CN105985981A - 人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以重组DNA技术生产人血清白蛋白的方法,特别是涉及合成的适合哺乳细胞表达的密码子组成的人血清白蛋白基因,携带所说的基因的重组表达载体和用所说的载体转化的哺乳动物细胞,以可分泌形式生产人血清白蛋白的方法。本发明的方法特征在于人血清白蛋白结构基因在所说的哺乳动物细胞内一次转化获得稳定的高水平表达,9pcd(皮克每细胞每天)。并且人血清白蛋白表达产物将分泌到发酵液培养基内,利于工业规模的分离和下游加工。
Description
技术领域
本发明涉及以重组DNA技术生产人血清白蛋白的方法,特别是涉及合成的适合哺乳细胞表达的密码子组成的人血清白蛋白基因,携带所说的基因的重组表达载体和用所说的载体转化的哺乳动物细胞,以可分泌形式生产人血清白蛋白的方法。
背景技术
人血清白蛋白是单链非糖基化蛋白质,由585氨基酸组成,分子量为66000道尔顿,等电点为4.7。它以前原蛋白质的形式在肝细胞中产生,并由细胞加工去除前原序列和信号肽后得以分泌。成熟的血清白蛋白分子呈椭圆形,并含有多个二硫键。人血清白蛋白在循环血液中可达42克每升,是血清中最丰富的蛋白。人体每天分解代谢消耗约14克,在正常情况下,肝细胞每天合成补充相同量的血清白蛋白使人体总HSA量保持动态平衡。HSA分子在人体内的半衰期为19天,平均寿命27天。
人血清白蛋白是由人类血浆提取的一类血液制剂药品,是现代医学用于预防和治疗的不可缺少的药品。人血清白蛋白具有维持血浆渗透压,调节血压,营养和促进伤口愈合的作用。其作为血液中的载体物质,参与多种生物分子如激素,氨基酸,胆色素和生物活性物质及药物等在血液中的运输。因此,人的血浆中提取的人血清白蛋白,在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及急性胃肠出血、肝硬化、肾水肿和合并水肿等病症。同时,人血白蛋白还是生物药物和疫苗的必不可少的保护剂和赋形剂。因而,临床应用广泛,需求量非常大。
目前临床上使用的HSA主要来自于分离和纯化献血者的血液或胎盘组织,价格相对便宜。但是传统血液HSA一方面受社会、经济和政治因素的制约,不能随意开发,另一方面由于血液难免被各种病原微生物的感染,如:爱滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等,使得血液制品的用药安全成为国际社会关注的突出问题。这样,使用现代生物技术研发和大规模生产人血清白蛋白,不仅能摆脱对人血源的依赖,而且能绝对避免病原微生物的污染、保证人血清白蛋白的用药安全。
人们尝试用不同的表达系统以重组DNA技术大批量生产HSA。由于HSA分子量大,结构相对复杂,所以用原核大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等原核表达系统或酵母等真核表达系统难以得到正确折叠的表达产物。例如在细菌中表达HSA将产生不溶的多聚体,需要重新加工而形成成熟的可溶性蛋白。HSA还于酵母中表达,产率很低并有相当一部分HSA已裂解,粘附在细胞上和不溶解(Sleep et al.1990,biotechnology 8:42-46;Etcheverry et al.1986,Biotechnology4:729-730;Quirk et al.1989,Biotech and Applied Biochem.11:273-287)。另外,这些表达系统所产生的HSA往往存在难以去除的菌体毒素及其他异源蛋白质污染物,所以很难得到大量的适合临床使用的HSA产品。使用哺乳动物细胞如CHO或COS细胞及昆虫细胞表达系统,能产生有正确空间构象的蛋白质产物。
1981年Genentech公司率先从人肝脏中克隆出了全长HSA cDNA。成熟的HSA蛋白质由585个氨基酸组成。成熟蛋白前面(氨基端)还有一prepro序列。preHSA含18个氨基酸,呈疏水性。proHSA含6个氨基酸,呈碱性。proHSA末端是Arg-Arg碱性氨基酸并能被内胎酶识别加工。Genentech公司研究人员首先将HSA成功地在大肠杆菌胞内表达(Lawn et al,1981,Nucleic Acids Res.9:6103-6114)。哈佛大学Gilbert等用小鼠白蛋白cDNA探针从人胎肝脏中杂交分离出人血清白蛋白cDNA,并在大肠杆菌中成功地获得分泌表达(Philipp BW and Gilbert W,1982,J Cell Biochem.Suppl 6:337-346)。但是应用大肠杆菌表达HSA容易形成折叠错误及构象有别于天然分子的重组白蛋白,表达量也低,一般在每升毫克水平,难以产业化(Latta M et al.1987,Bio/Technology 5:1309-1314)。因而有研究人员进而应用低等真核生物酵母表达系统表达HSA。英国的Delta生物技术公司,匈牙利科学院遗传学研究所和日本绿十字公司等研究小组成功地应用酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)表达系统分泌表达HSA,并达每升几毫克到一百毫克水平(Sleep D et al,1990,Bio/Technology 8:42-46;KalmanM et al.1990,Nucleic Acids Res.18:6075-6081;Okabayashi K.et al,1991,J.Biochem 110:103-110)。