JP2501569B2 - 抗成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体の検出法 - Google Patents
抗成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体の検出法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、成人Ｔ細胞白血病ウィルス〔ATLVと略称さ
れるが、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（HTLV−１と略称さ
れる）とも称されている〕のgag遺伝子またはその一部
とATLVのenv遺伝子またはその一部とが結合した融合遺
伝子によってコードされるポリペプチドを抗原物質とし
て用いる免疫学的方法により試料中の抗ATLV抗体を検出
する方法に関する。従って本発明は臨床診断の分野にお
いて有用である。
れるが、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（HTLV−１と略称さ
れる）とも称されている〕のgag遺伝子またはその一部
とATLVのenv遺伝子またはその一部とが結合した融合遺
伝子によってコードされるポリペプチドを抗原物質とし
て用いる免疫学的方法により試料中の抗ATLV抗体を検出
する方法に関する。従って本発明は臨床診断の分野にお
いて有用である。
従来技術 従来、抗原抗体反応は広い分野で利用されている技術
であるが、特に医療分野では病気の診断、治療および予
防に幅広く応用されている。これらは抗原抗体反応の高
い特異性に依存しており、この高い特異性が診断の正確
性、治療および予防の有効性を保証している。
であるが、特に医療分野では病気の診断、治療および予
防に幅広く応用されている。これらは抗原抗体反応の高
い特異性に依存しており、この高い特異性が診断の正確
性、治療および予防の有効性を保証している。
成人Ｔ細胞白血病（以下ATLという）はATLV（HTLV−
１）が原因と考えられており、ATLV（HTLV−１）感染の
血清診断はATLの診断および感染の予防などにとって重
要である。ATLV感染は、血清中のATL−関連抗原（以下A
TLAという）に対する抗体の有無を抗原抗体反応を利用
して検出することにより行われている。従来知られてい
る抗ATLV抗体検出方法としては、抗原物質としてATLVの
gag遺伝子の産物であるＰ−24を用いる方法（以下Ｐ−2
4法と称す）、抗原物質として全ATLVの遺伝子産物であ
るポリペプチドを用いる方法および抗原物質としてenv
遺伝子産物を用いる方法が知られている。
１）が原因と考えられており、ATLV（HTLV−１）感染の
血清診断はATLの診断および感染の予防などにとって重
要である。ATLV感染は、血清中のATL−関連抗原（以下A
TLAという）に対する抗体の有無を抗原抗体反応を利用
して検出することにより行われている。従来知られてい
る抗ATLV抗体検出方法としては、抗原物質としてATLVの
gag遺伝子の産物であるＰ−24を用いる方法（以下Ｐ−2
4法と称す）、抗原物質として全ATLVの遺伝子産物であ
るポリペプチドを用いる方法および抗原物質としてenv
遺伝子産物を用いる方法が知られている。
発明が解決しようとする問題点 抗ATLV抗体の検出における上記従来法において偽陰性
および偽陽性の診断結果が得られることがあり、さらに
優れた検出方法の開発が望まれている。
および偽陽性の診断結果が得られることがあり、さらに
優れた検出方法の開発が望まれている。
問題点を解決するための手段 本発明者は、抗ATLV抗体の優れた検出方法を見出すべ
く研究を行った結果、ATLVのgag遺伝子とenv遺伝子とが
結合した融合遺伝子によってコードされるポリペプチド
を抗原物質として用いた場合に抗ATLV抗体の検出が極め
て精度よく行われることを見出し、本発明を完成した。
く研究を行った結果、ATLVのgag遺伝子とenv遺伝子とが
結合した融合遺伝子によってコードされるポリペプチド
を抗原物質として用いた場合に抗ATLV抗体の検出が極め
て精度よく行われることを見出し、本発明を完成した。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、ATLVのgag遺伝子またはその一部とATLVのe
nv遺伝子またはその一部とが結合した融合遺伝子によっ
てコードされるポリペプチドを抗原物質として用いる免
疫学的方法により試料中の抗ATLV抗体を検出することを
特徴とする抗ATLV抗体の検出方法に関する。
nv遺伝子またはその一部とが結合した融合遺伝子によっ
てコードされるポリペプチドを抗原物質として用いる免
疫学的方法により試料中の抗ATLV抗体を検出することを
特徴とする抗ATLV抗体の検出方法に関する。
本発明に抗原物質として用いるポリペプチドとして
は、gag遺伝子またはその一部とenv遺伝子またはその一
部とが結合した融合遺伝子によってコードされるもので
あればいかなるものも用いることができる。好適には、
参考例１に示した方法で製造される下記アミノ酸配列を
有するもの（以下gag−env蛋白という）が用いられる。
gag−env蛋白は、Ｐ−24のＮ末端側14番目のアミノ酸
（プロリン）から139番目のアミノ酸（グリシン）まで
のポリペプチドとenvのＮ末端側197番目のアミノ酸（ス
レオニン）から295番目のアミノ酸（プロリン）までの
ポリペプチドとが結合したポリペプチドのＮ末端側にメ
チオニン−アスパラギン酸が、Ｃ末端側にリジン（Ly
s）が付加されたポリペプチドである。
は、gag遺伝子またはその一部とenv遺伝子またはその一
部とが結合した融合遺伝子によってコードされるもので
あればいかなるものも用いることができる。好適には、
参考例１に示した方法で製造される下記アミノ酸配列を
有するもの（以下gag−env蛋白という）が用いられる。
gag−env蛋白は、Ｐ−24のＮ末端側14番目のアミノ酸
（プロリン）から139番目のアミノ酸（グリシン）まで
のポリペプチドとenvのＮ末端側197番目のアミノ酸（ス
レオニン）から295番目のアミノ酸（プロリン）までの
ポリペプチドとが結合したポリペプチドのＮ末端側にメ
チオニン−アスパラギン酸が、Ｃ末端側にリジン（Ly
s）が付加されたポリペプチドである。
本発明が適用される試料としては、血液などの体液や
尿などがあげられる。
尿などがあげられる。
本発明で用いる免疫学的方法としては、下記のものが
あげられ、各文献記載の方法を用いて実施できる。
あげられ、各文献記載の方法を用いて実施できる。
〇エンザイム・イムノアッセイ（以下EIAという）酵素
免疫測定法，医学書院，石川栄治ら,1978年， 〇ラジオ・イムノアッセイ（以下RIAという）免疫血清
学，医歯薬出版，稲井真彌ら,1981年 〇フルオレッセンス・イムノアッセイ（以下FIAとい
う） 同上 〇逆受身凝集反応 同上 〇フィトヘマトアグリチネーション 同上 〇レーザーネフロメトリー 同上 〇免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方
法） 同上 〇パーティクルアグリチネーション 最新検査，医典社,vol.2 No.2,151〜157,1984,Gann75,
845,1984 RIA,EIA,FIAにおいては、均一系のみならず、サンド
イッチ法などの不均一系の分析方法も可能である。
免疫測定法，医学書院，石川栄治ら,1978年， 〇ラジオ・イムノアッセイ（以下RIAという）免疫血清
学，医歯薬出版，稲井真彌ら,1981年 〇フルオレッセンス・イムノアッセイ（以下FIAとい
う） 同上 〇逆受身凝集反応 同上 〇フィトヘマトアグリチネーション 同上 〇レーザーネフロメトリー 同上 〇免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方
法） 同上 〇パーティクルアグリチネーション 最新検査，医典社,vol.2 No.2,151〜157,1984,Gann75,
845,1984 RIA,EIA,FIAにおいては、均一系のみならず、サンド
イッチ法などの不均一系の分析方法も可能である。
具体例としてEIAをサンドイッチ法で行う例を下記に
示す。
示す。
抗原物質をマイクロタイタープレートのウェルにコー
ティングし、血清試料を適当な緩衝液たとえば緩衝液Ａ
〔0.15M NaCl,0.1％ゼラチン,1％牛血清アルブミンお
よび0.1％NaN3を含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.2）〕で希釈した液をウエルに入れ、４〜37℃,1時間
〜１週間静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ〔0.
