CN103755810A - 一种长效hiv‐1膜融合抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种长效抑制HIV‐1膜融合的高分子，其特征在于所述高分子包含二或三部分。前两部分是抑制HIV‐1膜融合的多肽部分和一个可与血清白蛋白结合（从而延长所述高分子在体内的半衰期）的拟抗体部分。这两部分中间还可以加一个连接分子来提高所述高分子抑制HIV‐1的活性。所述高分子可以在体内长效阻止病毒介导的细胞融合作用。

Description

一种长效HIV‐1膜融合抑制剂
优先权信息 
本申请依赖于2013年06月28日递交的201310264732.7号申请。 
发明领域
本发明涉及人类免疫缺陷病毒抑制剂领域，特别涉及用于治疗HIV感染的长效膜融合多肽类药物及其设计方法。 
发明背景 
HIV病毒的感染所引发的AIDS综合症是全世界未能解决的难题之一，目前缺乏有效的药物及疫苗来对抗HIV的感染。到目前为止，临床上用于治疗HIV感染的药物主要分为4大类，分别为逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂及HIV膜融合抑制剂。这些药物分别针对病毒复制过程中的不同环节加以干扰或阻断。上述四种药类中HIV膜融合抑制剂是最新的一种。 
很多抗HIV的抑制剂是多肽或蛋白。而多肽或蛋白药物在服用后都面临被降解的问题。一些传统的多肽长效化技术可以从一定程度上部分解决上述降解问题。 
但是，以HIV膜融合抑制剂为例，应用传统的多肽长效化技术（如PEG化学修饰和血清白蛋白/Fc融合技术等，）需要引入比HIV膜融合抑制剂多肽的体积大10倍以上的无关基团或蛋白分子，会导致HIV膜融合抑制剂的活性丧失，且长效化效果依然有限。 
发明概要：
本申请中披露的发明涉及一个高分子（macromolecule），这个高分子包括以下两部分：（i）一段有生物功能的多肽或蛋白，其序列是以下序列之一或者和以下序列之一有50%以上同源：（a）SEQ ID NO:1;(b)SEQ ID NO:5;(c)SEQ ID NO:6和（ii）一个血清白蛋白靶向多肽或蛋白，其序列是SEQ ID NO:3或者和SEQ ID NO:3有50%以上同源。 
上面所述的高分子，在所述生物功能的多肽(第一部分)和所述血清白蛋白靶向多肽（第二部分）之间还可以进一步包括一个连接分子（第三部分），该连接分子的分子量在300到5,500之间。 
上面所述的高分子中所述三部分可以以融合蛋白形式连在一起或者以共轭（conjugation）形式连在一起。 
上面所述的高分子中的连接分子可以是一个非多肽分子。非多肽分子可以是（但并不限于）以下分子之一或任何组合：聚乙二醇、聚丙二醇、(乙烯/丙烯)共聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚氰基、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和肝素。 
上面所述的高分子中的连接分子还可以是一个多肽分子，该多肽可以由天然或非天然氨基酸组成。所述天然氨基酸可以是可以形成蛋白质的天然氨基酸。所述天然氨基酸可以是由遗传密码直接编码的天然氨基酸。所述的作为连接分子的多肽还可以是SEQ ID NO:2或者和SEQ ID NO:2有50%以上同源。所述的同源性还可以是：60%以上同源，70%以上同源，80%以上同源；85%以上同源；90%以上同源；95%以上同源和99%以上同源。 
上面所述的高分子中有生物功能的多肽和所列出的序列：（a）SEQ ID NO:1;(b)SEQ ID NO:5.(c)SEQ ID NO:6还可以是至少60%同源，而且所述血清白蛋白靶向多肽和SEQ ID NO:3也可以是至少60%同源。所述的同源性还包括:70%以上同源，80%以上同源；85%以上同源；90%以上同源；95%以上同源和99%以上同源。 
本申请中披露的发明还涉及一个分离的核酸分子，该核酸分子编码上述高分子中的多 肽或蛋白。 
本申请中披露的发明还涉及一个表达载体，该表达载体包含上述核酸分子。 
