JP2002533726A - 結合のための小有機分子リガンドの同定 - Google Patents

結合のための小有機分子リガンドの同定

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JP2002533726A JP2000591433A JP2000591433A JP2002533726A JP 2002533726 A JP2002533726 A JP 2002533726A JP 2000591433 A JP2000591433 A JP 2000591433A JP 2000591433 A JP2000591433 A JP 2000591433A JP 2002533726 A JP2002533726 A JP 2002533726A
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ジム ウェルス
マーカス バリンガー
ブライアン シー クニンガム
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サネシス ファーマシューティカルス インコーポレイテッド
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Abstract

(57)【要約】 本発明は生物学的標的分子に結合するための小有機分子リガンドを迅速かつ正確に同定するための新規方法に関するものであり、これらの方法は結合活性の原理を利用する。本発明の方法に従って同定された小有機分子リガンドは、例えば、新規治療薬リード化合物、酵素インヒビター、標識化合物、診断試薬、タンパク質精製用のアフィニティー試薬等としての用途があり得る。生物学的標的分子として、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、核タンパク質、糖タンパク質、糖脂質及びリポタンパク質が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は新規な結合活性に基づく方法及び生物学的標的分子に結合する小有機
分子リガンドを迅速かつ正確に同定するための組成物に関する。本発明の方法に
従って同定された小有機分子リガンドは、例えば、新規治療薬リード化合物、酵
素インヒビター、標識化合物、診断試薬、タンパク質精製用のアフィニティー試
薬等としての用途がある。
【０００２】 （背景技術） 新規な生物学的エフェクター分子を生成する初期の主たる仕事は所定の生物学
的標的分子について一種以上のしっかりと結合するリガンドを同定し、特性決定
することである。これに関して、多くの分子技術が開発され、生物分子標的、例
えば、タンパク質、核酸、炭水化物、核タンパク質、糖タンパク質、糖脂質及び
リポタンパク質の特定の部位に結合する新規リガンドを同定するのに現在使用さ
れている。これらの技術の多くは機能性リガンドの同定をスピードアップするよ
うに努めて潜在的な結合化合物のコンビナトリアルライブラリーを使用すること
により分子多様性の固有の利点を利用する。例えば、高処理量スクリーニングア
ッセイと組み合わされた多様性化合物のオリゴマーライブラリー及び非オリゴマ
ーライブラリーの両方のコンビナトリアル合成が選択された分子標的への結合の
ための新規リード化合物の同定に有益なフォーマットを既に与えていた。
【０００３】 生物学的エフェクター分子を同定するためのコンビナトリアルアプローチは或
る適用に有益と判明していたが、これらのアプローチはまた幾つかの重大な欠点
を有する。例えば、しばしば、ライブラリー員が標的にほんの弱く結合し得る場
合、関係する標的分子へのライブラリー員の結合を検出することを可能にする適
当なスクリーニングアッセイが存在しない。更に、たとえ、これらのスクリーニ
ングアッセイが利用できる場合でさえも、多くの場合に、標的に最も有効に結合
する一種以上の実際のライブラリー員の迅速な同定を可能にする技術が利用でき
ず、又は確かではない結果を与え、機能性リガンド分子の実際の同定及び特性決
定を困難にし、時間を浪費し、又は不可能にする。更に、新規リガンドを同定す
るのに現在使用される多くのアプローチは単一の特定の化学反応型のみに依存し
、それによりこのようなアプローチの有用性をごく狭い範囲の適用に制限する。
最後に、現在使用されるアプローチの多くが高価であり、しかも時間を極めて浪
費する。こうして、選択された生物分子標的について小有機分子リガンドの迅速
、有効かつ正確な同定を可能にする新規な方法を開発するのに重大な関心がある
。
【０００４】 たいていの場合、標的生物分子に対するスクリーニング方法に用途があるコン
ビナトリアルライブラリーは殆どの小有機化合物よりも大きい分子を含む。標的
生物分子へのこのような“大きい”分子の結合についてアッセイするための技術
が当業界で知られており、標的に結合する一種以上の特定のライブラリー員を同
定するのにしばしば使用し得る。しかしながら、比較的小さい有機分子のライブ
ラリーが生物学的標的分子に対してスクリーニングされる場合、標的へのライブ
ラリー員の結合は検出するのがしばしば困難である。何とならば、“最良の”小
分子でさえもがほんの弱く結合し得るからである。更に、たとえ、標的へのライ
ブラリー員の結合を検出することができるとしても、結合された化合物の実際の
同定はデコンボルーション(deconvolution)の方法が利用できない限り不可能で
あるかもしれない。このようなものとして、本発明者らは生物学的標的への結合
について比較的小さい有機分子のライブラリーをスクリーニングする能力を有意
に増進する結合活性の原理に基づく新規方法をここに提案する。
【０００５】 互いに結合することができる二つの分子間の相互作用はこれらの分子が結合又
は相互作用する強さ、即ち、分子が互いについて有する“アフィニティー”に関
してしばしば特性決定される。一般に、一方の分子が他方の分子について有する
アフィニティーは、結合分子の夫々が単一の特定の部位のみを介して相互作用し
得ると推定して分子間の結合の強さの目安である。しかしながら、実際には、結
合分子は別の分子との相互作用が生じ得る多くの部位をしばしば有する。このよ
うな状況では、いずれか一つの結合部位におけるアフィニティーが変化されない
かもしれないが、結合の総合の強さは結合パートナーの一方又は両方における利
用できる部位の全てにおける結合を考慮する必要がある。結合のこの総合の強さ
が“結合活性”として知られており、あらゆる所定の結合部位で強い見掛アフィ
ニティーとして現れるであろう。数学的に、結合活性の強さは結合分子の夫々の
占有部位について増大する。それ故、結合活性の現象は生物学的標的分子への結
合について小有機分子のライブラリーをスクリーニングする能力を増進するだけ
でなく、標的に実際に結合する有機分子を同定するような方法に利用し得る。 それ故、本発明の目的は結合活性現象を利用し、生物学的標的分子に結合する
ことができる有機化合物の迅速かつ正確な同定を可能にする新規な方法及び組成
物を提供することである。このような方法が本明細書に記載され、その他の現在
使用される方法と較べて迅速であり、実施するのが容易であり、かつ比較的安価
である。
【０００６】 （発明の開示） 本件出願人は生物学的標的分子の特定の部位と相互作用することができ、それ
らに結合することができる小有機分子リガンドを迅速かつ有効に同定するための
結合活性に基づく分子アプローチを本明細書に記載し、生物学的標的に結合する
ことができると主題方法により同定された有機化合物は、例えば、新規な小分子
薬物リード、酵素インヒビター、標識化合物、診断試薬、タンパク質精製用のア
フィニティー試薬等として用途があり得る。本明細書に記載されたアプローチは
小有機化合物のライブラリーを迅速にスクリーニングして生物分子標的の関係す
る部位に結合することができるものを正確に同定することを可能にする。本明細
