CN103554233A - 鸭瘟病毒ul13截段重组蛋白、其多克隆抗体及制备方法和应用 - Google Patents

鸭瘟病毒ul13截段重组蛋白、其多克隆抗体及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的鸭瘟病毒（DPV）UL13截段重组蛋白、其编码基因、重组表达载体、工程菌以及利用工程菌制备该截段重组蛋白的方法，操作简便、成本低，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较；所得截段重组蛋白具有免疫反应活性，能够与DPV抗体特异性结合，可以作为检测DPV抗体的检测抗原，检测准确度高、特异性强、无交叉反应、无散毒危险；本发明还以DPV UL13截段重组蛋白为抗原免疫动物成功获得了多克隆抗体，该多克隆抗体可以作为检测DPV的检测抗体，具有检测特异性强、无交叉反应等优点。

Description

鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白、其多克隆抗体及制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种病毒的截段重组蛋白及其制备方法，以该截段重组蛋白为抗原免疫动物得到的多克隆抗体，以及该截段重组蛋白及其多克隆抗体的应用。 
背景技术
鸭瘟（Duck Plague，DP）是由疱疹病毒科的鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、接触性传染的败血性传染病，可导致商品水禽产蛋量下降及死亡，对野生水禽也有不同的致死率。近年来，随着养鸭业生产向集约化、规模化的方向发展，DP作为威胁养鸭业最严重的接触性传染病之一，造成了巨大的经济损失。 
临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。其中，中和试验的敏感性不够理想，且检测耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA方法具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作的特点，可用于大批鸭群和鹅群抗体水平的监测以及基层单位检疫。但是，以往的ELISA方法均使用DPV全病毒作为包被抗原，而全病毒抗原的纯化方法复杂，且纯度有限、稳定性差，影响检测结果的准确性。因此，研究一种新型抗原，对建立特异敏感的DPV抗体检测方法进而防控DP显得尤为重要。另一方面，对DPV的检测、研究也需要特异性的抗体。 
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种新型抗原，可作为DPV抗体捕获剂；目的之二在于提供该新型抗原的制备方法；目的之三在于利用该新型抗原免疫动物获得多克隆抗体；目的之四在于提供该新型抗原及其多克隆抗体在制备检测试剂中的应用。 
为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案： 
1.DPV UL13截段重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 
2.DPV UL13截段重组蛋白的编码基因。 
进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 
3.含有DPV UL13截段重组蛋白编码基因的重组表达载体。 
进一步，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DPV UL13截段重组 蛋白编码基因克隆入原核表达质粒pET32c(+)中而得到。 
4.含有前述重组表达载体的工程菌。 
进一步，所述工程菌是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中而得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DPV UL13截段重组蛋白编码基因克隆入原核表达质粒pET32c(+)中而得到。 
5.利用前述工程菌制备DPV UL13截段重组蛋白的方法，包括以下步骤：将工程菌接种于含氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.4，加入IPTG至终浓度为0.2mmol，30℃诱导培养5小时，收集菌液，离心，沉淀用pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀用含有8mol/L尿素的PBS溶解，再用镍琼脂糖凝胶亲和层析法纯化，以含有300mmol咪唑和8mol/L尿素的PBS为洗脱剂，所得纯化蛋白液置透析袋中，分别用含有4mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的PBS进行梯度透析，使变性蛋白逐渐复性，即得DPV UL13截段重组蛋白。 
6.以DPV UL13截段重组蛋白为抗原免疫动物得到的多克隆抗体。 
7.DPV UL13截段重组蛋白在制备DPV抗体检测试剂中的应用。 
8.DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体在制备DPV检测试剂中的应用。 
本发明的有益效果在于：（1）本发明选取DPV UL13基因编码蛋白的保守酶活区域（163aa-386aa），利用原核表达系统，成功制得了DPV UL13截段重组蛋白，经Western blot鉴定，该重组蛋白具有免疫反应活性，能够与DPV抗体特异性结合，可以作为检测DPV抗体的检测抗原；而且，该抗原制备方法简单，生产成本低，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较；产品纯度和稳定性好，检测准确度高；由于该抗原为DPV UL13基因编码蛋白中高度保守的酶活区域，抗原决定簇密集，用其检测DPV抗体特异性强，无交叉反应；由于该抗原非全病毒，用其检测时还无散毒危险。（2）本发明将表达的DPV UL13截段重组蛋白纯化后作为抗原免疫兔，成功获得了兔抗DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体，该多克隆抗体可以作为检测DPV的检测抗体，用于DPV的检测。由于该检测抗体所识别的抗原是DPV UL13蛋白中高度保守的酶活区域，用其检测DPV具有特异性强、无交叉反应等优点。 