本申请中披露的发明还涉及一个表达载体，该载体可以表达上述高分子中的多肽或蛋白。 
本申请中披露的发明还涉及一种药物或疫苗，该药物或疫苗包含上面所述的任何一个多肽或蛋白，或者上面所述的任何一个高分子，或者上面所述的任何一个核酸分子，或者上面所述的任何一个表达载体。 
发明内容：
本发明涉及一种长效抑制HIV的高分子。该高分子包括能抑制HIV的部分和使该高分子的抑制作用长效化的部分。 
抑制HIV的部分一般是一或多个多肽或蛋白。该多肽或蛋白可以干扰或阻断HIV进入宿主细胞的某一步骤，例如膜融合步骤。除膜融合步骤外，还可以用多肽或蛋白以及其他药剂来干扰或阻断HIV进入宿主细胞的其他步骤。例如，现在已计入临床阶段的药物可以抑制逆转录酶、蛋白酶、整合酶，从而达到抗HIV的效果。这些药物分别针对病毒复制过程中的不同环节，其中HIV膜融合抑制剂为一类新兴的HIV治疗药物，主要针对抑制HIV病毒膜融合过程从而达到抑制病毒感染的作用。 
人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)侵入靶细胞时由囊膜糖蛋白介导完成一个膜融合过程。在这个过程中,囊膜糖蛋白的表面亚单位gp120实现识别及与受体吸附,而跨膜亚单位gp41主要介导病毒囊膜和细胞膜的融合。在gp41上的2个七肽重复序列(HR1和HR2)在这一过程中发挥着重要的作用。当HIV-1侵染靶细胞时,gp41的构象发生一系列变化,最终形成一种发卡三聚体(或称六螺旋束)的结构,即3个HR2螺旋以反向平行的方式附着到3个HR1螺旋聚合形成的中心三聚体的沟槽中。推测在膜融合发生前存在一个HR1和HR2区暴露但未形成最终的发卡结构的发卡前体中间态。在中间态时,HR1和HR2区能结合外源加入的HR1、HR2或类似多肽,这就使得处在发卡前体中间态的gp41本身的HR1和HR2之间不能发生相互作用,从而导致gp41最终不能转变形成发卡三聚体的结构,即抑制了膜融合。 
T20（商品名：Fuzeon）是第一个被美国FDA批准的膜融合抑制剂，目前作为对其他抗HIV药物治疗效果不佳时所采用的补救治疗药物。T20含有36个氨基酸序列，包含7重复序列结合区(HBD)和一个色氨酸富集区（TRD）。作为第一代膜融合抑制剂，T20具有很高的抗病毒能力，可以广泛的抗击各种HIV病毒亚型。但是由于T20在体内的半衰期较短及T20的抗性株的出现限制了T20的临床应用。 
CP38作为第三代HIV膜融合抑制剂，它包含38个氨基酸序列。CP38是在T651的基础上成功改造的多肽，它增加了α螺旋和6螺旋的稳定性，改善了药物代谢动力学特性，是目前为止特别是针对T20出现的抗性株的最有效的膜融合抑制剂。对于生物制剂，如肽，多肽或多核苷酸，这些制剂的明显的局限性在于不够长的血清半衰期。这就需要更高频率的给药或更高的使用剂量来维持体内有效的药物浓度。因此，研发长效HIV膜融合抑制剂是我们面临的一个亟待解决的问题。 
除抑制HIV的部分外，本发明所涉及的高分子还包括一个血清白蛋白靶向多肽。近年来，基于靶向血清白蛋白的多肽长效化技术路线受到重视。这一技术采用人工改造后的、具有血清白蛋白靶向性的小蛋白分子（一般仅有约100残基，）与需要延长半衰期的多肽基因重组，而不会大幅度降低活性。所得到的融合蛋白药物进入血液循环系统后，绝大部分被吸附到血清白蛋白上，少部分保持游离状态。被吸附的融合蛋白药物借助与血清白蛋白的可逆性结合作用（半衰期：19‐20天，）避免被降解或排泄。随着游离的融合蛋白药物被消耗或清除，吸附状态的融合蛋白药物从血清白蛋白上逐渐解离下来，从而维持了血液中的药物浓度，长时间地维持药效。可用于产生这类人工靶向蛋白的原型蛋白包括：金黄色葡萄球菌A结构域蛋白（US5831012，EP0739353，）人纤连蛋白（US6818418，EP1266025）等。但是这些技术没有结合最新的拟抗体技术来 利用拟抗体的模板蛋白的结构信息，也就是说，没有主动地，系统地判断模板蛋白产生拟抗体能力的办法。而本发明中的血清白蛋白靶向多肽利用了最新的拟抗体技术，充分使用了模板蛋白本身和其家族的结构信息，来制作最有效的血清白蛋白靶向多肽。 