05％Tween20および0.15M NaClを含む1/15Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.2）〕でウエルをよく洗浄する。ウ
サギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のFabフラグメントとホ
ースラデイッシュパーオキシダーゼとを過沃素酸法によ
り結合させたコンジュゲートを適当な緩衝液、たとえば
緩衝液Ｂで希釈した液をウエルに入れる。４〜45℃で１
〜24時間静置後、同じ緩衝液で洗浄する。ついで適当な
基質溶液たとえばオルソ・フェニレジアミン基質溶液
〔0.02％，オルソ・フェニレンジアミンおよび35mM過酸
化水素を含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）〕
をウエルに入れ、15〜37℃で５〜60分間静置する。2NH2
SO4で反応を停止させ、室温で１〜10分間放置後、マイ
クロタイタープレート用フォトメーターで410nmおよび6
00nmにおける吸光度（O.D.）を測定し、前者の値から後
者の値を差し引いた値を抗体値とする。
ティングし、血清試料を適当な緩衝液たとえば緩衝液Ａ
〔0.15M NaCl,0.1％ゼラチン,1％牛血清アルブミンお
よび0.1％NaN3を含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.2）〕で希釈した液をウエルに入れ、４〜37℃,1時間
〜１週間静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ〔0.
05％Tween20および0.15M NaClを含む1/15Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.2）〕でウエルをよく洗浄する。ウ
サギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のFabフラグメントとホ
ースラデイッシュパーオキシダーゼとを過沃素酸法によ
り結合させたコンジュゲートを適当な緩衝液、たとえば
緩衝液Ｂで希釈した液をウエルに入れる。４〜45℃で１
〜24時間静置後、同じ緩衝液で洗浄する。ついで適当な
基質溶液たとえばオルソ・フェニレジアミン基質溶液
〔0.02％，オルソ・フェニレンジアミンおよび35mM過酸
化水素を含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）〕
をウエルに入れ、15〜37℃で５〜60分間静置する。2NH2
SO4で反応を停止させ、室温で１〜10分間放置後、マイ
クロタイタープレート用フォトメーターで410nmおよび6
00nmにおける吸光度（O.D.）を測定し、前者の値から後
者の値を差し引いた値を抗体値とする。
ここに示した方法は一例示であり、抗体や基質液、発
色剤などの変更は、適宣行うことがでる。
色剤などの変更は、適宣行うことがでる。
gag−env蛋白を用いる本発明方法は優れた抗ATLA抗体
の検出方法であるが、gag遺伝子産物とenv遺伝子産物と
を同一担体上に結合させたもの（以下カクテル抗原ポリ
ペプチドという）を用いても本発明方法と同様に優れた
効果が期待できる。カクテル抗原ポリペプチドは、gag
遺伝子産物とenv遺伝子産物とを適当な担体たとえばリ
ポソーム，合成樹脂またはガラス製の固相担体に物理的
または科学的に吸着させることにより製造することがで
きる。
の検出方法であるが、gag遺伝子産物とenv遺伝子産物と
を同一担体上に結合させたもの（以下カクテル抗原ポリ
ペプチドという）を用いても本発明方法と同様に優れた
効果が期待できる。カクテル抗原ポリペプチドは、gag
遺伝子産物とenv遺伝子産物とを適当な担体たとえばリ
ポソーム，合成樹脂またはガラス製の固相担体に物理的
または科学的に吸着させることにより製造することがで
きる。
本発明方法は、抗ATLV抗体の検出に優れた効果を示す
が、Ｐ−24と交差反応を示す疾患として知られているTS
P（Tropical Spastic Paraplesia,熱帯性痙攣性対麻痺
症）,HAM（HTLV−１関連脊髄病）,MS（Multiple Sclero
sis,多発性硬化症）およびATL以外の各種の癌（たとえ
ば肝癌，子宮癌）に適用できる。
が、Ｐ−24と交差反応を示す疾患として知られているTS
P（Tropical Spastic Paraplesia,熱帯性痙攣性対麻痺
症）,HAM（HTLV−１関連脊髄病）,MS（Multiple Sclero
sis,多発性硬化症）およびATL以外の各種の癌（たとえ
ば肝癌，子宮癌）に適用できる。
実施例1. 抗原物質としてgag−env蛋白（gag−env法）またはga
g遺伝子産物の断片であるＰ−24を用いるEIA（Ｐ−24
法）ならびに天然のATLVを用いるエーザイ法（エイテス
ト ATL,エーザイ社）によりATL患者,HTLV−１保菌者お
よび正常人血清における抗ATLV抗体の検出を行った。
g遺伝子産物の断片であるＰ−24を用いるEIA（Ｐ−24
法）ならびに天然のATLVを用いるエーザイ法（エイテス
ト ATL,エーザイ社）によりATL患者,HTLV−１保菌者お
よび正常人血清における抗ATLV抗体の検出を行った。
（１） gag−env蛋白およびＰ−24を用いるEIA（サン
ドイッチ法） 血清試料としてATL患者またはHTLV−１保菌者57名お
よび正常人30名の血清を用いた。gag−env蛋白としては
参考例１の方法で得られるポリペプチドを用い、Ｐ−24
は特開昭60−60534号に記載の方法に従って得られるgag
ポリペプチドを用いた。
ドイッチ法） 血清試料としてATL患者またはHTLV−１保菌者57名お
よび正常人30名の血清を用いた。gag−env蛋白としては
参考例１の方法で得られるポリペプチドを用い、Ｐ−24
は特開昭60−60534号に記載の方法に従って得られるgag
ポリペプチドを用いた。
１μｇのgag−env蛋白および３μｇのＰ−24をそれぞ
れマイクロタイタープレート（Nunc社）のウェルにコー