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明： 
图1为DPV UL13截段基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中1为PCR产物，M为DNA Marker（DL2000）。 
图2为重组质粒pUC19-UL13酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA Marker（DL2000），1为pUC19-UL13经BamH I和Hind III双酶切的产物，2为pUC19-UL13经BamH I单酶切的产物，3为pUC19-UL13经Hind III单酶切的产物，4为未经酶切的pUC19-UL13。 
图3为重组质粒pET32c-UL13酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA Marker（左边为DL15000，右边为DL2000），1为未经酶切的pET32c-UL13，2为pET32c-UL13经BamH I单酶切的产物，3为pET32c-UL13经Hind III单酶切的产物，4为pET32c-UL13经BamH I和Hind III双酶切的产物。 
图4为重组质粒pET32c-UL13表达的UL13截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1为空载质粒pET32c(+)用IPTG诱导的表达产物，2为pET32c-UL13未用IPTG诱导的表达产物，3为pET32c-UL13用IPTG诱导的表达产物。 
图5为不同IPTG浓度下含有重组质粒pET32c-UL13的宿主菌E.coli BL21(DE3)表达鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1至6的IPTG终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L。 
图6为不同诱导时间下含有重组质粒pET32c-UL13的宿主菌E.coli BL21(DE3)表达鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1至6的诱导时间分别为0h、2h、3h、5h、7h和诱导过夜。 
图7为不同诱导温度下含有重组质粒pET32c-UL13的宿主菌E.coli BL21(DE3)表达鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1至4的诱导温度分别为37、25、30、33℃。 
图8为镍琼脂糖凝胶（Ni2+-NAT）亲和层析纯化后的DPV UL13截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1为纯化后的DPV UL13截段重组蛋白。 
图9为DPV UL13截段重组蛋白高免血清的双向琼脂扩散试验图，其中A为未经DPVUL13截段重组蛋白免疫的阴性兔血清；B为四免10天后DPV UL13截段重组蛋白抗血清；中间孔为纯化的DPV UL13截段重组蛋白液，周边孔依次为1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32比例稀释的血清。 
图10为DPV UL13截段重组蛋白与DPV全病毒抗血清的Western-blot图，其中M为蛋白质Marker，1为空载质粒pET32c(+)转化菌株用IPTG诱导的表达产物，2为重组质粒 pET32c-UL13转化菌株用IPTG诱导的表达产物。 
图11为间接免疫荧光法检测DPV的结果，其中A为阴性对照，B为替代对照，C为阳性对照。 
图12为间接免疫荧光法检测DPV的结果，其中A为DPV感染12h的飞片，B为DPV感染24h的飞片，C为DPV感染36h的飞片，D为DPV感染48h的飞片。 
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。 
9日龄和10日龄鸭胚购自雅安山区非DPV疫区，其种鸭的DPV和抗体均为阴性。质粒pUC19-T购自宝生物工程(大连)有限公司；原核表达质粒pET32c(+)为Novagen公司产品。克隆宿主菌E.coli DH5α、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和DPV CHv株由四川农业大学禽病研究中心提供。辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔IgG和DAB底物购自美国KPL公司；FITC标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物公司。弗氏完全佐剂购自sigma生物试剂公司；弗氏不完全佐剂由液体石蜡油5份和羊毛脂1份混合而得，高压灭菌后保存，使用前加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。 
实施例1、DPV UL13截段基因的克隆 
1、引物设计与合成 
