JP2013533732A - 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2010年5月3日出願の米国仮特許出願第61/330698号の利益を主張し、本出願は参照することにより本明細書に援用される。
本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断と治療に有用な物質の組成物と、同用途のために該物質の組成物を使用する方法に関する。
悪性腫瘍(癌)は、米国において心臓疾患に続き第2の主要な死亡原因である(Boring等, CA Cancel J. Clin. 43:7(1993))。癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍塊を形成する異常な又は腫瘍形成性の細胞の数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節や遠くの部位に転移と呼ばれる過程を介して広がる悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
1.(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列をコードするDNA分子、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチドを欠くものをコードするDNA分子、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つものをコードするDNA分子、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くものをコードするDNA分子、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列、
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域、又は
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の相補鎖、
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
2.(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つものをコードするヌクレオチド配列、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列、
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域、又は
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の相補鎖、
を有する単離された核酸。
3.(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列をコードする核酸、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチドを欠くものをコードする核酸、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つものをコードする核酸、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くものをコードする核酸、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列、
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域、又は
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)の相補鎖、
にハイブリダイズする単離された核酸。
4.ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが起こる、請求項3に記載の核酸。
5.少なくとも約5ヌクレオチド長である、請求項3に記載の核酸。
6.請求項1、2、又は3に記載の核酸を有する発現ベクター。
7.前記核酸が、前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作用可能に結合する、請求項6に記載の発現ベクター。
8.請求項7に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
9.CHO細胞、大腸菌細胞、又は酵母細胞である、請求項8に記載の宿主細胞。
10.前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項8に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの生産方法。
11.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
12.(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する単離されたポリペプチド。
13.異種ポリペプチドに融合した請求項11又は12に記載のポリペプチドを有するキメラポリペプチド。
14.前記異種ポリペプチドが免疫グロブリンのエピトープタグ配列又はFc領域である、請求項13に記載のキメラポリペプチド。
15.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
16.(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
17.モノクローナル抗体である、請求項15又は16に記載の抗体。
18.抗体断片である、請求項15又は16に記載の抗体。
19.キメラ又はヒト化抗体である、請求項15又は16に記載の抗体。
20.増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項15又は16に記載の抗体。
21.細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項15又は16に記載の抗体。
22.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項21に記載の抗体。
23.細胞障害性剤が毒素である、請求項21に記載の抗体。
24.毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項23に記載の抗体。
25.毒素がメイタンシノイドである、請求項23に記載の抗体。
26.細菌中で産生される、請求項15又は16に記載の抗体。
27.CHO細胞中で産生される、請求項15又は16に記載の抗体。
28.結合する細胞に死を誘発する、請求項15又は16に記載の抗体。
29.検出可能に標識される、請求項15又は16に記載の抗体。
30.請求項15又は16に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
31.前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作用可能に結合する、請求項30に記載の核酸を有する発現ベクター。
32.請求項31に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
33.CHO細胞、大腸菌細胞、又は酵母細胞である、請求項32に記載の宿主細胞。
34.前記抗体の発現に適した条件下で請求項32に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記抗体を回収することを含む抗体の生産方法。
35.担体と組み合わされて、(a)請求項11に記載のポリペプチド、(b)請求項12に記載のポリペプチド、(c)請求項13に記載のキメラポリペプチド、(d)請求項15に記載の抗体、又は(e)請求項16に記載の抗体を含有する組成物。
36.前記担体が薬学的に許容される担体である、請求項35に記載の組成物。
37.(a)容器;及び
(b)前記容器に収容された請求項35に記載の組成物
を含んでなる製造品。
38.癌の治療的処置又は診断的検出のための前記組成物の使用に言及した、前記容器に貼付されたラベル、又は前記容器に含められたパッケージ挿入物を更に含む、請求項37に記載の製造品。
39.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、前記タンパク質に結合する抗体に前記細胞を接触させ、前記タンパク質に前記抗体が結合することにより前記細胞の増殖が阻害される方法。
40.前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項39に記載の方法。
41.前記抗体が抗体断片である、請求項39に記載の方法。
42.前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項39に記載の方法。
43.前記抗体が増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項39に記載の方法。
44.前記抗体が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項39に記載の方法。
45.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
46.細胞障害性剤が毒素である、請求項44に記載の方法。
47.毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
