JP2001510453A

JP2001510453A - 相補的組み合わせライブラリーを使用する薬剤の同定

Info

Publication number: JP2001510453A
Application number: JP52072798A
Authority: JP
Inventors: フォウルケス，ダナ，エム．; ケイ，ブライアン，ケイ．; フレリンガー，ジェフリイ，エイ．; ハイド―デルイシャア，ロビン，パリシュ
Original assignee: ノヴァロンファーマスーチカルコーポレイション
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2001-07-31
Also published as: EP0937253A1; WO1998019162A1; AU744444B2; CA2270394A1; AU5426898A

Abstract

(57)【要約】本発明は受容体への結合によって活性を仲介するリガンドがまだ知られていないときにも、標的受容体タンパク質の生物活性を仲介できる化合物ライブラリー中の化合物を同定することに向けられている。その方法は３工程からなる。（１）標的タンパク質（TP）に結合し、従って工程（２）と（３）において未知のリガンドにの対する代用物として使用できるメンバー（好ましくはペプチドまたは核酸）に対し少なくとも１個の可能な代用物組み合わせライブラリーをスクリーニングする。（２）少なくとも１個の相補的ライブラリー、好ましくは組み合わせライブラリー（これはペプチドまたは核酸に制限されず、また含まなくてもよい、従って「化合物ライブラリー」と時折呼ばれる）を、工程（１）からの１またはそれ以上の代用物のTPへの結合を阻害する化合物に対しスクリーニングする、そして、任意に、（３）前記TPの生物活性を仲介するかどうかを決定する。

Description

【発明の詳細な説明】相補的組み合わせライブラリーを使用する薬剤の同定本発明はその全体を参照してここに組み込まれる1996年10月31日に出願した出願番号08/740,671号の一部継続出願である。発明の背景発明の技術分野本発明は、標的タンパク質の生物活性を仲介することができる薬剤を同定する方法に関する。タンパク質結合および生物活性タンパク質の生物活性の多くは、それ自身タンパク質である１またはそれ以上の結合パートナー（リガンド）または他の生体分子に結合するそれらの能力に帰する事ができる。タンパク質の結合パートナーが既知であるとき、結合タンパク質及びそのパートナーの相互作用が生物活性にいかに影響しているかを研究することは比較的簡単なことである。さらに、コンプレックスの形成を拮抗的に阻害し、あるいは既に形成されたコンプレックスを分離するための化合物の能力について化合物をふるい分けることができる。このような阻害剤はタンパク質の生物活性に、少なくともインヴィヴオで相互作用の場所に供給できる場合に、影響を与えるようだ。結合タンパク質が受容体であり、結合パートナーが生物活性のエフェクターである場合、そのときは阻害剤は生物活性を弱めるであろう。結合パートナーが、結合によって、生物活性をブロックするものである場合、そのときはその相互作用の阻害剤は、実質的に、アゴニストである。官能基が互いにリガンド結合相互作用に関係する残基はタンパク質のリガンド結合部位またはパラトープを形成する。同様に、互いにこれらの相互作用に関係するリガンドの官能基はリガンドのエピトープを形成する。タンパク質の場合には、結合部位は一般に比較的小さい表面パッチである。タンパク質の結合特性は、タンパク質を変質することなく、これらの部位で局部的変更によって変えられる場合が多い。タンパク質の官能基とリガンドのそれとの間に化学反応が起きることが可能であり、共役結合となり、通常タンパク質リガンド結合はいくつかの非共役相互作用の集合効果の結果として生じる。静電的相互作用は塩架橋、水素結合、およびヴァンデルワールス力を含む。疎水性相互作用と呼ばれているものは実際には、非極性基とそれ自身との間の有利な相互作用よりはむしろ無極性基と水との間の水素結合の不在である。疎水性相互作用はタンパク質の配座を安定にする際に重要であり、疎水性残基は通常かくされており、従って結合部位部分ではないが、間接的にリガンド結合に影響する。ペプチドは、タンパク質が他のタンパク質、マクロ分子および、生物学的に重要な物質、例えば核酸、脂質および酵素基質と相互作用する物と同じ部位にてタンパク質を結合することが見出された。この性質の第一の例は、ビオチン結合タンパク質ストレプタヴィジンの単一のペプチド結合部位であることが示されたいくつかのグループの刊行物にあった。これは、ビオチン結合の原因である同じ部位であり、これらのペプチドはこの部位に結合するためのビオチンに匹敵する（ Biochemistry 34:15430-15435（1955）環状ペプチドファージライブラリーのスリーニングは高親和性でストレプタヴィジンを結合するリガンドを同定する、L. B.Giebel,R.T.Cass,D.L.Milligan,D.C.Young,R.Arze & C.R.Johnson;Gene 128:5 9-65（1993）選択された標的に親和性をもつ新規の配列源としてランダム38−アミノ酸ペプチドを示すＭ13ファージライブラリー、b.K.Kay，N.B.Adey，Y.S.He ，J.P.Manfredi，A.H.Mataragon & D.M.Fowlkes;Nature 354:82-4（1991）リガンド結合活性を同定するための合成ペプチドライブラリーの新しいタイプK.S.La m，S.E.Salmon，E.M.Hersh，V.J.Hruby，W.M.Kazmierski & R.J.Knapp;Proc.Nad .Acad.Sci.U.S.A.92:5426-5430(1995)ライブラリーのライブラリー：合成組み合わせライブラリーデザインおよび"pharmacophore"モチーフのスクリーニング、N .F.Sepetov，V.Krchnak，M.Stankova，S.Wade，K.S.Lam & M.Lebl;Biochem J 29 3(Pt 3):613-6(1993)ファージに発現したランダムペプチドライブラリーから選択されたビオチン結合、I．Saggio & R．Laufer)。多くの他の例があり、例えばスミスはリボヌクレアーゼＳに結合したファージに示されたペプチドが特異的共通モチーフをもち、これらのPLsがリボヌクレアーゼ活性に拮抗し、これはペプチドとRNAが同じリガンド結合部位によって結合したことを意味することを示した(Gene 128:37-42(1993)バクテリオファージ表示ライブラリーで発見されたリボヌクレアーゼＳペプチドアンタゴニスト、G.P.Smith,D.A.Schultz & J.E.Ladbury)。他の例は細胞表面インテグリンへのペプチドリガンドの結合からである(Biochemistry 34,:3948-3955（1995 ）ランダムファージ表示ライブラリーから選ばれたインテグリンアルファｖベーター３のためのペプチドリガンド、J.M.Healy，O.Murayama，T.Maeda，K.Yoshin o，K.Sekiguchi & M．Kikuchi;J．Cell Biol．124:373-80（1994）ファージ表示ライブラリーからアルファ５ベーター１のための高度に特異的リガンドの単離、 E.Koviunen，B．Wang & E．Ruoslahti)。この方法で得られたペプチドは明らかに模擬天然タンパク質であった：タンパク質MDM2およびp53に対する場合のようなタンパク質相互作用(Bottgar et al．ファージ表示による新規のmdm2結合ペプチドの同定、Oncogene，13:2141-7(1996))。しかし、これまで、この現象が充分に普通であり、未知の結合パートナーとタンパク質の相互作用の阻害物質を同定する際に活用されることは評価されていなかった。また、そのためにこの現象の利点をどのようにして利用するか誰も説明していなかった。伝統的薬剤スクリーニング伝統的薬剤スクリーニングにおいて、天然製晶品（特に民間療法に使用されるもの）は生物活性について試験された。これら製品の活性成分は精製し特性を調べて、これら"drug leads"の合成類似体を設計し、調製し、活性を試験した。これら類似体の最良のものは"drug leads"の次の世代となり、新規の類似体を作成し評価した。天然製品と合成化合物の両者は単一活性を条件に試験し、テスターへの関心のある任意の生物活性について徹底的に試験できた。試験は先ず動物で行い、次に単離器官、組織、または細胞培養物、膜抽出物または精製受容体を用い、高価でないさらに入手しやすいモデル系を、薬理学的評価について明らかにした。これら方法には多くの利点がある。これらアプローチの多くは、特にすべての動物と単離器官の試験では、試験に大量の化学的化合物を必要とする。可能性のある薬品化合物のコレクションの中の所定の化合物の量が限られ、これは実行されるスクリーン数を制限する必要がある。また、全動物、単離器官および培養細胞を用いて試験した化合物の中、構造／活性関係（ＳＡＲ）を確立することが本質的に困難である。これは、任意所定の化合物の活動の実際の分子標的が、アッセイでポジティブに採点する他の化合物のそれとは全く異なるためである。非常に特異的標的の一連の化合物を試験して、量的活性と種々の化学残基の作用を算定し、その情報を化合物の一定のクラス中の活性化合物のためのサーチに使用し、試験した活性化合物によってシェアーされた性質の複合物をもつ新規の化合物の合成に向けさえもする。すべての動物、器官および細胞に基づくスクリーニングの他の欠点は、一定の制限により活性化合物がそのように算定されることを妨げられることである。例えば、細胞膜通過の不能は、試験化合物ライブラリーの中で、有力なインヒビターが、活性化したオンコジーンラスに作用することを妨げ、細胞増殖アッセイで疑似の負のスコアを与えることを妨げることができる。しかし、単離した系のラスを試験することか可能な場合、有力なインヒビターは正の化合物として数えられ、適切なＳＡＲを確立するために貢献する。次の、化学修飾は膜透過性に対し化合物の構造を最適にするため行うことができる。化合物のスクリーニング法に基づく受容体への抗しがたい欠点は、受容体とその生物リガンドの活性について優先的知識を要することである。病気の場合の遺伝子マップによって、特定の遺伝子製品が病気の原因であることを決定する場合、既知の受容体または酵素ではないので、遺伝子生化学官能基について知識が不足し、既知の方法を用いてアッセイを確立することは難しい。本発明はこれら問題点をすべて回避する。組み合わせライブラリー数千、数万の、ランダムオリゴペプチドのライブラリーは、化学合成(Houghte n et al.,nature,354:84-6(1991))、または遺伝子発現(Marks et al.,JMol Biol ,222:581-97(1991))、によって調製され、クロマトグラフ支持体（Lam et al.， nature，354:82-4(1991)）に、バクテリア細胞（Colas et al.，Nature，380:54 8-550(1996)）内で、バウテリアピリ（Lu，Bio/Technology，13:366-372(1990) で、またはファージ（Smith，Science，228:1315-7(1985)）で示され、そして抗体(Valadon et al.，J Mol Biol，261:11-22(1996))、細胞質タンパク質( Schmitz et al.,J Mol Biol,260:664-677(1996))、ウイルス性タンパク質(Hong and Boulanger，Embo J，14:4714-4727(1995))、バクテリア性タンパク質(Jacob sson and frykberg,Biotechniques,18:878-885(1995))、核酸(Cheng et al.，Ge ne，171:1-8(1996))、およびプラスチック（Siani et al.，J Chem Inf Comput Sci，34:588-593(1994)）を含む多数の標的に結合するためスクリーニングした。タンパク質のライブラリー(Ladner,USP 4,664,989)、ペプチド(Simon et al. ，Proc Natl Acad Sci USA,89:9367-71(1992))、核酸(Ellington and JW,Nature ，246:818(1990))、炭水化物、および小有機分子（Eichler et al.，Med Res Re v，15:481-96(1995)）はまた薬剤スクリーニング目的に調製または示唆された。スパークスらは（Nature Biotechnology，14:741(1996年６月)）ＳＨ3−ドメインを用いてタンパク質につき16日マウス胚ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするファージ表示ランダムペプチドライブラリーから単離したＳＨ３ドメイン結合ペプチドを用いた。このプロセスは"ＣＯＬＴ"と呼ばれる(cloning o f hgand targets)。これらのタンパク質、先に知られていなかったものいくつかを、つぎに追加のＳＨ３−ドメイン結合リガンドに対しペプチドライブラリーをスクリーニングする際に結合標的として使用できる。ペプチドライブラリーの化学は生物学的プロセスに含まれる天然マクロ分子の多くに完全に類似であり、従ってこれらのライブラリーは標的タンパク質と相互作用する天然のものに似た構造で豊富である。さらに、変異体は各実際に多くの異なる化学的構成分の滑走ウインドウを示すような線形ポリマーからなる。たとえば、所定のマクロ分子の相互作用が結合ペプチド内の４個のアミノ酸の側鎖に基づく場合、１３個のアミノ酸ペプチドは結合できる残基の10個の潜在的組み合わせをもつ；従って、１０⁸個の膜のライブラリーは約１０⁹個の４量体順列をもつ。これは、例外的に大きな異なったペプチドライブラリーを生成しスクリーニングすることが容易な組み合わせで、初期同定およびタンパク質官能ドメインを調べるためにペプチド組み合わせライブラリーを用いるため刺激を与える。不幸にも、ペプチドそれ自体は治療実体として用いるために限られたユーテイリテイをもつ。合成には費用がかかり、プロテアーゼの存在で不安定であり、一般に細胞質の膜を通過しない。化合物の他のクラスは薬剤の候補に対しより良い性質をもつ。しかし、歴史的に、薬剤発見領域への、より小さいファームのエントリーに対し、化学化合物ライブラリーを獲得することはバリアーであった。全動物および細胞さえも試験するために必要な大量の化学品によって、化合物を合成したときはいつも、かなり大量で行われなければならないことは既知の事実であった。従って、１年につき化学者１人につき５０個以下の化合物の合成および精製処理量であった。大会社は取引バリアーとしておびただしい高価な収集物を保持していた。しかし、分子レベルへの標的の小型化とスクリーンの自動化で、アッセイに必要な所定の化合物の分量は、非常に小さい量に減少した。これらの変化は伝統的化学ライブラリーの代わりに所謂組み合わせ化学ライブラリーの利用のためのドアーを開いた。組み合わせ化学は、分子標的に向けられた自動化アッセイに適した少量の化合物の大多数につき迅速な比較的安価な合成を可能にする。多数の小会社と大学の研究室はかなりの範囲の多様性を用いて巧みに処理することに成功した(Doyle,1995,Gorden et al.，1994a,Gorden et al.，1994bで検討)。われわれは、多数の標的に対し薬剤発見スクリーンを開発する系統的手段を開発した。このシステムの特別な利点は、高処理量スクリーンが類似と非類似の標的と基本的に同一であり、生化学的に多様な標的のための独特なアッセイを発現するための要求を回避することである。これはいくつかの理由から望ましい。第一の主要な一つは特異的標的が治療上の介入にいかに有用であるかが確実でない。活性化合物を単離し試験するまで、本当に分子標的を“確認する”ことができることではない。したがって、これは実際と同じ多くの標的を選び、各々に対するスクリーンを確立し、つぎに同定した化合物を薬理学的に用いて各標的を確認する意味をなす。第二に、多くの可能な標的に対し、分子アッセイを確立に使用できる生化学活性を気付かない。多くの可能な標的は生化学データよりはむしろ遺伝的実験の結果に基づき提案できる。これはサブクローニングと突然変異原性の分析が容易なためのビールスの場合であり、現在、ヒト遺伝子データの流出で、多くの他の病気分野で真実であろう。そのチャレンジは遺伝子データから有用な薬剤スクリーンの開発まで行くことである。特許または特許出願を含めて、この明細書に引用したすべての参考文献は、ここに参照のため組み込まれる。いずれの参考文献も従来技術を構成することを承認するものではない。参考文献の議論は著者らが主張することを述べ、出願人は引用書類の正確性と適切性を吟味する権利を保有する。発明の概要本発明は、結合パートナーへの標的タンパク質の結合の抑制によって標的タンパク質の生物活性を介在できる薬剤を同定する方法に関する。従来法とは違って、天然結合パートナーは標的として用いられことは必要なく、また特性を与える必要さえもない。天然結合パートナーは相補的組み合わせライブラリーを用いて回避される。「ライブラリー」の語は関心のある性質につき同時にスクリーニングできる化学的または生物学的実体のコレクションを意味する。（それらは、所望により、連続してスクリーニングできるが、同時にスクリーニングすることがさらに有効である。）一般に、それらはもとの構造および／または機能に関係する。「組み合わせライブラリー」の語は各メンバーが、基礎要素の制限されたセットの系統的またはランダムな組み合わせであり、各メンバーの性質がそれに組み込まれた要素の選択と位置に依存することを意味する。代表的には、ライブラリーのメンバーが少なくとも同時にスクリーニングすることができる。ランダム化は全体または部分的である；いくつかの位置はランダム化でき、他は予定でき、そしてランダムな位置で、予定された方法で選択を制限できる。組み合わせライブラリーのメンバーはある種のオリゴマーまたはポリマーであり、異体はオリゴマーまたはポリマーの１またはそれ以上の位置で、可能なものとしては結合する連鎖によって、またはオリゴマーまたはポリマーの長さによって、単量体構築ブロックを選択して生じる。あるいは、メンバーは、１，４−ベンゾジアゼピン構造のような標準のコア構造をもつ非オリゴマー分子であってもよく、その変更はコア構造の特定の可変部位にて置換体を選択して導入される。標的分子を認識するためそのようなライブラリーの１またはそれ以上のメンバーの能力は「組み合わせ認識」と呼ばれる。「簡単な組み合わせライブラリー」では、メンバー全部が化合物（例えば、ペプチド）の同じクラスに属し、同時に合成することができる。「複合組み合わせライブラリー」は２個またはそれ以上の簡単なライブラリー、例えばＤＮＡｓとペプチドの混合物である。複合ライブラリーの簡単なライブラリーの成分数は、勿論、通常は、各単一ライブラリーのメンバーの平均数よりも小さい、あるいは各合成に比較してライブラリーの利点は小さい。偏した組み合わせライブラリーは、ライブラリーメンバーの１またはそれ以上の位置にて、可能な基本要素の１だけを、ライブラリーの全メンバーに対し許容する、すなわち、偏した位置が変化しない。「増幅できる組み合わせライブラリー」の語は各メンバーが、標的に結合することを見出した後、出発物質としてライブラリーに既に存在する要素を用いて、インヴィヴォまたはインヴィトロで増幅できるライブラリーを意味する。２種類の増幅できるメンバーがある。第一に、核酸は天然複製プロセスによってインヴィヴォで、またはポリメラーゼ鎖反応（PCR）のような技術によってインヴィトロで増幅できる。第二に、ペプチドは、ファージに存在するとき、またはコード化する核酸と結合するとき、ペプチドを符号化する結合した核酸のインヴィヴオまたはインヴィトロ増幅によって直接増幅でき、増幅した核酸はペプチドを生成するように発現する。「バイオポリマーライブラリー」の語は、ペプチド(ペプトイドと共に)、核酸、および／またはオリゴ糖からなるライブラリーを意味する。（それぞれ、天然産のアミノ酸、塩基、または糖からなる必要はない。）しかし、炭化水素合成の更に大きい複雑さのため、ペプチドと核酸は更に関心がもたれる。「組み合わせライブラリーのパネル」は異なる（オーバーラップの可能性があるが）そして別々のスクリーニングできる簡単なまたは複合した組み合わせライブラリーのコレクションである。「パネル」は成分簡単ライブラリーが共に混合されず、すなわち、まだ別々にスクリーニングされている複合ライブラリーとは異なる。「構造パネル」は上記のようなパネルであり、メンバーライブラリー間に、ある構造関係がある。例えば、２０個の偏したペプチドライブラリーのパネルをもち、各ライブラリーでは、中央残基が所定のアミノ酸として不変であるが、各ライブラリーでは不変の残基が異なり、そこで、集合的に、全部の２０個の可能な遺伝子的に符号化するアミノ酸が本特許により探査されている。「走査残基ライブラリー」は不変残基の位置が１のライブラリーから次のライブラリーへシフトするように、偏した組み合わせペプチドライブラリーのパネルの調製を意味する。例えば、ライブラリー１では、残基１は特定の残基AAとして一定であり、ライブラリー２では、残基２が、そして２またはそれ以上の(通常全部の)位置を通してこのように示される。また、サブパネルを定義できるライブラリーのパネルを構築できる。例えば、１のサブパネルでは、中央残基AA₁は全ライブラリーに対し同じであるが、ライブラリーはまた、全部の他の残基位置を通じて走査される不変残基AA₂を持つ。ライブラリー走査プログラムは１またはそれ以上のライブラリー（例えば、偏したペプチドライブラリーの構築パネル）が活性のためにスクリーニングされる。ライブラリーは平行に、連続して、または両方で、スクリーニングされる。連続スクリーニングでは、１のスクリーニングの結果を用いて、その系列の次のライブラリーの設計を案内する。出願人は、最初の組み合わせ（相補的）ライブラリー（好ましくは自然における組み合わせ）を、標的タンパク質に最初のライブラリーのリガンドを結合する１またはそれ以上の標的を阻害する能力に対し、スクリーニングする。成功したインヒビターは標的タンパク質の１またはそれ以上の生物活性の候補アンタゴニストである。出願人は組み合わせライブラリー、特にバイオポリマーライブラリーのこれらメンバーは、生物学的に重要な結合活性をもつ標的タンパク質に結合し、標的タンパク質が、ランダムに向かい合うように、標的タンパク質の全面にわたり、等しい可能性をその生物学的活性に仲介する天然結合パートナーと相互作用する部位に好適に結合すると信じている。そうならば問題のライブラリーの標的結合メンバーは、その天然結合パートナーへの標的タンパク質の複合化を阻害できるメンバーに対し、バイオポリマーライブラリーである必要のない第二の組み合わせライブラリー（「相補的ライブラリー」をスクリーニングする際に、未知または入手できない天然結合パートナーのために代用物として使用できる。代用物ライブラリーは好ましくはペプチドまたは核酸ライブラリーである、ライブラリーのサイズはその中の異なる分子の数としてのライブラリーの多様性。「多様性」はライブラリーの構造がどのくらい異なるかは評価しない。２個の構造の間の相違度をここでは「不均衡」または「ばらつき」と呼ぶ。「不均衡」はいくつかの点で、例えば、サイズ、親水性、極性、熱安定性等で量を計ることができる。ライブラリーの平均サンプリング頻度は、サイズ対多様性の比である。サンプリング頻度は全メンバーがスクリーニングされることを確かめるためにアッセイの検出リミットを超える必要がある。組み合わせライブラリーは通常少なくとも１０³個の異なる構造の多様性をもつ。好ましくは、初期の代用物発生ライブラリーは高多様性、例えば少なくとも約１０⁶、さらに好ましくは少なくとも約１０⁹個の異なるメンバーである。ペプチドライブラリーが好ましいが、異なるクラスの化合物（例えば、ペプトイドまたは核酸）からなるライブラリーは標的タンパク質の活性仲介結合部位を結合するために検出できる選択物出あるならば受容できる。相補的ライブラリーは、ペプチドライブラリーである必要はなく、好ましくはそうではなく、さらに低い包括的多様性であっても良い。代用物ペプチドの全部に対して；または選択されたものに対してスクリーニングできる。スクリーニングは個々にまたは集合的である。しばしば、相補的ライブラリーのメンバーは、最初のライブラリーのメンバーよりも標的タンパク質のパラトープに対し結合があまり特異的ではなく、これは多分それらの表面積がさらに小さく、他の分子との有利な（または不利な）相互作用に対し更に少ない機会を提供するためであろう。好ましい相補的ライブラリーはベンゾジアゼピンライブラリーである。相補的ライブラリーのメンバーの複合阻害活性の度合いは標識をつけた代用物および不溶化した標的タンパク質によって量を計られる。標識をつけた代用物ペプチドの分量を固定し、相補的化合物の量を変えるか、または、さらに好ましくは標識をつけた代用物ペプチドの量を変えて、相補的化合物の量を一定に保持する。相補的化合物の活性が大きくなるほど、固相において標識代用物ペプチドは小さくなり(すなわち、標的タンパク質に複合化し)、液相では一層大きくなる (すなわち、複合化しない)。いずれの相でも標識の量を計り、可変成分の量で相関関係を算定する。結合分子に対しスクリーニングライブラリーの従来法はそれ自体、親和度の定量化を与えない。最初のライブラリーの標的タンパク質のいくつかは、関心のある生物活性を仲介する天然結合パートナーによって結合した部位にて標的タンパク質を結合しないこと、またはそれをその部位に結合するが天然結合パートナーのそれに似た効果を持たないことが可能である、すなわち、これら名目上の代用物が天然結合パートナーに対し真の代用物ではないことが可能である。しかし、同定したメンバーの１またはそれ以上が真の代用物であるかぎり、名目上の代用物の全部が相補的ライブラリーをスクリーニングする際に用いられる場合、また、そのときは必然的に標的タンパク質に対し真の代用物の結合の阻害剤のためにスクリーニングするだろう。生成した「虚偽のヒット」(すなわち、標的タンパク質はの虚偽の代用物の結合を阻害する、または真の代用物の結合を阻害するが悪い部位で阻害する化合物 )の数を減らすため、関心のあるその生物活性を仲介するように標的タンパク質で相互作用する能力（あるいは生物系で評価できる少なくとも関連した活性）に対し、まず適当な生物系で名目上の代用物を試験する。次に、このモデル系で活性なこれら名目上の代用物のみを相補的ライブラリーをスクリーニングする際に用いる。標的タンパク質への代用物ペプリドの複合化を阻害する相補的ライブラリーのたいていの化合物は、その相互作用を代用物ペプチドを用いてブロックするような方法で標的タンパク質に結合することによって、この阻害を達成する。相補的化合物が標的タンパク質の代わりに代用物ペプチドに結合することが理論的に可能であるが、たいていのオリゴペプチドは安定なコンホメーションをもたないので、この相互作用は弱いようである。勿論、標的タンパク質または代用物ペプチド単独を用いて代用物ペプチドを結合するものから、標的タンパク質を結合する阻害性化合物を、標識をつけたまたは固定化した形で、アッセイまたはアフィニティ分離剤として、区別することは簡単な方法である。図面の簡単な説明図１．組み合わせライブラリーを作るため使用したベンゾジアゼピン骨格、およびその構造に導く合成経路。図２．バクテリアアルカリ性ホスファターゼに融合したペプチドリガンドの発現のためのベクターpFLAG-ATS-BAP。このベクターはシグナルタンパク質の大小両方をうまく発現するために用いた。たいていの場合、タンパク質は分泌し、媒体からのアンモニウム硫酸化沈殿によって融合タンパク質を簡単に濃縮する。まれな場合には、タンパク質は分泌しないが、細胞内に蓄積する。この場合、トリス緩衝液で細胞を洗浄し、活性な融合タンパク質を遊離するように音波処理する。いずれの場合も、十分な量の物質が100mlの培養液から得られる。FLAGエピトープは、Grihalde et al.，Gene，166:187-95(1995)に、融合タンパク質のための標識として開示されている。図３．ファージ表示ライブラリーからスクリーニングによって同定した結合ペプチドのアミノ酸の出現。 