JPH09510009A - 合成ペプチドを用いるｈｔｌｖ−ｉおよびｈｔｌｖ−ｉｉの識別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を含有する血清をＨＴＬＶ−IIに対する抗体を含有する血清から識別する方法を、その識別のためのペプチドと一緒に開示する。これらペプチドを含有する製造物品も提供され、これら物品はＨＴＬＶ−II感染血清からＨＴＬＶ−Ｉ感染血清を識別することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 合成ペプチドを用いるＨＴＬＶ−Ｉおよび ＨＴＬＶ−IIの識別 発明の背景 本発明は一般に試験試料におけるヒトＴ−細胞リンパ栄養性ウィルスＩおよび II型（ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−II）に対する抗体の検出方法に関し、より 詳細にはそれぞれＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIに対し特異性の合成ペプチド 、並びにＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIに対する抗体を識別検出することによ り、ＨＴＬＶ−Ｉ感染およびＨＴＬＶ−II感染の識別診断を可能にするのに有用 な方法に関するものである。 ＨＴＬＶ−Ｉはヒトにて病気を発生することが知られているのに対し、ＨＴＬ Ｖ−IIは明瞭には病気と関連しない。疫学的データは、ＨＴＬＶ−Ｉにつき血清 陽性と確認された米国の献血者の約５０％が実はＨＴＬＶ−IIで感染されている ことを示す［リー等、未公開見解］。したがって、適する献血者に告知およびカ ウンセリングするに際し、２種のウィルスを識別しうることに重要なニーズが存 在する。 ＨＴＬＶ−Ｉ感染をスクリーニングする現在の免疫分析は、 ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を検出すると共に、より低い程度であるがＨＴＬＶ− IIに対する抗体をも検出する。ＥＩＡよりも特異性である、たとえばウエスタン ・ブロット（ＷＢ）および放射免疫沈澱分析（ＲＩＰＡ）のような血清学的方法 は、これら２種のウィルスを識別しえない。 今日まで、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIとの識別は、たとえばプロウィルスの 制限地図作成もしくはＤＮＡ配列決定のような分子遺伝学技術を用いて、または ＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ−IIに関する特異的プライマーを用いるポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってのみ達成しうる。これら方法は試験すべき患者 からのリンパ腫の使用を必要とし、血清もしくは血漿試験試料よりも明らかに収 集および貯蔵が不便である。したがって、これら技術は時間がかかり、高価であ り、特殊な施設を必要とし、さらに容易には自動化されないという点で有用性に 制限がある。 ヨシダに係る米国特許第４，５２５，３００号および第４，８０４，４７６号 は、ヒト白血病ウィルス関連ペプチドに対する抗体の作成方法を教示している。 開示された抗体はヒト白血病ウィルスに結合することができる。 パルカー等、ジャーナル・イミュノロジー、第１３５（１）巻、第２４７〜２ ５４頁（１９８５）は、ｐ１９ｇａｇ内部コア蛋白質の各部分を示す合成ペプチ ドに対し発生したＨＴＬＶ−Ｉと反応するモノクローナル抗体の作成につき報告 している。或る種の発生したクローンはＨＴＬＶ−Ｉウィルス分離物に結合する がＨＴＬＶ−IIには結合しないと報告されている。 １９８６年３月２７日付け公開のスラモンに係るＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８５ ／０１８０３号は、試料における抗体ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIの検出方 法を教示しており、これは試料をＨＴＬＶゲノムから得られ固体支持体に固定化 された合成もしくはクローン化ポリペプチドおよび蛋白質と共に培養して行われ る。その教示はＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIを識別診断する方法を含み、こ れは蛋白質の免疫沈澱に続くたとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のような方法に よる分子量測定を必要とする。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は容易 には自動化されず、或いは日常の実験室使用に適する形態に変換することができ ない。 ウーに係る米国特許第４，６８９，３９８号はＨＴＬＶゲノム配列から得られ る他の合成ペプチドの群を教示しており、こ れらを用いて試験試料におけるＨＴＬＶに対し特異性の抗体を検出することがで きる。 １９８８年５月１８日付け公開のマサノリに係るヨーロッパ特許出願第０ ２ ６７ ６２２号は、固相に固定化された融合ＨＴＬＶ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝 子蛋白質を含む装置を教示しており、これを用いて試料におけるこれら蛋白質に 対する抗体を検出することができる。しかしながら、この装置はＨＴＬＶ−Ｉに 対する抗体とＨＴＬＶ−IIに対する抗体とを識別することができない。 パルカー等、ジャーナル・イミュノロジー、第１４２巻、第９７１〜９７８頁 （１９８９）は、ＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６およびｇｐ２１ ｅｎｖ蛋白質の免疫原 性領域の地図作成、並びに特異性モノクローナル抗体の生成に有用であるペプチ ドの合成につき報告している。これらペプチドは、ＨＴＬＶに対する抗体を検出 すべく免疫分析にて使用することができる。さらに、この報告はＨＴＬＶ−Ｉお よびＨＴＬＶ−IIにより共有されないｇｐ４６蛋白質の領域の存在を示唆するが 同定しておらず、したがって２種のウィルスに対する抗体を識別検出すべく使用 することができない。 １９８９年９月２１日付け公開のバールネ等に係るＰＣＴ特許公開ＷＯ８９／ ０８６６４（ＰＣＴ／ＳＥ８９／００１２６）は、ＨＴＬＶ−Ｉゲノムのｅｎｖ 領域から得られた他の合成ペプチドにつき教示しており、これらをＨＴＬＶ−Ｉ ウィルスに対する抗体の検出に使用することができる。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗 体とＨＴＬＶ−IIに対する抗体との識別については記載されていない。 １９９０年７月２６日付け公開のユナイテッド・バイオメジカル社に係るＰＣ Ｔ特許公開ＷＯ９０／０８１６２号は、ＨＴＬＶ−Ｉ反応性抗体の検出およびＡ ＴＬ（成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）の診断のための合成ペプチドを記載してい る。これらペプチドはＨＴＬＶ−Ｉの外被蛋白質における膜内外（ｐ２１ｅ）部 分および外部（ｇｐ４６）部分から得られる。さらに、これらペプチドを用いる 免疫分析についても記載されている。記載されたペプチドはシンスＥＩＡ（登録 商標）［オリンパス社、レイク・サクセス、ＮＹ］にてＨＴＬＶ−Ｉにつき使用 される。 １９９０年３月５日付け公開のブロンベルクに係るＰＣＴ特許公開ＷＯ９０／ １０２３１号は、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬ Ｖ−IIに対する各抗体を識別検出する方法を教示しており、これにはＨＴＬＶ− ＩおよびＨＴＬＶ−IIのｇａｇおよびｅｎｖ領域から得られた合成ペプチドに対 するこれら抗体の結合を検出する。記載された方法は各試料につき少なくとも４ 回の免疫分析の実施を必要とし、したがって多数の試料を日常的にスクリーニン グするには不便である。ブロンベルクの公開公報に開示されたペプチドは顕著な 交差反応性をも示す。ブロンベルクは、全ての結果を集積してＨＴＬＶ−ＩとＨ ＴＬＶ−IIとを識別する各ペプチドの相対的能力に従い吸光度と重量とを積算し て感染血清の識別性を向上させた。次いで加重吸光度をコンピュータプログラム に入力して、それぞれＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ−IIにつき「点数」を計算 した。ブロンベルクによれば、この血清分類技術を用いたとき間違った分類結果 はなかったが、少数のものが「分類しえない」と判明した。 １９９０年１２月２７日付け公開のバールネ等に係るＰＣＴ特許公開ＷＯ９０ ／１５８２０は、ＨＴＬＶ−Ｉ特異性抗体に対し免疫学的に反応するペプチドお よび開示されたペプチドから得られる抗体を記載している。