次年,HSA在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Lactis)中分泌表达达每升几百毫克水平,用高密度发酵技术更可提升产量到每升1-2克水平(Fleer R.et al,1991,Bio/Technology 9:968-975)。多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)也可用高密度发酵技术分泌表达1-2克每升的HSA。应用巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统进行高密度二相发酵和诱导表达,表达量更可高达每升2-4克(Barr KA et al.1992,Protocol for efficientsecretion of HSA developed from Pichia Pastoris.Pharm Eng.12:48-51)。九十年代以后,随着转基因植物和动物技术的成熟,HSA也被在马铃薯(Solanumtuberosum)和烟草(Nicotiana tabacum)中表达(Hoekema A.et al.1990,J CellBiochem.Suppl.14E:333;Sijmons PC et al.1990,Biotechnology NY8:217-221)。HSA还在转基因小鼠的乳汁中成功表达。表达量达到0.3mg/ml(Shani M et al.1992,Transgenic Res.1:195-208;Barash I et al.1994,Transgenic Res.3:141-1551;Barash I et al.1996,Nucleic AcidsRes.24:602-610;Hurwitz DR et al.1994,Transgenic Res 3:365-375)。
发明内容
本发明提供了适合哺乳动物细胞表达的由优化密码子组成的合成的编码人血清白蛋白的核苷酸序列及其功能等同物。
根据本发明这一目的一个优选实施方案,其中对所说的HSA编码序列进行了密码子优化,使其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是分泌表达HSA,其中提供了一个特殊的分泌肽核苷酸序列并将其融合的到HSA的5’端。
本发明的另一个目的是提供包含上述HSA编码序列的重组表达载体。
根据本发明这一目的一个优选实施方案,其中对所说的重组表达载体包括一个或多个由(1)CMV的启动子区域,(2)编码信号肽和HSA的核苷酸序列,(3)SV40转录终止子,(4)原核可选择标志基因(Amp抗性)和细菌复制原点(Oric),(5)真核可选择标志基因(Zeo抗性)。
本发明的再一目的是提供用上述携带HSA编码序列的重组表达载体转化的哺乳动物细胞。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵细胞。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的中国仓鼠卵细胞带有LmE1A.32(pgt)转基因,以增强启动子功效。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的哺乳动物细胞是CHO,COS,HeLa,PerC6,NSO1,SP1等细胞。
本发明的再一个目的是提供以DNA重组技术生产人血清白蛋白的方法,该方法包括在适于表达所需的蛋白质的条件下培养按上述方法制备的包含编码人血清白蛋白的核苷酸序列的哺乳动物宿主细胞,然后从培养物中回收并纯化所需的人血清白蛋白。
为了便于将本发明的合成的HSA基因连接到个不同的克隆载体或表达载体上,我们在其5’和3’端分别加入两个单一酶切位点,其中NheI和XhoI切点用于连接表达载体。另外,为了确保酶切位点的有效利用,我们将合成的HSA基因克隆进pBlueScript质粒以便酶切回收。为了便于将合成的HSA基因连接到信号肽的C末端上,在该基因的N末端加入了氨基酸序列AlaSer作为信号肽识别和切割位点。(HSA的C末端带有终止密码子TAA序列,以确保mRNA转译的正确终止。)上述这些修饰导致本发明合成的HSA基因序列总长度为1821bp。
用于表达本发明的HSA基因的表达载体可以是携带适用于在哺乳动物细胞中表达外源基因的表达调控元件,并可插入哺乳动物细胞基因组的任何载体,例如pCI-neo(Promega)、pSecTagFRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)和pOptivec-TOPO(Invitrogen)。本发明优选的是pDirect载体(AntagenBiosciences)。
