JPS63124963A - 抗成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、成人Ｔ細胞白血病ウィルス〔ＡＴＬＶと略称
されるが、ヒ）Ｔ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−１と
略称される）とも称されている〕のｇａｇ遺伝子または
その一部とＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子またはその一部とが
結合した融合遺伝子によってコードされるポリペプチド
を抗原物質として用いる免疫学的方法により試料中の抗
ＡＴＬＶ抗体を検出する方法に関する。

従って本発明は臨床診断の分野において有用である。

従来技術 従来、抗原抗体反応は広い分野で利用されている技術で
あるが、特に医療分野では病気の診断、治療および予防
に幅広く応用されている。

これらは抗原抗体反応の高い特異性に依存しており、こ
の高い特異性が診断の正確性、治療および予防の有効性
を保証している。

成人Ｔ細胞白血病（以下ＡＴＬという）はＡＴＬＶ　（
ＨＴＬＶ−１）が原因と考えられており、ＡＴＬＶ　（
ＨＴＬＶ−１）感染の血清診断はＡＴＬの診断および感
染の予防などにとって重要である。ΔＴＬＶ感染は、血
清中のＡＴＬ−関連抗原（以下ＡＴＬＡという）に対す
る抗体の有無を抗原抗体反応を利用して検出することに
より行われている。従来知られている抗ＡＴＬＶ抗体検
出方法としては、抗原物質としてＡＴＬＶのｇａｇ遺伝
　子の産物であるＰ−２４を用いる方法（以下Ｐ−２４
法と称す）、抗原物質として全ＡＴＬＶの遺伝子産物で
あるポリペプチドを用いる方法および抗原物質としてｅ
ｎｖ遺伝子産物を用いる方法が知られている。

発明が解決しようとする問題点 ることがあり、さらに優れた検出方法の開発が望まれて
いる。

問題点を解決するための手段 本発明者は、抗ＡＴＬＶ抗体の優れた検出方法を見出す
べく研究を行った結果、ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子とｅｎ
ｖ遺伝子とが結合した融合遺伝子によってコードされる
ポリペプチドを抗原物質として用いた場合に抗ＡＴＬＶ
抗体の検出が極めて精度よく行われることを見出し、本
発明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子またはその一部とＡ
ＴＬＶのｅｎｖ遺伝子またはその一部とが結合した融合
遺伝子によってコードされるポリペプチドを抗原物質と
して用いる免疫学的方法により試料中の抗ＡＴＬＶ抗体
を検出することを特徴とする抗ＡＴＬＶ抗体の検出方法
に関する。

本発明に抗原物質として用いるポリペプチドとしては、
ｇａｇ遺伝子またはその一部とｅｎｖ遺伝子またはその
一部とが結合した融合遺伝子によってコードされるもの
であればいかなるものも用いることができる。好適には
、参考例１に示した方法で製造される下記アミノ酸配列
を有するもの（以下ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白という）が用い
られる。ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白は、Ｐ−２４ＯＮ末端側１
４番目のアミノ酸（プロリン）から１３９番目のアミノ
酸（グリシン）までのポリペプチドとｅｎｖのＮ末端側
１９７番目のアミノ酸（スレオニン）から２９５番目の
アミノ酸（プロリン）までのポリペプチドとが結合した
ポリペプチドのＮ末端側にメチオニン−アスパラギン酸
が、Ｃ末端側にリジン（Ｌｙｓ）が付加されたポリペプ
チドである。

本発明が適用される試料としては、血液などの体液や尿
などがあげられる。

本発明で用いる免疫学的方法としては、下記のものがあ
げられ、各文献記載の方法を用いて実施できる。

０エンザイム・イムノアッセイ（以下ＥＩΔという） 酵素免疫測定法、医学書院１石川栄治ら。

１９７８年。

０ラジオ・イムノアッセイ（以下ＲＩＡという）免疫血
清学、医歯薬出版、稲井真彌ら、　１９８１年０フルオ
レツセンス・イムノアッセイ（以下ＦＩＡという） 同　　　上 ０逆受身凝集反応 同　　　上 ０フイトヘマトアグリチネーシヨン 同　　　上 ０レーザーネフロメトリー 同　　　上 ０免疫溶血反応（赤血球またはリポソームを用いる方法
） 同　　　上 、０パーテイクルアグリチネーシヨン 最新検査、医典社、　Ｖｏｌ、２　Ｎ（１２，１５１〜
１５７゜１９８４、　Ｇａｎｎ　　７５．８４５．１９
８４ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡにおいては、均−系のみな
らず、サンドイツチ法などの不均一系の分析方法も可能
である。