これらペプチドの数 種はＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染とを区別することができる。 最近、Ｒ．Ｂ．ラル等は合成ペプチドを使用するＨＴＬＶ−IIからのＨＴＬＶ −Ｉの血清学的識別につき記載しており、これを用いてＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ −IIとを識別する［Ｒ．Ｂ．ラル等、ジャーナル・インフェクシャス・ディジー ズ、第１６３巻、第４１〜４６頁（１９９１年１月）］。特に、ＨＴＬＶ−Ｉ「 Ｅｎｖ−５」（アミノ酸２４２〜２５７）はＨＴＬＶ−Ｉの免疫優性領域を示し 、さらにＥＮＶ−５に基づくＥＬＩＳＡはＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIとの区別 を可能にしたと報告されている。この最近の論文および識別につき記載した２種 の特許出願［バールネ、ＷＯ９０／１５８２０号およびブロンベルグ、ＷＯ９０ ／１０２３１号］を例外として、上記の開示された技術は全てＨＴＬＶ−Ｉおよ びＨＴＬＶ−IIに対する特異性抗体の検出を目的とする。しかしながら、現在ま でＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体とＨＴＬＶ−IIに対する抗体とを効果的に検出する と共に識別する簡単な方法を提供する詳細な方法については記載がない。ＨＴＬ Ｖ−Ｉに対する抗体とＨＴＬＶ−IIに対する抗体とを検出および識別するには、 これら２種のウィルスに対する独特な抗原決定子を同定せねばならない。蛋白質 に対する抗原決定子は、ホップおよびウッズの方 法［プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７８ 巻、第３８２４頁（１９８１）］を用いる親水性領域の同定、並びにカープルス およびシュルツの方法［ナチュールビッセンシャフテン、第７２巻、第２１２〜 ２１３頁（１９８５）］を用いる柔軟性領域の同定により予測されていた。抗原 決定子は蛋白質配列の親水性領域および柔軟性領域に位置すると思われる。さら に、抗原決定子は蛋白質分解またはインビトロ合成により産生されたペプチドの 免疫学的検査により実験的にも同定されている。 ＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ−IIからのペプチド配列を用いてＨＴＬＶ−Ｉ 感染とＨＴＬＶ−II感染とを識別する従来技術の方法は、ＨＴＬＶ−Ｉ由来のペ プチドがＨＴＬＶ−II感染した血清に対し交差反応性であると共に、ＨＴＬＶ− II由来のペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ感染した血清に対し交差反応性であるという問 題を有する。さらに従来技術の方法は血清における抗体の検出に関し重大な感度 の問題を示している。本発明者等は、ペプチドに対するアミノ酸の付加もしくは 欠失が、抗体に対するその結合能力に顕著な影響を及ぼすと考える。その結果、 ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIの独特な免疫優性領域からの ペプチド長さを変化させて分析の性能を顕著に向上させることができる。従来未 知とされていた抗原領域および既知の抗原領域であると思われた領域を調査する と共に系統的に解析して、顕著な抗原エピトープを示すペプチド配列を同定し、 これらはＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIごとに株特異性であると共に相互に僅かな 交差反応性しか示さない。発明の要点 本発明の目的は、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIとを識別するための優秀なペプ チド分析を与えることにある。 さらに本発明の目的は、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIとの間で向上した選択性 およびしたがって減少した交差反応性を有するペプチドを用い、ＨＴＬＶ−Ｉと ＨＴＬＶ−IIとを識別するための分析を与えることにある。 本発明の他の目的は、血清における抗体を検出するための優秀な感度を示すＨ ＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIとを識別する分析を与えることにある。 さらに本発明の他の目的は、病気の一層詳細な診断、したがって一層適切な患 者のカウンセリングおよび処置を可能にする医者の有用な手段となる方法を提供 することにある。 さらに本発明の目的は、容易に日常的な実験室使用を可能とすると共に敏感か つ特異的結果をもたらす簡単かつ再現性のあるＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−II 識別分析を与えることにある。 ＨＴＬＶ−Ｉ合成ペプチドに関する本発明によるアミノ酸配列は、セイキ等、 プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、 第３６１８〜３６２２頁（１９８３）により公表された予想アミノ酸配列から得 られた。ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドは次のものを包含する： ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ−１（配列番号１）、ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ−２（配列番号 ２）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ−３（配列番号３）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ−４（ 配列番号４）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ−５（配列番号５）およびＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ −６（配列番号６）。さらにＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドはＨＴ ＬＶ−Ｉ ｇａｇ−１（配列番号７）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−２（配列番号８ ）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−３（配列番号９）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−５（配 列番号１０）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−６（配列番号１１）およびＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−７（配列番号１２）をも包含する。 ＨＴＬＶ−II合成ペプチドに関する本発明によるアミノ酸配列は、２種のＨＴ ＬＶ−II基本型の予想アミノ酸配列から得られた。Ｍｏ ＨＴＬＶ−IIのアミノ 酸配列はシモトーノ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン ス、ＵＳＡ、第８２巻、第３１０１〜３１０５頁（１９８５）により公表された 。ＮＲＡ ＨＴＬＶ−II基本型の配列は未公開のデータである。ＨＴＬＶ−IIに 対し特異性のペプチドは次のものを包含する：ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−１（配列 番号１３）、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−１Ａ（配列番号１４）、ＨＴＬＶ−IIｅｎ ｖ −２（配列番号１５）、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−２Ａ（配列番号１６）、ＨＴ ＬＶ−II ｅｎｖ−３（配列番号１７）、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−４（配列番号 １８）、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−５（配列番号１９）、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ− ５Ａ（配列番号２０）、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−６（配列番号２１）およびＨＴ ＬＶ−II ｅｎｖ−８（配列番号２２）。ＨＴＬＶ−IIに対し特異性のペプチド はさらにＨＴＬＶ−II ｇａｇ−２（配列番号２３）、ＨＴＬＶ−II ｇａｇ− ３（配列番号２４）およびＨＴＬＶ−II ｇａｇ−４（配列番号２５）をも包含 する。ペプチドＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−１Ａ、ＨＴＬＶ− II ｅｎｖ−２ＡおよびＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−５ＡはＮＲＡ配列である。他の 残余のＨＴＬＶ−II配列は全てＭｏ配列である。 本発明によれば、試験試料におけるＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体をＨＴＬＶ−II に対する抗体から識別する方法が提供され、この方法は試験試料をＨＴＬＶ−Ｉ に対し特異性の少なくとも１種のペプチドと接触させて混合物を形成させ、ＨＴ ＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドを配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列 番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列 番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択し；この混合物 を抗原／抗体の複合体が形成するのに充分な時間および条件にて培養し；複合体 を抗−ヒトＩｇＧ抗体に接合させたシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させ て第２混合物を形成させ；この第２混合物を抗原／抗体／抗体の複合体が形成す るのに充分な時間および条件にて培養し；さらに測定対象のシグナル発生化合物 を検出することによりＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の存在を判定することからなっ ている。 本発明の他の具体例においては、試験試料にてＨＴＬＶ−Ｉ に対する抗体をＨＴＬＶ−IIに対する抗体から識別して判定する方法が提供され 、この方法は試験試料におけるＨＴＬＶ−IIに対する抗体の存在を判定し、これ には試験試料を配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配 列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列 番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５よりなる群から選択 されるＨＴＬＶ−IIに対し特異性の少なくとも１種のペプチドと接触させて混合 物を形成させ；この混合物を抗原／抗体の複合体が形成するのに充分な時間およ び条件にて培養し；複合体を抗−ヒトＩｇＧ抗体に接合させたシグナル発生化合 物を含む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ；この第２混合物を抗原／抗 体／抗体の複合体が形成するのに充分な時間および条件にて培養し；さらに測定 対象のシグナルを検出することによりＨＴＬＶ−IIに対する抗体の存在を判定す る。 本発明の好適具体例においては第１および第２の分析を上記したように行うが 、第１分析は試験試料を本発明によりＨＴＬＶ−Ｉからのペプチドと接触させる ことからなり、第２分析は試験試料を本発明によりＨＴＬＶ−IIからのペプチド と接触さ せることからなっている。 本発明のさらに好適な具体例は前記試験試料を第１分析にて配列番号１と接触 させると共に、前記試験試料を第２分析にて配列番号１５もしくは１６の１つと 接触させることからなっている。 最も好適な本発明による方法は上記２種の分析を行うことによるＨＴＬＶ−Ｉ およびＨＴＬＶ−II感染血清の識別を与え、第１分析は試験試料を第１ペプチド が配列番号１、２および６よりなる群から選択されると共に第２ペプチドが配列 番号３、４および５よりなる群から選択されるＨＴＬＶ−Ｉから得られた２種の ペプチドと同時に接触させることからなっている。第２分析は試験試料を第１ペ プチドが配列番号１３、１４、１５および１６よりなる群から選択されると共に 第２ペプチドが配列番号２２であるＨＴＬＶ−IIから得られた２種のペプチドと 同時に接触させることからなっている。両分析からの結果を解析して、ＨＴＬＶ −ＩおよびＨＴＬＶ−IIに対する各抗体につき試験試料の反応パターンを判定し てＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染とを区別する。 さらに本発明は、固相に結合させたＨＴＬＶ−Ｉに対し特異 性の本発明のペプチドを含む第１容器と、固相に接合させたＨＴＬＶ−IIに対し 特異性の本発明のペプチドを含む第２容器とを備え、包装材料が前記容器にラベ ルを備えて、ＨＴＬＶ−Ｉで感染した血清をＨＴＬＶ−IIで感染した血清から識 別すべく内容物を使用しうることを示すことを特徴とする包装材料を含む製品を も提供する。 本発明は、他の目的およびそれに付随する利点と共に以下の説明、実施例およ び表を参照して最も良く理解されるであろう。しかしながら、本発明はこれらの みに限定されない。発明の詳細な説明 本発明は、新規かつ独特なここに開示する合成ペプチドに対する抗体の結合を 検出することによるＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ−IIとに対する抗体の検出方 法を提供する。 本発明は、これらウィルスに対する抗体を含有した血清を検出すると共に両者 を識別するための分析にて有用である、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIの領域 における新規かつ独特なペプチド配列を同定する。これらの目的で、ＨＴＬＶ− Ｉに対し特異性であってＨＴＬＶ−IIに対する抗体を持った血清には顕著に交差 反応しないような、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖおよびｇａｇ の数種の抗原領域での独特なペプチド配列が与えられる。ＨＴＬＶ−Ｉ合 成ペプチドのアミノ酸配列は、セイキ等、プロシーディング・ナショナル・アカ デミー・サイエンス、ＵＳＡ、 第８０巻、第３６１８〜３６２２頁（１９８３） により公表された推定アミノ酸配列から得られた。 さらに本発明は、ＨＴＬＶ−IIに対し特異性であるがＨＴＬＶ−Ｉに対する抗 体を持った血清とは交差反応しないような、ＨＴＬＶ−II ｇｐ４６ ｅｎｖお よびｇａｇにおける新規かつ独特なペプチド配列を同定する。ＨＴＬＶ−II合成 ペプチドのアミノ酸配列は２種のＨＴＬＶ−II基本型、すなわちＭｏおよびＮＲ Ａの推定アミノ酸配列から得られた。Ｍｏ ＨＴＬＶ−II基本型のアミノ酸配列 はシモトウノ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、Ｕ ＳＡ、 第８２巻、第３１０１〜３１０５頁（１９８５）により公表された。ＮＲ Ａ ＨＴＬＶ−II基本型の配列は未公表データであって、本出願人およびカリホ ルニア大学評議会に譲渡された、係属中の１９９３年７月１日付け米国特許出願 第０８／０８６，４１５号に含まれる。 一般に本発明の方法は、試験試料を少なくとも１種のＨＴＬ Ｖ−Ｉもしくは少なくとも１種のＨＴＬＶ−IIペプチドが結合された固相と接触 させて混合物を形成させることを含む。この混合物を抗原／抗体の複合体が形成 するのに充分な時間および条件にて培養する。次いで、複合体をシグナル発生化 合物に接合された抗−ヒト抗体を含む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ る。この第２混合物を、抗原／抗体／抗体の複合体を形成させるのに充分な時間 および条件にて培養する。発生した測定可能なシグナルを検出することにより固 定化抗体の存在を判定する。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体およびＨＴＬＶ−IIに対 する抗体につき別々に試験試料を検査して、これら２種のウィルスによる各感染 を識別するための効果的方法を可能にする。 「固相」は臨界的でなく、不当な実験を要することなく当業者により選択しう る任意各種の物質とすることができる。「固相」という用語は広義に使用され、 不溶性であるか或いはその後の反応により不溶性にしうる任意の物質を意味する 。すなわち多孔質もしくは非孔質の各物質、ラテックスもしくはポリスチレン粒 子、微粒子、ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウエルの壁 部およびタンニン処理ヒツジ赤血球は、全て適する例である。固相の寸法、構造 および形状は本発 明の方法にて一般に臨界的でない。しかしながら、好ましくは本発明は、ＨＴＬ Ｖ−Ｉにつき特異性の２種以上のペプチドまたはＨＴＬＶ−IIに対し特異性の２ 種以上のペプチドを固相に固定化させる場合は、微粒子の使用を想定する。 固相にペプチドを固定化するのに適する方法は、イオン性、疎水性、共有性の 各相互反応などを包含する。