本发明所涉及的抑制HIV的高分子还可以包括一个连接分子。该连接分子的主要目的是使上述的两部分（抑制HIV部分和血清白蛋白靶向多肽部分）从空间上分开一定距离，从而使上述的两部分能更好地起到生物效果。因其所起的作用是隔离作用，所述连接分子的化学成分并不重要。只有其大小对隔离效果（即最终生物功能）有影响。所以所述连接分子可以是非多肽或多肽。非多肽的连接分子可以是天然或非天然。例如，非多肽的连接分子可以是（但并不限于）聚乙二醇,聚丙二醇,(乙烯/丙烯)共聚乙二醇,聚氧乙烯,聚氨酯,聚磷腈,多糖,右旋糖酐,聚乙烯醇,聚乙烯基吡咯烷酮,聚乙烯基乙基醚,聚丙烯酰胺,聚丙烯,聚氰基,脂质聚合物,几丁质,透明质酸,和肝素。多肽的连接分子中的氨基酸可以是任何氨基酸，包括天然的和非天然的，可以是D氨基酸，也可以是L氨基酸。可以是形成蛋白质的氨基酸，也可以是不参与形成蛋白质的氨基酸。可以是遗传密码直接编码的氨基酸，也可以是不直接被遗传密码编码的氨基酸。 
附图简述 
图1：纯化后ABT、AB SDS‐PAGE电泳结果 
图2：检测ABT、AB对N36和C34形成六螺旋的影响，显示了ABT（而非AB）可以有效地抑制六螺旋的形成。其中，图2A部分显示了用FN-PAGE检测N36和ABT及AB之间六螺旋的形成。图2B部分显示了AB，ABT和CP38对六螺旋形成的抑制能力。 
图3：通过P24-based ELISA,用MT-2细胞检测ABT、AB和CP38对HIV IIIB病毒的抑制能力。结果显示ABT和CP38抑制HIV IIIB病毒的能力相似，而AB则没有抑制能力。 
图4：通过P24-based ELISA测定检测ABT、AB和CP38对HIVBal病毒的抑制活性.ABT,CP38,and T20的IC50值分别是11.85nM,3.72nM,8.85nM。 
图5：ABT,CP38and T20在SD大鼠中的药物代谢动力学检测。ABT的半衰期是32.62小时。CP38和T20组的半衰期分别是10.47小时和3.80小时。此图从而显示了ABT的半衰期要远长于CP38和T20。 
图6:ELISA检测的ABT,CP38and T20在SD大鼠血清中的浓度。 
实施例1: 
1、ABT克隆的构建及表达 
1.1材料PCR试剂：PrimeSTARDNAPolymerase(Takara)10Xbuffer(Mg+)(Takara)dNTP(Takara) 
灭菌水：高压去离子水 
PCR引物：由上海杰李公司合成 
质粒：PHFT质粒由北京华金瑞清公司惠赠，PGEX‐6P‐1MD1.1‐L35‐CP38质粒由本室构建限制性内切酶：BamHI、XhoI、Bglll(Takara) 
T4连接酶：购自Takara公司 
30%Bis‐Acr聚丙烯酰胺凝胶：购自Bio‐rad公司Ni纯化柱：购自Qiagen公司大肠杆菌HB101和BL21(DE)3感受态均购自北京Tiangen公司，其他化学试剂均为国产分析纯。 
1.2实验步骤 
1.2.1ABT克隆构建 
为了得到长效的融合肽ABT(SEQIDNO:4)，我们采用了酶拼接PCR的方法，利用共Bglll酶切位点的特征，将两端多肽（SEQIDNO:1和SEQ IDNO:3）拼接在一起。为了不影响这两段多肽的功效发挥，两段肽中间使用了一条有效的linker序列（SEQIDNO:2）。合成克隆AB核酸序列的引物 
AB‐BamHI：5’‐CGCGGATCCGTTTCTTCTGTGATG‐3（SEQIDNO:12） 
AB‐Bglll：5’‐GGAAGATCTGGTACGGTAGTTAATC‐3’（SEQ ID NO:13） 
合成克隆L35‐CP38（SEQ IDNO:1和SEQID NO:2）核酸序列的引物L35 
‐CP38‐Bglll：5’‐GGAAGATCTGGAGGAGGAGGAAG‐3’（SEQIDNO:14） 
L35‐CP38‐XhoI:5’‐CGGCTCGAGCTATAATTCCCTTAAG‐3’ 
（SEQIDNO:15） 
