CN100334108C

CN100334108C - 重组赤羽病毒核衣壳蛋白、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN100334108C
Application number: CNB2005101168532A
Authority: CN
Inventors: 吴东来; 李少英; 孟庆文; 尹训南
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2025-10-31
Also published as: CN1769294A

Abstract

本发明公开了一种新的重组赤羽病毒核衣壳蛋白、编码该重组蛋白基因以及该重组蛋白的制备方法。本发明重组蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，编码该重组赤羽病毒核衣壳蛋白基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明重组蛋白的制备方法包括以下步骤：构建重组赤羽病毒核衣壳蛋白基因原核表达载体；用重组赤羽病毒核衣壳蛋白基因原核表达载体转化大肠杆菌；用IPTG诱导重组核衣壳蛋白表达，回收并纯化所表达的重组核衣壳蛋白。本发明重组赤羽病毒核衣壳蛋白能够在大肠杆菌中高效表达，所表达的重组蛋白具有高免疫学活性和高敏感性，利用该重组赤羽病毒核衣壳蛋白制备成的抗血清，采用间接荧光抗体法可以快速、准确的检测出组织中的赤羽病毒抗原。

Description

重组赤羽病毒核衣壳蛋白、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种重组赤羽病毒核衣壳蛋白、编码该重组赤羽病毒核衣壳蛋白基因，该重组赤羽病毒核衣壳蛋白的制备方法及其在检测或诊断赤羽病毒抗原中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

赤羽病毒，又称阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)是属于布尼病毒科布尼病毒属辛波病毒群的虫媒病毒，可引起牛、绵羊、山羊生产先天性畸形胎儿，以流、早、死产及先天性关节弯曲和积水性无脑症(Arthrogryposis-Hydraencephaly，AH综合症)为特征。最初于1959年在日本群马县赤羽村牛舍内采集的蚊虫Cules Tritaeniorhynchis和AedesVexans体内分离得到AKAV病毒，故命名为赤羽病毒。

AKAV为单股负链RNA病毒，其核酸由大(L，约7000nt)、中(M，4309nt)、小(S，858nt)三个节段组成。L节段编码L蛋白，其具有转录和复制活性；M节段编码囊膜糖蛋白G1、G2和非结构蛋白NSm；S节段编码核衣壳蛋白N(702bp)和非结构蛋白Ns(276bp)。对23个分离株(包括OBE-1株)，系统进化分析结果表明，N蛋白氨基酸97％-100％同源，具有高度保守性，用OBE-1株制作的N蛋白单克隆抗体做ELISA显示，所有株均有很高的反应活性。

赤羽病在1972-1975年曾在日本关东以西大流行，造成巨大的经济损失。目前，在东亚、东南亚、中东及东非许多国家分离到病毒或检测到阳性抗体。据流行病学调查，我国台湾及大陆许多地区也有本病流行，1996-1997年上海曾爆发本病，牛场中流产、早产、死产和畸形的胎儿约占20％-30％，给养牛业造成巨大的经济损失。本病在我国被列为二类动物传染病，为重点检疫对象。

最近台湾的研究人员发现猪可自然感染AKAV，试验证明其可经口鼻传播，他们对1088头猪进行了血清学调查，证实有816头猪呈血清学阳性反应，阳性率达75％，而且仔猪体内也可检到中和抗体，表明猪可能成为AKAV生活史的一环。以往认为成年牛感染AKAV无明显症状，但最近报道成年牛感染可导致脑脊髓炎。综上因素，未来防控本病的难度将加大，一旦暴发流行其损失也会更大。在目前本病还未在我国大流行之际，加强对其检疫为最佳防控措施。

鉴于本病给养牛业造成巨大的经济损失，加强对本病的诊断防治显的尤为迫切。迄今，国内报道的诊断方法有微量中和试验、琼脂扩散试验、以及PCR和ELISA诊断方法，这些方法均有其不足之处，或操作烦琐，或易受母源抗体干扰，或对技术设备要求较高。结合生产实际的需要，应用间接荧光抗体法直接检测组织中的AKAV抗原是一种简便、快速、准确、敏感性高的诊断方法。但该方法能够应用的前提是需要制备得到高特异性的AKAV抗原蛋白，并且该抗原蛋白还需具备易纯化制备、成本低，不存在散毒的危险等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性高，易纯化制备、成本低的重组AKAV核衣壳蛋白，该重组AKAV核衣壳蛋白可制备成抗体血清，简便、快速、准确的检测出组织中的AKAV抗原。