16個の標的に対し、ファージ表示ライブラリーをスクリーニングして同定した結合ペプチドの配列を分析した。まず、所定の標的を結合するペプチドに対し、共通配列を決定し、これから、コア結合領域を決定した。その標的を結合するペプチド全部のコア領域でのアミノ酸を記録し、記録したものを問題のペプチドの数によって分け、各標的に対し小計を得た。標的小計を加え、次に標的の数によって分けた。最終計をパーセンテージに変えた。残基の全部は値が５％に等しいことを示した。図４．コドン使用のために修正後、ファージ表示ライブラリーをスクリーニングして同定したペプチドを結合する際のアミノ酸残基の出現。図３の数は、NNK符号化図に対し得られるコドンの数によって分けられ、得られた数は100％に標準化した。図５．CMV UL44に結合するファージの精製。UL44に結合するファージの割合をテキストに記載されたように選択の２と３ラウンド後にモニターした。その割合は青いプラクの数／白いプラクの＃を示す。ライブラリー文字は各ライブラリーにおいて一定に保持された残基を示す。図６．CMV UL44に対する各ファージELIAs。各クローンを、UL55を３ラウンド選択後に拾い、ファージELISAフォーマットで結合について試験した。グラフの下の文字は、書くクローンが単離されたライブラリーを示す。凡例中の文字A-H はマイクロ力価プレートの列名称を示す。図７．ファージと基質との間の結合に対する競合。競合結合実験を、標的としてプレートに固定化したGSTUL44を用いてテキストに記載されているように実施した。種々の濃度の（ａ）グルタチオン（図７ａ）または（ｂ）ＤＮＡ（図７ｂ）を書くウェルに添加し、ファージの結合をファージELISAを用いてモニターした。四角の箱は融合のGST位置に結合するファージを示し、ダイアモンド形は融合タンパク質のUL44位置に結合するファージを示す。図８．UL44 BioKeyのELSアッセイ(代用物リガンド)。UL44に対しアフィニティ選択から単離したペプチドを合成しテキストに記載されたように特異的結合について試験した。(ELS=Enzyme Linked Spectrophometric)。試験した標的はストレプトアビジン、GST-UL44、GST、およびGST-src SH3であった。ビオチニル化ペプチド結合の量はストレプトアビジン-HRP共役体を用いてモニターした。図９．GST-UL44に結合する50pmol UL44 BioKeyの時間コース。UL44代用物リガンドの結合を時間の関数としてモニターした。シグナルは少なくとも４時間、線状融合で増加する。図１０．GST-UL44へのUL44 BioKey（代用物リガンド）の結合のための滴定曲線。ビオチニル化ペプチドの結合はプレートに固定化した標的濃度の関数（0.12 5マイクログラムから２マイクログラムまで）として、ペプチド濃度の関数（0.1 ないし0.5マイクログラム）としてモニターした。図１１．UL44 BioKey(代用物リガンド)：ビオチニル化UL44代用物リガンドと非ビオチニル化代用物リガンドとの間の自己拮抗を決定した。拮抗物は添加した非ビオチニル化UL44ペプチドの濃度である。シグナルは阻害剤を添加していないものと比較した結合のパーセントとして示される。図１２．PKC結合ファージの滴定。ファージの一連の希釈は固定化したPKCを用いてインキュベートし、ファージ結合量をファージELISAを用いてモニターした。図１３ａ． ProRS BioKEY（代用物リガンド）の特異的結合。（ａ）ProRSに対しアフィニティ選択から単離したペプチドを合成しテキストに記載されたように特異的結合を試験した。試験した標的は、ProRS、GST-src SH3、GST、GST-UL44、TyRSおよびGST-MDM2であった。ビオチニル化ペプチド結合の量はストレプトアビジン-HRP 共役体を用いてモニターした。図１３ｂ他の標的に対するBioKeys（代用物リガンド）はProRSに結合しない。src SH3、UL44、およびMDM2に対する代用物リガンドはテキストに記載されたようにProRSへの結合を試験した。図１４．ProRS BioKEYに対する自己拮抗。ビオチニル化ProRS代用物リガンドと非ビオチニル化代用物リガンドとの間の自己拮抗を決定した。拮抗者は添加した非ビオチニル化ProRSペプチドの濃度である。BioKey濃度は使用したビオチニル化ProRS代用物リガンドの濃度である。シグナルは添加した阻害剤のないものと比較した結合のパーセントとして示され、２つのフォーマットでグラフにした：拮抗者濃度の（ａ）線形（図１４ａ）とlog（図１４ｂ）のスケール。図１５． ProRS代用物リガンド結合に依存する濃度と時間。（ａ）ビオチニル化したペプチドの結合はペプチド濃度（0.1ないし0.5マイクログラム）の関数としてモニターした(図１５ａ)。（ｂ）ビオチニル化ペプチドの結合は時間の関数としてモニターした(図１５ｂ)。図１６．他の標的に対するBioKeys（代用物リガンド）はTyrRSに結合しない。 src SH3、UL44、MDM2およびProRSに対する代用物リガンドはテキストに記載されたようにProRSへの結合を試験した。図１７．TryRS BioKey（代用物リガンド）の結合特異性。TyrRSに対しアフィニテイ選択から単離したペプチドを合成し、テキストに記載されているように特異的結合を試験した。試験した標的はTyrRS、GST-src SH3、GST、GST-UL44、GS T-MDM2およびProRSであった。ビオチニル化ペプチド結合の量はストレプトアビジン-ＨＲＰ共役体を用いてモニターした。図１８．TryRS BioKey（代用物リガンド）の濃度依存結合。ビオチニル化ペプチドの結合をペプチド濃度（0.1ないし0.5マイクログラム）の関数としてモニターした。図１９．TryRS BioKey（ビオチニル化ペプチド）の結合に対する時間経過。図２０．代用物リガンドと阻害剤との間の結合に対するHiTryRs BioKeyとCB23 9とCB16914との間の拮抗。拮抗結合実験を、標的としてプレートに固定化したTy rRSを用いて、テキストに記載されているように行った。種々の濃度の阻害剤CB2 39を各ウェルに添加し、代用物リガンドの結合をELSAを用いてモニターした。ダイアモンド形は酵素の活性部位に結合する特異的阻害剤（CB239）を用いた拮抗を示す。四角の箱は、TyrRS活性に影響しない関連した阻害剤を用いた拮抗を示す。図２１．ファージと阻害剤との間の結合に対する拮抗。拮抗結合実験を、標的としてプレートに固定化したベーターグルコシダーゼを用いてテキストに記載されているように行った。ファージの結合はファージELISAを用いてモニターした。黒棒は阻害剤不在のファージ結合を示し、斜線棒は阻害剤存在のファージ結合を示す。好適例の詳細な記述本発明は、受容体に結合することによりその活性を仲介するリガンドが既に知られていないときでも、標的受容体タンパク質の生物活性を仲介できる化合物ライブラリー中の化合物の同定に向けられる。このような化合物を次に「薬剤リード」として使用できる、すなわち順に活性について試験できる類似物の設計のための出発点として使用できる。本発明の方法は３工程からなる：（１）標的タンパク質（TP）に結合し、従って工程（２）と（３）において末知のリガンドにの対する代用物として使用できるメンバー（好ましくはペプチドまたは核酸）に対し少なくとも１個の可能な代用物組み合わせライブラリーをスクリーニングする。（２）少なくとも１個の相補的ライブラリー、好ましくは組み合わせライブラリー（これはペプチド核酸に制限されず、また含まなくてもよい、従って「化合物ライブラリー」と時折呼ばれる）を、１以上の代用物（TPをTPに結合するペプチドまたは核酸）の結合を阻害する化合物に対しスクリーニングする。（３）前記TPの生物活性を仲介するかどうかを決定する。ライブラリースクリーニングプログラムは、代用物ライブラリースクリーニングの多数のラウンドを含むことができ、第一のライブラリーは広い「配列空間」をサンプリングし、そして後のライブラリーは標的を結合することが先に発見されたものに関連した配列に焦点を合わせる。あるいは、異なるライブラリーは、ペプチドおよび核酸、または異なる長さまたは組成物のペプチドのような異なる配列空間の見本になる。同様に、多数のラウンドの相補的ライブラリーのスクリーニングを含むことができる。後者のラウンドは同じクラスの化合物、異なるクラスの化合物、または先にスクリーニングしたもののサブクラスの見本となることができる。異なるラウンドはスクリーニングにおいて異なる代用物を使用できる。スクリーニングは任意の合理的順位で、例えば、代用物／相補的／代用物／相補的、または代用物／代用物／相補的／相補的である。相補的ライブラリーの化合物は同時にまたは連続してスクリーニングできる。以下、本発明はペプチド代用物を参照して記載される場合、そのような記述は核酸にもまた必要な変更を加えて応用する。実際に、受容体タンパク質の天然リガンドが知られていない（またはいくつかの他の理由でスクリーニングでの使用には望ましくない）ので、ペプチドライブラリーをサーチして代用物リガンドを同定する。勿論、所定のペプチドが受容体タンパク質を結合するとしても、それを正しい部位に結合する保証はない。しかし、別種のペプチドライブラリーをスクリーニングして、多くのTP−結合ペプチドを同定できる。これら少なくとも１個のペプチドは天然リガンドにより結合されると同じ部位にTPを結合するらしい。ペプチドライブラリーは高相互作用可能性をもつ部位に対しTPの表面を「試す」。１またはそれ以上のそのような部位を提供するためにTPは引き出され、そのような部位は天然リガンドによって結合できるように引き出される（あるいは、天然リガンドはTPのそのような部位を結合するように引き出される）ようである。好ましくは、ペプチドライブラリーは以下に定義されるような偏したライブラリーである。所望により、TP結合ペプチドが同定されると、天然リガンドに対し代用物として働く、すなわち、TPの生物活性を仲介するための能力をスクリーニングすることができる。その場合、この仲介性質をもつTP結合ペプチドのみが第二工程で用いる必要がある。第二工程では、TPで工程（１）のTP結合ペプチドの結合を阻害するように化合物の納涼区をスクリーニングする。化合物はペプチドである必要はなく、連続してまたは同時にスクリーニングできる。 TPのためのTP結合（代用物）ペプチドのアフィニティ範囲はけ継ごうが検出でき、発見すべく調べた化合物によりそのような結合の阻害もまた検出できるようなものでなければならない。先ず、スクリーニングする化合物は阻害活性が低いようだ。最適プログレスを導くと、さらに高い阻害活性の化合物がさらに存在するようだ。異なる代用物ペプチドは初期および次のラウンドのライブラリー構築およびスクリーニングには好ましい。一般的に言えば、10^-5ないし10^-11の範囲のアフィニティが望ましい。TPのための代用物リガンドのアフィニテイおよび第一ラウンドのために調べた化合物のアフィニティ範囲は代用物リガンドとスクリーニングに用いた薬剤の濃度を決定する。代用物リガンドのうどを結合一定値以下に、薬剤リードのうどを結合一定値以上に保持することが好ましい。例えば、ペプチド代用物リガンドが１×10^-7の結合定数を持つ場合、アッセイではこれ以下の濃度で用いる必要がある。逆に、約１×10^-6のアフィニティでTPに結合した化合物を見出したい場合、化合物はアッセイでこれよりも高い濃度で存在する必要がある。これはリガンドおよび化合物の利用の場所が制限される。リガンドはその結合がまだ検出できる濃度で用いなければならない。このように、本検出法では、１×10^-12Ｍより（大きいアフィニティ）小さい結合定数をもつ代用物リガンド、１×10^-6Ｍより（小さいアフィニティ）大きい結合定数をもつ化合物を用いようとすることは望ましくない。検出限度が改善すると、望ましいアフィニティが変化する。前述のことは特定のアフィニティ範囲に本発明を制限するように解釈されるものではない。化合物はペプチドに、またはTPに結合することによりTPへのTP結合ペプチドの結合を阻害できる。TP結合ペプチド単独に結合するものは、TP結合ペプチドが天然リガンドに対し真の代用物でない、即ち、化合物が天然リガンドを交差阻害しない場合、あまり有用ではないらしい。最後に、阻害性化合物が実際にTPの生物活性を仲介するかどうか決定する。理論では、TPと相互作用する能力に対し直接化合物ライブラリーをスクリーニングすることが可能である。例えば、直接（以下参照）に標識をつけ、ピン（Proc N atl Acad Sci USA 91:4708-12(1994)1,4-benzojiazepinライブラリーの組み合わせ合成と化学生物学評価、B.A.Bunin,M.J.Plunkett & J.A.Ellman）またはビース(Proc Natl Acad Sci USA 90:10922-6(1993)にそれ自体を固定化した異なった化合物のライブラリーへの直接結合を試験することができる。分子タグで指標とした複合合成化学ライブラリー、M.H.Ohlmeyer，R.N.Swanson，L.W.Dillard,J.C .Reader,G.Asouhne,R.Kobayashi,M.Wigler & W.C.Still)。しかしこのような直接結合によるスクリーニングは厳格にスクリーニングされる化合物ライブラリーの選択を制限する。例えば、多くの大製薬会社は何年にもわたり数千の化合物を蓄積している。そのような化合物は乾燥粉末または溶液で貯蔵され、したがって、任意の種類の固体マトリックスに固定化されていないので、推定のタンパク質薬剤標的で直接相互作用をアッセイできない。さらに、固定化した化合物へのTPの結合はピンまたはビーズマトリックスへのその配向によって直接妨げられる。従って、溶液中で行われるスクリーニングアッセイは、本発明の相補的ライブラリーの好ましいスクリーニング法のように、好ましい。この方法の別の利点は生物学的に意味のあるTPの部位へのに薬剤リードに焦点が合う。標的への化合物結合を要する場合にのみアッセイはTPの活性、例えばTP と生物学的リガンド（例えば他のタンパク質）の相後作用（例えば、酵素による）に影響する化合物を選択しない。別の観点では、本発明は生物学的作用が知られていない、多分直接決定できない、標的タンパク質の生物学的を同定するために用いる。この方法では、既知の（または決定できる）生物活性の化合物は、標的タンパク質を結合するペプチドの結合を阻害する能力をスクリーニングする。そのような化合物がそのような結合を阻害するならば、標的タンパク質は化合物の１またはそれ以上の生物活性を仲介すると仮定される。相補的ライブラリーは、事実上の（例えば、100個の化合物）構造多様性のライブラリー、例えば、種々の植物または動物源からの単離天然生成物、または種々の薬剤は継げんプログラムで先に作られた類似物のライブラリーであるとすれば、組み合わせライブラリーである必要はない。標的タンパク質標的タンパク質は天然に生じるタンパク質、またはサブユニットまたはそれらのドメインであり、任意の天然源由来であり、ビールス、微生物(バクテリア、菌、藻、および原生動物を含む)、無脊椎動物(昆虫および寄生虫を含む)、または脊椎動物（特に哺乳動物、鳥または魚および、哺乳動物のうち、特にヒト、サル、モンキー、ウシ、ブタ、ヤギ、ラマ、ヒツジ、マウス、ウサギ、ギニアピッグ、ネコおよびイヌ）の通常のまたは癌に罹った細胞を含む。あるいは、標的タンパク質は天然タンパク質の突然変異体である。標的タンパク質の標識化または固定化を容易にするため、またはその生物活性を変更するため突然変異体を導入することができる。(突然変異のタンパク質の阻害剤は突然変異体タンパク質の望まない活性を選択的に阻害するために有用である)。標的タンパク質は、なかんずく、グリコー、リポー、ホスフォー、または金属タンパク質出ある。細胞核の、細胞質の、膜の、または分泌タンパク質である。必須ではないが、酵素でもよい。標的タンパク質の既知の結合パートナー（たとえあるにしても）は、なかんずく、他のタンパク質、オリゴーまたはポリペプチド、核酸、炭化水素、脂質、または小有機または無機分子またはイオンである。標的タンパク質の生物活性または機能は、制限されないが、以下のものである。キナーゼタンパク質キナーゼチロシンキナーゼトレオニンキナーゼセリンキナーゼヌクレオチドキナーゼポリヌクレオチドキナーゼフォスファターゼタンパク質フォスファターゼヌクレオチドフォスファターゼ酸フォスファターゼアルカリフォスファターゼピロフォスファターゼデアミナーゼプロテアーゼエンドプロテアーゼエキソプロテアーゼメタロプロテアーゼセリンプロテアーゼシステインプロテアーゼヌクレアーゼデオキシリボヌクレアーゼリボヌクレアーゼエンドヌクレアーゼエキソヌクレアーゼポリメラーゼ DNA依存RNAポリメラーゼ DNA依存DNAポリメラーゼテロメラーゼプリマーゼヘリカーゼデヒドロゲナーゼトランスフェラーゼペプチジルトランスフェラーゼトランスアミナーゼグリコシルトランスフェラーゼリボシルトランスフェラーゼアセチルトランスフェラーゼ加水分解酵素ウレアーゼカルボキシリアーゼイソメラーゼヂスムターゼロターゼトポイソメラーゼグリコシダーゼエンドグリコシダーゼエキソグリコシダーゼデアミナーゼリパーゼエステラーゼスルファターゼセルラーゼリアーゼレダクターゼシンテターゼイオンチャンネル DNA結合 RNA結合リガーゼ RNAリガーゼ DNAリガーゼアダプターまたはスカホールドタンパク質構造タンパク質フィブリン（オーゲン）コラーゲンエラスチンタリン腫瘍サプレッサー付着分子オキシゲナーゼオキシダーゼペルオキシダーゼチャペロニン輸送体電子輸送体タンパク質輸送体ペプチド輸送体ホルモン輸送体セロトニン DOPA 核酸輸送体シグナル導入神経伝達物質構造成分ウイルスの細胞の器官の生物の情報担体／貯蔵抗原認識タンパク質 MHC Iコンプレックス MHC IIコンプレックス受容体 TNfα受容体 TNFβ受容体 β−アドレナリン性受容体 α−アドレナリン性受容体 IL-8受容体 IL-3受容体 CSF受容体エリトロポエイチン受容体 FASリガンド受容体 T-細胞受容体 B-細胞抗原受容体Ｆエピシロン受容体成長ホルモン受容体核受容体グルココルチコイドエストロゲンテストステロン結合タンパク質は１個以上のパラトープをもち、同じかまたは異なる。異なるパラトープは異なる結合パートナーのエピトープと相互作用する。各パラトープは特定の結合パートナーに特異的であり、またはいくつかの異なる結合パートナーと相互作用することができる。タンパク質はいくつかの異なる結合部位によって特定の結合パートナーを結合できる。結合部位は連続または非連続である(タンパク質の一次配列に関して)。ペプチドライブラリーペプチドライブラリーは組み合わせライブラリーであり、少なくともそのメンバーのいくつかはペプチドボンドによって結合した３またはそれ以上のアミノ酸をもつペプチドである。ペプチドは、直線、分枝、または環状であり、非ペプチジル部分を含む。アミノ酸は天然に生じるアミノ酸に限られない。偏向したペプチドライブラリーは１またはそれ以上の（しかし全部ではない）ペプチド残基が一定の残基である。各メンバーはペプチドリガンド（ＰＬ）と呼ばれる。１好適例では、内部残基が一定であり、その結果ペプチド配列は次のように書ける。（Ｘ_aa）_m−ＡＡ₁−（Ｘ_aa）_n 式中、Ｘ_aaは任意の天然に生じるアミノ酸、またはシステインを除く任意のアミノ酸であり、ｍとｎは独立して２ないし20の範囲から選択され、Ｘ_aaは同じか異なり、ＡＡ₁はライブラリー中の全ペプチドに対し同じ天然産のアミノ酸であるが、任意のアミノ酸である。好ましくは、ｍとｎは独立して４ないし９の範囲から選択される。好ましくは、ＡＡ₁はペプチドの中央またはその近辺に位置する。さらに好ましくは、ＡＡ₁は(ａ)ペプチドの両端からの少なくとも５個の残基、または(ｂ) ペプチドの中央50％にある。さらに好ましくは、ｍとｎは２以上によって異ならない。もっとも好ましくはｍとｎは等しい。選択されたＡＡ₁がＴＰ結合活性を要する（または少なくとも許される）場合にも、確かに配置されていることを確認するように特定の側面に位置する残基を必要とする。ＡＡ₁が多少中央に位置する場合、ライブラリーはソクメンに位置する残基について多くの代わりの選択を示す。ＡＡ₁が端部にある場合、この順応性は減る。最も好ましいライブラリーはＡＡ₁がトリプトファン、プロリンまたはチロシンである。第二の最も好ましいものはＡＡ₁がフェニルアラニン、アルギニン、アスパレート、ロイシンまたはイソロイシンである。第三の最も好ましいものはＡＡ₁がアスパラギン、セリン、アラニンまたはメチオニンである。最も好ましくない選択はシステインとグリシンである。これらの好適なものは多くの異なるＴＰｓに結合するためランダムペプチドライブラリーをスクリーニングした結果の評価に基づく。ライブラリー内の１位置を固定する効果は、20中１ないし20中 20の特定の残基の発生を増加し、20倍の増加となる。従って、理論では、特定の残基がペプチドの中央で結合するために必要である場合、クローンを発見する割合はランダム残基を用いた場合よりも20倍大きい。従って１個の固定残基をもつ 20ライブラリーを用いて、標的タンパク質にを結合する膜を発見する機会が、完全にランダムなライブラリーを用いるのと比較したとき、増加する[20ｘ(結合のために保存した残基の＃)]。これら20ライブラリー（または少なくともそれらのサブセット）が任意の標的に対し影響し、ペプチドリガンドに対する配列の従来の知識が必要とされない。官能ドメインに結合するリガンドは一定の独特の特徴を両方もつ傾向にある。従って、「偏向した」ペプチドライブラリーを用いて、リガンドを発見する負担を軽くできる。例えば、ＨＰＱはたいていのストレプトアビジン結合ペプチドに生じ、ＨＰＱ側鎖は内部に配向しＴＰストレプトアビジンのビオチン結合部位と相互作用する。残基の若干はビオチンを結合する際に関係しペプチドと相互作用する；しかし、ペプチドは結合決定子を用いる代わりの方法を採用する(Biochemistry 31:935 0-4(1992)[93003082]、ストレプトアビジンと複合したスクリーニングペプチドの結晶構造とリガンド結合の研究、P.C.weber，M.W．Pantohano & L.D.Thompson )。従って、偏向したライブラリー、例えばX(6)-H-X(6)で始める場合、ライブラリーが同種の結合部位をもつペプチドでライブラリーがリッチなので、非常に短期間でおおくの結合ペプチドを発見する。上記例は一定に保持された１個の残基をもつ偏向したライブラリーを示した。この真の効果はその位置で一定の残基をもつペプチドの数を増加することになる。この位置でのこの残基が結合に役立つ場合、標的タンパク質に結合するライブラリーに対し個々の数が増加する。全アミノ酸が等しく示される場合、そのときには可能な結合ペプチドの数が、20の天然産アミノ酸を作ったライブラリーで20倍増加する。異なる割合のアミノ酸を用いるライブラリーは出発ライブラリーでの各残基の割合に従って豊かになる。勿論、ライブラリーが結合をたまたま破壊する一定の残基で偏向する。従って、平行で異なる偏向したペプチドライブラリーの複数をスクリーニングする利点かある。一定のTrp、もう一つの、一定のGlu等をもつことができた。２個の残基を一定に保持し、両方が結合に必要な場合、結合剤の範囲は大量の増加となる。発生の範囲は各位置で独立しており、したがって、２個の残基を保持して定数を倍数的に増加する：等しい表示の簡単な場合には、各一では20倍、または全体では400倍である。これを支持する証拠は２個の残基の偏向したライブラリーを用いて発見され、srcホモロジイ３ドメイン（SH3）に結合するペプチドを豊富にする(Proc．Natl．Acad．Sci．USA．93:1540-1544（1996）Distinct ligand preferences of Src homology 3 domains from Src，Yes,Abl，Cortac tin，p53bp2，PLCgamma，Crk，and Grb2．A．Sparks，J．Rider，N．Hoffinan,D .Fowlkes,L.Quilliam,and B.Kay)。著者は同じサイズと複合性のランダムライブラリーの約100倍以上のSH3結合ファージの力価の増加を見出した。これはこれらライブラリーの理論量に近い((31の可能なコドンによって割ったＰに対する２コドン）²＝240倍の増加)。結合に必要なことが知られている２位置での偏向したライブラリーの使用は極端に強力な道具である。しかし、集合して全部の11個のアミノ酸ペプチドを含む平行な偏向したライブラリーを、各偏向したライブラリーにおいて、２個の一定の残基を用いて作ることは、44,000のライブラリーを要する。(固定した残基１につき11位置×20アミノ酸×固定した残基２につき10位置×20アミノ酸)。一定の残基の１が常に中央残基であった場合にも、4,000のライブラリーがある。このライブラリーの数をスクリーニングしながら、結合ペプチドの数の増加は多分仕事の複雑さを正当化するものではないであろう。しかし、ライブラリーの数が 100以下に制限される場合、これらを比較的容易にスクリーニングできる。次の仮定およびアプローチを用いる場合、この実際のレベルに仕事を減らすことができる。先ず、いくつかの残基はる維持した官能基をもち、ペプチド標的相互作用に対し相互変換できる場合が多い。さらに、遺伝子コードでの縮重によって、多くのアミノ酸が縮重されるべきコドンにおいて１個の塩基を許して符号化できる。アミノ酸をグループにして、次の方法でコード化することができる。これは１３まで変化する数を減らし、しかしこれは未だ、1690（13×13×10）ライブラリーを要し、中央残基をもつ11量体における可能な組み合わせ全部と、残りの10位置を走査する１の追加の一定残基を示す。この数は、次の方法で混合したオリゴヌクレオチドを用いるライブラリーを構築して10倍に減らすことができる。この例では、中央残基がＷとして一定に保持される(TTGにより符号化される)、Ｄ、Ｅ（GAXにより符号化される）は残り10位置によって走査される。ライブラリーを構築するため、10オリゴヌクレオチドが合成される。これらは、２本鎖オリゴヌクレオチドに変換され、共に混合され、ファージ表示ベクターに従来法によりグループとしてクローン化される。最終結果は中央Ｗ残基をもち、10側面位置のおのおのにＤまたはＥに富んだペプチドを表示するライブラリーである。側面残基に富んでいることはペプチドにつき一度だけ起こり、これによりペプチドの残りがランダムになる。このようにして、豊富になった残基（この場合ＤまたはＥ）が位置１の結合を増加するが、他の位置の結合を削除する場合に、これらライブラリーはなお更に高い数のペプチドに対し、標的タンパク質を結合する能力でコード化する。これはトリプレットコドンサブユニットからのライブラリーを構築し各位置に示される各コドンの割合を変化させ、単一コドンからライブラリーを構築する利点がある。この計算に加えられた追加の複雑なものの１つは、全20アミノ酸を示すための NNKコーディング図の使用である。残基Ｌ、Ｒ、およびＳはこの図では３倍の表示過多を示しているが、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｇ、およびＰは２倍の表示過多示している。これらの残基はNNKコーディング図を用いて更に高く、これら残基に富むことによって単離された代用物リガンドの数の増加は、１回だけコードされるこれら残基よりも小さい。表示過多／表示不足の程度は各位置での塩基の非等モル混合物を用いて減らすことができる。この問題は核酸がトリプレットによるトリプレットを合成した場合、塩基による塩基よりも、全体的に避けられ、各段階でそれぞれ異なるアミノ酸を符号化する20個の可能なトリヌクレオチドから１っ加える。タンパク質−ペプチド相互作用に重要である残基が豊富なことが望ましい。これら残基は他のアミノ酸と相互作用できあまりきつく詰められていない側鎖を含み、他のリガンドとの相互作用の自由度を大きくする。タンパク質結合部位での残基の研究はＲ、Ｈ、Ｗ、およびＹの過多表示を示した(Villar and Kauvar，FEBS Letters 349:125-130（1994）タンパク質結合部位でのアミノ酸優先)。一連のタンパク質に対しファージ表示から引き出したペプチド配列の編集は、アミノ酸が等量で見出されない、すなわち、いくつかのアミノ酸は他のアミノ酸よりも頻度多く種々の標的に結合することがペプチドにおいて現れることを示している。 