具体例としてＥＩＡをサントイフチ法で行う例を下記に
示す。

抗原物質をマイクロタイタープレートのウェルにコーテ
ィングし、血清試料を適当な緩衝液たとえば緩衝液Ａ　
Ｃ０，１５Ｍ　　ＮａＣｊ！、　Ｏ，’４％ゼラチン、
１％牛血清アルブミンおよび０．１％ＮａＮ３を含むｌ
／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，２）　）
で希釈した液をウェルに入れ、４〜３７℃、１時間〜１
週間静置し、適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂ（０，０
５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１５Ｍ　　ＮａＣＲを含
むｌ／１５Ｍリン酸ナトリウム１１１新液（ｐＨ７，２
））でウェルをよく洗浄する。ウサギ抗ヒト免疫グロブ
リン抗体のＦａｂフラグメントとホースラディツシュパ
ーオキシダーゼとを過沃素酸法により結合させたコンジ
ユゲートを適当な緩衝液、たとえば緩衝液Ｂで希釈した
液をウェルに入れる。

４〜４５℃で１〜２４時間静置後、同じ緩衝液で洗浄す
る。ついで適当な基質溶液たとえばオルソ・フェニレン
ジアミン基質ｍ液（０，０２％。

オルソ・フェニレンジアミンおよび３５ｍＭ過酸化水素
を含むｌ／１５Ｍ！ｌン酸ナトリウム緩衡液（ｐＨ７，
２））をウェルに入れ、１５〜３７℃で５〜６０分間静
置する。２ＮＨ２Ｓ○、で反応を停止させ、室温で１〜
１０分間放置後、マイクロタイタープレート用フォトメ
ーターで４１０１ｍおよび６００ｎｍにふける吸光度（
０，Ｄ、、）を測定し、前者の値から後者の値を差し引
いた値を抗体値とする。

ここに示した方法は一例示であり、抗体や基質液、発色
剤などの変更は、適宜行うことがでる。

ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白を用いる本発明方法は優れた抗ＡＴ
ＬＡ抗体の検出方法であるが、ｇａｇ遺伝子産物とｅｎ
ｖ遺伝子産物とを同−担体上に結合させたもの（以下カ
クテル抗原ポリペプチドという）を用いても本発明方法
と同様に優れた効果が期待できる。カクテル抗原ポリペ
プチドは、ｇａｇ遺伝子産物とｅｎｖ遺伝子産物とを適
当な担体たとえばリポソーム、合成樹脂またはガラス製
の固相担体に物理的または化学的に吸着させることによ
り製造することができる。

本発明方法は、抗ＡＴＬＶ抗体の検出に優れた効果を示
すが、Ｐ−２４と交差反応を示す疾患として知られてい
るＴ　Ｓ　Ｐ　（Ｔｒｏｐｉｃａｌ　５ｐａｓｔｉｃＰ
ａｒａｐｌｅｓｉａ、　熱帯性痙彎性対麻痺症）、ＨＡ
Ｍ（ＨＴＬＶ−１関連を髄病）　、　Ｍ　Ｓ　（Ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅＳｃｌｅｒｏｓｉｓ、多発性硬化症）および
ＡＴＬ以外の各種の癌（たとえば肝癌、子宮１）に適用
できる。

実施例１゜ 抗原物質としてｇａｇ−ｅｎｖ蛋白（ｇａｇ−ｅｎｖ法
）またはｇａｇ遺伝子産物の断片であるＰ−２４を用い
るＥＩＡ（Ｐ−２４法）ならびに天然のＡＴＬ■を用い
るエーザイ法（エイテスト■ＡＴＬ、エーザイ社）によ
りＡＴＬ患者、ＨＴＬＶ−１保菌者および正常人血清に
おける抗ＡＴＬＶ抗体の検出を行った。