以AB‐PHFT质粒为模板，以AB‐BamHI和AB‐Bglll为引物，克隆出AB片段；以PGEX‐6P‐1MD1.1‐L35‐CP38质粒为模板，以L35‐CP38‐Bglll和L35‐CP38‐XhoI为引物，克隆出L35‐CP38片段。DNA琼脂糖凝胶试剂盒回收AB和L35‐CP38片段，Nanodrop测量回收后的核酸浓度。使用Bglll进行单酶切，酶切体系20微升。即10X酶切buffer2微升，Bglll1微升，核酸片段17微升。37度酶切过夜后，分别使用PCR产物回收试剂盒回收单酶切后的核酸片段。然后使用T4连接酶链接两段核酸序列，4度过夜连接。取连接产物2微升为模板，以AB‐BamHI和L35‐CP38‐XhoI为引物，PCR连接后的核酸序列，然后DNA琼脂糖凝胶试剂盒回收连接后的核酸序列(SEQIDNO:4)。应用BamHI和XhoI双酶切该序列和ABT‐PHFT质粒，37度酶切过夜后，胶回收PCR双酶切产物和AB‐PHFT载体序列，在进行T4连接酶连接，4度过夜，次日取连接产物5微升转化大肠杆菌HB101,37度孵育箱培养16‐20小时，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆。对鉴定正确的克隆进行测序，命名为ABT‐PHFT。 
1.2.2表达ABT蛋白及人纤连蛋白（AB） 
测序鉴定正确的质粒ABT‐PHFT及含有AB核酸序列的PHFT质粒转化到BL21(DE3)的大肠杆菌中，培养16‐20小时，挑取4‐5个克隆菌株，加入到含卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养。次日，将16毫升过夜培养菌液加入500毫升LB中，30度，220rpm/min的转速培养4小时左右，当OD值达到0.6‐0.8时，加入IPTG0.2mm/ml诱导蛋白表达，16摄氏度下继续诱导12小时左右，4500rpm/min收集菌体。菌体收集下来，用20毫升的PBS重悬菌体，再次离心后，弃上清，菌体冻于‐80摄氏度冰箱。 
Ni柱纯化蛋白过程如下： 
（1）取冻存后的菌液，室温放置至解冻，用纯化试剂bindingbuffer(50mMNaH2PO4，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)30毫升重悬菌体，漩涡振荡器震10分钟，加入150微升的10%Titron100‐PBS后，颠倒震荡，放置于冰水混合物中。 
（2）超声破碎。超声破碎条件如下：超声功率300W，工作时间3s，间隔5s，共计超声30min。12000rpm/min离心20分钟。 
（3）取离心后的破碎后的菌液上清，使用0.45μm的滤膜过滤。同时取出平衡后的Ni纯化柱，将1毫升Ni柱材混入上清中，冰上水平震荡45min。 
（4）加入蛋白纯化柱，Ni柱琼脂糖颗粒在溶液中逐渐沉降，上清至少过柱2遍，使得蛋白与亲和纯化柱充分结合。 
（5）使用washingbuffer(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCI，60mM咪唑)溶液洗脱杂蛋白，洗脱体积约为40毫升。 
（6）使用stripingbuffer（50mMNaH2PO4，pH8.0，300mMNaCI，300mM咪唑）洗脱目的蛋白。收集洗脱下来的各个组分。4度PBS透析过夜，冻存于‐80度冰箱。 
（7）使用完毕的Ni纯化柱使用5毫升6M盐酸胍处理剥脱柱上蛋白，binding buffer平衡后，加入20%乙醇溶液保存于4度。 
图1显示了AB和ABT的电泳带 
实施例2: 
2、FN‐PAGE检测AB及ABT对六螺旋形成的影响 
2.1材料 
非变性聚丙烯酰胺凝（PAGE）胶电泳试剂盒：购自北京天恩泽公司 
N36、C34、FAM‐C34多肽由Biosystems433A蛋白合成仪合成 
2.2实验过程 
（1）配制18%的分离胶，5%的浓缩胶 
（2）配制N36、F‐C34、ABT、AB、N36+ABT和N36+AB等多肽，各多肽的终浓度为40um，37度放置30分钟，室温避光在电压125V的条件下，电泳2小时。 
（3）Fluorchem8800(紫外)检测 
（4）考马斯亮蓝染色PAGE胶 
此实验（图2）说明AB不和C34或N36竞争来影响六螺旋的形成。而只有ABT和C34或N36竞争来影响六螺旋的形成. 
