem vybrané oligonukleotidy, kódující vazebnou doménu, mutagenizovat, exprimovat a rechromatografovat (nebo provádět screening jiným is způsobem) pro nalezení zlepšené vazebné aktivity. Saturační mutagenezi je možno provádět zvláště s použitím syntetických oligonukleotidů, syntetizovaných z „dopovaných“ rezervoárů nukleotidů. Dopování se provádí tak, že se původní peptidová sekvence vyskytne pouze jednou v 10⁶ jednotlivých klonů

2o mutagenizovaného oligonukleotidu. Uspořádané oligonukleotidy se klonují do rodičovského vektoru TSAR. S výhodou je tímto vektorem m663 (Fowlkes a další, 1992, BioTechniques 13: 422 - 427). m663 je schopen vytvořit při růstu v E. coli kmen JM101 nebo DH5ctF’ modré plaky. Výhodnější je knihovna větší než 10⁶; avšak i knihovna s velikostí 10⁵ je dostatečná pro izolaci fága TSAR s peptidovými doménami se zvýšenou selektivitou pro vazbu k cílovému ligandů.

Podle dalšího alternativního způsobu je možno provádět screening knihovny způsobem obsahujícím krok obohacení a krok přesunu filtru (filter lift step) jak je uvedeno dále.

3o Náhodné peptidy z exprimované knihovny schopné vazby k danému ligandů („pozitivní“) jsou na počátku obohaceny v jednom ·· · ·» ·

- 31 ·· · · · • · · · • ‘9 · · · « • · · • · · · · · « nebo dvou cyklech metody panning nebo afinitní chromatografií jak je popsáno výše. Cílem je obohatit pozitivní peptidy až na frekvenci přibližně > 1/10⁵. Po obohacení se provádí test přesunem filtru. Například přibližně 1 - 2 x 10^s fágů, obohacených o vázající se látky, se přidá k 500 μΙ E. coli rostoucí v logaritmické fázi a vyseje se na velkou plotnu LB-agarózy s koncentrací agarózy 0,5 %. Agaróza se ponechá ztuhnout a na její povrch se položí nitrocelulózový filtr (například 0,45 pm). Sterilní jehlou se vytvoří řada značek, aby bylo možno filtr a plotnu znovu přesně uspořádat po dále popsaném ío vyvíjení. Plaky fága se ponechají vyvinout při inkubaci při 37 °C přes noc (přítomnost filtru tento proces neinhibuje). Filtr se pak z plotny odstraní spolu s fágem z každého jednotlivého plaku, který přilnul in šitu. Filtr je pak vystaven působení roztoku BSA nebo jiného prostředku pro blokování po dobu jedné až dvou hodin, aby se is zabránilo nespecifické vazbě ligandu (nebo „sondy“).

Samotná sonda je označena například biotinylací (s použitím komerčního NHS-biotinu) nebo přímým značením enzymu, například křenovou peroxidázou (HRP) nebo alkalickou fosfatázou. Sondy označené tímto způsobem jsou neomezeně stabilní a mohou být několikrát znovu použity. Blokovaný filtr se vystaví působení roztoku sondy po dobu několika hodin, aby byla umožněna vazba sondy in šitu na jakéhokoliv fága na filtru, který obsahuje peptid s významnou afinitou vůči sondě. Filtr se potom omyje pro odstranění nenavázané sondy a potom vyvine expozicí roztoku substrátu enzymu (v případě přímo značené sondy) nebo dále vystaví roztoku enzymaticky značeného avidinu (v případě biotinylované sondy). Ve výhodném způsobu se sonda značená HRP detekuje metodami ECL westernového blotování (Amersham, Arlington Heights, IL), které zahrnují použití luminolu v přítomnosti fenolu pro dosažení zvýšené chemiluminiscence detekovatelné krátkou expozicí filmu autoradiografií, při které exponované oblasti filmu odpovídají pozitivním plakům na původní plotně. Pokud se použije enzymového • Φ • Φ

• φ φ

•· ··»· substrátu, pozitivní fágové plaky se identifikují místním ukládáním zbarveného produktu enzymatického štěpení na filtru, které odpovídá plakům na originální plotně. Vyvolaný filtr nebo film se jednoduše správně zorientuje s plotnou pomocí značek a „pozitivní“ plaky se z agarózy vyříznou, a tím se fág izoluje. Pro vysokou hustotu plaků na původní plotně je obvykle nemožné izolovat jednotlivý plak z plotny na první pokus. Fágy získané z původního výřezu se proto znovu vysejí s nízkou hustotou a způsob se opakuje, aby se dosáhlo izolace jednotlivých plaků a tím jednotlivých klonů fága.

Úspěšné experimenty screeningu se provádějí optimálně s použitím tří cyklů postupného screeningu. Získané buňky jsou potom vysety s nízkou hustotou, aby se získaly izolované kolonie pro jejich individuální analýzu. Jednotlivé kolonie se vyberou a použijí pro inokulaci kultivačního média LB s obsahem ampicilinu. Po kultivaci přes noc při 37 °C se kultury zcentrifugují. Jednotlivé alikvoty buněk jsou potom znovu testovány na vazbu k cílovému ligandu, připojenému k nosiči. Jako negativní kontrola může být použita vazba k jinému nosiči, který má na povrchu připojen odlišný ligand.

Důležitým aspektem screeningu knihoven je eluce. Aby bylo

2o vysvětlení jasné, v následujícím textu se diskutuje exprese TSAR fágem; lze však snadno pochopit, že taková diskuse může být použita na jakýkoliv systém, ve kterém se exprimuje na povrchové fúzní molekule náhodný peptid. Je jasné, že podmínky přerušující interakce peptid - cíl v průběhu zpětného získávání fága jsou pro každou danou peptidovou sekvenci z množství na fágu exprimovaných proteinů specifické. Tak mohou být například určité interakce přerušeny kyselými hodnotami pH a ne zásaditým pH a naopak. Pro určení vhodných elučních podmínek pro každou kombinaci ligand/TSAR může být tedy žádoucí testovat řadu různých elučních podmínek (včetně ale bez omezení pH 2 až 3, pH 12 až 13, přebytek cílové látky za podmínek soutěže, detergenty, mírná denaturační činidla proteinů, ·· ·4·· močovina, různá teplota, světlo, přítomnost nebo nepřítomnost kovových iontů, chelatačních činidel apod.) a porovnat primární struktury proteinů TSAR exprimovaných na fágu získaných při dané kombinaci podmínek. Některé z těchto podmínek eluce mohou být nekompatibilní s fágovou infekcí pro svůj baktericidní účinek a proto je nutno jejich odstranění dialýzou (např. dialyzační sáček mikrokoncentrátory Centricon/Amicon).

Schopnost různých exprimovaných proteinů eluce za rozdílných podmínek může být způsobena nejen denaturací specifické peptidové oblasti, která se účastní vazby na cíl, ale také konformačními změnami v obklopujících oblastech. Tyto okolní sekvence mohou být také denaturovány v kombinaci se skutečnou vazebnou sekvencí; mohou také měnit svou sekundární nebo terciární strukturu jako odpověď na podmínky eluce (tj. pH 2 až 3, pH 12 až 13, přebytek cílové látky za podmínek soutěže, detergenty, mírná denaturační činidla proteinů, močovina, teplo, chlad, světlo, kovové ionty, chelatační činidla apod.), které naopak vedou k deformacím konformace peptidu, odpovědného za vazbu na cíl.

Podle dalšího alternativního způsobu, ve kterém TSAR obsahují mezi vazebnou doménou a efektorovou doménou oblast linkeru, mohou být konkrétní knihovny TSAR připraveny a jejich screening prováděn: (1) vytvořením vektoru, s výhodou fágového vektoru genetickým inženýrstvím tak, že sekvence DNA kóduje úsek Faktoru Xa (nebo peptidu štěpitelného proteázou Faktoru Xa) a uvedená sekvence je přítomna těsně u genu kódujícího efektorovou doménu, například genu proteinu obalu plil; (2) konstrukcí a uspořádáním dvouřetězcových syntetických oligonukleotidů jak je popsáno výše a jejich vložením do vytvořeného vektoru; (3) expresí množství vektorů ve vhodném hostiteli pro vytvoření knihovny vektorů; (4) screeningem vazby na imobilizovaný ligand; (5) odmytím přebytku fága; (6) působením proteázy Faktoru Xa na imobilizovaný fág. Částice se pak

-34oddělí od komplexu peptid - ligand a může být použita pro infekci bakterie pro regeneraci částice s plnou délkou molekuly plil pro další cykly screeningu. Toto alternativní provedení dovoluje s výhodou použití univerzálně účinných elučních podmínek a tedy dovoluje identifikaci TSAR exprimovaných fágem, které by jinak s použitím jiných známých elučních metod nemusely být izolovány. Pro ilustraci, s použitím tohoto postupu mohly být izolovány i TSAR s výjimečně pevnou vazbou. V případě potřeby je možno oligonukleotidy kódující vazebnou doménu vybrané tímto způsobem mutagenizovány, exprimovány a rechromatografovány (nebo proveden jejich screeníng jiným způsobem), aby mohla být odkryta zlepšená vazebná aktivita. Zvláště je možno provádět saturační mutagenezi s použitím syntetických oligonukleotidů, syntetizovaných z dopovaných nukleotidových rezervoárů. Dopování se provádí tak, že originální peptidová sekvence se vyskytuje pouze jednou v 10⁶ jednotlivých klonů mutagenizovaného oligonukleotidů. Shromážděné oligonukleotidy se klonují do rodičovského vektoru TSAR. S výhodou je vektorem vektor m663 (Fowlkes a další, 1992, BioTechniques 13: 422 - 427). Vektor m663 je schopen tvořit při růstu v E. coli kmen

JM101 nebo DH5aF’ modré plaky. Výhodná je knihovna větší než 10⁶;

pro izolaci fága TSAR obsahujícího peptidové domény se zvýšenou selektivitou pro vazbu na cílový ligand je však dostatečná knihovna s 10⁵ členy.

V kapitole Příklady provedení vynálezu se používá knihovny

TSAR; odborníkům v oboru je však zřejmé, že lze použít i jiných peptídových knihoven. Příkladem knihovny TSAR je knihovna TSAR-9, popsaná v Kay a další, 1993, Gene 128: 59 - 65. Konstrukty TSAR-9 obsahují peptid o délce přibližně 38 aminokyselin, v němž je 36 pozic zcela náhodných.

• 4 4

4« 4 •4 4444 • · 4 4 4 4 4 • ♦ · 4 4 4 444 4 • · 4 4 4 4 «44 4444 444 444 44 4

- 35 5.3.1. Protilátky a jejich deriváty pro použití při screeningu

Je možno vytvořit protilátky, rozpoznávající daný antigen. Tyto protilátky mohou být polyklonální nebo monoklonální. Takové protilátky je možno použít jako ligandů v prvním kroku screeningu podle předkládaného vynálezu.

Pro přípravu polyklonálních protilátek proti danému antigenu je možno použít mnoho v oboru známých postupů. Pro výrobu protilátky je možno imunizovat různá hostitelská zvířata (včetně ale bez omezení králíky, myši, krysy atd.) injekcí daného antigenu nebo jeho derivátu. io Pro zvýšení imunologické odpovědi je možno použít v závislosti na druhu hostitele různých adjuvans, včetně ale bez omezení Freundova adjuvans (úplného a neúplného), minerálních gelů jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivních látek jako je lyzolecitin, pluronových polyolů, polyaniontů, peptidů, olejových emulzí, hemocyaninů kuželnatky (keyhole limpet), dinitrofenolu a potenciálně použitelných humánních adjuvans, jako je BCG (bacille Calmette-Guerin) a corynebacterium parvum.

Monoklonální protilátka proti danému antigenu může být připravena jakýmkoli způsobem, kterým je možno produkovat molekuly protilátky trvalou buněčnou linií v kultuře. Tyto způsoby zahrnují, ale nejsou omezeny na hybridomové techniky původně popsané Kohlerem a Milsteinem (1975, Nátuře 256: 495 - 497) a pozdější hybridomové techniky lidských B buněk (Kozbor a další, 1983, Immunology Today 4: 72) a EBV-hybridomové způsoby (Cole a další, 1985, Monoclonal

Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., str. 77 - 96).

Monoklonální protilátky mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimérní monoklonální protilátky člověk - myš (nebo jiné druhy). Lidské monoklonální protilátky mohou být připraveny řadou v oboru známých metod (například Teng a další, 1983, Proč. ao Nati. Acad. Sci. USA 80: 7308 - 7312; Kozbor a další, 1983, Immunology Today 4: 72 - 79; Olsson a další, 1982, Meth. Enzymol.

·· ·· · · · • · 9 9 9 • · 9 9999 • · · 1

999 999 99 9 ♦ · ··· ·

92: 3-16). Je možno připravit molekuly chimérní protilátky obsahující myší doménu vázající antigen a lidské konstantní oblasti (Morrison a další, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851, Takeda a další, 1985, Nátuře 314: 452).

Známými způsoby je možno připravit molekulární klon protilátky proti danému antigenu. Pro konstrukci sekvencí nukleové kyseliny, které kódují molekulu monoklonální protilátky nebo její oblasti vázající antigen je možno použít metodologie rekombinantní DNA, viz např. Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold io Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Molekuly protilátky je možno známými způsoby čistit, například imunoabsorpční nebo imunoafinitní chromatografii, chromatografickými metodami jako je HPLC (high performance liquid chromatography) nebo jejich kombinacemi apod.

Známými způsoby je možno vytvořit fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp oblasti molekuly vážící se na antigen. Takové fragmenty například bez omezení zahrnují: fragment F (ab’)2, který je možno vytvořit štěpením molekuly protilátky pepsinem; fragmenty Fab’, které mohou být vytvořeny redukcí disulfidických můstků

2o fragmentu F (ab’)2 a fragmenty 2 Fab nebo Fab, které je možno vytvořit štěpením molekuly protilátky papainem a působením redukčního činidla.

5.4. Identifikace syntetických sekvencí, které zprostředkují vazbu

Když byl způsobem podle vynálezu (buď v prvním nebo ve druhém kroku screeningu) identifikován z peptidové knihovny abtid nebo mimetop pro konkrétní daný cílový ligand, může být užitečné určit, která oblast (které oblasti) sekvence exprimovaného peptidů jsou odpovědné za vazbu k cílovému ligandu. Takovou analýzu je *· ···· ·· ♦ · ·· ·· · · · možno provádět na dvou různých úrovních, tj. jako nukleotidové sekvence nebo sekvence aminokyselin.

Molekulárně biologickými technikami je možno ověřit a dále analyzovat peptid, který se váže na ligand, na úrovni oligonukleotidů.

Za prvé je možno štěpit vložené oligonukleotidy s použitím vhodných restrikčních enzymů a znovu je ligovat do původního expresního vektoru a u produktu exprese takového vektoru provádět screening na vazbu ligandu pro identifikaci oligonukleotidů kódujících vazebnou oblast abtidů nebo mimetopu. Za druhé mohou být oligonukleotidy převedeny do jiného vektoru, například z fágu do fágmidu. Nově exprimované fúzní proteiny by si měly zachovat stejnou vazebnou aktivitu, pokud je doména nutná a postačující pro vazbu ligandu. Tento poslední přístup rovněž ukáže, zda obklopující aminokyselinové zbytky kódované původním vektorem ovlivňují vazbu peptidu a is popřípadě jakým způsobem. Za třetí je možno syntetizovat oligonukleotidy na bázi nukleotidové sekvence stanovené pro fága v knihovně, které kódují vazebný peptid, amplifikovaný klonováním nebo pomocí PCR s použitím vnitřních nebo sekvenci obklopujících primerů, rozštěpit na dvě části a klonovat jako dva fragmenty s doménou s poloviční vazbou. V předcházejícím způsobu jsou vložené oligonukleotidy rozděleny na dvě stejné poloviny. Jestliže je peptidová doména důležitá pro vazbu malá, potom jeden rekombinantní klon se bude vázat a druhý ne. Jestliže se neváže žádný z nich, potom jsou důležité oba nebo část nezbytná k vazbě zaujímá střed (který může být otestován expresí právě této centrální oblasti).

Alternativně mohou být analyzovány vazebné domény syntézou peptidů, odpovídajících dedukované sekvenci abtidů nebo mimetopu. Za prvé by měl být syntetizován celý peptid a měla by být otestována jeho schopnost vázat se na cílový ligand, aby bylo možno ověřit, že

3o daný peptid je nutný a dostačující pro vazbu. Za druhé by měly být syntetizovány krátké fragmenty peptidu, založené na sekvenci ·· ···· » · ··· 9

- 38 aminokyselin vazebné domény náhodného peptidů, například překrývající se 10-mery a otestovány na svou vazbu k ligandu.