書に記載された方法により同定された小有機分子リガンドはそれら自体多くの適
用に使用されてもよく、又は一種以上のリンカー要素を使用して種々の異なる組
み合わせで一緒にカップリングされて新規な結合分子を与え得る。
【０００７】 特に上記に関して、本発明の一実施態様は生物学的標的分子の関係する部位に
結合する有機分子リガンドの同定方法に関するものであり、その方法は (a)有機分子リガンドが潜在的に結合し得る関係する部位を含む生物学的標的
分子を同定又は選択する工程、 (b)生物学的標的分子の多量体形態を得る工程（その多量体形態は少なくとも
二つの結合された生物学的標的分子及び複数の関係する部位を含む）、 (c)多量体形態を関係する部位に潜在的に結合することができる有機化合物の
ライブラリーの少なくとも第一員及び第二員と接触又は合わせる工程（前記ライ
ブラリーの第一員の少なくとも二つが多量体形態の関係する部位に結合する）、
及び (d)関係する部位に結合した有機化合物のライブラリーの第一員を同定する工
程を含む。
【０００８】 上記から明らかであるように、記載された方法の実施態様は有機分子ライブラ
リーの員に結合することができる複数又は少なくとも二つの関係する部位を含む
生物学的標的分子の多量体形態を使用するので、多量体形態が小有機化合物のラ
イブラリーの員に結合する強さは公知の結合活性原理のために大いに増進され、
それにより結合が生じたことを検出し、ライブラリーの５つのいずれの員が標的
分子に結合することができるのかを測定する能力を増進する。換言すれば、生物
学的標的分子の多量体形態の多くの利用できる結合部位（即ち、複数の関係する
部位）のために、標的の多量体形態とそれに結合する有機化合物の間の結合の総
合の強さが“単一部位”結合（即ち、アフィニティー）と較べて大いに増進され
るであろう（即ち、結合活性）。
【０００９】 或る特別な実施態様において、生物学的標的分子はポリペプチド、核酸、炭水
化物、核タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、又はリポタンパク質、好ましくはポ
リペプチドであり、これらは、例えば、酵素、ホルモン、転写因子、受容体、受
容体のリガンド、成長因子、免疫グロブリン、ステロイド受容体、核タンパク質
、シグナル伝達成分、アロステリック酵素調節物質等であってもよい。生物学的
標的分子の多量体形態は共有結合又は非共有結合された生物学的標的分子を含み
、例えば、２種以上の既存の生物学的標的分子を化学結合することにより、また
生物学的標的分子の多量体形態を直接合成することにより、又はポリペプチドの
場合には、ポリペプチド標的分子の多量体形態を組換え発現することにより、種
々の方法で得られてもよい。
【００１０】 本明細書に記載された方法の別の実施態様はアルデヒド、ケトン、オキシム、
ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミ
ン、N-置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエ
ーテル、チオエステル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、
カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセ
タール、アリールハライド、アリールスルホネート、アルキルハライド、アルキ
ルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン
、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン
、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシア
ネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物及び／又は酸クロリド、好ましくは
アルデヒド、ケトン、一級アミン、二級アミン、アルコール、チオエステル、ジ
スルフィド、カルボン酸、アセタール、アニリン、ジオール、アミノアルコール
及び／又はエポキシド、最も好ましくはアルデヒド、ケトン、一級アミン、二級
アミン及び／又はジスルフィドを含む有機化合物のライブラリーを使用する。
【００１１】 上記方法に関して、少なくとも(a)生物学的標的分子の多量体形態又は(b)少な
くとも第一及び第二の有機化合物ライブラリー員は必要により多量体形態をライ
ブラリー員と合わせてそれらの間の結合を評価する前に固体マトリックス物質に
共有結合されてもよい。 本発明の別の実施態様は生物学的標的分子の関係する部位に結合する有機分子
リガンドの同定方法に関するものであり、その方法は (a)有機分子リガンドが潜在的に結合し得る関係する部位を含む生物学的標的
分子を同定又は選択し、 (b)生物学的標的分子を関係する部位に潜在的に結合することができる多価有
機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及び第二員と合わせ（生物学的標的
分子の少なくとも二つの関係する部位が多価有機化合物のライブラリーの第一員
に結合する）、そして (c)生物学的標的分子に結合した多価有機化合物のライブラリーの第一員を同
定することを特徴とする。
【００１２】 生物学的標的分子の多量体形態を使用する上記実施態様と同様に、“多価”で
ある員（即ち、一緒に共有結合又は非共有結合された二つ以上の小有機分子を有
する員）を含む有機化合物ライブラリーが構築されてもよいので、有機化合物30
ライブラリーの員はまた生物学的標的分子の関係する部位に結合するのに利用で
きる複数の部位を有してもよい。それ故、有機化合物ライブラリーの員が生物学
的標的分子に結合する強さは公知の結合活性原理のために大いに増進され、それ
により結合の存在を検出し、ライブラリーのいずれの員が標的分子に結合するこ
とができるのかを測定する能力を増進する。換言すれば、有機化合物ライブラリ
ー員に存在する多くの利用できる結合部位のために、生物学的標的とそれに結合
する有機化合物の間の結合の総合の強さが“単一部位”結合（即ち、アフィニテ
ィー）と較べて大いに増進されるであろう（即ち、結合活性）。
【００１３】 本発明の別の実施態様は生物学的標的分子の関係する部位に結合する有機分子
リガンドの同定方法に関するものであり、その方法は (a)有機分子リガンドが潜在的に結合し得る関係する部位を含む生物学的標的
分子を選択し、 (b)(i)少なくとも二つの結合された生物学的標的分子及び少なくとも二つの関
係する部位を含む生物学的標的分子の多量体形態を(ii)関係する部位に潜在的に
結合することができる多価有機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及び第
二員と接触させ（多量体形態が多価有機化合物のライブラリーの第一員に結合す
る）、そして (c)多量体形態に結合した多価有機化合物のライブラリーの第一員を同定する
ことを特徴とする。 本発明のその他の実施態様は有機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及
び第二員を共有結合させた物質を含む固体マトリックス物質に関する。このよう
な物質は、中でも、現在記載された方法に用途があり得る。 本発明の付加的な実施態様は本明細書に鑑みて当業者に明らかになるであろう
。
【００１４】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は関係する生物学的標的分子の選択された部位に結合することができる
小有機分子リガンドを同定するための迅速かつ有効な方法を提供する。主題方法
により同定された有機分子リガンドそれ自体は、例えば、新規な治療薬、酵素イ
ンヒビター、標識化合物、診断試薬、タンパク質精製用のアフィニティー試薬等
の開発のためのリード化合物として用途があり、又は二つ以上の同定された有機