本发明所要解决的技术问题是以下技术途径来实现的：

一种重组AKAV核衣壳蛋白，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种编码上述重组AKAV核衣壳蛋白基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种编码上述重组AKAV核衣壳蛋白基因，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种制备本发明重组AKAV核衣壳蛋白的方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种制备本发明重组AKAV核衣壳蛋白的方法，包括以下步骤：

构建重组AKAV核衣壳蛋白基因原核表达载体；用该重组AKAV核衣壳蛋白基因原核表达载体转化大肠杆菌；诱导重组核衣壳蛋白表达，回收并纯化所表达的重组核衣壳蛋白。

将编码AKAV核衣壳蛋白基因插入到原核表达载体合适的限制性酶切位点之间，使编码AKAV核衣壳蛋白基因可操作的与原核表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将编码AKAV核衣壳蛋白基因插入到原核表达载体pET-28a(+)上的BamHI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组核衣壳蛋白原核表达载体PET-N；将所得到的重组核衣壳蛋白原核表达载体通过本领域常规方法转化大肠杆菌感受态细胞，作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)；用IPTG诱导重组AKAV核蛋白的表达，优选的，用IPTG诱导重组AKAV核蛋白表达的条件如下：菌液OD_600nm值为0.5-0.6时开始用浓度为0.6-1.5mM的IPTG进行诱导，诱导时间为4-5小时。所表达的重组核衣壳蛋白可通过本领域的常规方法纯化。本发明重组工程菌表达的约27ku(801bp)的重组蛋白为含有N基因氨基酸序列(699bp，19-26ku)及pET-28a(+)载体部分序列(102bp，约3ku)的融合蛋白。在pET-28a(+)部分有一His tag序列(含有6个连续的组氨酸)，因此可用ProBond^TMPurification System(含Ni²⁺)亲和层析的方法纯化重组蛋白。

本发明重组AKAV核衣壳蛋白能够在大肠杆菌中高效表达，所表达重组蛋白仅含约3kD的载体部分氨基酸，序列与天然蛋白接近，这为利用重组蛋白研究AKAV核衣壳蛋白的结构和功能提供了便利，也为简便、快速、准确的检出AKAV抗原及其他应用研究奠定了基础。经Western blot、琼扩检测和免疫荧光、ELISA应用试验显示，本发明重组AKAV核衣壳蛋白具有高度的免疫学活性，利用该重组蛋白制备成的抗血清，采用间接荧光抗体法可以快速、准确的检测出组织中的AKAV抗原。由该重组AKAV核衣壳蛋白制备成的抗血清与AKAV全病毒免疫制备的高免血清相比具有以下优点：抗原易纯化制备、成本低(工程菌经超声波破碎高速离心后，高浓度的重组蛋白全部在上清，以水溶性形式存在，这使其可直接进行纯化获得大量高纯度的融合蛋白，避免了变性、复性等复杂程序)，且不存在散毒的危险，最重要的是本发明重组AKAV核衣壳蛋白具有高度的特异性，保证了利用该重组蛋白检测AKAV抗原方法的特异性。

附图说明

图1为重组质粒PMD-S酶切及PCR鉴定；

1：λ-EcoT14I digest Marker；2：EcoRI and SalI双酶切；3：PCR扩增出的S片段；4：PCR扩增的水对照；5：DL2000 Marker。

图2为重组质粒PET-N酶切及PCR鉴定；

1：λ-EcoT14I digest Marker；2：BamHI and XhoI双酶切；3：PCR扩增出的N基因片段；4：PCR扩增的水对照；5：DL2000 Marker。

