CN102260698A - 大肠杆菌中表达PTA-linker-thanatin融合蛋白及其抗癌研究 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术制药工程中的基因工程生产融合蛋白类药物的技术领域。利用多重延伸PCR技术将死亡肽(thanatin)基因和三叶半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin，PTA)基因通过Linker柔性肽段(Gly₄Ser)₂基因连接拼接成编码PTA-Linker-Thanatin融合蛋白的基因，通过大肠杆菌(E.coli)表达系统表达PTA-Linker-Thanatin融合蛋白，经实验表明该实验制品具有强效的抑癌、抗菌等重要的生理功能。由于三叶半夏凝集素能凝集生长旺盛癌细胞结合并对人类及动物反转录病毒(包括HIV)具有抑制作用，抗菌肽具有选择性效应和无抗原性等特点，因此在面临抗药性和筛选新抗生素较为困难的今天，PTA-Linker-Thanatin融合蛋白有望成为新一代的抗癌、抗菌等多功能药物。植物蛋白和动物蛋白的融合为融合蛋白制品的制备提供了一条新的思路，在科研和药物开发等领域具有广阔的前景。

Description

大肠杆菌中表达PTA-linker-thanatin融合蛋白及其抗癌研究

技术领域

本发明涉及到用大肠杆菌的原核表达系统表达PTA-linker-thanatin融合蛋白，属基因工程生物技术领域。 

背景技术

三叶半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin，PTA)是一种从三叶半夏中分离出来具有凝血活性的三叶半夏蛋白，具有与甘露糖及其聚合物专一结合的性质，研究发现三叶半夏凝集素能和生长旺盛的肝癌细胞结合并使其凝集，对人类及动物反转录病毒(包括HIV)具有抑制作用，并在生殖和避孕方面也起到一定的作用等，成为近年来研究的热点。 

死亡肽(thanatin)又称死亡素，是在昆虫斑腹刺益蝽(PodisusmacμLiventris)中发现的，迄今为止在所有已知昆虫抗菌肽中，抗菌谱最广、抗菌活性最强的抗菌蛋白，由21个氨基酸残基组成，结构简单，具有抗肿瘤活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性。 

柔性肽(Gly₄Ser)n连接使两蛋白伸展性大，相互作用小，能自由运动，各自均可发挥原有的生物学效能。 

大肠杆菌表达系统具有生长快、遗传背景清晰、表达水平高、产物易纯化、稳定性好、抗污染能力强、适用范围广以及成本低的特点，是理想的外源蛋白表达系统，故本发明选用原核表达系统表达目的融合蛋白。 

本发明将植物凝集素和动物抗菌肽结合在一起是一个创新，可以使植物蛋白与动物蛋白互相弥补，更好的发挥各自的优势，为生物科学领域的科学研究和药物开发等方面提供了新思路、新途径。 

发明内容

在第一个方面中，本发明提供一种PTA-linker-Thanatin融合蛋白基因 序列，其为SEQ ID NO：1所示的序列。 

在第二个方面中，本发明提供一种PTA-linker-Thanatin融合蛋白质，其由SEQ ID NO：1所示的基因序列编码。 

在第三个方面中，本发明提供一种重组载体，其包含SEQ ID NO：1所示的基因序列。在一个实施方案中，所述重组载体是基于pEasy T1、pET-28a、pET-30a、pET-32a、pET-42a或pET-44a构建的。 

在第四个方面中，本发明提供一种宿主细胞，其包含SEQ ID NO：1所示的PTA-linker-Thanatin融合蛋白基因序列或包含含有SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组载体。在一个实施方案中，所述重组载体是基于pEasyT1、pET-28a、pET-30a、pET-32a、pET-42a或pET-44a构建的。在一个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，所述的宿主细胞，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4641。 

在第五个方面中，本发明提供第一方面所述的基因序列，第二方面所述的融合蛋白质，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的宿主细胞用于制备凝血和/或抗菌和/或抗肿瘤药物的应用。在一个实施方案中，所述肿瘤为肝癌。在一个实施方案中，所述肝癌细胞为SMMC 7721。在一个实施方案中，所述细菌为苏云金芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。在一个实施方案中，所述细菌为苏云金芽孢杆菌BtGC-91，金黄色葡萄球菌ATCC 25923，和大肠杆菌CCRC 11447。 