ティングした。
れマイクロタイタープレート（Nunc社）のウェルにコー
ティングした。
各血清を緩衝液Ａ（0.15M NaCl,0.1％ゼラチン,1％
牛血清アルブミンおよび0.1％NaN3を含む1/15Mリン酸ナ
トリウム緩衝液,pH7.2）で20倍に希釈した。この希釈液
100μを上記ウエルに入れ、室温で２時間静置後、緩
衝液Ｂ〔0.05％Tween20（和光純薬工業社製）および0.1
5M NaClを含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.2〕1
50μで３回洗浄した。
牛血清アルブミンおよび0.1％NaN3を含む1/15Mリン酸ナ
トリウム緩衝液,pH7.2）で20倍に希釈した。この希釈液
100μを上記ウエルに入れ、室温で２時間静置後、緩
衝液Ｂ〔0.05％Tween20（和光純薬工業社製）および0.1
5M NaClを含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.2〕1
50μで３回洗浄した。
ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のFabフラグメント
（酵素免疫測定法，医学書院，石川栄治ら,1978）とホ
ースラディシュパーオキシダーゼ（Sigma社製）とを過
沃素酸法（同上文献）により結合させたコンジュゲート
（80μg/ml）を緩衝液Ｂで20倍に希釈した溶液100μ
を各ウエルに入れた。室温で２時間静置後、緩衝液B150
μで３回洗浄した。ついで、オルソ・フェニレンジア
ミン基質溶液（0.02％オルソ・フェニレンジアミンおよ
び35mM過酸化水素を含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液,
pH7.2）100μに各ウエルを入れ、室温で15分間静置し
た。2N H2SO4 50μを各ウエルに入れて反応を停止
させ、10分間室温で放置後、マイクロタイタープレート
用フォトメーターMTP−22型（コロナ社製）で410nmおよ
び600nmにおける吸光度（O.D.）を測定し、その差で抗
体値を得た。試験はすべて二系列で行い平均値を測定値
とした。
（酵素免疫測定法，医学書院，石川栄治ら,1978）とホ
ースラディシュパーオキシダーゼ（Sigma社製）とを過
沃素酸法（同上文献）により結合させたコンジュゲート
（80μg/ml）を緩衝液Ｂで20倍に希釈した溶液100μ
を各ウエルに入れた。室温で２時間静置後、緩衝液B150
μで３回洗浄した。ついで、オルソ・フェニレンジア
ミン基質溶液（0.02％オルソ・フェニレンジアミンおよ
び35mM過酸化水素を含む1/15Mリン酸ナトリウム緩衝液,
pH7.2）100μに各ウエルを入れ、室温で15分間静置し
た。2N H2SO4 50μを各ウエルに入れて反応を停止
させ、10分間室温で放置後、マイクロタイタープレート
用フォトメーターMTP−22型（コロナ社製）で410nmおよ
び600nmにおける吸光度（O.D.）を測定し、その差で抗
体値を得た。試験はすべて二系列で行い平均値を測定値
とした。
（２） エーザイ社製のエイテスト ATLを用い、１項
と同じ試料を用いて臨床検査29（１）:91−94（1985）
に記載の方法（エーザイ法）にて１項と同じ試料につい
て抗ATLV抗体検出を行った。
と同じ試料を用いて臨床検査29（１）:91−94（1985）
に記載の方法（エーザイ法）にて１項と同じ試料につい
て抗ATLV抗体検出を行った。
（３） 正常人30名の血清について１および２項で測定
した測定値（O.D）の平均値および標準偏差値は次のと
おりであった。
した測定値（O.D）の平均値および標準偏差値は次のと
おりであった。
gag−env 0.055±0.013 Ｐ−24 0.010±0.004 エーザイ 0.040±0.009 平均値と標準偏差値の２倍との和をカットオフ値とす
ると、Ｐ−24の場合0.018,gag−env蛋白の場合0.081,エ
ーザイの場合0.059がカットオフ値となる。
ると、Ｐ−24の場合0.018,gag−env蛋白の場合0.081,エ
ーザイの場合0.059がカットオフ値となる。
ATL患者またはHTLV−１保菌者57名についての測定結
果を第１表に示す。
果を第１表に示す。
第１表の測定値と、上記のカットオフ値で陽性率を算
出した結果を第２表に示す。
出した結果を第２表に示す。
第２表により、正常人についてはどの方法でも偽陽性
は０％であり、ATL患者またはHTLV−１保菌者ではＰ−2
4の場合10名が偽陽性（カットオフ値0.018以下），エー
ザイ法の場合１名が偽陰性（カットオフ値0.059以下）
を示すのに対しgag−env蛋白の場合偽陰性（カットオフ
値0.081以下）は１名もなく、100％の陽性率を示すこと
がわかる。
は０％であり、ATL患者またはHTLV−１保菌者ではＰ−2
4の場合10名が偽陽性（カットオフ値0.018以下），エー
ザイ法の場合１名が偽陰性（カットオフ値0.059以下）
を示すのに対しgag−env蛋白の場合偽陰性（カットオフ
値0.081以下）は１名もなく、100％の陽性率を示すこと
がわかる。
エーザイ法とＰ−24法またはgag−unv法との相関性に
ついて計算した結果を第５図および第６図に示す。エー
ザイ法とＰ−24法との相関係数は0.8294,エーザイ法とg
ag−env法の相関係数は0.7479であった。この相関計数
の値は、エーザイ法,P−24法,gag−env法が互に相関関
係を有していることを示している。
ついて計算した結果を第５図および第６図に示す。エー
ザイ法とＰ−24法との相関係数は0.8294,エーザイ法とg
ag−env法の相関係数は0.7479であった。この相関計数
の値は、エーザイ法,P−24法,gag−env法が互に相関関
係を有していることを示している。
参考例1. （１） プラスミドpKYP26およびpEFM2の分離精製 pKYP26の含む大腸菌〔Escherichia coil IKYP26（FER
M BP−863）〕およびpEFM2を含む大腸菌（Escherichia