图3为重组蛋白的SDS-PAGE电泳图谱；

1：蛋白Marker；2：BL21菌对照；3：IPTG诱导前转化菌对照；4：IPTG诱导后的转化菌；5：纯化后的融合蛋白。

图4为重组蛋白的Western blot分析；

图5为重组工程菌SDS-PAGE薄层扫描结果(最大峰为融合蛋白)；

图6为诱导条件优化试验结果；

系列1：1～7为诱导时间1～个小时(D_600nm＝0.60，IPTG＝1mM)；系列2：开始诱导时D_600nm值，1～6分别为0.10，0.35，0.51，0.73，0.91，1.03(诱导3.5小时，IPTG＝1mM)；系列3：IPTG(mM)量，1～8分别为0.05，0.1，0.3，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0(诱导3.5小时，D_600nm＝0.61)。

图7感染AKAV后的BHK21细胞和乳鼠脑组织及二者阴性对照在荧光显微镜下观察，可见感染AKAV的细胞胞浆内有阳性荧光信号，而阴性对照细胞则不能检出。

a：接毒的BHK21细胞；b：阴性对照BHK21细胞；c：攻毒鼠脑切片；d：阴性对照鼠脑切片(1，2放大倍数200×；3，4放大倍数400×)。

以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

主要试验材料及来源

1.1菌株种毒

BHK21细胞由哈尔滨兽医研究所保存；AKAV OBE-1株种毒及阳性血清由日本农林水产省动物卫生研究所惠赠。

1.2主要试剂

各种大肠杆菌株限制性内切酶、连接酶、反转录酶、Taq酶、pMD18-TVector、pET-28a(+)表达载体、DNA Marker均为宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒(产品编号：W5002以下同)、胶回收小量试剂盒(W5212)购自上海华舜；RNeasyMini Kit(74106)、QAquickPCR Purification Kit(28104)购自QIAGEN公司；蛋白Marker(SM0431)购自Fermentas公司；辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG(A5295)购自SIGMA公司；ProBond^TM Purification System(K850-01)购自Invitrogen公司。

1.3繁毒及TCID50测定

将种毒接入BHK21细胞，待70％细胞出现CPE时收毒，将细胞冻融三次，1500g离心15分钟，取上清用96孔板测定毒价为10⁶TCID₅₀/ml，分装并于-80℃冻存。

[实施例1]重组AKAV核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建

用RNeasyMini Kit RNA抽提试剂盒提取AKAV总RNA，由赛百盛公司合成引物，扩增S节段基因，预期扩增长度840bp，引物序列：p1：5-TAA CTA CGC ATT GCA ATG GC-3(SEQ ID NO：3)；p2：5-AGT AGT GTGCTC CAC-3(SEQ ID NO：4)。扩增条件：42℃1h，94℃ 5min变性后进入循环，循环参数为94℃ 60s，55℃ 30s，72℃ 60s，30个循环后，72℃延伸10min，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

用PCR纯化产物与pMD18-T Vector连接，转化E.coli JM109，涂布含氨苄青霉素(100ug/ml)、X-gale和IPTG的LB固体培养基，37℃过夜培养后挑取白色单菌落，接种至含氨苄青霉素(100ug/ml)的液体LB，于37℃摇床培养8小时后用试剂盒抽提质粒，PCR、双酶切鉴定正确后送上海博亚公司测序确认，鉴定正确重组质粒命名为PMD-S。用引物p1和p2、酶EcoRI和SalI对重组质粒PMD-S进行PCR和酶切鉴定(图1)；结果均与预期结果一致。

用设计带有酶切位点的引物，以PMD-S质粒为模板亚克隆出N基因片段，引物序列：p1：5-AGA GGA TCC ATG GCA AAT CAA TTC-3(BamHI)(SEQ ID NO：5)；p2：5-TAG CTC GAG TTA GAT CTG GAT AC-3(XhoI)(SEQ ID NO：6)。用BamHI和XhoI对扩增出的纯化N基因片段和pET-28a(+)分别进行双酶切，酶切产物经纯化后用连接溶液I(宝公司)连接，然后转化E.coli JM109，涂布含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基，挑取光滑单菌落，摇菌培养后用试剂盒抽提质粒，PCR、双酶切鉴定正确后送上海博亚公司测序确认，鉴定正确重组质粒命名为PET-N。用引物p1和p2、酶BamHI和XhoI对重组质粒PET-N进行PCR和酶切鉴定(图2)，结果均与预期结果一致，该重组质粒PET-N经序列测定，测定结果如SEQ IDNO：2所示。。