（１）　　ｇ　ａ　ｇ　−ｅ　ｎ　ｖ蛋白およびＰ−２
４を用いるＥＩＡ（サンドイツチ法） 血清試料としてＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者５
７名および正常人３０名の血清を用いた。ｇａｇ−ｅｎ
ｖ蛋白としては参考例１の方法で得られるポリペプチド
を用い、Ｐ−２４は特開昭６０−６１５３４号に記載の
方法に従って１尋られるｇａｇポリペプチドを用いた。

１埒のｇａｇ−ｅｎｖ蛋白および３ＪｔｇのＰ−２４を
それぞれマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）のウ
ェルにコーティングした。

各血清を緩衝液Ａ（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１゜０．１％
ゼラチン、１％牛牛血清アルブミン上び０．１％ＮａＮ
５を含む１／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７゜
２）で２０倍に希釈した。この希釈液１００１ＩＪｌを
上記ウェルに入れ、室温で２時間静置後、ｔ！ｉ衝液Ｂ
ＣＯ１０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　（和光純薬工業社製）
および０．１５Ｍ　　Ｎａ（Ｊを含む１／１５Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、　ｐＨ７，２）　１５０ｊｔ！ｌで
３回洗浄した。

ウサギ抗ビト免疫グロブリン抗体のＦａｂフラグメント
（酵素免疫測定法、医学書院。

石川栄治ら、１９７８）とホースラディシュパーオキシ
ダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）とを過沃素酸法（同上文献）
により結合させたコンジユゲート（８０■／ｍｌ　）を
緩衝液Ｂで２０倍に希釈した溶液１００ｉＩｆ！を各ウ
ェルに入れた。室温で２時間静置後、緩衝液Ｂ　１５０
ｊｔ１で３回洗浄した。ついで、オルソ・フェニレンジ
アミン基質溶液（０，０２％オルソ・フェニレンジアミ
ンおよび３５ｍＭ過酸化水素を含む１／１５Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７，２）１００ｇを各ウェルに入
れ、室温で１５分間静置した。２Ｎ　　Ｈ２ＳＯ＊　　
５０．ｄを各ウェルに入れて反応を停止させ、１０分間
室温で放置後、マイクロタイタープレート用フォトメー
ターＭＴＰ−２２型（コロナ社製）で４１０ｎｍ右よび
６０Ｑｎｍにおける吸光度（０，Ｄ、　）を測定し、そ
の差で抗体値を得た。

試験はすべて二系列で行い平均値を測定値とした。

（２）エーザイ社製のエイテスト■ＡＴＬを用い、１項
と同じ試料を用いて臨床検査２９（１）　：　９１−９
４　（１９８５）に記載の方法（エーザイ法）にて１項
と同じ試料について抗ＡＴＬＶ抗体検出を行った。

（３）正常人３０名の血清について１および２項で測定
した測定値（０，Ｄ、　）の平均値および標準偏差値は
次のとおりであった。

ｇａｇ−ｅｎｖ　　　Ｏ，０５５±０．０１３Ｐ−２４
０，０１０±０．００４ エーザイ　　　　　　　０．０４０±０．００９平均値
と標準偏差値の２倍との和をカットオフ値とすると、Ｐ
−２４の場合０．０１８　。

ｇａｇ−ｅｎｖ蛋白の場合０．０８１．エーザイの場合
０．０５９がカットオフ値となる。

ＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者５７名についての
測定結果を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 第１表の測定値と、上記のカットオフ値で陽性率を算出
した結果を第２表に示す。

第　　　２　　　　表 第２表により、正常人についてはどの方法でも偽陽性は
０％であり、ＡＴＬ患者またはＨＴＬＶ−１保菌者では
Ｐ−２４の場合１０名が偽陰性（カットオフ値０．０１
８以下）。

エーザイ法の場合１名が偽陰性〈カットオフ値０．０５
９以下）を示すのに対しｇａｇ−ｅｎｖ蛋白の場合偽陰
性（カットオフ値０．０８１以下）は１名もなく、１０
０％の陽性率を示すことがわかる。

エーザイ法とＰ−２４法またはｇａｇ−ｅｎｖ法との相
関性について計算した結果を第５図および第６図に示す
。エーザイ法とＰ−２４法との相関係数は０．８２９４
．エーザイ法とｇａｇ−ａｎｙ法の相関係数は０．７４
７９であった。この相関計数の値は、エーザイ法。