V některých případech mohou být navíc zřejmé po srovnání primárních struktur různých vazebných oblastí peptidů z knihovny s vazebnou afinitou k cílovému ligandu lineární motivy (souhlasné motivy). Příspěvek těchto motivů k vazbě může být ověřen u syntetizovaných peptidů v kompetitivních experimentech (tj. při určení koncentrace peptidů, která je schopna z 50 % inhibovat vazbu fága na jeho cíl; IC₅o)· io Naopak lze také odstranit nebo mutovat motiv nebo některou oblast, která se zdá být důležitá pro vazbu, uvnitř DNA kódující inzert náhodného peptidů a změněný peptid může být znovu otestován na schopnost vazby.

Jakmile již byla identifikována vazebná doména peptidů, může být navíc modifikována vazebná charakteristika takového peptidů změnou sekvence vazebné domény za vytvoření rodiny příbuzných peptidů s rozdílnými vlastnostmi vůči specifickému ligandu.

Navíc lze identifikované peptidy zlepšit metodou řízené evoluce dalšími cykly náhodné mutageneze, selekce a amplifikace nukleotidových sekvencí, kódujících vazebné domény. Mutagenezi je možno provést vytvořením a klonováním nové sady oligonukleotidů, která se poněkud liší od rodičovské sekvence, například o 1 až 10 %. Selekce a amplifikace je dosaženo tak, jak se popisuje výše. Například pro ověření skutečnosti, že izolované peptidy mají zlepšené vazebné vlastnosti, mohou být spolu v průběhu screeningových experimentů zpracovány mutanty a rodičovský fág, lišící se svou expresí lacZ. Změna původního poměru barvy modrá - bílá v průběhu screeningového experimentu bude sloužit jako vizuální prostředek pro odhad úspěšné selekce peptidů se zvýšenou vazbou. Tento postup je

3o možno mnohokrát opakovat.

4444

-39• 4

44

4

444 444 « 4 4

4 4

4

5.5. Použití abtidů

5.5,1. Testy s použitím abtidů

Abtidy podle předkládaného vynálezu mají vazebné specifity, podobné ligandům (například protilátkám nebo receptorům), které se používají v prvním kroku screeningu při identifikaci abtidů. Z toho vyplývá, že abtidy mohou být použity při mnoha stejných případech, kde by mohl být použit ligand z prvního kroku screeningu. Jestliže je například ligandem, použitým v prvním kroku screeningu protilátka, ío abtid identifikovaný po druhém kroku screeningu se bude specificky vázat na stejný antigen, ke kterému se specificky váže protilátka. Proto může být abtid použit jako náhrada protilátky v mnoha reakcích nebo testech, při kterých by mohla být použita protilátka. Například by mohl být abtid použit při v oboru známých imunologických testech, například těch, které jsou určeny pro detekci nebo měření množství antigenu. Takové imunologické testy může být samozřejmě nutno vhodným způsobem modifikovat. Mnoho imunologických testů například využívá kroku, ve kterém se druhá protilátka, značená radioaktivní skupinou nebo enzymem jako je alkalická fosfatáza,

2o specificky váže na první protilátku. Neočekává se, že by se taková druhá protilátka specificky vázala na abtid. Bude však v možnostech jakéhokoliv odborníka v oboru vytvořit další značící skupinu, možná třetí protilátku, která by byla schopna specifické vazby na abtid nebo označit abtid před použitím detekovatelným markérem.

Imunologické testy, kterých je možno použít zahrnují bez omezení kompetitivní a nekompetitivní systémy testů s použitím technik jako jsou westernové bloty, radioimunotesty, ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), „sendvičové“ imunologické testy, tečkovací (dot) imunoblotovací testy, imunoprecipitační testy,

3o precipitinové reakce, gelové difúzní precipitinové reakce, imunodifúzní testy, aglutinační testy, testy s fixací komplementu,

9999 • · · · 9 * » • * · 9 » · 9·· · • 9 9 9 9 9 • •••999 ··» 999 ·· ·

-40 imunoradiometrické testy, fluorescenční imunologické testy, imunologické testy s proteinem A, imunoafinitní chromatografie a testy flow dipstick, pokud jmenujeme pouze některé. Pro příklady postupů, kterých je možno použít při imunologických testech lze nalézt obecné informace v Kricka, 1985, Clinical and Biochemical Analysis 17: 1 15; Armbruster, 1993, Clin. Chem. 39/2: 181 - 195; Birnbaum a další, 1992, Anal. Biochem. 206: 168 - 171; Miyai, 1985, Adv. Clin. Chem. 24: 61 -110; a tam uvedených referencích.

Imunologickými testy analyzované vzorky mohou; být jakékoliv io vzorky, které mohou obsahovat antigen nebo ligand, který chceme stanovit. Těmito vzorky mohou být například tělesné tekutiny jako plazma, krev, sérum, sliny, cerebrospinální tekutina, synoviální tekutina apod.

Detekovatelný markér použitý při imunologických testech může 15 být jakýkoliv v oboru známý detekovatelný markér. Takové markéry (labels) zahrnují radioizotopy, fluorescenční barviva, enzymy (například křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza), chemiluminiscenční molekuly, kovové atomy, fosforescenční barviva, barevné částice, kovové koloidy a koloidní barviva.

5,5.1.1 Sendvičová ELISA

Ve zvláštním provedení mohou být abtidy použity v sendvičové enzymové imunologické analýze. V následujícím textu je uveden popis takového provedení pomocí neomezujícího příkladu: Molekula obsahující abtid se fixuje na pevný substrát. Molekula s obsahem abtidu může být připojena na látku, která poskytne pevnější připojení molekuly k substrátu. Analyzovaný vzorek se uvede do styku s molekulou, která obsahuje abtid, navázanou na substrát. Ty substance ve vzorku, které jsou specifickými vazebnými partnery abtidu (analyt), se navážou na abtid a složky vzorku, které se nenavážou se odstraní promytím. Přidá se monoklonální protilátka

-41 ♦ 99

9 9

9

9 9

9

999 9999 ·· ····

9 9 9

9 99 9 9

9 9

999 99 9 proti analytu s připojeným enzymem. Tato monoklonální protilátka s připojeným enzymem se váže na část analytu, pro kterou je specifická, a tím je vytvořen úplný sendvič. Po odstranění nenavázané monoklonální protilátky s připojeným enzymem promytím se do jamek přidá roztok substrátu. Úměrně množství přítomného analytu ve vzorku se vytváří zbarvený produkt. Reakce se ukončí přídavkem zastavovacího roztoku a spektrofotometricky se změří absorbance. Následující text tyto kroky ilustruje podrobněji.

(a) Polystyrénové mikrotitrační jamky (Flow Laboratory) se při io pokojové teplotě nechají přes noc pokrýt 100 μΙ roztoku molekuly obsahující abtid v koncentraci 1 mg/ml v roztoku soli s fosfátovým pufrem (PBS).

(b) Pokrývači roztok se slije a jamky se blokují jednu až dvě hodiny při pokojové teplotě 300 μΙ 1 % bovinního sérového albuminu (BSA) v PBS s 0,05 % Tween 20 (pufr PBSTween).

(c) Na jamku se přidá 150 μΙ vzorku (který může obsahovat analyt, jehož přítomnost nebo množství je třeba stanovit) zředěného v 1 % BSA-PBS. Jamky se inkubují 1 hodinu při pokojové teplotě.

(d) Jamky se čtyřikrát promyjí pufrem PBS-Tween.

(e) Přidá se 100 μΙ monoklonální protilátky specifické k analytu s navázanou křenovou peroxidázou v 1 % BSA-PBS na jamku. Koncentrace monoklonální protilátky může být od přibližně 10 ng/ml až 10 mg/ml. Jamky se inkubují 1 hodinu při pokojové teplotě.

(f) Jamky jsou promyty šestkrát pufrem PBS-Tween.

(g) Do každé jamky se přidá 100 μΙ pracovního roztoku ABTS® Boehringer Mannheim krystalizovaná diamonná súl (2,2’30 azino-di-[3-ethylbenzthiazidin sulfonátu (6)]. Zásobní roztok •9 9999 • · 9 9 9 9 9 • 999 99 999 9 • 9 9 9 9 9 • •9 9999 999 999 99 9

-42ABTS® se připraví s koncentrací 15 mg/ml v dH₂O. Pro vytvoření pracovního roztoku se naředí 200 pl tohoto zásobního roztoku ABTS® do 10 ml citrátového fosfátového pufru (17 mM kyseliny citrónové, 65 mM hydrogenfosforečnanu sodného) a 10 μΙ 30 % H₂O₂.

(h) Na čtečce mikrotitračních destiček (Dynatech MR600, Dynatech Corp., Alexandria, VA) se změří při 405 nm absorbance ve všech jamkách.

io 5.5.2 Farmaceutické prostředky

Vynález poskytuje způsoby léčení podáváním účinného množství farmaceutického (terapeutického nebo diagnostického) prostředku obsahujícího abtid pacientovi. Takový abtid, pro který se předpokládá terapeutické nebo diagnostické použití, se dále označuje is jako „terapeutický abtid“ nebo „terapeutický abtid podle vynálezu“. Takové terapeutické látky jsou abtidy, které se specificky vážou na molekulu in vivo, aby dosáhly určitého terapeutického nebo diagnostického účinku. Ve výhodném provedení je terapeutický abtid v podstatě vyčištěný. Pacientem je s výhodou zvíře, včetně ale bez

2o omezení zvíře jako kráva, prase, kůň, kuře, kočka, pes apod. A s výhodou savec, nejvýhodněji člověk.

Složení farmaceutických prostředků a způsoby podávání, které mohou být použity, jsou v oboru známy a mohou být zvoleny z následujících příkladů.

Pro podávání terapeutických abtidů podle vynálezu je možno použít četných známých způsobů dodání do organismu, například enkapsulace v lipozomech, mikročástic, mikrokapslí, rekombinantních buněk obsahujících terapeutický abtid, receptorem podmíněné endocytózy (viz například Wu a Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429 30 4432) apod. Způsoby podávání zahrnují bez omezení intradermální,

4444

-43 intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intranazáiní, epidurální a orální cesty, stejně jako transdermální a subkutánní implantáty s postupným uvolňováním. Terapeutické abtidy je možno podávat jakoukoliv vhodnou cestou, například infúzí nebo jednorázovou injekcí, absorpcí epiteliálními nebo mukokutánními výstéikami (například ústní, rektální a intestinální siiznice apod.) a mohou být podávány spolu s dalšími biologicky účinnými látkami. Podávání může být systémové nebo místní. Navíc může být žádoucí zavádět farmaceutické prostředky podle vynálezu vhodnou cestou do io centrálního nervového systému včetně intraventrikulární a intrathekální injekcí; intraventrikulární injekce může být uskutečněna intraventrikulárním katétrem například připojeným k zásobníku, jako je například Ommayův rezervoár. Ve specifickém provedení může být žádoucí použití lipozomů, které je možno směrovat pomocí abtidů na specifické identifikovatelné antigeny buněčného povrchu.

Ve specifickém provedení může být žádoucí podávat terapeutické abtidy podle vynálezu místně do určité oblasti v případě potřeby; toho může být dosaženo například bez omezení lokální infúzí během chirurgického výkonu, místní aplikací například ve spojení s obvazem po chirurgickém výkonu, injekcí nebo pomocí katétru, pomocí čípku nebo implantátu, přičemž uvedený implantát může být porézní, neporézní nebo gelovitý materiál, včetně membrán, jako jsou sialastické membrány nebo vláken.

Předkládaný vynález poskytuje farmaceutické prostředky.

Takové prostředky obsahují terapeuticky účinné množství terapeutického abtidů a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo pomocné látky. Takové nosné látky zahrnují bez omezení fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Nosná látka a prostředek mohou být sterilní.

3o Prostředek by měl být vhodný vzhledem ke způsobu podávání.

···· ·· ·· · φ φ • · · · · · φ • ·· · ·····» • · · · · · ··· ···· ··· ··· φ« φ

-44 Prostředek může obsahovat v případě potřeby také menší množství smáčedel nebo emulgačních činidel nebo prostředků pro pufrování pH. Prostředek může být ve formě kapalného roztoku, suspenze, emulze, tablety, pilulky, kapsle, prostředku s prodlouženým uvolňováním nebo prášku. Prostředek může být ve formě čípku s tradičními nosnými a vaznými látkami, jako jsou triglyceridy. Orální prostředek může obsahovat standardní nosné látky, jako jsou farmaceutický manitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, sodná sůl sacharinu, celulóza, uhličitan hořečnatý apod.

Ve výhodném provedení je složení prostředku upraveno obvyklými způsoby jako farmaceutický prostředek pro intravenózní podávání člověku. Typicky jsou prostředky pro intravenózní podávání ve formě roztoků ve sterilním izotonickém vodném pufru. V případě potřeby může prostředek také obsahovat solubiiizační prostředek a is lokální anestetikum, jako je lignokain pro zmírnění bolesti v místě injekce. Obecně se složky dodávají buď odděleně nebo spolu smíseny v jednotlivé dávkovači formě, například jako suchý lyofilizovaný prášek nebo koncentrát neobsahující vodu v hermeticky uzavřené nádobě, jako je ampule nebo sáček s označením množství aktivní

2o složky. Pokud má být prostředek podáván infuzí, může být v infuzní láhvi obsahující sterilní farmaceutickou vodu nebo fyziologický roztok. Pokud se prostředek podává injekcí, může být přibalena ampule sterilní vody pro injekce nebo fyziologický roztok, takže složky mohou být smíseny před podáním.

Terapeutické abtidy podle vynálezu mohou být ve formě neutrální nebo kyselé. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli s volnými aminoskupinami, jako soli odvozené od kyseliny chlorovodíkové, fosforečné, octové, šťavelové, vinné apod. a soli s volnými karboxylovými skupinami, jako jsou soli sodné, draselné,

3o amonné, vápenaté, soli s hydroxidy železa, izopropylaminem, triethylaminem, 2-ethylaminoethanolem, histidinem, prokainem apod.

·« ···· • · · · ·«···· • · · · .< · ··»·«·· ··· «·· ·« „

-45 Množství terapeutického abtidu podle vynálezu účinné při léčbě konkrétního stavu nebo poruchy bude záviset na povaze poruchy nebo stavu a bude určeno standardními klinickými postupy. Navíc mohou být pro zjištění optimálních dávkovačích rozsahů popřípadě použity testy in vitro. Přesná použitá dávka prostředku bude také záviset na cestě podání a vážnosti nemoci nebo poruchy a její velikost by měla být stanovena podle úsudku ošetřujícího lékaře a stavu jednotlivého pacienta.

Vynález rovněž poskytuje farmaceutický balíček nebo kit obsahující jednu nebo více nádobek naplněných jednou nebo více složek farmaceutických prostředků podle vynálezu. S touto nádobkou (nádobkami) může být dodáván návod ve formě předepsané státní institucí pro řízení výroby, použití nebo prodeje farmaceutických prostředků nebo biologických produktů, který obsahuje schválení pro výrobu, použití nebo prodej k humánním účelům.

5.5.3 Diagnostická a terapeutická použití abtidů in vivo

Další oblastí, kde mohou být abtidy použity místo protilátek je zobrazování, detekce nebo léčení onemocnění. Běžné diagnostické a terapeutické metody využívají protilátek pro směrování zobrazujících látek nebo terapeutických prostředků na určitý cíl, například na tumory. Protože abtidy mají stejnou specifitu vazby jako protilátky, mohou být použity namísto protilátek v těchto diagnostických a terapeutických metodách.

Abtidy mohou být připojeny na cheiatační činidla, jaká jsou například popsána v US patentu No. 4,741,900 nebo 5,326,586. Komplex abtid - cheiatační činidlo pak může být radioaktivně označen, čímž se získá zobrazovací prostředek pro diagnózu nebo léčení onemocnění. Abtidu je také možno použít v metodách, které se popisují v související US patentové přihlášce No. 08/127,351 týkající se vytváření radioaktivně značeného peptidu pro použití v zobrazování ·· ···· • ·· ·· · · ·· ·· · · · • · · · · · · • · * · · · ··· · • · · · · · ··· ·<·· ··· ··· ·· ·

-46 nebo v radioterapii. Tato přihláška obsahuje přehled metod použití peptidů v zobrazovacích prostředcích.

Při diagnostických aplikacích in vivo mohou být podáním dostatečného množství značeného abtidů podle předkládaného vynálezu zobrazeny specifické tkáně nebo dokonce specifické buněčné poruchy.