16タンパク質のいずれかに結合するペプチドにおいて残基発生の生の範囲を示すグラフは図３である；図４はコドン利用のため修正する効果を示す。芳香族残基、プロリン、システィンおよびアスパラギン酸の明確な過多表示がある。固定した残基をもちまたは表示したペプチドにより走査する偏向したライブラリーは好ましいが、過少表示される残基（例えばアラニン、メチオニン、およびリジン）をもつ偏向したライブラリーは、残りの固定した残基を含みまたは中間物有用性を走査するライブラリーではあまり好ましくない。新規ペプチドは追加の標的について記載されているが、このデータセットが更新され再評価される必要があるが、その傾向は全く明らかである。残基が好ましいと決定する経験的方法はタンパク質の代表的混合物を見つけランダム合成ペプチドライブラリーに結合する。結合しなかったペプチドを洗浄した後、残りのペプチドを溶出し、結合した残りの残基のモル比を決定できた。概略は残基がタンパク質の元の混合物に結合するペプチドとなることを語っている。このアプローチはまた各標的に働き、結合に重要な残基の初期情報を与える。残基が好ましいことを決定するための代わりの方法は、タンパク質の混合物を見つけ、表示したペプチドの１残基を固定し結合ファージを選択する１組のファージ表示ライブラリーを用いる。アフィニティ選択の数ラウンド後に、最大数の結合ファージをもつライブラリーは固定した残基が表示ペプチドの結合に寄与するものである。上記の情報を用いて、ライブラリーの数を、一定に保持された中央残基がグループ１から７および13である場合に、大きく減らすことができる。Ｃ残基は一定に保持されたＣがペプチドの端部に置かれる特別の場合である。しかしループを含んだシステインをもつライブラリーのための特別な用途があり(実施例１、２、および４参照)、この方法は特にこれらライブラリーから結合ペプチドの数を増加するために特に有用である。これら８個の一定残基はグループ１−７からの残基と一緒にすることができ、56ライブラリーの構造パネルに、構成し操作するための実際の数を与える。一定の合成戦略は上で議論したが、本発明は一定に保持された１またはそれ以上の予定した組み合わせまたは所定の位置でアミノ酸の特定の混合物をもつペプチドライブラリーを合成する任意の特定方法に制限されない。偏向したライブラリーについて考慮する他の方法は、複合性を生じる更に充分な方法を示すことである。ＴＰの結合部位の構造的性質は一定の残基をもつPLs のみ、Ｗが結合できるようなものである場合、単一の固定した中央に配置したＷは、独特のメンバーの同じ数を持つ全体にランダムなライブラリーよりも、可能な結合モチーフをもつであろう。しかし、固定したＷをもつライブラリーの使用は実際に、ＷとTPsを結合しない（そして特にそれらができない）場合、障害となることが容易に明らかである。従って、特異的TPに結合する同定された異なったPLs間で普通に分かつ任意の明白なモチーフに注目することが重要である。これは２つの目的がある。先ず、 TPが１以上の官能ドメイン(FD)をもつ場合、PLsの２つの明確な母集団に結合できる。それ自体薬剤スクリーニングを実際に企画する前にこれを識別することが望ましい。TPに単一FD以上のものがある場合、スクリーニングおよび全FDsにスクリーニングを行うことによって導かれた適当な薬剤を見出す見込みは増加する。可能な薬剤に対する標的のドメインが相互作用すればそれだけ、特定のTPに働く化合物を同定することが多くなる。しかし、実際に存在する場合、多数のFDs を検出できる保証はない。例えば、TPは２つの非常に似たFDsを持ち(例えばアダプタータンパク質Grb-2内の２個のSH3ドメイン)、従ってPLsはTpが２個のFDsを持ったとしても単一クラスである。二番目に、モチーフを公正する残基側鎖の化学的性質はLP／FD相互作用の性質について非常に有用な情報を与える。この情報は特定の化合物ライブラリーに、またはスクリーニングプロセスのための化合物ライブラリーの一定のサブセットに注意を向ける際に役立つ。各アミノ酸は、サイズ、チャージおよび親水性との特定の特徴と、特徴ある側鎖をもつ。特定のアミノ酸がペプチドライブラリーの一定の位置に有利である場合、どの置換体が化合物ライブラリーに有利であるかを示唆する。いくつかの例を以下に示す：残基考慮する置換体 Ser、Thr ヒドロキシル化種、特に天然で脂肪族のもの。またチオール化した種。 Asp、Glu カルボキシル化種、特に天然で脂肪族のもの。エステルおよびアルコール Asn、Gln カルボキシル化種；アミド Lys、Arg アミン化種；デルターグアニドグループの誘導体。 His 脂環式チッソ特にイミダゾール誘導体をもつ芳香族化合物 Phe 芳香族化合物、置換したまたは置換していない。 Tyr Pheに関する限り、しかしまたヒドロキシル化種。 Trp 芳香族構造、特に２または３個の縮合環をもつ；環は脂環式チッソを含む；インドール誘導体は特に関心がある。 Cys チオール化およびヒドロキシル化種。 Met チオール化種；スルフォニウム塩；スルフォキシド；スルフォン。 Ala、Val、脂肪族炭化水素 Leu、Ile Pro ピロリジン誘導体これらは示唆するものであり、必須ではないことを強調する。最も「ヒット」を与えるらしいライブラリーに優先権を与えることをここでは「合理的ライブラリー選択」と呼んだ方がいい。１個以上のペプチドリガンドを同定する場合、それぞれについて試験できる。拮抗的阻害はそれらが同じ部位に結合することを意味する；それがないと、異なる部位に結合する。TPの官能ドメインが知られている場合、これらのドメインはリガンドがどのドメインを結合するかを同定するスクリーニング標的として別々に使用できる。ペプチドライブラリーは生物学的または非生物学的な合成法で調製できる。生物学的方法では、関心のあるペプチドを符号化する遺伝子は、ペプチドが細胞の表面または細胞により生成したファージの外殻のいずれかに表示されるように、ホスト細胞に発現する。勿論、多様性を達成するため、遺伝子をペプチドの可変残基に対応するコドンにてランダム化しなければならない。従って、単一DNA ではなく、むしろDNA混合物であり、ホスト細胞培養基に導入され、その結果、各細胞はDNAが受けるものによって、ライブラリーの多くの可能な任意のペプチド配列を発現する可能性もつ。(平均では、各細胞は混合物の配列の１のみを発現する)。遺伝子は、合成過程で、適当な合成サイクル中に純ヌクレオチドよりはむしろヌクレオチドの混合物を用いてランダム化できる。合成サイクルは一度に１個の塩基を、または全コドンを添加できる。ペプチドライブラリーはまたアミノ酸を徐々に添加して非生物学的に調製できる。種々の残基を組み込むサイクルの間に、活性化したAAはAA混合物からランダムに選択される。好ましくは、合成は固体、例えばピンまたはビーズ表面で行われる。参照（Proc Natl Acad Sci USA 81:3998-4002(1984)[84248046]、単一アミノ酸の分解に対しエピトープ用ウイルス抗原をプローブするペプチド合成の使用、H.M.Geysen，R.H.Meloen & S.J.Barteling）またはビーズ(Nature 354:82-4 (1991)[92049760]リガンド結合活性を同定するための合成ペプチドライブラリーの新しいタイプ、K.S.Lam，S.E.Salmon,E.M．Hersh，V.J．Hruby，W.M.Kazmiers ki & R.J.Knapp)。ペプチドライブラリーが固相であるなら、標識を付けるべき標的タンパク質に有用である。標識をつけたTPによりマークされたペプチドは配列される。好ましくは、標識は最少数のステップのみが必要であるようなものであり、ラジオアイソトープの使用に要求されるような特定の取り扱いを最小にできるものである。適当なエピトープ、例えば、cMycまたはインフルエンザヘマグルチニン、または酵素、例えばベーターガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)、またはフルオロクロマチックタンパク質（例えば、藻類の緑蛍光タンパク質）が、組替えDNA技術を用いてTPの一次構造に組み込まれる。このようなエピトープは手軽に抗体を共役する適当な酵素（アルカリ性ホスファターゼはセイヨウワサビパーオキシダーゼが好ましい）を用いて検出される。組替え技術によって組み込まれる他の標識は、³²ＰでのTPの迅速充分な標識付けを可能にするタンパク質キナーゼＡのような酵素に対し基質部位を含む。あまり好ましくないが、実行できるが、インヴィヴォで¹⁴Ｃまたは³ Ｈ標識のアミノ酸またはインヴィトロで¹²⁵Ｉのような組替えタンパク質のラヂオ標識がある。ペプチドライブラリーが液相である場合、Tpは固定化でき、以下に参照される Cantryの方法で、ライブラリーはスクリーニングされる。標的はクロマトグラフ媒体であるいは直接、例えばAffigel（BioRad）を用い、または間接に固定化できる。間接の固定化では、TPはアフィニティ試薬によって支持体に非共有的に結合される。例えば、６個のヒスチジンで標識を付けた標的タンパク質はQiagenニッケル結合樹脂、またはグルタチオンセファローズ（Pharmacia）に固定化したＧＳＴ標識を付けた標的、またはマルトース（New Ingland Biolabs）またはデキストラン媒体に固定化したマルトース結合タンパク質／標的タンパク質融合で固定化できる。続いて、Cantleyらの方法によって所望の活性をもつペプチドを分離するように固定化した標的を用いる(Trends Biochem Sci．20:470-475（199 5）[96108162]Recognition and specificity in protein tyrosine kinase-medi ated signalling．S．Zhou & L．C．Cantley and Methods Enzymol 254:523-535 （1995）[96052729]SH2 domain specificity determination using oriented ph ospho-peptide library S．Zhou & L．C．Cantley and Cell 72:767-78（1993） 93201599 SH2 domains recognize specific phosphopeptide sequ-ences．S．Zh ou，S．E．Shoelson，M．Chaudhuri，G．Gish，T.Pawson，W．G．Haser，F．Kin g，T．Roberts，S．Ratnofsky，R．J．Lechleider & ...)．この方法では、ペプチドの混合物はTPから溶出し全混合物は自動化技術で配列される。有用な情報は、固有の１のアミノ酸が、例えば「固定した」x-x-x-x-Y-x-x-x-x-xである偏向したペプチドライブラリープールを用いて最も容易に達成される。チロシン（Ｙ）が実際にTP内に含まれるドメインに対し結合モチーフに含まれる場合、モチーフ内の他の残基はチロシンに記録される。従って、同種の結合ペプチドがチロシンに続くロイシンをもたなければならない場合、プールの配列決定はx-x-x-x-Y- L-x-x-x-xの配列を生じる。自然結合パートナーの前の知識なしで、19までの（システインを除く全アミノ酸）ライブラリープールを用いることが好ましい。これはランダムペプチドプールのコストがひどく高いので実際に非常に当惑させられる。好ましくは、奇数のシステインとペプチドが良く結合しないような成分としてシステインを避ける。ファージライブラリーをスクリーニングする際に、また結合しないファージを除去できるので、固体支持体にTPを固定化するようにする。(Science 249:404-6 （1990）[90333257]，Random peptide Iibrarles:a source of specific protei n binding molecules，J．J．Devlin，L．C．Panganiban & P．E．Devlin;Scien ce 249:386-90（1990）[90333256]，Searching for peptide ligands with an e pitope library，J．K．Scott & G．P．Smith;Gene 128:59-65（1993）93285470 ，An M13 phage library displaying random 38-amino-acid peptides as a sou rce of novel seguences with affinity to selected targets，B．K．Kay，N． B．Adey，Y．S．He，J.P．Manfredi，A．H．Mataragnon & D．M．Fowlkes)．ファージ表示ライブラリーからのペプチドと比較して支持体（例えば、ピンまたはビーズ）上の化学合成アプローチを用いるペプチドを同定する利点は、多様性の重要な追加源を与えるペプチドを含むＤアミノ酸の同定が容易であることによる。逆に言えば、ファージ表示ライブラリーを用いる利点はピン（多分10⁴または10⁵）または可能性のあるビーズ（多分10⁶）よりも大きい数をスクリーニングできることである。ペプトイドライブラリーペプトイドは、ペプチドに似たオリゴマーであり、ペプチド結合（−NHCO−）が類似している結合で置換されている。例えば、−NH−は−NR−で置換でき、ここでＲはＨとは別の官能基である。これは、例えば、−Ｏ−、−Ｓ−、または− CH＝CH−のような等電子配置のものと置換できる。−CO−は例えば、−SiO−、 −CS−、−SO₂−、−PO(OH)−、または−COR−と置換できる。ペプトイド中の結合が同一であることは必要ない；たとえば、多様性の追加の（または代替）源として、各−NRCO−のＲが異なる。ユニット間の主鎖結合の少なくとも１がペプチジルボンドでないとすれば、ペプトイドは１またはそれ以上のペプチジルボンドを含むことができる。ペプトイドライブラリーを生物学的に調製できないことを除き、ペプトイドはスクリーニング工程のためのペプチドのそれに似ている利点を楽しむであろう。化合物ライブラリー化合物ライブラリーは組み合わせライブラリーであり、実際に、標的タンパク質の生物活性を仲介する能力を持つ場合にメンバーが薬剤として使用するに適している。ペプチドは薬剤として一定の欠点をもつ。これらは血清プロテアーゼによって分解を受けやすく、細胞膜を貫通することが難しい。好ましくは、化合物ライブラリーの化合物の全部または殆どが、１またはそれ以上の製薬学的ペプチドの欠点を避ける、または少なくとも同じ程度で欠点をもつことがない。化合物ライブラリーを設計する際に、新しい薬剤を得るために一般に使用した分子修飾の方法を覚えておく助けになる。これらの基本的な種類の修飾は同定できる：分離、リード薬剤はその成分薬傾向部分を同定するため簡単にされる；結合、同じか異なる２またはそれ以上の既知の薬傾向部分が共役的にまたは非共役的に会合させ新しい薬剤を生成する；そして改変、１の部分が同じか異なるが、事実上、離段または分離する他の部分と置換される。「分離」、「結合」および「改変」の語の使用は元のリードへの最終製品の構造的関係を意味するだけのものであり、どのように新しい薬剤が実際に合成されるかではない、もっとも２つが同じであることは可能であるが。分離の工程はフィソスチグミン（1925）からのネオスチグミン（1931）およびエンドロフォニウム（1952）の考案によって示される。次の結合はデメカリウム（1956）およびアンベノニウム（1956）によって示される。改変はサイズ、極性、またはもとの部分の電子分布を変えられる。改変は環閉鎖または開放、更に低いまたは高い同族体の形成、二重結合の導入または飽和、光学的に活性な中心の導入、嵩高基の導入、除去または置換、等配電子または生命等配電子置換、基の位置または配向の変化、アルキル基の導入、および阻害または促進、誘導（静電気または共役（共鳴）効果への考察での基の導入、除去または置換を含む。このように、置換基は電子受容体および／または電子供与体を含む。代表的なでんし供与体(＋Ｉ)は−CH₃、−CH₂R、−CHR₂、−CR₃および−COO^-を含む。代用的な電子受容体(−I)は−NH₃＋、−NR₃+、−NO₂、−CN、−COOH、−C OOR、−CHO、−COR、−COR、−Ｆ、−Cl、−Br、−OH、−OR、−SH、−SR、−CH =CH₂、−CR=CR₂および−C=CH−を含む。置換体はまた共役系において電子密度の増加または減少するものを含む。前者（＋Ｒ）基は−CH₃、CR₃、−Ｆ、−Cl、−Br、−Ｉ、−OH、−OR、−OCOR、−SH 、−SR、−NH₂、−NR₂、および−NHCORを含む。後者（−Ｒ）基、−NO₂、CN、− CHC、−COR、−COOH、−COOR、−CONH₂、−SO₂Rおよび−CF₃を含む。合成的には、修飾は種々のユニットプロセスにより達成され、求核および親電子置換、還元および酸化、添加除去、二重バンド開裂、および環化を含む。ライブラリーを構築するため、１またはそれ以上の製薬活性（これは標的タンパク質の既知のまたは疑われる活性に関連する必要はない）をもつ化合物、または化合物の族は、２またはそれ以上の既知または可能な薬傾向部分に分離できる。これら部分の各類似体は同定でき、これら類似体の混合物はリード化合物へのいくらかの類似性をもつ化合物を再集合するように反応させる。ライブラリーの全メンバーがリード化合物の部分全部に類似の部分を持つ必要はない。ライブラリーの設計はベンゾジアゼピンの例で説明することができる。クロロジアゾエポキシド、ジアゼパンおよびオキサゼパンを含むいくつかのベンゾジアゼピン薬剤は、抗不安剤に用いられた。ベンゾジアゼピン誘導体は広く行きわたった生物活性をもつ；誘導体は抗olyticsとしてだけでなく、抗convalsants、コレシストキン（CCK）受容体サブタイプＡまたはＢ、カッパオピオイド受容体、血小板活性因子、およびＨＩＶトランスアクチベイターTat拮抗薬、およびGPIIb IIa、転換転写酵素およびラスfarnesyltransferase阻害剤として作用することが報告された。ベンゾジアゼピン構造は２−アミノベンゾフェノン、アミノ酸、およびアルキル化剤に分離された。参照bunin,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9 1:4708(1994)。少ない２−アミノベンゾフェノン誘導体のみが市販されているので、後に２−アミノアリールスタンネート、酸クロリド、アミノ酸、およびアルキル化剤に分離された。Bunin et al.,Meth.Enzymol.,267:448(1996)。アリールスタンナンは他の部分が置換されている、または全４個が各ライブラリーメンバーを作るように結合するものが等しいと考えられているコア構造を考慮することができる。基本ライブラリー合成プランおよびメンバー構造は図１に示される。酸クロライド構築ブロックはＲ¹部位で変異制を導入する。Ｒ²部位はアミノ酸によって導入され、Ｒ³部位はアルキル化剤によって導入される。Ｒ⁴部位はアリルスタンナンに固有である。Buninらは20の酸クロライド、35のアミノ酸、および16のアルキル化剤から調製された11,200の異なる誘導体の１，４−ベンゾジアゼピンを生成した。（Ｒ4には多様性は導入されなかった；このグループは固相に文しを結合するために用いた。）Availabl Chemicals Directory（HDL Information Syst ems,San Leandro CA）によれば、300以上の酸クロライド、80のFmoc保護アミノ酸および800アルキル化剤が市販されていた(さらに、勿論、合成できた)。用いた特定部分は構造分散を最大にするように選択されるが、マイクロ力価プレートのウェルで手軽に合成されるように数を制限した。構造が類似している化合物間の選択では、置換化合物が少ないものが好ましい。可変要素は脂肪族および芳香族の基を含む。脂肪族の基は、非環式および環式 (モノ−またはポリ−)構造、置換したまたは置換していないものを試験した。( 非環式基の全部が線状であり、分枝脂肪族を導入することは容易であった)。芳香族の基は単環および複環、融合または融合していない、置換または置換していない、ヘテロ原子を持つまたは持たない。二次置換体は−NH₂、−OH、−OMe、− CN、−Cl、−F、および−COOHを含んでいた。使用しないが、スペーサー部位、たとえば−Ｏ−、−Ｓ−、−OO−、−CS−、−NH−、および−NR−を組み込むことができた。 Buninらは1，4−ベンゾジアゼピンをコア構造として用いるかわりに、代わりに１，４−ベンゾジアゼピン−2，5−ジオン構造を用いることを示唆した。 Buninらが注目したように、必ずしも必要ではないが、さらに異なったライブラリーの構築ができるように、結合機能性の跡を残さない結合戦略を用いると有利である。当該分野で既知または示唆されている他の組み合わせ非オリゴマー化合物ライブラリーは、カルバメート、メルカプトアシル化ピロリジン、フェノール剤、アミンイミド、Ｎ−アシルアミノエーテル(アミノアルコール、芳香族ヒドロキシ酸、およびカルボン酸から作られた)、Ｎ−アルキルアミノエーテル（芳香族ヒドロキシ酸、アミノアルコールおよびアルデヒドから作られた）１，４−ピペラジン、および１，４−ピペラジン−6−オンを基礎とした。 Dwittet al.,Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),90:6909-13(1993)は、40の別々のヒダントインと40の別々のベンゾジアゼピンの同時であるが分離の合成を記載している。かれらは合成を、配列フォーマットで、他の従来の同時合成技法（例えば、ウェルまたはピン）とは違って、固体支持体（ガス分散チューブ内）で行った。ヒダントインは先ず同時脱保護で次に各５つのアミノ酸樹脂を８つのイソシアネートで処理して合成した。ベンゾジアゼピンは５つの脱保護アミノ酸樹脂のおのおのを８つの2−アミノベンゾフェノンイミンのおのおので処理して合成した。 Chenetal.，J．Am．Chem．Soc.，116:2661-62(1994)はホルメートエステルのパイロット（９メンバー）組み合わせライブラリーを記載している。ポリマービーズ結合アルデヒド調製は３つのアリコートに「分割」し、各々は３つの異なるイリド試薬の１つで反応させた。反応生成物は一緒にして、３つの新しいアリコートに分け、その各々は異なるマイケルドーナーで反応させた。化合物同定はガスクロマトグラフィー／マススペクトロスコピー分析によって単一ビーズ主薬で検出できることが見出された。 Holmes，USP 5,549,974(1996)はチアゾリジノンおよびメタチアザノンのライブラリーの組み合わせ合成のための方法論を示している。これらライブラリーはアミン、カルボニル化合物、および環化条件でのチオールを組み合わせて作られる。 Ellman，USP 5,545,568（1996）はベンゾジアゼピン、プロスタグランジン、ベーターターンミメチクス、およびグリセロール基礎の化合物の組み合わせ合成を記載している。参照Ellman,USP 5,288,514。 Summerton，USP 5,506,337（1996）はモルフォリノサブユニット構造を優勢的に形成した組み合わせライブラリーを調製する方法を開示している。複素環式組み合わせライブラリーは一般にNezi et al.,Chem.Rev.97:449-72 （1997）を再検討する。評価される候補の簡単なライブラリーの例は次の誘導体を含む。１個のヘテロ原子を含む環状化合物ヘテロチッソピロールペンタ置換ピロールピロリジンピロリンピロリンインドールベーターカルボリンピリジンジヒドロピリジン１，４−ジヒドロピリジンピリド［2,3−ｄ]ピリミジンテトラヒドロ−３Ｈ−イミダゾ[4，５−ｃ]ピリジンイソキノリンテトライソキノリンキノロンベーターラクタムアザビシクロ［４．３．０］ノネン−８−オンアミノ酸ヘテロオキシゲンフランテトラヒドロフラン 2，5−二置換テトラヒドロフランピランヒドロピラノンテトラヒドロピラノンガンマーブチロラクトンヘテロ硫黄スルフォン２またはそれ以上のヘテロ原子を含む環状化合物多重ヘテロチッソイミダゾールピラゾールピペリジンジケトピペラジンアリールピペラジンベンジルピペラジンベンゾジアゼピン１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオンヒダントイン５−アルコキシヒダントインジヒドロピリミジン１，３−二置換−５，６−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン環状ウレア環状チオウレアキナゾリンキラル３−置換−キナゾリン−２，４−ジオントリアゾート１，２，３−トリアゾートプリンヘテロチッソおよびヘテロ酸素ジケロモルフォリンイソキサゾールイソキサゾリンヘテロチッソおよびヘテロ硫黄チアゾチジンＮ−アキシルチアゾリジンジヒドロチアゾール２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゼート２−アミノチアゾールチオフェン３−アミノチオフェン４−チアゾリジノンベンズイソチアゾロンライブラリーの合成の詳細は、参照Nefzi，et al.，Chem．Rev，97:449-72( 1997)、ここに引用した参考文献も参照。次のタイプの１またはそれ以上の部分をライブラリーの化合物に組み込むことができ、多くの薬剤は１またはそれ以上の次のカテゴリーに含まれる。アセタール酸アルコールアミドアミジンアミンアミノ酸アミノアルコールアミノエーテルアミノケテンアンモニウム化合物エノールエステルエーテルグリコシドグアニジンハロゲン化化合物炭化水素ケトンラクタムラクトンマスタードチッソ化合物ニトロソ化合物有機ミネラルフェノールキノンセミカルバゾンスチルベンスルフォンアミドスルフォンチオールチオアミドチオウレアウレアウレイドウレタン全製薬学クラスの薬剤、または薬剤構造を徹底的に列挙することなく、下記の化学構造の１またはそれ以上の化合物は支持された製薬活性を示すことが見出されており、これら構造、または誘導体は、同じまたは異なる活性の化合物に対しスクリーニングする際にデザイン原子として用いることができる。（いくつかの場合には、そのクラスの１またはそれ以上のリード薬剤が指示される。）催眠薬高級アルコール（クロメチアゾール）アルデヒド（水化クロラール）非環式ウレイド（アセチルカルブロマール）バルビツレート（バルビタール）ベンゾジアゼピン（ジアゼパム）抗痙攣剤バルビツレート（フェノバルビタール）ヒダントイン（フェニトイン）オキサゾリジンジオン（トリメタジオン）スクシンイミド（フェンスクシニミド）アシルウレイド（フェナセミド）麻酔鎮痛剤モルフィネフェニルピペリジン（メペリジン）ジフェニルプロピルアミン（メソトリメプラジン）鎮痛、抗発熱、抗リューマチ剤サリチレート（アセチルサリチル酸）ｐ−アミノフェノール（アセトアミノフェン）５−ピラゾロン（ジピロン）３，５−ピラゾリジンピオン（フェニルブタゾン）アリール酢酸（インドメタシン）副腎皮質ステロイド（コーチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン、トリアムシロン） athranilic acids 神経弛緩剤フェノチアジン（クロロプロマジン）チオキサンテン（クロロプロチキセン）レセルピンブチロフェノン（ハロペンドール）不安緩解剤プロパンジオールカルバメート（メプロバメート）ベンゾジアゼピン（クロロジアゾエポキシド、ジアゼパム、オキサゼパム）ａｎｔｉｄｉｐｒｅｓｓａｎｔトリサイクリック（イミプラミン）筋肉／弛緩剤プロパンジオール及びカルバメート（メフェネシン）ＣＮＳ興奮剤キサンチン（カフェイン、テオフィリン）フェニルアルキルアミン（アンフェタミン）（フェネチリンはフェオフィリンとアンフェタミンの結合物）オキザゾリジノン（ペモリン）コリン作用薬コリンエステル（アセチルコリン）Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバメートアドレナリン作用薬芳香族アミン（エピネフリン、イソプテレノール、フェニルエフリン）脂環式アミン（シクロペンタミン）脂肪族アミン（メチルヘキサンアミン）イミダゾリン（ナファゾリン）抗−アドレナリン作用薬インドールエチルアミンアルカロイド（ジヒドロエルゴタミン）イミダゾール（トラゾリン）ベンゾジオキサン（ピペロキサン） β−ハロアルキルアミン（フェノキシベンズアミン）ジベンズアゼピン（アザペチン）ヒロラジノフサラジン（ヒドララジン）抗ヒスタミン剤エタノールアミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ）エチレンジアミン（トリペレンナミン）アルキルアミン（クロルフェニルアミン）ピペラジン（シクリジン）フェノチアジン（プロメタジン）局所麻酔剤安息香酸エステル（プロカイン、イソブカイン、シクロメチカイン）塩基アミド（ジブカイン）アニリド、トルイジン、２，６、−キシリジド（ライドカイン）三級アミド（オキセタカイン）血管拡張剤ポリオールナイトレート（ニトログリセリン）利尿剤キサンチンチアジド（クロロチアジド）スルホンアミド（ｃｈｌｏｒｔｈａｌｉｄｏｎｅ）抗駆虫薬シアニン染料抗マラリア薬４−アミノキノリン８−アミノキノリンピリミジンビグアニドアクリジンジヒドロトリアジンスルホンアミドスルフォン抗バクテリア薬抗生物質ペニシリンセファロスポリンオクタヒドロナフサセン（テトラサイクリン）スルホンアミドニトロフラン環状アミンナフチリジンキシレノール抗腫瘍剤アルキル化剤ナイトロジェンマスタードアジリジンメタンスルフォナートエステルエポキシドアミノ酸拮抗剤葉酸拮抗剤ピリミジン拮抗剤プリン拮抗剤抗ビールス剤アダマンタンヌクレオシドチオセミカルバゾンイノシンアミジン及びグアニジンイソキノリンベンズイミダゾールピペラジン薬理学的クラスについては、参照、例えば、Medical Pharmacology:Principle s and Concepts (C.V.Mosby Co.:８^thed．