分子リガンドがルーチン技術及び公知の技術を使用して一種以上のリンカー要素
を介して一緒にカップリングされて新規な生物分子結合コンジュゲート分子を与
え得る。 主題発明の一実施態様は生物学的標的分子の関係する部位に結合する有機分子
リガンドの同定方法に関する。本明細書に記載された方法における初期工程とし
て、生物学的標的分子がその方法中にスクリーニングされた小有機分子化合物へ
の結合について標的として同定され、又は得られる。本発明に用途がある生物学
的標的分子として、小有機分子が結合し得るあらゆる生物学的分子が挙げられ、
好ましくは、例えば、ポリペプチド、核酸（DNA及びRNAの両方を含む）、炭水化
物、核タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質等が挙げられる。こ
こに用途がある生物学的標的分子は商用、合成、組換え、生物学的標的分子の天
然源からの精製等を含むが、これらに限定されない種々の方法で得られてもよい
。
【００１５】 特に好ましい実施態様において、生物学的標的分子はポリペプチドである。有
機分子リガンドに結合するための標的としてここに用途があるポリペプチドとし
て、実際に、二つ以上のアミノ酸を含み、小有機分子に潜在的に結合することが
できる関係する部位を有し、又はその部位を有するように修飾し得るあらゆるペ
プチド又はタンパク質が挙げられる。ここに用途がある関係するポリペプチドは
商用、化学、組換え、合成、天然源からの精製、又はそれ以外に得られてもよく
、たいていの場合、タンパク質、特に特定のヒト症状と関連するタンパク質、例
えば、細胞表面タンパク質及び可溶性受容体タンパク質、例えば、リンパ球細胞
表面受容体、酵素、例えば、プロテアーゼ及びチミジレートシンセターゼ、ステ
ロイド受容体、核タンパク質、アロステリック酵素インヒビター、凝固因子、セ
リン／スレオニンキナーゼ及びデホスホリラーゼ、スレオニンキナーゼ及びデホ
スホリラーゼ、細菌酵素、菌類酵素及びウイルス酵素、シグナル伝達分子、転写
因子、DNA及び／又はRNAの合成又は分解と関連するタンパク質、免疫グロブリン
、ホルモン、例えば、エリスロポイチン/EPO、顆粒球コロニー刺激受容体、顆粒
球マクロファージコロニー刺激受容体、トロンボポイエチン(TPO)、IL-2、IL-3
、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12を含む種々のサイトカインの受容体
、成長ホルモン、プロラクチン、ヒト胎盤ラクトーゲン(LPL)、CNTF、オクトス
タチン、種々のケモキン及びそれらの受容体、例えば、RANTES、MIP1-α、IL-8
、種々のリガンド及びチロシンキナーゼの受容体、例えば、インスリン、インス
リン様成長因子１(IGF-1)、上皮成長因子(EGF)、ヘレグリン-α、及びヘレグリ
ン-β、血管内皮成長因子(VEGF)、胎盤成長因子(PLGF)、組織成長因子（TGF-α
及びTGF-β）、その他のホルモン及び受容体、例えば、骨形態発生因子、卵胞刺
激ホルモン(FSH)、及び黄体形成ホルモン(LH)、組織壊死因子(TNF)、アポトーシ
ス因子-1及び-2(AP-1及びAP-2)、mdm2、これらに対し20％以上の配列同一性を共
有するタンパク質及び受容体等である。
【００１６】 生物学的標的分子の“関係する部位”は、小有機分子が結合することが所望さ
れる標的分子のあらゆる部位であってもよい。関係する部位は標的に自然に存在
してもよく、又は当業界でルーチンで使用され、公知である技術を使用して標的
に人工的に導入されてもよい。好ましい実施態様において、関係する部位は酵素
タンパク質の活性部位又は別の生物学的標的分子に結合する標的の結合部位であ
る。 本発明の一つの特別な実施態様において、関係する部位を含む生物学的標的分
子が一旦同定されると、その生物学的標的分子の多量体形態がその後に得られる
。“多量体形態”は特別の生物学的標的分子の少なくとも二つが共有結合又は非
共有結合、好ましくは共有結合され、その結果、得られる“多量体”構造が生物
学的標的分子の多くの複製及び複数又は少なくとも二つの関係する部位を含むこ
とを意味する。標的分子の多量体形態は、例えば、幾つかの既知の化学架橋剤、
ビオチン／ストレプトアビジン、免疫グロブリン媒介結合等のいずれかを使用す
る二つ以上の生物学的標的分子の化学架橋、生物学的標的分子の多量体形態の人
工合成又はポリペプチド標的の場合には標的ポリペプチドの多量体形態の組換え
発現を含む幾つかの方法で調製され、又は得られてもよい。多量体形態はまた標
的分子に存在する二つ以上の化学反応性基の間の共有結合形成により得られても
よい。生物学的標的分子の多量体形態を得るための技術は当業界で公知であり、
一般に書籍、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)及びAusubelら, Curre
nt Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wile
y-Interscience 1991に見られる。
【００１７】 生物学的標的分子は少なくとも一つの関係する部位を含むので、その生物学的
標的分子の多量体形態は複数又は少なくとも二つの関係する部位（これらに対し
、小有機化合物のライブラリーが結合についてスクリーニングし得る）を有する
であろう。選択された生物学的標的分子の多量体形態を調製するための技術が当
業界で知られており、ルーチン様式でここに使用し得る。 関係する生物学的標的分子の多量体形態は少なくとも約２の結合された生物学
的標的分子、しばしば約２〜約200の結合された生物学的標的分子、更にしばし
ば約２〜約100の結合された生物学的標的分子、通常約２〜約50の結合された生
物学的標的分子、更に通常約２〜約20の結合された生物学的標的分子、好ましく
は約２〜約10の結合された生物学的分子、更に好ましくは約２〜約６の結合され
た生物学的分子を含むであろう。生物学的標的分子は公知の分子結合技術を使用
して共有結合又は非共有結合、好ましくは共有結合されて多量体形態を与えるで
あろう。
【００１８】 本発明の特別な実施態様において、上記のようにして得られた生物学的標的分
子の多量体形態が標的分子の多量体形態の関係する部位に潜在的に結合すること
ができる有機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及び第二員と合わされ、
又は接触されるであろう。有機化合物は、それらが生物学的標的の関係する部位
と適合性であるサイズ又は構造を有し、それによりそれらの間の結合を可能にす
る場合に“関係する部位に潜在的に結合することができる”であろう。多量体形
態及び少なくとも第一及び第二の有機化合物ライブラリー員を合わせる工程は結
合がそれらの間で生じることを可能にし得る条件下で行なわれ、これらの条件は
その系の成分の性質に依存し、ルーチン及び経験により決定し得る。
【００１９】 用途がある第一及び第二の有機化合物は同じ化学クラスのものであることが好
ましいが（例えば、全てアルデヒドであり、また全てアミンである等）、また異
なる化学クラスのものであってもよい。生物学的標的分子又はその多量体形態に
対しスクリーニングすべき有機化合物のライブラリーは、例えば、商用源及び非
商用源を介して、通常の化学合成技術又はコンビナトリアル合成技術（Gallopら
, J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994)、Gordonら, J. Med. Chem. 37: 1385-14
01 (1994)、Czarnik及びEllman, Acc. Chem. Res. 29: 112-170 (1996)、Thomps
on及びEllman, Chem. Rev. 96: 555-600 (1996)、並びにBalkenhohlら, Angew.