48.毒素がメイタンシノイドである、請求項46に記載の方法。
49.前記抗体が細菌中で産生される、請求項39に記載の方法。
50.前記抗体がCHO細胞中で産生される、請求項39に記載の方法。
51.前記細胞が癌細胞である、請求項39に記載の方法。
52.前記癌細胞に更に放射線治療又は化学療法薬が施される、請求項51に記載の方法。
53.前記癌細胞が、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、子宮頚部癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、及び白血病細胞からなる群から選択される、請求項71に記載の方法。
54.前記癌細胞が、同じ組織由来の正常細胞と比較して前記タンパク質を大量に発現する、請求項51に記載の方法。
55.前記細胞の死を誘発する、請求項39に記載の方法。
56.前記タンパク質が、(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する、請求項39に記載の方法。
57.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対し、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物の治療方法であって、前記タンパク質に結合する抗体の治療的有効量を前記哺乳動物に投与することにより前記哺乳動物を有効に治療する方法。
58.前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項57に記載の方法。
59.前記抗体が抗体断片である、請求項57に記載の方法。
60.前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項57に記載の方法。
61.前記抗体が増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項57に記載の方法。
62.前記抗体が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項57に記載の方法。
63.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
64.細胞障害性剤が毒素である、請求項62に記載の方法。
65.毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
66.毒素がメイタンシノイドである、請求項64に記載の方法。
67.前記抗体が細菌中で産生される、請求項57に記載の方法。
68.前記抗体がCHO細胞中で産生される、請求項57に記載の方法。
69.前記腫瘍に更に放射線治療又は化学療法薬が施される、請求項57に記載の方法。
70.前記腫瘍が、胸部腫瘍、直腸結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、中枢神経系腫瘍、肝臓腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺癌細胞、膵臓腫瘍、又は子宮頚部腫瘍からなる群から選択される、請求項57に記載の方法。
71.前記腫瘍の癌性細胞が、同じ組織由来の正常細胞と比較して前記タンパク質を大量に発現する、請求項57に記載の方法。
72.前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する、請求項57に記載の方法。
73.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含むことが疑われる試料中における前記タンパク質の存在を決定する方法であって、前記タンパク質に結合する前記抗体に前記試料を曝し、前記試料中における前記タンパク質への前記抗体の結合を決定し、前記タンパク質に対する抗体の結合により前記試料中における前記タンパク質の存在が示される方法。
74.前記試料が前記タンパク質の発現が疑われる細胞を含む、請求項73に記載の方法。
75.前記細胞が癌細胞である、請求項74に記載の方法。
76.前記抗体が検出可能に標識される、請求項73に記載の方法。
77.前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する、請求項73に記載の方法。
78.哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、
(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを、前記哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料中と、同一組織由来の既知の正常細胞のコントロール試料中で測定することを含み、コントロール試料と比較して試験試料中に前記タンパク質が高いレベルで発現していることが、試験試料を採取した哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す方法。
79.前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程が、インサイツハイブリダイゼーション又はRT-PCR分析でオリゴヌクレオチドを使用することを含む、請求項78に記載の方法。
80.前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程が、免疫組織化学分析又はウェスタンブロッティング分析で抗体を使用することを含む、請求項78に記載の方法。
81.前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する、請求項78に記載の方法。
82.哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、
前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質に結合する抗体に対し、前記哺乳動物由来の組織細胞の試験試料を接触させ、試験試料中における、前記抗体と前記タンパク質の複合体の形成を検出することを含み、複合体の形成が哺乳動物中における腫瘍の存在を示す方法。
83.前記抗体が検出可能に標識される、請求項82に記載の方法。
84.前記組織細胞の試験試料が、癌性腫瘍を有することが疑われる個体から得たものである、請求項82に記載の方法。
85.前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する、請求項82に記載の方法。
86.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の発現又は活性の増大に関連する細胞増殖障害を治療又は予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対し、前記タンパク質のアンタゴニストの治療的有効量を投与することによって、前記細胞増殖障害を有効に治療又は予防する方法。
87.前記細胞増殖障害が癌である、請求項86に記載の方法。
88.前記アンタゴニストが抗TATポリペプチド抗体、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項86に記載の方法。
89.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞に対し、抗体を結合させる方法であって、前記タンパク質に結合する抗体に前記細胞を接触させ、前記細胞に抗体を結合させることにより、前記細胞に抗体を結合させることを含む方法。
90.前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項89に記載の方法。
91.前記抗体が抗体断片である、請求項89に記載の方法。
92.前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項89に記載の方法。
93.前記抗体が増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項89に記載の方法。
94.前記抗体が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項89に記載の方法。
95.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項94に記載の方法。
96.細胞障害性剤が毒素である、請求項94に記載の方法。
97.毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項96に記載の方法。
98.毒素がメイタンシノイドである、請求項96に記載の方法。
99.前記抗体が細菌中で産生される、請求項89に記載の方法。
100.前記抗体がCHO細胞中で産生される、請求項89に記載の方法。
101.前記細胞が癌細胞である、請求項89に記載の方法。
102.前記癌細胞に更に放射線治療又は化学療法薬が施される、請求項101に記載の方法。
103.前記癌細胞が、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、子宮頚部癌細胞、黒色腫細胞又は白血病細胞からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
104.前記癌性細胞が、同じ組織由来の正常細胞と比較して前記タンパク質を大量に発現する、請求項103に記載の方法。
105.前記細胞の死を誘発する、請求項89に記載の方法。