Ｐ−２４法、ｇａｇ−ｅｎｖ法が互ニ相関関係を有して
いることを示している。

参考例１゜ （１）プラスミドｐＫＹＰ　２６およびｐＥＦＭ２の分
離精製 ｐＫＹＰ２６の含む大腸菌［：Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ　　ＩＫＹＰ２６　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８６
３）］およびｐＥＦＭ２を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ　
ｉｃｈ　１ａｃｏｌｉ　　ＥＥＦＭ２　（ＡＴＣＣ５３
２２８））をそれぞれ５０■／ｍｌのアンピシリンを含
むＬ培地（１％バタトトリプトン、０．５％酵母エキス
、１％ＮａＣＣｌ（７，５）１０＋ｍＬで３７℃、１８
時間培養した。この培養液全量を５０■／ｍｌのアンピ
シリンを含むし培地１１に植菌し、３７℃で培養した。

４時間後に、クロラムフェニコールを１７０■／ｍｌ　
、！：なるように加え、さらに３７℃、１６時間培養し
た。遠心分離法（５，ＯＯＯｒｐｍ　１０分間）により
集菌を行い、０．８％ＮａＣ１で菌体を洗浄した後、５
ＱｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）２０ｍｌに懸濁し、氷
冷した。１０ｍｇ／ｍｌのりゾチームを３ｍｌ加え水中
に１０分間静置した後、０．５Ｍ　　ＥＤＴＡを９．（
ｉｍｌ加え、水中に１０分間静置し、２％トリトンＸ−
１００（和光純薬工業社製）を２．３ｍｌ加え水中にさ
らに１時間静置した。　５０，０００　Ｘ　ｇで４℃、
１時間超遠心分離を行い、上清約４Ｑｍｌを得た。

次にこの上清に３Ｍ　　ＮａＯＨを加えｐＨを１２．５
として、室温で１０分間静かに攪拌した。２Ｍ）リス塩
酸（ｐＨ７，５）を加え、ｐＨを８．５にもどし、さら
に３分間攪拌した。

この時点で液の容量は約５５ｍｌであった。

１／９容の５Ｍ　　ＮａＣｊ！を加えた後、１０ｍＭ）
リス塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡで飽和した
フェノールを等最前え、激しく攪拌した後、低速遠心分
離法（３，３０Ｏｒｐｍ　。

１０分間、以下同条件）により水層を集めたく以下、こ
の処理をフェノール抽出と略記する）。１／、２５０容
の５　ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａ　（シグマ社製）を
加え、３７℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った後、１１
５容の５Ｍ　　ＮａＣｊ！を加え、１／３容の３０％Ｐ
ＥＧ６０００（半井化学薬品社製）を加え一２０℃に２
時間静置した。遠心分離法で沈殿を集め、１０ｍＭ）リ
ス塩酸（ｐ　Ｈ７，５）および１ｍＭＥＤＴＡからなる
液２ｍｌに溶かし、ソジウム・ドデシル・サルフェイト
（ＳＤＳ）を０．５％となるように加え、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎａｓｅ　　Ｋ　（シグマ社製）を５０■／ｍｌとなる
ように加えて、３７℃１時間蛋白質分解反応を行った。

フェノール抽出を３回繰り返し行った後、等量のクロロ
ホルムを加え、激しく攪拌した後低速遠心分離法により
水層を集めた。１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え
、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃、１時間静
置した。

冷却遠心分離法（４℃、　１１，０００　ｒｐｍ、　　
１０分間）で沈殿を集め、１０ｍＭ）！Ｊス塩酸（ｐＨ
７，５）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる液１ｍｌに
溶かした。このようにしてｐＫＹＰ２６およびｐＥＦＭ
２を各々８００肩を得ることができた。ｐＫＹＰ２６の
構造は、ＥｃｏＲＩ。

Ｋｐｎ　１．ＢａｍＨＩ、Ｂｇｊ７Ｉ［、Ｐｓ　ｔ　１
で切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。またｐ
ＥＦＭ２の構造は、Ｘｈｏ　Ｉ。