当業者は、有用な固相の使用に関し用いうる方法の 範囲を認識するであろう。当業界で知られた結合剤を用いて、固相に対するペプ チドの接合を確保することができる。結合剤は、ペプチドを添加する前に固相の １部として混入することができ或いは固相に誘導化させることもできる。 「試験試料」という用語はヒトおよび動物の体液の試料、たとえば血清、血漿 、腹液、尿、脳髄液またはその他任意の身体成分、或いは問題とする抗体を含有 しうる任意の組織培養上澄液とすることができる。 適する「指示薬」は、試験試料から得られた抗体につき特異的な結合員子に結 合（接合）された、外部手段により検出しうる測定可能なシグナルを発生するこ とのできるシグナル発生化合物（標識）とすることができる。試験試料由来の抗 体に対し 特異的な結合対の抗体員子である場合のほか、指示薬は任意特定の結合対の員子 でもあり、たとえばビオチンもしくは抗−ビオチン、アビジンもしくはビオチン 、炭水化物もしくはレクチン、相補性ヌクレオチド配列、イフェクタもしくは受 容体分子、酵素補因子および酵素、酵素抑制剤もしくは酵素などいずれかのハプ テン／抗−ハプテンを包含する。 考えられる各種の「シグナル発生化合物」（標識）は発色源、たとえば酵素の ような触媒、たとえばフルオレセンおよびローダミンのような発光性化合物、化 学発光性化合物、放射性元素および直接可視標識を包含する。酵素の例はアルカ リホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどを 包含する。特定標識の選択は臨界的でないが、それ自身で或いは１種もしくはそ れ以上の追加物質と組合わされてシグナルを発生しうるものである。 反応混合物は、ＨＴＬＶ抗原／抗体の複合体が形成するのに充分な時間および 条件にて培養される。培養の適する時間、温度および他の条件の選択は当業者に 周知されている。 下記する説明および実施例で用いる方法は、たとえばマニアチス等、モレキュ ラ・クローニング、ラボラトリー・マニュア ル、 コールド・スプリング・ハーバー（１９８２）に記載されたような、当業界 で知られた標準的分学遺伝学技術により行った。本発明の１具体例においては、 ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体に特異性である本発明の合成ペプチドを、ポリスチレ ンビーズに固定化させる。次いで、このビーズをヒト血清、血漿もしくは他の体 液の希釈試験試料と共に培養し、さらに抗体がビーズ上の固定化ペプチドに対し 特異的に結合する条件下で適する時間にわたり培養する。次いでビーズを洗浄し て、存在しうる未結合の蛋白質を除去する。次いで第２の培養を行い、ビーズを 適するシグナル発生化合物で標識された抗−ヒト抗体を含む指示薬と共に培養す る。適する検出系により、ビーズ上に固定化された標識抗−ヒト抗体複合体の量 を検出可能なシグナルの測定により測定することができる。かくして、試験試料 におけるＨＴＬＶ−Ｉに対する特異的抗体の存在が判定される。次いで上記した ように免疫分析を反復するが、ただしＨＴＬＶ−IIに対する抗体に特異性である 本発明による合成ペプチドを固相に固定化させる。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体お よびＨＴＬＶ−IIに対する抗体に関する試験試料の反応パターンを比較して、こ れら２種のウィルスによる感染を識別することができる。 他の具体例においては、ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の本発明による合成ペプチ ドをポリスチレンビーズに固定化させる。次いでビーズを試験試料または希釈試 験試料および抗−ヒトＩｇＧに接合させたシグナル発生化合物を含む適する指示 薬と共に、抗体をビーズ上の固定化ペプチドに対し特異的にかつ指示薬に対し同 時的に結合させうる条件下で適する時間にわたり培養する。ビーズ上に固定化さ れた標識抗−ヒト抗体複合体の量は、発生した測定可能なシグナルを検出して測 定することができる。かくして、試験試料におけるＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の 存在を１回の培養により判定することができる。次いで免疫分析を上記したよう に反復するが、ＨＴＬＶ−IIに対し特異性である本発明による合成ペプチドを用 いる。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体およびＨＴＬＶ−IIに対する抗体に関する試験 試料の反応パターンを比較することにより、これら２種のウィルスによる各感染 の識別を可能にする。 さらに他の具体例においては、ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体に特異性の本発明に よる合成ペプチドの少なくとも１種またはＨＴＬＶ−IIに対する抗体に特異性の 本発明による合成ペプチドの少なくとも１種を、ニトロセルロース膜に固定化さ せる。 さらにペプチドそれ自身、他のペプチドまたはたとえばＢＳＡ、鍵穴リンペット ヘモシアニン、卵アルブミンなどの各種のキャリヤ蛋白質に、ニトロセルロース 膜への固定化前に結合させ或いは架橋させることもできる。試験試料を希釈する と共に膜上で抗原／抗体の複合体が形成するのに充分な時間および条件にて培養 する。次いで膜表面を洗浄して未結合蛋白質を除去し、第２培養にて膜をシグナ ル発生化合物で標識された抗−ヒト抗体を含む指示薬と共に培養する。膜上に固 定化された標識抗−ヒト抗体の量、したがってＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ− IIに対する抗体の存在を、適する検出系で発生した測定可能なシグナルを検出し て判定する。検出系により認識されたシグナルレベルの定量は、試験試料に存在 する特異性抗体の量の定量を可能にする。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体およびＨＴ ＬＶ−IIに対する抗体との試験試料の反応パターンを比較することにより、これ ら２種のウィルスによる各感染の識別を可能にする。 さらに他の具体例においてはサンドイッチ分析を用いる。この方法は、試験試 料を少なくとも１種のＨＴＬＶ−Ｉペプチドもしくは少なくとも１種のＨＴＬＶ −IIペプチドが結合された固相と接触させて混合物を形成させることを含む。こ の混合物 を、抗原／抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および条件にて培養する。 次いで複合体をシグナル発生化合物が結合された抗原と接触させて第２混合物を 形成させる。この第２混合物を培養すると共に、抗原／抗体／抗原の複合体の存 在を発生した測定可能なシグナルの検出により判定する。ＨＴＬＶ−Ｉに対する 抗体およびＨＴＬＶ−IIに対する抗体につき試験試料の反応パターンを比較して 、これら２種のウィルスによる各感染を識別することができる。 さらに他の具体例においては、ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の本発明による２種 のペプチドの組合せ物を、たとえばポリスチレンビーズに対する固定化により単 一の固体支持体に同時被覆する。これらペプチドの同時被覆の手順は、上記した および後記の実施例に記載する単一ペプチドの被覆と実質的に同じである。要約 すれば、各ペプチドを個々に保存溶液に適する濃度で溶解する。次いで２種のペ プチドの一部をビーズ用の被覆溶液に一緒に添加する。好ましくは２種のペプチ ドを等しい濃度で添加するが、各ペプチドごとに異なる比率も使用することがで きる。次いで被覆されたビーズを上記方法による免疫分析で使用する。次いで、 この手順をＨＴＬＶ−IIに対し特異性である 本発明による同時被覆された２種のペプチドを有するビーズで反復する。ＨＴＬ Ｖ−Ｉに対する抗体およびＨＴＬＶ−IIに対する抗体の試験試料への反応パター ンを比較して、これら２種のウィルスによる各感染を識別することができる。 好適具体例は、ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の２種のペプチドまたはＨＴＬＶ− IIに対し特異性の２種のペプチドを使用して微粒子固相に結合させることを含む 。好ましくは微粒子ＥＩＡ（ＭＥＩＡ）をポリスチレン微粒子を用いて行う。こ れら粒子の寸法は好ましくは０．１９〜５μｍである。蛋白質は粒子上に受動的 または積極的に結合させることができる。受動被覆はペプチドと微粒子との間の 非共有結合もしくは接合を意味する。受動被覆の例は、ペプチドを無菌水により 保存溶液に溶解させることを含む。次いでペプチドを適する被覆緩衝液で所望最 終被覆濃度の２倍に希釈させる。微粒子を洗浄すると共に緩衝塩被覆溶液に再懸 濁する。微粒子とペプチドとの溶液を等比率で混合し、適する温度および時間に て培養する。被覆過程の終了後、被覆された微粒子を遠心分離により分離し、洗 浄し、次いで微粒子希釈剤に再懸濁させる。