实施例3:HIV‐1实验室适应株及原代病毒株的病毒抑制试验 
3.1实验材料 
细胞：MT‐2细胞、M7细胞培养基：1640，1640+10%FBS 
培养板：96孔平地培养板（corning，）96孔圆底培养板（corning）细胞裂解液：5%TritonX‐100 
病毒：实验室适应株HIV‐1IIIB，HIV‐1Bal病毒及各种HIV‐1原代病毒株 
3.2实验过程 
（1）在96孔板内倍比稀释ABT、AB、CP38及T20多肽蛋白，同时设定阳性对照孔（未加入多肽蛋白孔）和阴性对照孔（细胞对照孔和病毒对照孔）。 
（2）将‐80摄氏度解冻的病毒株充分混匀，按照100倍TCID50值（即50%组织感染剂量加入孔中） 
（3）将MT‐2或M7细胞调整到1x105个/ml浓度，每孔加入100微升细胞。37度5%CO2培养过夜。 
（4）吸取150微升/孔的培养基，补入150微升新鲜的1640+10%FBS培养基，继续培养4天，感染后的第五天吸取50微升的细胞上清到96孔板中，加入：5%Triton X‐100‐PBS裂解细胞，4度过夜。 
（5）使用实验室自建的P24检测试剂检测细胞上清中的P24含量，TMB显色，Ultra386(Tecan)检测OD450的吸光度值。 
从表1中可以看到融合蛋白ABT和原本的抗HIV的多肽CP38及T20相比，有更好或类似的IC50(也就是对HIV的抑制力).另外，从图3可见，ABT,CP38和T20对HIV-1IIIB菌株的抑制力要远高于AB（融合蛋白ABT中的拟抗体模版蛋白）。ABT,CP38和T20的IC50分别是47.55nM，38.9nM和34.06nM。 
类似地，从图4也可见，ABT,CP38和T20对HIV-1Bal(另一个HIV菌株)的抑制力也远高于拟抗体模版蛋白AB。 
表1：ABT、AB对各种HIV‐1原代病毒株的抑制效果 
Figure BDA0000432145770000071
实施例4: 
4、6螺旋竞争实验 
4.1实验材料 
包被缓冲液：0.1MTris‐cl pH8.8 
抗体：兔抗NY364、单克隆抗体NC‐1、兔抗鼠HRP(DAKO) 
多肽：N36、C34、ABT、AB、CP38 
（1）包被:用pH8.8的0.1M Tris‐cl pH8.8缓冲液将兔抗gp41多抗(兔抗NY364)稀释到2ug/ml，加入96孔酶标板里，每孔100ul，4度过夜。 
（2）封闭:每孔加入2%的明胶(用pH7.2的PBS溶解)200ul，37度孵育60分钟，洗板三次。 
（3）将相应浓度的待检化合物和对照化合物各30ul分别与2uM的N3630ul在37度孵育30分钟。然后各孔分别加入60ul的1umC34，37度孵育30分钟。 
（4）将上一步孵育好的混合液100ul移入已包被和封闭好的相应孔中，37度孵育60分钟，洗板三次。 
（5）每孔加入100ul用PBS稀释至1ug/ml的单克隆抗体NC‐1，37度孵育60分钟，洗板三次。 
（6）每孔加入100ul用pBS稀释至1:3000的兔抗鼠IgG‐HRP，37度孵育60分钟，洗板六次。 
（7）每孔加入3，3’，5，5’‐四甲基联苯胺(TMB)液100ul，显色3‐10分钟。 
（8）显色10分钟，每孔加入终止液1M H2SO4氏50ul。 从图2B可见，融合蛋白ABT参与了HR1和HR2之间的形成六螺旋的互相作用。也就是说，ABT有着和CP38相似的阻断C34和N36形成6-HB（六螺旋）的活力。而AB则没有此能力。 
实施例5： 
5、大鼠药物代谢动力学实验 
5.1实验材料：SD‐大鼠T20,CP38,ABT等多肽药物 
MT‐2细胞，HIV‐IIIB病毒， 
P24检测试剂实验过程：采取大鼠尾静脉注射多肽药物，检测药物在大鼠体内的药物代谢过程。(1)静脉注射前，采阴性血清作为阴性对照。 
(2)尾静脉注射药物：T20(1mg/ml/kg),CP38(1mg/ml/kg),ABT(4.9mg/ml/kg),药物浓度均为234μM，每只注射200微升。 
(3)尾静脉注射后，30min,1.5h,3h,6h,9h,12h,24,48h,72h,96h眼眶采血200微升。 
(4)样本室温放置2小时后，分离血清，冻于‐80度冰箱。 
(5)56度1h，灭活血清中的补体及酶类，分别做1：80，1：160，1：320，1:640,1:1280,1:2560,1:5120,1：10240倍稀释后，做病毒抑制试验，同实施例3实验过程。通过P24的水平检测血清中多肽药物作用。 
如前面发明内容中讨论过，与血清白蛋白的结合可以大幅度增加多肽或蛋白的半衰期。本实验用大鼠对ABT,CP38和T20的半衰期进行了比较。结果如图5中所示，融合蛋白（ABT，由·代表）的半衰期要比CP38和T20显著增长。ABT的半衰期是32.62小时，而CP38和T20的半衰期分别是10.47小时和3.80小时。应该特别指出的是，因为人的血清白蛋白的半衰期（19至21天）要比大鼠血清白蛋白的半衰期（1.2天）长得多，融合蛋白（ABT）在人体内的半衰期很可能要比CP38和T20的半衰期更长得多。 
实施例6：ELISA检测血清中药物浓度 
6.1实验材料：T20,CP38,ABT等多肽药物 
兔抗T20抗体，兔抗CP38抗体,兔抗ABT抗体,鼠抗T20抗体，鼠抗CP38抗体,鼠抗ABT抗体,TMB显色液等,聚苯乙烯板(Corning,highbinding) 
(1)T20ELISA试验方法 