ＫｐＴｌ　１．　ＢｇＩ！Ｉｌ、　Ｈｐａ　１．　Ｐｓ
　ｔ　Ｉテ切断してアガロースゲル電気泳動で確認した
。

（２）ＡＴＬＶのＰ２４遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ
の造成 （２）−Ｌ　　ｐＡＦＢ７の造成： ｐＧＥＬＩ　Ｃε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ
ＧＦｉＬｌ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６２９）から常法によ
り採取〕の５ＲをｌＱｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、
７ｍＭ　　ＭｇＣｌ１．．６ｍＭメルカプトエタノール
および１００ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶液（以下、Ｙ−１
００１１衝液と略記する）４０ρに溶かし、制限酵素Ｐ
ｓｔ■（宝酒造社製、以下特記しない限り制限酵素は宝
酒造社製を用いた）１０単位、ＢａｍＨＩ３単位を加え
、３７℃、２時間消化反応を行った。この反応液からＬ
ＧＴ法によりβｐｐターミネーターを含む約１．７００
ｂｐのＤＮＡ断片を約０．２■得た。

これとは別に、ｐＧＥＬ　１の１０■を１００、ｄのＹ
−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＰｓｔＩを１６単位
加え、３７℃。

１時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動法に
よりＰｓｔｌ消化が完全に行われたのを確認した後、制
限酵素Ｈｐａ　１を３単位加え、３７℃、３０分間消化
反応を行いＨｐａ　１部分分解を行った。この反応液か
らＬＧＴ法によりｔｒｐ系のプロモーターを含む約９４
０ｂｐの部分分解ＤＮＡ断片約０．２Ｊｔｇを得た。

次に、ｐＡＦＡｌｏ　（ＡＴＣＣ３９５８２に担持され
た第１図に示すプラスミド）の３０ｇを２５０４のＹ−
１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｈｐａ　Ｉ　１４０単
位、ＢａｍＨＩ　３０単位を加え、３７℃、３時間消化
反応を行い、この反応液からＬＧＴ法でＰ２４遺伝子を
含む、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を約０．５■得た。

上記で得たｐＧＥＬｌ由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片
（約１，７００ｂｐ）約０．１ｇ、　Ｐｓ　ｔ　Ｉ−）
（ｐａ　ｒ断片（約９４０ｂｐ）約０．１５ｘｒおよび
ｐＡＦＡ　１０由来のＨｐａＩ−ＢａｍＨＥ断片（約７
００　ｂｐ）約０．２■を２０　ｍ　Ｍ　）リス塩酸（
ｐＨ７，５）。

１０ｍＭ　　ＭｇＣＡ’２．１０ｍＭジチオスレイトー
ルおよび１ｍＭ　　ΔＴＰを含む溶液（以下、Ｔ　４　
ＤＮＡ　！Ｊガーゼ緩衝液と略記する）２０ρに溶かし
、３単位のＴ４ＤＮΔリガーゼ（宝酒造社製）を加え、
４℃、１６時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株 〔ポリバーら、ジーン２　、７５　（１９７７）　〕を
形質転換し　Ａ　ｐ　ｌのコロニーを得、このコロニー
よりバーンボイムらの方法〔ヌクレイツク・アシド・リ
サーチュ、　１５１３　（１９７９）　〕によりプラス
ミドＤＮＡを回収し、第１図に示したｐＡＦＢ７を得た
。

（２）−２ｐＡＡＢ６の造成： ｐＴＡＧ４２４Ａ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３４１に担持さ
れた第２図に示すプラスミド、特開昭６６０−６１５３
４）２１Ｌを２０ρのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限
酵素ＢａｍＨ１を４単位加え、３７℃、２時間消化反応
を行った。

つづいて該溶液のＮａＣ１＄度を１５０ｍＭになるよう
に調整し、制限酵素Ｎｃｏ　Ｉにッポンジーン社製）を
４単位加え、 ３７℃、２時間消化反応を行った。つづいて、ＢａｍＨ
Ｉ、Ｎｃｏ　■で切断したＤＮＡを３３ｍＭ）リス−酢
酸（ｐＨ７，９＞。

６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５
ｍＭジチオスレイトール、および０．４　ｍ　ＭのｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰを含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩
衝液と略記する）２０ｇに溶かし、Ｔ４ＤＮΔポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）１単位を加え、３７℃、３０分反応
を行った。