在第六个方面中，本发明提供凝血和/或抗菌和/或抗肿瘤药物，其包含第一方面所述的基因序列，第二方面所述的融合蛋白质，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的宿主细胞作为活性成分。在一个实施方案中，所述肿瘤为肝癌。在一个实施方案中，所述肝癌细胞为SMMC 7721。在一个实施方案中，所述细菌为苏云金芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，和大肠杆菌。在一个实施方案中，所述细菌为苏云金芽孢杆菌BtGC-91，金黄色葡萄球菌ATCC 25923，和大肠杆菌CCRC 11447。 

SEQ ID NO：1 

GGAGAATTCATGGGTTCTAAGAAGCCTGTTCCTATTATTTACTGCAACCGTCGTAC TGGTAAGTGGCAACGTATGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTTCTATGGCCTCCAAGCTCCTCCTCTTATTCCTCCCGGCCATCCTCGGCCTCGTCATTCCCCGGGCAGCCGCGGCAGTGGGCACCAACCACCTGCTGTCCGGCGAGATCCTGGACACGAACGGCCATCTCAGGAACGGCGACTTCGACTTGGTAATGCAGGAAGACTGCAACGCCGTCCTTTACAACGGCAACTGGCAGTCCAACACGGCCAACAAAGGACGGGACTGCAAGCTCACCCTCACCAACCGCGGCGAGCTCATCATCAAGAATGGCGACGGATCCATCGTCTTTAGGAGCGGCTCCCAGTCCGAGAGGGGCGACTACGCCTTGGTCGTCCATCCGGAGGGGAAGCTGGTCATCTACGGCCCATCCGTCTTCAAGATTAACCCTTGGGTCCCCGGCCTCAACAGCCTGCGGCAGCTCGGCAACATCCCTGTCACCGACAACATGCTCTTCTCCGGCCAAGTCCTCCACGAAGACGGCAGGCTCACGGCGAGGAACCACAAGCTCGTGATGCAGGGCGACTGCAACCTGGTCCTGTACGGCGGCAAATTCGGCTGGCAATCCAACACCCACGGCAACGGCGACCACTGCTTCCTCAGGCTGAGCCACAAGGGCGAGCTCATCATCAAGGACGACAACTTCAAGACAATCTGGAGCAGCCAGTCCAGCTCCAAGCAGGGTGACTACGTCTTCATCCTCCAAGAGAACGGCTTCGGCGTCATCTACGGCCCTGCCATCTTTGAGACCAACTCGAAGCGCTCCATTGCTGCGTAGCTCGAGTCC 

本发明还提供一种在大肠杆菌中制备三叶半夏凝集素和死亡素(PTA-linker-Thanatin)融合蛋白的方法：本发明通过以下步骤在大肠杆菌中表达PTA-Linker-Thanatin融合蛋白： 

1.从三叶半夏块茎中提取总RNA，将总RNA反转录成单链cDNA，再用PCR方法扩增得到双链DNA。 

2.利用多重延伸PCR技术合成pta-linker-thanatin融合蛋白基因(SEQ ID NO：1)。 

3.将pta-linker-thanatin融合蛋白基因连接到表达载体pET28a上，构建pET28a-pta。PCR、酶切验证并测序分析。若测序无误则诱导表达。 

4.诱导PTA融合蛋白表达，将稀释菌液置于LB液体培养基中37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入诱导剂IPTG，28℃振荡培养4小时。破碎菌体获得粗提蛋白。 

5.亲和层析分离纯化目的蛋白，冻干保存。 

6.PTA-Linker-Thanatin融合蛋白活性研究。 

本发明经试验研究表明PTA-Linker-Thanatin融合蛋白对兔血具有很强的凝血作用和抑菌作用。 

本发明经过抗癌药理试验研究表明PTA-Linker-Thanatin融合蛋白具有很强的抗癌作用，对人肝癌细胞的生长具有很强的抑制作用，可作为抗癌候选药物进行进一步的研究和大规模生产。 

附图说明：

图1 pta-linker-thanatin基因PCR验证图；附0.8％琼脂糖电泳图；其中从左到右依次Marker、pta基因PCR验证结果、Marker、pta-linker-thanatin基因PCR验证结果的条带。 