1976);Korolkovas and Burckhalter，E ssentials of Medicinal Chemistry(John Wiley & Sons,Inc.:1976)。合成法については、参照、例えば、Warren，Organic Synthesis:The DisconnectionAppro ach (John Wiley & Sons，Inc.:1982);Fuson，Reactions of Organic Compounds (John Wiley & Sons,Inc.:1966);Payne and Payne,How to doan Organ ic Synthesis (Allyn and Bacon,Inc.:1969);Greene,Protective Groups in Orga nic Synthesis (Wiley-Interscience)。置換基の選択については、参照、例えば、Hansch and Leo,Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemi stry and Biology (John Wiley & Sons,Inc.:1979)。ライブラリーは好ましくは各メンバーが同定できるように合成することが好ましく、メンバーが活性であることが示される場合、それを分析する必要がない。いくつかの同定法が提案されている。（１）符号化、すなわち、メンバーそのものよりも容易に同定される同定部分の各メンバーへの付着。これは標識がそれ自体共役体の活性に影響できる利点をもつ。（２）空間的アドレッシング、すなわち、各メンバーはマトリックス上または中で特定の座標でのみ合成される。これは例えば、特定のピンの位置、またはマイクロ力価プレートの特定のウェルで良い。本発明は同定の任意特定の形をに制限されない。しかし、種々の構築ブロックの特徴あるスペクトル証拠に基づき、活性であると見出されるライブラリーのこれらメンバーを簡単に特徴付けることは容易である。固相合成は誘導体が形成されるよりも大きいコントロールを可能にする。しかし、固相は活性を妨げることができた。この問題を解決するため、合成後、スクリーニング前に、各メンバーの分子の若干または全部を遊離させることができた。化合物ライブラリーのスクリーニング充分なスクリーニングを行うには多くの適当なフォーマットがある。フォーマットの選択は、一部、スクリーニングされる化合物ライブラリーの性質に依存する。ピンまたはビーズに固定化した化合物からなる固相ライブラリーは、可溶性化合物からなる化合物ライブラリーとは異なってスクリーニングしなければならない。一般に、可溶性化合物のアッセイは、１）固定化標的および２）可溶性標識リガンドからなる。アッセイの設計はＰＬ／ＴＰコンプレックスの形成を測定するようにする。ＰＬの同種のものにＴＰ結合部位（すなわち、そのＦＤ）を結合しＰＬの結合、およびＰＬ／ＴＰコンプレックスの形成を妨げる化合物。このような相互作用は一次速度論に従う、すなわち、形成されたコンプレックスの量は化合物の増加量とともに減少する。可能なユーティリティをもつ化合物は特異性の要素を示すだろう。これは有用な化合物は１または若干のみのＰＬ／ＴＰコンプレックスの形成を阻害するであろうが、全部ではない。それ自体読み出しの阻害のためのコントロールを含むアッセイキットを確立する必要がある。例えば、形成したＰＬ／ＴＰコンプレックスの量の読み出しがアルカリ性フォスファターゼを用いるエリサアッセイによる場合、ＬＰ／ＴＰコンプレックスの阻害に対するフォスファターゼの試験化合物の阻害間を区別することができることが必要である。注：本発明を用いて確立される全スクリーニングが同じ試薬、すなわち、ＰＬとタンパク質標的を一般的に含むので、主題のプロセスの固有の利点がある。その理由は、多くの機能的に同じおよび同じでないＰＬ／ＴＰコンプレックスが仮想により同時に試験できるので、所定の化合物の活性が非常に容易に決定できるからである。本発明の特定の自励では、標的は関心あるＴＰとその同種のＰＬである。ＰＬがペプチドであるから、ＰＬを標識付ける手段が多い。ペプチドの標識付けの非常に手軽な方法はそのアミノまたはカルボキシ末端に結合したビオチン部分を用いて科学的に合成することである。好ましくは、ビオチン部分は、タンパク質ループ（逆回転）で、または天然マルチドメインタンパク質、例えば、グリシンとセリン残基のインタードメイン空間で、１またはそれ以上の残基を付加して上記のペプチド配列から分離される。しかし多くの変更が例えば２個のグリシン、Ｇ −Ｓ−Ｇ、Ｓ−Ｇ−Ｓ等に良く働く。ＴＰ内のＦＤに結合するペプチドの残基からいくらか離れた距離に柔軟に結合したビオチンを持つことがその目的である。ＰＬ／ＴＰコンプレックスが形成すると、市販されているアルカリ性フォスファターゼ共役ストレプトアビジンを用いる方法によって、第三のコンプレックスを形成し次いでアルカリ性フォスファターゼに対し可溶性比色計基質を用いて検出する方法によって検出することができる。時間単位当たり加水分解された基質の量は最初の存在するＰＬ／ＴＰコンプレックスの量を直接反映しているので、速度諭的容量のマイクロ力価プレートリーダーを手軽に用い、最初のスクリーニングの化合物の多数の希釈を試験する必要がなく、所定の化合物によるコンプレックス形成の阻害を評価できる。ストレプトアビジンコンプレックスヘビオチニル化ペプチドをプリコンプレックスすることが好ましい。これはそれ自体でそしてＰＬ試薬の結合価を増加してアッセイで要求される工程の数を減らし、従って更に強いシグナル対ノイズ比に導く明らかな親和力を増加する。ＰＬ／ＴＰコンプレックスの親和力が特に低い場合、更に大きい親和力をもつコンプレックスを使用することが好ましく、例えば、ペプチドはDwyer(Nature Biotechnology，14:348-351,Detection of Low Ff inity Inteactions between Peptides and heat Shock Proteins by Chemilumin escence of Enhanced Avidity Reactions(CLEAR)，Leshe D．Causey and Donard s.Dwyer)によって記載されたようにビオチンを用い予め標識を付けたデキストランポリマー（DEX）にコンプレックスすることができる。これはＴＰに対し高い親和力のＰＬを苦労して探す必要を非常にうまく回避する。期待される結果の例を以下に示す。この実験では、ＤＥＸ（5：1ないし10：１のモル比、1.0μg/mlに希釈）に共役結合したペプチド約100μlを、抗体を結合するための標準法を用いて標準低バックグラウンド「ELISA」グレードマイクロ力価プレートにコーティングした標的タンパク質の組替えGST融合体と接触させる。15分後、100μlの希釈したテスト化合物（PBS中５％DMSO中10ミクロモル、ｐＨ7.4）を各プレートの同じ位置でウェルに添加する。15分後、ウェルを数回ＰＢＳで洗浄し生成したコンプレックスの量を比色計試薬を用いて評価する。以下の過程の例では、マイクロ力価プレートリーダーからの数字による出力は、完全に結合(＋＋＋)、少ない結合(＋＋)、若干結合(＋)、そして結合を検出できない（−）として数えた。表I. 18化合物につき試験したペプチド結合１／タンパク質標的１＋＋＋：完全コンプレックスが生成した。ウェルA1とD5は化合物希釈体を含むが試験化合物ではない。PLリガンドをD5に添加しない、従ってここに生成した任意のシグナルは非特異的バックグラウンドの結果であり、全ウェルに対する値から減する。表II．18化合物につき試験したペプチド結合２／タンパク質標的２＋＋＋：完全コンプレックスが生成した。ウェルAlとD5は化合物希釈体を含むが試験化合物ではない。PLリガンドをD5に添加しない、従ってここに生成した任意のシグナルは非特異的バックグラウンドの結果であり、全ウェルに対する値から減する。表III．18化合物につき試験したペプチド結合３／タンパク質標的３＋＋＋：完全コンプレックスが生成した。ウェルA1とD5は化合物希釈体を含むが試験化合物ではない。PLリガンドをD5に添加しない、従ってここに生成した任意のシグナルは非特異的バックグラウンドの結果であり、全ウェルに対する値から減する。結果の解釈：全部の場合において、ウェル２に添加した化合物はコンプレックス形成および／またはブロックしたフォスファターゼ標識を妨げたので、非特異的効果をもつことが明らかである。ウェル３に添加した化合物は特異的にPL1／T P1コンプレックスの形成をブロックする；従って、化合物B3はPL1に結合するために応答できるTP1のFDにおける結合部位の特異的阻害剤であることが明らかである。同様に、ウェルC4の化合物はTP2のその同種の結合部位にPL2の結合を特異的にブロックする。このアッセイでは、PL3とPT3の間の相互作用を化合物が特異的にブロックすることは観察されなかった。 PTsのFDsと相互作用する化合物は直接、ピンまたはビーズに固定化した化合物に結合する直接PTに対し試験して同定される。しかし、これは有利ではない。先ず、「付着」タンパク質に対しうまく働かない。関心あるタンパク質が基層、例えば、高バックグラウンドとプラスチックまたはアミド樹脂に結合する場合、特異的結合を検出することは難しい。更に重要なことは、化合物がむしろ高密度でピンまたはビーズで合成されるので、タンパク質標的は化合物とPT間の非常に高いみかけの親和力により結合でき、従って、シグナルバックグラウンドは適当なリード化合物の確かな検出に対し高すぎる。最後に、固定化した化合物とPT間の親和力を評価する手軽な手段はない。標識を付けた（ビーズまたはピンへの結合を検出するため)TPを用いて、直接結合アッセイを有意義に改善し、適当なPLによって特異的阻害によって所定の化合物とTPの相互作用の特異性と親和力を試験できる。ここで、デキストランとペプチドをコンプレックスすることが望ましい（平均分子量約6,000−8000）(約10 個のペプチド／モル)。デキストラン／PLコンプレックスは共に固定化した化合物と接触させる標識を付けたPTと予め混合する。デキストラン自体の存在は、化合物のプラスチック支持体との非と悔いてきコンプレックスの生成を最小にし、デキストラン／PLコンプレックスは固定化した化合物への標識を付けたTPの特異的高親和力結合を調整する。化合物は合成され評価されマトリックスに固定化され、それらの最終的使用は溶液中である。従って、PTに対しPL同種のものを調製して、最初の上記例で述べたような選択性と特異性に対し推定される阻害化合物を評価できる。化合物はまたマトリックスのシート、例えば、誘導体プラスチック、ナイロンまたはニトロセルロースのシートで、デキストラン／PLコンプレックスの混合物中で合成後に評価できる。この方法の利点は、１枚のシートに多くの試料をもたせて小型化し簡単な記録を保持することである。推定の阻害化合物が同定されると、上記のような研究に基づく解決のために大量に合成できる。実施例以下、実施例を示すが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。参照例Ａ結合ペプチドの選択の単一残基偏向ファージ表示ライブラリーの効果概論ファージライブラリーはペプチドの大コレクションを表示し、同時にそれらを符号化する遺伝子情報を伝える手段として用いた。これは種々の分子に対しペプチドリガンドの発見のために強力な道具であるが、若干の制限がある。現在、１ −５×10⁹クローンのオーダーの複雑さでライブラリーを作ることが可能である。25残基のランダム範囲でライブラリーを作ことは技術的に容易であるが、アミノ酸のすべての可能な組み合わせを示すために、表示したペプチドの長さは約７個のアミノ酸（20⁷または1.28×10⁹の可能性）に限られる。これはいくつかの相互作用に充分であるが、若干のタンパク質：ペプチドの相互作用が、２個のタンパク質の相互作用を正確に模倣するには７個のアミノ酸ペプチドよりも多くを要する。従って、どの結合ペプチドも示さなかったコストで更に最適なペプチドを表示する可能性をもつライブラリーを用いまたは結合するために、やや最適である。この問題を回避するために、我々は新しいアプローチをとった。リガンドのための共通配列は高く維持される少なくとも１個のアミノ酸残基を持つ。共通リガンド配列に基づく目的構造ライブラリー（すなわち、X-X-X-P-P-X-X-P-X-Xライブラリー（Yu H，Chen JK，Feng S，Dalgarno DC，Brauer AW and Schreiber SL (1994)Cell 76:933-945)）をうまく用いて、同じ族中のタンパク質を用いてファージ表示結合ペプチドの大多数を単離した。我々は、ランダムペプチドに対しコードする領域によって迂回した単一の固定残基をもつライブラリーが、そのためにペプチドリガンドの情報が何も得られない標的に対し類似のやり方で働かねばならないことを、理論化した。固定した残基がリガンドの形成で重要である場合、結合特性でペプチドを表示するファージの数は、豊富である。逆に、固定した残基が結合ペプチドの生成のために有害である場合、結合特性を示すこのライブラリーのファージな数は、減ずるであろう。我々は、結合するであろうペプチドに情報の本体が存在する２個のドメイン、標的としてAb1およびSrcからのSH3ドメインを用いてこの仮定を試験した。リガンドは次に表示するライブラリーでスクリーニングした。１）相補的ランダム12アミノ酸ペプチド(ランダムライブラリー)、２）１の固定化したアミノ酸がランダム５mer（偏向したライブラリー）によって各サイドに位置するペプチドをもつ４個のライブラリー、そして３）タンパク質を含むSH3ドメインを結合するリガンドのための同意に対し適合させるX₆PXPPXPX₂モチーフ(クラスＩ SH3目的構造ライブラリー)。用いた４種の偏向したライブラリーは固定したプロリン、アルギニン、アスパラギン酸塩またはフェニルアラニン残基を含んでいた。こちしたプロリンの予測した効果は有益であり、アルギニンとアスパラギン酸塩残基は中位であり、フェニルアラニンは有害であった。結果は、偏向したプロリンが、ランダムライブラリーよりもはるかに難しく、特異的に結合するファージを単離するために目的構造ライブラリーとほぼ同じに良好であった。偏向したアルギニンライブラリーは更に効率が良く、ランダムライブラリーと偏向したアスパラギン酸塩とフェニルアラニンのライブラリーとはランダムライブラリーよりも有効性が小さかった。方法ファージを選り分けた。簡単に、SrcとAbl GST融解タンパク質をELISAプレートで固定化し、BSAでブロックした。各ライブラリーからの約２×10¹¹個のファージを各ウェルに添加し結合させた。ファージを洗浄後、E.coli DH5αF'中で終夜溶離し増幅ささた。次に増幅したファージを何も増幅しないで結合と溶離の追加の２ラウンドに委ねた。DH5αF'の菌そうに一連の希釈物を配置して力価を概算した。次に各希釈物を培養し、クローンファージを、プラークを分離したウェルをピックアップして単離した。先に述べたように抗−ファージELISAを用いて特異性を確立した。特異的融解タンパク質またはGST単独を用いてプレートをコーティングし、上記のようにファージを結合した。結合したファージはセイヨウワサビパーオキシダーゼに結合した抗−ファージ抗体を用いて検出した。結果各ファージは両タンパク質のための各ライブラリーから単離し、結合の特異性を抗−ファージELISAによって決定した。結果は以下に示して検討する。 Abl 結合ファージ特異的に結合したファージを単離するために最も有効であったライブラリーは、クラスＩSH3目的構造であった：12のうち10は特異的で８は親和力が非常に高いらしいことを示す非常に強いシグナルを与えた。プロリン偏向ライブラリーは 12のうち７が特異的でほぼ有効であった。アルギニン偏向ライブラリーは12のうち６が特異的シグナルを与えたが、そのうち２は中位の強度であった。アスパラギン酸塩偏向ライブラリーは１個のシグナルのみを与え、中位の強度であった。フェニルアラニンライブラリーはバックグラウンドと感知できるほどの相違はなかった。ランダムライブラリーは12のシグナルのうち12が低い強度であり、これは非常に高い親和力がないらしいことを示している。表A-1：Abl SH3ドメインデータ一で単離されたファージ表A-2:SrcSH3ドメインで単離されたファージ結論単一残基偏向ライブラリーの使用は望ましい結合特性をもつペプチドを表示したファージの単離を大いに高める。両者の場合に、単一残基偏向ライブラリーはランダムライブラリーよりも大きい数の高親和力結合を生成した。この増加は単離したファージの数と、ファージが標的に対しもつ親和力の両方にある。さらに、各場合に、偏向ライブラリーは所謂目的構造ライブラリーと同じく良好であった。目的構造ライブラリーは、標的を含むSH3ドメインのリガンド親和力に必要な残基の従来の知識を用いて作られた。相互作用する分子に関する情報は少ないかないため、この手法はタンパク質へのペプチドリガンドの単離において極めて価値がある。実施例１ヒトサイトメガロウィルス感染症治療薬の同定ヒトサイトメガロウィルス関連疾病:ヒトサイトメガルウィルス(HCMV)は遍在するヒト病原体である（最新の知見に関してはHuang & Kowalik，1993;Britt & Alford，1993参照）。HCMVは高度に特異的な種である。ヒトはそのウィルスの唯一の宿主であり、伝播は個人間の直接または間接接触によって成立する。HCMVに感染しても健康な子供と成人では一般的に無症状である。しかしながら、HCMVは単核症の症例の起炎菌の約8%を占めており(Klemola et al.，1970;Horwitz et a l.，1979)、個人によってはHCMVに汚染された血液製剤を輸血された場合、輸血病(Reyman，1996)をも引き起こす。HCMVは胎児や免疫不全患者に重大な病気をもたらしうる。 HCMVはヒトにおいてもっともありふれた先天性感染症であり(Britt & Alford ，1996)、アメリカでは毎年約４万人の感染した子供が生まれる。これらの感染した子供達の約10-15%が長期的な神経学的病状を示すと仮定すると、HCMVは新生児の中枢神経系発達不全の主要な感染性原因となる(Fowler et al.，1993)。感覚器損傷が子宮内感染の最も頻度の高い結果であるが、先天性HCMV感染がアメリカで最も頻度の高い小児期難聴の非遺伝的原因であるようだ(Hicks et al.,1993 )。 HCMV感染症は、充実臓器の同種異型移植片のレシピエントにおいてよくみられる移植後合併症である。一般的には、同種異型移植片のレシピエントの免疫抑制の度合いは臨床的に重要なHCMV感染症の可能性と相関がある。心臓、腎臓、肝臓の同種異型移植片レシピエントの60%以上が顕性HCIMV感染症を呈する（Pollard ，1988;Brltt & Alford，1996参照）。充実臓器同種移植片レシピエントは遷延熱、白血球数減少、血小板数減少、非典型的リンパ球増加症、肝トランスアミナーゼ上昇といったHCMV感染に由来するさまざまな臨床症状を呈し(Hofflin et al .，1987;Singh et al.，1988;Smyth et al.，1991)、腹部内臓穿孔を伴う消化管の重症感染症、肝炎、肺炎といった生命にかかわる合併症を発症する(Dummer，1 990;Smyth et al.，1991参照)。真菌、原生動物、病原性バクテリアによる複合感染は、おそらくHCMVがナチュラルキラー細胞活性とＴ細胞の増殖を抑制する能力の獲得する結果(Schrier et al.，1986)として、HCMV感染の進行後期に発症する(Chatterjee et al.，1978;Rand et al.，1978)。 HCMV感染症は、異質遺伝子型の骨髄移植レシピエントの約40-50%にみられ、結果として肺炎が最も頻度の高い臨床症状である(Wingard et al.，1990)。ガンシクロヴィルを使用してもHCMV肺炎を伴う骨髄移植後の患者の死亡率は10-20%に留まっている(Goodrich et al.，1991;Schmidt et al.，1991;Yau et al.，1991;Enr ight et al.，1993;Winston et al.，1993)。 HCMVは、HIVの病理発生におけるコファクターであるかもしれない。疫学的研究によると、HCMV感染はHIV感染者においてAIDS発症のリスクを高めることと関連があることを示唆している(Webster et al.，1989;Webster，1991;Webster et al.，1992)。そのような役割について直接の証拠は得られていないが、培養細胞においては、HCMVがHIVの遺伝子発現と成長に影響を与えうるということは明らかに示されている(Barry et al.，1990;Rando et al.，1990;Biegalke et al. ，1991;Koval et al.，1991;Peterson et al.，1992)。HIVの成長過程におけるコファクターとしてのよくわかっていない役割に加えて、HCMVはAIDSにおける主要な生命を脅かす日和見感染症でもある。AIDSにおけるHCMV感染症はほとんど全ての臓器系を侵すと報告されているが、臨床的に重要なHCMV感染症は中枢神経系（主として、経過の長いAIDS患者の20-25%にみられる網膜症）、消化器系、そして肺に最も多くの報告がなされている(Britt & Alford，1996)。ヒトサイトメガロウィルス感染症に対する予防と治療法最近のいくつかの論評によってHCMV感染症に対する異なった予防法と治療法が距述されている(Coen，1992;Britt & Alford，1996)。 HCMVに特異的な免疫グロブリンを用いた受動的免疫予防法は一般的には確立されたHCMV感染症に対する治療法としては成功しておらず(Britt & Alford，1996) 、能動的免疫予防法にもまた課題が残っている。弱毒HCMVワクチンは人間に対する試みにおいて保護的効果がなかった(Stern，1984;Plotkin et al.，1989)。さらに生ウイルスワクチンの使用にあたっては、HCMVの病原性と毒性決定要素にたいしての理解が限られていることによる安全性の問題と、出産年齢の女性への奇形を誘発するかもしれないウイルスの接種についての問題につきあたった(Plotk in et al.，1990)。最近、gBといった個人のHCMVタンパクを使ったワクチンサブユニットの開発に関心が寄せられている(Plotkin et al.，1990;Spaete，1991)。二種類のよく研究された薬剤がHCMV感染症の治療に有効であることが証明されている。アシクロヴィルの同種であるガンシクロヴィルとフォスカーネットは細胞培養アッセイにおいてともに強力な抗HCMV作用を示す。ガンシクロヴィルはウイルスの遺伝子産物であるUL97によってHCMV感染細胞のなかで選択的にリン酸化され、それに続くウイルスDNAポリメラーゼによる成長しているDNA鎖への合体は鎖の停止を促す(Frank et al.，1984;Reid et al.，1988)。ウイルスポリメラーゼやUL97の突然変異はガンシクロヴィルに抵抗性である(Sullivan et al.，1993 ;Baldanti et al.，1995;Hanson et al.，1995)。フォスカーネットはHCMVのDNA ポリメラーゼを直接阻害する(Snoeck et al.，1993)。多くの研究がガンシクロヴィルとフォスカーネットの同種移植片レシピエントとAIDS患者両者のHCMV感染症のコントロールに対する有効性を証明している(Britt & Alford，1996)が、フォスカーネットの長期的な使用はしばしば網膜毒性につながることから(Chrisp & Clissold，1991;Reusser et al，1992)、フォスカーネットの使用は限定されている。AIDSの症例では、抗HCMV薬療法はたいてい長期的に続けられなくてはならない。なぜならウイルスの複製が薬の中止からまもなくして再開し、その結果、一方あるいは双方の薬に耐性のウイルス変異株が飛躍的に一般的になってきており(Drew et al.，1991;Baifour，1992)、抗HCMV活性を有する他の薬剤の必要性が強調されてきている。近年、AIDS患者の網膜症にたいする治療薬として抗HC MV活性を有する新しい薬がFDAによって承認された。ヴィスチドは臨床試験においてよい成績をあげたヌクレオチドアナログであるが、腎障害を引き起こす可能性がある。抗ウイルス薬の進歩のターゲットとなるかもしれないHCMV遺伝子産物は数多い。しかし、二つのHCMVタンパクが有力なターゲットとしてよく引き合いにだされる。第一番目は、HCMVUL80のオープンリーディングフレームにコードされているプロテイナーゼで、アッセンブリンと命名されている(Welch etal.，1991a & b)。このプロテイナーゼはビリオン分子の集合の間に機能する。類ヘルペスシンプレックスウイルス遺伝子の温度感受性の対立遺伝子は、ある温度下ではウイルスの組立には役に立たない(peterson et al.，1983)。これは、アッセンブリン活性を阻害する薬剤はウイルスの組立と増殖を阻止することを意味する。二番目のターゲットはUL-44にコードされたポリメラーゼ補助タンパクである。このタンパクはUL-54 にコードされたポリメーラーゼとともにこの実施例のトピックである。新薬の発見のターゲットとしてのヒトサイトメガロウイルスDNA複製現在使用されている抗HCMV薬は直接あるいは間接的にウイルスポリメラーゼをターゲットとしており、HCMVのDNA複製が薬の阻害のターゲットであることを確証した。我々は直接HCMVにコードされているDNAポリメラーゼの進行的な機能を妨げる薬剤に対する強力なスクリーニングアッセイを開発することを提案するものである。約230,000塩基対のHCMVゲノムは単位長さ、直線的、二本鎖DNA分子としてビリオンのなかに詰め込まれる(Mocarski，1996)。ウイルスDNAが新しく感染した細胞に入ると、それは回転し(LaFemina & Hayward，1983)、それから核の中で複製し巨大な連鎖状分子を生成する。HCMVDNA複製にはoriLytとよばれるシス活性型のDNA複製開始点と(Hamzeh et al.，1990;Anders et al.，1992;Masse et al.， 1992)一連のトランス活性型ウイルスタンパクが必要である。１１のトランス活性型ウイルス複製タンパクがもともとヘルペスシンプレックスウイルスDNA複製の研究のために開発されたトランジエント複製アッセイを用いて(Challberg，19 86)同定されている(Pari & Anders，1993;Pari et al.