Klinicky byla testována a využívána široká řada kovových iontů, vhodných pro zobrazování tkání in vivo. Pro zobrazování pomocí radioizotopů se obvykle požadují následující vlastnosti: (a) nízká dávka radiace pro pacienta; (b) vysoký fotonový výtěžek, který dovoluje provedení postupu nukleární medicíny v krátkém časovém úseku; (c) možnost výroby v dostatečném množství; (d) přijatelné náklady; (e) jednoduchá příprava k podání; a (f) požadavek, aby pacient nemusel být dále izolován. Tyto vlastnosti mohou být obecně převedeny do následujících kritérií: (a) radiační expozice nejkritičtějšího orgánu je menší než 5 rad; (b) jediný obraz je možno získat v průběhu několika hodin po infuzí; (c) radioizotop se nerozpadá prostřednictvím vyzáření částice; (d) izotop je možno snadno detekovat; (e) poločas je menší než čtyři dny (Lamb and

Kramer, „Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine“, In Radiotracers For Medical Applications, díl 1, Rayudu (red.), CRC Press, lne., Boča Raton, str. 17 - 62). S výhodou je kovem technecium - 99 m.

Cíle, které lze zobrazit, mohou být například pevné novotvary, určité orgány jako lymfatické uzliny, parathyroidy, slezina a játra, místa zánětu nebo infekce (například makrofágy přítomné v těchto místech), infarkt myokardu nebo trombózy (neoantigenní determinanty fibrinu nebo destiček) apod., zřejmé jakémukoli odborníkovi v oboru. Neoplastické tkáně mohou být navíc přítomny v kostech, vnitřních orgánech, pojivové tkáni nebo kůži.

• ··· ·· ····

Odborníkovi v oboru je také zřejmá možnost použití předkládaného vynálezu při léčbě in vivo (například k použití radioterapeutických kovových komplexů), zvláště po diagnóze stavu způsobeného nemocí diagnostickou metodou in vivo popsanou výše, 5 nebo při diagnostických použitích in vitro (například s použitím radioaktivních nebo fluorescenčních kovových komplexů).

Způsob získání vnitřních tkání pacienta podle předkládaného vynálezu bude zahrnovat podávání účinného množství abtidového prostředku obsahujícího radioaktivní kov pacientovi a záznam scintigrafického obrazu, získaný z rozpadu radioaktivního kovu. Podobně se předpokládá použití při zesílení obrazu vnitřních tkání pacienta získaného magnetickou rezonancí, které zahrnuje podání účinného množství abtidového prostředku, obsahujícího paramagnetický kov pacientovi a záznam MR obrazu vnitřních částech organismu pacienta.

Další způsoby zahrnují způsoby zesílení sonografického obrazu vnitřních částí těla pacienta podáním účinného množství abtidového prostředku obsahujícího kov a záznamem sonografického obrazu vnitřní části těla pacienta. V této poslední aplikaci kovem s výhodou jakýkoliv iont netoxického těžkého kovu. Rovněž se poskytuje způsob zesíiení rentgenového obrazu vnitřní části organismu pacienta, který zahrnuje podání abtidového prostředku s obsahem kovu pacientovi a záznam rentgenového obrazu vnitřní Části organismu pacienta. Výhodný je radioaktivní netoxický iont těžkého kovu.

Použití abtidů na místě protilátek v těchto metodách má určité výhody. Protože abtidy jsou spíše peptidy než velké proteiny, jako je tomu u protilátek, kinetika jejich distribuce v těle a vylučování z krevního řečiště se liší od kinetiky pro velké proteiny, jako jsou protilátky. Jak je například ukázáno v části 1. 4, abtidů je možno

3o použít pro zobrazování stavů onemocnění in vivo za 2 až 5 hodin.

·· ···· ·· · · ·· ·· · · · • · · · · · · • · · · ······ • · · · · · ··· MM ··· ··· ·· e

-48 Běžné metody pro zobrazování tumorů s použitím protilátek vyžadují přibližně 24 až 48 hodin.

Protože abtidy jsou peptidy, vylučují se z krve rychleji než protilátky. To znamená, že při použití abtidů pro zobrazení stavů onemocnění budou v krvi menší hodnoty pozadí, než je tomu při použití protilátek.

Peptidy budou nejpravděpodobněji vyvolávat menší imunologickou odezvu u pacientů, než je tomu u velkých proteinů jako jsou protilátky. Tento ohled je zvláště důležitý v tom případě, jestliže io se požaduje provádět diagnózu nebo léčení opakovaně nebo dlouhodobě.

Pro svou obecně malou velikost mohou zůstat abtidy rozpustné ve fyziologických tekutinách za podmínek, kdy protilátky nemohou.

Protože jsou abtidy obecně peptidy, mohou být vyráběny 15 synteticky nebo rekombinantními metodami, a proto mohou být výrobně lacinější než protilátky.

Abtidy mohou být používány jednotlivě. Alternativně mohou být abtidy použity jako směsi abtidů, ve kterých se peptidové sekvence abtidů liší.

5.6, Syntéza peptidů

5.6.1 Způsob syntézy na pevné fázi

Abtidy nebo mimetopové peptidy mohou být připraveny v oboru známými způsoby. Stručně, syntéza peptidu na pevné fázi například sestává z navázání karboxylové skupiny C-koncové aminokyseliny na pryskyřici a následného přidávání aminokyselin s chráněným adusíkem. Ochranné skupiny mohou být jakékoliv v oboru známé skupiny. Předtím, než se k rostoucímu řetězci přidá nová aminokyselina, ochranná skupina předchozí aminokyseliny přidané k

-49 řetězci se odstraní. Navazování aminokyselin na vhodné pryskyřice se popisuje v Rivier a další, US patent No. 4,244,946. Takové syntézy na pevné fázi byly například popsány v Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Vale a další, 1981, Science 213: 1394 - 1397; Marki a další, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3178 a v US patentu No. 4,305,872 a 4,316,891. S výhodou se používá automatického syntezátoru peptidů.

Jako neomezující příklad je možno uvést syntézu peptidů na automatickém peptidovém syntezátoru Applied Biosystems lne. („ABI“) io model 431A s použitím protokolu syntézy „Fastmoc“ dodaným firmou ABI, který používá jako vazebného činidla 2-(1H-benzotriazol-1-yl)1,1,3,3,-tetramethyluroniumhexafluorofosfátu („HBTU“) (R. Knorr a další, 1989, Tet. Lett., 30: 1927). Syntézy je možno provádět na 0,25 mmol komerčně dostupné 4-(2’, 4’-dimethoxyfenyl-(9-fluorenyl15 methoxykarbohyl)-aminomethyl)-fenoxypolystyrenové pryskyřici („Rink resin“ firmy Advanced ChemTech) (H. Rink, 1987, Tet. Lett. 28: 3787). Fmoc aminokyseliny (1 mmol) se navazují podle protokolu Fastmoc. Používají se následující Fmoc aminokyselinové deriváty s chráněnými postranními řetězci: FmocArg(Pmc)OH; FmocAsn(Mbh)OH;

FmocAsp(‘Bu)OH; FmocCys(Acm)OH; FmocGlu(‘Bu)OH;

FmocGln(Mbh)OH; FmocHis(Tr)OH; FmocLys(Boc)OH;

FmocSerfBuJOh; FmocThr(‘Bu)Oh; FmocTyrfBuJOH. [Použité zkratky: Acm = acetamidomethyi; Boc = terc-butoxykarbonyl; ^lBu = terc.-butyl; Fmoc = 9-fluorenylmethoxykarbonyl; Mbh = 4,4’-dimethoxybenzhydryl;

Pmc = 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl; Tr = trityl].

Syntéza se provádí v rozpouštědle N-methylpyrrolidonu (NMP) s HBTU, rozpuštěným v Ν,Ν-dimethylformadmidu (DMF). Odstranění ochranné skupiny Fmoc se provádí s použitím přibližně 20 % piperidinu v NMP. Na konci každé syntézy se stanoví množství přítomného peptidu ultrafialovou spektroskopií. Vzorek suché peptidové pryskyřice (3-10 mg) se zváží, a pak se přidá 20 %

-50piperidinu v DMA (10 ml). Po 30 min sonikaci se při 301 nm zaznamená ultrafialová absorbance dibenzofulven-piperidinového adduktu (vytvořeného štěpením N-koncové skupiny Fmoc). Substituce peptidú (mmol g'¹) může být vypočtena podle rovnice:

A x v s substituce =-x 1000

7800 x w kde A je absorbance při 301 nm, v je objem 20 % piperidinu v DMA (ml), 7800 je extinkční koeficient ( mol’¹ dm³ cm'¹) dibenzofulven - piperidinového adduktu a w je hmotnost vzorku peptidové pryskyřice (mg).

io Nakonec se N-koncová skupina Fmoc odštěpí působením 20 % piperidinu v DMA, a potom se acetyluje s použitím acetanhydridu a pyridinu v DMA. Peptidová pryskyřice se důkladně promyje v DMA, CH₂CI₂ a nakonec diethyletherem.

is 5,6,2 Štěpení a odstranění ochranných skupin

Na neomezujícím příkladu je ukázáno následující štěpení a odstranění ochranných skupin: na peptidovou pryskyřici usušenou na vzduchu se působí ethylmethylsulfidem (EtSme), ethandithiolem (EDT) a thioanisolem (PhSMe) přibližně 20 min před přídavkem 95 % vodné

2o kyseliny trifluoroctové (TFA). Na gram peptidové pryskyřice se použije celkový objem přibližně 50 ml těchto reagencií. Používá se následujícího poměru: TFA : EtSMe : EDT : PhSMe (10 : 0,5 : 0,5 : 0,5). Směs se 3 hodiny míchá při pokojové teplotě v atmosféře N₂. Směs se zfiltruje a pryskyřice promyje TFA (2x3 ml). Kombinovaný filtrát se ve vakuu odpaří a ke žlutooranžovému zbytku se přidá bezvodý diethylether. Výsledná bílá sraženina se izoluje filtrací. Různé metody štěpení se popisují v King a další, 1990, Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255 - 266.

• · ··· ·

-51 5.6.3 Čištění peptidů

Čištění syntetizovaných peptidů je možno provádět standardními metodami včetně chromatografie (např. iontoměničové, afinitní a rozdělovači kolonové chromatografie, kapalné chromatografie s vysokou účinnosti (HPLC)), centrifugace, diferenciální rozpustnosti nebo jinými standardními postupy.

5.6.4 Připojení peptidů k jiným molekulám

Abtidy podle předkládaného vynálezu je možno připojit k jiným io molekulám (např. detekovatelný markér, molekula umožňující adsorpci na pevný substrát nebo toxin podle různých provedení vynálezu) v oboru známými způsoby. Takové způsoby zahrnují použití homobifunkčních nebo heterobifunkčních zesíťujících molekul.

Homobifunkční molekuly mají alespoň dvě reaktivní funkční 15 skupiny, které jsou stejné. Reaktivní funkční skupiny na homobifunkční molekule zahrnují například aldehydové skupiny a aktivní esterové skupiny. Homobifunkční molekuly s aldehydovými skupinami zahrnují například glutaraldehyd a subaraldehyd. Použití glutaraldehydu jako zesíťujícího prostředku se popisuje v Poznaňský a další, 1984, Science 223: 1304 - 1306.

Homobifunkční molekuly s alespoň dvěma jednotkami aktivního esteru zahrnují estery dikarboxylových kyselin a Nhydroxysukcinimidu. Některé příklady takových N- sukcinimidylových esterů zahrnují disukcinimidylsuberát a dithio-bis25 (sukcinimidylpropionát) a jejich rozpustné bis-sulfonové a bissulfonátové soli, jako jejich sodné a draselné soli. Homobifunkční reagencie jsou dostupné od firmy Pierce, Rockford, Illinois.

Heterobifunkční molekuly mají alespoň dvě rozdílné reakční skupiny. Některé příklady heterobifunkčních reagencií obsahujících

3o reaktivní disulfidické vazby zahrnují N-sukcinimidyl-3-(2-52 pyridildithio)propionát (Carlsson a další, 1978, Biochem J. 173: 723 737), sodná sůl S-4-sukcinimidyloxykarbonyl-alfamethylbenzylthiosulfátu a 4-sukcinimidyloxykarbonyl-alfa-methyl-(2pyridyldithio)toluen. Výhodný je N-sukcinimidyl-3-(25 pyridyldithio)propionát. Některé příklady heterobifunkčních reagencií, obsahujících reaktivní skupiny s dvojnou vazbou, která reaguje s thiolovou skupinou, zahrnují sukcinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)cyklohexan-1-karboxylát a sukcinimidyl-mmaleimidobenzoát.

io Další heterobifunkční molekuly zahrnují sukcinimidyl 3(maleimido)propionát, sulfosukcinimidyl-4-(p-maleimido-fenyl)butyrát, sulfosukcinimidyl-4-(N-maleimidomethylcyklohexan)-1-karboxylát a maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester. Výhodná je sodná sulfonátová sůl sukcinimidyl-m-maleimidobenzoátu. Mnoho z výše uvedených heterobifunkčních reagencií a jejich sulfonátových solí je dostupných od formy Pierce.

Další informace o výrobě a použití těchto i dalších polyfunkčních reagencií je možno získat z následujících a/nebo jiných publikací z oboru.

Carlsson a další, 1978, Biochem. J. 173: 723 - 737.

Cumber a další, 1985, Methods in Enzymology 112: 207 - 224.

Jue a další, 1978, Biochem. 17: 5399 - 5405.

Sun a další, 1974, Biochem. 13: 2334 -2340.

Blattler a další, 1985, Biochem. 24: 1517 - 152.

Liu a další, 1979, Biochem. 18: 690 - 697.

Youle a Neville, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 5483 - 5486. Lerner a další, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 3403 - 3407.

Jung a Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761: 162.

Caulfield a další, 1984, Biochem. 81: 7772 - 7776.

Staros, 1982, Biochem. 21: 3950 - 3955.

Yoshitake a další, 1979, Eur. J. Biochem. 101: 395 - 399.

- 53 Yoshitake a další, 1982, J. Biochem. 92: 1413 - 1424.

Piích a Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254: 3375 - 3381.

Novick a další, 1987, J. Biol. Chem. 262: 8483 - 8487.

Lomant a Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104: 243 - 261.

Hamada and Tsuruo, 1987, Anal. Biochem. 160: 483 - 488.

Hashida a další, 1984, J. Applied Biochem. 6: 56 - 63.

Způsoby zesítění se popisují také v Means a Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1: 2 - 12.

io 5,6.4.1 Biotinylace peptidů

Způsoby biotinylace peptidů jsou v oboru dobře známy. Při provedení vynálezu je možno použít jakoukoliv pohodlnou metodu. Bylo použito například následujícího postupu:

(1) rozpustí se 10 mg peptidů ve 100 μΙ 0,1 % kyseliny octové;

(2) přidá se 900 μΙ PBS;

(3) přidá se 3,3 mg biotin-LC-NHS (Pierce, Rockford, IL);

(4) 30 min se inkubuje při pokojové teplotě;

(5) čistí se na koloně Superose 12 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

2o Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je možno úplněji pochopit pomocí následujících obrázků, ve kterých:

Obr. 1 ukazuje schematický diagram obecného způsobu identifikace abtidu dvoustupňovým postupem screeningu.

Obr. 2 ukazuje vazbu biotinylované monoklonální protilátky

7E11-C5 na imobilizovaný mimetopový peptid 7E11-9.5, detaily viz část 6.1.2.2.

Obr. 3 ukazuje podobnost aminokyselinových sekvencí oblastí CDR2L a CDR3L monoklonální protilátky 7E11-C5 a abtidů 7E11-C5 z •4 4444

444· 44 44 44 4 • · 4 4 · 4 4 • ·· 4 444··· «4 «4 4 4 •444444 444 444 44 4

-54tabulky 2. Počet aminokyselin v abtidech, podobných CDR je uváděn v závorkách spolu s procentem homologie. Čárkování označuje mezery, které byly přidány pro zlepšení homologie. V případě klonů 13 a 16 byla homologie se sekvencí CDR2L větší, jestliže byla sekvence

CDR2L revertována. Dále jsou uvedeny sekvence ukázané pro jednotlivé klony (klon: sekvence): 14: SEQ ID NO: 1; 17: SEQ ID NO: 2; 15: SEQ ID NO: 3; 13: SEQ ID NO: 4; 16: SEQ ID NO: 5; CDR3L: SEQ ID NO: 6; CDR2L: SEQ ID NO: 7; CDR2L: (rev): SEQ ID NO: 8.

Obr. 4 ukazuje vazbu abtidů k mimetopovému peptidu 7E11-9.5 io v tečkovacím testu, jak se popisuje v oddílu 1.2.1. Čísle na levé straně obrázku se vztahují k abtidů 7E11-C5, který byl kápnut do označené pozice. Číslo 351 označuje monoklonální protilátku 7E11-C5, použitou jako pozitivní kontrola. Čísla na vrchní části obrázku označují různá zředění abtidů nebo monoklonální protilátky, která byla použita.

is Obr. 5 ukazuje vazbu biotinylovaných mimetopů imobilizovaných abtidů. □ označuje vazbu mimetopového peptidu biotinLYANPGMYSRLHSPA-NH₂ na abtid 7E11-C5 klon 14; O označuje vazbu mimetopového peptidu biotin-LYANPGMYSRLHSPA-NH₂ na abtid 7E11-C5 klon 17; O představuje vazbu mimetopového peptidu biotin-GMYSRLH-NH₂ na abtid 7E11-C5 klon 14; Δ označuje vazbu mimetopového peptidu biotin-GMYSRLH-NH₂ na abtid 7E11-C5 klon

17. Detaily viz část 6.1.2.2.

Obr. 6 ukazuje vychytávání antigenu z lyzátu tumorových buněk LNCaP monoklonální protilátkou 7E11-C5 a abtidem 7E11-C5 klon 14.