微粒子の性質に応じ、ペプチドは静 電相互作用などにより微粒子に結合するようになる。 積極被覆は、ペプチドと固体支持体との間で共有結合を生成せしめることを意 味する。一般に、この種の共有結合は微粒子の表面における適する官能基に対し 、結合すべきペプチドのカルボキシ末端もしくはアミノ末端により形成される。 かかる官能基を有する微粒子を、誘導化微粒子と称する。誘導化微粒子の例は、 その表面にカルボキシ官能基を有する。次いで、カルボキシ誘導化微粒子を１− エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）で 処理する。次いで微粒子を受動被覆された微粒子の手順と同様に処理するが、た だし溶液のｐＨは４．５とすべきである。ＥＤＡＣをペプチドおよび微粒子と同 時に最終被覆溶液に添加することができ、或いは混合前のペプチドもしくは微粒 子に添加することができる。得られる被覆微粒子は、ペプチドのアミノ末端と微 粒子のカルボキシ基との間の反応により微粒子に結合したペプチドを有する。非 誘導化微粒子と共にＥＤＡＣを使用しても積極被覆が得られる。 ２種のペプチド配列で被覆された微粒子を同じ分析で使用するには、２種の手 法が想定される。第１に、微粒子を同時被覆することができる。同時被覆に際し 、ペプチドを適する濃度で 保存溶液に個々に溶解させ、次いで一緒に添加する。このペプチド混合物に微粒 子を添加する。しかしながら、好ましくは相互に独立して、第１量の微粒子を第 １ペプチド配列により被覆すると共に、第２量の微粒子を第２ペプチド配列によ り被覆する。個々の被覆の後、第１および第２量の被覆微粒子を分析に使用すべ く合する。この好適技術は、実際に微粒子ビーズに存在する各ペプチドの量の定 量を容易化させる。 本発明の方法は、固相が微粒子からなる自動化および半自動化システムを用い る装置で使用するのに適する。この種のシステムは、ここに参考のため引用する それぞれ公開ＥＰＯ出願第０ ４２５ ６３３号および第０ ４２４ ６３４号 に対応する係属中の米国特許出願第４２５，６５１号および第４２５，６４３号 に記載されたシステムを包含する。 各種の他の固相を用いる他の具体例も考えられ、本発明の範囲内である。たと えばいずれも本出願人によるものであって参考のためここに引用する、ＥＰＯ公 開０ ３２６ １００号に対応する同時係属の米国特許出願第１５０，２７８号 およびＥＰＯ公開０ ４０６ ４７３号に対応する米国特許出願第３７５，０２ ９号に記載された、負帯電ポリマーとの固定化し うる反応複合体を固定化するイオン捕獲法を本発明により用いて、迅速溶液相免 疫化学反応を行うことができる。免疫化しうる免疫複合体を、負帯電ポリアニオ ン／免疫複合体と予め処理された正帯電多孔質マトリックスとの間のイオン相互 作用により反応混合物の残部から分離し、本出願人によるものであって参考のた めここに引用するＥＰＯ公開０ ２７３ １１５号に対応する同時係属の米国特 許出願第９２１，９７９号に記載されたような、化学発光シグナル測定を包含す る各種の上記シグナル発生系を用いて検出する。 免疫分析に関する走査型トンネル顕微鏡測定の使用も、本発明の方法を容易に 適合させうる技術である。走査型プローブ顕微鏡測定、特に原子力顕微鏡測定に おいては、捕獲相（たとえば本発明の選択ペプチド）を固相に付着させると共に 、走査型プローブ顕微鏡測定を用いて、固相の表面に存在しうる抗原／抗体の複 合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡測定の使用により、一般には抗原／抗体 の複合体を検出すべく多くの免疫分析系にて用いねばならない標識が不要となる 。この種の系は本出願人によるものであって参考のためここに引用する係属中の 米国特許出願第６６２，１４７号に記載されている。 本発明を主として固相の使用につき開示したが、本発明のペプチドは非固相分 析系で用いることも考えられる。これら分析系は当業者に公知であり、本発明の 範囲内であると考えられる。 ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドまたはＨＴＬＶ−IIに対し特異性のペプ チドのみを、上記方法のいずれかにより免疫分析に用いる他の具体例も想定され る。ここに開示したペプチドの特異性およびこれらペプチドにより示される交差 反応性の欠如は、単一の分析でこれらペプチドを使用しても優秀な結果を与える ことを可能にする。すなわち、ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の本発明による１種も しくはそれ以上のペプチド、またはＨＴＬＶ−IIに対し特異性の本発明による１ 種もしくはそれ以上のペプチドを用いる単一の免疫分析は、ＨＴＬＶ−Ｉまたは ＨＴＬＶ−IIによる感染に関し向上した特異性および選択性をもたらす。しかし ながら、優秀な識別結果を得るためには、２つの分析を行い、第１分析にてＨＴ ＬＶ−Ｉに対し特異性の１種もしくはそれ以上のペプチドを用いると共に第２分 析にてＨＴＬＶ−IIに対し特異性の１種もしくはそれ以上のペプチドを用いて、 ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−IIで感染された各血清を識別するのが好適である 。 したがって、ＨＴＬＶ−Ｉに対する特異性抗体をＨＴＬＶ−IIに対する抗体と は独立して検出する試験を設計することができ、これはこれらウィルスのそれぞ れの適する合成ペプチドを選択すると共に、これらを固相に被覆して２種のウィ ルス感染の識別診断を容易化させる。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の特異的検出に 適するペプチドはここに特定され、配列番号１〜配列番号１２として示されるＨ ＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ領域のペプチドおよびＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ領域のペプチド を含む。ＨＴＬＶ−IIに対する抗体の特異的検出に適するペプチドもここに特定 され、ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ領域のペプチドおよびＨＴＬＶ−II ｇａｇ領域の ペプチドを含み、配列番号１３〜配列番号２５として示される。 分析につき使用される試薬は、たとえば小瓶もしくは瓶のような１個もしくは それ以上の容器を有するキットの形態で提供することが考えられる。各容器もし くは小瓶は、たとえば希釈剤、指示薬、シグナル発生化合物、本発明の少なくと も１種のペプチドを含む分析試薬など別々の試薬を含有する。さらにキットは、 その内容物を用いてＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染とを識別しうることを 示す指示書をも含む。 以下の実施例および関連する表はさらに本発明を例示することを意図する。し かしながら、本発明はこれら特定実施例またはその実施形態のみに限定されない ことが了解されよう。 実施例実施例１ ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の検出 試薬 各ペプチドは、当業界に公知であってメリフィールド、ジャーナル・アメリカ ン・ケミカル・ソサエティ、 第８５巻、第２１４９〜２１５４頁（１９６３）並 びにバラニーおよびメリフィールド、Ｅ．グロスおよびＪ．マイエンホファー編 、ザ・ペプチド、第２巻、第１〜２８４頁（１９７９）、アカデミック・プレス 、ニューヨーク（参考のためここに引用する）に記載された手法を用い、アミノ 酸を固相に段階的に付加することにより合成した。要約すれば、この手順は次の 通りである。Ｃ末端から開始しＮ末端方向に進行させて合成を行った。Ｎをｔ− ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）とするＮ−保護アミノ酸を用いた。Ｃ末 端側のｔ−Ｂｏｃアミノ酸を固相に接合させた。ｔ−Ｂｏｃ保護基をトリフルオ ロ酢酸で除去して遊離ア ミノ基とし、次のアミノ酸に結合させた。順次にｔ−Ｂｏｃアミノ酸を添加し、 たとえばＤＣＣ（Ｎ−Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド）のような試薬を 用いて結合させ、次いで脱保護した。ペプチド合成完了後、最終ｔ−Ｂｏｃ保護 基を除去し、該ペプチドを無水弗化水素を用いてポリマーから切除した。 上記のように作成したペプチドを、ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体を捕獲すべく、 当業界で知られた手法によりポリスチレンビーズ固体支持体に被覆した。要約す れば、ポリスチレンビーズを蒸留水で洗浄し、燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）溶液に おける０．０１〜５０μｇ／ｍＬのペプチドと共に４０℃にて２時間にわたり培 養した。