coli EEFM2（ATCC53228）〕をそれぞれ50μg/mlのアン
ピシリンを含むＬ培地（１％バクトトリプトン、0.5％
酵母エキス、１％NaCl,pH7.5）10ml、で37℃、18時間培
養した。この培養液全量を50μg/mlのアンピシリンを含
むＬ培地１に植菌し、37℃で培養した。４時間後に、
クロラムフェニコールを170μg/mlとなるように加え、
さらに37℃、16時間培養した。遠心分離法（5,000rpm10
分間）により集菌を行い、0.8％NaClで菌体を洗浄した
後、50mMトリス塩酸（pH8.0）20mlに懸濁し、氷冷し
た。10mg/mのリゾチームを8ml加え氷中に10分間静置し
た後、0.5M EDTAを9.3ml加え、氷中に10分間静置し、
２％トリトンＸ−100（和光純薬工業社製）を2.3ml加え
氷中にさらに１時間製置した。50,000×ｇで４℃、１時
間超遠心分離を行い、上清約40mlを得た。次にこの上清
に3M NaOHを加えpHを12.5として、室温で10分間静かに
撹拌した。2Mトリス塩酸（pH7.5）を加え、pHを8.5にも
どし、さらに３分間撹拌した。この時点で液の容量は約
55mlであった。1/9容の5M NaClを加えた後、10mMトリ
ス塩酸（pH7.5）、1mM EDTAで飽和したフェノールを等
量加え、激しく撹拌した後、低速遠心分離法（3,300rp
m,10分間、以下同条件）により水層を集めた（以下、こ
の処理をフェノール抽出と略記する）。1/250容の5mg/m
l RNase A（シグマ社製）を加え、37℃、１時間RNA分解
反応を行った後、1/5容の5M NaClを加え、1/3容の30％
PEG6000（半井化学薬品社製）を加え−20℃に２時間静
置した。遠心分離法で沈殿を集め、10mMトリス塩酸（pH
7.5）および1mM EDTAからなる液2mlに溶かし、ソジウ
ム・ドデシル・サルフェイト（SDS）を0.5％となるよう
に加え、Proteinase Ｋ（シグマ社製）を50μg/mlとな
るように加えて、37℃１時間蛋白質分解反応を行った。
フェノール抽出を３回繰り返し行った後、等量のクロロ
ホルムを加え、激しく撹拌した後低速遠心分離法により
水層を集めた。1/10容の3M酢酸ナトリウムを加え、2.5
倍容のエタノールを加え、−20℃,1時間静置した。冷却
遠心分離法（４℃,11,000rpm,10分間）で沈殿を集め、1
0mMトリス塩酸（pH7.5）および1mM EDTAからなる液1ml
に溶かした。このようにしてpKYP26およびpEFM2を各々8
00μｇを得ることができた。pKYP26の構造は、EcoR I,K
pn I,BamH I,Bgl II,Pst Iで切断してアガロースゲル電
気泳動で確認した。またpEFM2の構造は、Xho I,Kpn I,B
gl II,Hpa I,Pst Iで切断してアガロースゲル電気泳動
で確認した。
M BP−863）〕およびpEFM2を含む大腸菌（Escherichia
coli EEFM2（ATCC53228）〕をそれぞれ50μg/mlのアン
ピシリンを含むＬ培地（１％バクトトリプトン、0.5％
酵母エキス、１％NaCl,pH7.5）10ml、で37℃、18時間培
養した。この培養液全量を50μg/mlのアンピシリンを含
むＬ培地１に植菌し、37℃で培養した。４時間後に、
クロラムフェニコールを170μg/mlとなるように加え、
さらに37℃、16時間培養した。遠心分離法（5,000rpm10
分間）により集菌を行い、0.8％NaClで菌体を洗浄した
後、50mMトリス塩酸（pH8.0）20mlに懸濁し、氷冷し
た。10mg/mのリゾチームを8ml加え氷中に10分間静置し
た後、0.5M EDTAを9.3ml加え、氷中に10分間静置し、
２％トリトンＸ−100（和光純薬工業社製）を2.3ml加え
氷中にさらに１時間製置した。50,000×ｇで４℃、１時
間超遠心分離を行い、上清約40mlを得た。次にこの上清
に3M NaOHを加えpHを12.5として、室温で10分間静かに
撹拌した。2Mトリス塩酸（pH7.5）を加え、pHを8.5にも
どし、さらに３分間撹拌した。この時点で液の容量は約
55mlであった。1/9容の5M NaClを加えた後、10mMトリ
ス塩酸（pH7.5）、1mM EDTAで飽和したフェノールを等
量加え、激しく撹拌した後、低速遠心分離法（3,300rp
m,10分間、以下同条件）により水層を集めた（以下、こ
の処理をフェノール抽出と略記する）。1/250容の5mg/m
l RNase A（シグマ社製）を加え、37℃、１時間RNA分解
反応を行った後、1/5容の5M NaClを加え、1/3容の30％
PEG6000（半井化学薬品社製）を加え−20℃に２時間静
置した。遠心分離法で沈殿を集め、10mMトリス塩酸（pH
7.5）および1mM EDTAからなる液2mlに溶かし、ソジウ
ム・ドデシル・サルフェイト（SDS）を0.5％となるよう
に加え、Proteinase Ｋ（シグマ社製）を50μg/mlとな
るように加えて、37℃１時間蛋白質分解反応を行った。
フェノール抽出を３回繰り返し行った後、等量のクロロ
ホルムを加え、激しく撹拌した後低速遠心分離法により
水層を集めた。1/10容の3M酢酸ナトリウムを加え、2.5
倍容のエタノールを加え、−20℃,1時間静置した。冷却
遠心分離法（４℃,11,000rpm,10分間）で沈殿を集め、1
0mMトリス塩酸（pH7.5）および1mM EDTAからなる液1ml
に溶かした。このようにしてpKYP26およびpEFM2を各々8
00μｇを得ることができた。pKYP26の構造は、EcoR I,K
pn I,BamH I,Bgl II,Pst Iで切断してアガロースゲル電
気泳動で確認した。またpEFM2の構造は、Xho I,Kpn I,B
gl II,Hpa I,Pst Iで切断してアガロースゲル電気泳動
で確認した。
（２） ATLVのP24遺伝子を含むプラスミドDNAの造成 （２）−１ pAFB7の造成： pGEL1〔Escherichia coli IGEL1（FERM BP−629）か
ら常法により採取〕の５μｇを10mMトリス塩酸（pH7.