106.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項1から5のいずれか1項又は請求項30に記載の核酸の使用。
107.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項1から5のいずれか1項又は請求項30に記載の核酸の使用。
108.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項1から5のいずれか1項又は請求項30に記載の核酸の使用。
109.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項6、7又は31に記載の発現ベクターの使用。
110.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項6、7又は31に記載の発現ベクターの使用。
111.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項6、7又は31に記載の発現ベクターの使用。
112.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項8、9、32、又は33に記載の宿主細胞の使用。
113.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項8、9、32、又は33に記載の宿主細胞の使用。
114.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項8、9、32、又は33に記載の宿主細胞の使用。
115.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項11から14のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
116.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項11から14のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
117.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項11から14のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
118.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項15から29のいずれか1項に記載の抗体の使用。
119.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項15から29のいずれか1項に記載の抗体の使用。
120.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項15から29のいずれか1項に記載の抗体の使用。
121.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項35又は36のいずれか1項に記載の組成物の使用。
122.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項35又は36のいずれか1項に記載の組成物の使用。
123.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項35又は36のいずれか1項に記載の組成物の使用。
124.癌の治療的処置又は診断的検出のための薬剤の調製における、請求項37又は38のいずれか1項に記載の製造品の使用。
125.腫瘍の治療のための薬剤の調製における、請求項37又は38のいずれか1項に記載の製造品の使用。
126.細胞増殖障害の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項37又は38のいずれか1項に記載の製造品の使用。
127.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の増殖増強効果に細胞の増殖が少なくとも部分的に依存する細胞の増殖を阻害する方法であって、前記タンパク質に結合する抗体に対して前記タンパク質を接触させることにより、前記細胞の増殖を阻害する方法。
128.前記細胞が癌細胞である、請求項127に記載の方法。
129.前記細胞が前記タンパク質を発現する、請求項127に記載の方法。
130.前記タンパク質に対する前記抗体の結合が、前記タンパク質の細胞増殖増強活性をアンタゴナイズする、請求項127に記載の方法。
131.前記タンパク質に対する前記抗体の結合が前記細胞の死を誘発する、請求項127に記載の方法。
132.前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項127に記載の方法。
133.前記抗体が抗体断片である、請求項127に記載の方法。
134.前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項127に記載の方法。
135.前記抗体が増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項127に記載の方法。
136.前記抗体が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項127に記載の方法。
137.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項136に記載の方法。
138.細胞障害性剤が毒素である、請求項136に記載の方法。
139.毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項138に記載の方法。
140.毒素がメイタンシノイドである、請求項138に記載の方法。
141.前記抗体が細菌中で産生される、請求項127に記載の方法。
142.前記抗体がCHO細胞中で産生される、請求項127に記載の方法。
143.前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
を有する、請求項127に記載の方法。
144.(a)配列番号2に示されたポリペプチド、
(b)配列番号2に示されたポリペプチドであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連シグナルペプチドを欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるポリペプチド、
に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の増殖増強効果に腫瘍の増殖が少なくとも部分的に依存する、哺乳動物の腫瘍の治療的処置法であって、前記タンパク質に結合する抗体に対して前記タンパク質を接触させることにより、前記腫瘍を有効に処置する方法。
145.前記腫瘍の細胞が前記タンパク質を発現する、請求項144に記載の方法。
146.前記タンパク質に対する前記抗体の結合が、前記タンパク質の細胞増殖増強活性をアンタゴナイズする、請求項144に記載の方法。
147.前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項144に記載の方法。
148.前記抗体が抗体断片である、請求項144に記載の方法。
149.前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項144に記載の方法。
150.前記抗体が増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項144に記載の方法。
151.前記抗体が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項144に記載の方法。
152.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項151に記載の方法。
153.細胞障害性剤が毒素である、請求項151に記載の方法。
154.毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
155.毒素がメイタンシノイドである、請求項153に記載の方法。
156.前記抗体が細菌中で産生される、請求項144に記載の方法。
157.前記抗体がCHO細胞中で産生される、請求項144に記載の方法。
158.前記タンパク質が、
(a)配列番号2に示されたアミノ酸配列、
(b)配列番号2に示されたアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(c)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を持つもの、
(d)配列番号2に示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連シグナルペプチド配列を欠くもの、
(e)配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、又は
(f)配列番号1に示されたヌクレオチド配列の完全長コード化領域によりコードされるアミノ酸配列、
である、請求項144に記載の方法。
159.請求項15から29の何れかに記載の抗体が結合する同じエピトープに結合する単離された抗体。
160.モノクローナル抗体である請求項159に記載の抗体。
161.抗体断片である、請求項159に記載の抗体。