，1993)。このアッセイでは、細胞は、oriLytシークエンスと必要なトランス活性型ウイルス複製タンパクを供給するプラスミドかコスミドとの結合を含むリポータープラスミドとともにトランスフェクトされている。DpnIに耐性の複製されたリポータープラスミドDN AはそれからDNAブロットアッセイによってモニターされる。リポーター複製に必要な１１のHCMV産物は表101に記載されている。HCMV複製タンパクのうち５つはもともと既知の１型ヘルペスシンプレックスウイルス(HSV-1)複製タンパク類似のシークエンスと予想された機能を確認した生化学的研究をもとにして同定され。これらはUL54HCMVオープンリーディングフレームにコードされたDNAポリメラーゼ(Huang et al.，1975;Ye & Huang et al.，1993)とポリメラーゼ補助タンパクUL44(Ertl et al.，1991;Ertl & Powell，1992);一本鎖DNA結合タンパクUL57( Anders et al.，1986;Kemble et al.，1987;Anders & Gibson，1988)；それからヘリカーゼ／プライマーゼと推定されるタンパクUL105とUL70(Martinetti & Barrell，1991;Che eet al.，1990)。さらに、HCMVUL102は、プライマーゼ関連因子をコードするHSV -1UL8遺伝子と似た場所に、他のウイルス遺伝子と関連したウイルスクロモゾームに位置していることは注目すべきである(Chee et al.，1990)。すなわち、これらの遺伝子は位置的なホモログである。これらのタンパクはおそらく、HCMVDN A複製を仲介するために複製フォークに直接働いている。今日までにシークエンスされたすべてのヘルペスウイルスからこの一連のタンパクのホモログ候補がみつかっており(EBV;Bear et al.，1984;VZV:Davidson & Scott，1986;HSV-1:Mcge och et al.，1988;HCMV:Chee et al.，1990;HVS:Albrecht et al.，1992;冊V6:) 、それらは特徴的な一連のヘルペスウイルス複製機械タンパクを表しているのかもしれないことを示唆するものである。表101．Challberg(1986)のトランスフェクションアッセイによるHCMVDNA複製に必要な遺伝子 Pari & Anders(1993)に修正を加えたもの。示された遺伝子産物はもともとのプロモーターの調節のもとで発現された。表の下の部分に提示された５つの調節成分は全て直接DNA複製に機能する表の上の部分の５つの成分の発現を活性化する役割を果たしているかもしれない(Iskenderian et al.，1996)。表中の遺伝子のいくつかは多数のポリペプチドをコードしている。たとえば、UL112-113は４つのポリペプチドをコードしているが(Wright et al.，1988)、一連のものの中のどの成分が複製機能に重要なのかはいまだ知られていない。表中のエプスタイン -バーウイルス(EBV)ホモログも溶菌性EBV複製の補助に重要であることが示されている(Fixman et al.,1992)。 HCMV遺伝子がコードする直接的初期遺伝子産物IEI/IE2，UL36-38，IRSI-TRSI は転写レベルでウイルスと細胞の遺伝子発現を調節していることが示されている (Pizzorno et al.，1988;Cherrington & Mocarski，1989;Depto & Sternberg，1 989;Sternberg et al.，1990;Colberg-Poley et al.，1992;Stasiak & Mocarski ，1992)。 UL84と112-113遺伝子は未知の機能をもった初期ウイルスタンパクをコードしている(Wright et al.，1988;He et al.，1992)。転写調節に関しては何の影響も観察されていないが、UL84タンパクはIE2タンパクに結合することが示されており(Spector & Tevethia，1994)、それゆえその転写調節機能をいくらか調節しているのかもしれない。最近、Iskenderian et al.，（1996）はIEI/IE2，UL36-38 ，IRSI，ULI12-113の組み合わせがHCMV複製タンパクを調節しているいくつかのH CMVプロモーターからより効果的に発現を活性化する集団として協力していることを示した。このようにしてUL84と同様これらのタンパクも複製フォークで働く一連のHCMVタンパク発現を促進するのに役立っているのかもしれない。 HCMV複製の研究によってHSV-1 DNA複製に必要なHSV−1 UL9タンパクホモログを同定することはできなかった。このタンパクはHSV−1 DNA複製開始点にシークエンス特異的に結合するため、このことは驚くことではない(Elias et al.，198 6;Koff & Tegtmeyer，1988)。HSV-1 UL9タンパクは表101中の６つのＨＳＶタンパクとともに、上述のトランスフェクションアッセイ（Challberg，1986）でHSV -1 DNA複製を再構成するのに必要にして十分である。それゆえ、開始点結合タンパクの例外をのぞいてはウイル又複製に直接携わっているすべてのHCMVタンパクが同定されたといって良さそうである。もしHCMVが開始点結合タンパクを使っているとしたら、それはおそらく表101のなかの１１のタンパクのなかの１つである。この実施例のなかでも特に興味をひかれるのはHCMV UL44タンパクである。上述のように、このタンパクは一般的にはDNAポリメラーゼ補助タンパクと呼ばれている。HCMV UL44タンパクは、HSV-1 UL42タンパクにやや類似している（データは示されていない）。これらのタンパクは両方ともウイルスDNAポリメラーゼと1:1のコンプレックスで存材している(UL42:Powell & Purifoy，1977;Gallo et al.，1988，Crute & Lehman，1989;UL44:Huang，E.-s.，1975;Ertl & Powell， 1992)。ウイルスミュータントの分析によりHSV-1 UL42タンパクがウイルスDNA複製に重要であることが示され(Johnson et al.，1991;Digard et al.，1993)、アンチセンス実験によりHCMV UL44タンパクがウイルスDNA複製に重要であることが示された(Ripalti et al.，1995)。HSV-1ポリメラーゼ進行因子相互作用を妨げる突然変異はウイルスDNA複製を阻止するため(Digard et al.，1993a&b;Redding et al.，1994)、相互作用がＤＮＡ複製に必要だという主張になり、ポリメラーゼ進行因子相互作用はウイルスの増殖に重要であるという結論を支持するものである。ポリメラーゼＣ末端におけるアミノ酸(Digard & Coen，1990;Digard et al.，1993a; Stow，1993;Tenny et al.，1993;Digard et al.，1995)とHSV-1進行因子内の２つの異なった部位(Monahan et al.，1993)が相互作用に重要であることが示された。生化学的研究によって、HSV-1 UL42とHCMV UL44タンパクは、伸長するＤＮＡ鎖末端からの酵素の解離を阻止することによってウイルスポリメラーゼの進行を劇的に高めることを確立した(Gottlieb et al.，1990;Hernandez & Lehman，199 0;Weiland et al.，1994)。それゆえ、進行因子とポリメラーゼとの相互作用を妨げる、あるいは進行因子とＤＮＡとの相互作用（進行因子ははじめＤＮＡ結合タンパクとして同定された）を妨げる、あるいは進行因子の機能を妨害するようなものはおそらくウイルスＤＮＡ複製をも妨げるだろう。結果として、そのような媒介はウイルスの複製を妨げており、それゆえ抗ウイルス剤の候補たりうる。この実施例の目的はウイルスUL44進行因子をターゲットとする小分子抗HCMV剤候補の同定のための高度情報処理選別の開発である。ＤＮＡ合成進行因子UL44に焦点を当てるが、組み合わせ認識法が他のウイルスタンパクにも即応用できる。この薬剤発見法は、特に調節因子のような生化学アッセイにすぐには置けないようなタンパクにとって有効である。我々が組み合わせ認識法のターゲットとして UL44を選んだのは、それはウイルスの複製と試験館内でのCMV DNA合成に必要だからである。このようにして、われわれは生化学的アッセイ、ウイルス複製アッセイ両方からUL44に作用するどのポテンシャルの複合物でもその活性を迅速に評価することができる。 HCMV複製の抑制因子を同定するために組み合わせ認識法を使用することによってどんな有利な点があるのか。UL44進行因子のようなウイルス因子のためのアッセイは自動化が難しく、高価である。現在のところ、進行因子の作用はアガロースゲルの上にサンプルをそれぞれの時点で流すことによって測定している。他のウイルス調節タンパクのための大量情報処理アッセイは実質的にデザインするのか不可能である。しかし、以下に述べる過程は多くのウイルスタンパクのために大量情報処理選別を行うことができる。実験計画と方法 UL 材のクローニングと発現はじめに分子親和選択道具として使うためにリコンビナントタンパクを産生する。われわれは、グルタチオン-S-トランスフェレース（ＧＳＴ）溶解物は組み立てやすく、効率的に希望通りのタンパク産物を産生するということを発見した。大部分のHCMVのmRNAがそうであるように、UL44をコードしているmRNAはスプライスされていない。それゆえ、精製されたビリオンから準備されたHCMVゲノムＤＮＡからの機能的単位としてのシークエンスをコードしているUL44を完全に単離することができる。われわれは次のオリゴヌクレオチドプライマーとCMV DNAからUL4のコードしている領域を増殖するためのＰＣＲを使った：5'-CTGTGCGGATCC ATGGATCGCAAGACG-3'と5'-CTGTGCGAATTCCTAGCCGCACTTTTG-3'。結果の1.3kbの産物はT4 DNAポリメラーゼ(NEB)で鈍くしたウィザードＰＣＲプレップスクリーンアップレジンを用いて精製され、アガロースゲル上で再精製されたBamHIで切られ、BamHIとSmaIで消化されたベクターpGex2Tにクローンされた。個々のクローンは制限酵素によって正しく挿入されているか試され、２つのクローンは、正しいタンパクがそのクローンによってコードされていたということを完全に保証するように配列された。プラスミドを有する大腸菌DH5aF'がIPTGとともに誘導され、融合タンパクをつくり、産物は生産者(Pharmacia)が推奨するグルタチオンセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。結果のタンパクは融合タンパクとして用いられるか、プロテアーゼトロンビン（融合のＧＳＴ部分とUL44タンパクのあいだを切る）を用いて、ビーズ上の融合タンパク1mgをトロンビン(Pharmacia)50単位を２時間室温で反応させることによって、グルタチオンセファロースから切り出された。結果のUL44タンパクはＳＤＳゲル電気穿孔法によって分析され、２つの主な切り出し産物を含んでいた。十分な長さのものとおよそ５キロダルトン短いものである。ファージライブラリー公表されたブロトコール(ペプチドとタンパクのファージ表示のなかのバクテリオファージＭ１３のなかのランダムペプチドライブラリーの構成：B．Kay，J ． Winter & J．McCaffertyの編集によるAcademic Press出版の実験の手引き)を用いてファージライブラリーが作成された。簡潔に言うと、１つの固定残基とともにランダムなペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドが相補的なプライマーをシークエナーゼ(USB)を用いて拡張することにより二本鎖ＤＮＡに変えられた。結果の断片はXhoI & XbaIとともに消化され、ゲルは精製されはじめに消化されたmBAXベクターに結びつけられた。その結紮は１０の連続した電気穿孔によってバクテリアのなかに誘導され、変形したバクテリアは一晩増幅させた。ファージを含む上澄みが得られ、PEG/NaClを用いてファージを沈殿させ、10%グリセロールを含む１Ｘ PBS中で再沈澱させ、-80度で凍らせた。オリゴヌクレオチドのうち１０個は次の構造をもつペプチドをコードしていた：X5UX5，Xは任意のアミノ酸でUは固定残基である。次の残基は固定されており、それぞれのライブラリーに１つずつ：D(GAT)，F(TTC)，H(CAC)，K(AAA)，L(CTG)，M(ATG)，N(AAT)， P(CCG)，R(CGT)，W(TGG)。簡便のため、X5DX5ライブラリーは"D"ライブラリーと呼ばれ、X5FX5は"F"ライブラリーなどと呼ぶ。それぞれに対するオリゴヌクレオチド配列は5'-GACTGTGCCTCGAGK(NNK)5xxx(NNK)5TCT AGACGTGTCAGT-3'で、xxxはそれぞれの固定残基にたいする上に示されたコドンである。それに加えて、固定されたＣ(TGC)の前の１０のランダムな残基のライブラリーは側面が同じ配置で構成されていた。これは"X10C"ライブラリーとされている。5'-ACTGACACGTCTAGA -3'の配置をもつオリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡを二本鎖に変換するプライマーとして使われた。カロライナワークショップライブラリー（ＣＷＬ）は12-a.a."偏向していない "（一定の残基がない）ペプチドファージライブラリーであり、すべてのアミノ酸がNNKによってコードされている。UL44 特異的なファージのアフィニティーセレクション UL44かGSTUL44はマイクロ力価プレート(Costar)の上でタンパク１マイクログラムを200マイクロリッター0.1M NaHCO3のなかで、pH8.5、４度で一晩培養することにより、固定された。プレート上の残りのタンパク結合部位は1%BSA 150マイクロリッターを0.1M NaHCO3の中に加え、１時間室温でプレートを培養することによりブロックされた。それからプレートを300マイクロリッターのTBST （100mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl，0.1% tween-20）で５回洗った。それからファージライブラリーが200マイクロリッターのTBSTの中のウェルに加えられ、５時間室温で培養された。ウェルは５回TBSTで洗われて、ファージを200マイクロリッターの50mMグリシンでpH2.0、10分間培養することによって溶出させた。溶出液は、pH7.0の200mM NaHP04バッファー200マイクロリッターで中和され試験管に移された。それからファージを大腸菌DH5aF'の一晩培養したものの100倍希釈を含む2XYTブロス5mlに溶出したファージを加えることにより増幅させた。そのカルチャーは触媒とともに37度で一晩置いた。次の朝3000xgで１０分間SS-3 4ローターで遠心分離することによりバクテリアが取り除かれた。増幅されたファージを含む上澄み100マイクロリッターはそれからアフィニティー精製の次のラウンドに使われた。 UL44と結合するファージの装飾は、２ラウンドから始まるアフィニティーセレクション過程中、DH5aF'上に白いプラークを形成した非特異的なファージをを含めることによりモニターされた。それぞれのセレクションラウンドにおいて平板培養したらすぐにX-galとIPTGの存在下にファージを平板培養することによってプラークの青白比がモニターされた。われわれのライブラリー由来のファージは青、非特異的なコントロールファージは白プラークとして現れた。もし特別なライブラリーがターゲットに結合するファージにエンリッチされたら、それらは選択的にコントロールファージより多く保持されるはずで、これは青白プラーク比に反映されている（表５）。このデータに基づいてわれわれはGSTUL44が標的タンパクとして使われるときにD、F、N、W、X10C、CWL（カロライナワークショップライブラリー）ライブラリーから個々の分離菌を試した。96ファージのうち87 ファージがGSTUL44に結合し、このうち86ファージがほかのGST融合タンパクに結合し、一つはGSTUL44融合に特異的だった。それゆえ、融合タンパクのGST成分を認識するペプチドを発現するファージを得ることは比較的簡単である。しかし、タンパクのUL44部分に特異的なファージを分離することもでき、これは、われわれが一つのポリペプチドの多数のドメインを標的にしていることを示すものである。融合タンパクのUL44部分に結合する分離ファージの数を増やすために、われわれはトロンビンで融合を断ち、フリーUL44を選別過程の標的として使った。ライブラリーのすべてのバインダーの分布を査定するために、われわれはそれぞれのライブラリーから１６の個々のファージをテストした。ファージの大部分はUL44 に特別な結合性を示したが、X10Cライブラリー由来のファージはELISAファージ中でずっと強いシグナルを発した（表６）。ファージがUL44にたいしてどれほど特異的であるかを決定するために、われわれは様々な標的に対して２３の分離菌の結合性を査定した。２つのファージ集団が見つかった：１つめはトロンビンに切られたUL44とGSTUL44を認識したが、２つめはトロンビンに切られたUL44しか認識しなかった。これら２３のファージすべてが自動ＤＮＡ配列分析機にかけられ、結果は以下の通りである。 Immulon4Rプレート上でGSTUL44とトロンビン切断UL44にたいして、またCOVALINK Rプレート上でトロンビン切断GSTUL44にたいしてパンニングから分離されたもの二つの重要なポイントは配列分析中に説明されている。はじめに、我々がいかにして標的を固定化するかに関わらず、われわれはX10Cライブラリーから全く同じペプチドを表すファージを断続的に分離した。これらのファージは同じＤＮＡ配列を有し、ライブラリーの複雑さと理論的に可能な配列の複雑さのおかげで、われわれはおそらく断続的に全く同じファージを分離していた可能性が高い。このペプチドを表すファージはGSTUL44とトロンビン切断UL44の両方に結合する。つぎに、第二集団由来のファージはトロンビン切断GSTUL44のみを認識する多様な集団を表している。これらのペプチドのうちゲンバンクあるいはSWISS-PROTデータベースのなかの既知のタンパクに関連しているものは皆無のようである。この選別法で分離されたファージは生物的に関連のある部位に特異的であり、またそれらはタンパク中の異なる部位を標的としているということを証明するために、われわれはタンパクの中のGST部分とグルタチオン(GSH)を認識するファージで競争実験をおこなった。X10Cライブラリーから束縛されたペプチドを表示するUL44に特異的なファージに結合する部位をマップするために、われわれはこのファージを線状二重鎖ＤＮＡに結合する競争をさせた。基質とファージへの結合特異性を示すために、両方のファージを両方の基質と競争させた。マイクロ力価プレートはGSTUL44タンパクでコートされ、上述の通りにブロックされた。GST部位あるいは融合のUL44部分に特異的なファージはそれから別々のウェルに加えられ、同時にGSHかDNAの様々な濃度の溶液が加えられた。結果は表７に示されている。これらのファージは同じアフィニティーセレクションランから分離されたことを覚えていることが重要である。これは明らかに、ファージの結合は量依存的にGSHと競争していたため、GST特異的なファージは酵素の活性部位に結合することを示す。ここで使われたGSH濃縮はUL44特異的ファージの同じGSTUL44タンパクへの結合には影響はなかった。逆に、UL44特異的ファージはUL44ポケットに結合するＤＮＡに結合し、ＤＮＡの増加によって用量依存的に競争された。ＤＮＡの同じ濃度もGST特異的ファージの同じGSTUL44融合タンパクへの結合にほとんど影響はなかった。ファージ表示由来のペプチドを用いたCMV UL44に対する酵素関連分光測光測定法（ELSA）イミュロン4(cat.# 011-010-3855)96-ウェルプレートはDynatechより手に入れた。ウシ血清、アルブミン(BSA)(A2153)、ストレプタヴィジンアルカリンフォスファターゼ(SA-AP)(S2890)、Tween-20(P1379)、Ｐ−ニトロフェニルフォスフェートタブレット(pNPP)(N-1891，N-2770)はSigmaより手に入れた。リン酸緩衝サリン溶液(PBS)(21600-010)はGibco-BRLより手に入れた。超純粋グリセロール(#1 6374)はUSBより手に入れた。ビオチニレートされた代用リガンドは適切な溶媒（水または10%アセトニトリル）による1mMストック溶液として用意された。SA-AP はPBSを含んだ10%グリセロールの1mg/mlのストック溶液として用意され、-80度で一部保存された。結合ファージの表面に表示されたペプチドに対応するペプチド(H -Ser -Gly -Ser -Gly -Glu -His -Val -Cys -Ser -Trp -Gly -Trp -Gly -A rg -Cys -OHとビオチン-H -Ser -Gly -Ser -Gly -Glu -His -Val -Cys -Ser -Trp -Gly -Trp -Gly -Arg -Cys -OH))（下線部残基は上記のX10Cペプチド由来であり、 Ser-Gly-Ser-Gly単位がリンカーである）はAnaSpec，Incにいよって合成された。標的タンパクはマイクロ力価ウェルのなかでそれぞれのウェルにつき0.5-2.0 マイクログラムを0.1M NaHCO3 100マイクロリッターのなかで４度で一晩培養することによって固定化した。（研究によりウェルごとに0.5マイクログラムの標的タンパクという条件が至適タンパク結合を生み出すことが示されている。）標的タンパクが除かれ、ウェルは室温で１時間0.1M NaHCO3の中で準備された1%BSA 200マイクロリッターでブロックされた。ブロックしている１時間の間に、SA-A P：代用リガンド共役体が、標的タンパクウェルごとにSA-AP２マイクログラムとビオチニレートされた代用リガンド50pmolを混ぜることにより準備された。（これはビオチニレートペプチドとビオチン結合部位の1:1比に相当する。）その混合物は室温で15-20分培養した後、トリアミノメタン緩衝サリン−トゥイーン− ２０（TBST）トリ塩酸、pH8.0、150mM NaCl、0.05%トゥイーンー２０で希釈し、ウェルごとに共役体が100マイクロリッターあるようにした。代用リガンドのより低濃度のものに対しては、無関係のビオチニルペプチドが滴定され、ビオチニルペプチドの全体量を50pmol/well、そして全SA-APを２マイクログラム/wellに保った。ブロックした後、ウェルはいったん200マイクロリッターのTBSTで洗われた。それから代用リガンド:SA-AP共役体が加えられ(100マイクロリッター/wel l)、室温で二時間培養した。それからウェルは300マイクロリッターで５回、Bio Rad 1575イミュノウォッシュプレートウォッシャーを用いて洗われた。その定量法はpNPPを100マイクロリッター加え室温で15-20分培養することによって発展した。吸光率は450nmだった。表８はファージ表示由来のペプチドが特異的にUL44に結合することを表している。唯一の重要な結合はGST-UL44へのものであって、ストレプタビジンやGST、G ST-SrcSH3融合タンパクではない。これは、このペプチドによって認識される構造はUL44であって、GST標識ではないことを示唆する。この結合は時間そして用量依存的である（表９＆１０）。結合は代用リガンド濃度とプレート上の標的タンパク濃度に依存している。プレートに結合する標的タンパクはだいたいタンパク0.5マイクログラム/wellで飽和する。このペプチドのUL44への結合はビオチニレートされていない同じペプチドと特異的に競合する(表11)。結論われわれはGSTUL44融合タンパクに特異的に結合する偏向したペプチドライブラリー由来のペプチドを表示しているファージを分離した。これらのファージは２つのうち１つのドメインに結合する：融合物のGST部分のGSH結合部位かまたはUL 44融合体のDNA結合部位である。ファージはそれぞれの部位に特異的であり、それぞれのリガンドに結合するのに競合しうる。UL44領域に結合するDNAに結合するファージと同じ配列のペプチドもまたUL44に特異的に結合する。この結合は、ペプチドと親ファージの間の競合アッセイか、ストレプタビジンアルカリンホスファターゼ共役体(SA-AP)を用いて事後に見つけられるビオチニレートペプチドを使うことによって示すことができる。この共役体はUL44のDNA結合に結合するものを探すために、多くの低分子量複合体をスクリーニングするのに使える。これはいくつかの方法によって行うことができる。一番目の方法はここに示されたアッセイを用いるものである。はじめに、標的タンパク、この場合UL44かUL44融合タンパクを固い表面（すなわちマイクロ力価プレート）上で固定する。ペプチドはSA-APと混合し、この混合物は低分子量複合物と同時に固定化した標的を含むウェルに加えられる。結合のための時間のあと、ウェルはバッファーで洗われ、共役体のための基質(RNPP)が加えられ、ウェルの中のどの共役体でもクリアな基質を色のついた生成物に変えることができるようになる。色の量はウェル中のSA-APの量の比例している。もし代用リガンド：SA-AP複合体と同じ場所で低分子量複合体が標的と結合しているのなら、ペプチド-SA-AP複合体が同じ場所を占めているはずがないから色の量が減ったことがわかる。これは潜在的な薬物誘導の同定になるだろう。この方法は大量の複合体(1,000 - 1,000,000)をスクリーニングする自動化フォーマットの中で使用できる。というのは、代用リガンドと同じ場所に標的に結合し標識代用リガンドが標的に結合するのを妨げる性質をもつからである。これははじめに複合体が加えられ、代用リガンドが加えられる前に結合する、あるいは逆にはじめに代用リガンドが標的に結合し、複合体が加えられ、代用リガンドの置換がモニターされるという方法で行われる。ここのペプチドはプレコンプレックスフォーマット（上述の通り）で使われるか、単一リガンドとして使われそれから第二段階でみつけられる。この実施例はウイルスタンパク上の生物学的に関連のある部位を標的にした代用リガンドを分離するためのファージ表示の使用と潜在的な治療薬物誘導の発見のために小さい分子の大量情報処理選別においてこのリガンドを使う有用性を説明する。似たような実験は抗ウイルス療法の標的となるいかなるウイルスタンパクを用いてもできる。これは、他のヘルペスウイルスと同様CMVをも含むが、増殖の分類や方法にかかわらず、他のどのウイルスタンパクでも同様である。必要なものはウイルスタンパクの材料だけである。この場合、タンパクはバクテリアの中の標的をクローニングしたり発現させたりして供給された。クローンされたタンパクは、バクテリア、イースト、バクロウイルス、ヴァクシニアウイルス、 CHO細胞(chinese hamster ovary cells)、HeLa、線維芽細胞、アデノウイルス、あるいは潜在的な代用リガンドに活性型コンホメーションを与えるような方法で標的タンパクが産生されるような発現系ならどのようなものにおいても発現しうる。タンパクはin vitroで、網赤血球や酵母菌などRNAからタンパクへの翻訳のための酵素を経た機序のもととなるあらゆる材料の溶解産物との接合体のなかのどのRNAポリメラーゼを用いた転写と翻訳によっても作ることができる。もし標的タンパクが十分小さかったら、あるいは合成計画が新しく考案されることができるなら、標的も完全に合成分子となることができる。生物活性試験（仮説）上述のように、一般的にはペプチドは細胞の形質膜を通過しない。リポソーム、電気穿孔法、微細注入法などの技術によって、ペプチドを細胞内に運ぶことはできるが、われわれは進行因子と相互作用するペプチドの生物物理的効果を評価するためにわれわれがはじめに用いた方法のようにペプチドの細胞内運搬には頼らないアッセイを使うことを計画した。