上記の酵素処理液を２０４のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
に溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃、
１８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｌのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第２図に
示したｐＡＡＢ６を得た。

（２）−３ｐＡＨＡｌの造成： 前項で得たｐＡＡＢ６の１５Ｊｔｇを１００４のＹ−１
００緩衝液に溶かし、制限酵素５ｔｕ１１５単位とＣｊ
！ａＩ　（二、−・イングランド・バイオ・ラプス（Ｎ
ｅｗ　ＢｎｇｌａｎｄＢｉｏ　Ｌａｂｓ）社製〕２０単
位を加え、３７℃。

３時間消化反応を行い、この反応液からＬＧＴ法でｐ２
４遺伝子の前半部分を含む約４００ｂｐのＤＮＡ断片を
約０．３■得た。

次にｐＧＥＬｌの５■を４０４のＹ−１００緩衝液に溶
かし、制限酵素Ｃｊ！ａｌにュー・イングランド・バイ
オ・ラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ
）社製〕５５単、ＰＳｔ■８単位を加え、３７℃、２時
間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法でｔｒｐ
系のプロモータ一部分を含む約１．０００　ｂ　ｐのＤ
ＮＡ断片を約０．２■得た。

これとは別に、第１項で得たｐＫＹＰ２６の２肩をｌｏ
ｍＭ）リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）。

７ｍＭ　　ＭｇＣＲｚ　　、６ｍＭ＋１ルカプトエタノ
ールおよび１０ｍＭ　　ＮａＣ１を含む溶液（以下、Ｙ
−１０緩衝液と略記する）３０ｍに溶かし、制限酵素Ｋ
ｐｎＩ５単位を加え、３７℃、２時間消化反応を行った
。

このＫｐｎ　Ｉで切断したＤＮＡを２０４のＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ緩衝液に溶かしＴ４ＤＮＡポリメラーゼ１
単位を加え、３７℃。

３０分間反応をおこなった。このＤＮＡ反応液を３０譚
の一１００緩衝液に溶かし、制限酵素ｐｓｔ１４単位を
加え、３７℃。

２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法でｚ
ｐｐ系のターミネータ一部分を含む約１．７００　ｂ　
ｐのＤＮＡ断片を約０．２■得た。

上記で得たｐＡＡＢ６由来の５ｔｕｌ−Ｃ１ｌａ■断片
（約４００ｂｐ）約ｏ、１ｇ。

ｐＧＥＬ１由来のＣｊ！ａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１，０
００ｂｐ）約０．２肩、ｐＫＹＰ２６由来のＫｐｎＩ−
ＰｓｔＩ断片（約１．７００ｂｐ）約０．１■を３０ｄ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、４単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、４℃、１８時間結合反応を行った
。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、Δ
ｐ１のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第２図に
示したｐＡＨＡｌを得た。

（２）−４ｐへＦＧＩＯの造成： 前項で得たｐＡＨＡｌの５１１ｇを５０ｄのＹ−１，０
０緩衝液に溶かし、制限酵素ＰＳｔＩを８単位加え、３
７℃、２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法でｔｒｐ系のプロモータ一部分およびＰ２４遺伝子の
Ｎ末端部分を含む約１．１００　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を
約０．５ｊｔｇ得た。

次に、第１項で造成したｐＡＦＢ７の６■を、３０ｄの
ｙ−ｔｏｏ緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩを８単
位加え、３７℃。

２時間消化反応を行った。この反応液に０．２Ｍトリフ
、−ＨＣｊｉ！　（＋）８８．０）　、　　１２０ｍＭ
Ｃａ　Ｃｊ！　２　、　１２０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ
β２，２ＭＮａＣ１および１０ｍＭ　　ＥＤＴＡからな
る液！Ｉｎ！を加え、滅菌水を１５４加え、３０℃に３
分間保温した。ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ〔ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕を１０単
位加え３０℃で８０秒間分解反応を行った。反応後フェ
ノール抽出を行い、エタノール沈殿法でＤＮＡを回収し
た。

このＤＮＡを３０４０Ｙ−１００緩衝液に溶かし、制限
酵素ＰｓｔＴを８単位加え、３７℃、２時間消化反応を
行った。この反応液からＬＧＴ法で、Ｐ２４２４遺伝子
を含む約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を約０．１■得た。