图2原核表达的PTA-Linker-Thanatin融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测图；附12％Tris-glycine SDS-PAGE图；其中从左到右依次是Marker，含PET28a-pta-linker-thanatin质粒的大肠杆菌未诱导，终浓度0.1mmol/ml的IPTG 28℃诱导4h，终浓度0.4mmol/ml 28℃诱导4h，纯化浓缩后的PTA-Linker-Thanatin融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测图。 

图3凝血活性检测图(兔血红细胞的显微镜照片图)。A图为未加凝集素的正常兔血红细胞(阴性对照)；B图为在兔血红细胞中加入纯化后的PTA-Linker-Thanatin融合蛋白溶液的显微图。 

图4利用MTT法检测原核表达的PTA-Linker-Thanatin融合蛋白对肝癌细胞的抑制效果图。 

图5含pta-linker-thanatin融合蛋白基因的克隆载体质粒图。 

图6含pta-linker-thanatin融合蛋白基因的表达载体质粒图。 

申请人于2011年3月8日，将本发明构建的大肠埃希氏菌(大肠杆菌)(Escherichia coli)BL21/PTA-linker-thanatin保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.4641。 

具体实施方案

下面对本发明的实施例作详细说明，本发明。 

实施例1 

三叶半夏凝集素和死亡素(PTA-linker-thanatin)融合蛋白基因。

1.取0.3g新鲜半夏块茎(采自山东菏泽)放入已加入4ml Transzol(TransGen)的研钵中研磨，用移液器反复吹打，室温孵育5分钟。 

2.将上述提取液分装8管，每管500μL，每管加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。 

3.12,000×g，4℃离心15分钟。 

4.转移无色的水相上清分装4管，每管加入500μL Transzol，100μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。 

5.12,000×g，4℃离心15分钟，转移无色的水相上清装4管。 

6.每管加入600μL异丙醇，室温孵育10分钟。 

7.12,000×g，4℃离心10分钟，去上清，加1ml 75％乙醇，剧烈涡旋。 

8.7500×g，4℃离心5分钟。 

9.弃上清，室温晾干沉淀。 

10.沉淀溶入30μL DEPC水，获得半夏总RNA。 

11.合成PTA基因的第一条cDNA链 

反应体系如下： 

反应程序：55℃，30分钟；85℃，5分钟。获得PTA基因的第一条cDNA链。 

12.RT-PCR反应 

Forward Primer：5’ATGGCCTCCAAGCTCCTCC 3’ 

Reverse Primer：5’CTACGCAGCAA TGGAGCGC 3’ 

反应体系如下： 

反应程序：94℃2min；94℃30s；62℃30s；72℃1min，30个循环；72℃5min，PCR扩增获得PTA基因(如SEQ ID NO：1106..879所示)。PCR验证结果如图1中1所示。 

13.设计多重延伸PCR引物 

P1：5’GGACTCGAGCTACGCAGCAATGGAG 3’ 

P2：5’GGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTTCTATGGCCTCCAAGCTCC 3’ 

P3：5’GCAACCGTCGTACTGGTAAGTGCCAACGTATGGGTGGTGGTGGTGGTG 3’ 

P4：5’GGAGAATTCATGGGTTCTAAGAAGCCTGTTCCTATTATTTACTGCAACCGTCGTACTGG 3’ 

在引物P1和P4的5’端引入酶切位点EcoR I和Xho I。 

14.第一步多重延伸PCR 

PCR体系如下： 

PCR的反应程序为： 

94℃5min；94℃45sec，50℃45sec，72℃45sec，30cycles；72℃10min反应结束后，回收PCR产物，并将其克隆到T载体上，测序验证。 

15.第二步多重延伸PCR以P1，P3为引物，13中获得的DNA片段作为模板，PCR体系和反应程序如13所述。 

16.第三步多重延伸PCR以P1，P4为引物，14中获得的DNA片段作为模板，PCR体系和反应程序如13所述。通过14-16所述的三步多重延伸PCR反应在PTA基因(如SEQ ID NO：1106..879所示)上依次加入了linker基因序列(如SEQ ID NO：176..105所示)及thanatin基因序列(如SEQ IDNO：110..75所示)，获得PTA-linker-thanatin融合蛋白基因(如SEQ ID NO：1所示)。 