Detaily viz část 6.1.3.

Obr. 7 ukazuje biologickou distribuci abtidového klonu 14DPTA-¹¹¹ln v myši SCID, která nese xenograftové tumory lidského karcinomu prostaty LNCaP 2 hodiny E3- pruh nalevo z každé dvojice pruhů nebo 4 hodiny pruh napravo z každé dvojice, po injekci ao 2 pg peptidu se specifickou aktivitou 1,18 χ 10⁶ Bq. Detaily viz část

6.1.4.

• · ·· *

Obr. 8 ukazuje biologickou distribuci abtidového klonu 17DPTA-¹¹¹ln u 4 myší SCID, které nesou xenograftové tumory lidského karcinomu prostaty LNCaP 2 hodiny pruh nejvíce nalevo z každé čtveřice, myš 1; E| druhý pruh zleva pro každou skupinu, myš 6; nebo

5 hodin RT třetí pruh zleva pro každou skupinu, myš 2; pravý pruh z každé čtveřice, myš 4; po injekci 0,02 pg peptidu, specifická aktivita 8,88 x 10⁴ Bq/ng. Detaily viz oddíl 6.1.4.

Obr. 9 ukazuje biologickou distribuci kontrolního peptidu značeného ¹¹¹ln u myši SCID s xenodraftem lidského karcinomu io prostaty LNCaP 2 hodiny pruh nejvíce vlevo z každé skupiny pěti pruhů; druhý pruh zleva v každé skupině; nebo 5 hodin třetí pruh zleva v každé skupině; čtvrtý pruh zleva pro každou skupinu; pruh nejvíce vpravo v každé skupině; po injekci 1,5 pg peptidu, specifická aktivita 1,11 x 10⁵ Bq/pg. Detaily viz část 6.1.4.

is Obr. 10 schematicky ilustruje konstrukci knihovny TSAR R26.

Expresní knihovna R26 byla zkonstruována postupem pro knihovnu TSAR-9, popsaným ve zveřejněné PCT přihlášce WO 94/18318 z

18. 8. 1994 kromě modifikací uvedených v obr. 10. Proces uspořádání oligonukleotidů z obr. 10 vede k expresi peptidů s následující sekvencí aminokyselin:

S(S/R)X₁₂kAÓX₁₂SR ((SEQ ID NO: 89), kde π = S, P, T nebo A; a δ = V, A, D, E nebo G.

Obr. 11 schematicky ilustruje konstrukci knihovny TSAR D38. Expresní knihovna D38 byla zkonstruována postupem pro knihovnu

TSAR-9, popsaným ve zveřejněné PCT přihlášce WO 94/18318 z 18. 8. 1994 kromě modifikací uvedených v obr. 11.

Obr. 12 schematicky ilustruje konstrukci knihovny TSAR DC43. Expresní knihovna DC43 byla zkonstruována postupem pro knihovnu TSAR-9, popsaným ve zveřejněné PCT přihlášce WO 94/18318 z

3o 18. 8. 1994 kromě modifikací uvedených v obr. 12.

« · ··· · * · · • · · • · # · · • « • · · 9

Obr. 13 schematicky ilustruje oligonukleotidy používané při konstrukci polymorfního epiteliálního mucinového (PEM) abtidů saturační mutagenezi knihovny TSAR (viz část 6.2.2).

Příklady provedení vynálezu

6.1. Abtidv napodobujíc? vazebnou specifitu monoklonální protilátky

7E11-C5

6.1,1 Identifikace a izolace abtidů napodobujících vazebnou specifitu monoklonální protilátky 7E11-C5 io 7E11-C5 je myší lgG1 monoklonální protilátka, specifická proti antigenu lidského karcinomu prostaty, LNCaP. 7E11-C5 se silně váže na maligní prostatický epitel, ale pouze slabě na normální prostatický epitel. Neváže se na neprostatické tumory nebo na většinu normálních orgánů (/viz Horoszewicz a další, 1987, Anticancer Res. 7: 927 - 936).

Protilátka 7E11-C5 se také popisuje v US patentu No. 5,162,503 z 10. 11. 1992. Hybridomy produkující monoklonální protilátku 7E11-C5 byly pěstovány jako ascity u myší a 7E11-C5 byla čištěna z ascitické kapaliny afinitní chromatografií na Proteinu A na čistotu lepší než 90 %, jak bylo testováno elektrof orézou na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného.

Aby bylo možno identifikovat abtidy napodobující vazebnou specifitu monoklonální protilátky 7E11-C5, jako cílový ligand v prvním kroku screeningu knihovny TSAR-9 byla použita monoklonální protilátka 7E11-C5 (viz Kay a další, 1993, Gene 128: 59 - 65 a zveřejněná PCT přihláška WO 94/18318 z 18. 8. 1994). Bylo použito následujícího postupu screeningu. Nejprve byla protilátka 7E11-C5 navázána na jamku mikrotitrační destičky. 7E11-C5 v koncentraci 11,2 mg/ml ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS), pH 6,0, byla rozpuštěna na koncentraci 100 pg/ml v 0,1 x PBS pH 7,2. 100 μΙ roztoku tohoto zředění bylo přidáno do jedné jamky mikrotitrační ·· ···· • · · · ······ • · · · · · »···«·· · · · · ·« · · ·

-57 destičky a ponecháno inkubovat 1-6 hodin při pokojové teplotě a přes noc při 4 °C. Po inkubaci byla jamka promyta alespoň čtyřikrát blokovacím pufrem, který se skládal buď z 1 % bovinního sérového albuminu (BSA) v PBS, 1 % odtučněného sušeného mléka (NFDM) v

PBS nebo 0,1 % Tween® v buď 1 % BSA v PBS nebo 1 % NFDM v PBS. Do každé jamky bylo přidáno 200 pl blokovacího pufru a ponecháno inkubovat při pokojové teplotě alespoň 1 hodinu.

Potom byl do každé jamky obsahující navázanou 7E11-C5 přidán alikvot z knihovny TSAR-9. Do jamky byl přidán alikvot ío knihovny obsahující 1O¹⁰ částic fága a destička byla ponechána inkubovat při pokojové teplotě alespoň 1 hodinu. Tím došlo k navázání těch fágů, které obsahují vazebné domény schopné vazby na 7E11C5, na destičku. Po jedné hodině byla jamka důkladně promyta pufrem, který se skládal buď z 1 % bovinního sérového albuminu (BSA) v PBS, 1 % odtučněného sušeného mléka (NFDM) v PBS nebo 0,1 % Tween® v buď 1 % BSA v PBS nebo 1 % NFDM v PBS.

Po promytí byl fág, navázaný na protilátku 7E11-C5 v jamce eluován přídavkem 100 pl kyselého roztoku 0,2 M glycinhydrochloridu o pH 2,0. Po inkubaci po dobu 15 minut až 1 hodina byl kyselý roztok

2o obsahující eluovaného fága převeden do mikrocentrifugační zkumavky 1,5 ml a pro neutralizaci kyselého roztoku byl přidán stejný objem 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5. V některých případech byl neutralizovaný roztok fága ihned přidán do druhé jamky obsahující navázanou protilátku 7E11-C5 a postup vazby a eluce byl opakován.

Jestliže bylo potřeba monitorovat stupeň obohacení v průběhu výše uvedených kroků, byl přidán k alikvotu knihovny TSAR-9 fág, který se na 7E11-C5 neváže, ale exprimuje gen pro β-galaktosidázu. Tento fág při vysetí v přítomnosti X-gal a IPTG poskytuje modré plaky.

. Po kroku screeningu byl eluovaný fág vyset v přítomnosti X-gal a

IPTG. Stejným způsobem byl vyset alikvot fága, který neprošel screeningem. Pro oba vzorky fága byl zjištěn poměr bílých a modrých

4

4 ·4·4

4· 4 4 4

4 4 4

4 444 4

4 ·

444 44 4

-58 plaků. Přírůstek podílu bílých plaků (fága TSAR-9, který se váže na 7E11-C5) k modrým plakům (z fága, který se neváže) udával stupeň, do kterého byla obohacena při procesu screeningu populace fága o fág, který se váže na 7E11-C5.

Jestliže bylo potřeba v průběhu výše uvedených kroků screeningu monitorovat specifitu vazby, byl prováděn screening vůči irelevantnímu cíli (buď BSA, myší IgG nebo plastická hmota) spolu se screeningem na 7E11-C5. Zvýšení počtu bílých plaků oproti modrým plakům po provedení techniky panningu proti 7E11-C5 spíše než ío irelevantnímu cíli uvedenému výše udávalo míru specifity vazby.

Po screeningu byl fág pomnožen přídavkem alikvotu eluovaného fága k roztoku obsahujícímu živnou půdu LB broth a kompetentní buňky E. coli DH5ctF’ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Typicky byl ke 125 pl půdy LB broth obsahující buňky E. coli DH5aF’ ve zředění 1 : is 50 (přibližně 1 x 10⁹ buněk/ml) přidán alikvot 2 až 5 μΙ roztoku fága. K tomuto roztoku bylo přidáno 3,3 mi vrchního agaru a směs byla vyseta na Petriho misku s agarem. Často byl zjišťován titr fága několikanásobným zředěním 1:10a vysetím zředění jak je popsáno výše. Po inkubaci přes noc při 37 °C byly plotny vyhodnoceny na růst

2o plaků a v případe potřeby počítány. Plotny byly eluovány přídavkem 3 až 5 ml 100 mM NaCl, 10 mM MgCI₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (pufr SM) na každou plotnu a inkubovány 1 až 5 hodin za mírného kývání. Roztok byl potom z plotny odstraněn, centrifugován a buď skladován, dále amplifikován nebo analyzován.

V některých případech bylo prováděno pomnožení fága v roztoku přídavkem 1 až 5 μΙ roztoku fága k 1 až 5 ml půdy LB broth obsahující kompetentní buňky E. coli DH5aF’ v ředění 1 : 50 nebo 1 : 100 (přibližně 1 x 10⁹ buněk/ml). Po inkubaci buď 6 hodin nebo přes noc byl roztok zcentrifugován a supernatant oddělen. V některých případech byly fágové částice vysráženy polyethylenglykolem (PEG) přídavkem 1/5 objemu PEG k vyčeřenému roztoku fága a inkubací na

9 9 9 9 9 • •9 9 99 99 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 • · · · 999999 • 9 9 9 9 9 • 99 9999 999 999 99 9

-59 ledu po dobu 1 hodiny. Po centrifugací byl obvykle fág rekonstituován 100 μΙ pufru SM.

Z použití výše popsaných postupů bylo izolováno 10 různých fágů, které exprimovaly peptidy obsahující vazebné domény schopné vazby na monoklonální protilátku 7E11-C5. Molekuly obsahující tyto vazebné domény jsou tady mimetopy antigenu, rozpoznávaného monoklonální protilátkou 7E11-C5. Vazebné domény peptidú exprimovaných těmito devíti fágy byly sekvenovány pomocí standardních způsobů sekvenování DNA (Sequenase™, U. S. io Biochemical Corp., Cleveland, OH). Stanovení těchto sekvencí DNA umožnilo určení sekvence aminokyselin příslušných mimetopů. Tyto sekvence jsou ukázány v tabulce 1. Průzkum těchto aminokyselinových sekvencí ukázal, že sdílejí společný motiv MYxxLH (SEQ ID NO: 10).

Η	Μ	ro	>5»·	ιη	10		G0	<η	α	Ο
rM	«Η	r-l	Η	Η	Η	γ4	Η	Η	Η	Οί
0	0	0	ό	6	0	0	0	0	0	0
X	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω
Η	Η	Μ	κ	Η	Η	Η	Η	Η	Η	Η
σ	σ	σ	Ο	σ	α	α	α	σ	σ	σ
ω	Cd	Cd	ω	ω	Cd	ω	ω	ω	ω	ω
03	03	03	03	03	03	03	03	03	03	03

·· ···· • · »·· * • · ·· * to □

η π

Η

	03 X
			0	β/
			03	2
			σ	Ω Ω
			2 b	2 04
			Η	04
			X	X
			X
			Η	2
			Ω	[čij
<			ÍM	04
03			03	04
03			0	03
σ		03	04	Ω
Η	03		Ω	2
Ω	Ω	Ω	X	X
X	Ε-<	03	0	0
X	Cd	X	03	0
>	0u	Ο	0	X	04
	2	0	04	ω	Eb		X	0
X	2	Ω		2	2	X	Η	X
Ο)	03	03	03 ε-<	X	Ξ	ο	ω	Μ

X

Ο)

X	Κ	X	X	5C	X	X	X	X
Ω		Ω	Ω		Ω	Ω	Ω	Ω
X		X	X	2	σ	>«	Ω	Η
03	ζ	X	Ω	5	α	X	X	Η
><	^4	5«	X	^4	^4	^4	Η	X
Ζ	2	Σ	ζ	2Ζ	2	Σ	Ζ	Ζ

χ ω

χ >« ζ

ο

0		03 Ε-¹	Η	0	X	03	01
X	X	Ω <	X	0	Μ		Ω
2	X	> >		0	Cd	0	0
2	X	0 h	Η	Cd	0	03	0
	0	X	α	X	0	Ζ	>·
	X	03	X	2	>	0	Ω
Ε-4	Ω	>	ζ	5	03	b	Ω
>»	2	Ω	Ω	W	X	0	Ω
>	>	0	W	2	X		0
X	>	0		0	ω	Cd	X
03	Ω			Ω	>	X	0
Η	Ω	2		X		σ	0
Ω	Ζ	>			03	>	X
Ω	03	>			Ω	X	σ
Ζ	X	X			X
X	03	0
03	03	03
>	Μ
U	03	Η
03	X	X
	b	Ω
	σ	b
	>	><
	03

>« *4

4444 • 4 · · · 4 · • · · · · · 44 4 4 • 4 4 · 4 4

44» 4444 444 444 44 4

-61 Aby bylo možno použít mimetopy pro identifikaci abtidů, byly syntetizovány peptidy odpovídající sekvenci mimetopů a rozpuštěny buď ve vodě nebo v PBS na konečnou koncentraci 5 pg/ml. Konkrétně byly syntetizovány: peptid nazvaný 7E11-9.5 se sekvencí

LYANPGMYSRLHSPA (SEQ ID NO: 20) a peptid o sekvenci GMYSRLHSPA (SEQ ID NO: 21).

Nejprve byl testován na schopnost vazby na monoklonální protilátku 7E11-C5 mimetopový peptid 7E11-9.5. 96 jamkové destičky (Immunlon 4, Dynatech, Alexandria, VA) byly potaženy 50 pl roztoku io mimetopového peptidú 7E11-9.5 o koncentraci 5 pg/mi a inkubovány při pokojové teplotě přes noc. Po inkubaci byly jamky promyty čtyřikrát 1 % BSA v PBS. Bylo připraveno sériové ředění biotinylované monoklonální protilátky 7E11-C5 počínaje koncentrací 29 pg/ml a do jamek pokrytých mimetopovým peptidem byla přidána různá množství této monoklonální protilátky. Po inkubaci 1 hodina při pokojové teplotě byly jamky promyty čtyřikrát 1 % BSA v PBS a dvakrát PBS. Potom bylo do každé jamky přidáno 100 pl enzymu Extravidin-Alkaline Phosphatase (4250 jednotek/ml, Sigma, St. Louis, MO) v ředění 1 : 2000 v PBS. Po 1 hodině byla destička opět promyta čtyřikrát PBS a do každé jamky bylo přidáno 100 pl roztoku substrátu enzymu pnitrofenylfosfátu o koncentraci 1 mg/ml. Destička byla ponechána 15 min až 1 hodinu pro vyvinutí barvy a při 405 nm byla odečítána absorbance. Výsledky ukazuje obr. 2. Z obr. 2 je vidět, že se monoklonální protilátka 7E11-C5 váže na syntetizovaný mimetop

7E11-9.5 v závislosti na koncentraci.