[实施例2]诱导条件优化试验

将重组质粒PET-N转化入E.coli BL21(DE3)表达宿主菌，从LB平板上挑取单菌落接入3mlLB培养基(所有培养基均含卡那霉素)，37℃过夜培养，然后以1 50接入100ml 2×YT培养基37℃培养，做诱导条件优化试验，以未诱导的菌作对照，分别做不同的诱导时间，不同的D_600nm值起始诱导，不同的IPTG量诱导试验，最后确定最佳诱导条件。

由图6可知不同诱导时间及开始诱导时不同D_600nm值对融合蛋白的表达率有明显影响，而不同IPTG量诱导则不很明显。确定D_600nm值为0.5～0.6时起始用IPTG诱导重组核衣壳蛋白表达，IPTG的为0.6～1.5mM，诱导时间为4～5小时。

[实施例3]重组AKAV核衣壳蛋白的鉴定、纯化和表达量测定

工程菌经诱导后，经超声裂解，12000×g离心15分钟经检测表达蛋白均在上清，样本条带与对照比较，在27ku处多一条亮带，与预期大小一致，ProBond^TM Purification System纯化后则只剩此带，这说明其确为诱导表达的融合蛋白。用牛抗AKAV阳性血清做一抗作用，辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG做二抗作用，DAB显色后结果显示，对应位置均有明显条带，而对照没有，这表明所表达的融合蛋白具有免疫学活性(图3、图4)。

本发明的重组融合蛋白，采用GENETYX-WIN Version5.1的软件进行推测，其结果为具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

收获诱导后的菌液并与1500×g4℃离心10min，弃上清，然后用同菌液体积的PBS溶液悬浮-离心-弃上清洗三次，最后用1/10菌液体积的PBS悬浮，超声裂解至透明，以12000×g4℃离心15min，取上清和沉淀备检。在12％的SDS-PAGE检测阳性后，用Western blot检测活性，以牛抗AKAV阳性血清做一抗，辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG为二抗，DAB显色，通过薄层扫描检测融合蛋白表达率。用薄层扫描仪对工程菌SDS-PAGE检测表明，融合蛋白占可溶性菌体总蛋白百分比最高达58.5％(图5)。

[试验例1]本发明重组AKAV核衣壳蛋白制备抗血清检测AKAV抗原试验

1材料和方法

1.1材料

1.1.1种毒 AKAV OBE-1株种毒由日本农林水产省动物卫生研究所惠赠。

1.1.2一抗和二抗兔抗AKAV重组核衣壳蛋白血清的制备详见下述；FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号ZF-0311，批号64419；抗体稀释液∶甘油＝1∶1，0.75mg/ml)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3繁毒材料BHK21培养细胞由哈兽研保存；一窝昆明系小白鼠其中9只3日龄乳鼠和一只母鼠，由哈兽研实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1繁毒及TCID50测定将种毒接入BHK21细胞，待70％细胞出现CPE时收毒，将细胞冻融三次，1500g离心15分钟，取上清用96孔板测定毒价为10⁶TCID50/ml，分装并于-80℃冻存。

1.2.2兔抗AKAV重组核衣壳蛋白血清的制备：采用本发明实施例3所纯化的重组核蛋白，将重组核蛋白配制成浓度为460ug/ml，然后免疫2月龄的兔子。首免，1ml重组蛋白溶液与等量的完全福氏佐剂(Sigma公司)乳化后背部皮下多点注射；两周后二免，取1ml重组核蛋白溶液与等量的不完全福氏佐剂乳化后背部皮下多点和腿部肌肉注射；再两周后三免，取1.3ml重组蛋白溶液直接耳静脉注射，一周后心脏采血，分离血清-20℃冻存。用哈兽研保存的琼扩抗原评价此血清，将其稀释64倍后仍可见清晰沉淀线。