これらビーズを０．１％トリトンＸ−１００（登録商標）を含有するＰ ＢＳで１時間にわたり洗浄し、ＰＢＳにおける２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ） で１時間にわたり封鎖し、ＰＢＳにおける５％蔗糖で１５分間かけてオーバーコ ートし、次いで乾燥させた。 この実施例にてＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の検出につき固相として用いたビー ズは、アミノ酸１７４〜２０４に対応するペプチドＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ−１（ 配列番号１）で被覆した。 抗−ヒトＩｇＧ抗血清は、ヤギを公知方法により精製ヒト ＩｇＧで免疫化して作成した。得られた抗血清を親和性精製し、西洋ワサビペル オキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した。方法 各試料を１：２〜１：１０００の希釈率の範囲で試料希釈剤緩衝液で希釈した 。２００μＬの希釈試料を、被覆ビーズと共に反応皿にて４０℃で６０分間にわ たり培養した。充分洗浄した後、ビーズを適する希釈剤で希釈されたヤギ抗−ヒ トＨＲＰＯと共に４０℃にて３０分間培養した。ビーズを再び充分洗浄した。ビ ーズ上に固定化されたＨＲＰＯの量を、室温における３０分間にわたるＯ−フェ ニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）試薬との培養により定量した。この培養の終 了後、１．０ｍＬの１Ｎ硫酸を添加して発色反応を停止させた。発色程度を、４ ９２／６００ｎｍにおける得られた溶液の吸光度を測定して決定した。結果 本発明の方法を、Ｄ．Ｗ．アンダーソン等、ブラッド、第７４巻、第２５８５ 〜２５９１頁（１９８９）の方法により、ＨＴＬＶに対する抗体につき陽性であ ると予め確認されている１００種の試験試料パネルに適用した。うち５０種の試 料はＨＴＬＶ−Ｉにつき陽性であると確認され、また５０種の試料 はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＨＴＬＶ−IIにつき陽性であると確認 されたものである。本発明の方法は５０種の試料のうち４８種（９６％）がＨＴ ＬＶ−Ｉに対する抗体につき陽性であると検出した。さらにＨＴＬＶ−II感染血 清の５０種の試料では顕著な交差反応が検出されなかった。実施例２ ＨＴＬＶ−IIに対する抗体の検出 試薬 実施例１に上記したように作成したペプチドを、ＨＴＬＶ−IIに対する抗体を 捕獲するため固相としてのポリスチレンビーズに次のように被覆した。ポリスチ レンビーズを１５％ｖ／ｖのイソプロパノールで洗浄し、４０℃にて２時間にわ たりＰＢＳ溶液における０．０１〜５０μｇ／ｍＬのペプチドと共に培養した。 これらビーズを０．１５％トリトンＸ−１００（登録商標）を含有するＰＢＳで １時間かけて１回洗浄し、ＰＢＳにおける２％ＢＳＡで１時間にわたり封鎖し、 次いでＰＢＳにおける５％蔗糖で室温にて２０分間にわたりオーバーコートし、 次いで乾燥させた。 この実施例にてＨＴＬＶ−IIに対する抗体を検出するため、 ビーズをＨＴＬＶ−II ｇｐ４６ ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸１７１〜１９８に対 応するペプチドＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−２（配列番号１５）で被覆した。 抗−ヒトＩｇＧ抗血清は、ヤギを精製ヒトＩｇＧで免疫化して作成した。得ら れた抗血清を親和性精製し、当業界で知られた標準法によりＨＲＰＯで標識した 。方法 各試料を試料希釈剤緩衝液で１：２〜１：１０００の希釈率にて希釈した。２ ００μＬの希釈試料を被覆ビーズと共に反応皿にて４０℃で６０分間にわたり培 養した。充分洗浄した後、ビーズを適する希釈剤で希釈されたヤギ抗−ヒトＨＲ ＰＯと共に４０℃にて３０分間培養した。ビーズを再び充分洗浄した。ビーズ上 に固定化されたＨＲＰＯの量は、ＯＰＤ試薬と共に室温にて３０分間にわたり培 養して定量した。この培養の終了後、１．０ｍＬの１Ｎ硫酸を添加して発色反応 停止させた。発色の程度を、４９２／６００ｎｍにおける基質の吸光度を測定し て決定した。結果 この方法を、アンダーソンの方法（上記）によりＨＴＬＶに対する抗体につき 陽性であると共に、ＰＣＲによりＨＴＬＶ− IIにつき陽性であると確認された試験試料のパネルに適用した場合、この試験は ７４種の試料のうち７２種（９７．３％）を検出することができた。さらにＨＴ ＬＶ−Ｉにつき陽性と確認された５０種の試料につき試験した場合、１つの試料 についてのみ交差反応が検出された。しかしながら、この試料はＨＴＬＶ−II陽 性であるとする限界付近でもあった。実施例３ ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−II感染血清に対するペプチドの反応性 各試薬を実施例２と同様に作成したが、ただし配列番号１〜配列番号２５のた めのペプチドを個々にビーズに被覆した。表１に下記するデータは、２８種の確 認されたＨＴＬＶ陽性試料のパネルにつき得たデータの総括である。これら試料 の１４種はＨＴＬＶ−Ｉ陽性であると確認され、他の１４種の試料はＨＴＬＶ− II陽性であると確認されているものである。配列番号の対応名を括弧内に示す。 表１に示したように、ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドにつきＨＴＬＶ− II血清に対する交差反応性は観察されず、ＨＴＬＶ−IIに対し特異性のペプチド では顕著な交差反応性がＨＴＬＶ−Ｉ血清につき観察されなかった。 実施例４ 同時被覆ビーズを用いるＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIに対する各抗体の検出 試験Ａ 実施例１に記載した手順を用い、ビーズをＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の本発明 によるペプチドの混合物を含有する溶液で同時被覆した。ビーズを同時被覆する ことにより、本発明者らはＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ−IIを検出する分析の 感度増大が可能であると共に、交差反応性に対する選択性のレベルを維持しうる ことを突き止めた。たとえば所定の試験試料における抗体は、一方のペプチドで 検出しうるが他方のペプチドでは検出できない。しかしながら、同じ２種のペプ チドが他の試料については反対の結果をもたらしうる。したがって、両ペプチド による同時被覆ビーズは、この両試料のいずれにおいてもそれぞれの抗体を検出 する。この分析のため、各ペプチドを実施例１におけるように被覆したが、ただ しペプチド被覆溶液は等しい濃度の配列番号２および５を含んだ。分析は、実施 例３におけると同じ２８種の血清試料パネルを用いて行った。表２に示したよう に、２８員のパネルに用いた際、本発明の方法はＨＴ ＬＶ−Ｉにつき陽性である１４種の試料のうち１４種（１００％）を正確に同定 することができ、ＨＴＬＶ−IIにつき陽性の１４種の試料につき顕著な交差反応 は観察されなかった。配列番号１および４並びに配列番号１および５の組合せ物 につき行った分析でも同様な結果が得られた。 実施例１に記載した手順を用い、上記のように作成したＨＴＬＶ−IIにつき特 異性であるペプチドをポリスチレンビーズに同時被覆した。用いたペプチド組合 せ物は配列番号１５および１３、配列番号１５および１４、配列番号１５および １８、配列番号１５および１９、配列番号１５および２１、並びに配列番号１５ および２２とした。結果を表２に示す。表２に示したように、ＨＴＬＶ−II特異 性ペプチドの組合せ物で行った分析は、ＨＴＬＶ−Ｉにつき陽性と確認された試 料につき顕著な交差反応性を示さず、ＨＴＬＶ−IIの検出に関しては優秀な結果 を示した。 試験Ｂ 同時被覆されたビーズを用いる分析を他の試料試験につき準備した。本発明に より作成したペプチドを、当業界で知られた方法を用いＨＴＬＶ−IIに対する抗 体を捕獲すべく固体支持体としてのポリスチレンビーズに被覆した。１５％Ｎ− プロピルアルコールで洗浄することによりポリスチレンビーズを作成し、 燐酸塩緩衝溶液における０．０１〜５０μｇ／ｍＬのペプチドと共に４０℃にて ２時間にわたり培養した。これらビーズを０．１５％トリトンＸ−１００を含有 するＰＢＳにより４０℃で１時間にわたり１回洗浄し、ＰＢＳにおける２％ＢＳ Ａにより４０℃で１時間にわたり封鎖し、次いでＰＢＳにおける５％蔗糖で室温 にて２０分間かけてオーバーコートした。次いでビーズを排液すると共に、３７ ℃に加熱された窒素ガスにより乾燥するまで約１〜２時間かけて乾燥させた。こ れらビーズを使用するまで２〜８℃にて脱水貯蔵した。 この実施例にてＨＴＬＶ−IIに対する抗体を検出するため、ビーズを配列番号 １５および２２によるペプチドで等しい濃度にて同時被覆した。