根据UL13基因编码蛋白序列中第163至386位氨基酸（SEQ ID No.1，命名为pUL13）对应的核苷酸序列，用Oligo6.0软件设计以下引物：上游引物：5’-ggatccctggtggctacggagag-3’（SEQ ID NO.3），划线部分为BamH I位点，该引物是将原本的C碱基替换为兼并的T碱基得到的优化引物；下游引物：5’-aagcttccaagggcgtatatgtc-3’（SEQ ID NO.4），划线部分为Hind III位点。合成引物，以灭菌去离子水溶解制成浓度为10pmol/L的溶液，-20℃保存备用。 
2、DPV基因组DNA的提取 
a.鸭胚成纤维细胞（DEF）的制备：取10日龄健康鸭胚，依次用5%(v/v)碘酒、75%(v/v)酒精消毒蛋壳表面，无菌条件下取出胚体并用PBS洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后，将胚体剪成1mm3大小的块状，加PBS适量，转移至三角瓶中，加入2.5%(v/v)胰蛋白酶溶液，150μL/胚，37℃水浴消化3min，所得细胞悬液立即以4000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用适量MEM悬浮，8层纱布过滤，滤液加入10%(v/v)小牛血清和100IU/mL双抗（青霉素和链霉素），分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，置37℃细胞培养箱中培养。 
b.DPV的增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃去培养液，用灭菌PBS清洗细胞表面 2次后，加入DPV液2-3mL覆盖细胞表面，37℃吸附1h，弃去DPV液，再加入含3%(v/v)小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，37℃培养。 
c.DPV基因组DNA的提取：取用DPV种毒感染后细胞病变达80%的DEF，弃去培养液，加入细胞裂解液500μL，同时加入10mg/mL蛋白酶K溶液至蛋白酶K终浓度为100μg/mL，混匀，37℃孵育10min，所得细胞悬液转入EP离心管中，依次用饱和酚与氯仿的混合液、氯仿各抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次，加入1/10体积的3mol/L NaAC溶液，混匀，再加入2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min，13000rpm离心20min，沉淀用预冷的70%(v/v)乙醇洗涤2次，真空抽干，TE缓冲液溶解，再加入RNA酶1μL，37℃作用30min，-20℃保存备用。 
3、PCR扩增DPV UL13截段基因 
以DPV基因组DNA为模板，采用前述合成引物，PCR扩增DPV UL13截段基因。PCR反应体系为：ddH2O7μL，2×Taq Mixture10μL，DNA模板1μL，上、下游引物各1μL，总体积20μL，轻轻混匀，2000rpm瞬时离心后进行PCR。PCR反应参数为：先98℃预变性5min，再94℃变性50s、59℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用。取5μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，在约680bp处有一条特异性DNA条带。 
将PCR产物委托宝生物工程(大连)有限公司进行T-克隆（采用质粒pUC19-T）及测序，所得重组质粒命名为pUC19-UL13。对该质粒进行PCR和酶切鉴定，酶切鉴定结果见图2，重组质粒pUC19-UL13经BamH I和Hind III双酶切得到两条片段，其中小片段的分子量大小约680bp。同时，测序结果显示，T克隆获得的DPV UL13截段基因序列与预期序列（SEQ ID NO.2）完全一致。 
实施例2、重组原核表达质粒的构建 
分别对pUC19-UL13质粒及pET32c(+)载体进行BamH I和Hind III双酶切，回收DPV UL13截段基因与pET32c(+)线性片段，在DNA连接酶的作用下于16℃连接过夜。连接产物转化克隆宿主菌E.coli DH5α感受态细胞，所得转化产物接种至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日挑取单个白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养18h，抽提质粒，进行PCR和酶切鉴定，所得阳性重组质粒即为重组原核表达质粒，命名为pET32c-UL13。酶切鉴定结果见图3，可见重组原核表达质粒pET32c-UL13经BamH I和Hind III双酶切得到两条片段，经BamH I或Hind III单酶切得到一条片段，片段大小与理论值相符。 
实施例3、重组原核表达工程菌的构建 
挑取含重组质粒pET32c-UL13的克隆工程菌DH5α，划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于LB液体培养基中，剧烈振荡培养10～16h，抽提质粒，转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，所得转化产物接种至含Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日筛选阳性克隆菌，获得含重组质粒pET32c-UL13的表达工程菌BL21(DE3)。 
实施例4、重组原核表达工程菌的诱导表达 
挑取含重组质粒pET32c-UL13的表达工程菌BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Amp的LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养至OD600=0.4，加入IPTG诱导培养。 