このin vitroアッセイははじめはHSV-1系で発達した(Hernandez & Lehman，1990)が、われわれはそのアッセイをHCMV複製系に適用し、確認しようと思う。In vitroのHSV-1系は３つのウイルスにコードされたタンパクを使用している：DNAポリメラーゼ(HSV UL30)、進行因子(HSV UL 42)、そして一重鎖DNA結合タンパク(HSV UL29)である。In vitroでの複製系に使われた鋳型は、オリゴヌクレオチドプライマー(5'-GTT TTCCCAGTCACGAC-3')が強化された一重鎖M13mp18 DNAである。オリゴヌクレオチドはたいていはDNA配列に使われ、商業的に流通している(New England BioLabs)。それゆえ、複製アッセイは開始点非依存的なである。HSV-1ポリメラーゼと一重鎖DNA結合タンパクはM1 3 DNAに強化されたプライマーを伸長し様々な長さの鎖を生成するが、M13環状DN Aの完全な長さにプライマーが伸長した完全な二重鎖DNAはあまり産生されない。対照的に、進行因子を加えると、大部分の生成物は完全な長さの二重鎖M13 DNA である。様々な長さ対完全な長さのＤＮＡ産物はアガロースゲル中の反応産物の電気穿孔的分離法によってモニターされる(Hernandez & Lehman，1990)。 ErtlとPowell(1992)はHCMVポリメラーゼとバキュロウィルス感染Sf9細胞から得た組替えタンパクとして精製した進行因子はプライマー延長反応を協同しあい、さらに進行因子はアッセイでポリメラーゼ活性を刺激することを示した。同様に、Weiland et al(1994)はE.coliで生産されたHCMV UL44進行因子はプライマー伸長アッセイでHCMV DNAポリメラーゼ活性を高めることを示した。我々は次のようにして、HCMVシステムで開始点非依存的プライマー伸長アッセイを行う。 HCMVポリメラーゼ(UL54)と一重鎖DNA結合タンパク(UL57)の符号配列は上述したように進行因子(UL44)のためHCMVゲノミックDNAから増幅される。UL54とUL57符号領域は自動ＤＮＡ配列分析により保証され、pBlueBacHis2(インビトロジェン) でクローニングされる。プラスミドはSf9細胞で複製タンパクの発現のためバキュロウィルス組替えを構築するために使われる。発現タンパクは５’末に２つの符号を有し、１つはXプレスリーダーペプチド(Asp Leu Tyr A sp Asp Asp Asp Lys)でありエライザアッセイでモノクロナール抗体を用いて容易に検出され、他方は２価のカチオンに高い親和性を持つ６つのヒスチジン結合部位を含む。一段階としてニッケル−キレート樹脂を用いて組替えタンパクを精製できる。HSV-1複製アッセイと同等のHCMVは精製されたタンパクを用いて最適化される。もし我々がビトロで開始点非依存的プライマー伸長アッセイを首尾よく達成したなら、相互作用を動揺させる能力を試験するため、反応過程の要因と相互に作用することを示したペプチドを滴定する。全てでなくとも多くのペプチド過程要因の相互作用はポリメラーゼー過程要因やＤＮＡ−過程要因相互作用よりかなり低い親和性を持つが、ペプチド相互作用により影響を見るように強いるため非常に過剰のペプチドを使用することができる。我々はまた、他の要因の添加前に過程要因との相互作用の機会をペプチドに与えるため反応物の添加の順を変えることができる。いくつかのペプチドは過程要因の必須相互作用を妨害する。；そして、結果としてプライマーの延長反応過程を阻害する。阻害効果の特異性は哺乳類ＤＮＡポリメラーゼα（Ｑ−セファロースと２本鎖ＤＮＡセルロースを用いて逐次クロマトグラフィによりヒーラ細胞から部分的に精製された、Ｏｗｓｉａｎｋａｅｔａｌ．，１９９３）か、又は、Ｍ１３−プライマー複合体でＥ．ｃｏｌｉクレノーポリメラーゼ（市販品）を阻害する活性ペプチドの能力を試験することによりアッセイされる。ＨＳＶ−１システムにおいてこのタイプのアッセイに対する前例がある。Ｏｗｓｉａｎｋａｅｔａｌ．（１９９３）はＨＳＶ−１の過程因子（過程因子と結合する我々のペプチドに対する反対の「センス」）のセグメントに対応する一連の１５メルペプチドをアッセイし、プライマーの延長反応を阻害する１つのペプチドを同定し、細胞ＤＮＡポリメラーゼと比較してビールスに対する特異性を示した。ＨＣＭＶ複製反応を阻害するペプチドは、この提案のフェーズＩＩにある連続性を妨害する可能性を持つ組合せライブラリーからの小分子の同定するためハイスループットペプチドディスプレイスメントによる探索に利用される。我々は、ＨＳＶ−１とＨＣＭＶポリメラーゼ／過程因子複合体の類似的性質と大変に似たシステムを用いたＥｒｔｌとＰｏｗｅｌｌ（１９９２）とＷｅｉｌａｎｄｅｔａｌ（１９９４）の報告があるならＨＣＭＶポリメラーゼの連続性をモニターするため、ビトロの起源より独立したプライマー延長アッセイは確立されることに自信がある。しかしながら、もし、組替え蛋白質が活性状態には見えないなら、５’エピトープ標識は機能を妨害していると最初は予想できる。潜在的問題に取り組むために、我々はエンテロキナーゼ分解でエピトーブ標識を取り除ける。そして、もし機能を持った生産物を生じないなら、ＨＳＶ−１蛋白質（ＨｅｒｎａｎｄｅｚとＬｅｈｍａｎ，１９９０）、続いてＨＣＭＶ蛋白質（Ｅｒｔｌｅｔａｌ．，１９９１；ＥｒｔｌａｎｄＰｏｗｅｌｌ，１９９２）で行ったように、標準クロマトグラフィー手順により昆虫細胞抽出物より非標識蛋白質を精製できる。我々は活性ＨＣＭＶ蛋白質を生産できないということは起こりそうないが、２つの代わりの取り組みを考えよう。昆虫細胞がポリメラーゼ、過程因子、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質とヘリカーゼ／プリマーゼ複合体（ＳｋａｌｉｔｅｒとＬｅｈｍａｎ，１９９４）を発現しているバキュロウィルスの混合物で感染させた時、昆虫細胞の抽出物は環状プラスミドの型の起源と無関係の複製のスポンサーとなることがＨＳＶ−１システムでは示されている。このアッセイを成し遂げるために、ＨＣＭＶヘリカーゼ／プリマーゼサブユニット（ＵＬ１０５，ＵＬ７０，ＵＬ１０１−１０２）をバキュロウィルスベクターでクローンし、上にあげＨＳＶ−１蛋白質と同等なＨＣＭＶ蛋白質を発現しているバキュロウィルスの混合物で感染し、抽出物を生産し、その活性を試験する。それから、ペプチドは抽出物において起源と無関係の複製を阻害する能力を試験される。代わりとして、ＨＣＭＶｏｒｉＬｙｔ−依存性の複製を再構成するため必要とされる１１個の因子の完全なセットを発現している一連のプラスミドを細胞は感染させられる（ＰａｒｉとＡｎｄｅｒｓ，１９９３；Ｐａｒｉｅｔａｌ．，１９９３）。電気穿孔法によってペプチドは細胞の中へ導入され、機能的な小ポリペプチドを高い効率で細胞へ導入するのに使われ(Ｋａｓｈａｎｃｈｉｅｔａｌ.，１９９２)反応の阻害能力が試験される。ＨＣＭＶＵＬ４４の特異的機能性ドメインと結合する化合物の小分子、組合せケミカルライブラリーの探索（仮説）組合せケミカルライブラリーはＵＬ４４の巨大分子相互作用を防止する化合物を同定するために探索される。上に記述したベンゾジアゼピンライブラリーと他の化学的多様性を持ったライブラリーを探索する。化合物ライブラリーは個々の化合物をＧＳＴ−４４融合物でコートしたマイクロタイタープレートウェルに置き、分子プローブを添加して探索される。探索アッセイでビオチン化ペプチドをプローブとして使用できる一方、ペプチドや蛋白質モジュールがバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）(上に記載)と融合された発現ベクターｐＭＹを用いることによって化合物探索にとって、これはより使用者友好的になることを見出した。ＢＡＰ融合蛋白質は酵素とペプチド又はドメインの両方の活性を保持している。代表的な各々のクラスのＵＬ４４ペプチドリガンドとＢＡＰ蛋白質を融合し（オリゴヌクレオチドから組み立てられたＤＮＡ断片を挿入して）、ハイスループットスクリーニングアッセイを組み立てるため融合蛋白質を用いた。もし化合物が拮抗的にＢＡＰ−リガンド融合物と固定化されたＵＬ４４蛋白質の結合を阻害するなら、ウェルはカラー変色ではクリアーのまま残るだろう。；一方、化合物がドメインに結合しないなら、ＢＡＰ−リガンド融合蛋白質は固定化標的に結合し、強い黄色へと変化していく。リガンド／ＢＡＰ融合蛋白質もまたＦＬＡＧエピトープを符号しているので、化合物の影響をリガンド／ＢＡＰ融合物と固定化ＦＬＡＧｍＡｂＭ１との結合で調べることにより、どんな明らかな非特異的活性に対する試験をも我々は調べた各々の化合物のコントロールウェルとして含める結合活性を有する特異的化合物が同定されたなら、多方面にわたる生化学的なそしてビールスの成長研究により、それらは特徴づけられる。我々の目的はＵＬ４４機能的ドメインの各々で働くリード化合物の同定である。もしこれを成し遂げたなら、共働作用活性の組合せを試験すべきである。それに従って、プログラムは同定された化合物の構造に基づく第二世代の組合せケミカルミニライブラリーの開発の進歩になる。我々はナノモルの範囲で活性を持つ化合物を同定するように努める。実施例２：プロテインキナーゼＣβIIに結合するペプチドを発現するファージの単離プロテインキナーゼは細胞内の重要な調節因子でありまたシグナル伝達の中心的役割を果たしている。最も重要な役割の一つはプロテインキナーゼＣの調節である。そのさまざまなアイソザイムは細胞増殖を調節する多くの過程に関与し、それゆえ、抗腫瘍剤としての魅力的なターゲットになっている。この可能性を調べるために我々はヒトプロテインキナーゼＣβIIに特異的な代用物リガンドの単離を行った。プロテインキナーゼＣβIIを産生するバキュロウィルスはＬ．Ｂａｌｌｕｓ（ＳｐｈｉｎｘＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｒｐ．）より得た。また、実施例１に示すように固定化した。ファージのアフィニティ選別は実施例１に示すように少し方法を変えて行った。遊離を行うには最初前もって５０℃に暖めたｐＨ２．０のグリシン緩衝液で処理し、すぐに前もって暖めたｐＨ１２の１００ｍＭエタノールアミン緩衝液を１０分間流すと効率よくなることがわかった。遊離したファージをプールし、中和し、９６穴アレイに置かれた２ｍｌのメガ力価プレートにＥ．ｃｏｌｉＤＨＦａＦ‘を含む１ｍｌの２ＸＹＴで増幅した。結果：我々は９５の別個のファージ（ＣＷＬより得た７つを除いてそれぞれのライブラリーより８つ）を試験し、Ｄ，Ｆ，Ｘ１０Ｃライブラリーに結合能力の可能性があることを見出した。これらのライブラリーより得たさらなるファージの試験も行い２３の結合可能性があるファージを見出した。我々はさらに別の７つの蛋白に対するファージの試験を行い結合の特異性をも確信した。強いシグナルと特異性よいことが１３クローンに見出した。これらよりＤＮＡを単離し、自動化された配列決定方法により配列が決められた。ＤＮＡ配列は比較され、翻訳され、ファージにコードされたペプチドの配列を以下に示す。ペプチドは３つのクラスに分けられる。第一の、そして最も大きなクラスは、Ｘ１０Ｃライブラリーからのペプチドであり、２つのシステイン残基によりなされた４つのアミノ酸のループにより特徴づけられている。２つ目のペプチドのグループもまたＸ１０Ｃライブラリーよりのものであり、２残基ループによって特徴づけられている。保持されている配列はヘキサペプチドであり、残基での変化はペプチドのうちの一つがバリンがイソロイシンへ置き換わったことである。第三のグループはもともとの配列を保持していない３つのペプチドからなっている。親和力を高める目的のために異なるクローンを相対的順に置き換えるために、我々はファージの濃度を減じた一連のファージＥＬＩＳＡを行った。結果は表１２に示す。ファージはかなり広い範囲の結合親和力を持っており、最高結合の半分を持つには０．５μｌから１０μｌのファージ上清液が必要であった。我々が単離した人工のリガンドを標的として真核細胞のプロテインキナーゼをこの例は用いる。上に示したペプチド配列は同じ場所に結合する低分子の探索に容易に用いられる。人工リガンドは実施例１で議論したどんな方法にも用いられる。標的として他のどんな細胞酵素をも用いることができる。酵素機能の一つ以上の補因子や調節因子の存在下でもこのような選択は行うことができる。ＰＫＣの場合には、酵素祖を活性化するために、ダイアシルグリセロールやホルボールエステルの存在下、選別をすることができた。これは酵素が異なったコンフォメーションをとり、得られたリガンドを変えるからであろう。既知のリガンドを用いてファージを溶出することによって特異的部位の標的へこの戦略を変えられる。これをするために、私はすべての結合と増殖段階を前に述べたように行うが、溶出段階は大量の天然のリガンド（フォルボール）の存在下、さらに保温することにした。その代わりに、最初天然のリガンドを加え、次にファージを加えることによって、最後の選別からのプールされたファージをソートできた。天然のリガンドの結合はファージの特異的部位への結合を阻止するが、ほかへの結合は阻止しない。つぎに結合していないファージを含む上清を取り、それぞれの結合を調べた。このようにして、特異的既知部位に対するファージを増やすことができる。これらのファージの配列分析によりリガンドの結合部位を表わすペプチドクラスターを生じる。代わりのものを見つけようとする場合、化合物が手に入れられるならばこの方法を使うことができる。この場合、それぞれの選別時にファージは化合物と共に溶出されるか、最後の選別からのファージが結合する前に標的は化合物によって阻止される。これらの方法のどちらも化合物により阻止された部位へ結合する人工のリガンドを生ずる。これらのリガンドはハイスループットスクリーニング( ＨＴＳ)に用いられ、同じか重なる場所に結合するさらなる化合物を見出せる。実施例３．ヒトＭＤＭ２に結合するペプチドの単離ヒトＭＤＭ２ｃＤＮＡからＧＳＴ表現ベクターへのサブクローニングＭＤＭ２（マウスダブルミニュート蛋白）は腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の蛋白生産を阻害することによって、細胞増殖を調節する。正常細胞ではｐ５３はＤＮＡ損傷と調節不可能な細胞増殖のセンサーとして働き、細胞周期を止めたりプログラムされた細胞死（アポトーシス）を起こすことによって多くの遺伝子産物を活性化し細胞増殖を阻止する。ＭＤＭ２はｐ５３のＮ末と相互作用を起こし、これらの遺伝子を活性化するのを防ぐ。こうしてＭＤＭ２の過剰発現は調節不可能な細胞増殖を招く。このシステムへの薬理学的介在の一つの可能性はＭＤＭ２とｐ５３相互作用を阻止することである。この相互作用の小分子阻害剤を見出すため考えられた探索方法を形式化したこれらの代用リガンドを用いることを目標として、ファージディスプレイを用いることにより、ｐ５３とＭＤＭ２相互作用の代用リガンドの単離を企てた。親和性選別の融合蛋白を生産するために、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで消化し、 pGSThMDM２を産生するためにＢａｍＨＩとＳｍａＩで切ったｐＧＥＸ５Ｘ−１（ファルマシア）へｃＤＮＡを結合することによりｐＱＥ１１−ｈＭＤＳからＭＤＭ２ｃＤＮＡをサブクローンした。ＭＤＭ２の最初の１３９アミノ酸に融合したＧＳＴを表現する削除された構成物はＢｓｒＧＩとＸｈｏＩでｐＧＳＴｈＭＤＭ２を消化し、端をクレノウで処理し、再結合させて得られた。すべてのクローンは制限酵素マッピングとＤＮＡ配列分析により確かめられた。融合蛋白は生産者からの標準プロトコールにより生成され、トロンビンで切断され使われる。ＭＤＭ２結合蛋白を示すファージの親和性選別増幅の例以外の実施例１，２で用いたと同じテクニックを用いたファージの選別は、２００μｌの結合反応容器で１から１００μｌのファージ上清と同等にファージを希釈して２から３回単離した後、ファージエライザを行うことによってモニターされた。プールエライザによってモニターされた結合物の増幅３回の選別の後、結合ファージの増幅を示したライブラリーはＨとＷライブラリーであった。９５クローンを試験しＨライブラリーからは４８個、Ｗライブラリーからは４７個であった。強い結合を示したのは、Ｈライブラリーからは５個、Ｗライブラリーからは２８個であった。いろいろな種類の蛋白に対するこれらの３３個のファージの特異性を調べた結果、それらの１７個が結合して強いシグナルを与え、また、特異性も有していた。示されたファージのＤＮＡ配列は決定され、下に示す。これらのペプチド配列は２つのグループに分けられる。第一のグループはそれ自体共通の配列ＦｘＤｙＷｑｄＬを有し、上流の残基は完全に保持されている。この配列は完全にヒトやマウスのｐ５３蛋白と同じであり、生化学的研究や結晶学の研究（ｌｅｎｇｅｔａｌ１９９５ａｎｄＫｕｓｓｉｅｅｔａｌ１９９６）によりｈＭＤＭ２のＮ末と相互作用をもつことが示されている。もう一つのペプチドはお互い限定的な相同性を持ち、ｐ５３やジーン銀行にある他の蛋白からのペプチド配列とは同じではない。結論：これらの実験により、今回の場合はＭＤＭ２とｐ５３との蛋白同士の相互作用であるが、生物学的相互作用を模したリガンドを同定するために、コンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーの利用が示された。これらの実験で得られたペプチドは明らかにｐ５３のもともとの配列を反映しており、ＭＤＭ２と関係する残基部分がマウスとヒトのｐ５３と同等である。Ｌｅｎｇ，Ｐ．，Ｄ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｖ．Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ，Ｓ．ＤｅｂａｎｄＳ．Ｐ．Ｄｅｂ．（１９９５）．ＭｄＭ２のＮ末の１３０番目のアミノ酸はｐ５３で仲介される翻訳過程の活性化を十分阻害する。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０：１２７５−１２８２．Ｋｕｓｓｉｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｓ．Ｇｏｒｉｎａ，Ｖ．Ｍａｒｅｃｈａｌ，Ｂ．Ｅｌｅｎｂａａｓ，Ｊ．Ｍｏｒｅａｕ，Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．（１９９６）．ｐ５３腫瘍抑制形質活性化領域へ結合するｍｄｍ２ガン蛋白の構造サイエンス２７４：９４８−９５３。実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉプロリンｔＲＮＡ合成酵素（ＰｒｏＲＳ）に結合するペプチドの単離トランスファーＲＮＡ合成酵素はｔＲＮＡ分子が特異的なアミノ酸にＡＴＰ依存的に結合するのを触媒する。これらの結合したｔＲＮＡは翻訳過程で新しい蛋白質の生産に使われる。これらの酵素はすべての生物において成長に必要とされ、バクテリアからヒトでは全く異なっている。従って抗微生物化合物として魅力的な標的となる。我々はＥ．ｃｏｌｉプロリン合成酵素に対する代用リガンドの単離とこれらの代用リガンドが酵素の活性部位への標的となっているかどうか調ベる方法を確立した。ファージ表示Ｅ．ｃｏｌｉ．ＰｒｏＳ結合ペプチドの親和性選別ファージの選別は実施例３と同じ技術を使用した。プール・エライザによりモニターされた結合物の増幅３回の選別の後で、結合ファージを非常に増幅させたただ一つのライブラリーはＸ１０Ｃライブラリーであった。標的に対する結合を９５のクローンで調べ、３４のクローンについては種々の蛋白質に対して作用を見た。配列はこのうち３０から得ており下に示す。我々は次に標的に結合した単離ファージで効率化を確認するために第二の親和性選抜をおこなった。第一の選抜とのただ一つの違いは結合に対する時間を４℃ 、で終夜としたことである。我々は再びＸ１０Ｃライブラリーの増幅を観察し、Ｐライブラリーの増幅も少し認められた。ＰおよびＸ１０Ｃライブラリーからの個々の単離したものの試験を行い、配列分析により２０を分析した。Ｘ１０Ｃより得た全ての９つの配列は初めの探索より得た最も多いものと同じであった。Ｐライブラリーより得た全ての１１クローンは同じであり、下に示すペプチドを符号化していた。第三の選抜も第一の場合と同様に行った。Ｘ１０ＣとＰライブラリーから得たファージを試験した。今回は以前の選抜で見出されたものの他、いくつかの新しい配列を生じた。：頻回スクリーニングライブラリーの配列（ＳＲリンカー−ランダムペプチド− ＳＲリンカー）単離されたそれぞれのファージは内外のループでいくつかの保持された残基を持ち８残基の干渉したループ構造で２つのシステインで強いられたペプチドの構造を示す。Ｐライブラリーから単離された一つのクローンは同じ制限されたものを含んでいる。表示されたペプチドを符号化しているＤＮＡのコードされた構造はこのファージはＸ１０Ｃライブラリーからの混ざり物ではないことを示している。Ｘ１０Ｃライブラリーの固定化されたＣ残基はＴＧＣコードを使うが、Ｐライブラリーから単離されたファージでは、このＣ残基はＴＧＴコードで符号化されており、明らかにこのクローンは本当にＰライブラリーより生じたものであることを示している。最もよく単離されるファージに対応するペプチドは合成され、実施例１に示すようにエライザで使用された。図１３にはペプチドはＥ．ｃｏｌｉＰｒｏＲＳに特異的であり、ＴＰは他のペプチドには結合しないことを示している。この相互作用は同じ配列をもつビオチン化されていないペプチドによって用量依存的に阻止される（図１４）。さらに、ＰｒｏＲＳへのこのペプチドの結合は時間とペプチドの濃度依存的である（図１５）。これらのファージから設計されたペプチドにより答えられるだろう一つの質問はそれらが標的蛋白質のランダムな領域に向けられているかどうか、あるいは他の生物学的相互作用を有する活性部位や領域に向けられているかどうかである。上のエライザで用いられたペプチドは標的への酵素活性への影響を評価するため負荷試験に加えられた。必要とされたペプチドとの予備保温時間は長く（約５３０μＭのペプチドを用いて５０％阻害するための時間は約１．５時間）、ペプチドは効果的に酵素活性を阻害し、そのＫｉ値は５００μＭ以上であつた。この阻害はプロリンに対して拮抗的であり、これらのペプチドは酵素の活性部位に向けられている。我々は標識の他の領域に結合するペプチドを表現するようなどんなファージも単離していない。この例はいくつかの重要な点を示している。第一に、バクテリアの蛋白質、この場合はＥ．ｃｏｌｉからの蛋白質、に結合するペプチドを示すファージを単離できる。それに加えて、偏向したライブラリーの利用は明らかに完全にランダムライブラリーの使用に対して有利さを与えている。この蛋白質に特異的に結合する全てのファージは束縛されたペプチドを表現し、これらのペプチドはＸ１０Ｃライブラリーで増幅されている。結合ファージより単離したＸ１０Ｃ以外のライブラリーでただ一つのものはＰライブラリーであり、中心のＰ残基は我々が同定した４つのペプチドのうち３つで保存されている。探索されたライブラリーの残りの構造により、これらのどれもがＰｒｏＲＳに結合するペプチドを増幅するとは期待されていない。例えば、最初のＣの前のＷ残基は保持されているが、我々のＷライブラリーはＷの位置のために正しいペプチドに増幅されているとは期待されていない。それは両サイドが５つのランダムな残基で囲まれている。２つのＣ残基を介在する８残基ループで符号するに十分な残基はない。こうして結合物のランダムな数より高い数を持つライブラリーはＸ１０ＣとＰライブラリーだけであり、そのどちらも結合ファージを与えた。他のライブラリーはどんな結合ファージをも与えないことによってこの考えに助けを貸すことになる。この例が示す第二の点は捕らえるに十分なほどの高い親和性を持って標的に結合する我々の選別過程が持つファージ単離の効率性である。この方法で標的を探索した後には、存在する結合ファージは単離できるという高い自身を持っている。選択されたペプチドのクラスター分析により、標的蛋白質へ選択的に結合するペプチドが存在することを示唆されている。もしペプチドが蛋白質のどんな表面にも結合できるなら、おのおののペプチドは異なっており、ペプチド配列のクラスターは存在しない。明らかに単離された全てのペプチドは同じ部位に結合する。さらに、それらは蛋白質の利用可能な生物学的活性部位である、酵素の活性部位に結合する。それゆえ、この過程で単離されたペプチドは標的蛋白の生物学的に同等な部位を標的としている。第四の、そして興味が持たれる点はジスルフィドを含むペプチドを単離したことによって示される。この特殊な蛋白質はＥ．ｃｏｌｉより得られた。原核細胞の内側ではジスルフィド結合は減じられている環境にある。ペプチドライブラリーにより、このことから表示されたペプチドは細胞内では直線的であり、細胞の外にさらされた後では円形になることを意味している。このことはペプチドは選別に使われた成熟ファージで示されたのと細胞の内では同じコンフォメーションを取らないことを意味している。もしＥ．ｃｏｌｉの中で表現されたペプチドがＥ．ｃｏｌｉ蛋白質に結合し、その機能を阻害し、その蛋白質が必須のものであるなら、そのペプチドはファージ表示ライブラリーを作り、増殖する過程において選別される。（なぜならこれらのファージはＥ．ｃｏｌｉホストで成長する）この例で使われた全ての直線のライブラリーと対照的に、Ｘ１０Ｃライブラリーは細胞の内側で異なったコンファメーションを示す環式ペプチドを表現しなければならない。それゆえ、問題の蛋白質、この場合はＥ．ｃｏｌｉプロリンｔＲＮＡ合成酵素には結合しない。こうして、Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質に結合するペプチドを単離しようとするなら、ペプチドそれ自体が束縛されなければならないし、ライブラリー構築や増殖時に選択されなければならない。さらに、ラドナー（ＵＳＰ５、２２３、４０９）により示唆されているように、システイン残基間の間隔が偶然選ばれたなら２個，４個、または６個の固定されたシステインを持つライブラリーを用いることは成功をおさめることになろう。この場合は必要とされる間隔は８残基であるが、このことは、前もってはわからないことである。全ての組み合わせで多くの異なったライブラリーをつくり、探索することはやっかいなことである。このような場合、この文書の初めで述べたように、１個のシステインを固定し、各々の場所で別に増殖するのが利点がある。このようにして、各々の場所でシステインを表現するペプチドの数は増加するが、それぞれのクローンは一組のシステインを持ち、全ての他の残基はランダムとなろう。実施例５．Ｈ．インフイルエンザチロシンｔＲＮＡ合成酵素今まで述べたプロリンｔＲＮＡ合成酵素で議論したように、チロシルｔＲＮＡ合成酵素は新しい抗生物質の標的として魅力的である。我々はこの合成酵素の代用リガンドの単離とこれらのペプチドはこの酵素のどこに標的とされるかをきめることを試みた。ファージ表示Ｅ．ｃｏｌｉＴｙｒＲＳ結合ペプチドの親和性選別実施例３で使用したと同じ技術をもちいたファージの選択結果：３回の選別の後、ファージ・エライザによりＤ，Ｆ，Ｗ，Ｎ，Ｐ，ＣＷＬ，ＰＨＤ７（ランダム７−ｍｅｒ，ニューイングランドバイオラボ）とＰＨＤ１２（ランダム７−ｍｅｒ，ニューイングランドバイオラボ）ライブラリーでの結合ファージの増加が見られた。これらのライブラリーの各々から得たそれぞれのクローンは特異的結合を調べられ、表示されたペプチドはＤＮＡ配列から引出された。結果を下に示す。ペプチド配列は４つの別々のグループに分類され、最初の２つのグループは多様に関連したもの同士であり、あとの２つは各々１つの配列を含んでいる。グループ１と２にはいくつかの似た場所がある。それらは全て、中心にＹＸＷＰモチーフを含んでいる。Ｙはフリーのチロシンを模しており、ＷＰはＡＴＰを模していると考えることもできる（Ｐは５員環糖を、Ｗは塩基として示される）。グループ１の集団はＷを有しており、それは保持されたＷＰのすぐ下流の位置にあり、しかし、これは普遍的ではない。一方、グループ２はさらに広く保持されたＹＷＷＰＤＷＧモチーフを含み、これは次の位置にＳをもつ傾向がある。ＴｙｒＲＳ１からＴｙｒＲＳ６に対応するペプチドは（上に示してある）合成され、いくつかのアッセイを行った。ペプチドＴｙｒＲＳ１はビオチン化され、上に示したように、標準的エライザとして用いられた。