包被1μg/ml NHS亲和层析特异性纯化的兔抗T20抗体抗体，50微升每孔，4度过夜。PBST洗ELISA板3次，每次浸泡5分钟。使用2%脱脂牛奶-PBS，37度封闭2小时。洗ELISA板3次，加入1：20稀释后血清标本，37度，45分钟。然后洗ELISA板3次，加入鼠抗T20抗体（1：1200稀释），50微升每孔，37度45分钟。PBST洗ELISA板3次，每次浸泡5分钟。然后加入HRP标记二抗，即Rabbit anti mouse-HRP(1:3000稀释使用)，37度45分钟。PBST洗ELISA板5次，每次浸泡5分钟。TMB底物显色5分钟后，2M H2SO4终止。酶标仪读取OD450值。 
(2)CP38ELISA试验方法 
包被1μg/ml NHS亲和层析特异性纯化的兔抗CP38抗体，50微升每孔，4度过夜。PBST洗ELISA板3次，每次浸泡5分钟。使用2%脱脂牛奶-PBS，37度封闭2小时。洗ELISA板3次，加入1：20稀释后血清标本，37度，45分钟。然后洗ELISA板3次，加入鼠抗CP38抗体（1：1000稀释），50微升每孔，37度45分钟。PBST洗ELISA板3次，每次浸泡5分钟。然后加入HRP标记二抗，即Rabbit anti mouse-HRP(1:3000稀释使用)，37度45分钟。PBST洗ELISA板5次，每次浸泡5分钟。TMB底物显色5分钟后，2M H2SO4终止。酶标仪读取OD450值。 
(3)ABT ELISA试验方法包被5μg/ml兔抗ABT抗体，50微升每孔，4度过夜。PBST洗ELISA板3次，每次浸泡5分钟。使用0.5%明胶-PBS，37度封闭2小时。洗ELISA板3次，加入1：50稀释后血清标本，37度，45分钟。然后洗ELISA板3次，加入鼠抗ABT抗体（1：1500稀释），50微升每孔，37度45分钟。PBST洗ELISA板3次，每次浸泡5分钟。然后加入HRP标记二抗，即Rabbit anti mouse-HRP(1:3000稀释使用)，37度45分钟。PBST洗ELISA板5次，每次浸泡5分钟。TMB底物显色5分钟后，2M H2SO4终止。酶标仪读取OD450值。 
如图6所示，ABT（融合蛋白），CP38和T20在SD-大鼠血清中的半衰期分别是27.097小时,7.479小时和1.372小时。可见融合蛋白ABT的半衰期比多肽CP38和多肽T20显著增长。也就是说，ABT融合蛋白中的拟抗体模板部分起到了显著的稳定作用。 
序列： 
SEQ ID NO:1 
CP38(38aa) 
ThrThrTrpGluAlaTrpAspArgAlaIleAlaGluTyrAlaAlaArgIleGluAlaLeuLeuArgAlaLeuGlnGluGlnGlnGluLysAsnGluAlaAlaLeuArgGluLeu 
SEQ ID NO:2 
L35(35aa) 
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer 
SEQ ID NO:3 
AB(103aa) 
ValSerSerValProThrLysLeuGluValValAlaAlaThrProThrSerLeuLeuIleSerTrpAspAlaSerSerSerSerValSerTyrTyrArgIleThrTyrGlyGluThrGlyGlyAsnSerProValGlnGluPheThrValProGlySerLysSerThrAlaThrIleSerGlyLeuLysProGlyValAspTyrThrIleThrValTyrAlaGluValArgSerPheCysThrAspTrpProAlaGluLysSerCysLysProLeuArgGlyLysProIleSerIleAsnTyrArgThr 
SEQ ID NO:4 
ABT(178aa) 
ValSerSerValProThrLysLeuGluValValAlaAlaThrProThrSerLeuLeuIleSerTrpAspAlaSerSerSerSerValSerTyrTyrArgIleThrTyrGlyGluThrGlyGlyAsnSerProValGlnGluPheThrValProGlySerLysSerThrAlaThrIleSerGlyLeuLysProGlyValAspTyrThrIleThrValTyrAlaGluValArgSerPheCysThrAspTrpProAlaGluLysSerCysLysProLeuArgGlyLysProIleSerIleAsnTyrArgThrArgSerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerThrThrTrpGluAlaTrpAspArgAlaIleAlaGluTyrAlaAlaArgIleGluAlaLeuLeuArgAlaLeuLeuGluGlnGlnGluLysAsnGluAlaAlaLeuArgGluLeu 
SEQ ID NO:5 
T20 
PheTrpAsnTrpLeuSerAlaTrpLysAspLeuGluLeuLeuGluGlnGluAsnLysGluGlnGlnAsnGlnSerGluGluIleLeuSerHisIleLeuSerThr 
SEQ ID NO:6 
T651 
MetThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGln GlnGluLysAsnGluGlnGluLeu 