Chem. Int Ed. 35: 2288-2337 (1996)を参照のこと）を使用するこのような化合
物を合成することにより、更に大きい前駆体化合物、例えば、既知の治療薬、大
きい化学分子等からこのような化合物を分解生成物として得ることによる等の種
々の方法で得られてもよい。
【００２０】 本発明の方法に使用される１価“有機化合物”は、たいていの場合、一般に約
2000ダルトン未満のサイズ、通常約1500ダルトン未満のサイズ、更に通常約750
ダルトン未満のサイズ、好ましくは約500ダルトン未満のサイズ、しばしば約250
ダルトン未満のサイズ、更にしばしば約200ダルトン未満のサイズである小さい
化学分子であるが、2000ダルトンより大きいサイズの有機分子がまたここに用途
があり得る。用途がある有機分子は商用源又は非商用源から初期に得られたまま
で本明細書に記載された方法に使用されてもよく（例えば、多数の小有機化学化
合物が商用供給業者、例えば、アルドリッチ・ケミカル社（ミルウォーキー、WI
）及びシグマ・ケミカル社（セントルイス、MO）から容易に入手し得る）、又は
化学合成により得られてもよい。
【００２１】 本発明に用途がある有機分子化合物として、例えば、アルデヒド、ケトン、オ
キシム、例えば、O-アルキルオキシム、好ましくはO-メチルオキシム、ヒドラゾ
ン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、例えば、N-メチル
アミン、三級アミン、例えば、N,N-ジメチルアミン、N-置換ヒドラジン、ヒドラ
ジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、チオエステル、ジスル
フィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、
ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハライド、ア
リールスルホネート、アルキルハライド、アルキルスルホネート、芳香族化合物
、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール
、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スル
ホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、
ジアゾ化合物、酸クロリド等が挙げられる。実際に、生物学的標的分子の関係す
る部位に潜在的に結合することができる殆どあらゆる小有機分子が本発明に用途
があり、但し、それが水溶液に充分に可溶性かつ安定であり生物学的標的分子に
結合するその能力について試験されることを条件とする。
【００２２】 ここに用途がある有機化合物のライブラリーは一般に少なくとも２種の有機化
合物、しばしば少なくとも約25種の異なる有機化合物、更にしばしば少なくとも
約100種の異なる有機化合物、通常少なくとも約300種の異なる有機化合物、更に
通常少なくとも約500種の異なる有機化合物、好ましくは少なくとも約1000種の
異なる有機化合物、更に好ましくは少なくとも約2500種の異なる有機化合物、最
も好ましくは少なくとも約5000種以上の異なる化合物を含むであろう。集団が選
択又は構築されてもよく、その結果、集団の夫々個々の分子が集団のその他の分
子から空間上分離されてもよく（例えば、ライブラリーの夫々の員が別個のミク
ロタイタウェルである）、又は集団の二つ以上の員はデコンボルーションの方法
が容易に利用し得る場合に合わされてもよい。有機化合物の集団が調製される方
法は本発明に重要ではないであろう。通常、有機分子ライブラリーの夫々の員は
同じ化学クラスのものであるが（即ち、全てのライブラリー員がアルデヒドであ
り、全てのライブラリー員が一級アミンである、等）、有機化合物のライブラリ
ーはまた２種以上の異なる化学クラスからの分子を含んでもよい。
【００２３】 有機化合物のライブラリーを関係する部位を含む生物学的標的分子に対しスク
リーニングするための反応条件は関係する部位の性質及び有機化合物の選択され
たライブラリーの化学的性質に依存し、当業者により実験様式で決定し得る。有
機分子の集団をスクリーニングして標的ポリペプチドに結合するものを同定する
工程について、結合アッセイに使用される有機分子の濃度を決定することは当業
者の技能レベルの範囲内にあるであろう。 現在記載される方法は結合活性の原理を利用するので、生物学的標的の化学反
応性基と有機化合物ライブラリーの一種以上の員の間の共有結合形成は、これら
の成分が合わされる場合には所望されない。こうして、本発明の特に好ましい実
施態様において、有機分子ライブラリーの員及び生物学的標的分子の両方はそれ
らの間の望ましくない共有結合形成を潜在的に可能にする化学反応性基を有し得
るので、生物学的標的分子又は有機化合物ライブラリー員のいずれか又は両方、
好ましくは生物学的標的分子の化学反応性基は標的及び有機化合物ライブラリー
員を合わせる前に“キャッピング剤”による処理により“キャップ”されてもよ
い。標的分子又は有機ライブラリー員、好ましくは標的分子の化学反応性基の“
キャッピング”は、利用できる化学反応性基の一つ以上が変化され、その結果、
それらが最早別の化学反応性基と共有結合を形成することができないことを意味
する。これらの基が共有結合形成に関与することを防止するように化学反応性基
を変化するのに用途がある“キャッピング剤”は当業界で公知であり、ここにル
ーチンで使用し得る。生物学的標的及び／又は有機化合物ライブラリー員はそれ
らの間の共有結合形成が可能ではないように選ばれることが好ましいであろう。
【００２４】 本発明の方法は(a)生物学的標的分子又はその多量体形態及び／又は(b)有機化
合物ライブラリー員の少なくとも一つがその一方の分子に結合するための少なく
とも二つの利用できる部位を含むという結合活性の原理に基づいている。結合活
性の現象を利用することにより、標的分子と有機化合物ライブラリー員の間の結
合の強さは標的と一種以上のライブラリー員の間の結合を検出するだけでなく、
標的分子に結合した実際のライブラリー員の容易な同定を可能にする能力を増進
又は促進するような程度まで増大される。換言すれば、結合活性はそれらがそう
しないと弱く結合して容易な検出により検出されない場合に標的に結合する有機
化合物の同定を可能にする。このようなものとして、上記の本発明の一実施態様
は有機化合物ライブラリー員に結合するのに利用できる少なくとも二つの関係す
る部位を含む生物学的標的分子の多量体形態を使用し、それにより結合活性の現
象を利用する。しかしながら、本発明の更に別の実施態様は単一生物学的標的分
子又はその多量体形態及び標的の関係する部位に潜在的に結合することができる
“多価”有機化合物のライブラリーを使用してもよく、それにより結合活性の現
象を再度利用する。有機化合物を記載するのに使用される場合の“多価”はその
化合物が生物学的標的分子の関係する部位に結合することができる少なくとも二
つの化学構造、好ましくは少なくとも二つの同じ化学構造を有することを意味す
る。一実施態様において、上記のこの少なくとも二つの有機化合物は関係する有
機化合物の少なくとも二つ（これらの夫々が標的分子の関係する部位に結合する
のに利用できる）を含む“多価”分子を生成するように一緒に共有結合又は非共
有結合される。多価有機化合物は二つ以上の同じ結合された有機化合物を有する
ことが好ましいが、二つ以上の異なる結合された有機化合物を有する多価有機化
合物がまたここに用途があり得る。本発明に使用するための多価有機化合物は、
例えば、商用、公知かつルーチンの化学合成技術を使用する合成を含む種々の方
法で、又は更に大きい化学分子の分解生成物として、或いはその他の新規技術に
より得られてもよい。
【００２５】 ここに用途がある“多価”有機化合物の特別な例として、例えば、糖部分が酸
化されてアルデヒド官能基を生成するデキストラン、ポリマー主鎖を介して結合
された有機化合物、デンドロマー、ポリアミノ酸、例えば、複数のアミン基を有
するポリリシン等が挙げられる。 生物学的標的分子又はその多量体形態が有機化合物ライブラリーの員（多量体
であってもよく、またそうでなくてもよい）と合わされ、それらの間の結合が一
旦生じると、標的分子の一つ以上の関係する部位に結合した一種以上の有機化合
物を同定する必要がある。これに関して、結合した有機化合物を同定するための
多くの技術がある。例えば、質量分光分析の公知の技術が単独で、又は関係する
部位に結合した有機化合物リガンドを同定するための検出用のその他の手段と組
み合わせて使用されることが好ましいかもしれない。質量分光分析を使用する前
に、結合した有機化合物を標的分子に化学的に架橋したいことがあり得る。質量
分光分析を使用する技術は当業界で公知であり、種々の適用に使用されていた（
例えば、Fitzgerald及びSiuzdak, Chemistry＆Biology 3:707-715 (1996)、Chu