上記で得たｐＡＨＡ１由来のＰｓｔＩ断片（約１．１０
０ｂｐ）約０．２■、ｐＡＦＢ７由来（７）Ｐｓ　ｔ　
Ｉ−ＢＡＬ３　Ｌヌクレアーゼ分解断片（約４５０ｂｐ
）０．１■、およヒ前項で得たｐＫＹＰ２６由来のＫｐ
ｎ　ｒ−ＰｓｔＩ断片（約１．７００　ｂ　ｐ　）　０
．１尾を３０４のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃、１８時間結合
反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐｌのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第３図に
示したｐＡＦＧ　１０を得た。Ｐ２４をコードする領域
のＣ末端の塩基配列を決定したところ、第３図に示した
様にＰ２４のＣ末端までを含み、さらに■ａｌ・Ｖａｊ
２・Ｌｅｕ−３ｅｒ・Δｓｎが付いた構造になっている
ことが確認された。

（３）　　ＡＴＬＶのｇａｇ遺伝子によりコードされる
抗原ポリペプチドとｅｎｖ遺伝子によりコードされる抗
原ポリペプチドとが融合したハイブリッド抗原ポリペプ
チドをコードする組換え対プラスミドｐＥＴＩ７の造成
： 第２項で得た組換え体プラスミドｐＡＦＧ１０の１０■
を１００４のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｘｈ
ｏＩを１０単位。

５ｔｕＩを１２単位加え、３７℃、３時間消化反応を行
った。

この反応液からＬＧＴ法によりトリブトプァン系のプロ
モーターとＰ２４遺伝子の前半を含む約６３０ｂｐのＤ
ＮＡ断片約０．５■を得た。

次に第１項で得たｐＥＦＭ２の５■を５０頭のＹ−１０
０緩衝液に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩを１０単位、Ｈｐ
ａＩを８単位加え、３７℃、３時間消化反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により、ｅｎｖ遺伝子の後半を
含む約２．７００　ｂ　ｐのＤＮＡ断片を約１■得た。

上記で得たｐＡＦＧ１０由来のＸｈｏＩ−３ｔｕＩ断片
（約６３０ｂｐ）０．０５ｐｍｏｌｅとｐＥＦＭ１由来
のＸｈｏ　Ｉ−Ｈｐａ　Ｉ断片（約２，７００ｂｐ）０
．０１ｐｍｏｌｅを４０ρのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ５単位を加え、４℃、１
８時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し　Ａ
ｐｌのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第４図に
示したｐＥＴｒ７を得た。

（４）ｐＥＴＩ７を保有する大腸菌によるｇａｇ遺伝子
によりコードされる抗原ポリペプチドとｅｎｖ遺伝子に
よりコードされる抗原ポリペプチドとの融合ポリペプチ
ドの生産：第３項３で得られた組換え体プラスミドｐＥ
ＴＩ７を用い常法により大腸菌Ｗ３１１０ＳｔｒＡ株（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−７３２）を形質転換した。得られた
Ａｐ３のコロニーを８ｍｌのＭＣＧ培地〔０，６％　Ｈ
ａ　２　ＨＰ　０４　。

０．３％　ＫＨ２ＰＯ４，０，５％　ＮａＣｊ７゜０．
１％　ＮＨ，ｃｆ、０．５％グルコース、０．５％カザ
ミノ酸、１ｍＭ　ＭｇＳ○４＋　　４μｇ／ｍｌビタミ
ンＢｌ＋　ｐＨ７，２１に接種し、３０℃で１８時間培
養した。得られた培養液を８．０００ｒｐｍ　、　　１
０分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレムリのサ
ンプルバッファーニ懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、クマシーブＩＪ　ＩＪアントブ
ルーにて染色して、分子量約２５．　ＯＯＯの部位にポ
リペプチドバンドを検出した。このバンドは該プラスミ
ドを含まない大腸菌を用いた場合には存在しなかった。