162.キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項159に記載の抗体。
163.増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項159に記載の抗体。
164.細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項159に記載の抗体。
165.細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群より選択される、請求項164に記載の抗体。
166.細胞障害性剤が毒素である、請求項164に記載の抗体。
167.毒素がメイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項166に記載の抗体。
168.毒素がメイタンシノイドである、請求項166に記載の抗体。
169.細菌中で産生される請求項159に記載の抗体。
170.CHO細胞中で産生される請求項159に記載の抗体。
171.結合する細胞の死を誘発する、請求項159に記載の抗体。
172.検出可能に標識される、請求項159に記載の抗体。
173. 請求項15から29に記載の何れかの抗体の相補性決定領域の少なくとも一つを含む、請求項159に記載の抗体。
174.TATポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞。
175.請求項15から29の何れかの抗体が結合するエピトープに結合する抗体を同定する方法であって、前記方法は、試験抗体の、請求項15から29に記載の何れかの抗体の結合を遮断する能力を決定することを含み、ここで、前記請求項15から29の何れかの抗体の結合を少なくとも40%でかつ等しい抗体濃度で遮断する前記試験抗体の能力は、前記請求項15から29の何れかの抗体が結合するエピトープへ結合可能であることを示す方法。
I.定義
ここで使用される「TATポリペプチド」及び「TAT」という用語は、直後に数値表示がある場合には種々のポリペプチドを指し、完全な表示(つまり、TAT/数字)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」という用語がここでは実際の数的表示として提供されている「TAT/数字ポリペプチド」及び「TAT/数字」という用語には、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体及び天然配列ポリペプチドとポリペプチド変異体の断片(ここでさらに定義される)を包含する。ここに記載されているTATポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって調製してもよい。「TATポリペプチド」という用語は、ここに記載の各個々のTAT/数字ポリペプチドを指す。「TATポリペプチド」を指すこの明細書の全ての開示は、各ポリペプチドを個々に指すと同時に集合的に指す。例えば、調製、精製、誘導、抗体の形成、TAT結合オリゴペプチドの形成、TAT結合有機分子の形成、投与、含有する組成物、疾患の治療等の記載は、本発明の各ポリペプチドに関している。「TATポリペプチド」という用語は、また、ここに記載のTAT/数字ポリペプチドの変異体を含む。一実施態様において、TAT211ポリペプチド配列は配列番号2として示される。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
A.抗TAT抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療及び/又は診断薬としての用途が見出され得る抗TAT抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
1.ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原(特に、合成ペプチドが用いられる場合)を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、SOCl2、又はR及びR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを用いて結合させることができる。
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作成することができる。
本発明の抗-TAT抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、TATタンパク質の2つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とTAT結合部位とが結合しうる。あるいは、抗TATアームは、TAT-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)(例えば、Baeuerle, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 11(1):22-30 (2009)を参照)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプター、又はT細胞レセプター分子(例えばCD3)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はTATを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はTAT結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4676980号]及びHIV感染の治療のために[国際公開第91/00360;国際公開第92/200373;欧州特許第03089号]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第4676980号に開示されたものが含まれる。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性(ADCC)及び/又は補体依存細胞障害性(CDC)を向上させることは望ましい。これは、抗体のFc領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ADCC)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第5739277号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、IgG分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープを意味する。
また、本発明は、化学治療薬、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
好ましい一実施態様では、本発明の抗TAT抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5208020号、同5416064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体C242に結合するDM1と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体A7、又はHER-2/neuオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。TA.1-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞SK-BR-3におけるインビトロで試験され、細胞当たり3×105HER-2表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。A7-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗TAT抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗TAT抗体を化学的に結合させることにより調製される。1分子の毒素/抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均3-4のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5208020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
一部の実施態様では、免疫複合体は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体である、アウリスタチン(米国特許第5635483号、同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管の動態、GTP加水分解、核分裂、及び細胞分裂を妨害することが判明しており(Woyke等、(2001) Antimicrob. Agents and Chemother 45(12):3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌活性(Pettit等、(1998) Antimicrob. Agents Chemother 42:2961-2965)を有する。ドラスチン又はアウリスタチンの薬剤成分は、ペプチド剤成分のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端で抗体に付着させることができる(WO02/088172)。