ら, J. Am. Chem. Soc. 118:7827-7835 (1996)、Siuzdak, Proc. Natl. Acad. S
ci USA 91:11290-11297 (1994)、Burlingameら, Anal. Chem. 68:599R-651R (19
96)、Wuら, Chemistry＆Biology 4:653-657 (1997)及びLooら, Am. Reports Med
. Chem. 31:319-325 (1996)を参照のこと）。
【００２６】 別の実施態様において、標的分子へのライブラリー員の結合及び結合した成分
の共有結合架橋に続いて、標的分子／有機化合物コンジュゲートは質量分光分析
に直接かけられてもよく、又は断片化され、次いで断片が標的分子に結合した有
機化合物の同定のための質量分光分析にかけられてもよい。無傷の標的タンパク
質／有機化合物コンジュゲート又はその断片の質量分光分析の成功は標的分子の
性質に依存し、実験基礎に基づいて決定し得る。 質量分光分析の使用に加えて、種々のその他の技術を使用して関係する生物学
的標的分子に結合した有機化合物を同定してもよい。結合した有機分子を同定す
る能力を増進するように反応混合物の成分の分離のために、例えば、種々のクロ
マトグラフィー技術、例えば、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー等を使用してもよい。このようなクロマトグラフィー技術は質量分光分析と組
み合わせて、又は質量分光分析とは別に使用されてもよい。必要により、上記技
術のいずれかを使用するその同定を促進するように標識プローブ（蛍光、放射能
、又はその他）を有機化合物ライブラリー員又は生物学的標的分子にカップリン
グしてもよい。標的生物分子に結合した有機化合物を同定するのに用途があり得
るその他の技術として、例えば、核磁気共鳴(NMR)、キャピラリー電気泳動、Ｘ
線結晶学等が挙げられ、これらの全てが当業者に公知であろう。
【００２７】 特に好ましい実施態様において、結合した有機分子の同定は(a)生物学的標的
分子もしくはその多量体形態又は(b)有機化合物ライブラリー員もしくはその多
価形態の一方又は両方をこれらの成分を合わせる工程の前に固体マトリックス物
質に結合することにより増進される。生物学的標的分子又はその多量体形態がそ
の固相結合された標的を有機化合物ライブラリーの員と合わせる工程中に固体マ
トリックス物質に結合される場合、標的の関係する部位に結合するライブラリー
員はそれら自体が必ず固体マトリックス物質に結合されるようになり、次いでこ
れらが洗浄されて未結合の反応成分を除去してもよく、それにより結合した員の
その後の同定を促進する。同じ手法とともに、有機化合物ライブラリー員又はそ
の多価形態がこれらの員を生物学的標的分子又はその多量体形態と合わせる工程
中に固体マトリックス物質に結合される場合、固相結合されたライブラリー員に
結合する標的分子は必ず固体マトリックス物質に結合されるようになり、次いで
これらが洗浄されて未結合の汚染物質を除去してもよく、それにより結合した員
の同定を促進する。別の好ましい実施態様において、異なる有機化合物ライブラ
リー員が固体マトリックス物質の空間上異なる領域に共有結合されてもよく、次
いで固体マトリックスの特定の領域への標的分子の結合が結合されている有機化
合物を必ず同定するであろう。
【００２８】 本発明に用途がある“固体マトリックス物質”は、例えば、種々の型のクロマ
トグラフィー、アフィニティー精製、又はリガンドもしくは潜在的リガンド分子
が固体基質に共有結合で固定されることを必要とするあらゆるその他の技術にル
ーチンで使用されるこれらの物質を含む、当業界で知られており、生物学的標的
分子及び／又は有機化合物が共有結合で固定し得るこれらの固体マトリックスの
全てを含む。ここに使用される固体マトリックス物質はその性質が有機又は無機
であってもよく、例えば、上記の生物学的標的分子又は有機化合物の結合を支持
するあらゆる樹脂物質から形成されてもよい。例えば、合成ポリマー樹脂、例え
ば、ポリ（フェノール-ホルムアルデヒド）、ポリアクリル、又はポリメタクリ
ル酸もしくはニトリル、アミン-エピクロロヒドリンコポリマー、スチレンとポ
リエチレン又はポリプロピレンのグラフトポリマー、ポリ(2-クロロメチル-1,3-
ブタジエン)、ポリ（ビニル芳香族）樹脂、例えば、スチレン、α-メチルスチレ
ン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン、ビニルトルエン、ビニルナフタレ
ンもしくはビニルピリジン、メタクリル酸の相当するエステル、スチレン、ビニ
ルトルエン、ビニルナフタレン、及び同様の不飽和モノマー、モノビニリデン環
含有窒素複素環化合物を含むモノビニリデンモノマーから誘導された樹脂並びに
上記モノマーのコポリマーが全て好適である。このような固体マトリックス物質
の調製のための技術が、例えば、Ikedaら, Journal of Polymer Science 12:182
9-1839 (1974)に見られ、又はMeitznerらの米国特許第4,382,124号に記載された
ようなものであってもよい。このような固体マトリックス物質の合成のためのそ
の他の技術が米国特許第3,915,642号、同第3,918,906号、同第3,920,398号、同
第3,925,019号及びダウ・ケミカル社（ミッドランド、ミシガン）により発行さ
れたモノグラフ“ダウエックス：イオン交換”第３編、(1964)に見られる。
【００２９】 本発明に用途がある付加的な固体マトリックス物質として、例えば、バイアコ
アー、金メッキしたカルボキシメチル化デキストラン及びその他の金フィルム、
ガラス又はガラス含有マトリックス等が挙げられる。固体マトリックス物質に固
定されている分子及び固体マトリックス物質はそれらの間の共有結合が容易に行
なわれるように適合性化学官能基を有し、又は有するように修飾されることが好
ましい。これに関して、リガンドを固体マトリックス物質に固定するための技術
は当業界で公知であり、架橋される成分の化学的性質に依存するであろう。リガ
ンドを固体マトリックス物質に固定するための詳細な条件は無用な実験を行なわ
ないで経験的様式で決定し得る。標的分子又は有機化合物ライブラリー員を固体
マトリックス物質に共有結合するのに使用し得る結合及び化学の例として、例え
ば、スルフヒドリル基による結合、NHS-エステル基による結合、アルデヒドとケ
トンとアミンの間の還元アミン化（March, Advanced Organic Chemistry, John
Wiley＆Sons, New York,第４編, 1992, 898-900頁）、アミンを調製するための
別法（Marchらの上記文献, 1276頁）、ヒドラゾン及びヒドラゾン誘導体、例え
ば、セミカルバゾンを得るためのアルデヒドとケトンとヒドラジン誘導体の間の
反応（Marchらの上記文献, 904-906頁）、アミド結合形成（Marchらの上記文献,
1275頁）、尿素の形成（Marchらの上記文献, 1299頁）、チオカルバメートの形
成（Marchらの上記文献, 892頁）、カルバメートの形成（Marchらの上記文献, 1
280頁）、スルホンアミドの形成
【００３０】 （Marchらの上記文献, 1296頁）、チオエーテルの形成（Marchらの上記文献, 12
97頁）、ジスルフィドの形成（Marchらの上記文献, 1284頁）、エーテルの形成
（Marchらの上記文献, 1285頁）、エステルの形成（Marchらの上記文献, 1281頁
）、エポキシドへの付加（Marchらの上記文献, 368頁）、アジリジンへの付加（
Marchらの上記文献, 368頁）、アセタール及びケタールの生成（Marchらの上記
文献, 1269頁）、カーボネートの生成（Marchらの上記文献, 392頁）、エナミン
の生成（Marchらの上記文献, 1284頁）、アルケンのメタセシス（Marchらの上記
文献, 1146-1148頁及びGrubbsら, Acc. Chem. Res. 28:446-452 (1995)）、アル
ケン及びアセチレンとのアリールハライド及びスルホネートの遷移金属触媒カッ
プリング（例えば、ヘック反応）（Marchらの上記文献, 717-178頁）、アリール
ハライド及びスルホネートと有機金属試薬、例えば、有機ホウ素試薬（Miyaura
ら, Chem. Rev., 95:2457 (1995)）、有機スズ試薬、及び有機亜鉛試薬の反応（
Marchらの上記文献, 662頁）、オキサゾリジンの生成（Edeら, Tetrahedron Let
ts. 38:7119-7122 (1997)）、チアゾリジンの生成（Patekら, Tetrahedron Lett
s. 36:2227-2230 (1995)）、アミンをイミドエステルによりカップリングするこ
とによりアミジン基により結合されたアミン（Daviesら, Canadian J. Biochem.