1.2.3细胞接毒将培养瓶上贴壁的BHK21细胞消化下来后，用含8％胎牛血清的DMEM吹散悬浮并计数，细胞终浓度为1×10⁵个/ml，然后以每孔1ml将其接入24孔板，20小时后(此时细胞面积约占培养板面积的70～80％)吸出培养基，用PBS洗两遍，样本孔加200ulDMEM稀释的病毒液(DMEM液∶病毒液＝199∶1，毒价为2×10⁴TCID50/ml)，对照孔加200ulDMEM溶液，37℃感作1小时后加入含2％胎牛血清的DMEM维持液，在37℃5％CO₂培养箱内培养14小时。

1.2.4乳鼠攻毒6只乳鼠分别脑内接种1.2.1毒价为10⁶TCID50/ml病毒液10ul，其余三只接种等量DMEM作为对照，尾端剪断少许以示区别。

1.2.5抗原片处理方法：

1.2.5.1培养细胞弃去孔内的培养基，吹干细胞后用70％的冷乙醇4℃固定30分钟然后用pH7.4的PBS洗片3遍，每次5分钟；将一抗用PBS作1∶20稀释后每孔加入200ul，37℃作用30分钟，取出后用PBS洗3遍；二抗用含0.01‰伊文思兰的样品稀释液作1∶100倍稀释后每孔加入200ul，37℃作用30分钟，取出后用PBS洗3遍，吹干后立即用荧光显微镜观察。

1.2.5.2乳鼠脑冰冻切片将接毒后5～6天出现神经症状的和对照乳鼠脑取出冻入-24℃冰冻切片机载样板上，切出5um厚的切片，轻轻展开后，立即将其粘到多聚赖氨酸处理过的载玻片上；待片子晾干后放入4℃丙酮中固定5分钟，取出后室温晾干，然后在洗涤缸内用PBS洗片3遍，每次5分钟；将I抗用PBS作1∶20稀释后滴到样品上，把片子放入湿盒中37℃作用30分钟，取出后用PBS洗3遍；将二抗用含0.01‰伊文思兰的样品稀释液作1∶100倍稀释滴加到样品上，37℃作用30分钟，取出后用PBS洗3遍，吹干后封片并立即用荧光显微镜观察。

2试验结果

2.1 BHK21细胞

在荧光显微镜下观察被病毒感染的培养细胞样本，可见有单个或成团的细胞的细胞浆内有很强的绿色荧光信号，而对照细胞则没有，见图7。

2.1乳鼠

攻毒后5～6天的乳鼠相继出现在桌面上转圈的神经症状，直至死亡，解剖发现腹腔出血，脑硬膜淤血，而对照鼠则正常。镜检可发现，在攻毒鼠脑神经细胞胞浆中有亮绿色荧光信号，而对照组则无荧光信号，见图7。

上述结果说明，采用本发明重组AKAV核衣壳蛋白所制备成的抗血清，采用间接荧光抗体法可以快速、准确的检测出组织中的AKAV抗原，该方法特异性高且所需操作时间短，适合临床诊断的需要。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所

<120>重组赤羽病毒核衣壳蛋白、其制备方法及应用

<130>012

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>267

<212>PRT

<213>Akababe virus

<400>1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Met Ala Asn Gln Phe Ile Phe Asn Asp Val Pro Gln Arg Asn

35 40 45

Ala Ala Thr Phe Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Val Ala Phe Ile Ser Lys

50 55 60

Tyr Gly Gln Gln Leu Asn Phe Thr Val Ala Arg Val Phe Phe Leu Asn

65 70 75 80

Gln Lys Lys Ala Lys Met Val Leu His Lys Thr Pro Gln Pro Ser Val

85 90 95

Asp Leu Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Thr Val Val Asn Asn His Phe

