KR100637940B1 - 약독화 페스티바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 효소 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 약독 페스티바이러스, 그를 제조하는 방법, 이들의 사용방법 및 검출 방법에 관한 것이다.

Description

약독화 페스티바이러스{Attenuated pestiviruses}
본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 리보뉴클리아제 활성(RNase 활성)을 불활성화시켜 페스티바이러스를 약독화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따라 약독화된 페스티바이러스, 이러한 페스티바이러스를 제조하기 위한 핵산, 본 발명의 약독 페스티바이러스를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 약독 바이러스와 병원성 바이러스사이의 구별을 위한 방법에 관한 것이다.
페스티바이러스는 세계적으로 많은 국가에서 동물의 경제적으로 중요한 질병의 원인제이다. 현재 공지된 바이러스 단리물은 플라비리데(Flaviridae)과 내의 한 속을 함께 형성하는 3개의 종으로 그룹지어졌다.
I. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV: Bovine Viral Diarrhea Virus)는 소의 바이러스성 설사(BVD) 및 소의 점막 질병을 일으킨다(Baker, 1987; Moennig 및 Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
II. 전에는 돼지 콜레라 바이러스(hog cholera virus)라고 명명되었던 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스(CSFV: Classical Swine Fever Virus)가 클래시컬 돼지 콜레라(CSF) 또는 돼지 콜레라(HC)에 관여한다(Moennig and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
III. 보더 병 바이러스(Border disease virus)는 전형적으로 양에서 발견되고, 보더 병(BD)을 일으킨다. 소에서 MD에 유사한 증상이 BDV로 어린 양의 자궁내 감염후 일어나는 것으로 또한 기술되어 있다(Moennig and Plagemann, 1992; Thil et al., 1996).
페스티바이러스의 또다른 분류가 Becher 등(1995) 또는 다른 사람에 의해 제공된다.
페스티바이러스는 5' cap 및 3' 폴리(A) 서열이 결여된 포지티브 극성의 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 작은 인벨롭된(enveloped) 바이러스이다. 바이러스 게놈은 세포 및 바이러스 프로테아제를 포함하여, 공동 번역 및 번역후 처리에 의해 최종 절단 생성물을 제공하는 약 4000개의 아미노산으로 된 폴리단백질을 코딩한다. 바이러스 단백질은 NH2-Npro-C-ERNS-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH의 순으로 폴리단백질내에 배열되어 있다(Rice, 1996). 단백질 C 및 당단백질 ERNS, E1 및 E2는 페스티바이러스 비리온의 구조적 성분을 나타낸다( Thiel 등, 1991). E2 및 보다 덜한 정도로 ERNS는 항체 중화용 표적으로 발견되었다(Donis et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijin et al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). ERNS는 막 앵커(anchor)를 결여하고, 감염된 세포로부터 상당한 양으로 분비된다; 이 단백질은 RNase 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). 바이러스 생활사에 대한 이 효소의 활성의 기능은 현재 알려져 있지 않다. CSFV 백신 균주 경우, 부위 지정 돌연변이에 의한 RNase의 실험적 파괴는 세포 배양물내에서 야생형 바이러스에 동등한 세포 배양물내의 성장 특성을 갖는 세포변성(cytopatholigic) 바이러스를 가져오는 것으로 보고되었다. 효소 활성은 페스티바이러스 ERNS 와 식물 및 진균 기원의 상이한 공지된 RNase사이에 보존된 두개 아미노산 스트레치(stretches)의 존재에 좌우된다. 이들 보존된 서열 모두 히스티딘 잔기(Schneider et al., 1993)를 함유한다. CSFV 백신 균주의 ERNS 단백질의 라이신에 대한 이들 잔기 각각의 교환은 RNase 활성의 파괴를 가져온다(Hulst et al., 1998). CSFV 백신 균주중의 게놈에 이들 돌연변이를 도입하는 것은 바이러스의 생존성, 또는 성장 성질에 영향을 주지않고, 약간의 세포변성 형질을 나타내는 바이러스에 이른다(Hust et al. 1998).
CSFV 및 BVDV용으로 약독화되거나 죽은 바이러스 또는 이종성 발현 시스템에서 발현되는 바이러스 단백질을 포함하는 백신이 제조되어 현재 사용되고 있다. 생백신으로 사용되는 이들 바아러스의 약독화의 구조적 기초는 알려져 있지 않다. 이는 백신화에 이어서 역 돌연변이 또는 재조합에 의해 예측할 수없는 복귀돌연변이체의 위험에 이른다. 다른한편, 면역 유도에서 불활성화된 백신 또는 이종성으로 발현된 바이러스 단백질(서브유니트 백신)의 효능은 오히려 낮다.
일반적으로, 약독화의 기초로서 정의된 돌연변이를 갖는 생백신은 현재의 백신 제조의 불리한점을 피할 수 있게 할 것이다. 페스티바이러스에서의 약독화 돌 연변이용의 가능한 표적은 현재 이용되지 않고 있다.
