CN103397036B

CN103397036B - 一种用于毕赤酵母表达重组人血清白蛋白的基因序列

Info

Publication number: CN103397036B
Application number: CN201310277310.3A
Authority: CN
Inventors: 倪世明; 符美娟; 丘力功; 黄明; 韦剑; 王灿顶; 蔡小杰
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: CN103397036A

Abstract

本发明公开了一种用于毕赤酵母表达重组人血清白蛋白的基因序列，其含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。含有此基因的pPink-LC载体经线性化后与PichiaPink?工程菌进行同源重组，可实现人血清白蛋白的高效表达。

Description

一种用于毕赤酵母表达重组人血清白蛋白的基因序列

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种优化的用于毕赤酵母重组表达人血清白蛋白的基因序列和表达该基因的甲醇毕氏酵母工程菌。

背景技术

人血清白蛋白（HSA）在人体内重要的生理功能，主要用于临床纠正因大手术、创伤、器官移植等引起的急性血容量减少；处理大面积烧伤、呼吸窘迫等引起的水、电解质和肢体平衡失调，以防止和控制休克；还用于急胃肠出血、肾透析以及严重的慢性疾患，如消化道吸收不良、肝硬变、肾病综合症、脑血管意外或脑局部缺血等内科疾病，特别是合并水肿的病例。人血白蛋白（HSA）还是生物制药必不可少的保护剂和赋形剂。

天然的HSA是由人类血浆提取的一类血液制剂药品，是现代医学用于预防和治疗不可缺少的药品，它是一类特殊的药品，其唯一原料是人血，一方面受社会、经济和政治因素的制约，不能随意开发，一方面是维系生命的重要物质，受原料短缺制约，临床应用受限，属于紧缺药品，另一方面由于血液难免被各种病原体感染，如：爱滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等，血液制品的用药安全成为国际社会关注的突出问题。

基于以上来源和安全性的原因，利用基因重组技术大规模生产重组人血清白蛋白成为必然的选择。

由于HSA含有多个二硫键，采用原核系统很难得到正确折叠的表达产物；而使用哺乳细胞或昆虫细胞则在表达量和成本方面存在突出的问题，通常重组HSA的表达是采用较为低等的真核表达系统特别是用酵母的方式进行。如将在AOX1启动子控制下的HSA基因导入巴斯德毕赤酵母以得到转化细胞，得到可通过甲醇诱导的HSA表达工程株。有学者对毕赤酵母重组表达的HSA进行了比较实验，结果表明两者几乎完全相同。为了进一步提高HSA在酵母中的表达产率，有通过HSA编码序列进行修饰，通过改变基因结构以改进目标基因表达效率和水平的方法报道。如在98102506.4的中国发明专利提供的技术方案为：去除编码序列的内含子的剪接位点、非转录终止区的转录终止序列、长的重复序列、内部启动子序列及核糖体位点的修饰的基础上改造HSA基因密码子，使表达HSA的基因基本由酵母偏性密码子组成。

我们在HSA基因序列优化改改造研究中，综合考虑密码子的宿主偏性、基因GC含量、CpG含量、mRNA二级结构、序列的内含子的剪接位点、RNA结构不稳定序列、非转录终止区的转录终止序列、长的重复序列、等与基因表达效率相关的因素，设计了包括中国发明专利98102506.4中公开的基因序列在内的几个HSA序列优化方案。研究结果表明，将优化方案中的基因整合进腺苷合成缺陷型的PichiaPink毕赤酵母后都能表达HSA，但其中一个优化方案的序列对应的表达量不仅高于天然基因的表达量，也显著高于包括中国专利98102506.4中的公布序列在内的其他的优化方案的序列的表达量。此最佳方案的优化的基因序列与中国发明专利98102506.4的表达HSA的序列之间除了信号肽区不同外（前者为HSA信号肽，后者为α因子前原序列），在其他编码序列亦存在显著的区别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在腺苷合成缺陷型的PichiaPink毕赤酵母高效表达的人血清白蛋白（HSA）的基因序列。