ヤギを精製ヒト ＩｇＧで免疫化して抗−ヒトＩｇＧ抗血清を作成した。得られた抗血清を親和性 精製すると共に、標準法によりＨＲＰＯで標識した。同様な分析を、配列番号１ および５で同時被覆されたポリスチレンビーズを用いて行った。結果 この実施例の方法により作成されたビーズをアンダーソンの方法（上記）によ りＨＴＬＶにつき陽性と確認された１００種 の試験試料パネルに対する免疫分析で使用した。うち５０種の試料はＨＴＬＶ− Ｉにつき陽性と確認され、また５０種の試料はＰＣＲによりＨＴＬＶ−IIにつき 陽性であると確認されたものである。この分析において、配列番号１５および２ ２で被覆されたビーズは５０種の試料のうち４７種をＨＴＬＶ−II陽性と正しく 同定した。さらに、この免疫分析において、ビーズはＨＴＬＶ−Ｉにつき陽性と 確認された血清試料に対しては顕著な交差反応性を示さなかった。 配列番号２および５で同時被覆されたビーズを用いて行った分析につき、ＨＴ ＬＶ−Ｉに対し陽性と確認された５７種の試料のうち５５種が検出され、ＨＴＬ Ｖ−II感染の血清については顕著な交差反応性を示さなかった。実施例５ 分析性能に及ぼすペプチド配列の影響 実施例１と同様に試薬を作成したが、ただしビーズを個々にＨＴＬＶ−Ｉ ｅ ｎｖ −１（配列番号１）（１７４〜２０４）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ−６（配列 番号６）（１９０〜２１３）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−１（配列番号７）（１０ ０〜１２９）、ＨＴＬＶ−Ｉ ｇａｇ−３（配列番号９）（１０９〜１２９）、 ＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−２（配列番号１５）（１７１〜１９８）およびＨＴＬＶ −II ｇａｇ−２（配列番号２３）（１１１〜１２９）で被覆した。さらに、本 発明のペプチドと同じ抗原領域から採取したが、数個短いか或いは数個長いアミ ノ酸残基を有するペプチドをも作成した。これらペプチドはＨＴＬＶ−Ｉ ｇａ ｇ −４（１０３〜１１６）（配列番号２６）、ＨＴＬＶ−II ｇａｇ−１（１１ ５〜１３５）（配列番号２８）およびＨＴＬＶ−II ｅｎｖ−７（１８６〜１９ ５）（配列番号２７）に対応する。これら分析からのデータを表３に示す。 このデータは、ペプチドに少数のアミノ酸を付加または欠失した場合に、抗体 に対する結合能力および結合特異性に顕著に影響しうることを明かに示す。実施例６ 従来技術のペプチドによるＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIの識別 実施例１および２におけると同様に免疫分析を行い、実施例３に用いたと同じ ２８員のパネルに適用した。ビーズをブロンベルグ（上記）およびバールネ（上 記）に開示されたペプチド で被覆した。試験したバールネのペプチドはＨＴＬＶ−Ｉ「Ｈ」および「Ｏ」並 びにＨＴＬＶ−II「Ｈ」および「Ｏ」とした。試験したブロンベルグのペプチド は、この開示のペプチドとほぼ同じ領域における４種の開示された好適ペプチド ＩＧＢ、２ＧＢ、ＩＥＡおよび２ＥＡとした。比較法のそれぞれを本発明の方法 により行ったが、従来技術のペプチドで置換した。市販の合成ＥＩＡの場合、分 析は製造業者の推奨する方法にしたがって行った。結果を表４に要約する。 実施例７ ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−IIとの識別（比較） 実施例１および２の方法を用いて、予めＰＣＲにより分類された試験試料のパ ネルを調査した。本発明をブロンベルグの方 法と比較した。試験したブロンベルグのペプチドは、本発明の数種のペプチドと ほぼ同じ領域に入る４種の開示された好適ペプチド１ＧＢ、２ＧＢ、１ＥＡおよ び２ＥＡとした。これら比較法のそれぞれを本発明の方法により従来技術のペプ チドと置換して行った。結果を表５に示す。 上記した好適態様については、広範囲の変化および改変をなしうることがもち ろん了解されよう。したがって上記の詳細な説明については、本発明の範囲を定 義しているのは以下の請求の範囲（その全ての均等物を含む）であることが了解 されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー，ヘレン・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60045、レイ ク・フオレスト、モーニングサイド・ドラ イブ・825 (72)発明者 オードン，デブラ・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60002、アン テイオク、ウエスト・レイク・ビスタ・ 23865

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 試験試料にてＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体をＨＴＬＶ−IIに対する抗体から 識別する方法であって： ａ． 前記試験試料におけるＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の存在を判定し、この判 定は ｉ． 前記試験試料をＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の少なくとも１種のペプチド と接触させて混合物を形成させ、その際ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドを 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、 配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列 番号１２よりなる群から選択し； ii． 前記混合物を、抗原／抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し； iii． 前記複合体を、抗ヒトＩｇＧ抗体に接合させたシグナル発生化合物を含 む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ； iv． 前記第２混合物を、抗原／抗体／抗体の複合体を形成させるのに充分な 時間および条件にて培養し； ｖ． 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試 料におけるＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の存在を判定する ことからなり； ｂ． 前記試験試料におけるＨＴＬＶ−IIに対する抗体の存在を判定し、前記判 定は ｉ． 前記試験試料を配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号 １６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２ １、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５よりなる群 から選択されるＨＴＬＶ−IIに対し特異性の少なくとも１種のペプチドと接触さ せて混合物を形成させ； ii． 前記混合物を、抗原／抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し； iii． 前記複合体を、抗ヒトＩｇＧ抗体に接合させたシグナル発生化合物を含 む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ； iv． 前記第２混合物を抗原／抗体／抗体の複合体を形成させるのに充分な時 間および条件にて培養し； ｖ． 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試料におけるＨＴＬ Ｖ−IIに対する抗体の存在を判定する ことからなり； ｃ． ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIに対する各抗体につき前記試験試料の反 応パターンを判定してＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染とを識別する ことを特徴とする抗体の識別方法。 ２． ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の前記ペプチドを配列番号１、２、４、５、７ および８よりなる群から選択する請求の範囲第１項に記載の方法。 ３． ＨＴＬＶ−IIに対し特異性の前記ペプチドを配列番号１５および１６より なる群から選択する請求の範囲第１項に記載の方法。 ４． 前記試験試料を前記工程（ａ）（ｉ）にてＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の前 記ペプチドの２種と接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。 ５． 前記２種のペプチドのうち、第１ペプチドを配列番号１、２および６より なる群から選択すると共に、前記２種のペプチドのうち、第２ペプチドを配列番 号３、４および５よりなる群から選択する請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 前記第１ペプチドが配列番号１であり、前記第２ペプチドが配列番号５で ある請求の範囲第４項に記載の方法。 ７． 前記試験試料を前記第１と第２ペプチドに同時に接触させる請求の範囲第 ４項に記載の方法。 ８． 前記第１と第２ペプチドを、ポリスチレンビーズに被覆する請求の範囲第 ７項に記載の方法。 ９． 前記第１と第２ペプチドを、微粒子ビーズに被覆する請求の範囲第７項に 記載の方法。 １０． 前記試験試料を前記工程（ｂ）（ｉ）にてＨＴＬＶ−IIに対し特異性の 前記ペプチドの２種と接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。 １１． 前記２種のペプチドのうち、第１ペプチドを配列番号１３、１４、１５ および１６よりなる群から選択すると共に、前記２種のペプチドのうち、第２ペ プチドが配列番号２２である請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２． 前記試験試料を前記２種のペプチドに同時に接触させる請求の範囲第１ １項に記載の方法。 １３． 前記第１と前記第２ペプチドを、ポリスチレンビーズに被覆する請求の 範囲第１２項に記載の方法。 １４． 前記第１と前記第２ペプチドを、微粒子ビーズに被覆する請求の範囲第 １２項に記載の方法。 １５． 前記試験試料を前記工程（ａ）（ｉ）にてＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の 第１と第２ペプチドに同時に接触させ、前記第１ペプチドを配列番号１、２およ び６よりなる群から選択すると共に前記第２ペプチドを配列番号３、４および５ よりなる群から選択し、前記試験試料を工程（ｂ）（ｉ）にてＨＴＬＶ−IIに対 し特異性の第３と第４ペプチドに同時に接触させ、前記第３ペプチドを配列番号 １３、１４、１５および１６よりなる群から選択すると共に前記第４ペプチドが 配列番号２２である請求の範囲第１項に記載の方法。 １６． 固相に接合させたＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチド（ＨＴＬＶ−Ｉ に対し特異性の前記ペプチドは配列番号１〜１２よりなる群から選択される）を 含む第１容器と； 固相に接合させたＨＴＬＶ−IIに対し特異性のペプチド（ＨＴＬＶ−IIに対し特 異性の前記ペプチドは配列番号１３〜２５よりなる群から選択される）を含む第 ２容器と を備え、包装材料が前記容器に付されたラベルを含み、ＨＴＬＶ−Ｉで感染した 血清をＨＴＬＶ−IIで感染した血清から識別すべく内容物を使用しうることを表 示することを特徴とする包装材料を含む製造物品。 １７． ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の前記ペプチドが配列番号１、２、４、５、 ７および８よりなる群から選択されると共に、ＨＴＬＶ−IIに対し特異性の前記 ペプチドが配列番号１５および１６よりなる群から選択される請求の範囲第１６ 項に記載の物品。 １８． 前記第１容器が配列番号１、２および６よりなる群から選択されるＨＴ ＬＶ−Ｉに対し特異性の第１ペプチドと配列番号３、４および５よりなる群から 選択されるＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の第２ペプチドとを含み、前記第２容器が 配列番号１３、１４、１５および１６よりなる群から選択されるＨＴＬＶ−IIに 対し特異性の第１ペプチドと配列番号２２であるＨＴＬＶ−IIに対し特異性の第 ２ペプチドとを含む、請求の範囲第１６項に記載の物品。 １９． 試験試料にてＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体をＨＴＬＶ−IIに対する抗体か ら識別する方法であって： ａ． 前記試験試料におけるＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体の存在を判定し、前記判 定は ｉ． 前記試験試料をＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の少なくとも１種のペプチド と接触させて混合物を形成させ、その際 ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性のペプチドを配列番号１、配列番号２、配列番号３、 配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、 配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２よりなる群から選択し； ii． 前記混合物を、抗原／抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し； iii． 前記複合体を、前記抗原／抗体の複合体に結合しうるペプチド抗原に接 合させたシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ； iv． 前記第２混合物を、抗原／抗体／抗原の複合体を形成させるのに充分な 時間および条件にて培養し； ｖ． 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試料におけるＨＴＬ Ｖ−Ｉに対する抗体の存在を判定する ことからなり； ｂ． 前記試験試料におけるＨＴＬＶ−IIに対する抗体の存在を判定し、前記判 定は ｉ． 前記試験試料を配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号 １６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２ １、配列番号２２、配列番 号２３、配列番号２４および配列番号２５よりなる群から選択されるＨＴＬＶ− IIに対し特異性の少なくとも１種のペプチドと接触させて混合物を形成させ； ii． 前記混合物を、抗原／抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し； iii． 前記複合体を、前記抗原／抗体の複合体に結合しうるペプチド抗原に接 合させたシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ； iv． 前記第２混合物を、抗原／抗体／抗原の複合体を形成させるのに充分な 時間および条件にて培養し； ｖ． 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試料におけるＨＴＬ Ｖ−IIに対する抗体の存在を判定する ことからなり； ｃ． ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−IIに対する各抗体につき前記試験試料の反 応パターンを判定してＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−II感染とを識別する ことを特徴とする抗体の識別方法。 ２０． ＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の前記ペプチドを配列番号１、２、４、５、 ７および８よりなる群から選択する請求の範 囲第１９項に記載の方法。 ２１． ＨＴＬＶ−IIに対し特異性の前記ペプチドを配列番号１５および１６よ りなる群から選択する請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２２． 前記試験試料を前記工程（ａ）（ｉ）にてＨＴＬＶ−Ｉに対し特異性の 前記ペプチドの２種と接触させる請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２３． 前記２種のペプチドのうち、第１ペプチドを配列番号１、２および６よ りなる群から選択すると共に、前記２種のペプチドのうち、第２ペプチドを配列 番号３、４および５よりなる群から選択する請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２４． 前記試験試料を前記工程（ｂ）（ｉ）にてＨＴＬＶ−IIに対し特異性の 前記ペプチドの２種と接触させる請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２５． 前記２種のペプチドのうち、第１ペプチドを配列番号１３、１４、１５ および１６よりなる群から選択すると共に、前記２種のペプチドのうち、第２ペ プチドが配列番号２２である請求の範囲第２４項に記載の方法。