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗TAT抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗TAT抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
ここで開示されている抗TAT抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した2層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985);Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980);及び米国特許第4485045号及び同4544545号;及び1997年10月23日に公開の国際公開97/38731に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第5013556号に開示されている。
本発明のTAT結合オリゴペプチドはここで記載される様なTATポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。TAT結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。TAT結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約5のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約6、7、8、9、10、11、1−73、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なTATポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。TAT結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する(例えば、米国特許第5556762号、同第5750373号、同第4708871号、同第4833092号、同第5223409号、同第5403484号、同第5571689号、同第5663143号;PCT公開第WO84/03506号、及びWO84/03564号;Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984);Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985);Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986);Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987);Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378;Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832;Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624;Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581;Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照)。
TAT結合有機分子とは、ここに記載されるようなTATポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。TAT結合有機分子は既知の方法(例えばPCT公開第WO00/00823及びWO00/39585号参照)を用いて同定され、化学的に合成されうる。TAT結合有機分子は通常、約2000ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約1500、750、500、250又は200ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なTATポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する(例えばPCT公開第WO00/00823及びWO00/39585号参照)。TAT結合有機分子は、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、N置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
TATポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開81/01145を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ADEPTにおいて使用することができる。例えば国際公開88/07378及び米国特許第4975278号を参照されたい。
本発明は、本出願でTATポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のTATポリペプチドをコードするcDNA(部分及び完全長)が同定され単離された。
ここに記載した抗TAT抗体及び完全長天然配列TATポリペプチドに加えて、抗TAT抗体及びTATポリペプチド変異体も調製できると考えられる。抗TAT抗体及びTATポリペプチド変異体は、コード化DNAに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び/又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などの抗TAT抗体の翻訳後プロセス又はTATポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr;Asn;Gln
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらの分類の1つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された(非保存)部位に導入されうる。
抗TAT抗体及びTATポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型には、抗TAT抗体又はTATポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、抗TAT抗体又はTATポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば抗TAT抗体又はTATポリペプチドを、抗TAT抗体の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸を有するエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
以下の説明は、主として、抗TAT抗体及びTATポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより抗TAT抗体及びTATポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて抗TAT抗体及びTATポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい[例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963)参照]。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。抗TAT抗体又はTATポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望する抗TAT抗体又はTATポリペプチドを生成させてもよい。
抗TAT抗体又はTATポリペプチドをコードするDNAは、抗TAT抗体又はTATポリペプチドmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ヒト抗TAT抗体又はTATポリペプチドDNAは、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。また抗TAT抗体又はTATポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動核酸合成)により得ることもできる。
宿主細胞を、ここに記載した抗TAT抗体又はTATポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
抗TAT抗体又はTATポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
本発明の抗TAT抗体又はTATポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国特許再発行第30985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖、及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
抗TAT抗体及びTATポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。抗TAT抗体及びTATポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