Potom byl mimetopový peptid použit pro izolaci abtidů z peptidové knihovny. 50 až 100 pl roztoku tohoto peptidú bylo použito pro potažení jamek 96 jamkové destičky, jamky byly blokovány 0,5 % BSA v PBS a potom použity pro screening. Pro počáteční screening

3o byl použit aiikvot náhodné fágové knihovny TSAR-9 (obsahující přibližně 3 x 10¹° částic fága) a byly provedeny 4 cykly tohoto

-62 screeningu. Po prvních dvou cyklech byl fág amplifikován. Potom byly provedeny dva další cykly. Tímto postupem byl z knihovny TSAR-9 izolován fág, který exprimoval peptidy schopné vazby na mimetopový peptid 7E11-9.5. Peptidy obsahující vazebné domény těchto fágů jsou abtidy a bylo zjištěno, že napodobují vazebné specificity monoklonální protilátky 7E11-C5. Tyto abtidy se označují jako „abtidy 7E11-C5“.

U fága kódujícího abtidy 7E11-C5 bylo provedeno sekvenování DNA sekvencí nukleotidů, kódujících vazebné peptidy fágů, aby byly získány DNA a aminokyselinové sekvence abtidů 7E11-C5. Tabulka 2 ukazuje sekvenci aminokyselin pěti abtidů 7E11-C5, které měly relativně vysokou afinitu k mimetopu.

Tabulka 2

Klon Sekvence

GIINANDPLPFWFMSPYTPGPAPIDINASRALVSNESG 17 DLSRNLDFGRFLLYNAYVPGFTPTFISLTAEHLSSPKG

CGRAYCLSGNYNIFGALFPGVSTPYADVGHDDAQSWRR 13 RCSPrWGISYPFGLLSSNPGVCHSSDAETNIRNDILTT

GHSNYCFVSTLGMPIVGFPSINARGLIHYGGSDPRLAA

Aminokyselinová sekvence ukázaná v tabulce 2 pro klon 14 je SEQ ID NO: 1. Aminokyselinová sekvence pro klon 17 je SEQ ID NO: 2, aminokyselinová sekvence pro klon 15 je SEQ ID NO: 3, aminokyselinová sekvence pro klon 13 je SEQ ID NO: 4 a aminokyselinová sekvence pro klon 16 je SEQ ID NO: 5.

Bylo zajímavé zjistit, zda by mohl existovat nějaký strukturální základ pro podobnost vazebných charakteristik mezi monoklonální protilátkou 7E11-C5 a abtidy 7E11-C5. Aminokyselinové sekvence oblastí určujících komplementaritu (CDR) monoklonální protilátky

-63 7E11-C5 byly určeny sekvenováním klonů cDNA genů, kódujících variabilní oblasti protilátky. CDR jsou odpovědné za specifickou vazbu monoklonální protilátky 7E11-C5 na její antigen. Obr. 3 ukazuje porovnání sekvencí aminokyselin abtidů z tabulky 2 a částí sekvencí aminokyselin některých CDR monoklonální protilátky 7E11-C5. Překvapivě je vidět, že existují podobnosti v sekvencích těchto abtidů a sekvencí CDR monoklonální protilátky.

6.1,2. Charakterizace abtidů 7E11-C5 io Abtidy 7E11-C5 byly testovány na svou schopnost vazby na mimetopy 7E11-C5, které byly použity jako cílové ligandy ve výše popsaném druhém kroku screeningu. Byly určeny sekvence DNA oblastí fága DNA, kódující abtidy. To umožnilo určení aminokyselinových sekvencí abtidů. Na základě těchto určených is aminokyselinových sekvencí byly připraveny syntetické peptidy, které těmto sekvencím odpovídaly. Syntetické peptidy (abtidy 7E11-C5) měly délku 38 aminokyselin.

6.1.2.1 Tečkovací blotovací reakce s použitím abtidů 7E11-C5

V některých případech byly tyto abtidy použity v tečkovacím blotovacím (dot blot) experimentu. V těchto případech bylo na nitrocelulózové (0,2 pm nebo 0,45 pm, Schleicher & Schuell, Keene, NH) proužky nebo kotouče kápnuto 1 pl roztoku abtidů o 38 zbytcích s koncentrací 1 mg/1 ml. Po sušení (přibližně půl hodiny) byla nitrocelulóza blokována 1 hodinu v roztoku 1 % BSA v PBS. Nitrocelulóza pak byla ponechána inkubovat v přibližně 5 ml roztoku 7E11-9.5 biotinylovaného mimetopového peptidú (BiotinLYANPGMYSRLHSPA) s koncentrací 0,1 mg/ml. Tento mimetopový peptid byl jeden z peptidú popsaných v části 1. 1 výše, které byly

3o syntetizovány na základě devíti peptidú, identifikovaných při

-64• 99 • 9 · 9

• ·· · screeningu podle části 1. 1 výše. Po jedné hodině byla nitrocelulóza přibližně pětkrát omyta roztokem 1 % BSA v PBS. Potom byla přidána fosfatáza Extravidin-Alkaline Phosphatase (4250 jednotek/ml, Sigma, St. Louis, MO) v ředění 1 : 2000 v PBS a ponechána inkubovat 1 hodinu a potom byla nitrocelulóza opět důkladně promyta. Nakonec byl přidán jako substrát roztok 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfátu (0,15 mg/ml) a nitro tetrazolinová modř (0,3 mg/mi, Sigma, St. Louis, MO) (BCIP/NBT). Roztok byl ponechán pro vyvinutí barvy a byla odečtena absorbance při 405 nm.

io Příklad takové dot blot reakce je ukázán v obr. 4. V obr. 4 byly testovány abtidy 7E1-C5, známé jako klony 14, 17, 15, 16 a 13 na svou schopnost vázat biotinylovaný mimetopový peptid 7E11-9.5. Jako pozitivní kontrola byla testována také monoklonální protilátka 7E11-C5. V obr. 4 byla 7E11-C5 kápnuta do oblasti označené 351.

Obr. 4. ukazuje, že alespoň tři z abtidů (klon 14, 17 a 15) se na mimetop váží. To ukazuje, že tyto abtidy jsou schopny napodobit specifickou vazbu, kterou vykazuje monoklonální protilátka 7E11-C5.

6.1.2.2 Abtidy 7E11-C5 namísto protilátek při imunologických testech

2o Schopnost syntetizovaných abtidů s aminokyselinovou sekvencí kódovanou náhodnými inzerty fága, který se váže na mimetop 7E119.5, byla dále vyhodnocena testovacími metodami ELISA.

Abtidy 7E11-C5 klon 14 a klon 17 (viz tabulka 2) byly vždy rozpuštěny v 0,1 x PBS za poskytnutí roztoku o koncentraci 5 pg/ml.

Pro pokrytí jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky (Immulon 4, Dynatech, Alexandria, VA) při inkubaci přes noc při 4 °C bylo použito 50 pl každého z těchto roztoků. Po inkubaci byly roztoky abtidů odstraněny a jamky byly blokovány 200 μΙ roztoku 1 % BSA v PBS. Mimetopové peptidy 7E11-9.5 (LYANPGMYSRLHSPA (SEQ ID NO:

20)) a GMYSRLHSPA (SEQ ID NO: 21) byly biotinylovány jak se popisuje v části 6. 4. 1 a rozpuštěny ve vodě za poskytnutí roztoku 1

9« 9999 • · · · 99 999 9 « 9 9 9 9 9 ··· 9999 999 999 99 9

-65 mg/ml. Z těchto roztoků byla připravena sériová ředění 1 : 2, která byla přidána do jamek mikrotitrační destičky, obsahujících navázané abtidy. Po inkubaci 1 hodinu při pokojové teplotě byly jamky čtyřikrát promyty 1 % BSA v PBS. Potom byl do každé jamky přidán enzym

Extravidin-Alkaline Phosphatase (4250 jednotek/ml, Sigma, St. Louis, MO) v ředění 1 : 2000 v PBS a inkubován 1 hodinu pří pokojové teplotě. Po inkubaci byly jamky čtyřikrát promyty 1 % BSA v PBS a potom dvakrát v PBS. Bylo přidáno 100 μΙ roztoku p-nitrofenylfosfátu s koncentrací 1 mg/ml v diethanolaminovém (DEA) pufru (oba io Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) a po inkubaci 15 až 30 min při pokojové teplotě byla odečten při 405 nm absorbance roztoků. Výsledky jsou ukázány v obr. 5.

Obr. 5 ukazuje, že s výjimkou nelineárního efektu při vysokých koncentracích mimetopu je dobrá korelace mezi množstvím mimetopu přidaného do jamek a absorbancí při 405 nm. Použití protilátek v testech, jako je ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) pro měření koncentrace látky je v oboru dobře známa. Pro úspěch takové analýzy je klíčová schopnost protilátek specificky se vázat na své antigeny. Protože abtidy se rovněž specificky vážou na antigeny, bylo zajímavé určit, jestli mohou být abtidy použity na místo protilátek při imunologických testech jako je ELISA apod. pro měření koncentrace látky. Výsledky z obr. 5 ukazují, že abtidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity v testech stejným způsobem jako protilátky.

6.1.2.3 Biotinylace protilátek

Způsoby biotinylace protilátek jsou v oboru dobře známy. Při provedení vynálezu je možno použít jakékoliv vhodné metody. Bylo použito například následujícího postupu:

(1) rozpuštění 10 mg protilátky v 1 ml PBS;

• ··
	• ·	··
• ·	•
• · ·	•
• ·	•
···*··	···	··

• · • · • ·« · ·<

·· ···· (2) přídavek 0,44 mg biotin-LC-NHS (Pierce, Rockford, IL);

(3) inkubace 30 min při pokojové teplotě;

(4) čištění na koloně Superose 12 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

6.1.3. Rozpoznávání antigenu LNCaP abtidy 7E11-C5 a monoklonálními protilátkami 7E11-C5

Monoklonální protilátka 7E11-C5 rozpoznává prostatický specifický mucinový antigen buněčné linie lidského zhoubného nádoru prostaty LNCaP (Horoszewicz a další, 1987, Anticancer Res. 7: 927 io 936). Pro zjištění, zda abtidy 7E11-C5 rozpoznávají a vážou se na nativní antigen byly provedeny následující experimenty: byl proveden sendvičový test s použitím antigenu LNCaP. Jamky mikrotitrační destičky byly potaženy buď monoklonální protilátkou 7E11-C5, klonem 14 abtidů 7E11-C5 nebo BSA jako negativní kontrolou.

Potahování a omývání bylo stejné jako v případě testu popisovaného v části 6.1.2.2. Do jamek bylo přidáno 100 μΙ lyzátu buněk LNCaP. Lyzát LNCaP byl připraven jak se popisuje v publikované PCT přihlášce WO 94/18318 z 18. 8. 1994. Po zachycení lyzátu na destičce bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ roztoku biotinylované monoklonální protilátky 7E11-C5 o koncentraci 5 pg/ml. Po inkubaci stejně jako v části 6.1.2.2 byl do každé jamky přidán enzym Extravidin-Alkaline Phosphatase (4250 jednotek/ml, Sigma, St. Louis, MO) v ředění 1 : 2000 v PBS a inkubován 1 hodinu při pokojové teplotě. Po inkubaci byly jamky čtyřikrát promyty 1 % BSA v PBS a potom dvakrát v PBS.

Bylo přidáno 100 μΙ roztoku p-nitrofenylfosfátu s koncentrací 1 mg/ml v diethanolaminovém (DEA) pufru (oba Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) a po inkubaci 15 až 30 min při pokojové teplotě byla odečten při 405 nm absorbance roztoků. Výsledky jsou ukázány v obr. 6. Obr. 6 ukazuje, že abtid 7E11-C5 je

3o schopen rozpoznat nativní antigen 7E11-C5 u lyzátů LNCaP. To je překvapivé zjištění, které nemohlo být odborníky v oboru předvídáno.

·· ···· gy ··· ···· ··· ··» ·· «

Obecně se předpokládalo, že screening knihovny mimetopem by mohl poskytnout látku, která se na mimetop váže. Bylo však neznámé, zda by se taková látka mohla také navázat na nativní epitop, který napodobuje mimetop. Mimetop by mohl představovat epitop naprázdno ( in a loose fashion), tj. jeho primární struktura by mohla být mírně modifikována; a jeho sekundární struktura nebo faktory ovlivňující účinek mimetopu by mohly být odlišné od těch, které vystupují v nativním epitopu. V takovém případě by látka vážící se na mimetop nebyla pro nativní epitop specifická. Předcházející úvaha se uvádí jako možné vysvětlení a není omezením předkládaného vynálezu.

6.1,4 Použití abtidů 7E11-C5 v biodistribučních studiích

Abtidy 7E11 popsané v oddílu 6.1 a jeho pododdílech byly is použity ve studiích biologické distribuce pro určení jejich schopnosti zaměřit se na xenodraftové tumory lidského karcinomu prostaty

LNCaP, které byly transplantovány myši.

Samci myši SCID (C.B-17/lcr Tac-myš SCID) získané od Fox Chase (Philadelphia, PA) nebo Taconic Farms (Germantown, NY) byli umístěni ve sterilních klecích s filtračními kryty a dostávali podle libosti autoklávovanou stravu pro laboratorní hlodavce (Purina, St. Louis, MO) a filtrovanou vodovodní vodu.

Do levé zadní končetiny myši bylo podkožně injikováno 1 x 10⁷buněk linie LNCaP lidského tumoru prostaty (Horoszewicz a další,

1986, Anticancer Res. 7: 927 - 936). Buňky rostly před sklizní v exponenciální fázi a byly resuspendovány v 0,2 ml sterilního ' fyziologického roztoku. Tumory byly ponechány růst v myši 2 až 3 měsíce před injekcí abtidů.

Pro studie biologické distribuce byly abtidy modifikovány na

3o svých aminokoncích chelatačním činidlem anhydridem kyseliny

-68 • · · · · · • ·

diethylentriaminpentaoctové (DTPA-A) (Sigma, St. Louis, MO). Na počátku bylo rozpuštěno přibližně 2 mg každého abtidu ve vhodném objemu 0,1 % kyseliny octové a potom byl přidán 1 ml 0,1 m hydrogenuhličitanu sodného pH 8,0. 2 mg DTPA-A bylo suspendováno ve 100 μΙ dimethylsulfoxidu (DMSO) a k této suspenzi bylo přidáno 10 μΙ abtidu. Po pětiminutové inkubaci při pokojové teplotě byla suspenze filtrována filtry na vzorky 0,2 pm z polyvinylidendifluoridu (PVDF) (Acrodisc, Gelman Sciences, Inc., Ann Arbor, Ml) a čištěna s použitím FPLC kolony Superose-12 (Pharmacia Piscataway, NJ) s PBS jako io mobilní fází. Modifikované peptidy byly skladovány ve zmraženém stavu při - 20 °C nebo - 70 °C.

Abtidy modifikované DTPA byly označeny ¹¹¹lnCI2 následujícím způsobem. 3,7 χ 10⁶ až 18,5 χ 10^{6 111}lnCI2 (Amersham, Chicago, IL) bylo nejprve neutralizováno přídavkem stejného objemu 0,1 m NaOAc a potom bylo přidáno 100 až 200 pg abtidu modifikovaného DTPA-A. Po inkubaci 0,5 hod byl značený peptid čištěn s použitím FPLC kolony Superose 12 (Pharmacia Piscataway, NJ) s PBS jako mobilní fází. Značené frakce byly jímány jímačem frakcí. Zkumavky obsahující označený peptid byly spojeny a použity pro přípravu stříkaček pro injekce myším.

V jednom experimentu Byl dvěma skupinám myší s měřitelnými xenodrafty LNCaP intravenózně injikován abtidový klon 14 - DPTA¹¹¹ In (viz tabulka 2). Bylo použito přibližně 0,2 ml roztoku radioaktivně značeného abtidu 10 mg/ml ve fyziologickém roztoku. Specifická aktivita abtidu byla přibližně 1,18 MBq/pg. Celková injikovaná dávka radioaktivity byla přibližně 120 až 140 χ 10⁶ cpm.

První skupina myší byla usmrcena 2 hodiny po injekci abtidu a tkáně byly vyjmuty pro analýzu. Druhá skupina byla usmrcena 4 hodiny po injekci. Vyjmuté tkáně byly zváženy a množství ¹¹¹ln v nich bylo určeno gama čítačem. Počty impulzů za minutu (cpm) na gram každé tkáně byly vypočteny dělením zjištěného cpm ¹¹¹ In nalezeného v _ _ v w w w v * v » w w * W V * * *

- 69 tkáni a hmotnosti tkáně v gramech. Data se uvádějí jako poměr cpm/g v každém orgánu k cpm/g v krvi (poměr orgán : krev). Byly zjištěny poměry, které jsou ukázány v tabulce 3 a obr. 7.