5）,7mM MgCl2,6mMメルカプトエタノールおよび100mM
NaClを含む溶液（以下、Ｙ−100緩衝液と略記する）4
0μに溶かし、制限酵素Pst I（宝酒造社製、以下特記
しない限り制限酵素は宝酒造社製を用いた）10単位、Ba
mH I8単位を加え、37℃,2時間消化反応を行った。この
反応液からLGT法によりlppターミネーターを含む約1,70
0bpのDNA断片を約0.2μｇ得た。
ら常法により採取〕の５μｇを10mMトリス塩酸（pH7.
5）,7mM MgCl2,6mMメルカプトエタノールおよび100mM
NaClを含む溶液（以下、Ｙ−100緩衝液と略記する）4
0μに溶かし、制限酵素Pst I（宝酒造社製、以下特記
しない限り制限酵素は宝酒造社製を用いた）10単位、Ba
mH I8単位を加え、37℃,2時間消化反応を行った。この
反応液からLGT法によりlppターミネーターを含む約1,70
0bpのDNA断片を約0.2μｇ得た。
これとは別に、pGEL1の10μｇを100μのＹ−100緩
衝液に溶かし、制限酵素Pst Iを16単位加え、37℃,1時
間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動法により
Pst I消化が完全に行われたのを確認した後、制限酵素H
pa Iを３単位加え、37℃,30分間消化反応を行いHpa I部
分分解を行った。この反応液からLGT法によりtrp系のプ
ロモーターを含む約940bpの部分分解DNA断片約0.2μｇ
を得た。
衝液に溶かし、制限酵素Pst Iを16単位加え、37℃,1時
間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動法により
Pst I消化が完全に行われたのを確認した後、制限酵素H
pa Iを３単位加え、37℃,30分間消化反応を行いHpa I部
分分解を行った。この反応液からLGT法によりtrp系のプ
ロモーターを含む約940bpの部分分解DNA断片約0.2μｇ
を得た。
次に、pAFA10（ATCC39582に担持された第１図に示す
プラスミド）の30μｇを250μのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素Hpa I140単位、BamH I30単位を加え、37
℃,3時間消化反応を行い、この反応液からLGT法でP24遺
伝子を含む、約700bpのDNA断片を約0.5μｇ得た。
プラスミド）の30μｇを250μのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素Hpa I140単位、BamH I30単位を加え、37
℃,3時間消化反応を行い、この反応液からLGT法でP24遺
伝子を含む、約700bpのDNA断片を約0.5μｇ得た。
上記で得たpGEL1由来のPst I−BamH I断片（約1,700b
p）約0.1μg,Pst I−Hpa I断片（約940bp）約0.15μｇ
およびpAFA10由来のHpa I−BamH I断片（約700bp）約0.
2μｇを20mMトリス塩酸（pH7.5）,10mM MgCl2,10mMジ
チオスレイトールおよび1mM ATPを含む溶液（以下、T4
DNAリガーゼ緩衝液と略記する）20μに溶かし、３単
位のT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を加え、４℃,16時間
結合反応を行った。
p）約0.1μg,Pst I−Hpa I断片（約940bp）約0.15μｇ
およびpAFA10由来のHpa I−BamH I断片（約700bp）約0.
2μｇを20mMトリス塩酸（pH7.5）,10mM MgCl2,10mMジ
チオスレイトールおよび1mM ATPを含む溶液（以下、T4
DNAリガーゼ緩衝液と略記する）20μに溶かし、３単
位のT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を加え、４℃,16時間
結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株〔ボリバーら，ジー
ン２,75（1977）〕を形質転換し、ApRのコロニーを得、
このコロニーよりバーンボイムらの方法〔ヌクレイック
・アシド・リサーチ７,1513（1979）〕によりプラスミ
ドDNAを回収し、第１図に示したpAFB7を得た。
ン２,75（1977）〕を形質転換し、ApRのコロニーを得、
このコロニーよりバーンボイムらの方法〔ヌクレイック
・アシド・リサーチ７,1513（1979）〕によりプラスミ
ドDNAを回収し、第１図に示したpAFB7を得た。
（２）−２ pAAB6の造成： pTAG424A（FERM BP−341に担持された第２図に示す
プラスミド，特開昭60−61534）２μｇを20μのＹ−1
00緩衝液に溶かし、制限酵素BamH Iを４単位加え、37
℃,2時間消化反応を行った。
プラスミド，特開昭60−61534）２μｇを20μのＹ−1
00緩衝液に溶かし、制限酵素BamH Iを４単位加え、37
℃,2時間消化反応を行った。
つづいて該溶液のNaCl濃度を150mMになるように調整
し、制限酵素Nco I（ニッポンジーン社製）を４単位加
え、37℃,2時間消化反応を行った。つづいて、BamH I,N
co Iで切断したDNAを33mMトリス−酢酸（pH7.9）,66mM
酢酸カリウム,10mM酢酸マグネシウム,5mMジチオスレイ
トール，および0.4mMのdATP,dCTP,dGTPG,dTTPを含む溶
液（以下、T4DNAポリメラーゼ緩衝液と略記する）20μ
に溶かし、T4DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）１単位
を加え、37℃,30分反応を行った。
し、制限酵素Nco I（ニッポンジーン社製）を４単位加
え、37℃,2時間消化反応を行った。つづいて、BamH I,N
co Iで切断したDNAを33mMトリス−酢酸（pH7.9）,66mM
酢酸カリウム,10mM酢酸マグネシウム,5mMジチオスレイ
トール，および0.4mMのdATP,dCTP,dGTPG,dTTPを含む溶
液（以下、T4DNAポリメラーゼ緩衝液と略記する）20μ
に溶かし、T4DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）１単位
を加え、37℃,30分反応を行った。
上記の酵素処理液を20μのT4DNAリガーゼ緩衝液に
溶かし、３単位のT4DNAリガーゼを加え、４℃,18時間結
合反応を行った。
溶かし、３単位のT4DNAリガーゼを加え、４℃,18時間結
合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、ApRの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第２図に示したpAA
B6を得た。
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第２図に示したpAA
B6を得た。
（２）−３ pAHA1の造成： 前項で得たpAAB6の15μｇを100μのＹ−100緩衝液
に溶かし、制限酵素Stu I15単位とCla I〔ニュー・イン
グランド・バイオ・ラブス（New England Bio Labs）社
製〕20単位を加え、37℃,3時間消化反応を行い、この反
応液からLGT法でp24遺伝子の前半部分を含む約400bpのD
NA断片を約0.3μｇ得た。
に溶かし、制限酵素Stu I15単位とCla I〔ニュー・イン
グランド・バイオ・ラブス（New England Bio Labs）社
製〕20単位を加え、37℃,3時間消化反応を行い、この反
応液からLGT法でp24遺伝子の前半部分を含む約400bpのD
NA断片を約0.3μｇ得た。
次にpGEL1の５μｇを40μのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素Cla I〔ニュー・イングランド・バイオ・
ラブス（New England Bio Labs）社製〕５単位,Pst I8
単位を加え、37℃,2時間消化反応を行った。この反応液
からLGT法でtrp系のプロモーター部分を含む約1,000bp
のDNA断片を約0.2μｇ得た。
し、制限酵素Cla I〔ニュー・イングランド・バイオ・
ラブス（New England Bio Labs）社製〕５単位,Pst I8
単位を加え、37℃,2時間消化反応を行った。この反応液
からLGT法でtrp系のプロモーター部分を含む約1,000bp
のDNA断片を約0.2μｇ得た。
これとは別に、第１項で得たpKYP26の２μｇを10mMト
リス−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,6mMメルカプトエタノ
ールおよび10mM NaClを含む溶液（以下、Ｙ−10緩衝液
と略記する）30μに溶かし、制限酵素Kpn I5単位を加