本发明的另一个目的在于提供一种携带上述基因的PichiaPink工程重组菌株。

本发明的另一个目的在于利用上述PichiaPink工程重组菌株生产重组人血清白蛋白。

本发明所采取的技术方案是：

一种经优化的表达人血清白蛋白的基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种甲醇营养型的巴斯德毕赤酵母基因工程重组菌，其含有上述经优化的表达人血清白蛋白的基因。

所述的基因工程重组菌，其为Mut+表型的PichiaPink? 工程重组菌。

上述工程重组菌在生产重组人血清白蛋白中的应用。

一种克隆载体，其含有上述经优化的表达人血清白蛋白的基因。

一种表达载体，其含有上述经优化的表达人血清白蛋白的基因。起始载体可为pPink-LC载体、p-PINK-HC载体或其它可选用的高拷贝筛选用质粒。

一种甲醇营养型的巴斯德毕赤酵母基因工程重组菌，其含有上述的表达载体。

上述的工程重组菌在生产重组人血清白蛋白中的应用。

本发明的有益效果是：本发明优化后的人血清白蛋白基因序列可在PichiaPink? 工程菌中实现人血清白蛋白的高效表达。

附图说明

图1：HSA优化基因序列与天然基因序列比对分析1（Optimized：优化后的HSA序列，Original：天然的HSA序列）；

图2：HSA优化基因序列与天然基因序列比对分析2（Optimized：优化后的HSA序列，Original：天然的HSA序列）；

图3：HSA优化基因序列与公布的HSA改造序列编码的氨基酸序列比对分析；

图4：表达载体的构建流程图；

图5：pPink-LC-HAS高表达株上清的凝胶电泳结果（M：maker，1：浓度为100mg/L 的HAS标准品，2-6：优化序列筛选出的1-5号菌株诱导表达72h的上清）；

图6：不同基因序列表达HSA上清电泳结果比较（M：maker，1：浓度为150mg/L的HAS标准品，2：天然序列对应的表达株3诱导表达72h的上清，3：专利98102506.4披露的基因序列对应的表达株2诱导表达72h的上清:4：本发明序列对应的表达株5诱导表达72h的上清）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例

1、优化基因的合成和分析

优化的基因序列由SEQ ID NO.1所示，由GeneScript公司合成，长1842bp，GC%：42.18。其与天然的HSA序列（GenBank登录号为NM_000477.1）的不同见图1和2。

优化的基因序列与发明专利98102506.4公开的基因序列（见中国发明专利98102506.4 SEQ No.1）经blastn同源性比对，发现两者在核苷酸序列方面无同源性（或相似性），表明两者间显著不同。而经tblastx同源性比对表明，两者编码的氨基酸序列在成熟肽段部分则高度同源（见图3），皆编码相同功能的人血清白蛋白。

2、pPink-LC-HSA的化学法转化

按附图4的流程进行pPink-LC-HSA表达载体的构建：合成的基因片段和载体分别经EcoRI/KpnI内切酶酶切后纯化，用T4连接酶于37℃下温育2小时进行连接反应，将合成基因片段连入pPink-LC表达载体（Invitrogen公司）中，得到重组的pPink-LC-HAS表达载体。重组pPink-LC-HSA载体扩增后经纯化，用SpeI限制性内切酶酶切线性化，用化学法转化入感受态的PichiaPink毕赤酵母菌中。经转化同源重组的表达菌株为Mut+表型。转化的具体步骤如下：