• · ··· ·

Tabulka 3

Biodistribuce abtidového klonu 14-DPTA-¹¹¹ln u myši LNCaP s xenodraftem

Skupina 1^a	Skupina 2^b
Tkáň^c	AVG	s.e.m.	AVG	s.e.m.
Krev	1,00	0,00	1,00	0,00
Plíce	0,81	0,04	1,06	0,26
Slezina	0,83	0,16	1,42	0,74
Játra	0,95	0,04	2,12	0,69
Ledvina-P	55,85	10,22	171,73	77,97
Ledvina-L	53,03	11,97	182,79	86,38
Tumor	1,85	0,80	3,91	2,85
Sval	0,33	0,03	0,42	0,01
Testes-P	0,54	0,02	0,94	0,25
Testes-L	0,68	0,24	0,88	0,24

³ Skupina 1: usmrceny ve 2. hod; n = 2 ^b Skupina 2: usmrceny ve 4. hod; n = 2 io ^c Udaná hodnota je poměr orgán : krev

Tabulka 3 a obrázek 7 ukazují, že s výjimkou ledviny je nejvyšší poměr orgán ; krev nalezen v tumoru, a to jak 2 hodiny, tak i 4 hodiny po injekci abtidu. Tento výsledek ukazuje, že abtidy s vazebnou specificitou protilátek, tj. specifické pro tumorové antigeny, mohou být použity pro lokalizaci těchto tumorů.

U žádného netumorového orgánu kromě ledviny nedošlo k neobvyklé lokalizaci abtidu. Poměr pro ledvinu je extrémně vysoký pro • 4 • · 4 4 4 4

-70 dobře známou tendenci indikovaných peptidu vyskytovat se v ledvinách před vyloučením z organismu.

V dalším experimentu byl intravenózně injikován čtyřem myším SCID nesoucím měřitelné xenodrafty LNCaP abtidový klon 17-DPTA5 ¹¹¹ln (viz tabulka 2). Podání xenodraftů probíhalo stejně, jak je uvedeno výše. Bylo ínjikováno přibližně 0,2 ml roztoku 0,1 pg/ml roztoku radioaktivně značeného abtidu klonu 17 ve sterilním fyziologickém roztoku. Specifická aktivita abtidu byla přibližně 8,8 x 10⁴ Bq/ng. Celková injikovaná dávka radioaktivity byla tedy přibližně io 100 až 110 x 10® cpm.

V tomto experimentu byly myši usmrceny ve druhé nebo páté hodině po injekci značeného abtidu. Stejně jako výše jsou data uváděna jako poměry orgán : krev. Jak je ukázáno v tabulce 4 a obrázku 8, abtidový kion 17-DPTA-¹¹¹ln se lokalizoval u myši do is LNCaP xenodraftových tumorů.

Tabulka 4

Biodistribuce	abtidového	klonu 17-DPTA-¹¹¹ln	u mvši LNCaP
s xenodraftem	Skupina 1 Myš č.		Skupina 2 Myš č.
Tkáň³	1	6	2	3
Krev	1,00	1,00	1,00	1,00
Plíce	2,52	2,57	4,33	2,47
Slezina	5,82	3,00	5,53	3,70
Játra-S	5,42	5,58	8,37	4,03
Ledvina P	235,63	234,88	321,09	106,74
Ledvina-L	563,71	220,69	424,64	104,09

·· 4444

	- 71 -	• 4· 44 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4444444 ·	4 444444 4 4 · 4 · 4 4 4 4 4 4 4444 4 4 4 4444 44 4
Tumor-S 10,60	15,01	8,36	2,90
Sval 0,93	2,96	1,16	3,04
Testes-P 2,71	2,19	2,31	3,15
Testes-L 1,64	1,14	5,36	3,41
^a Udaná hodnota je poměr orgán : krev
Tabulka 4 a obrázek	8 ukazuje	podobně jako	tabulka 3 a

obrázek 7, že injikovaný abtid se lokalizoval do tumoru. Tím se ukázalo, že abtidy mohou být použitelné při lokalizaci tumorů.

Narozdíl od výsledků výše popsaných dvou experimentů, ve kterých se radioaktivně značené abtidy lokalizovaly do tumorů, při provedení stejných experimentů s radioaktivně značenou kontrolou (neabtidový peptid, tripeptid GYK-DPTA) nebyla pozorována specifická lokalizace do tumorů. To je vidět v obrázku 9, který ukazuje výsledky biologické distribuce pro experimenty s použitím kontrolního peptidu značeného ¹¹¹ln.

Radioaktivně značený peptidový konjugát GYK-DPTA-¹¹¹ln byl intravenózně injikován pěti myším SCID s měřitelnými LNCaP xenodrafty. Vyjmutí orgánů bylo provedeno 2 hod (n = 2) a 5 hod (n = 3) po injekci 1,5 pg kontrolního peptidu o specifické aktivitě 1,11 MBq/pg. Poměry orgán : krev jsou uvedeny v tabulce 5 a obrázku 9. Je vidět, že kontrolní peptid není do tumoru selektivně lokalizován. Zatímco poměr tumor: krev u jedné myši byl 3,26, kontrolní peptid byl distribuován stejně dobře do jiných orgánů (například plíce 3,52, slezina 3,27, játra 2,7 apod.). Tyto výsledky ukazují, že u těchto orgánů existuje nespecifické zachytávání kontrolního peptidu. Zatímco abtidový klon 14-DPTA-¹¹¹ln vykázal poměr tumor : krev po dvou hodinách pouze 1,85 (což se zdá méně než výsledek získaný pro kontrolní peptid), klon 14-DPTA-¹¹¹ln se vyznačoval specifickou ·· 9999 lokalizací k tumoru, protože poměry orgán : krev u jiných orgánů byly mnohem nižší (například plíce 0,81, slezina 0,83, játra 0,95 apod.).

-72Tabulka 5

Biodistribuce GYK-DPTA-¹¹¹ln u myši LNCaP s xenodraftem

	Skupina 1		Skupina 2
	Myš č.		Myš č.
Orgán/krev	1	2	3	4	5
Krev	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
Plíce	2,96	3,52	0,95	2,84	2,39
Slezina	1,74	3,27	0,97	2,21	4,04
Játra-S	31,79	21,70	21,56	25,38	17,78
Ledvina-P	563,87	406,27	273,82	509,53	269,30
Ledvina-L	584,69	417,98	297,65	433,97	280,50
Tumor-S	1,14	3,26	0,86	1,68	1,87
Sval	1,04	1,02	0,29	4,34	2,51
Testes-P	603,01	58,49	0,82	2,05	2,25
Testes-L	44,65	2,08	0,93	2,11	2,32

6.2. Vazba abtidů na antigen karcinomu prsu

6.2.1 Identifikace a izolace abtidů. které se váží na polymorfní io epiteliální mucin (PEM)

Ukázalo se, že monoklonální protilátka SM-3, která se specificky váže na tumorový antigen polymorfního epiteliálního mucinu (PEM), který se nalézá na lidských buňkách zhoubného bujení prsu, je • · · ··· · · · · · · · · ·· ···· specifická pro epitop, definovaný sekvencí aminokyselin VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 9) (Bruchell a další, 1989, Int. J. Cancer 44: 691 - 696). Peptid obsahující tuto sekvenci byl syntetizován a použit pro izolaci abtidů z peptidových knihoven TSAR analogickými způsoby jak bylo popsáno výše. V těchto experimentech byly specifickými použitými knihovnami TSAR knihovny R26, D38 a DC43. Popis těchto knihoven je uveden na obrázcích 10 až 12. Fágy navázané na PEM byly eluovány buď standardními metodami kyselé eluce, metodami kyselé eluce za přísných io (stringent) podmínek, kdy fágy byly inkubován s peptidem PEM pouze 10 min před krokem praní a eluce, nebo s použitím přebytku peptidu PEM. Byly izolovány takové fágy z každé knihovny, které exprimují peptidy schopné vazby na PEM. Aminokyselinové sekvence fágů vázajících se na PEM jsou ukázány v tabulce 6.

··· ·· ····

-74 Tabulka 6

Sekvence fágů vázajících se na PEM

Kysele eluovaná knihovna R26

A15

A54

A5

A39

A16

SFMDYFFHTPEPKPAGYPNAYTDPKHPA SSSIFDYAPFSWGSAGLSNSSINVFERS SASLWDALGGWTTSAVPSYPRPHQTPGR SLGLPWIDVFGRSSAEPWPFGRTNLPRS SVHGAFLDSFFPWAADGPHGRGRL-TSF (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 28) (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 30)

Knihovna DC43

MA-8 EEKQGGRWSTMMPRPWCHEGGCGFLYYDAMTKPKTPPIMRTAA (SEQ ID

NO: 31)

MA-21 LPRPFDDASWKLRAVKESPDGCGFGSPLLFPPYSGLPTFSSCD (SEQ ID

NO: 32)

V22 GSFESARGVTCIGNHSIGAHGCGPLRSYASFNRGSGRRH (SEQ ID

NO: 33)

Knihovna D38

MA-32 DQIGSRPQTTSRSISGSWWENAKTLWQQDYAFSAPNAA (SEQ ID NO: 34)

V23 LSDAWGNFTTSYRDSAGFPSHAMTTSQGGKRNHASRFP (SEQ ID

NO: 35)

V21 VQLDDTSPRASGQETSQSEYDARPLLSKFAIPRPWSR (SEQ ID NO: 36)

VI IDSSKNRISGTGYLSFPHIRHANRRHMADDSNLAPGPS (SEQ ID

NO: 37)

4 4 4 4 4

4« 4 « ·· 44 · · « « 4 4 4 4 4 4 «4 4 444444

4 4 4 4 4

444 «444 «4« «4« «4 4

- 75 Tabulka 6 (pokračování)

Kyselá „přísná“ eluce knihovny DC43

V44	WSIGTHTGPEGKFRIPCDRSGCGGTTLTHGGLNSSPTGQHERP NO: 38)	(SEQ	ID
V39	DPCEDGYWLSSVGRAGASIRGCGAIRRSSRTLTAEYSTRASNH NO: 39)	(SEQ	ID
VI0	GSKRSCWGTTISNYFRPVPEGCGSASSINPNTNTGRLPSLHRQ NO: 40)	(SEQ	ID
V7	SSASSGCLGRAEHLDLDSVWGCGSQADMSRRYSPWYGRPRTGV NO: 41)	(SEQ	ID
V4	NVMWSSSKAGIRDCSQVPPGGCGPVNRHRASPPLTPFRHGSIR NO: 42)	(SEQ	ID

Knihovna D38

V45	PLTSGSSSEYRNRDDCPVYKYATNCPRLNFSPSRYSPF NO: 43)	(SEQ	ID
V32	GDAYGGIFSRPRQGLADSYIHASYTGKHFFRGPRPPTR NO: 44)	(SEQ	ID
V27	STCIGAEGEWKSFHNFLQCRDATSTSSSTLDPTALRFG NO: 45)	(SEQ	ID
V40	YSATLWDQFGSRQVELWSNRHASSALPFASRASVLGSR 1 NO: 46)	(SEQ	ID

Peptidem eluovaná knihovna R26

P24 ILGWPFLTGIiGDSTVHPRGRKGTDPS (SEQ ID NO: 47)

P49	SIPSFSMWLNQLGSAALPSKGNSQDRSD	(SEQ	ID	NO:	48)
P2S	SRDDIFTGGPLVLFRGSKTSNHDVHSMR	(SEQ	ID	NO:	49)
PS	RAELVNWYEWFHVTAEAETPVINSHNMT	(SEQ	ID	NO:	50)

4»

· 4 ·· · • · · • · 4 · • · · ··· 4444 444 4

- 76 Tabulka 6 (pokračování)

Knihovna DC43 ·· ····

MP-1	GAPVWRGNPRWRGPGGFKWPGCGNGPMCNTFTPARGGSRNNGP NO: 51)	(SEQ	ID
MP-2	GSASSCFPNFTARGVTVGFFGCGSPAHPAAPRVLNPATDFPAP NO: 52)	(SEQ	ID
MP-22	VFRRTARSSRPIGATVFPWYGCGNSNDETLPHHDSPPSFFLGA NO: 53)	(SEQ	ID
MA-13	NTCWTDLFWHGLPGGDLPRDGCGLPSELTTHPSRERRDASEN	(SEQ ID

NO: 54)

Knihovna D38

MP-20 IDWNWLERGQHNRGYLHSFPDAKSQPTRGPRVAPNGND (SEQ ID

NO: 55)

MP-30 GRGSDMREHWPWSMPLILDQHANDPSPRAQSHYYSHPF (SEQ ID

NO: 56)

6.2.2 Saturační mutageneze MP-1 a identifikace dalších abtidů vázajících se na PEM

Byla zkonstruována knihovna získaná saturační mutagenezí založená na jednom z abtidů PEM, MP-1. Byly syntetizovány sekvence nukleotidů kódující abtid MP-1 s použitím schémata dopování, podobného schématu popsanému v úseku 5. 3, kde byl každý nukleotid kontaminován 9 % každého z dalších tří nukleotidů (například G = 73 % G, 9 % A, 9 % T a 9 % C). Výsledné mutagenní oligonukleotidy byly použity pro konstrukci knihovny výše popsanými ío metodami knihovny TSAR (viz obr. 13).

Byl proveden screening získané knihovny pro identifikaci fága, exprimujícího abtidy schopné vazby na PEM. Vazba izolovaných fágů na PEM byla potvrzena testem ELISA. Fágy, které se vázaly na PEM i fágy, které se nevázaly na PEM byly sekvenovány pro určení is sekvence aminokyselin exprimovaných abtidů. Tabulka 7 ukazuje aminokyselinové sekvence těchto vazebně pozitivních a negativních fágů.

• ···

Tabulka 7

Porovnání sekvence: vazebný motiv MP-1

Pozitivní vazebné sekvence

MPl G2kPVWRGNPRWRGPGGFKWPGCGNGPMCNTFTPARGGSRNNGP (SEQ ID NO: 51) E4 VSTGWSGTPRWCAPGGKQGSGCGNGPRWTTLTPDLGGTRKYGP (SEQ ID NO: 57) E7 GAPLWCEKLSGTGSGGFKWPGCGSGPTYNTFTPARVGSDNKWP (SEQ ID NO: 58) El 6 GPPVWSAKSRWTGTGVLNWPGCGKVPSCSTYTPSRDRSRKSDP (SEQ ID NO: 59) E21 GSALLTSXGCVRGPGGLMRPGCGNDRLGKSSTYAHGGWIKTGP (SEQ ID NO: SO) E33 GSPVWSGDNRWRGSSPLKRPGCGNGAKCNTLKDNRKDSRKTKH (SEQ ID NO: 51) ₁₀ E44 G PLLPGEAAVHGARGLMRSGCGNGPTWNRLTAACRDSRNKGP (SEQ ID NO: 52)

E65 GSPVWMGSTRWTGHGWFRSQGCGNVPRTNSCAPAGKDSQNKGP (SEQ ID NO: 63) E73 GAPVWRGNRWCSDNGELERPGCGYGPRFNILPPGRGNSRKPSP (SEQ ID NO: 64) E84 GSSGWKVKHRCGGPGTLQRPGCGNLPLGHTFPPTRGGSHMEGA (SEQ ID NO: 65) E85 GPRSWMGQPRGSDAGSCKWAGCGDAPMWRASTPGHGGPPNRGS (SEQ ID NO: 66) E88 EALVCRGXPPWSGPAGLLWQGCGTGPVSRTFTSAQGRSRNKTS (SEQ ID NO: 67)

E90 GAPWGDILWCSGARGAKWPGCGKGPTNKTFSHSRGGTQKSGL (SEQ ID NO: 68)

Ξ22 GAPVSRCXPACGGFWGVNWPGCGNASMCKTFTNGHGVSSDNGH (SEQ ID NO: 69) E29 GAHGYKNGSTCTGLGGWRCRGCGKGAMCNNPSPAGGAYHNQGP (SEQ ID NO: 70) E62 G PQGSEHQCCSGHWGLKFPGCGNGPICNNFTALRGASRKNGP (SEQ ID NO: 71) E64 GEPVWCRHSGGRVQGGLDWLGCGDGPLRYTVTPARGGPSKHGP (SEQ ID NO: 72) E66 GLSLVRGDSWGSGAGGWKRHGCGHGPMYNPQTPARGGSCTRNT (SEQ ID NO: 73)

E67 VSRAWSGXPRLMGSHGLNCPGCGKGHSGIMFIPDPAGSANTPP (SEQ ID NO: 74)

E68 CAPMWSGKPPWCVGGGVKFRGCGNRPĎCNIITPRLVESRDKAL (SEQ ID NO: 75) E70 ADPVCSRKPDGGGLRGLRWPGCGKGPILYNVTAARGGSRNNGP (SEQ ID NO: 76)