え、37℃,2時間消化反応を行った。このKpn Iで切断し
たDNAを20μのT4DNAポリメラーゼ緩衝液に溶かしT4DN
Aポリメラーゼ１単位を加え、37℃,30分間反応をおこな
った。このDNA反応液を30μの−100緩衝液に溶かし、
制限酵素Pst I4単位を加え、37℃,2時間消化反応を行っ
た。この反応液からLGT法でlpp系のターミネーター部分
を含む約1,700bpのDNA断片を約0.2μｇ得た。
リス−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,6mMメルカプトエタノ
ールおよび10mM NaClを含む溶液（以下、Ｙ−10緩衝液
と略記する）30μに溶かし、制限酵素Kpn I5単位を加
え、37℃,2時間消化反応を行った。このKpn Iで切断し
たDNAを20μのT4DNAポリメラーゼ緩衝液に溶かしT4DN
Aポリメラーゼ１単位を加え、37℃,30分間反応をおこな
った。このDNA反応液を30μの−100緩衝液に溶かし、
制限酵素Pst I4単位を加え、37℃,2時間消化反応を行っ
た。この反応液からLGT法でlpp系のターミネーター部分
を含む約1,700bpのDNA断片を約0.2μｇ得た。
上記で得たpAAB6由来のStu I−Cla I断片（約400bp）
約0.1μg,pGEL1由来のCla I−Pst I断片（約1,000bp）
約0.2μg,pKYP26由来のKpn I−Pst I断片（約1,700bp）
約0.1μｇを30μのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶かし、４
単位のT4DNAリガーゼを加え、４℃,18時間結合反応を行
った。
約0.1μg,pGEL1由来のCla I−Pst I断片（約1,000bp）
約0.2μg,pKYP26由来のKpn I−Pst I断片（約1,700bp）
約0.1μｇを30μのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶かし、４
単位のT4DNAリガーゼを加え、４℃,18時間結合反応を行
った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、ApRの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第２図に示したpAH
A1を得た。
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第２図に示したpAH
A1を得た。
（２）−４ pAFG10の造成： 前項で得たpAHA1の５μｇを50μのＹ−100緩衝液に
溶かし、制限酵素Pst Iを８単位加え、37℃,2時間消化
反応を行った。この反応液からLGT法でtrp系のプロモー
ター部分およびP24遺伝子のＮ末端部分を含む約1,100bp
のDNA断片を約0.5μｇ得た。
溶かし、制限酵素Pst Iを８単位加え、37℃,2時間消化
反応を行った。この反応液からLGT法でtrp系のプロモー
ター部分およびP24遺伝子のＮ末端部分を含む約1,100bp
のDNA断片を約0.5μｇ得た。
次に、第１項で造成したpAFB7の６μｇを、30μの
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素BamH Iを８単位加
え、37℃,2時間消化反応を行った。この反応液に0.2Mト
リス−HCl（pH8.0）,120mM CaCl2,120mM MgCl2,2M N
aClおよび10mM EDTAからなる液５μを加え、滅菌水
を15μ加え、30℃に３分間保温した。BAL31ヌクレア
ーゼ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda
Research Laboratories）社製〕を10単位加え30℃で80
秒間分解反応を行った。反応後フェノール抽出を行い、
エタノール沈殿法でDNAを回収した。このDNAを30μの
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Pst Iを８単位加え、
37℃,2時間消化反応を行った。この反応液からLGT法
で、P24遺伝子部分を含む約450bpのDNA断片を約0.1μｇ
得た。
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素BamH Iを８単位加
え、37℃,2時間消化反応を行った。この反応液に0.2Mト
リス−HCl（pH8.0）,120mM CaCl2,120mM MgCl2,2M N
aClおよび10mM EDTAからなる液５μを加え、滅菌水
を15μ加え、30℃に３分間保温した。BAL31ヌクレア
ーゼ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda
Research Laboratories）社製〕を10単位加え30℃で80
秒間分解反応を行った。反応後フェノール抽出を行い、
エタノール沈殿法でDNAを回収した。このDNAを30μの
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Pst Iを８単位加え、
37℃,2時間消化反応を行った。この反応液からLGT法
で、P24遺伝子部分を含む約450bpのDNA断片を約0.1μｇ
得た。
上記で得たpAHA1由来のPst I断片（約1,100bp）約0.2
μg,pAFB7由来のPst I−BAL31ヌクレアーゼ分解断片
（約450bp）0.1μｇ、および前項で得たpKYP26由来のKp
n I−Pst I断片（約1,700bp）0.1μｇを30μのT4DNA
リガーゼ緩衝液に溶かし、T4DNAリガーゼ６単位を加
え、４℃,18時間結合反応を行った。
μg,pAFB7由来のPst I−BAL31ヌクレアーゼ分解断片
（約450bp）0.1μｇ、および前項で得たpKYP26由来のKp
n I−Pst I断片（約1,700bp）0.1μｇを30μのT4DNA
リガーゼ緩衝液に溶かし、T4DNAリガーゼ６単位を加
え、４℃,18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、ApRの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第３図に示したpAF
G10を得た。P24をコードする領域のＣ末端の塩基配列を
決定したところ、第３図に示した様にP24のＣ末端まで
を含み、さらにVal・Val・Leu・Ser・Asnが付いた構造
になっていることが確認された。
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第３図に示したpAF
G10を得た。P24をコードする領域のＣ末端の塩基配列を
決定したところ、第３図に示した様にP24のＣ末端まで
を含み、さらにVal・Val・Leu・Ser・Asnが付いた構造
になっていることが確認された。
（３） ATLVのgag遺伝子によりコードされる抗原ポリ
ペプチドとenv遺伝子によりコードされる抗原ポリペプ
チドとが融合したハイブリッド抗原ポリペプチドをコー
ドする組換え対プラスミドpET I7の造成： 第２項で得た組換え体プラスミドpAFG10の10μｇを10
0μのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Xho Iを10単
位,Stu Iを12単位加え、37℃,3時間消化反応を行った。
ペプチドとenv遺伝子によりコードされる抗原ポリペプ
チドとが融合したハイブリッド抗原ポリペプチドをコー
ドする組換え対プラスミドpET I7の造成： 第２項で得た組換え体プラスミドpAFG10の10μｇを10
0μのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Xho Iを10単
位,Stu Iを12単位加え、37℃,3時間消化反応を行った。
この反応液からLGT法によりトリプトプァン系のプロ
モーターとP24遺伝子の前半を含む約630bpのDNA断片約
0.5μｇを得た。
モーターとP24遺伝子の前半を含む約630bpのDNA断片約
0.5μｇを得た。
次に第１項で得たpEFM2の５μｇを50μのＹ−100緩
衝液に溶かし、制限酵素Xho Iを10単位,Hpa Iを８単位
加え、37℃,3時間消化反応を行った。この反応液からLG
T法により、env遺伝子の後半を含む約2,700bpのDNA断片
を約１μｇ得た。
衝液に溶かし、制限酵素Xho Iを10単位,Hpa Iを８単位
加え、37℃,3時間消化反応を行った。この反応液からLG
T法により、env遺伝子の後半を含む約2,700bpのDNA断片
を約１μｇ得た。
上記で得たpAFG10由来のXho I−Stu I断片（約630b
p）0.05pmoleとpEFM2由来のXho I−Hpa I断片（約2,700