本発明に係る抗TAT抗体、TAT結合オリゴペプチド、TAT結合有機分子及び/又はTATポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th 版, Osol, A. 編. [1980])。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Tris、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ポリソルベート等の界面活性剤;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは5−200mg/mlの間、好ましくは10−100mg/mlの間の濃度の抗体で構成される。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
癌におけるTAT発現を定量するために、種々の診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、TATポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学(IHC)によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をIHCアッセイへ供してもよいし、次のようなTATタンパク質染色強度基準と合致させてもよい:
スコア0 - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の10%未満で観察される。
スコア1+ - わずかに/弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の10%を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア2+ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の10%を越えて観察される。
スコア3+ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の10%を越えて観察される。
TATポリペプチド発現に関して0又は1+スコアの腫瘍は、TATが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、2+又は3+スコアの腫瘍はTATが過剰発現していることを特徴としうる。
上述した抗体の産生方法をここで詳細に記載する。
本発明の他の実施態様は、抗TAT発現癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗TAT抗体、オリゴペプチド又は有機分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第2の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
TATポリペプチドをコードする核酸配列(又はそれらの相補鎖)は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAプローブの生成において種々の用途を有している。また、TATコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるTATポリペプチドの調製に有用であり、これらTATポリペプチドは、例えば、ここで記載の抗TAT抗体の調製において用途を見出し得る。
他のヒト腫瘍及び/又は正常ヒト組織に比べて対象となる特定のヒト腫瘍組織において発現が顕著に且つ検出可能に上方制御されるポリペプチド(及びそれをコードする核酸)を同定するために、遺伝子発現情報を含む専有データベース(GeneExpress(登録商標)、Gene Logic Inc.、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を分析した。具体的に言うと、GeneExpress(登録商標)データベースの分析は、Gene Logic Inc.(米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)から入手できるGeneExpress(登録商標)データベースで使用するソフトウエア、またはGeneExpress(登録商標)データベースで使用する、ジェネンテック社で作成され、開発された専有ソフトウエアを用いて行った。分析のポジティブヒットの評価は、例えば、正常基本組織及び/又は正常増殖性組織における組織特異性、腫瘍特異性及び発現レベルなどを含むいくつかの基準に基づく。このmRNAの発現分析を用いて、TAT425ポリペプチドをコードするmRNAが、ヒト前立腺腫瘍及び腎臓腫瘍において、それぞれ対応する正常なヒト前立腺及び腎臓組織に比べて、顕著に、再現可能に、且つ検出可能に過剰発現することが決定された。
このアッセイにおいて、5’ヌクレアーゼアッセイ(例えば、TaqMan(登録商標))及びリアルタイム定量的PCR(例えば、ABI Prizm 7700 配列検出システム(Sequence Detection System)(登録商標))が、他の悪性腫瘍又は正常な非癌性組織と比較して、癌性腫瘍又は腫瘍で著しく過剰発現している遺伝子を見つけるために使用された。5’ヌクレアーゼアッセイ反応は、蛍光PCRに基づく技術であり、リアルタイムで遺伝子発現をモニターするためにTaq DNAポリメラーゼ酵素の5’エキソヌクレアーゼ活性を利用している。二つのオリゴヌクレオチドプライマー(その配列は目的の遺伝子又はEST配列に基づいている)が、PCR反応の典型的なアンプリコンを生成するために使用される。第三のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、2つのPCRプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計されている。プローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素により非拡張可能であり、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識されている。レポーター色素からの任意のレーザー誘起発光は、2つの色素がプローブ上にあるように互いに近接して配置されている場合、消光色素により消光される。PCR増幅反応の間、Taq DNAポリメラーゼ酵素は鋳型に依存した方法でプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアの消光効果を含まない。合成された各新規分子について、1分子のレポーター色素が遊離され、消光していないレポーター色素を検出することが、データの定量的解釈の基礎を提供する。
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のmRNA合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
6.0μl(125mCi)の32P-UTP(Amersham BF 1002,SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥32P-UTPを含む各管に以下の成分を添加した:
2.0μlの5x転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 各10μlの10mM GTP,CTP及びATP+10μlのH2O)
1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRNasin
1.0μlのDNAテンプレート(1μg)
1.0μlのH2O
1.0μlのRNAポメラーゼ(PCR産物についてT3=AS,T7=S,通常)
A.凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC+975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。
スライド当たり1.0x106cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの32P混合物をスライド上のプレハイブリダイゼーション50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
洗浄は、2x10分間、2xSSC、EDTAで室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μl=20μg/ml)。スライドを2x10分間、2xSSCEDTAで室温において洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、Vf=4L)。
ここに開示した様々なDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは添付図に示した核酸(又はその相補鎖)に相補的であるように得られた。
TAT425に関しては、弱から中程度の発現が正常な前立腺上皮に観察されるものの、検査された他の正常組織では発現について陽性を示さなかった。これに対して、64の原発性前立腺癌のうち46が発現について陽性で、14の転移性前立腺癌のうち6が発現について陽性である。