このポリペプチドの分子量は、プラスミドｐＥＴＩ７の
構造から予想される／％イブリッド抗原ポリペプチドの
分子量（２５，０５１，０２）と一致した。

（５）第４項で述べた培養液１１より遠心分離（８，０
０Ｏｒｐｍ、　３０分間）して得られた菌体を２０　Ｑ
ｍｌの脱イオン水に懸濁し、マントンガウリンホモゲナ
イザ−（製造元；　ＭＡＮＴＯＮ−ＧＡＵＬＩＮ　　Ｍ
ＡＮ（ＩＰＡＣＴＵＲＩＮＧ　　　Ｃｏ、、　　ｌＮＣ
６ＵＳＡ）　１こより４００ｋｇ／ｃｄの圧力で菌体破
砕を行い、沈殿画分を遠心分離により得た。本沈殿画分
は５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析する
とｇａｇ−ｅｎｖ蛋白８４５■を含有していた。

本沈殿画分を４％（Ｗ／Ｖ　）　）リドンＸ−１００，
１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む２０
ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に分散し遠心分離に
より再び沈殿画分を得、この沈殿を２ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム、０．３％（Ｖ／Ｖ　）２−メル
カプトエタノール、７Ｍ尿素を含むリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４）で溶解し、あらかじめ７Ｍ尿素を含む２０ｍＭ
！Ｊン酸緩衝液（以下、平衡化緩衝液とよぶ、ｐＨ７，
０）で平衡化したＴＳＫｇｅ　ＩＣＭ）ヨパール６５０
（東洋曹達工業社製）　１０　Ｑｍｌに通塔、吸着させ
た。

平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、０．ＩＭＮａＣｌを加
えた平衡化緩衝液で溶出し、高純度画分２５　Ｑｍｌを
得た。本画分は４３０軸のｇａｇ−ｅｎｖ蛋白を含有し
ていた。この高純度画分を、ｌＱｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ
９，４）３１を外液として透析し１．生じた沈殿を遠心
分離により除去後、遠心分離上清として目的ｇａｇ−ｅ
ｎｖ蛋白溶液４０　Ｑｍｌを得た。

Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　１．；より分析すると
、蛋白純度は９０％以上であり、収量は１６０ｍｇであ
った。

発明の効果 本発明によれば、抗ＡＴＬＶ抗体の検出を精度高く行う
ことができ、ＡＴＬの血清診断を効果的に行うことがで
きる。さらに本発明方法はＰ−２４と交差反応を示す疾
患に応用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＡＦＢ７の造成工程を示す。 第２図はプラスミドｐＡＨＡ１の造成工程を示す。 第３図はプラスミドｐＡＦＧ１０の造成工程を示す。 第４図はプラスミドｐＥＴＩ７の造成工程を示す。 第５図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸、Ｐ−２４法の抗
体値をＸ軸としたときの相関図を示す。相関係数は０．
８９２４である。単一度数分布による最小２乗法（１次
回帰）により、回帰式を求めるとＹ＝２．７４３７Ｘ＋
’０．２１５１を示す。 第６図は、エーザイ法の抗体値をＹ軸、ｇａｇ−ｅｎｖ
法の抗体値をＸ軸としたときの相関図を示す。相関係数
は０．７４７９である。単一度数分布による最小２乗法
（１次回帰）により回帰式を求めるとＹ＝１．９４７３
Ｘ−０，１１１９を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）成人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下ＡＴＬＶという
   ）のｇａｇ遺伝子またはその一部とＡＴＬＶのｅｎｖ遺
   伝子またはその一部とが結合した融合遺伝子によってコ
   ードされるポリペプチドを抗原物質として用いる免疫学
   的方法により試料中の抗ＡＴＬＶ抗体を検出することを
   特徴とする抗ＡＴＬＶ抗体の検出法。
2. （２）免疫学的方法が、ラジオ・イムノアッセイ、エン
   ザイム・イムノアッセイ、フルオレッセンス・イムノア
   ッセイ、逆受身凝集反応、フィトヘマトアグリチネーシ
   ョン、パーテイクルアグリチネーション、レーザーネフ
   ロメトリーおよび免疫溶血反応（赤血球またはリポソー
   ムを用いる方法）から選ばれる特許請求の範囲第１項の
   検出法。
3. （３）固相にコーティングされた抗原物質を用いる特許
   請求の範囲第１項の検出法。
4. （４）固相が、合成樹脂、ガラス製のチューブ、ガラス
   製のビーズまたはガラス製のマイクロタイタープレイト
   である特許請求の範囲第３項の検出法。