bp）0.01pmoleを40μのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶か
し、T4DNAリガーゼ５単位を加え、４℃,18時間結合反応
を行った。
p）0.05pmoleとpEFM2由来のXho I−Hpa I断片（約2,700
bp）0.01pmoleを40μのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶か
し、T4DNAリガーゼ５単位を加え、４℃,18時間結合反応
を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、ApRの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第４図に示したpET
I7を得た。
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第４図に示したpET
I7を得た。
（４） pET I7を保有する大腸菌によるgag遺伝子によ
りコードされる抗原ポリペプチドとenv遺伝子によりコ
ードされる抗原ポリペプチドとの融合ポリペプチドの生
産： 第３項３で得られた組換え体プラスミドpET I7を用い
常法により大腸菌W3110StrA株（FERM BP−732）を形質
転換した。得られたApRのコロニーを8mlのMCG培地〔0.6
％ Na2HPO4,0.3％ KH2PO4,0.5％ NaCl,0.1％ NH4C
l,0.5％グルコース,0.5％カザミノ酸,1mM MgSO4,4μg/
mlビタミンB1,pH7.2〕に接種し、30℃で18時間培養し
た。得られた培養液を8,000rpm,10分間遠心して菌体を
回収した。この菌体をレムリのサンプルバッファーに懸
濁後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子量約2
5,000の部位にポリペプチドバンドを検出した。このバ
ンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合には
存在しなかった。
りコードされる抗原ポリペプチドとenv遺伝子によりコ
ードされる抗原ポリペプチドとの融合ポリペプチドの生
産： 第３項３で得られた組換え体プラスミドpET I7を用い
常法により大腸菌W3110StrA株（FERM BP−732）を形質
転換した。得られたApRのコロニーを8mlのMCG培地〔0.6
％ Na2HPO4,0.3％ KH2PO4,0.5％ NaCl,0.1％ NH4C
l,0.5％グルコース,0.5％カザミノ酸,1mM MgSO4,4μg/
mlビタミンB1,pH7.2〕に接種し、30℃で18時間培養し
た。得られた培養液を8,000rpm,10分間遠心して菌体を
回収した。この菌体をレムリのサンプルバッファーに懸
濁後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子量約2
5,000の部位にポリペプチドバンドを検出した。このバ
ンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合には
存在しなかった。
このポリペプチドの分子量は、プラスミドpET I7の構
造から予想されるハイブリッド抗原ポリペプチドの分子
量（25,051.02）と一致した。
造から予想されるハイブリッド抗原ポリペプチドの分子
量（25,051.02）と一致した。
（５） 第４項で述べた培養液１より遠心分離（8.00
0rpm,30分間）して得られた菌体を200mlの脱イオ水に懸
濁し、マントンガウリンホモゲナイザー（製造元;MANTO
NGAULIN MANUFACTURING Co.,INC.USA）により400kg/cm2
の圧力で菌体破砕を行い、沈殿画分を遠心分離により得
た。本沈殿画分はSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に
より分析するとgag−env蛋白845mgを含有していた。
0rpm,30分間）して得られた菌体を200mlの脱イオ水に懸
濁し、マントンガウリンホモゲナイザー（製造元;MANTO
NGAULIN MANUFACTURING Co.,INC.USA）により400kg/cm2
の圧力で菌体破砕を行い、沈殿画分を遠心分離により得
た。本沈殿画分はSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に
より分析するとgag−env蛋白845mgを含有していた。
本沈殿画分を４％（W/V）トリトンＸ−100,10mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液
（pH7.4）に分散し遠心分離により再び沈殿画分を得、
この沈殿を2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム,0.3
％（V/V）２−メルカプトエタノール,7M尿素を含むリン
酸緩衝液（pH7.4）で溶解し、あらかじめ7M尿素を含む2
0mMリン酸緩衝液（以下、平衡化緩衝液とよぶ,pH7.0）
で平衡化したTSKgelCMトヨパール650（東洋曹達工業社
製）100mlに通塔、吸着させた。
レンジアミン四酢酸ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液
（pH7.4）に分散し遠心分離により再び沈殿画分を得、
この沈殿を2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム,0.3
％（V/V）２−メルカプトエタノール,7M尿素を含むリン
酸緩衝液（pH7.4）で溶解し、あらかじめ7M尿素を含む2
0mMリン酸緩衝液（以下、平衡化緩衝液とよぶ,pH7.0）
で平衡化したTSKgelCMトヨパール650（東洋曹達工業社
製）100mlに通塔、吸着させた。
平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、0.1M NaClを加えた
平衡化緩衝液で溶出し、高純度画分250mlを得た。本画
分は430mgのgag−env蛋白を含有していた。この高純度
画分を、10mM炭酸緩衝液（pH9.4）３を外液として透
析し、生じた沈殿を遠心分離により除去後、遠心分離上
清として目的gag−env蛋白溶液400mlを得た。SDS−PAGE
により分析すると、蛋白純度は90％以上であり、収量は
160mgであった。
平衡化緩衝液で溶出し、高純度画分250mlを得た。本画
分は430mgのgag−env蛋白を含有していた。この高純度
画分を、10mM炭酸緩衝液（pH9.4）３を外液として透
析し、生じた沈殿を遠心分離により除去後、遠心分離上
清として目的gag−env蛋白溶液400mlを得た。SDS−PAGE
により分析すると、蛋白純度は90％以上であり、収量は
160mgであった。
発明の効果 本発明によれば、抗ATLV抗体の検出を精度高く行うこ
とができ、ATLの血清診断を効果的に行うことができ
る。さらに本発明方法はＰ−24と交差反応を示す疾患に
応用できる。
とができ、ATLの血清診断を効果的に行うことができ
る。さらに本発明方法はＰ−24と交差反応を示す疾患に
応用できる。
第１図はプラスミドpAFB7の造成工程を示す。 第２図はプラスミドpAHA1の造成工程を示す。 第３図はプラスミドpAFG10の造成工程を示す。 第４図はプラスミドpETI7の造成工程を示す。 第５図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸,P−24法の抗体値
をＸ軸としたときの相関図を示す。相関関数は0.8924で
ある。単一度数分布による最小２乗法（１次回帰）によ
り、回帰式を求めるとＹ＝2.7437X＋0.2151を示す。 第６図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸,gag−env法の抗
体値をＸ軸としたときの相関図を示す。相関係数は0.74
79である。単一度数分布による最小２乗法（１次回帰）
により回帰式を求めるとＹ＝1.9473X−0.1119を示す。
をＸ軸としたときの相関図を示す。相関関数は0.8924で
ある。単一度数分布による最小２乗法（１次回帰）によ
り、回帰式を求めるとＹ＝2.7437X＋0.2151を示す。 第６図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸,gag−env法の抗
体値をＸ軸としたときの相関図を示す。相関係数は0.74
79である。単一度数分布による最小２乗法（１次回帰）
により回帰式を求めるとＹ＝1.9473X−0.1119を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (3)