取1mL诱导培养的菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。结果见图4，重组质粒pET32c-UL13转化菌株用IPTG诱导时表达产物约48kDa，与DPV UL13截段重组蛋白的理论值相符，未用IPTG诱导时没有特异性蛋白条带出现，而空载质粒pET-32c(+)转化菌株用IPTG诱导的表达产物约20kDa，与质粒本身大小相符。 
取诱导培养的菌液，4℃、10000r/min离心5min，弃上清，菌体沉淀用20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（600w，30sec/次，10次），然后4℃、10000r/min离心10min，取上清作为样品①，沉淀用洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2%Triton X-100）洗涤3次后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解，作为样品②。分别取样品①和样品②，加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，观察重组蛋白在胞浆（样品①，可溶性）和沉淀中（样品②，包涵体形式）的相对百分含量。结果显示，重组蛋白主要存在于沉淀中，说明重组蛋白在菌体中以不溶的包涵体形式存在。 
1、诱导剂IPTG的浓度优化 
分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L，30℃诱导5h，收集培养菌液，按前述方法处理后进行12%SDS-PAGE电泳。结果见图5，未加IPTG时无特异性蛋白条带出现，而随着IPTG浓度的升高，蛋白表达量呈现减少趋势，因此，优选IPTG浓度为0.2mmol/L。 
2、诱导时间的优化 
IPTG终浓度为0.2mmol/L，30℃分别诱导0h、2h、3h、5h、7h和诱导过夜，收集培养菌液，按前述方法处理后进行12%SDS-PAGE电泳。结果见图6，诱导时间为5h时，重组蛋白的表达量最大，继续增加诱导时间，重组蛋白的表达量反而下降，因此，优选诱导时间为5h。 
3、诱导温度的优化 
IPTG终浓度为0.2mmol/L，分别于25℃、30℃、33℃、37℃诱导5h，收集培养菌液，按前述方法处理后进行12%SDS-PAGE电泳。结果见图7，诱导温度为30℃时，重组蛋白的表达量最大，继续升高诱导温度，重组蛋白的表达量反而略有下降，因此，优选诱导温度为30℃。 
实施例5、DPV UL13截段重组蛋白的大量制备、纯化与复性 
取实施例4诱导培养的菌液200mL，4℃、8000r/min离心10min，沉淀用20mL20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，10次），然后4℃、10000r/min离心10min，沉淀用尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解，再用Ni2+-NAT亲和层析柱进行纯化，分别用含有50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液（50mmol/L PBS+8mol/L尿素）进行梯度洗脱。蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为50mmol咪唑洗脱峰，峰3为300mmol咪唑洗脱峰。分别收集不同浓度的咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验蛋白纯度及浓度。结果显示，只有300mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的DPV UL13截段重组蛋白（图8）。所得纯化蛋白液置透析袋中，分别用含有4mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的PBS溶液进行梯度透析，每种梯度于4℃搅拌4h，复性后的蛋白用Bradford法测定蛋白浓度，即得DPV UL13截段重组蛋白。 
实施例6、DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体的制备 
以纯化的DPV UL13截段重组蛋白为抗原，将其与等量的弗氏完全佐剂混合，剧烈振荡使抗原充分乳化成油包水的乳剂苗。取健康雄性家兔6只，耳动脉采血2ml，分离血清作为阴性对照，然后每只兔皮内注射前述乳剂苗（DPV UL13截段重组蛋白量为0.5mg）进行一免。一免两周后，将纯化的DPV UL13截段重组蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合，剧烈振荡使抗原充分乳化成油包水的乳剂苗，然后每只兔皮下注射该乳剂苗（DPV UL13截段重组蛋白量为0.75mg）进行二免，二免一周后，每只兔皮下注射同样乳剂苗（DPV UL13截段重组蛋白量为1.0mg）进行三免。三免一周后，从兔耳缘静脉采血，5000rpm离心10min分离血清，取倍比稀释的血清（1:2、1:4、1:8、1:16、1:32），采用双向琼脂扩散法进行兔抗DPV UL13 截段重组蛋白多克隆抗体的效价测定。若三免效价低则进行四免，直接兔耳源静脉注射纯化的DPV UL13截段重组蛋白液0.1mg/只。四免后约10天左右进行血清中抗体效价的检测。结果见图9，未经DPV UL13截段重组蛋白免疫的阴性兔血清没有形成沉淀线，而四免10天后倍比稀释的兔血清（1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）均可见明显的沉淀线，说明所制备的兔抗DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体的效价至少为1:32。 
实施例7、DPV UL13截段重组蛋白作为DPV抗体捕获剂的应用 