このペプチドはＴｙｒＲＳに特異的に結合し（図１６）、他のペプチドは標的のＴｙｒＲＳｎｉｈａ結合せず（図１７）、結合は時間と濃度に依存していた（図１８−１９）。グループ１と２からのペプチドは結合に競合するかどうか、それらは重なり合わない場所に結合するかどうか調べたかった。全てのペプチドは他のペプチドを示すファージと結合すると同様に親ファージの結合に競合するためにつかわれた（ＴｙｒＲＳ１−６）。すべてのペプチドは結合においてその対応する親ファージと競合することは明らかである。（下の表）さらに、グループ２からのペプチドはグループ１と２からのファージと結合において競合するが、グループ１からのペプチドはグループ２からのファージとは効果的には競合しない。このことはグループ１からのペプチドはよく結合し、グループ２からのペプチドはさらによく結合し、グループ１からのペプチドが入り込み結合するのを阻止するというペプチド結合のモデルと一致している。配列の重なり合いは標的の特異的な場所でペプチドは相互作用をしていることを強く示唆する。これは機能的に関連する部位なのだろうか？このには質問２つの方法で述べられる。第一には酵素活性を阻害するかどうか見るためにペプチドを標準的チャージングアッセイに加えた。グループ１と２からのペプチドは効果的に酵素活性を阻害し、ＡＴＰとアミノ酸と競合的に阻害し、このことが達成された。こうして、両方のクラスターからのペプチドは酵素活性部位を標的とし、それ自体効果的な阻害剤であった。明らかにこれらのペプチドは標的とされる薬剤の相互作用の潜在的な領域に向けられている。もしこのペプチドが低分子量の化合物により置き換えられるならば、化合物は薬剤のリード候補になる。この標的への効果的な阻害剤は我々の使用に利用でき、ＴｙｒｔＲＮＡ反応の中間体を模している。これらの阻害剤はチロシルアデニル化合物である。そのような化合物のうちの１つについてファージの分裂能力試験を行った。単離された全てのファージとの標的相互作用である。阻害剤はグループ１ファージの大部分に結合するファージに対して効果的な競争者であることを確認した。ＴｙｒＲＳ１ＢペプチドがＴｙｒＲＳに結合するのを阻害する化合物の能力を調べた。混合物をマイクロタイター皿のウェルで固定化された標識に加える前に種々の濃度の化合物が代用リガンドに加えられた場合を除いては標準的エライザ法が用いられた。結果は図２０に示される。化合物が代用リガンドの標的への結合を用量依存的に阻害することは明らかである。関連化合物であるプロリルアデニレートは別な合成酵素（ＰｒｏＲＳ）の阻害剤であるが、これは代用リガンドの結合には影響を持たなかった。この例は明らかにいくつかの重要な点を示している。第一には、ファージの表面に示されたペプチドの大部分は蛋白質の活性領域の標的とされる。加えて、これらの実験は低分子量化合物が生物学的活性部位へ結合するのを検出するためにペプチドを基とした代用リガンドの使用の有用性を示している。このアッセイは、蛋白質の機能について予備的知識がない時でさえ、酵素機能の潜在的阻害剤のための数多くの化合物の試験に使用される。必要とされるのは、代用リガンドと低分子間の結合の競争を検出できることである。実施例６．トランスメンブレイン受容体への標的（仮説）膜にかかる細胞受容体は生物学的活性蛋白質として正しいコンフォメーションをとるためにしばしば細胞膜に存在する。蛋白質の天然の形を標的とし人工のリガンドをみつけることを目的としたこれまでの技術に問題を生ずる。この問題に対する１つの解決は受容体の選択を表現するために生きた細胞を用いることであり、人工リガンドのライブラリーへの標的を提出する方法として生の細胞を使うことである。この１つのシステムとしてゼノパスラエヴィスからのオオサイトがある。先ず興味を持っている受容体をクローン化し、バクテリアかファージＲＮＡポリメラーゼを用いてビトロで生産されるＲＮＡからのベクターへ入れた。このＲＮＡはオオサイトに注入され、オオサイトは保温され蛋白質が生成された。今は細胞表面に興味を持っている受容体があるオオサイト（多分１結合反応当たり１−１０）は人口リガンドのライブラリーと混合され結合が起こる。オオサイトは非特異的な結合のリガンドを除くために洗われ、相互作用を壊すためにｐＨ，塩濃度やその他の処理をしてリガンドは溶出される。リガンドはそれから増幅され、さらなる選別にまわされる。上に述べた正の選別は興味を持っている受容体に特異的なリガンドを生じさせる。しかしながら、オオサイトの表面にある蛋白質に結合しているリガンドを除くために負の選別を用いる必要がある。人工リガンドのプールをＲＮＡが注入されていないため表面には天然のオオサイト蛋白質だけを提示しているオオサイトに結合することによって達成される。オオサイトに結合しているどんなリガンドも除かれ、上清に残っているリガンドは次に行う正の選別に用いられる。この負の選別は正の選別のおこなわれる前後になされるか、または、選別過程に一回だけ必要とされる。どんな場合にも、考え方はオオサイト蛋白質に結合している人工のリガンドを除くことであり、増幅されたリガンドのプールを興味を持っている受容体に結合するリガンドとすることである。受容体に結合するリガンドの増幅は修飾されたエライザ法により感知される。この場合注入され、受容体を表現しているオオサイトはマイクロタイター皿のウェルに置かれ、それぞれの人工リガンドが添加される。ペプチドを表現しているファージの場合、単離されたプラークより成長されたファージクローンが使われた。オオサイトは洗浄され、リガンドは通常ホースラディシュパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼのような酵素に結合した抗体により型どおりの方法で検知される。負の対照として、注入されていないオオサイトが対照のウェルにある同じクローンで処理され、シグナルが比較される。注入されたオオサイトを含むウェルで高いシグナルを与えるクローンは陽性と判断され（特異的に受容体と結合する）、両方のウェルで同じシグナルを持つものは通常、オオサイト表面で蛋白質に結合する。結合するクローンは配列が決められ、共通の要素が比較される。他の表現システムも同様に働くとおもわれる。これらはバクテリア、イースト、バキュロウィルス、バシニアウィルス、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）ヒーラ細胞、線維芽細胞、アデノウィルスや潜在的な代用リガンドに活性コンフォメーションを提示する方法で標的蛋白質を生産する他の別な表現システムを含んでいる。蛋白質はビトロでは転写や翻訳によりつくられ、レティキュロサイト、ウィートジャームやＲＮＡから蛋白質へ翻訳する酵素的機械のほかの源などから得た消化物と共にいろいろな種類のＲＮＡポリメラーゼを用いてつくられる。適当な蛋白質の折りたたみを促進する環境では蛋白質を生産し単離するにはそれらのことは有利である。１つの例はビトロの転写・翻訳反応でのカニイン・パンクレアチック・ミクロソームである。もし標的蛋白質が十分小さかったり、合成スキームが新規に生産するように工夫されたなら、標的は完全に合成分子でありうる。実施例７．代用リガンドとして核酸の単離と利用（仮説）ペプチドに基づく人工リガンドの利用はここで議論した薬剤探索の典型的であり強力な方法である。しかしながら、ペプチドリガンドを単離するには難しい、いくつかの標的がある。この場合、リガンドとしてＤＮＡやＲＮＡを基本としたアプタマーの利用が望まれ、特に、これにより非常に多くのＤＮＡやＲＮＡライブラリー（複雑さは１０¹⁴以上）の仕事ができる。リガンドはいくつかの異なった探索方法で単離される。（米国特許５，２７０，１６３；５，４７５，０９６；５，５６７，５８８；５，５９５，８７７；５，６３７，４５９）。例えば、ＤＮＡライブラリーの最初のライブラリーはランダムコアとなる１０から１００塩基で側面を固める各々の両端の１０から３０塩基の配列を定義する。補足的に両端の配列を定義するプライマーはライブラリーの増幅に使われ、タグを持つ (ビオチンのような)。増幅後には２本鎖ＤＮＡはマトリックス（ストレプタビジンアガロース）に結合し、１本鎖ＤＮＡを遊離するように変性される。リガンドを単離するために標的蛋白質は出発ライブラリーである１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と保温され、アプタマーは結合に置かれる。蛋白質：アプタマー複合体は非常に高い能力で蛋白質には結合するが一本鎖ＤＮＡへの親和性が低いニトロセルロースか、又は、ナイロン膜でろ過され集められる。結合していないアプタマーは過剰の緩衝液でろ過を通して洗い除かれ、もともとの標的蛋白質に結合しているアプタマーだけが残る。これらのアプタマーはいくつかの方法(ｐＨショック、フェノール抽出、ＳＤＳ処理、熱処理)の１つを用いて溶出され、エタノールで沈殿され、次の選別に使うための新たなプールを合成するため、ＰＣＲにより増幅される。この過程は１から２０回繰り返された。これを行う回数は、それぞれの回や他の選別の回ごとに結合物の増幅の程度を検査して決められる。これはいくつかの方法で成し遂げられる。最もよく用いられる方法はライブラリーの少しのパーセントを放射活性物質で標識し、各々の回、フィルターに残ったライブラリーの分画を検査することである。別な方法はアプタマーを検出する増幅反応でプライマーを利用することである。この２つの例はローダミンとジゴキシゲニンである。ローダミンは蛍光で直接検出され、ＤＩＧは酵素に、あるいは、蛍光の読み出しに直接的にあるいは間接的に連動させた抗体によって検出される。標識されたプライマーの使用により、プレートのウェルに標的蛋白質が固定化されている標準的エライザ法で標的に結合したアプタマーの検出はなされ、アプタマーは加えられ結合に付され上に述べたうちの１つにより検出される。十分なレベルの増加が達成されたなら、最後のプールは増幅され、挿入物の迅速な配列を可能にするプラスミドの中へクローンされる。ベクターでのそれらと矛盾しないプライマーの制限部位を用いることによりこれはなされる。しかしながら、生成物をＴに標識されたベクターへクローンするためには熱的に安定な多くのポリメラーゼによって加えられた付加的なＡ残基を利用するのが望ましい。クローニングに使われる制限部位を含むアプタマーの可能性が故にこれは望ましいことである。そして、クローニングで全てあるいは一部のアプタマーの消失になる。個々の代用リガンドアプタマーは標識されたプライマーを使用してプラスミドＤＮＡから増幅により準備される。結果として得たリガンドは特異性の対照とされるいくつかの他の無関係な蛋白質に対してと同様に標的蛋白質への結合活性が試験される。標的蛋白質に特異的に結合し、強いシグナルを与えるクローンから得たＤＮＡは自動的ＤＮＡ配列決定のため準備される。配列は並べられ、相同的領域が検索される。直線的配列の相同的領域はアプタマーと標的の特異的な相互作用を必要とする２次、３次構造を表示する。薬剤のリードのための小分子ライブラリーの探索において、これらのリガンドを利用するために、前に述べたようにリガンドはローダミンかＤＩＧで標識された。その代わりに、ピットナーが記述しているように標識される（米国特許５、６５０、２７５と米国特許５，６４１，６２９）。リードとなる薬剤の探索は上の例に示す方法で核酸代用リガンドを用いてなされる。実施例８．アグロバクテリウムフェセリス β−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＰｒｏＲＳに結合するペプチドファージ表示を用いて単離されたペプチド代用リガンドの多くは、生物学的に活性な部位に向けられていると発明者は信じる。これらは蛋白質―蛋白質相互作用、蛋白質―リガンド相互作用の部位であり、酵素の活性部位、酵素の調節部位である。一連の蛋白質でのこの現象を示すため、生物活性が検査できる種々の組み合わせの酵素を選んだ。活性部位で代用リガンドが標的酵素に結合するなら、酵素活性の効果的な阻害剤として行動するだろう。それに加えて、下に示すような多くの標的のように、阻害に向けた多くの活性部位が利用できる。これらを用いることにより、標的と蛋白質間の相互作用の部位の地図にすることができる。標的とされる酵素はアグロバクテリウムフェセリス β−グルコシダーゼにの例）、豚すい臓から得たカルボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガー・マンハイムｃａｔ＃１０３２３３）（実施例９）、アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマｃａｔ＃Ａ３２６３）(実施例９)、Ｅ．ｃｏｌｉＰｒｏＲＳ(実施例４と９)、グリコーゲンフォスフォリラーゼａ、それとイースト・ヘキソキナーゼである。親和性選別は蛋白質がいくつかの方法で提出されている以外は実施例３の方法で行われた。まず第一に、蛋白質は前の例のように、イムロン４プレート（ダイネックス）に固定化された。しかしながら、追試験では標的に特異的に結合しているファージを単離することができなかった。示された標的はイムロン４プレートに結合した時大きく活性が減じていた。それはプラスチックに結合すると変性すると思われる。この問題を避けるために、２つの方法が用いられ、どちらもビオチン化蛋白質を利用していた。蛋白質（１ｍｇ）はｄｄＨ₂Ｏで１０ｍＭの貯蔵溶液として新たに準備したサルフォＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣビオチン（ピアス、ｃａｔ＃２１３３８）でビオチン化された。全ての蛋白質は塩分を含む燐酸緩衝液に溶かした。ビオチン化試薬は蛋白質に対して１７倍モル過剰に蛋白質溶液に添加された。反応は室温で３０分行われ、氷を３０分間加えた。ビオチン化された蛋白質は製造元の指示に従いセファデックスＧ−５０マイクロースピンカラム（ファルマシアバイオテックｃａｔ＃２７−５３３５−０１）を用いて過剰のビオチン化試薬から分離された。蛋白質のアッセイはバイオ・ラドの蛋白質アッセイ試薬（ｃａｔ＃５００−０００６）を用いて行った。全ての蛋白質は１ＸＰＢＳに１０％グリセロールを加え−８０℃で保存した。アフィニティ精製の第一の方法では、ファージライブラリーは溶液として１μ ｇのビオチン化標的蛋白質と混合され、室温４時間保温された。ファージ・蛋白質複合体はそれからビーズを加え、室温で３０分間試験管を回して保温しストレプタビジンパラマグネチックビーズ（プロメガ、ｃａｔ＃Ｚ５４８２）上に捕獲された。複合体は磁石を用いて試験管のふちに導かれ、ビーズは５ｍＭのビオチンを含むＴＢＳＴで洗浄された。ビーズは１回目の選別時に１回洗浄され、それぞれの選別時に３回洗浄された。ファージは溶出され、実施例３に記述したように、逐次的手順により増幅された。アフィニティ精製の第二の方法では、ファージライブラリーは、第一にストレプタビジンパラマグネチックビーズ上に捕獲された１μｇのビオチン化標的蛋白質と混合された。蛋白質が結合した後には、ストレプタビジン上の残っている結合部位をふさぐためビーズは一度５ｍＭのビオチンを含むＴＢＳＴで洗浄された。ライブラリーとビーズは次に室温で４時間、回転させながら混合され、上のように溶出され、増幅された。ファージエライザは１μｇのでマイクロタイタープレート（イムロン４、ダイネックス）を先ずコートし、次にＢＳＡでブロックして行われた。ビオチン化蛋白質は次にウェルに添加され、１時間、ストレプタビジンへの結合が行われた。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ファージエライザに用いられた。結果：次のペプチドは特異的にβ−グルコシダーゼに結合するファージ上に表示されることが示された。ペプチドは類似性より２つの集団に分けられる。固定化の異なった方法により蛋白質は同じ結果を与える：両方の集団からのペプチドは溶液からまたは、ビーズ表示標的から分離され、そして２つの方法から同一のペプチドが分離された。第二の集団のペプチドは主にＷとＰ固定の残基ライブラリーから単離され、保持された配列でＰＷＰモチーフと一致していた。第一のグループでペプチドを提示しているファージはＮ，Ｋ、Ｒライブラリー由来であり、この集団の共通の配列と一致していた。固定された残基ライブラリーが探索されたモチーフでたた１つ保持されていた残基はＤとＷであった。両方の場合において、共通の配列は、これらのライブラリーが標的に結合するペプチドを符号化するのを不可能にしてカルボキシル末端側に対して５残基より大きく伸びている。これらのペプチドを表示しているファージが酵素の活性部位に向けられているかどうか見るために、ファージとβ−グリコシダーゼ活性に対して活性部位指向の不可逆的阻害剤であるコンデュリトールとの競争が行われた。標的は上のように固定化され、３ｍＭコンデュリトールと３時間保温された。プレートはアスピレートされ、標準のファージエライザが行われた。結果を図２１に示す。グループ２からのファージの結合はコンデュリトールにより阻害されたがグループ１からのファージによっては影響を受けなかった。コンデュリトールは低分子（分子量１６２．１）であり、グループ２からのファージはコンデュリトールの結合部位と重なり合わない活性部位の一部を認識するのは可能である。それゆえ少なくともグループの１つは酵素の活性部位と結合するペプチドを表示する。ファージの表面で表示されている次のペプチドはカルボキシペプチダーゼと特異的に結合することが分った。ファージの表面で表示されている次のペプチドはアルコールデヒドロゲナーゼと特異的に結合することが分った。これらの両方の標的に対して、集団に対してどんな明らかな共通性をも有しないペプチドと同様にお互いの共通性を有し、集団性を持つペプチドがある。これらのペプチドを表示するファージは結合に選択的である標的に対して大変特異的である。交叉反応エライザアッセイによりそれらは試験した他のどんな標的より特異的な標的に対して少なくとも１０倍以上強いシグナルを与えることが示された。ファージの表面で表示されている次のペプチドはビオチン化されたＰｒｏＲＳと特異的に結合することが分った。これらの配列は標的がイムロン４プレートに直接固定化された実施例４にあるものとは明らかに異なっていた。プラスチックに結合することにより、蛋白質のコンフォメーションが変化し、歪められた結合部位を提示する可能性がある。溶液中で結合するファージの選別は蛋白質のより天然の形と結合するペプチドを表わしており、標的の天然のコンフォメーションをより良く示すものである。同様なアフィニティ選別手順はグリコーゲンフォスフォリラーゼａとイーストヘキソキナーゼを用いて行われた。この例での各々の標的に対して酵素活性はファージ表示ペプチドの存否により、または効果的な阻害剤であるかどうか調べるために合成ペプチドを用いることにより監視された。そのうえ、ファージ／合成ペプチドと阻害剤あるいは基質の間の競争は同定された代用リガンドが標的の活性部位に結合するかどうかを決めるために行われた。これらの代用リガンドは上の例で述べたようにこれらの標的に対する低分子量の阻害剤を探索するために使われる競合的結合アッセイを作り上げるために用いられた。ここに提示したデータからいくつかの蛋白質はプラスチックへの結合に対する不活化に大変敏感であることが明らかである。ストレプタビディンでコートされたマイクロタイタープレートやビーズの利用はビオチン化された標的蛋白質と共同で標的蛋白質の提示に代わりの方法を提供する。他のものと同様エピトープ標識やリガンド：融合蛋白質の組み合わせに対する抗体の利用などの標的提示の他の方法はファージの選別と低分子量阻害剤の探索において有利である。実施例９（仮説）Ｂ７：ＣＤ２８複合体の阻害剤の同定背景抗原提示細胞でのＢ７の表示は後の免疫応答の結果に決定的な役割を持つことを暗示する生物学的文献が多くなっている。Ｂ７の表示はビトロで、さらに重要なことはビボではＴ細胞のプライミングに対して強力なアジュバンドとなる。このプライミングは少なくとも一部は、ＣＤ２８を巻き込んで起こっているという重要な事実がある。ＣＤ２８はＢ７に対して比較的高い親和性を持つ受容体である。ＣＤ２８のＴ細胞の表面での契約はｃＲＥＬ依存性経路で活性の増加を招く。Ｂ７／ＣＤ２８のＢ７に対する抗体との相互作用を防ぐことはシグナル伝達を阻害し、効率的なＴ細胞の動き出しを阻害する。この相互作用を防ぐ化合物は明らかに強い免疫学的な性質を有する。分子プローブとしてのペプチドＣＤ２８のＢ７結合部位を特徴づけ、また、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用を防ぐ低分子量化合物の探索を確立するため強力にしたファージ表示ペプチドライブラリーからＣＤ２８の小さなＢ７−代用リガンドを同定することを提案する。いくつかの理由からＣＤ２８結合ペプチドを発展させることを選んだ。１．融合蛋白質発現システムでのＣＤ２８の膜遠位部フラグメントのクローン化と発現ＣＤ２８の細胞外ドメインはＰＣＲを用いてＣＤ２８ｃＤＮＡからクローンされる。ＰＣＲにより増幅された生成物（リンカーと共に）はＴＡプラスミド（インビトロジェン、サン・ジェイゴ、ＣＡ，ｐＣＲＩＩベクター、「オリジナルＴＡクローニングキット」）の中でクローン化された。つづいてそこに融合蛋白質を生成するためにｐＧＥＸ２Ｔベクター（ファルマシア）を挿入する。挿入物の配列は自動配列決定機により確認される。つづいて、組み替えプラスミドを隠しているバクテリアはＧＳＴ−ＣＤ２８細胞外ドメイン融合蛋白質を発現するために導入される。蛋白質はグルタチオン−アガロース（ファルマシア）単純なアフィニティクロマトグラフィにより精製される。ＧＳＴ融合のように外部のドメインを生成するのに困難があるなら、ＣＴＬＡ４−ＩｇとＣＤ２８−Ｉｇ（Ｐｅａｃｈ，１９９５＃９）で首尾よく行われたように、それをＩｇ融合構成物でクローンする。我々はこの融合構成物を哺乳類細胞で生産し、蛋白質Ａディスクを用いて上清から精製する。２．ＣＤ２８に結合するペプチドに対するバクテリオファージＭ１３ランダムペプチドライブラリーの探索実施例１に述べたと同様な方法の範囲内でファージ表示ランダムペプチドライブラリーはアフィニティ選別技術を用いて固定化したＧＳＴ−ＣＤ２８融合蛋白質への結合で探索される。それぞれの単離物のＧＳＴ−ＣＤ２８融合蛋白質への結合は、ホースラディシュパーオキシダーゼへ結合した抗ファージ羊抗体（ファルマシア）を用いて単一酵素結合免疫吸着剤アッセイ（エライザ）によって評価される。３．ファージ配列と共通ＣＤ２８結合ペプチドの決定既知のＣＤ２８結合リガンドであるＢ７．１とＢ７．２を用いた共通性検討ＣＤ２８結合蛋白質の共通配列は実施例４のＵＬ４４に記述したと同様な方法で決定される。ほかのライブラリーからの配列と明らかに好ましいライブラリーからのファージの配列を比較することにより、最適のＣＤ２８結合蛋白質のリガンドを定義することができる。新規なＣＤ２８リガンドを同定するためにプロジットシステムとスイス蛋白質データベースの使用のように、これらの共通の配列はコンピュータ検索では役に立つことが予想される。いくつかのＣＤ２８結合蛋白質はＢ７．１とＢ７．２の範囲内において、ＣＤ２８結合ドメインと類似性を持つと予想される。発表（Ｐｅａｃｈ，１９９５、＃９）された観察に基づいて、Ｂ７．１および／またはＢ７．２において、ＩｇＶ重なりのＧＦＣＣ'Ｃ”β −シート面とＩｇＣドメインのＡＢＥＤβ−シート面といくつかの構造類似性をみれると期待される。ファージ表示により同定されたモチーフの結合活性は合成ペプチドにより確認される。付加されたビオチン残基を持つペプチドを合成し、続いてエライザにより相対的結合を調べ（Ｓｐａｒｋｓ，１９９＃１０８）、点を打つ。実際のＫｄ測定は蛍光ポーラリゼイションによってビオチン化されていないペプチドに対して決定された。それに加えて、解離定数はＢＩＡコア装置（ファルマシア）で定量された。真正のリガンドと類似性を持つ配列に加えて類似の配列を見出すことが予想される。我々はさらに下に両方の配列を特徴づける。加えて、ＣＤ２８の他の未知リガンドと類似した配列を同定する可能性があり、それはＣＤ２８蛋白質の他の部位と結合するかもしれない。これらを性格づけることはＣＤ２８を用いていままで未知のシグナル経路を示すかもしれないので特に興味深いことである。４．ＣＤ２８依存性Ｔ細胞に基づくアッセイにおいてアゴニスト／アンタゴニスト活性に対するペプチドの試験刺激的リンパ球混合反応に対する樹状細胞（又はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）の能力は我々の主な生物学的アッセイの基である。我々は５日目に両方の³Ｈ−Ｔｄｒの取りこみを測定し、直接的に結合した抗体を用いてＦＡＣＳにより２日目のＩＬ−２（ＣＤ２５）の誘導を続いて調べた。ＩＬ−２のアップレギュレーションはＴ細胞の活性化において初期に起こる。それは増殖よりより速く、感受性の高い読み出し情報を与える。これらの実験を行うため、種々の数の刺激細胞の存在下、正常末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）と刺激細胞を保温する。ＩＬ−４とＧＭＣＳＦでＰＢＭＣからの樹状細胞を生長させることによりＭＨＣが合わなかった個人から樹状細胞刺激物を用意する（Ｒｏｍａｎｉ，１９９４＃１１９；Ｘｕ，１９９５＃１２２）。そのような培養物はかなりＤＣで増殖され、強力なＭＬＣ刺激物である。培養物はフローサイトメトリーでクラスII⁺,B7⁺細胞の数が調べられる。培養物に濃度が増加するようにペプチドが添加され、反応性が調べられる。負の対照は同様な大きさとアミノ酸組成を持つ無関係なペプチドからなっている。ＰＭＡに加えてａｎｔｉ−ＣＤ２８処理の組み合わせは正の対照として働き、最大のＴ細胞反応の指標となる。すべてのデータは同一の試験を３回づつ行い、データは標準的統計法を用いて分析された。我々はアンタゴニストペプチドは用量―反応曲線を同等のＴ細胞反応に対して高い刺激細胞濃度のほうへ移動させると期待している。アゴニスト活性を有するペプチドは刺激細胞の数の低いほうへ用量反応を移動させられると期待される。我々はこれらのペプチドはＣＤ２８を活性化するようなアゴニストとして機能するか、ＣＤ２８に依存する応答をふせぐアンタゴニストとして機能すると予想している。阻止活性を示せないどんなペプチドもＴ細胞を刺激するため副最適な濃度のａｎｔｉ−ＣＤ３を用いてアゴニスト活性を試験された。アゴニストとして働くペプチドは高められた活性を示す。抗ＣＤ２８抗体はこれらの反応の対照となる。これらのデータは確認され、ペプチドの用量―反応曲線を用いて清書される。ペプチドは単一濃度の刺激剤（最大の５０％刺激を与える濃度添加）の下、種々の濃度で培養へ加えられる。アゴニストは用量の増加と共にベースラインの上に刺激が見られたが、アンタゴニストペプチドは濃度の増加と共に応答は減じている。これは低用量では阻害するが高用量では刺激した。ＭＨＣ結合ペプチドはこの特徴づけとともに報告される。（３２）この計画の最も大きなつまずきはＣＤ２８細胞外ドメイン結合蛋白を得ることができなかったことであろう。我々の以前の実験に基づき、ＣＤ２８の一部は、たとえ単量体であっても他の蛋白質（Ｂ７）に結合していることは明らかであったので、このようなことは起こらないと信じる。しかしながら、今回のように起こり得ない場合でも、Ｂ７．１の細胞外ドメインとバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）との融合構成物つくる。もしＧＳＴ−ＣＤ２８に対するこのドメインの親和性が大変高いなら（１μＭより大きい）、我々は選択的にＢ７配列に変化を起こさせ、化合物ライブラリー探索に使用可能な程度まで親和性を低める。５．ＧＳＴ−ＣＤ２８融合蛋白質に対する組合わせ化学リガンドのハイスループットスクリーニングの確立Ｂ７／ＣＤ２８アンタゴニストを同定するために組合せ化学ライブラリーが探索された。これらの化合物はビボでＢ７／ＣＤ２８機能を壊すために使用される。我々は上に記述したベンゾジアゼピンライブラリーと仮説的実施例１にあるＵＬ４４で記述したと同様に他の化学的多様性ライブラリーを探索した。結合活性を有する特異的化合物が同定されたなら、機能的ドメイン（ＳＨ３，ＷＷとＰＴＢドメイン）の家族性だけでなくＣＤ２８の他の機能的共通性との交叉反応性も試験する。我々は化合物がビオチン化されたペプチドリガンドの他のコントロール融合蛋白質だけでなくＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに結合するのを妨げるかどうか試験することにより迅速に特異性を調べることができる。