- 【請求項１】成人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下ATLVとい
う）のgag遺伝子とATLVのenv遺伝子とが結合した融合遺
伝子によってコードされているポリペプチドを抗原物質
として用いる免疫学的方法により試料中の抗ATLV抗体を
検出することを特徴とする抗ATLV抗体の検出法。 - 【請求項２】融合遺伝子によってコードされるポリペプ
チドが下記アミノ酸配列を有するポリペプチドである特
許請求の範囲第１項記載の抗ATLV抗体の検出法。 - 【請求項３】免疫学的方法が、ラジオ・イムノアッセ
イ，エンザイム・イムノアッセイ，フルオレッセンス・
イムノアッセイ，逆受身凝集反応，フィトヘトマトアグ
リチネーション，パーテイクルアグリチネーション，レ
ーザーネフロメトリーおよび免疫溶血反応から選ばれる
特許請求の範囲第１項記載の検出法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61271606A JP2501569B2 (ja) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | 抗成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体の検出法 |
| EP19870116787 EP0267622A3 (en) | 1986-11-14 | 1987-11-13 | Method for detecting anti-adult t cell leukemia virus antibody |
| CA000551934A CA1289068C (en) | 1986-11-14 | 1987-11-13 | Method for detecting anti-adult t cell leukemia virus antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61271606A JP2501569B2 (ja) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | 抗成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体の検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63124963A JPS63124963A (ja) | 1988-05-28 |
| JP2501569B2 true JP2501569B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=17502418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61271606A Expired - Lifetime JP2501569B2 (ja) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | 抗成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体の検出法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2501569B2 (ja) |
| CA (1) | CA1289068C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5614366A (en) * | 1986-12-31 | 1997-03-25 | Genelabs Technologies, Inc. | HTLV-I peptide antigens and kit |
| JP2668403B2 (ja) * | 1988-08-02 | 1997-10-27 | 日水製薬株式会社 | Ａｔｌ抗体測定試薬 |
| SE8900721D0 (sv) * | 1989-03-02 | 1989-03-02 | Blomberg Jonas | Methods for detection of antibodies to |
| US5359029A (en) * | 1990-07-18 | 1994-10-25 | Biochem Immunosystems Inc. | Peptides and analogues and mixtures thereof for detecting antibodies to HTLV-I and HTLV-II viruses |
| US5773211A (en) * | 1991-07-10 | 1998-06-30 | Abbott Laboratories | Differentiation of HTLV-I and HTLV-II using synthetic peptides |
| JP3506252B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2004-03-15 | ジェネラブス・テクノロジーズ・インコーポレイテッド | Ｈｔｌｖ−ｉ／ｈｔｌｖ−ｉｉの分析及び方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59104325A (ja) * | 1982-12-07 | 1984-06-16 | Japan Found Cancer | ヒト白血病ウイルスの遺伝子ｒｎａに相補性を示すｄｎａ |
| JPS6187697A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-06 | Fujirebio Inc | Ａｔｌｖ抗原活性を有する蛋白及びその製造法 |
| JPS61108540A (ja) * | 1984-11-01 | 1986-05-27 | Dainichi Nippon Cables Ltd | 断熱管の製法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340878C (en) * | 1984-10-26 | 2000-01-25 | Takis S. Papas | Production of human t-cell leukemia (lymphotropic) retrovirus (htlv-i) envelope protein fragments in bacteria and use in seroepidemiological survey of human lymphoid malignancies |
| JP2564268B2 (ja) * | 1985-08-28 | 1996-12-18 | 協和醗酵工業株式会社 | 融合抗原ポリペプチド |
| EP0246101A3 (en) * | 1986-05-14 | 1989-06-07 | FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. | Protein having htlv-1 antigenic activity and preparation thereof |
-
1986
- 1986-11-14 JP JP61271606A patent/JP2501569B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-11-13 EP EP19870116787 patent/EP0267622A3/en not_active Withdrawn
- 1987-11-13 CA CA000551934A patent/CA1289068C/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59104325A (ja) * | 1982-12-07 | 1984-06-16 | Japan Found Cancer | ヒト白血病ウイルスの遺伝子ｒｎａに相補性を示すｄｎａ |
| JPS6187697A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-06 | Fujirebio Inc | Ａｔｌｖ抗原活性を有する蛋白及びその製造法 |
| JPS61108540A (ja) * | 1984-11-01 | 1986-05-27 | Dainichi Nippon Cables Ltd | 断熱管の製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0267622A3 (en) | 1991-01-30 |
| JPS63124963A (ja) | 1988-05-28 |
| CA1289068C (en) | 1991-09-17 |
| EP0267622A2 (en) | 1988-05-18 |
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