SEQ ID NO:7 
CP38 
ACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCTTTACTCAGAGCTTTACAAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCCTTAAGGGAATTA 
SEQ ID NO:8 
L35 
GGAGGAGGAGGAAGTGGCGGCGGCGGCTCGGGTGGTGGTGGTTCTGGAGGTGGCGGTAGCGGAGGTGGAGGTAGTGGAGGCGGAGGTTCGGGAGGCGGAGGTAGC 
SEQ ID NO:9 
AB: 
GTTTCTTCTGTTCCGACCAAACTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCGACTAGCCTGCTGATCAGCTGGGATGCTTCTAGCTCTTCCGTGTCTTATTACCGTATCACGTACGGTGAAACCGGTGGTAACTCCCCGGTTCAGGAATTCACTGTACCTGGTTCCAAGTCTACTGCTACCATCAGCGGCCTGAAACCGGGTGTCGACTATACCATCACTGTATACGCTGAAGTTCGTTCTTTCTGCACCGACTGGCCGGCGGAAAAATCTTGCAAACCGCTGCGTGGTAAGCCAATCTCGATTAACTACCGTACC 
SEQ ID NO:10 
ABT 
GTTTCTTCTGTTCCGACCAAACTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCGACTAGCCTGCTGATCAGCTGGGATGCTTCTAGCTCTTCCGTGTCTTATTACCGTATCACGTACGGTGAAACCGGTGGTAACTCCCCGGTTCAGGAATTCACTGTACCTGGTTCCAAGTCTACTGCTACCATCAGCGGCCTGAAACCGGGTGTCGACTATACCATCACTGTATACGCTGAAGTTCGTTCTTTCTGCACCGACTGGCCGGCGGAAAAATCTTGCAAACCGCTGCGTGGTAAGCCAATCTCGATTAACTACCGTACCAGATCTGGAGGAGGAGGAAGTAGCGGCGGCGGCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGAGGTGGCGGTAGCGGAGGTGGAGGTAGTGGAGGCGGAGGTTCGGGAGGCGGAGGTAGCACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCATTACTCAGAGCTTTACTAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCC TTAAGGGAATTA 
SEQ ID NO:11 
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGA TGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGT TTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAG 
TAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAG ATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCATCACCATCATCACCACCATCACCATAGCAGCGACTACAAAGACGACGATGACAAAGGTGAAAACCTGTACTTCCAGGGATCCGTTTCTTCTGTTCCGACCAAACTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCGACTAGCCTGCTGATCAGCTGGGATGCTTCTAGCTCTTCCGTGTCTTATTACCGTATC 
ACGTACGGTGAAACCGGTGGTAACTCCCCGGTTCAGGAATTCACTGTACCTGGTTCCAAGTCTACTGCTACCATCAGCGGCCTGAAACCGGGTGTCGACTATACCATCACTGTATACGCTGAAGTTCGTTCTTTCTGCACCGACTGGCCGGCGGAAAAATCTTGCAAACCGCTGCGTGGTAAGCCAATCTCGATTAACTACCGTACCAGATCTGGAGGAGGAGGAAGTAGCGGCGGCGGCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGAGGTGGCGGTAGCGGAGGTGGAGGTAGTGGAGGCGGAGGTTCGGGAGGCGGAGGTAGCACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCATTACTCAGAGCTTTACTAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCCTTAAGGGAATTATAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAA GGAGGAACTATATCCGGAT 