17.将PTA-linker-thanatin融合蛋白基因TA连接到克隆载体pEasy-T1(TransGen)中，获得重组克隆载体质粒(图5)，PCR验证图如图1中2所示，测序验证结果同SEQ ID NO：1所示。 

实施例2 

感受态细胞的制备(CaCl ₂ 法)

从LB平板上挑取新活化的E.coli BL21单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1∶100～1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀＝0.5左右。将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃保存。 

实施例3 

PTA-linker-thanatin融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达

1.将在实施例1中构建的含PTA-linker-Thanatin融合蛋白基因的重组克隆载体pEasy T1-pta和大肠杆菌表达载体pET 28a通过EcoR I和Xho I限制性内切酶双酶切后回收目的片段，在T4DNA连接酶的作用下，构建表达载体pET28a-pta，载体转化到实施例2制备的E。coli BL21感受态细胞中，37℃培养。 

2.将1中的培养物取200μL轻涂于两个含LB/Kan平板上，倒置培养过夜， 涂板前将平板室温平衡放置并设置对照组。挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Kan 50μg/ml)中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50ml LB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600＝0.6左右(大约需3hr)。取部分菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.1mmol/ml和0.4mmol/ml作为实验组，两组继续28℃震荡培养4hr。分别取菌液1ml，离心3,500g×30min收获菌体，用PBS溶液重悬菌体，置于-80℃保存。将菌体重悬液于37℃速溶，置于冰上超声破碎。20,000g×30min，回收上清液，取包含可溶蛋白的上清液作为样品，SDS-PAGE凝胶电泳分析。SDS-PAGE凝胶电泳分析结果如图2中1-3所示。 

申请人已经将本实施例中构建的转入表达载体pET28a-pta的E.coliBL21细胞于2011年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.4641。 

实施例4 

PTA-linker-thanatin融合蛋白的纯化

1.根据实施例3步骤2中所述的方法获得包含PTA-linker-thanatin融合蛋白的上清液。 

2.将Ni⁺Sepharose^TM树脂(GE Healthcare)缓慢均匀加入待装树脂的亲和层析柱内，待树脂自然沉降。 

3.使用3倍柱体积的ddH₂O冲洗上述树脂。 

4.使用3倍柱体积的Ni⁺柱结合缓冲液(20mmol/L Tris-HCl；500mmol/LNaCl，PH 8.0)充分平衡树脂。 

5.将1中制备的蛋白溶液按照以下速度上样：10×(柱直径)²/h。本研究使用的亲和柱柱直径为2.5cm，上样速度为1ml/min。 

6.使用10倍柱体积的Ni⁺柱结合缓冲液(20mmol/L Tris-HCl；500mmol/LNaCl，PH 8.0)洗柱。 

7.使用3倍柱体积的Ni⁺柱Wash缓冲液(20mmol/L Tris-HCl；500mmol/LNaCl；50mmol/L imidazole，PH 8.0)洗涤凝胶柱。 

8.使用5倍柱体积的Ni⁺柱洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl；500mmol/LNaCl；150mmol/L imidazole，PH 8.0)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测，SDS-PAGE凝胶电泳检测结果如图2中4所示。 

实施例5 

PTA-linker-thanatin融合蛋白的抑菌活性的检测(参考“Park，D.S.，et al.， Isolation and tunctional analysis of a 24-residue linear α-helical antimicrobialpeptide from Korean blackish cicada，Cryptotympana dubia(Homoptera).Archivesof Insect Biochemistry and Physiology，2007.66(4)：p.204-213.”) 

最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations，MIC)的测量是通过培养液微量稀释的方法进行的。本试验利用MIC来表示该蛋白的抑菌活性。将半对数期生长的受测试的细菌重悬于各自的常规培养液中进行培养，并利用各自的培养基将受测试的各种菌液稀释到10⁵CFU/ml。将实施例4中获得的融合蛋白样品用磷酸盐缓冲液(pH 6.0)溶解，并连续稀释获得不同浓度的蛋白溶液，然后取100ul加入到100ul各菌液中混匀，在96孔板上37℃孵育10h，用酶标仪(Thermo)测量650nm处吸光度。受测试的有革兰氏阳性菌(苏云金芽孢杆菌BtGC-91(购自Ciba-GeigyLimited)，金黄色葡萄球菌ATCC 25923(上海复祥生物科技有限公司))、革兰氏阴性菌(大肠杆菌CCRC 11447(上海复祥生物科技有限公司)和酵母菌AH 109(Clontech Laboratories))。阳性对照为天然thanatin蛋白。PTA-Linker-Thanatin融合蛋白对于受测试的四种菌株的抗菌活性分析显示，表达的蛋白对除酵母菌外的受测试菌具有抗菌活性。结果表1所示。 