50:416-422 (1972)）等が挙げられる。実際に、固体マトリックス物質への標的
分子又は有機分子ライブラリー員の共有結合固定化は適合性化学反応性基がそれ
らの間に存在する場合に行ない得る。
【００３１】 生物学的標的と有機化合物ライブラリー員の間の結合を検出する能力を促進す
る付加的な局面は固体マトリックス結合成分の密度又は局所濃度、好ましくは固
体マトリックスに結合された有機分子ライブラリー成分の密度を増大することで
ある。例えば、有機化合物ライブラリー員が固体マトリックス物質に共有結合さ
れ、生物学的標的分子の多量体形態が固体マトリックスに通されてそれらの間の
結合を可能にする実施態様において、マトリックス中に比較的高い局所濃度のラ
イブラリー員を使用することにより結合を検出し、結合成分を同定する能力を促
進し得る。このような濃度は経験的に決定し得る。 本発明の付加的な実施態様は有機化合物又は多価有機化合物のライブラリーの
少なくとも第一員及び第二員を共有結合した固体マトリックス物質に関する。こ
のような固体マトリックス物質は、例えば、本発明の方法に用途があるであろう
。
【００３２】 （実施例） 実験１ 活性化デキストランが小分子の多価ディスプレイに適した可溶性足場であるか
どうかを測定するために、ビオチンをアルデヒド活性化デキストランに結合し、
固定された抗アビチンモノクローナル抗体への結合における結合活性について試
験した。ディスプレイの原子価に対する結合活性の非依存性を調べるために、分
子当り可変数の結合ビオチンを有するデキストランを調製し、これらを抗ビオチ
ン結合アッセイで試験した。
【００３３】 ビオチン-デキストランコンジュゲートの調製 アルデヒド活性化デキストラン（ピアス・バイオケミカルズ）を0.3M酢酸ナト
リウム、pH 4.7中で16時間にわたって室温で種々の比の1-アミノプロポキシルア
ミン（２官能性リンカーとして利用できる）及びメトキシルアミン（キャッピン
グ剤として利用できる）の混合物（アルデヒド基当り合計10当量）と反応させた
。反応液をPBS緩衝液（10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH 7.4）中でNAP-5
カラム（ファーマシア）により脱塩し、アミン含量をフルオルアルデヒドアッセ
イ（ピアス）により測定した。デキストラン溶液を４℃で一夜にわたって５当量
（アミンリンカーの最高濃度＋20mM当り）のビオチンのスルホ-N-ヒドロキシス
クシンアミドエステル（これはDMSO中の室温で１時間のビオチンと夫々１当量の
EDC及びスルホ-NHSの反応により調製された）で処理した。夫々のコンジュゲー
トのビオチン含量を製造業者の指示（ピアス）に従ってHABA-アビジン複合体に
よる滴定により測定した。
【００３４】 抗ビオチンMAb結合アッセイ ヌンク・マキシソープ96ウェルプレートを一夜にわたって４℃で５μg/mlのヤ
ギ抗マウスFcポリクローナル抗体（ベーリンガー・マンハイム；50mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液、pH 9.6中100μl/ウェル）で前被覆した。ウェルをPBS（ピアス）中
で１時間にわたって室温でスーパーブロックでブロックし、洗浄し（PBS＋0.05
％トゥイーン20）、結合緩衝液（スーパーブロック＋0.05％トゥイーン20）中で
１時間にわたって室温でマウス抗ビオチン腹水（シグマ、全IgG中3.8μg/ml）で
被覆し、再度洗浄した。ビオチンデキストランコンジュゲートの連続希釈液を添
加し、続いて所定の濃度のビオチン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)
コンジュゲートを添加して収率飽和以下の結合を得た。室温で２時間後に、ウェ
ルを洗浄し、HRP活性についてアッセイした。カレイダグラフ（シナージイ・ソ
フトウェア）を使用して、IC50値を置換プロットの４パラメーターフィットから
測定した。脱塩カラムからデキストランの100％回収、及び40,000のデキストラ
ン分子量と推定して、スルホ-NHS-ビオチンとの反応の前のデキストランのアミ
ン含量を計算した。
【００３５】 結果 抗ビオチン結合に関する、ビオチン基準（直接アッセイにより測定されたビオ
チン濃度）当りの、IC50濃度vsコンジュゲートのデキストラン前駆体当りのアミ
ンリンカーの数のプロットを図１に示す。最適の結合活性効果が分子当り60のア
ミンリンカーを含むデキストランから誘導されたコンジュゲートから見られ、遊
離ビオチンのそれに対する見掛ビオチンICSOの80倍の減少に相当した。利用でき
るアミン基を有しないデキストランサンプル中で見られた抑制はビオチンコンジ
ュゲート反応液の不完全な脱塩により生じた遊離ビオチンの存在のためである。
この物質のビオチン当りのICSO（64nM）は遊離ビオチンについて測定されたICSO （61nM）と良く一致する。
【００３６】 実験２ 目的：多くの結合部位を有するタンパク質を使用して、弱いアフィニティーリ
ガンドの結合が検出し得るかどうかを評価するため。市販の抗ビオチン抗体（シ
グマ、クローンBN-34）は夫々100nM及び130μMのアフィニティーでビオチンそし
てまたデスチオビオチンとして知られているビオチン類似体を結合する。小分子
リガンドビオチン及びデスチオビオチンは共有結合により固体担体に固定される
であろう。デスチオビオチンに関するアフィニティー（130μM）は1:1のタンパ
ク質対リガンド結合相互作用で通常のELISAに基づくアッセイを使用して容易に
検出されると予想されるよりも実質的に弱い。
【００３７】 小分子リガンドの固定及び多価検出： 方法A.コバリンク96ウェルプレート（ヌンク）に、１％DMSOを含む食塩加リン
酸緩衝液pH 7.2 (PBS)中10μMの濃度のビオチン-NHS、デスチオビオチン-NHS、
又はNHS-プロピオネート100μLを添加した。室温で１時間のインキュベーション
後に、プレートをプレート洗浄液で洗浄し、スーパーブロック（ピアス）中0.05
％のトゥイーン20でブロックした。滴定により飽和以下であると既に測定された
α-Fc-HRPコンジュゲートIgG（ベーリンガー）と一緒に適当な濃度のα-ビオチ
ンIgG（シグマ）を１時間にわたって添加した。プレートを洗浄し、TMB基質（ピ
アス）を添加し、製造業者の指示（ピアス）に従ってシグナルを発生させた。 方法B.アミノPEGA樹脂（0.25ミリモル）（カルビオケム）をジメチルホルムア
ミド中で膨潤させ、DMF中のビオチン（１ミリモル）、HBTU（１ミリモル）及び
ジイソプロピルエチルアミン（1.5ミリモル）の予め混合した溶液で処理した。
１時間混合した後、樹脂を排出し、DMF及びジクロロメタンで洗浄した。同じ方
法を使用してデスチオビオチン及び酢酸を共有結合した。樹脂を96ウェルポリス
チレンフィルタープレートの別々のウェルにアリコートにし、0.05％トゥイーン
20を含むPBS中のα-Fc-HRPコンジュゲートIgG（ベーリンガー）と一緒の適当な
濃度のα-ビオチンIgG（シグマ）を添加した。１時間後に樹脂を排出し、0.05％
トゥイーン20を含むPBSで洗浄し、製造業者の指示（ピアス）に従ってTMB基質を
添加した。
【００３８】 方法C.硫酸と過酸化水素の混合物を使用して、ガラス顕微鏡スライド(VWR)を
洗浄した。スライドを95％エタノール中のアミノプロピルトリエトキシシランの
５％溶液で１時間処理した。処理後に、スライドをエタノールで洗浄し、120℃
で２時間アニールした。スライドを１％DMSOを含むPBS中のビオチン-NHS、デス
チオビオチン-NHS、又はNHS-アセテートの10μM溶液の添加により１時間にわた
って特定の部位で誘導体化した。次いでスライドを水及びメタノールで洗浄した
。ガラススライドの部分を異なる小分子がカップリングされた場所に従って片に
切断し、これらの片を96ウェルポリスチレンフィルタープレートに分配し、0.05
％トゥイーン20を含むPBS中のα-Fc-HRPコンジュゲートIgG（ベーリンガー）と
一緒の適当な濃度のα-ビオチンIgG（シグマ）を添加した。１時間後に樹脂を排
出し、0.05％トゥイーン20を含むPBSで洗浄し、製造業者の指示（ピアス）に従
ってTMB基質を添加した。
【００３９】 結果 方法Ａに記載されたようにして誘導体化されたコバリンクプレートを最初にα
-ビオチン抗体に対し滴定した。下記の図２はビオチン、デスチオビオチン、未
反応のウェル及びプロピオン酸でブロックされたウェルの認識のためのプロット
を示す。抗体はnM以下の濃度で固定ビオチン及び固定デスチオビオチンの両方を
容易に検出する。ビオチン及びデスチオビオチンの両方の検出に関する比較的同
様の感度は結合活性効果を示す。たとえ、これらの２種のリガンドの夫々に関す
る抗体のアフィニティーが1000倍だけ異なるとしても、それらは両方とも容易に