（1） PichiaPink? Strain1（腺嘌呤缺陷型）（Invitrogen公司）在YPD平板划线培养，30℃培养3天；

（2）挑取单克隆入10ml YPD培养基中，30℃、250rpm培养1天；

（3）转接入100ml YPD培养基中，30℃、250rpm培养至OD600=0.6～1.0；

（4） 540rpm*10min收获菌体，100mM LiAc洗涤1次

（5） 540rpm*10min收获菌体，用350ul的100mM LiAc悬起菌体，终体积为500ul ；

（6）分装50ul每管，6000rpm离心，吸尽LiAc后，依次加入：

50%PEG3350（v/v） 240ul

1M LiAc 36ul

2mg/ml 单链DNA 25ul（沸水浴变性）

10ug DNA和H2O 50ul

（7）剧烈涡旋混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

（8）30℃水浴孵育1h；

（9）42℃水浴热休克30min；

（10）6000rpm离心收集酵母菌体，用200ul无菌水重悬，涂布PAD平板，30℃培养3~7天；

（11）挑取白色菌落，甘油保菌及进行诱导表达。

3、pPink-LC-HSA的诱导表达

在诱导表达中，扩增培养基为BMGY培养基，诱导培养基为BMMY培养基。诱导表达实验步骤如下：

（1）挑选单菌落，置于装有10ml BMGY培养基的50ml离心管中，30℃/250 rpm培养至OD600 = 2-6 (24 h可至OD600=4.5)；

（2）室温下1000rpm离心10min，收集菌体用BMMY重悬，使OD600=1.0左右，并移入250ml摇瓶，30℃/250 rpm培养；

（3）每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5%～1.0%；

（4）于72h取上清用SDS-PAGE法、Western-Blot法检测与鉴定重组蛋白的表达，筛选出高表达株，见图5。

SDS-聚丙烯胺凝胶电泳操作：

（1）制胶与电泳

使用10％的凝胶配方10mL，混匀灌胶，加适量纯化水覆盖于胶面上以保持胶面平整。

ddH20 3.3mL

30%丙稀酰胺溶液 4.0mL

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 2.5mL

10%SDS 0.1mL

10%过硫酸铵溶液(aps) 0.1mL

TEMED 0.004mL

待分离胶凝固后，倾去纯化水，用滤纸吸干水分并按下列配方配制5％积层胶铺于分离胶上，插入梳子；将蛋白样品上样，电泳（200V恒压，电泳时间1小时），电泳后剥胶。

ddH20 2.7mL

30%丙稀酰胺溶液 0.67mL

1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 0.5mL

10%SDS 0.04mL

10%过硫酸铵溶液(aps) 0.04mL

TEMED 0.001mL

（2）将电泳胶浸于考马斯亮蓝染色液中，染色1-2h；用脱色液反复脱色直至背景无色。

4、不同序列对应表达的人血清白蛋白含量比较

按步骤1至3的操作进行天然序列和中国专利98102506.4中公布的含α因子前原片段的编码序列的合成以及相关的质粒构建、转化和诱导表达，并各自筛选出8-10个高表达株。然后取各序列对应的高表达株按3的实验步骤进行诱导表达对比研究。

人血清白蛋白的含量检测方法为：取收获液上清用上样缓冲液稀释4倍后上样，进行SDS-聚丙烯胺凝胶电泳：上样量7μL，分离胶浓度为10%，200V恒压，电泳时间1小时。考马斯亮蓝染色后，以已知量的人血清白蛋白标准品为参照，光密度扫描法分析目标蛋白量，据此得出不同序列对应的表达产量。不同序列来源的表达量比较分析按t检验进行，分析结果见表1和图6。

结果表明，在相同的表达株构建和筛选条件下，本发明序列对应的重组PichiaPink毕赤酵母菌株比专利98102506.4披露的基因序列对应的表达株有更高的表达量，且差异十分显著（p<0.01）。

表1 不同序列对应的重组PichiaPink毕赤酵母菌株摇瓶表达HSA检测结果

HSA对应的基因序列	筛选的高表达株数目	收获时间	收获时OD600nm	HSA表达量（mg/L）
					天然序列	8	72h	25.00±2.00	110±12
98102506.4披露的基因序列	10	72h	26.20±1.40	500±60¹
					本发明序列	10	72h	25.60±1.70	735±65^1、2

注：1指与天然序列的菌株比较，表达量差异十分显著（p<0.01）；2指与专利98102506.4披露的基因序列的菌株比较，表达量差异十分显著（p<0.01）。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司