100 105 110

Pro Gln Tyr Thr Ala Asn Pro Val Ser Asp Thr Ala Phe Thr Leu His

115 120 125

Arg Ile Ser Gly Tyr Leu Ala Arg Trp Val Ala Glu Gln Cys Lys Ala

130 135 140

Asn Gln Ile Lys Phe Ala Glu Ala Ala Ala Thr Ile Val Met Pro Leu

145 150 155 160

Ala Glu Val Lys Gly Cys Thr Trp Ser Asp Gly Tyr Ala Met Tyr Leu

165 170 175

Gly Phe Ala Pro Gly Ala Glu Met Phe Leu Glu Thr Phe Glu Phe Tyr

180 185 190

Pro Leu Val Ile Asp Met His Arg Val Ile Lys Asp Gly Met Asp Val

195 200 205

Asn Phe Met Arg Lys Val Leu Arg Gln Arg Tyr Gly Gln Leu Thr Ala

210 215 220

Glu Glu Trp Met Thr Ser Lys Leu Asp Ala Val Lys Ala Ala Phe Gly

225 230 235 240

Ser Val Ala Gln Ile Ser Trp Ala Lys Ser Gly Phe Ser Pro Ala Ala

245 250 255

Arg Ala Phe Leu Ala Gln Phe Gly Ile Gln Ile

260 265

<210>2

<211>804

<212>DNA

<213>Akababe virus

<400>2

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatggcaaa tcaattcatt 120

ttcaacgatg ttccacaacg gaatgcagct acatttaatc cggatgcagg gtatgtggca 180

tttatcagta agtatgggca gcagctcaac tttactgttg ctagagtctt cttcctcaac 240

cagaagaagg ccaagatggt cttacataag acgccacaac caagtgtcga tcttactttt 300

gcaggggtca aatttacagt ggttaataac cattttcccc agtacactgc aaatccagtg 360

tcagacactg cctttacgct tcaccgcatc tcgggctact tagctcgctg ggttgctgag 420

cagtgcaagg ctaatcagat caaatttgca gaggcagctg ccacaattgt gatgccactg 480

gctgaggtga agggttgcac ctggagtgac gggtatgcaa tgtacctggg atttgcccct 540

ggtgctgaga tgtttctgga aacctttgag ttttacccac tggttatcga catgcaccgt 600

gtgataaagg atggaatgga tgtcaacttc atgaggaagg tcttacgtca gaggtatggg 660

cagctgactg cagaagagtg gatgacatct aagttggacg cagtcaaggc tgcatttggc 720

tcagttgccc aaatatcctg ggctaaatct ggcttctcac ctgcagctag agctttcctg 780

gctcaatttg gtatccagat ctaa 804

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>

<400>3

taactacgca ttgcaatggc 20

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>

<400>4

agtagtgtgc tccac 15

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>

<400>5

agaggatcca tggcaaatca attc 24

<210>

(211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>

<400>6

tagctcgagt tagatctgga tac 23

Claims

1.一种重组赤羽病毒核衣壳蛋白，其特征是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1的重组赤羽病毒核衣壳蛋白的基因，其特征是具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.一种制备权利要求1的重组赤羽病毒核衣壳蛋白的方法，包括以下步骤：

构建重组赤羽病毒核衣壳蛋白基因原核表达载体；用该原核表达载体转化大肠杆菌；诱导重组核衣壳蛋白表达，回收并纯化所表达的重组核衣壳蛋白。

4.按照权利要求3的方法，其特征是所述的重组赤羽病毒核衣壳蛋白基因原核表达载体为PET-N。

5.按照权利要求3的方法，其特征是所述的大肠杆菌是BL21(DE3)。

6.按照权利要求3的方法，其特征是所述的诱导是当菌液OD_600nm值为0.5-0.6时，用浓度为0.6-1.5mM的IPTG进行诱导，诱导时间为4-5小时。

7.按照权利要求3的方法，其特征是采用亲和层析的方法纯化重组蛋白。

8.权利要求1的重组赤羽病毒核衣壳蛋白在制备诊断或检测赤羽病毒抗原的药物中的应用。

9.权利要求2的编码重组赤羽病毒核衣壳蛋白的基因在制备诊断或检测赤羽病毒抗原的药物中的应用。