SEQ ID NO:12 
CGCGGATCCGTTTCTTCTGTGATG 
SEQ ID NO:13 
GGAAGATCTGGTACGGTAGTTAATC 
SEQ ID NO:14 
GGAAGATCTGGAGGAGGAGGAAG 
SEQ ID NO:15 
CGGCTCGAGCTATAATTCCCTTAAG 
Figure IDA0000432145820000011
Figure IDA0000432145820000021
Figure IDA0000432145820000041
Figure IDA0000432145820000061
Figure IDA0000432145820000071
Figure IDA0000432145820000081
Figure IDA0000432145820000091
Figure IDA0000432145820000101
Figure IDA0000432145820000111
Figure IDA0000432145820000121

Claims (26)

1.一个高分子（macromolecule），包括以下两部分：
i.一段有生物功能的多肽或蛋白，其序列是以下序列之一或者和以下序列之一有50%以上同源：（a）SEQ ID NO:1;(b)SEQ ID NO:5；(c)SEQ IDNO:6;
ii.一个血清白蛋白靶向多肽或蛋白，其序列是SEQ ID NO:3或者和SEQ ID NO:3有50%以上同源。
2.权利要求1的高分子，在所述生物功能的多肽(第一部分)和所述血清白蛋白靶向多肽（第二部分）之间进一步包括一个连接分子（第三部分），该连接分子的分子量在300到5，500之间。
3.权利要求2的高分子,其中所述三部分以融合蛋白形式连在一起或以共轭（conjugation）形式连在一起。
4.权利要求2的高分子，其中的连接分子是一个非多肽分子。
5.权利要求4的高分子，其中的连接分子是以下分子之一或任何组合：聚乙二醇,聚丙二醇,(乙烯/丙烯)共聚乙二醇,聚氧乙烯,聚氨酯,聚磷腈,多糖,右旋糖酐,聚乙烯醇,聚乙烯基吡咯烷酮,聚乙烯基乙基醚,聚丙烯酰胺,聚丙烯,聚氰基,脂质聚合物,几丁质,透明质酸,和肝素。
6.权利要求1的任何一个高分子，其中的连接分子是一个多肽,该多肽可以由天然或非天然氨基酸组成。
7.权利要求6的高分子，其中连接分子的多肽由天然氨基酸组成。
8.权利要求7的高分子，其中形成多肽的天然氨基酸是可以形成蛋白质的天然氨基酸。
9.权利要求8的高分子，其中形成多肽的天然氨基酸是由遗传密码直接编码的天然氨基酸。
10.权利要求9的高分子,其中的多肽的序列是SEQ ID NO:2或者和SEQ ID NO:2有50%以上同源。
11.权利要求10的高分子,其中的多肽的序列和所列出的序列至少60%同源。
12.权利要求11的高分子,其中的多肽的序列和所列出的序列至少70%同源。
13.权利要求12的高分子,其中的多肽的序列和所列出的序列至少80%同源。
14.权利要求13的高分子,其中的多肽的序列和所列出的序列至少90%同源。
15.权利要求14的高分子,其中的多肽的序列和所列出的序列至少95%同源。
16.权利要求14的高分子,其中的多肽的序列和所列出的序列至少99%同源。
17.权利要求（1）到（16）的任何一个高分子，其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少60%同源，并且所述血清白蛋白靶向多肽和其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少60%同源。
18.权利要求1到16的任何一个高分子，其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少70%同源，并且所述血清白蛋白靶向多肽和所列出的序列至少70%同源。
19.权利要求1到16的任何一个高分子，其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少80%同源，并且所述血清白蛋白靶向多肽和所列出的序列至少80%同源。
20.权利要求1到16的任何一个高分子，其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少90%同源，并且所述血清白蛋白靶向多肽和所列出的序列至少90%同源。
21.权利要求1到16的任何一个高分子，其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少95%同源，并且所述血清白蛋白靶向多肽和所列出的序列至少95%同源。
22.权利要求1到16的任何一个高分子，其中所述有生物功能的多肽和所列出的序列至少99%同源，并且所述血清白蛋白靶向多肽和所列出的序列至少99%同源。
23.一个分离的核酸分子，其编码权利要求1-22的高分子中的多肽或蛋白。
24.一个表达载体，其包含权利要求23的核酸分子。
25.一个表达载体，其可以表达权利要求1-22的高分子中的多肽或蛋白。
26.一种药物组合或疫苗，其包含权利要求1-22中任何一个高分子，或者权利要求23的核酸分子，或者权利要求24或25的任何一个表达载体。
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