用于本发明的HSA是由化学全基因合成的,含有优化的密码子。此基因两端分别带有NheI和XhoI酶切位点。HSA基因用NheI和XhoI酶切出并插入pDirect载体的NheI和XhoI酶切位点。信号肽为原pDirect载体自身带有的从MluI到NheI位点之间的Secrecon序列。所形成的最终表达载体含有从5’起的CMV启动子,Secrecon信号肽,HSA编码序列,SV40转录终止信号,Amp抗性基因,Oric,Zeo抗性基因。
附图说明
图1为本发明的真核可选择标志基因示意图;
图2为本发明的鉴定HSA的实例示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
实例介绍:
1)详细的HSA克隆过程
实例1:HSA基因克隆和表达载体的构建
经密码子优化的HSA基因的化学全合成服务购自Epoch Biolabs公司,并由该公司克隆进pBlueScript载体,测序验证100%正确。然后,我们将带有HSA基因的pBlueScript质粒转化TOP10化学感受态细胞(Invitrogen),取30ul涂布在含Amp的琼脂糖平板上,37℃培养过夜。次日,挑单克隆菌落,接种到2ml含Amp的LB培养液,37℃培养过夜。次日,用Qiagen公司的试剂盒提取质粒。用NheI和XhoI酶酶切,走琼脂糖凝胶电泳,从胶上回收1.7kb左右的HSA基因片断,用T4连接酶(New England Biolabs)在16C连接过夜插入pDirect载体的NheI和XhoI酶切位点。连接产物转化Stable3化学感受态细胞(Invitrogen),细菌全部涂布在含Amp的琼脂糖平板上,37℃培养过夜。次日,挑单克隆菌落,接种到2ml含Amp的LB培养液,37℃培养过夜。再次日,用Qiagen公司的试剂盒提取质粒。用NheI和XhoI酶酶切鉴定含HSA基因片断的细菌克隆。
2)详细的转化细胞过程
实例2:HSA稳定表达细胞株的建立
转化:采用逆转化法将含有HSA的表达载体质粒pDiect-HSA转化进CHO细胞中。具体实施如下:先将15ul脂质转化试剂(例如HiPerfect,QIAGEN)稀释到250ul无血清培养基OptiMEM(Invitrogen),室温培养5分钟。同时将2.5ug线性化的表达载体质粒稀释到250ul无血清培养基OptiMEM。将室温培养好的脂质转化试剂加入到稀释的DNA溶液中,再在室温培养15-20分钟。培养期间可消化处理细胞。将贴壁的CHO用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37℃消化5分钟。收集单细胞悬浮液,并进行细胞计数。将40万细胞悬浮在2.5ml的DMEM-10%小牛血清培养基中(不含抗生素),并转移到一个6孔细胞培养板中。将经过15-20分钟培养的DNA/脂质转化试剂的混合物直接加入细胞中。并将细胞放回培养箱培养24-48小时。
克隆形成:将转化好的细胞用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37C消化5分钟。于500xg离心力下将细胞离心下来,去除上清。将细胞悬浮在10ml新鲜DMEM-10%小牛血清培养基中(可含抗生素),并加入100-500ug/ml的Zeocin(Invitrogen)后,将细胞加入到96孔培养板中,每孔加100ul细胞悬浮液。将细胞放回培养箱培养8-12天直到抗性克隆出现。
有限稀释克隆细胞株:将表达HSA的细胞从96孔中取出,经过细胞计数,将100个细胞悬浮在10ml的新鲜培养基中,并将细胞加入到新的96孔培养板中。将细胞放回培养箱培养8-12天直到细胞克隆出现。
3)详细的HSA定量过程
实例3:检测HSA的表达量
细胞处理:将细胞于24孔或6孔细胞培养板中培养至50-90%满。用消毒过的磷酸盐缓冲液洗一下细胞。然后加入适量的新鲜DMEM-10%小牛血清培养基。经过24小时培养后,收集培养上清,同时用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37℃消化细胞并进行细胞计数。培养上清可直接用酶联免疫吸附法测定HSA的量。
HSA标准溶液:将纯化的人血清白蛋白冻干粉(Sigma-Aldrich)溶解在磷酸盐缓冲液中。蛋白浓度用MicroBCA法(Pierce)测定。然后将HSA浓度用磷酸盐缓冲液调整到1mg/ml,并加入NaN3防腐剂保护。
酶联免疫吸附法:在做此实验的前一天,将15C7抗HSA小鼠单克隆抗体用0.5M NaCO3稀释到5ug/ml,然后加50ul每孔到高吸附96孔板中(Nunc),4℃包被过夜。然后板用含0.1%Tween20的TBS缓冲液(TBST)洗一次。每孔中再加入200-300ul的含10%小牛血清的TBST的溶液在室温封闭一小时。96孔板去除封闭液后用TBST洗三次,然后可加入待测细胞培养上清或标准HSA溶液,每孔加50ul。HSA的标准溶液要先用封闭液稀释到1000ng/ml,然后做1∶2的序列稀释。样品可在37℃保温培养2小时或4℃过夜培养。经培养的样品板用TBST液洗三次,然后加入50ul每孔的经稀释的检查抗体1A9-HRP偶联物。在37℃保温培养1小时后,96孔板用TBST洗至少六次,每次十分钟。然后每孔中加入100ul的3,3,5,5-四甲基联苯胺/TMB底物溶液。经过室温5-10分钟,加入2N硫酸终止液。TMB底物颜色有蓝变黄。经96板读板器读取450nm吸收数据,然后根据标准样品曲线计算出样品中的HSA含量。在根据总培养上清量和细胞总数计算出每个细胞每天可产出的皮克HSA。表1提供了一个测定pcd的实例。