表1PTA-Linker-Thanatin融合蛋白抗菌活性分析 

实施例6 

PTA-Linker-Thanatin融合蛋白凝血活性测定

将实施例4中获得的PTA-Linker-Thanatin融合蛋白稀释至浓度为40 μg·mL^-1，在96孔板(Thermo)上用0.85％生理盐水作2倍梯度稀释。在载玻片上加10μL样品，等体积混合2％兔血红细胞(取自新西兰大白兔)，室温放置5-10min左右，高倍镜(40×)下检测血凝效果。用生理盐水作空白对照。每次设3个平行实验，结果取平均值。高倍镜(40×)下检测融合蛋白血凝效果，结果显示融合蛋白具有明显的凝血效果。如图3所示。 

实施例7 

MTT法(参考“袁媛，et al.，MTT法筛选青梅对SPCA-1体外增殖抑制作用有效部位的研究.食品工业，(001)：p.10-11.)抗肿瘤活性检测” 

将培养的肝癌细胞SMMC 7721(购自上海工硕生物技术有限公司)接种于96孔细胞培养板(购自研域(上海)化学试剂有限公司)中，浓度约为2×10⁴细胞/mL。每孔接种180μL，继续培养24h后加入溶解于PBS中的上述制备的PTA-Linker-Thanatin融合蛋白至终浓度分别为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.15mg/mL(体积为20μL)。对照组每孔加20μLPBS。继续培养24h后每孔加入MTT溶液(称取噻唑蓝0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中)20μL，37℃，孵育4h。小心吸去96孔板中的培养液后。每孔加入200μL DMSO。在恒温振荡器上振荡5min，在酶标仪(Multiskan MK3酶标仪)中测定各孔OD值。测定波长为492nm。计算各提取物对肿瘤细胞的生长抑制率。生长抑制率(％)＝(对照组平均OD值-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。利用MTT法对重组三叶半夏凝集素的抗肿瘤的活性检测的结果显示PTA-Linker-Thanatin融合蛋白对肝癌细胞SMMC 7721的增殖具有抑制作用，并且抑制效果随着加入的蛋白浓度的增加而加强。结果如图4所示。 

Claims (10)

1.一种在大肠杆菌中制备三叶半夏凝集素和死亡素(PTA-linker-Thanatin)融合蛋白的方法，其特征在于通过多重延伸PCR技术获得如SEQID NO：1所示序列的PTA-linker-Thanatin融合蛋白基因，接着构建重组表达载体，在大肠杆菌表达系统中表达所述三叶半夏凝集素和死亡素的融合蛋白。

2.一种PTA-linker-Thanatin融合蛋白基因序列，其为SEQ ID NO：1所示的序列。

3.一种PTA-linker-Thanatin融合蛋白质，其由权利要求2所述的基因序列编码。

4.一种重组载体，其包含权利要求2所述的基因核酸序列。

5.权利要求4所述的重组载体，其是基于pEasy T1、pET-28a、pET-30a、pET-32a、pET-42a或pET-44a构建的。

6.一种宿主细胞，其包含SEQ ID NO：1所示的PTA-linker-Thanatin融合蛋白基因序列或权利要求4或5所述的重组载体。

7.权利要求6所述的宿主细胞，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4641。

8.权利要求2所述的基因序列，权利要求3所述的融合蛋白质，权利要求4-5所述的重组载体，权利要求6或7所述的宿主细胞用于制备凝血和/或抗菌和/或抗肿瘤药物的应用。

9.权利要求8的应用，其中所述肿瘤为肝癌。

10.凝血和/或抗菌和/或抗肿瘤药物，其包含权利要求2所述的基因序列，权利要求3所述的融合蛋白质，权利要求4-5所述的重组载体，权利要求6或7所述的宿主细胞作为活性成分。

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