認識される。検出系は潜在的に４価である。何とならば、α-Fc-HRP検出抗体が
二つの結合部位を既に有するα-ビオチン抗体を２量化し得るからである。４価
抗体の潜在的アフィニティーはおそらくα-ビオチン抗体に関するα-Fc-HRP検出
抗体のアフィニティーを滴定しているこのアッセイの感度より充分に下である。
これらの結果は多価結合系が非常に高い観察された結合感度を示し、結果を正確
に定量化するのに特殊なアッセイを必要とし得ることを示す。 図３中、可溶性ビオチンが一定濃度のα-ビオチン抗体及びα-Fc-HRP検出抗体
に対して滴定されて固定ビオチン又は固定デスチオビオチンと競合するのに必要
とされる遊離ビオチンの量を評価する。予想されたように、固定ビオチンと競合
するのに必要とされる可溶性ビオチンの濃度（約１μM）はビオチンに関する抗
体の測定アフィニティー（100nM）よりも極めて高い。第二の曲線は固定デスチ
オビオチンを含むウェル中の可溶性ビオチンの滴定を示す。可溶性ビオチンの極
めて低い濃度（約50nM）がデスチオビオチンに関する抗体の実質的に低いアフィ
ニティーのためにこの相互作用と競合するのに必要とされる。 方法Ｂ及び方法Ｃを使用して構築された担体を用いて行なわれた同様の実験は
同様の結果を生じた。
【００４０】 実験３ 多量体タンパク質を調製するための技術 方法A.IL-4（50μM、MES pH 6.0）の溶液を４℃で12時間にわたって２当量の
ビオチン-NHS（ピアス）で処理した。質量分光分析による分析はモノ-ビオチニ
ル化IL-4及び未修飾IL-4のほぼ等しい部数の混合物を明らかにした。タンパク質
をNAP-5カラム（ファーマシア）による精製により未反応のビオチンから分離し
た。タンパク質の混合物を0.2当量のニュートラビジン（ピアス）とのインキュ
ベーションにより更に精製して４価複合体（4:1のIL-4:ニュートラビジン）を生
成した。所望の４価複合体を、バイオ-シレクトSEC 125-5カラム（バイオ-ラド
）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。更に、部位特異的
ビオチニル化をシステイン突然変異体A104Cの発現（その他の部位が同じ目的に
容易に使用し得る）及びビオチンHPDP（ピアス）との反応により達成した。この
戦略は修飾による標的タンパク質結合部位のブロッキングを防止するのに潜在的
に重要である。 方法B.アルデヒド活性化デキストラン（ピアス）を50mM MES pH 6.0中で12時
間にわたって３当量のピリジルジチオプロピオニルヒドラジド（PDPH、ピアス）
で処理した。NAP-5カラム（ファーマシア）を使用して、反応液を精製し、とり
込まれたチオピリジル基の数をジスルフィドとDTTの反応そして340nMにおけるUV
吸光度（チオピリドン）の監視により定量化することができた。チオピリジル官
能基で誘導体化されたアルデヒド部位の数を、セミカルバジドの如きキャッピン
グヒドラジド試薬を添加して利用できるアルデヒドの或る％と反応させることに
より調節することができた。次いでチオピリジル-デキストランをIL-4 A104Cと
反応させてIL-4誘導体化デキストランを生成した。これらの構築物を、バイオ-
シレクトSEC 125-5カラム（バイオ-ラド）を使用するサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより精製した。
【００４１】 方法C.容易に誘導体化し得る脂質を調製するために、ホスファチジルエタノー
ルアミン（シグマ、P7943）10mgを３当量のジイソプロピルエチルアミンを含む
クロロホルム(2mL)に溶解した。チオール特異的反応性官能基をとり込むために
、２官能性マレイミド-NHSエステル架橋剤（BMPS、ピアス）5mgを添加した。室
温で２時間後に、反応液を濃縮し、シリカゲルカラムで精製した。１％〜５％の
レベルのマレイミド誘導体化脂質と残部を構成するホスファチジルコリンとの混
合物を用いて押出技術によりリポソームを調製した。リポソームを、バイオ-シ
レクトSEC 125-5カラム（バイオ-ラド）を使用するサイズ排除クロマトグラフィ
ーにより精製した。遊離システインを含むタンパク質、例えば、IL-4 A104C又は
試薬SATA（ピアス）を使用して遊離チオールで誘導体化された抗ビオチン抗体を
チオールとマレイミドの間の反応によりリポソームの外部に共有結合した。
【００４２】 以上の記載は本発明を実施するのに使用し得る特別な方法を詳述する。このよ
うな特別な方法を詳述したので、当業者は本発明の成果を使用する際に同じ情報
に到達するのに別の信頼できる方法を工夫する方法を充分に良く知っているであ
ろう。しかしながら、こうして、詳述された以上が明細書に明らかであり、それ
は本発明の全範囲を限定するものと見なされるべきではない。むしろ、本発明の
範囲は特許請求の範囲の法的構成のみにより決められるべきである。本明細書に
引用された全ての文献は明らかに参考として含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 抗ビオチンモノクローナル抗体へのビオチン-デキストランコンジュゲートの
結合を示す。
【図２】 ビオチン、デスチオビオチン、未反応のウェル及びプロピオン酸でブロックさ
れたウェルの認識のためのプロットを示す。
【図３】 固定ビオチン又は固定デスチオビオチンと競合するのに必要とされる遊離ビオ
チンの量を評価するために一定濃度のα-ビオチン抗体及びα-Fc-HRP検出抗体に
対し滴定された可溶性ビオチンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バリンガー マーカス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010 バーリンゲーム チュラ ヴィス タ アベニュー 918−＃３ (72)発明者 クニンガム ブライアン シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94402 サン マテオ ヒルクレスト ロ ード 410

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的標的分子の関係する部位に結合する有機分子リガン
    ドの同定方法であって、前記方法が (a)前記有機分子リガンドが潜在的に結合し得る関係する部位を含む生物学的
    標的分子を選択し、 (b)少なくとも二つの結合された生物学的標的分子及び少なくとも二つの関係
    する部位を含む前記生物学的標的分子の多量体形態を前記の関係する部位に潜在
    的に結合することができる有機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及び第
    二員と接触させ（前記ライブラリーの前記第一員の少なくとも二つが前記多量体
    形態の前記の関係する部位に結合する）、そして (c)有機化合物の前記ライブラリーの前記第一員を同定することを特徴とする
    同定方法。
  2. 【請求項２】 前記生物学的標的分子がポリペプチド、核酸及び炭水化物か
    らなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記生物学的標的分子が酵素、ホルモン、転写因子、受容体
    、受容体のリガンド、成長因子又は免疫グロブリンであるポリペプチドである請
    求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記の関係する部位が酵素活性部位又はリガンド結合部位を
    含む請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記生物学的標的分子の前記多量体形態が前記生物学的標的
    分子の少なくとも二つを化学結合することにより得られる請求の範囲第１項記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 前記生物学的標的分子がポリペプチドであり、前記多量体形
    態がその組換え発現により得られる請求の範囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記生物学的標的分子の前記多量体形態が２〜約100の結合
    された生物学的標的分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記生物学的標的分子の前記多量体形態が２〜約10の結合さ
    れた生物学的標的分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記生物学的標的分子の前記多量体形態が少なくとも二つの
    共有結合された生物学的標的分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記生物学的標的分子の前記多量体形態が少なくとも二つ