表1:细胞株的pcd测定
4)详细的细胞培养过程
实例4:细胞株的扩增
经过有限稀释克隆好的细胞株,用上述HSA定量测定法测定出高产细胞株。然后将高表达HSA的细胞从96孔中取出,转移至24孔培养板中扩增培养2-7天。当细胞达到80-90%覆盖率后,转移至6孔培养板中扩增培养2-7天。当细胞达到80-90%覆盖率后,可进行H产量的测定,同时将剩余的细胞冷冻保藏于液氮中。
5)HSA的定性鉴定
实例5:HSA的定性鉴定
正确表达的HSA可用Western免疫印记法测定。细胞先用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37C消化,然后用磷酸盐缓冲液洗一下细胞。细胞再经蛋白裂解液(1%Triton X-100,50mM Tris-HCl,150mM NaCl,蛋白酶抑制剂(Roche))裂解。经过高速离心后,蛋白上清用MicroBCA(Pierce)定蛋白量。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内,进行电泳。溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。转膜利用iBlot(lnvitrogen),根据厂商的产品说明,将蛋白转移到聚偏氟乙烯PVDF膜上(一般5-7分钟)。转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western封闭液(5%脱脂奶粉),在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗(例如1A9-HRP),室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。经洗涤液洗涤5-10分钟,共洗涤3次,可使用增强型化学发光法ECL类试剂来检测蛋白信号,并用Versa Doc(Bio-Rad)暗箱记录信号。图2提供了一个鉴定HSA的实例。
6)详细的纯化过程
根据常规纯化工艺进行纯化。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点,本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内,本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,合成的适合哺乳动物细胞表达的密码子组成的人血清白蛋白的核苷酸序列及其功能等同物。
2.根据权利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,核苷酸序列,于5’-端加入信号肽核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,其中对所说的人血清白蛋白编码序列具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,编码具有SEQ ID NO 2所示的蛋白质序列。
5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,包含编码人血清白蛋白的核苷酸序列的适合哺乳动物表达的重组表达载体。
6.根据权利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,其中包括一个或多个由(1)CMV的启动子区域,(2)编码信号肽和HSA的核苷酸序列,(3)SV40转录终止子,(4)原核可选择标志基因(Amp抗性)和细菌复制原点(Oric),(5)真核可选择标志基因(Zeo抗性)。
7.根据权利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,所述的改构的人血清白蛋白基因片段表达盒的基因重组表达载体或质粒为pDirect-HSA,或其他用于哺乳动物细胞表达的载体,重组表达载体转化的哺乳动物细胞,哺乳动物细胞为中国仓鼠卵细胞;中国仓鼠卵细胞具有LmElA.32(pgt)转基因序列,以增强启动子功效。
8.根据权利要求9所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,哺乳动物细胞为CHO,COS,HeLa,PerC6,NS01,SP1细胞中的任何一种细胞。
9.根据权利要求7所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,用于本发明的HSA是由化学全基因合成的,含有优化的密码子,化学全基因两端分别带有NheI和XhoI酶切位点。
10.根据权利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,其特征在于,本表达方法适用于自然界存在的任何信号肽序列。
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Application publication date: 20161005 |