上記の一以上の例で説明したように、腫瘍抗原として同定されている可能性があるTATペプチドを以下のように分析し検証した。発現配列タグ(EST)のDNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を検索し、目的のEST配列をGEPISにより同定した。インシリコにおける遺伝子発現プロファイリング(GEPIS)は、ジェネンテック社で開発された、新しい癌治療の標的に対する目的の遺伝子を特徴付けるバイオインフォマティクスツールである。GEPISは、遺伝子発現プロファイルを決定するための大量のEST配列及びライブラリ情報を利用している。GEPISは、ESTデータベースにおけるその出現数との比例関係に基づいて、遺伝子の発現プロファイルを決定することができ、それはLIFESEQ(登録商標)EST関連のデータベースとジェネンテック専有情報を厳格かつ統計学的に意味のある形で統合することによって動作する。GEPISは非常に具体的な分析課題又は広範なスクリーニング課題の何れかを実施するように構成することができるが、この例では、GEPISは、新規腫瘍抗原を同定しクロス検証するために使用される。初期スクリーニングでは、GEPISは、特定の組織または目的の組織(多くの場合目的の腫瘍組織)での発現に関連するLIFESEQ(登録商標)データベースからのEST配列を同定するために使用される。この初期スクリーニングで同定されたEST配列(又は、初期スクリーニングから取得した複数の関連した重複しているEST配列を整列させることから得られるコンセンサス配列)は、その後、エンコードされたタンパク質中の少なくとも1つの膜貫通ドメインの存在を特定することを意図してスクリーニングに供された。最後に、GEPISは、目的の様々な配列についての完全な組織発現プロファイルを生成するために用いられた。このタイプのスクリーニングのバイオインフォマティクスを使用して、様々なTATペプチド(及びそれらをコードする核酸分子)が、他の癌及び/又は正常な非癌性組織と比較して、特定のタイプの癌又は所定の癌において有意に過剰発現されているものとして同定された。GEPISヒットの評点は、例えば、正常で不可欠な組織及び/又は増殖性組織における、組織特異性、腫瘍特異性及び発現レベルを含むいくつかの基準に基づいている。この分析を使用して、GEPISによって決定されるTAT425は、特定の腫瘍(すなわち、前立腺、腎臓、膵臓)において、その関連する正常組織と比較して、高度な組織発現及び発現の著しい上方制御を証明している。このように、TAT425ポリペプチドは、哺乳動物における癌の診断及び治療のための優れた標的ポリペプチドである。
この実施例は、TAT425に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
ハイブリドーマ細胞は、TATに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。TATに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
TAT425に対する抗体を上述のように調製し、以下のように、商業的に入手されたM4I−80ラット抗TAT425モノクローナル抗体を用いて免疫組織化学分析を行った。まず組織切片をアセトン/エタノール(凍結又はパラフィン包埋)中で5分間固定した。次いで組織切片をPBSで洗浄し、その後アビジン及びビオチン(Vector Kit)でそれぞれ10分間遮断した後、PBSで洗浄した。次いで切片を10%の血清で20分間遮断し、その後ブロッティングにより過剰量を取り除いた。その後切片に10μg/mlの濃度で1時間にわたり一次抗体を添加し、その後PBSで洗浄した。次いでビオチン標識した二次抗体(抗一次抗体)を30分間にわたって切片に添加し、その後切片をPBSで洗浄した。次に切片をVector ABCキットの試薬に30分間曝し、その後PBSで洗浄した。さらに切片をジアミノベンジジン(Pierce)に5分間曝し、その後PBSで洗浄した。次いでMayersのヘマトキシリンを用いて切片を対比染色し、カバーガラスで覆って可視化した。また、Sambrook等、Molecular Cloninng: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989及びAusubel等、Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley及びSons (1997)に記載のようにして、免疫組織化学分析を行うこともできる。
記載されたモノクローナル抗体が結合するTAT425エピトープは、標準的な競合的結合分析によって決定することができる(Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990))。クロスブロッキング研究は、蛍光を定量するPANDEXTM Screen Machineを用いて、TAT425を発現するように操作されたインタクトなPC3細胞における直接的な蛍光によって抗体において行うことができる。各モノクローナル抗体は、確立された手順を用いて、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)とコンジュゲートされる(Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980))。TAT42を発現するPC3細胞のコンフルエントな単層をトリプシン処理し、一回洗浄し、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%アジ化ナトリウムを含有する冷PBS中に1.75×106細胞/mlで再懸濁した。最終濃度1%のラテックス粒子(IDC,Portland,OR)が、PANDEXTMプレート膜の目詰まりを低減するために加えられた。懸濁液中の細胞の20μl、精製したモノクローナル抗体(100μg/ml〜0.1μg/ml)の20μlをPANDEXTMプレートウェルに添加し、氷上で30分間インキュベートする。20μlのFITC標識モノクローナル抗体の所定希釈液が各ウェルに添加され、30分間インキュベートし、洗浄し、蛍光をPANDEXTM Screen Machineにより定量化する。モノクローナル抗体は、同じ抗体濃度での無関係なモノクローナル抗体コントロールと比較した場合、各々が他の結合を40%以上ブロックするならば、一つのエピトープを共有することが考えられる。このアッセイを使用して、当業者は、上記のものと同じエピトープに結合する他のモノクローナル抗体を同定することができる。欠失分析はまた、配列番号2の抗原エピトープとして示されるポリペプチド配列内のおよその位置を同定するために行われ得る。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺すか又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)、つまり免疫複合体を用いると(Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;米国特許第4975278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら、(1986) Lancet (Mar. 15, 1986):pp603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ADCを設定して精製するために、モノクローナル抗体(mAb)の選択性並びに薬剤結合特性及び薬剤放出特性に注目した。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共に、この方策に有用であるとして報告されている(Rowland等、(1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等、(1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許第1391213号;Liu等、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928;Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が含まれる。
Ab−(L−D)p
を有するADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:(1)共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2)共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
TAT425二重特異性抗体、具体的には抗CD3/TAT425二重特異性抗体の構築を以下に記述する。
対象のTAT425ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、標準的な発現ベクター及びクローニング法を使用して得る。あるいは、対象のTAT425ポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞株は例えばATCCから公的に入手可能であり、標準的なELISA又はFACS分析法を使用して常套的に同定することができる。ついで抗TAT425ポリペプチドモノクローナル抗体(及びその毒素コンジュゲート誘導体)をアッセイで用いて、TAT425ポリペプチド発現細胞を死滅させるインビトロでの抗体の能力を定量することができる。
以下の方法は、TATをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち哺乳類における腫瘍の存在を診断するための使用を記載する。
この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるTATの非グリコシル化形態の調製を例証する。