<120> 一种优化的用于毕赤酵母重组表达人血清白蛋白的基因序列

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaattcatga agtgggttac ctttatttcc cttttgtttt tgtttagttc cgcatactca 60

agaggtgttt ttagaagaga cgcacataag tccgaagtcg ctcatagatt caaggatttg 120

ggtgaagaga acttcaaggc ccttgttttg attgcctttg cacaatactt gcaacagtgt 180

ccattcgaag atcatgttaa attggtcaac gaagttactg agtttgctaa gacatgtgtt 240

gcagatgaat ctgctgagaa ttgcgacaaa tcccttcaca ctttgttcgg tgacaagttg 300

tgtactgttg ctacacttag agaaacatat ggagagatgg ccgattgttg cgcaaaacaa 360

gaaccagaga gaaacgaatg tttcttgcag cacaaggatg acaacccaaa tcttcctaga 420

ttggttagac ctgaggttga tgtcatgtgc accgcttttc atgacaatga agagactttc 480

ttgaagaaat acctttacga aatcgctaga agacacccat acttctatgc acctgagttg 540

ttgtttttcg ctaaaagata caaggctgcc tttactgaat gttgccaagc agctgataaa 600

gccgcatgtt tgcttccaaa gcttgatgaa ttgagagacg agggtaaagc atcttccgct 660

aaacaaagat tgaagtgtgc atcccttcag aaatttggag aaagagcttt caaggcttgg 720

gccgttgcaa gattgtccca aagatttcct aaggccgaat ttgcagaggt ctcaaaattg 780

gttaccgatc ttactaaggt tcatactgaa tgttgccacg gagatttgct tgagtgtgct 840

gatgacagag ctgacttggc caaatatatt tgcgaaaacc aggattcaat ctctagtaag 900

ttgaaggaat gttgcgagaa acctttgctt gaaaagtctc attgtattgc cgaagttgag 960

aacgatgaga tgccagcaga ccttccttca ttggctgccg attttgtcga aagtaaagac 1020

gtttgtaaga attacgctga ggccaaggac gttttcttgg gaatgttcct ttacgaatat 1080

gcaagaagac atccagatta ctctgttgtc ttgcttttga gattggccaa aacttatgaa 1140

actacattgg agaagtgttg cgcagctgcc gaccctcacg aatgttatgc taaagtcttt 1200

gatgagttca agccattggt tgaagagcct caaaacttga tcaaacagaa ctgtgaattg 1260

ttcgagcaac ttggagaata caagtttcag aacgctcttt tggttagata tactaagaaa 1320

gtcccacaag tttctacccc tactttggtt gaagtctcca gaaatttggg taaagttgga 1380

tcaaaatgtt gcaagcatcc agaagctaag agaatgcctt gtgccgagga ctacttgagt 1440

gttgtcctta atcagttgtg cgtccttcac gaaaagactc cagtctccga tagagttaca 1500

aagtgttgca ccgagagttt ggttaacaga agaccatgtt tctctgcttt ggaagtcgac 1560

gagacttatg ttcctaaaga gtttaacgcc gagactttta ctttccatgc agatatctgt 1620

acattgtctg aaaaggagag acaaatcaag aaacagaccg ctttggtcga acttgttaag 1680

cacaaaccta aggctaccaa agagcaattg aaggccgtca tggatgactt tgcagctttc 1740

gttgaaaaat gttgcaaggc tgatgacaag gagacttgtt ttgccgaaga aggaaagaag 1800

ttggtcgccg ccagtcaagc cgcattgggt ttgtaaggta cc 1842

Claims

1.一种经优化的表达人血清白蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种克隆载体，其含有权利要求1所述的基因。

3.一种表达载体，其含有权利要求1所述的基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其为pPink-LC载体或pPink-HC载体。

5.一种甲醇营养型的巴斯德毕赤酵母基因工程重组菌，其含有权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的基因工程重组菌，其为Mut⁺表型的PichiaPink 工程重组菌。

7.权利要求5或6所述的工程重组菌在生产重组人血清白蛋白中的应用。

8.一种甲醇营养型的巴斯德毕赤酵母基因工程重组菌，其含有权利要求3或4所述的表达载体。

9.根据权利要求8所述的基因工程重组菌，其为Mut⁺表型的PichiaPink 工程重组菌。

10.权利要求8或9所述的工程重组菌在生产重组人血清白蛋白中的应用。