以DPV UL13截段重组蛋白作为DPV抗体捕获剂，采用Western-blot法检测DPV全病毒抗血清。具体操作步骤如下：取含重组质粒pET32c-UL13的表达工程菌BL21(DE3)用IPTG诱导的表达产物（全蛋白），进行SDS-PAGE电泳，以空载质粒pET-32c(+)转化菌株用IPTG诱导的表达产物为对照组；电泳完毕后，电转移至NC膜上，用封闭液封闭，PBST洗膜3次；再将膜放入用封闭液稀释的兔抗DPV全病毒血清中（以1:100倍稀释；对照组以兔阴性血清替代），室温下振摇反应1h，PBST洗膜3次；再将膜放入用封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔IgG中（以1:1000倍稀释），室温下振摇反应1h，PBST洗膜3次；再加入新制DAB底物溶液，显色，蒸馏水漂洗终止反应。结果见图10，含重组质粒pET32c-UL13的表达工程菌BL21(DE3)用IPTG诱导的表达产物在约48KDa处出现一条清晰的特异条带，而对照组没有出现任何条带，说明DPV UL13截段重组蛋白反应原性好，可以作为检测DPV抗体的检测抗原应用。 
实施例8、DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体作为DPV捕获剂的应用 
以DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体作为DPV捕获剂，采用间接免疫荧光法检测DPV。具体步骤如下：参照实施例1所述方法制备鸭胚成纤维细胞，以3×104个/孔接种至预先放有飞片的6孔板中，待细胞长至60%-80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞3次，然后接种DPV，37℃孵育2h，弃去病毒液，分别于接毒12h、24h、36h、48h后收获飞片，PBS清洗3次，4%甲醛室温固定20min，PBST清洗3次，0.2%Triton X-100透化20min（时间过短，细胞膜透化不充分，将会导致BSA封闭不完全，一抗、二抗染色不充分），PBST清洗3次，4%BSA室温封闭2h，PBST清洗3次，再加入用含有0.5%BSA的PBST稀释的兔抗DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体（稀释倍数为1:150），4℃孵育过夜，次日PBST清洗3次，再加入用含有0.5%BSA的PBST稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG（稀释倍数为1:150），37℃孵育1h，PBST清洗3次，吸干液体，用90%甘油封片，镜检。同时设置阴性对照（鸭胚成纤维细胞不接种DPV）、替代对照（用未经DPV UL13截段重组蛋白免疫的兔血清替代兔抗DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体，同时用3%BSA替代FITC标记的山羊抗兔IgG）和阳 性对照（用兔抗DPV全血清替代兔抗DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体）。结果见图11和图12，阴性对照和替代对照的检测结果均为阴性，阳性对照的检测结果为阳性；试验组在DPV感染12h时少数细胞中可见点状阳性荧光，感染24h及36h时阳性荧光逐渐增多且呈片状，感染48h时阳性荧光渐趋减少；说明DPV UL13截段重组蛋白多克隆抗体可以作为检测DPV的检测抗体应用。 
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 
Figure IDA0000412095970000011
Figure IDA0000412095970000021

Claims (10)

1.鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET32c(+)中而得到。
5.含有权利要求3或4所述重组表达载体的工程菌。
6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中而得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET32c(+)中而得到。
7.利用权利要求6所述工程菌制备鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将工程菌接种于含氨苄青霉素即Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.4，加入IPTG至终浓度为0.2mmol，30℃诱导培养5小时，收集菌液，离心，沉淀用pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀用含有8mol/L尿素的PBS溶解，再用镍琼脂糖凝胶亲和层析法纯化，以含有300mmol咪唑和8mol/L尿素的PBS为洗脱剂，所得纯化蛋白液置透析袋中，分别用含有4mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的PBS进行梯度透析，使变性蛋白逐渐复性，即得鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白。
8.以权利要求1所述的鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白为抗原免疫动物得到的多克隆抗体。
9.权利要求1所述的鸭瘟病毒UL13截段重组蛋白在制备鸭瘟病毒抗体检测试剂中的应用。
10.权利要求8所述的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒检测试剂中的应用。
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