Negativní vazebné sekvence

MPI GAPVWRGNPRWRGPGGFKWPGCGNGPMCNTFTPARGGSRNNGP (SEQ ID NO: 51) E3 GTRVPPGFALRGGRDGLSWAGCGKAPISKTYTSARGRSRKKGS (SEQ ID NO: 77) E15 RSAVSEGXPREIVPGGCMWPGCGNGRKSNTLTHGPEQFQEIEP (SEQ ID NO: 78) E24 SSGVGNGXPRSWAPDALNGGCGNIQFANTITPDRGGSCNQTL (SEQ ID NO: 79) E27 GSSVCGGQPSGRGFGGLPGPGCGNGPTSNTLTSARGGFPNKGL (SEQ ID NO: 30) E37 GAPLWQGDPADEVLGGSMIPGCGIGALSQTFTPTPGGSRKNVT (SEQ ID NO: 81) E43 AGRELRQDEGEGGAGADVARLREGPICSTFTPARGGSCPSGL (SEQ ID NO: 82) E49 QARVSMA.ISCRSGPSDLMHQGCGYGPRCNPDTTDSGGSHTNTP (SEQ ID NO: 83) E60 GDPECRGKPRGRWTGSLACTGCGNGPNSKICTRARGVSRNKGP (SEQ ID NO: 84) E72 STPGCSGYSGSGDPRCLTCTACGNGHTRKTLTPAHGRSTHKEP (SEQ ID NO: 85) E34 GQPECRITSGCCGTDGNXWLGCGKVDMCNTLNPAVGCHGTNGS (SEQ ID NO: 86) E83 REPWGGKPWCRGPGGLRWRGCGKSQFDKIITLSRDNRRDKRP (SEQ ID NO: 87)

Při porovnání sekvencí uvedených v tabulce 7 (viz zvláště zbytky aminokyselin vytištěné tučně) je možné určit vliv jednotlivých aminokyselinových zbytků ve specifických polohách uvnitř sekvence na schopnost vazby peptidu na PEM. Abtidy, které se vážou na PEM je možno charakterizovat vzorcem:

R1R2R3R4R5R6R7R8R9R9R10R11R12R13R14R15R16R17R18R19R20R21R22R23R24 R25R26R27R28R29R30R31R32R33R34R35R36R37R38R39R40R41R42R43 (SEQ ID NO: 88) kde

R1 = G, C, E, nebo V, s výhodou G;

R₂ = A, S, P, nebo L, s výhodou A;

R₃ = P, T, H, nebo L, s výhodou P;

R₄ = L, M, Q, G, A, nebo S;

R₅ = W nebo Y, s výhodou W;

R₆ = S, C, K nebo T, s výhodou S;

R₇ = E, S, C, D, V, nebo R;

R₈ = N, Η, K, S, nebo E;

R₉ = L, H, R, N, Q, T, nebo G;

R₁₀= W, P, R, T, nebo D, s výhodou W;

Rn= W, C, V, L, nebo G, s výhodou W;

Ri2= S, T, M, nebo H, s výhodou S nebo T;

Ri3⁼ G;

R₁₄,= S, A, G, N, Q, nebo H, s výhodou S;

Ri₅= W, H, G, A, nebo R;

R₁₆= G, T, Ε, P, V, nebo W, s výhodou G;

Ri7= V, F, W, K, nebo A;

Ris= K, Q, D, E, R, nebo L, s výhodou K;

Ri9= R, F, nebo S, s výhodou R;

R₂₀= P, S, I nebo H, s výhodou P;

R21“ G;

·· ··· ·

-80 R22- C;

R23“ G;

R₂4= D, S, T, N, nebo H;

R₂s= G, D, L, nebo R;

R₂6= P nebo S, s výhodou P;

R₂7= M, S, D, I, L, nebo R;

R₂8= G, W, C, L, F, Y, nebo T, s výhodou G nebo W;

R₂9= S, Ν, V, F, H, nebo R;

R₃₀= N, A, S, M, nebo R, s výhodou N;

R₃₁= F, Q, P, nebo V, s výhodou F;

R₃2= S, V, I, K, A, nebo S;

R₃₃ ⁼ P, A, N, nebo Y, s výhodou P;

R₃₄= G, N, nebo L;

R₃₅= K, R, C, Q nebo L, s výhodou K nebo R;

R₃₆= V, K, R, nebo A;

R₃₇= G, D, A, nebo E, s výhodou G;

R38“ S, T, P, Y nebo W; s výhodou S;

R₃₉= R, I, L, P, A nebo S;

R₄o= Ν, K, nebo M, s výhodou N nebo K;

R₄i= S, R, T, E, Q, P, Y nebo H;

R₄₂= G, A, S, D, Ν, P, Y, nebo K, s výhodou G;

R₄₃= P, H nebo A.

Předkládaný vynález není omezen rozsahem popsaných zvláštních provedení. Odborníkům v oboru budou z předcházejícího popisu a přiložených obrázků zřejmé různé modifikace vynálezu navíc k těm, které jsou v popisu uvedeny. Tyto modifikace mají být v rámci přiložených nároků. Pokud se citují různé publikace, jsou uváděny jako reference ve svém celku.

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Molekula obsahující peptid, který se váže na danou látku,

5 identifikovaný způsobem, zahrnujícím:

(a) screening první knihovny náhodných peptidú prvním ligandem, přičemž uvedený první ligand je specifickým vazebným partnerem uvedené dané látky, pro identifikaci prvního peptidu, který se specificky váže na první ligand; a io (b) screening druhé knihovny náhodných peptidú druhým ligandem, obsahujícím uvedený první peptid identifikovaný v kroku (a) pro identifikaci druhého peptidu, který se váže na uvedený druhý ligand a který se váže na uvedenou danou látku.

2. Molekula obsahující peptid, který se váže na daný antigen, kde uvedený peptid je identifikován způsobem zahrnujícím:

(a) screening první knihovny náhodných peptidú protilátkou nebo jejím derivátem vázajícím se na antigen, která se

2o specificky váže na daný antigen, pro identifikaci prvního peptidu, který se specificky váže na uvedenou protilátku nebo její derivát vázající se na antigen; a (b) screening druhé knihovny náhodných peptidú sloučeninou obsahující uvedený první peptid identifikovaný v kroku (a) pro

25 identifikaci druhého peptidu, který se váže na uvedenou sloučeninu a který se váže na uvedený daný antigen.

·· ····

-82 3. Molekula podle nároku 2, kde uvedená první knihovna náhodných peptidu se liší od druhé knihovny náhodných peptidu.

5 4. Molekula podle nároku 2, kde uvedená první knihovna náhodných peptidu je stejná, jako uvedená druhá knihovna náhodných peptidu.

5. Molekula podle nároku 1, kde uvedený způsob dále zahrnuje ío porovnání sekvencí většího množství různých prvních peptidú identifikovaných jako vázající se na uvedený první ligand v kroku (a) pro identifikaci shodných vazebných sekvencí, ve kterých uvedený druhý ligand kroku (b) obsahuje uvedenou shodnou vazebnou sekvenci.

6. Molekula podle nároku 2, kde uvedený způsob dále zahrnuje porovnání sekvencí většího množství různých prvních peptidú identifikovaných jako vázající se na uvedenou protilátku nebo její derivát vázající se na antigen v kroku (a) pro identifikaci

2o shodných vazebných sekvencí, ve kterých uvedená sloučenina z kroku (b) obsahuje uvedenou shodnou vazebnou sekvenci.

7. Molekula podle nároku 1, kde první ligand zahrnuje receptor.

25 8. Molekula podle nároku 2, kde protilátkou je monoklonální protilátka 7E11-C5.

9. Molekula podle nároku 1, kde knihovna z kroku (a) nebo kroku (b) je knihovna rekombinantních vektorů, které exprimují větší • · · · · ·

- 83 množství heterofunkčních fúzních proteinů, přičemž uvedené fúzní proteiny obsahují vazebnou doménu kódovanou oligonukleotidem, obsahujícím náhodné nukleotidy, kde náhodné nukleotidy jsou uspořádány v jedné nebo více

5 následných sekvencích, kde celkový počet náhodných nukleotidů je větší než nebo roven přibližně 15 a menší než nebo roven přibližně 600.

10. Molekula podle nároku 2, kde knihovna podle kroku (a) nebo io kroku (b) je knihovna rekombinantních vektorů, které exprimují větší počet heterofunkčních fúzních proteinů, kde uvedené fúzní proteiny obsahují vazebnou doménu kódovanou oligonukleotidem obsahujícím náhodné nukleotidy, přičemž náhodné nukleotidy jsou uspořádány v jedné nebo více

15 následných sekvencích, kde celkové množství náhodných nukleotidů je větší než nebo rovno přibližně 15 a menší než nebo rovno přibližně 600.

11. Molekula podle nároku 1, ve které knihovnou z kroku (a) nebo

2o kroku (b) je chemicky syntetizovaná knihovna.

12. Molekula, obsahující sekvenci aminokyselin, zvolenou ze skupiny sestávající z:

GIINANDPLPFWFMSPYTPGPAPIDINASRALVSNESG (SEQ ID NO: 1) , CGRAYCL S GNYNIFGALFPGVS T PYADVGHDDAQSWRR (SEQ ID NO: 3) , DLSRNLDFGRFLLYNAYVPGFTPTFISLTAEHLSSPKG (SEQ ID NO: 2) , RCSPIWGISYPFGLLSSNPGVCHSSDAETNIRNDILTT (SEQ ID NO: 4) , 3 GHSNYCFVSTLGMPIVGFPSINARGLIHYGGSDPRLAA (SEQ ID NO: 5);

30 nebo její vazebnou část.

·· ···· • ·

-84 13. Peptid, jehož sekvence aminokyselin sestává ze sekvence, zvolené ze skupiny sestávající z:

GIINANDPLPFWFMSPYTPGPAPIDINASRALVSNESG (SEQ ID NO: 1) CGRAYCL SGNYNIFGALFPGVS T PYADVGHDDAQSWRR (SEQ ID NO: 3) DLSRNLDFGRFLLYNAYVPGFTPTFISLTAEHLSSPKG (SEQ ID NO: 2) RCSPIWGISYPFGLLSSNPGVCHSSDAETNIRNDILTT a (SEQ ID NO: 4) Cl GHSNYCFVSTLGMPIVGFPSINARGLIHYGGSDPRLAA (SEQ ID NO: 5)

10 nebo její vazebné části.

14. Způsob identifikace peptidů, vázajícího se na danou látku, který zahrnuje:

(a) screening první knihovny náhodných peptidů ligandem,

15 přičemž uvedený ligand je specifickým vazebným partnerem uvedené dané látky, pro identifikaci prvního peptidů, který se specificky váže na uvedený ligand; a (b) screening druhé knihovny náhodných peptidů sloučeninou, obsahující uvedený první peptid identifikovaný v kroku (a) pro

20 identifikaci druhého peptidů, který se váže na uvedenou sloučeninu a který se váže na uvedenou danou látku.

15. Způsob identifikace peptidů, který se váže na daný antigen, zahrnující:

25 (a) screening první knihovny náhodných peptidů protilátkou nebo jejím derivátem vázajícím se na daný antigen, která se specificky váže na daný antigen, pro identifikaci prvního peptidů, který se specificky váže na uvedenou protilátku nebo její derivát vázající se na antigen; a ·· ····

- 85 (b) screening druhé knihovny náhodných peptidů molekulou obsahující uvedený první peptid identifikovaný v kroku (a) pro identifikaci druhé peptidové sekvence, která se váže na uvedenou molekulu a která se váže na uvedený daný antigen.

16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e uvedená první knihovna náhodných peptidů se liší od druhé knihovny náhodných peptidů.

io 17. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e uvedená první knihovna náhodných peptidů je stejná jako druhá knihovna náhodných peptidů.

18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím,

15 že ligandem je receptor.

19. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e protilátkou je monoklonální protilátka 7E11-C5.

20 20. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e knihovna z kroku (a) nebo kroku (b) je knihovna rekombinantních vektorů, které exprimují větší množství heterofunkčních fúzních proteinů, přičemž uvedené fúzní proteiny obsahují vazebnou doménu kódovanou

25 oligonukieotidem, obsahujícím náhodné nukleotidy, kde náhodné nukleotidy jsou uspořádány v jedné nebo více následných sekvencích, kde celkový počet náhodných nukleotidů je větší než nebo roven přibližně 15 a menší než nebo roven přibližně 600.

·· 4 · · 4

21. Molekula podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e knihovna podle kroku (a) nebo kroku (b) je knihovna rekombinantních vektorů, které exprimují větší počet

5 heterofunkčních fúzních proteinů, kde uvedené fúzní proteiny obsahují vazebnou doménu kódovanou oligonukleotidem obsahujícím náhodné nukleotidy, přičemž náhodné nukleotidy jsou uspořádány v jedné nebo více následných sekvencích, kde celkové množství náhodných nukleotidů je větší než nebo io rovno přibližně 15 a menší než nebo rovno přibližně 600.

22. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e knihovnou z kroku (a) nebo kroku (b) je chemicky syntetizovaná knihovna.

23. Způsob detekce nebo měření daného analytu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) uvedení vzorku do styku s molekulou, obsahující peptid schopný specificky vázat uvedený daný analyt za podmínek,

20 při kterých může nastat specifická vazba mezi uvedenou molekulou a analytem; a (b) detekce nebo měření množství vazby, kde přítomnost nebo množství uvedené vazby indikuje přítomnost, popřípadě množství uvedeného analytu ve vzorku;

25 kde uvedený peptid je identifikován způsobem podle nároku

14.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e uvedená molekula je imobilizována na pevném substrátu.

·· ·*··

8725. Způsob lokalizace tumoru u pacienta, se tím, že zahrnuje:

• · · 9 ·· vyznačující (a) zavedení molekuly, obsahující peptid, který se specificky váže na tumorový antigen do pacienta; a (b) lokalizace molekuly v pacientovi;

kde molekula je označena pro umožnění detekce; a kde uvedený peptid se identifikuje způsobem, zahrnujícím:

(i) screening první knihovny náhodných peptidů protilátkou nebo jejím derivátem vázajícím se na antigen, která se specificky váže na uvedený tumorový antigen, pro identifikaci prvního peptidu, který se specificky váže na uvedenou protilátku nebo jeho derivátu vázajícího se na antigen; a (ii) screening druhé knihovny náhodných peptidů molekulou, obsahující uvedený první peptid, identifikovaný v (i) pro identifikaci druhého peptidu, který se váže na uvedenou molekulu a který se váže na uvedený tumorový antigen.

26. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

25 27. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.

28. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 5 a farmaceuticky přijatelný nosič.

5 29. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 7 a farmaceuticky přijatelný nosič.

30. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující io se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 8 a farmaceuticky přijatelný nosič.

31. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 12 a

15 farmaceuticky přijatelný nosič.

32. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje větší množství molekul podle nároku 1, přičemž peptidové sekvence uvedených molekul jsou odlišné.

33. Molekula obsahující peptid nebo jeho vazebnou část, která se váže k danému ligandu, přičemž peptid se identifikuje způsobem zahrnujícím: screening knihovny náhodných peptidů daným ligandem, kde daný ligand je peptid o délce v rozmezí 5

25 až 40 aminokyselin, pro identifikaci peptidů, který se specificky váže na daný ligand, kde daný ligand se rovněž specificky váže na protilátku nebo receptor.

44 4444 ·· » 4 ·· · 4

- 89 34. Molekula podle nároku 31, kde ligandem je peptid o délce v rozmezí 10 až 20 aminokyselin.

35. Způsob pro získání zobrazení vnitřních struktur subjektu,

5 vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství molekuly podle nároku 1 subjektu, kde uvedená molekula je radioaktivně značena radioaktivním kovem, a záznam scintigrafického obrazu, získaného rozpadem uvedeného radioaktivního kovu.

36. Molekula obsahující peptid vázající se na danou látku, kde uvedený peptid se identifikuje způsobem, zahrnujícím: screening knihovny náhodných peptidů ligandem, kterým je peptid o délce 36 nebo méně aminokyselin, kde ligand je is epitop antigenu, který se specificky váže na protilátku nebo kde ligand představuje část receptorového ligandu, která je odpovědná za specifickou vazbu receptoru na receptorový ligand.

2o 37. Peptid obsahující sekvenci aminokyselin WQGTHF (SEQ ID NO: 23) a sekvenci aminokyselin LVSKNDSG (SEQ ID NO: 24), která se specificky váže na antigen buněk lidského karcinomu prostaty.