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるTATの潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。
以下の方法は、酵母中でのTATの組換え発現を記述する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのTATの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。TATをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してTATの細胞内発現を指示する。分泌のために、TATをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然TATシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)TATの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるTATの組換え発現を示す。
TATをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Novagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に述べると、TATコード化配列,又はTATのコード化配列の所望する部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
天然又は組換えTATポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-TATポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-TATポリペプチドは、対象のTATポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗TATポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
Claims (46)
- (a)配列番号10−12の何れか一のCDR−L1配列、
(b)配列番号13−15の何れか一のCDR−L2配列、
(c)配列番号16−18の何れか一のCDR−L3配列、
(d)配列番号19−22の何れか一のCDR−H1配列、
(e)配列番号23−26の何れか一のCDR−H2配列、及び
(f)配列番号27−30の何れか一のCDR−H3配列
からなる群より選択された少なくとも一のCDR配列を含んでなる単離された抗体。 - 抗体断片である請求項1に記載の抗体。
- キメラ又はヒト化抗体である請求項1に記載の抗体。
- 二重特異性抗体である請求項1に記載の抗体。
- T細胞の表面に発現されるタンパク質に結合する請求項4に記載の抗体。
- T細胞の表面に発現されるタンパク質がCD3である請求項5に記載の抗体。
- 増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項1に記載の抗体。
- 細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項1に記載の抗体。
- 細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群より選択される、請求項8に記載の抗体。
- 細胞障害性剤が毒素である、請求項8に記載の抗体。
- 毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項10に記載の抗体。
- 毒素がメイタンシノイドである、請求項10に記載の抗体。
- 細菌中で生成される、請求項1に記載の抗体。
- CHO細胞中で生成される、請求項1に記載の抗体。
- 結合する細胞の死を誘発する、請求項1に記載の抗体。
- 前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項15に記載の抗体。
- 検出可能に標識される、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号3−5に示される何れかのVL配列を含む単離された抗体。
- 配列番号6−9に示される何れかのVH配列を含む単離された抗体。
- 配列番号3のVL配列及び配列番号6のVH配列を含む単離された抗体。
- 配列番号3のVL配列及び配列番号7のVH配列を含む単離された抗体。
- 配列番号4のVL配列及び配列番号8のVH配列を含む単離された抗体。
- 配列番号5のVL配列及び配列番号9のVH配列を含む単離された抗体。
- 請求項1に記載の抗体を生成する細胞。
- 請求項1に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項1に記載の抗体である第二の抗体が結合するTAT425抗原性エピトープに結合する第一の抗体を同定する方法であって、該方法が、該第二の抗体のTAT425ポリペプチドへの結合を遮断する該第一の抗体の能力を決定することを含み、該第二の抗体の該TAT425ポリペプチドへの結合を遮断する該第一の抗体の能力が、等しい抗体濃度で少なくとも40%であった場合に、該第二の抗体が結合するエピトープへ該第一の抗体が結合することができることを示す方法。
- TAT425ポリペプチドを発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞に、請求項1に記載の抗体を接触させることを含み、該抗体の該TAT425ポリペプチドへの結合が、該細胞の増殖の阻害を引き起こす方法。
- 前記TAT425ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項27に記載の方法。
- TAT425ポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該方法が、該哺乳動物に対して、請求項1に記載の抗体の治療的有効量を投与することにより、該哺乳動物を効果的に処置することを含む方法。
- 前記TAT425ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項30に記載の方法。
- TAT425タンパク質を含むと疑われる試料中における該TAT425タンパク質の存在を決定する方法であって、該方法が、請求項1に記載の抗体に該試料を曝露し、該試料中において該タンパク質に対する該抗体の結合を決定することを含み、該タンパク質への抗体の結合が、該試料中における該タンパク質の存在を示す方法。
- 前記試料が、前記タンパク質を発現すると疑われる細胞を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項34に記載の方法。
- 前記抗体が検出可能に標識される、請求項33に記載の方法。
- 哺乳動物において腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法が、該哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料、及び同じ組織起源の既知の正常細胞のコントロール試料における、TAT425ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを決定することを含み、コントロール試料と比較して試験試料における該TAT425ポリペプチドの発現レベルが高い場合に、試験試料を採取した哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。
- 前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを決定する工程が、インサイツハイブリダイゼーション又はRT−PCR分析においてオリゴヌクレオチドを使用することを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを決定する工程が、免疫組織化学分析又はウエスタンブロット分析において抗体を使用することを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記腫瘍が前立腺腫瘍である、請求項37に記載の方法。
- 前記TAT211ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項37に記載の方法。
- 哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法が、該哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料を請求項1に記載の抗体と接触させ、試験試料中での該抗体とTAT425タンパク質との複合体の形成を検出することを含み、複合体の形成が、該哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。
- 前記組織細胞からなる試験試料が、癌性腫瘍を有すると疑われる個体から得られる、請求項42に記載の方法。
- 前記癌性腫瘍が前立腺腫瘍である、請求項43に記載の方法。
- 前記TAT425タンパク質が配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項42に記載の方法。
- 2E4.6.1、4D11.17.2、13H2.28.2、及び14E7.17.1からなる群から選択される抗体が結合するのと同じTAT425エピトープに結合する抗体。
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