    の非共有結合された生物学的標的分子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 有機化合物の前記ライブラリーがアルデヒド、ケトン、オ
    キシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、
    三級アミン、N-置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール
    、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド
    、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、
    チオアセタール、アリールハライド、アリールスルホネート、アルキルハライド
    、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、
    アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チア
    ゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、
    イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物又は酸クロリドを含む請求
    の範囲第１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 接触させる前記工程の前に、前記ライブラリー員と共有結
    合を形成することができる前記多量体形態の化学反応性基をキャッピング剤によ
    る前記多量体形態の処理によりキャップする請求の範囲第１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記の接触の工程中に、少なくとも前記多量体形態又は前
    記有機化合物ライブラリーの前記の少なくとも第一員及び第二員を固体マトリッ
    クス物質に共有結合する請求の範囲第１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記多量体形態を前記固体マトリックス物質に共有結合す
    る請求の範囲第１３項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記有機化合物ライブラリーの少なくとも第一員及び第二
    員を前記固体マトリックス物質に共有結合する請求の範囲第１３項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記の少なくとも第一及び第二の有機化合物ライブラリー
    員を前記固体マトリックス物質の空間上異なる領域に共有結合し、工程(c)を前
    記多量体形態が結合する空間上異なる領域を測定することにより行なう請求の範
    囲第１５項記載の方法。
  17. 【請求項１７】 未結合成分を前記固体マトリックス物質から洗浄する工程
    を更に含み、前記洗浄を工程(b)に続いて、かつ工程(c)の前に行なう請求の範囲
    第１３項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 生物学的標的分子の関係する部位に結合する有機分子リガ
    ンドの同定方法であって、前記方法が (a)前記有機分子リガンドが潜在的に結合し得る関係する部位を含む生物学的
    標的分子を選択し、 (b)前記生物学的標的分子を前記の関係する部位に潜在的に結合することがで
    きる多価有機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及び第二員と接触させ（
    前記生物学的標的分子の少なくとも二つの関係する部位が多価有機化合物の前記
    ライブラリーの前記第一員に結合する）、そして (c)多価有機化合物の前記ライブラリーの前記第一員を同定することを特徴と
    する同定方法。
  19. 【請求項１９】 前記生物学的標的分子がポリペプチド、核酸及び炭水化物
    からなる群から選ばれる請求の範囲第１８項記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記の関係する部位が酵素活性部位又はリガンド結合部位
    を含む請求の範囲第１８項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 接触させる前記工程の前に、前記ライブラリー員と共有結
    合を形成することができる前記生物学的標的分子の化学反応性基をキャッピング
    剤による前記標的分子の処理によりキャップする請求の範囲第１８項記載の方法
    。
  22. 【請求項２２】 前記の接触の工程中に、少なくとも前記生物学的標的分子
    又は前記の少なくとも第一及び第二の多価有機化合物ライブラリー員を固体マト
    リックス物質に共有結合する請求の範囲第１８項記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記の少なくとも第一及び第二の多価有機化合物ライブラ
    リー員を前記固体マトリックス物質に共有結合する請求の範囲第２２項記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 前記の少なくとも第一及び第二の多価有機化合物ライブラ
    リー員を前記固体マトリックス物質の空間上異なる領域に共有結合し、工程(c)
    を前記生物学的標的分子が結合する空間上異なる領域を測定することにより行な
    う請求の範囲第２３項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 未結合成分を前記固体マトリックス物質から洗浄する工程
    を更に含み、前記洗浄を工程(b)に続いて、かつ工程(c)の前に行なう請求の範囲
    第２２項記載の方法。
  26. 【請求項２６】 生物学的標的分子の関係する部位に結合する有機分子リガ
    ンドの同定方法であって、前記方法が (a)前記有機分子リガンドが潜在的に結合し得る関係する部位を含む生物学的
    標的分子を選択し、 (b)(i)少なくとも二つの結合された生物学的標的分子及び少なくとも二つの関
    係する部位を含む前記生物学的標的分子の多量体形態を(ii)前記の関係する部位
    に潜在的に結合することができる多価有機化合物のライブラリーの少なくとも第
    一員及び第二員と接触させ（前記多量体形態が多価有機化合物の前記ライブラリ
    ーの前記第一員に結合する）、そして (c)多価有機化合物の前記ライブラリーの前記第一員を同定することを特徴と
    する同定方法。
  27. 【請求項２７】 有機化合物のライブラリーの少なくとも第一員及び第二員
    を共有結合させた固体マトリックス物質。
  28. 【請求項２８】 前記ライブラリー員がアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒ
    ドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン
    、N-置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエー
    テル、チオエステル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カ
    ルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタ
    ール、アリールハライド、アリールスルホネート、アルキルハライド、アルキル
    スルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、
    ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、
    チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネ
    ート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物又は酸クロリドを含む請求の範囲第２
    ７項記載の固体マトリックス物質。
  29. 【請求項２９】 有機化合物のライブラリーの前記の少なくとも第一員及び
    第二員が多価有機化合物である請求の範囲第２７項記載の固体マトリックス物質
    。
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