25 38. Molekula obsahující sekvenci aminokyselin zvolenou ze skupiny:

SFMDYFFHTPEPKPAGYPNAYTDPKHPA (SEQ ID NO: 26),

SSSIFDYAPFSWGSAGLSNSSINVFERS (SEQ ID NO: 27) ,

SASLWDALGGWTTSAVPSYPRPHQTPGR (SEQ ID NO: 28), ··· ···

SLGLPWIDVFGRSSAEPWPFGRTNLPRS (SEQ ID NO: 29), SVHGAFLDSFFPWAADGPHGRGRLTSF (SEQ ID NO: 30), EEKQGGRWSTMMPRPWCHEGGCGFLYYDAMTKPKTPPIMRTAA (SEQ ID NO: 31),

LPRPFDDASWKLRAVKESPDGCGFGSPLLFPPYSGLPTFSSCD (SEQ ID NO: 32),

GSFESARGVTCIGNHSIGAHGCGPLRSYASFNRGSGRRH (SEQ ID NO: 33),

DQIGSRPQTTSRSISGSWWENAKTLWQQDYAFSAPNAA (SEQ ID NO: 34),

LSDAWGNFTTSYRDSAGFPSHAMTTSQGGKRNHASRFP (SEQ ID NO: 35),

VQLDDTSPRASGQETSQSEYDARPLLSKFAIPRPWSR (SEQ ID NO: 36) ,

IDSSKNRISGTGYLSFPHIRHANRRHMADDSNLAPGPS (SEQ ID NO: 37),

WSIGTHTGPEGKFRIPCDRSGCGGTTLTHGGLNSSPTGQHERP (SEQ ID NO: 38),

DPCEDGYWLSSVGRAGASIRGCGAIRRSSRTLTAEYSTRASNH (SEQ ID NO: 39),

GSKRSCWGTTISNYFRPVPEGCGŠASSINPNTNTGRLPSLHRQ (SEQ ID NO: 40),

SSASSGCLGRAEHLDLDSVWGCGSQADMSRRYSPWYGRPRTGV (SEQ ID NO: 41),

NVMWSSSKAGIRDCSQVPPGGCGPVNRHRASPPLTPFRHGS IR (SEQ ID NO: 42),

PLTSGSSSEYRNRDDCPVYKYATNCPRLNFSPSRYSPF (SEQ ID NO: 43),

GDAYGGIFSRPRQGLADSYIHASYTGKHFFRGPRPPTR (SEQ ID NO: 44),

STCIGAEGEWKSFHNFLQCRDATSTSSSTLDPTALRFG (SEQ ID NO: 45),

YSATLWDQFGSRQVELWSNRHASSALPFASRASVLGSR (SEQ ID NO: 46) ,

ILGWPFLTGLGDSTVHPRGRKGTDPS (SEQ ID NO: 47), SIPSFSMWLNQLGSAALPSKGNSQDRSD (SEQ ID NO: 48), • · · · · ·

- 91 SRDDIFTGGPLVLFRGSKTSNHDVHSMR (SEQ ID NO: 49), RAELVNWYEWFHVTAEAETPVINSHNMT (SEQ ID NO: 50), GAPVWRGNPRWRGPGGFKWPGCGNGPMCNTFTPARGGSRNNGP (SEQ ID NO: 51),

GSASSCFPNFTARGVTVGFFGCGSPAHPAAPRVLNPATDFPAP (SEQ ID NO: 52),

VFRRTARSSRPIGATVFPWYGCGNSNDETLPHHDS P PS FFLGA (SEQ ID NO: 53),

NTCWTDLFWHGLPGGDLPRDGCGLPSELTTHPSRERRDASEN (SEQ ID NO: 54),

IDWNWLERGQHNRGYLHSFPDAKSQPTRGPRVAPNGND (SEQ ID NO: 55) and

GRGSDMREHWPWSMPLILDQHANDPSPRAQSHYYSHPF (SEQ ID NO: 56).

39. Molekula, obsahující sekvenci aminokyselin zvolenou ze skupiny:

VSTGWSGTPRWCAPGGKQGSGCGNGPRWTTLTPDLGGTRKYGP (SEQ ID NO: 57),

GAPLWCEKLSGTGSGGFKWPGCGSGPTYNTFTPARVGSDNKWP (SEQ ID NO: 58),

GPPVWSAKSRWTGTGVLNWPGCGKVPSCSTYTPSRDRSRKSDP (SEQ ID NO: 59),

GSALLTSKGCVRGPGGLMRPGCGNDRLGKSSTYAHGGWIKTGP (SEQ ID NO: 60),

GSPVWSGDNRWRGSSPLKRPGCGNGAKCNTLKDNRKDSRKTKH (SEQ ID NO: 61),

G PLLPGEAAVHGARGLMRSGCGNGPTWNRLTAACRDSRNKGP (SEQ ID NO: 62),

GSPVWMGSTRWTGHGWFRSQGCGNVPRTNSCAPAGKDSQNKGP (SEQ ID NO: 63),

- 92 GAPVWRGNRWCSDNGELERPGCGYGPRFNILPPGRGNSRKPSP (SEQ ID

NO: 64),

GSSGWKVKHRCGGPGTLQRPGCGNLPLGHTFPPTRGGSHMEGA (SEQ ID

NO: 65),

GPRŠWMGQPRGSDAGSCKWAGCGDAPMWRASTPGHGGPPNRGS (SEQ ID NO: 66),

EALVCRGKPPWSGPAGLLWQGCGTGPVSRTFTSAQGRSRNKTS (SEQ ID NO: 67),

GAPWGDILWCSGARGAKWPGCGKGPTNKTFSHSRGGTQKSGL (SEQ ID NO: 68),

GAPVSRCKPACGGFWGVNWPGCGNASMCKTFTNGHGVSSDNGH (SEQ ID NO: 69) ,

GAHGYKNGSTCTGLGGWRCRGCGXGAMCNNPSPAGGAYHNQGP (SEQ ID NO: 70),

G PQGSEHQCCSGHWGLKFPGCGNGPICNNFTALRGASRKNGP (SEQ ID NO: 71) ,

GEPVWCRHSGGRVQGGLDWLGCGDGPLRYTVTPARGGPSKHGP (SEQ ID NO: 72),

GLSLVRGDSWGSGAGGWXHHGCGHGPMYNPQTPARGGSCTRNT (SEQ ID NO: 73),

VSRAWSGKPRLMGSHGLNCPGCGKGHSGIMFIPDPAGSANTPP (SEQ ID 15 NO: 74) ,

CAPMWSGKPPWCVGGGVKFRGCGNRPDCNIITPRLVESRDKAL (SEQ ID NO: 75) and

ADPVCSRKPDGGGLRGLRWPGCGKGPILYNVTAARGGSRNNGP (SEQ ID NO: 76).

40. Molekula, vyznačující se tím, že se váže na daný ligand podle nároku 33, přičemž uvedený ligand obsahuje sekvenci VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 9) nebo její část.

• · · · · ·

41. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu zvolenou ze skupiny molekul podle nároku 38 a farmaceuticky přijatelný nosič.

93 42. Prostředek pro léčení nebo diagnózu, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu zvolenou ze skupiny molekul podle nároku 39 a farmaceuticky přijatelný nosič.

43. Molekula, vyznačující se tím, že se váže na io polymorfní epiteliální mucin, kde uvedená molekula obsahuje sekvenci aminokyselin, představovanou vzorcem:

Ri R2R3R4R5R6R7R8R9R9R10R11R12R13R14R15R16R17R18R19R20R21R 22R23R24R25R26R27R28R29R30R31R32R33R34R35R36R37R38R39R40R41 R42R43 (SEQ ID NO: 88)

15 kde

R1 = G, C, E, nebo V;

R₂ = A, S, P, nebo L;

R₃ = P, T, H, nebo L;

R₄ = L, M, Q, G, A, nebo S;

20 R_s = W nebo Y;

R₆ - S, C, K nebo T;

R₇ = E, S, C, D, V, nebo R;

R₈ = N, Η, K, S, nebo E;

R₉ = L, H, R, N, Q, T, nebo G;

25 Rio= W, P, R, T, nebo D;

Rn= W, C, V, L, nebo G;

Ri₂= S, T, M, nebo H;

Ri3⁼ G;

Ri₄,= S, A, G, N, Q, nebo H;

30 Ri5= W, H, G, A, nebo R;

R₁₆= G, T, Ε, P, V, nebo W;

• · ··· ·

- 94 Riz= V, F, W, K, nebo A;

Ri8= K, Q, D, E, R, nebo L;

Ri9= R, F, nebo S;

R₂₀= P, S, I nebo H;

5 R2i⁼ G;

R22⁼ C;

R23⁼ G;

R24⁼ D, S, T, N;

R25“ G, D, L;

10 R₂6= P nebo S;

R₂7= M, S, D, I, L, nebo R;

R₂₈= G, W, C, L, F, Y, nebo T; R₂₉= S, N, V, F, H, nebo R;

R30“ N, A, S, M, nebo R;

15 R₃₁= F, Q, P, nebo V;

R32“ s, V, I, K, A, nebo S;

R₃₃= P, A, N, nebo Y;

R₃₄= G, N, nebo L;

R₃₅= K, R, C, Q nebo L;

20 R₃₆= V, K, R, nebo A;

R₃₇= G, D, A, nebo E;

R₃₈= S, T, P, Y nebo W;

R₃₉= R, I, L, P, A nebo S;

R₄₀= N, K, nebo M;

25 R₄₁= S, R, T, E, Q, P, Y nebo H;

R₄₂= G, A, S, D, N, P, Y, nebo K; R₄₃= P, H nebo A.

44. Molekula podle nároku 43, kde

30 Ri = G;

R₂ = A;

R₃=P;

R₅ = W;

R₆=S;

Rw= W;

5 Rn=W;

Ri2= S nebo T; Ri4,= S;

Rl6⁼ G; Rl8⁼ K; 10 Rl9⁼ R: R20⁼ P; R26“ P; R28⁼ G nebo W R₃0⁼ N; 15 R₃1 = F; r₃₃ ⁼ P; R₃5 ⁼ K nebo R: R₃7⁼ G; R₃8⁼ S: 20 R4O” N nebo K;

R42⁼ G;

45. Molekula podle nároku 2, kde protilátka nebo její derivát vázající se na antigen je schopna specifické vazby na lidský

25 tumorový antigen.

46. Molekula obsahující peptid o délce 17 až 50 aminokyselin, který se váže na buňky karcinomu prostaty, přičemž peptid obsahuje sekvenci WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6) a sekvenci

30 LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7).

47. Molekula obsahující peptid o délce 19 až 50 aminokyselin, který se váže na buňky karcinomu prostaty, přičemž peptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci obecného vzorce:

5 R1XR2 kde:

Ri = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);

R₂ = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7); a X je sekvence jakýchkoliv 2 až 33 aminokyselin.

48. Molekula obsahující peptid o délce 19 až 50 aminokyselin, kde peptid obsahuje sekvenci aminokyselin vzorce

RiXR₂ kde:

is Rj = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6), YNAYVPGFT (SEQ ID

NO: 89), WFMSPYT (SEQ ID NO: 90), FPGVSTPY (SEQ ID NO: 91), WGISYPF (SEQ ID NO: 92) nebo FPS;

R₂ = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7), LVSNESG (SEQ ID NO: 93), LSRNLDFG (SEQ ID NO: 94), LSGNYNIFG (SEQ ID NO:

20 95), TNIRNDIL (SEQ ID NO: 96) nebo GSDPRL;

X = sekvence alespoň 2 jakýchkoliv aminokyselin.

49. Molekula obsahující peptid o délce 19 až 50 aminokyselin, který se váže na buňky karcinomu prostaty, kde peptid

25 obsahuje sekvenci aminokyselin vzorce:

RjXR₂ kde:

• · · · · ···· • · · · ·

Ri = sekvence 9 aminokyselin, která má alespoň 50 % homologii se sekvencí WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);

R₂ = sekvence 8 aminokyselin, která má alespoň 50 % homologii se sekvencí LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7); a

5 X je sekvence jakýchkoliv 2 až 33 aminokyselin.

Zastupuje:

·· ···< 9 9 4 • · · • · · · • ·

99 ·

1/9

Obr. 1

1.25 _ 1 = 0.75 |θ.5

Ο

0.25

Obr. 2

1Ε-06 1Ε-05 0.0001 0.001 0.01

Koncentrace protilátky (μΜ) • * · 99 9

2/9

Klon 14 GIINANDPLPFVFMS—PYTPGPAPIDINASRALVS-NESG

WQGTHFPYT LVSKNDSG

CDR3L CDR2L <5/9 = 55,5 Z) <7/8 = 87.5 Z)

Klon 17

DL-SRNLDFGRFLLYNA—YVPGFTPTFISLTAEHLSSPKG LVSKN-DSG WQGTHF-P-YT

CDR2L CDR3L <6/8 = 75 Z.) <6/9 = 66.6 Z)

Klon 15 CGRAYCL-SGNYNIFGALFPGVS—TPYADVGHDDAQSVRR

LVSKN-DS-G VQG-THFPYT

CDR2L CDR3L <4/8 = 50 Z) <6/9 = 66.6 Z)

Klon 13 RCSPIV-GIS-YPFGLLSSNPGVCHSSDAET-NIRNDILTT VQG-THFPYT GSDN-K-SVL

CDR3L CDR2KREV) <6/9 = 66.6 Z) <4/8 = 50 Z)

Klon 16

GHSNYCFVSTLGMPIVGFP-SINARGLIHYGGSDPR—LAA

WQGTHFPYT

CDR3L <3/9 = 33.3 Z)

GSDNKSVL

CDR2KREV) <5/8 = 62.5 Z)

Obr. 3 •4 4444

44 4

444 4

3/9

Obr. 4

444

Obr. 5

Koncentrace peptidu (μΜ) • · · · · · • · · • · · • ··· · • · • ·· · • ·· ·· · · • · • · • · ··· ···· ···

Obr. 6

Orgán

Obr. 7

Poměr orgán : krev

5/9

Orgán

Orgán ·· ····

6/9

Sac II

c.

tgt.gcc.tcg.agB.(NNB)^.Ncc.gcg,g

c.

N=A,G,T,C

B=G,T,C

V=G,A,C

Xho I gg, cgc. cNV. (NNV)^ · ^a9^a · tet, cgt, gtc

Vyplnění DNA polymerázou

Ala tgt.gcc.tcg.agB.(NNB)12.Ncc.gcg. g ^ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ zzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz* gg. cgc. cNV. (NNV)^ - ^ga. tet. cgt, gtc Xba I

Štěpení Xho I + Xba I tcg.agB.(NNB)* ,Ncc.gcg.g

-zzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz zzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzgg,cgc.cNV, (NNV)^ .tga. tc

Ligace Xho I + Xba I štěpeného vektoru M13 m633 Elektroporace do XL1-Blue E

Knihovna fúzních proteinů plil s náhodnou sekvencí P S R T . . .

S <S/R) X₁₂n AdX₁₂S R *=S,P,T GR A d=V,A,D,E, GR G Signálové peptidázové štěpící místo

Obr. 10 ·· ····

7/9

6 TGT GTC TCG AGN (NNB^qNAC GCC AN

N=A,C,G,T

B=C,G,T

V=A,C,G

NTG CGG TNV (NNV^AGA TCT GTG TTG

Vyplnění sekvenázou

Xho I

G TGT GTC TCG AGN (NNB^NAC GCC AN

NTG CGG TNV (NNV) _SAGA TCT GTG TTG Xba I

Štěpení Xho I a Xba I TCG AGN (NNB)gg NAC GCC AN

NTG CGG TNV (NNV^AGA TC

Ligace Xho I + Xba I štěpeného M13mp18Xa Elektrotransformace E. coli JS5

Knihovna D38 genetické diverzity, vyjádřená jako náhodné fúze N-koncového plil . H SiS (S/R) X jo (Y/H/N/B) A (I/M/T/N/K/S/R) X₁₅ S R Signálové peptidázové štěpící místo

Obr. 11 ·· 4444 • 4 • 4
4 4«

4 4 4 4 • 4

44 4

8/9

G TGT GTC TCG AGN (NNB^GGT TGT GGT

N=A,C,G,T

B=C,G,T

V=A,C,G

CCA ACA CCA <NNV)₂₀AGA TCT GTG TTG Vyplnění sekvenázou

Xho I

G TGT GTC TCG AGN (NNB^GGT TGT GGT

CCA ACA CCA (NNV)_2QAGA TCT GTG TTG Xba I

Štěpení Xho I a Xba I TCG AGN <NNB)₂₀ GGT TGT GGT

CCA ACA CCA <NNV)_2QAGA TC Ligace Xho I + Xba I štěpeného M13mp18Xa Elektrotransformace E. coli JS5

Knihovna D43 genetické diverzity, vyjádřená jako náhodné fúze N-koncového plil (S/R) X₂₀G C G X₂₀S R

Signálové peptidázové štěpící místo

Obr. 12 ·· ···· »··* ··· · • · ·· ·

QO

9/9

Z cm vo o

o

CM «X

Q_

Ρ»

8» v

ia v>

£» §· &

&

kA

Λ

CL

123 □a §

a. 3~ =»>

LU;g

Q_ 3 V

123

CM §, =»& CM £, a-S

Ca r

«8? CM §, =»^

A VA Ui. U> β y> o>

a, ° 123 ‘

ŠSSte

Obr. 13