ペプチドリガンドのＣＤ２８細胞外ドメインへの結合を拮抗的に阻害する化合物は生物学的実験に使用される。（上参照）もしターゲット間で交叉反応性があるなら（これは全く可能である）同定された化合物の構造に基づく第二世代の組合せ化学ミニライブラリーは生じる。これらの目的を持って組み立てられたミニライブラリーのいくつかのものはＣＴＬＡ４へよりもより大きな特異性と多分より大きな親和性を持ってＣＤ２８ドメインに結合すると期待される。我々はナノモルの範囲で活性を持つ化合物を同定しようとしている。実施例１０（仮説）アポトプティック−シスタンパクの拮抗物質の同定背景アポトーシスとしても知られているプログラム細胞死は、正常および異常の両方の細胞プロセスである。手足の指の形成、蛾の変態中における幼生の筋肉の破壊、口の形成、誤ってつながった神経細胞の除去、および自己抗原として認知されている胸腺細胞の除去といった、胎児成長中に起こる正常な細胞死について多くの例がある。細胞死のコントロールにおける欠陥は、自己免疫のいくつかの種類、成長調節からのガン細胞の逸脱、およびウイルス性感染細胞の不死化の基礎として記述されていて、少ないが挙げられている。このように、アポトーシスの分子的な基礎を多くの科学者たちは、正常および異常な成長調節として理解することを批判的に考えている。もし、細胞死に巻き込まれた分子を特定できることができると、これを用いてアポトーシスを阻害あるいは誘発するするために使用することができる治療薬を開発するための高い価値をもった標的として役立つ。これらの薬品は、いくつかの種類の自己免疫性の病気の治療、バクテリアおよびウイルス性感染との戦い、損傷した神経細胞の再生促進、およびガンとの戦いにおいて有用性があるかもしれない。アポトーシスの開始において関係している多くの分子が知られている。これらは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、Ｆａｓ受容体（ＡＰＯ１およびＣＤ９５としても知られている）、種種の免疫細胞受容体、Ｒｂ相互作用タンパク、線虫神経誘導タンパク、および胚軸形成に含まれている二つのハエタンパクといった、タンパク質を含んでいる。ＴＮＦ、ＮＧＦ、およびＦａｓ受容体（Ｒ）は、１２のメンバーからなるＴＮＦＲタンパクファミリーのメンバーである。このファミリーの細胞外ドメインは、全て３から６のシステインの豊富なドメインを共有している。細胞外ドメインが比較的保存的な一方で、〜８０アミノ酸ドメインを共有しているＴＮＦ、ＮＧＦＲ、およびＦａｓＲ分子の他は、細胞質内の領域は保存的ではない。機能分析（以下を参照）の結果、このドメインは、これらの受容体の細胞死シグナリングにおいて中心的役割を果たし、それゆえこのドメインはデスドメイン（ＤＤ）と名づけられた。異なるＤＤ配列間のアミノ酸配列同一性のパーセントは〜３０％ではあるが、結果配列がＤＤについて証明された。１３の異なるＤＤの基本的構造の最新の比較についてが、ケイ・カウフマン博士によってウェブ上に公開された(http://ulrec3.unil. ch/domains/dd/index.html）。ＴＮＦ、ＮＧＦ、およびＦａｓ受容体の特異的ＤＤ配列の比較は、以下のアラインメントに見出すことができる。見られるように、同一性の程度（空いているます）は低く、ＤＤの全長にわたって分散している。ごく少数の残基（すなわち、ｇｌｙ１７、ｉｌｅ２３、ａｓｐ２４、ｌｅｕ４２、ｔｒｐ４５、ｌｅｕ５８、ｌｅｕ６２、ｇｌｕ７２）が、３種の全てのタンパク質中で保存（以下の太字）されている。ＴＮＦおよびＦａｓ受容体の場合、これらのＤＤは細胞死を活性化させるのに重大な意味を持つことが明らかにされている。両方の受容体をコードしているｃＤＮＡクローンを種々の培養細胞株に導入すると、これらの細胞はＴＮＦあるいはＦａｓリガンドの存在でアポトーシスを起こす（NagataおよびGolstein、1995）。しかしながら、形質移入された受容体がこれらのＤＤ中に突然変異を持つと、細胞外シグナルの存在でアポトーシスは起こらない（タルターリアら、1993）。ドメインのＮ末端から１０程度あるいはＣ末端から３程度の少量のアミノ酸を切断することによって不活性化する。さらに、ＴＮＦＲＤＤ（上記アラインメント）中の多くの残基（黒字）をアラニンで置換すると、受容体はもはや宿主細胞においてアポトーシスをもたらさない。面白いことに、ＦａｓＲ中で自然発生する突然変異が観察されている：リンパ球増殖および自己免疫症候群類似ヒト膠原病を経験しているｌｐｒマウス中において、一のアミノ酸突然変異（Ｖ２３８における変化に等しい；ヒトＦａｓＲタンパク配列の）がＦａｓ受容体のＤＤ中にある（WatanabeFukunagaら、1992）。同様の表現型が、ｇｌｄマウスにおいて起こっていて、ここではＦａｓリガンドが欠損している（Takahashiら、1994）。このように、ＴＮＦおよびＦａｓＲの適切な役割は無処置のＤＤを必要とするのが明らかである。ＭＯＲＴ１／ＦＡＤＤおよびＴＲＡＤＤタンパクのどちらも、死亡効果ドメイン（ＤＥＤ）と名づけられた付加的なモチーフを共有している。この〜８０アミノ酸長ドメインは、実施例と１８〜３８％同一性である。ＤＥＤは、このドメインがＦＡＤＤから除去された場合には細胞死がブロックされるので、細胞死において本質的な役割を果たす（Chinnaiyanら、1996）。１．グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、数種の異なるプロテインからの細胞死ドメインとの融合の作成標的として使用するために、ＧＳＴ細胞死ドメイン融合タンパクを準備した。生物学的に適切な方法でＤＤにペプチドが結合することを証明するために、ＤＤの突然変異を不活性化することに対する感応性をテストする。一のネガティブコントロールは、ヒトＦａｓ、ＴＮＦ、およびＮＧＦ受容体ＤＤのマウスｌｐｒ突然変異の同等物（WatanabeFukunagaら、1992 ）である。他の不活性突然変異は、文献中の記述に従ってＤＤ中に導入することができる（Tartaglia、1993）。突然変異ＤＤへのＧＳＴの融合は、ペプチドＤＤ相互作用の特異性を検査する試験におけるネガティブコントロールとして有用である（すなわち、ペプチドリガンドは不活性化ＤＤと、ほとんど結合せず、あるいは全く結合しない）。突然変異は、クローニングのためのＤＤの構築中に一対のオリゴヌクレオチドを除去することによって操作される。２．ＧＳＴ細胞死ドメイン融合タンパクに結合するファージ置換ランダムペプチドライブラリからのペプチド配列同定仮説実施例１中のＵＬ４４のために述べた方法と類似の方法で、ファージ置換ランダムペプチドライブラリをＧＳＴＤＤ融合プロテインを用いてアフィニティ選択によってスクリーニングした。ライブラリを標準的な技術に従ってスクリーニングする（Kayら、1993；AdeyおよびKay、1996）。手短には、数マイクログラムのＧＳＴＤＤ融合タンパクをＥＬＩＳＡ方式マイクロタイタープレート中に固定する。過剰のタンパク（すなわち、ＢＳＡ、ピアスケミカルスーパーブロック）を用いて非特異的タンパク結合を阻害した後、約１０１１ファージをそれぞれのくぼみに加える。４℃で数時間インキュベーションした後、タンパクファージ複合体を変性する２００ｍＭのグリシン（ｐＨ２）とともに液体をくぼみから捨てる。ｐＨを中性にした後、バクテリアを遊離したファージによって感染し、一晩培養した。感染細胞は〜１０００／分／バクテリアのファージを放出し、このため最終培地の滴定量はｍｌあたり１０１２のプラーク形成である。これがスクリーニングの一ラウンドを形成する。このプロセスを連続して三回繰り返し、生成したファージを隔離集団として成長させる。ＤＤのアミノ酸配列同一性が３１％未満なので、ペプチドリガンドの各ＤＤ選択は変化することが予想される。最適なＤＤペプチドリガンドの描写は可能性のある細胞リガンドのコンピューター探索に有用である（http://exp asy.hcuge.ch/sprot/scnpsit2.html）。加えて、モティーフの同定に成功すれば、ＳＨ３（Sparksら、1996ａ）およびＷＷ（未公開）ペプチドリガンドについてしたように付加的な偏ったペプチドライブラリを作り、これは将来的に他のＤＤのペプチドリガンド特異性の定義を促進する。モティーフについての結論は合成ペプチドによって確認される。ビオチン付与のペプチドを合成し、次に酵素結合検定法（Sparksら、1994）およびドットブロット法によって結合比を追跡する。実際のＫｄ測定は、蛍光分極によって非ビオチン化ペプチドのために決定される;ＤＤセグメントはトロンビン切断によってＧＳＴＤＤ融合タンパクから分離され、そしてそのＮ末端にて蛍光される。選択的に、もしペプチドリガンドがトリプトファンを欠いている場合、代わりに、ペプチドＤＤ複合体形成の最中にトリプトファンを持つＤＤの蛍光性質がモニターされる。加えて、解離定数はＢＩＡコアシステムについて計量される。Karlsson、 Anal.Biochem.、228:274280(1995)およびReghavan、Structure、3:331-3(1995) 参照。他の標的分子についての実験に基づき、ファージディスプレーされたライブラリからのペプチドは１０μＭから１０ｎＭ解離定数を持つと予測される。もしペプチドリガンドの各残基の重要性を決定し、そしてそれによって課題の標的のためのより効果的なライブラリ設計を促進することが望まれるならば、一組のアラニン走査変異体を調製し、その親和性を測定する。同様に合成ペプチドが競合試験に使用される。可溶性ペプチドを種々のＧＳＴＤＤ融合タンパクで培養した放射性（３５Ｓメチオン標識）細胞ライセートに添加する。類似の実験が行われて、ＳｒｃＳＨ３ペプチドリガンドを用いて自然のリガンドと同じように結合することを示した（Sparksら、1994）。もしペプチドがＤＤに結合すると、グルタチオンアガロースからクロマトグラフィーによって回収し、ＳＤＳＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフするとき、細胞のタンパクがＧＳＴＤＤ融合タンパクに結合することはほとんどあるいは全くない。もし、自然のリガンドに比して低親和性のために、ペプチドが相互作用をブロックし損なうとすると、多価フォーマット中で再試験する。ビオチン標識化ペプチドリガンドをストレプトアビジンと合成して、親和活性によってＤＤへのペプチドの親和性を高める。ＳＨ３領域へのペプチドリガンドを用いる実験中、ファージ置換ランダムペプチドライブラリから分離して、４へペプチドの結合価を上げることは見かけの親和力を上げる効果的な手段である。３．ＣＯＬＴによってヒトλｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングして、新規の細胞死ドメイン含有タンパクを同定する薬が導くことの評価において関係がある一つは交差反応性である。薬が、望んでいない標的と相互作用するために好ましくない副作用を生じるということである。ＤＤがいくらかの同一性を共有すると仮定すれば、もっとも起こりうるＤＤ特異的化合物の交差反応標的は、他のタンパク含有ＤＤである。現在、９のＤＤ含有プロテインのみが知られている。他のＤＤ含有プロテインをＣＯＬＴ技術によって同定することができる（Sparks ら、1996b）。ＣＯＬＴは２０以上のタンパク含有ＳＨ３ドメインを分離するために使用されており、その半分は新規である。公開されていない研究において、我々はＣＯＬＴを用いてＷＷドメイン含有プロテインと同様にカルモジュリンファミリーのメンバーを同定した。ＷＷドメインは３８アミノ酸の新しく記述されたタンパクモティーフであり、二つの保存されたトリプトファン残基によって特徴付けられ（Sudolら、1995）、プロリンリッチに結合する（ChenおよびSudol、 1995）。ＣＯＬＴは、ヒトあるいは他のゲノム中の他のタンパク含有ＤＤドメインを同定する好ましい方法である。ＤＤリガンドに一致するペプチドはビオチンを用いて合成され、ストレプトアビジン結合アルカリリン酸塩を合成し、λヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするのに用いられる。たとえばＴ細胞（Ju rkit）およびＨｅＬａｃＤＮＡライブラリである。ＤＤ含有タンパクを発現しているラムダプラークは、ペプチド複合体およびＮＢＴおよびＢＣＩＰにさらした時に青のプラークをニトロセルロースフィルター上に形成する。このようなプラークのｃＤＮＡ挿入断片は救出され（Shortら、1988）、このヌクレオチド配列はジデオキシ配列決定によって決定することができる。以下に記載するパラダイムに従ってタンパク含有ＤＤをヒトゲノムから系統的にクローニングすることを提案する。ＧＳＴＤＤ融合タンパクとして発現された所定のＤＤのためのペプチドリガンドを同定する。ペプチドのビオチン標識化形をＣＯＬＴにおいて使用して、タンパク含有ＤＤをコードするｃＤＮＡクローンを分離する。そして、その最適なペプチドリガンドを同定するために、ＧＳＴ融合タンパクとして新規ＤＤをサブクローニングおよび発現する。これらのリガンドは他の新規なタンパク含有ＤＤをクローンするために順々に使用される。この反復的な方法では、多くのＤＤをゲノムから同定することができる。このような収集は、薬の発見（以下を参照）と同様に細胞死経路の他の可能性のある成分を同定する目的のために重要である。最近、ＴＮＦ、ＮＧＦおよびＦａｓ受容体ＤＤドメインの機能を妨害する薬物リードの産生について焦点を合わせている。高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）を、ベンゾジアゼビン、ペプチド、および他の小さな化学物質の組み合わせのライブラリをスクリーニングするために使用する。このようなスクリーニングは、上述したように同定されたペプチドリガンドを酵素アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と融合し、次にペプチドリガンドＡＰ融合がマイクロタイタープレートのくぼみに固定化されるＧＳＴＤＤタンパクと結合することを阻害する物質を探すことに基づいている。他のスクリーニングは、ＤＤを直接ＡＰに融合して、付与される化合物の組み合わせを持つビードを染色する。一の特定のタンパク含有ＤＤに特異的な薬を産生するために、関係のないＤＤに対する薬物リードの交差反応性を試験することが重要である。もし交差反応性の試験が薬の発見において早期に実施することができると、意図しない細胞タンパク含有ＤＤとの反応による最終生成物が持つ毒性を、より少なくする可能性がある。細胞死システムモデル中で、可能性のある薬はどれでも試験される。アポトーシス経路中に含まれるタンパクの相互作用を阻害することによって働く薬物リードの発見は、多数のヒトの病気の治療に有用であることがわかる。実施例１１：エストロゲン受容体に対する代用リガンドの単離核受容体はホルモンリガンドに結合する蛋白質でありＤＮＡへの結合をおこさせ、一部の遺伝子の発現を活性化する。核受容体の例にはエストルゲン受容体、レチノイン酸受容体とグルココルチコイド受容体がある。これらの蛋白質は細胞増殖のコントロールへの影響により薬理学的興味から重要である。例えば、その継続的な増殖がエストロゲンの存在によっている腫瘍がある。その機能により、核受容体は少なくとも２つの生物学的に関連する部位を持っている：ホルモン結合ポケットとＤＮＡ結合部位である。加えて、多くの受容体は第三の蛋白質―蛋白質相互作用部位を提供するホモーとヘテロ二量体を形成する。各々の場合、結合部位は非常に特異的である。：ホルモン結合ポケットは特有なホルモンとのみ結合し、ＤＮＡ結合部位は特異的な配列因子と相互作用し、ある蛋白質のみ相互作用し二量体を形成する。この例では代用リガンドはこれらのドメインのそれぞれについて単離され、結果として得られる代用リガンドは受容体活性の小分子アゴニスト／アンタゴニストを発見するための探索に使われる。方法エストロゲン受容体はパンベラコーポレーションより購入し、イムロン４プレート（ティナテック）に直接固定化した。受容体に結合するファージのアフィニティ選別はＴｙｒＲＳを用いた例に記述したように行った。多くのライブラリーはプールファージエライザを用いて増殖を示した。興味深いことに、Ｘ５ＬＸ５ライブラリーはエストラジオールとの競合に感受性が高かった。それぞれのクローンは各々の増加されたライブラリーからエストラジオールとの競合に対する感受性だけでなくエストロゲン受容体に対する特異的結合も試験された。多くの特異的な結合ファージは単離され、これらの一部の結合はエストラジオールに感受性が高かった。この例はエストロゲン受容体に特異的なファージを単離できることとこれらのいくつかはエストラジオール結合ポケットに結合し、一方、他は標的の別な部位に結合していることを示している。これらの１つはＤＮＡ結合ポケットであり、もう１つは蛋白質の二量化部位である。エストロゲン受容体の多様な独立した部位に結合するペプチドの配列を得るためにこれらのファージを用いることば可能である。これらのペプチドは合成され、前の例で記述したように受容体活性に対する小分子アゴニスト／アンタゴニストを見出すための探索に使用される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月２９日（１９９８．５．２９）【補正内容】請求の範囲１．（ａ）標的タンパク質に結合するための複数の最初のメンバーリガンドからなる最初の組み合わせライブラリーをスクリーニングし、これによって１またはそれ以上の標的結合リガンドを同定し、（ｂ）標的タンパク質に１またはそれ以上の標的結合リガンドを結合することを阻害する能力に対し複数の二番目のメンバーリガンドからなる二番目のライブラリーをスクリーニングし、これによって１またはそれ以上の阻害リガンドを得て、そして（ｃ）最初の組み合わせライブラリーがペプチドからなるとき、ペプチドが抗体様ドメインからならないことを条件として、どの阻害リガンドが標的タンパク質の生物活性を仲介するかを決定する、各工程からなる結合パートナーへの標的タンパク質の結合の阻害によって標的タンパク質の生物活性を仲介できるリガンドを同定する方法。２．最初の組み合わせライブラリーがペプチドおよび／またはペプトイドからなる請求項１記載の方法。３．最初の組み合わせライブラリーが核酸からなる請求項１記載の方法。４．最初の組み合わせライブラリーがペプチド、ペプトイドおよび／または核酸からなり、二番目のライブラリーがない請求項１記載の方法。５．最初の組み合わせライブラリーが二番目のライブラリーよりも大きい多様性をもつ請求項１記載の方法。６．二番目のライブラリーが組み合わせライブラリーである請求項１記載の方法。７．工程（ａ）で得られた標的結合リガンドを、その生物活性を仲介するように標的タンパク質と相互作用する能力に対し適当な生物学系で試験し、有効なリガンドのみをスクリーニングエ程（ｂ）で用いる請求項１記載の方法。８．工程（ｂ）で得られた阻害リガンドに試験をして、それらの阻害作用が標的タンパク質を結合するかまたは標的結合リガンドを結合することにあるかどうかを決定する請求項１記載の方法。９．最初のライブラリーがペプチドライブラリーであり、二番目のライブラリーがベンゾジアゼピンライブラリーである請求項１記載の方法。１０．最初のライブラリーが偏向ペプチドライブラリー、または、２またはそれ以上の異なる偏向ペプチドライブラリーの組み合わせであるが、非偏向ペプチドライブラリーではない請求項１記載の方法。１１．標的タンパク質がヒトサイトメガロウィルスと結合したものである請求項１記載の方法。１２．標的タンパク質がDNAポリメラーゼ補助タンパク質UL44である請求項１記載の方法。１３．標的タンパク質が酵素である請求項１記載の方法。１４．標的タンパク質がタンパク質キナーゼである請求項１３記載の方法。１５．標的タンパク質が転移RNA合成酵素である請求項１３記載の方法。１６．標的タンパク質がベーターグルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼである請求項１３記載の方法。１７．標的タンパク質が貫膜受容体である請求項１記載の方法。１８．標的タンパク質が核受容体である請求項１記載の方法。１９．標的タンパク質がエストロゲン受容体である請求項１８記載の方法。２０．標的タンパク質の生物活性の仲介のための組成物の製造において、阻害リガンドが標的タンパク質の生物活性を仲介することが先に知られていないとの条件で、請求項１−１９のいずれか１項記載の方法によって同定した阻害リガンドの使用方法。２１．各ライブラリーが１または２個の一定の残基を有し、各成分ライブラリーにおいて、ペプチドの中央50％内の最初の固定位置にて、最初の位置に割り当てたアミノ酸か、前記成分ライブラリー内で一定であり、パネルの全ライブラリーでは同じではなく、そのようなライブラリー対ライブラリー変化の結果として、予定した長さのすべての可能な造伝学的に符号化したペプチドを前記パネルが集合的に示す、偏向した組み合わせペプチドライブラリーの構造パネル。２２．前記ペプチドが（Ｘ_aa）_m−R1−（Ｘ_aa）_n 式中、Ｒ１は最初の固定位置でのアミノ酸であり、ｍとｎは２以上によって違わない形のものである請求項２１記載のパネル。２３．前記構造のパネルか、各ライブラリーでは、二番目の位置か一定に保持されるが、この二番目の位置が最初の位置を除き全残基の位置を走査するように、二番目の位置の位置選定が変えられ、これによってパネルがサブパネルからなり、前記最初と二番目の位置が固定され、各サブパネルでは、前記二番目位置に割り当てたアミノ酸が前記成分ライブラリー内で一定であるが、前記サブパネル内でライブラリーからライブラリーに変わる、請求項２１記載のパネル。２４．（X_aa）_m−Cys （式中、ｍは５よりも大きいかまたは等しい）の形の偏向組み合わせペプチドライブラリー。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月３日（１９９８．１２．３）【補正内容】請求の範囲２５．最初の組み合わせライブラリーのリガンドがクロマトグラフィー支持体、細胞、またはウイルスで表示される請求項１−１９のいずれか１項記載の方法。２６．ペプチドがクロマトグラフィー支持体、細胞、またはウイルスで表示される請求項２１記載の方法。２７．工程（ａ）において、標的を結合するリガンドを分離し、または標的を結合しないリガンドから識別する請求項１−１９のいずれか１項記載の方法。２８．（ａ）標的タンパク質に結合するための複数の最初のメンバーリガンドからなる最初の組み合わせライブラリーをスクリーニングし、これによって１またはそれ以上の標的結合リガンドを同定し、（ｂ）標的タンパク質に１またはそれ以上の標的結合リガンドを結合することを阻害する能力に対し複数の二番目のメンバーリガンドからなる二番目のライブラリーをスクリーニングし、これによって１またはそれ以上の阻害リガンドを得て、そして（ｃ）リガンドがペプチドであるとき、その長さが４１個よりも大きくない標的タンパク質の生物活性をどの阻害リガンドが仲介するかを決定する、各工程からなる、結合パートナーへの標的タンパク質の結合を阻害して標的タンパク質の生物活性を仲介できるリガンドを同定する方法。２９．リガンドが（Ｘ_aa）_m−R1−（Ｘ_aa）_n 式中、Ｒ１は最初の固定位置でのアミノ酸であり、ｍとｎは独立して２から２０までの範囲である形のペプチドである請求項２１記載のパネル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ケイ，ブライアン，ケイ. アメリカ合衆国ノースカロライナ州 27514，チャペルヒル，ウイステリアウェイ 18 (72)発明者フレリンガー，ジェフリイ，エイ. アメリカ合衆国ノースカロライナ州 27516，チャペルヒル，モンテレイバレイロード 1111 (72)発明者ハイド―デルイシャア，ロビン，パリシュアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27516，チャペルヒル，ポートスミスプレイス 205

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）標的結合リガンドに結合するための複数の最初のメンバーリガンドからなる最初の組み合わせライブラリーをスクリーニングし、これによって１またはそれ以上の標的結合リガンドを同定し、（ｂ）標的タンパク質に１またはそれ以上の標的結合リガンドを結合することを阻害する能力に対し複数の二番目のメンバーリガンドからなる二番目のライブラリーをスクリーニングし、これによって１またはそれ以上の阻害リガンドを得て、そして（ｃ）どの阻害リガンドが標的タンパク質の生物活性を仲介するかを決定する、各工程からなる結合パートナーへの標的タンパク質の結合の阻害によって標的タンパク質の生物活性を仲介できるリガンドを同定する方法。２．最初の組み合わせライブラリーがペプチドおよび／またはペプトイドからなる請求項１記載の方法。３．最初の組み合わせライブラリーが核酸からなる請求項１記載の方法。４．最初の組み合わせライブラリーがペプチド、ペプトイドおよび／または核酸からなり、二番目のライブラリーがない請求項１記載の方法。５．最初の組み合わせライブラリーが二番目のライブラリーよりも大きい多様性をもつ請求項１記載の方法。６．二番目のライブラリーが組み合わせライブラリーである請求項１記載の方法。７．工程（ａ）で得られた標的結合リガンドを、その生物活性を仲介するように標的タンパク質と相互作用する能力に対し適当な生物学系で試験し、有効なリガンドのみをスクリーニング工程（ｂ）で用いる請求項１記載の方法。８．工程（ｂ）で得られた阻害リガンドに試験をして、それらの阻害作用が標的タンパク質を結合するかまたは標的結合リガンドを結合することにあるかどうかを決定する請求項１記載の方法。９．最初のライブラリーがペプチドライブラリーであり、二番目のライブラリーがベンゾジアゼピンライブラリーである請求項１記載の方法。１０．最初のライブラリーが偏向ペプチドライブラリー、または、２またはそれ以上の異なる偏向ペプチドライブラリーの組み合わせであるが、非偏向ペプチドライブラリーではない請求項１記載の方法。１１．標的タンパク質がヒトサイトメガロウィルスと結合したものである請求項１記載の方法。１２．標的タンパク質がDNAポリメラーゼ補助タンパク質UL44である請求項１記載の方法。１３．標的タンパク質が酵素である請求項１記載の方法。１４．標的タンパク質がタンパク質キナーゼである請求項１３記載の方法。１５．標的タンパク質が転移RNA合成酵素である請求項１３記載の方法。１６．標的タンパク質がベーターグルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼである請求項１３記載の方法。１７．標的タンパク質が貫膜受容体である請求項１記載の方法。１８．標的タンパク質が核受容体である請求項１記載の方法。１９．標的タンパク質が核受容体である請求項１８記載の方法。２０．標的タンパク質の生物活性の仲介のための組成物の製造において、阻害リガンドが標的タンパク質の生物活性を仲介することが先に知られていないとの条件で、請求項１−１９のいずれか１項記載の方法によって同定した阻害リガンドの使用方法。２１．各ライブラリーが１または２個の一定の残基を有し、各成分ライブラリーにおいて、ペプチドの中央50％内の最初の固定位置にて、最初の位置に割り当てたアミノ酸が、前記成分ライブラリー内で一定であり、パネルの全ライブラリーでは同じではなく、そのようなライブラリー対ライブラリー変化の結果として、予定した長さのすべての可能な遺伝学的に符号化したペプチドを前記パネルが集合的に示す、偏向した組み合わせペプチドライブラリーの構造パネル。２２．前記ペプチドが（Ｘ_aa）_m−R1−（Ｘ_aa）_n 式中、Ｒ１は最初の固定位置でのアミノ酸であり、ｍとｎは２以上によって違わない形のものである請求項２１記載のパネル。２３．前記構造のパネルが、各ライブラリーでは、二番目の位置が一定に保持されるが、この二番目の位置が最初の位置を除き全残基の位置を走査するように、二番目の位置の位置選定が変えられ、これによってパネルがサブパネルからなり、前記最初と二番目の位置が固定され、各サブパネルでは、前記二番目位置に割り当てたアミノ酸が前記成分ライブラリー内で一定であるが、前記サブパネル内でライブラリーからライブラリーに変わる、請求項２１記載のパネル。２４．（Xaa）_m−Cys （式中、ｍは５よりも大きいかまたは等しい）の形の偏向組み合わせペプチドライブラリー。