상기 약독화 돌연변이의 추가의 잇점은 이 돌연변이를 약독화 페스티바이러스용 분별 표지로서 사용가능하게 하고 약독화 바이러스를 본 분야의 페스티바이러스와 분별시키는 분자의 독특성에 있다.
페스티바이러스의 감염의 효과적이고 안전하며, 검출가능한 예방 및 치료의 중요성 때문에, 면역의 유도에 대한 높은 잠재력 및 병인성 페스티바이러스로부터 또한 구별될 수 있는 약독화의 정의된 기초를 갖는 살아 있고, 특이적으로 약독화된 백신이 강하게 필요되고 있다.
그러므로, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제점은 본 분야의 병인성 페스티바이러스로부터 또한 구별될 수 있으며, 면역 유발에 대한 고효능을 갖는 살아있는 약독화된 백신으로서 사용하기 위해 특이적으로 약독화되고 검출가능하게 표지된 페스티바이러스를 제조하는 것이다.
상기 기술적 문제점에 대한 해결은 상세한 설명과 청구범위에서 특징화된 구체예에 의해 달성된다. 놀랍게도 페스티바이러스는 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성의 불활성화에 의해 특이적으로 약독화될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 약독화 페스티바이러스는 이제 고면역원성의 생백신을 제공한다. 그러므로, 한 면에서 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화된 페스티바이러스를 포함하는 생백신을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "백신"은 동물에서 면역 학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분 및 가능하게는 반드시 필요한 것은 아니지만 상기 활성 성분의 면역학적 활성을 향상시키는 하나이상의 추가의 성분을 함유하는 약제학적 조성물을 언급한다. 백신은 또한 약제학적 조성물에 전형적인 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 본(original) 형태의 완전한 생 유기체 또는 소위 변형된 살아있는 백신(MLV) 또는 소위 죽은 백신(KV)으로서 적절한 방법에 의해 불활성화된 유기체를 함유할 수 있다. 또다른 형태로, 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 상기 유기체의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유니트 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 유기체 또는 이러한 유기체의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약제학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화)제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나이상을 포함할 수 있다.
면역 반응을 향상시키는 추가의 성분은 흔히 어쥬번트라고 불리우는 구성물, 예를들어 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자이다.
"약제학적 조성물"은 본질적으로 투여됐을 때 유기체의 생리학적, 예를들어 면역학적 기능 또는 살아있는 유기체의 표면안 또는 표면상을 변화시킬 수 있는 하나이상의 성분, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 항생제 또는 항기생충제, 및 특정의 다른 목적, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 처리 특성, 생식불능, 안정성, 장내 또는 비경구 경로, 예를들어 경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하. 피내 또는 다른 적절한 경로를 통해서 조성물을 투여함의 용이성, 투여후의 내성, 조절된 방출 성질을 달성하기 위하여 첨가되는 다른 구성 성분으로 구성된다.
본 발명의 백신은 상기 언급된 바와 같이 하나의 면역학적 활성 성분이 페스티바이러스 또는 페스티바이러스 기원인 백신을 의미한다.
용어"생백신"은 살아있는, 특히 살아있는 바이러스 활성 성분을 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어"페스티바이러스"는 과 플라비비리다에내의 BVDV, CSFV 및 BDV와 같은 속에 속하고, 당단백질 RNS의 발현에 의해 특징 지워지는 모든 페스티바이러스를 언급한다. 물론, 상기 용어는 Becher등 및 다른 사람에 의해 특징지워진바 당단백질 ERNS를 발현하는 모든 페스티바이러스를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바 "RNase 활성"은 RNA를 가수분해시키는 당단백질 ERNS의 능력을 언급한다.
용어 당단백질 E0은 종종 공보에서 당단백질 ERNS와 동의어로 사용된다.
용어"상기 당단백질내에 존재하는 RNase 활성의 불활성화"는 상기 당단백질 ERNS의 비변형된 야생형과 비교해서 변형된 당단백질 ERNS의 RNA를 가수분해시키는 감소된 능력 또는 불능을 언급한다.
당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성의 불활성화는 본 명세서에 명시되고 Hulst 등(1998)에 의해 기술된 바와 같이 상기 당단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 달성될 수있다. 그러므로, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 RNase 활성이 상기 당단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 생백신에 관한 것이다.
당단백질 ERNS가 Ruemenapf 등(1993)에 의해 기술된 바와같이 각 모노머가 CSFV 폴리단백질의 아미노산 268 내지 494에 상응하는 227개 아미노산으로 구성되는 약 97 kD의 이황화 결합된 호모다이머(homodimer)를 형성한다는 것이 밝혀졌다. CSFV의 알포트(Alfort) 균주에 발현된바 처음 495 아미노산은 단지 참고 목적으로 도 1에 예시한다. CSFV의 알포트 균주의 게놈 서열은 수탁 번호 J04358하에서 GenBank/EMBL 데이타 라이브러리에서 이용가능하다; 다르게는 BVDV 균주 CP7에 대한 아미노산 서열은 GenBank/EMBL 데이타 라이브러리에서(수탁 번호 U63479) 접근될 수 있다. 아미노산의 두개의 영역이 당단백질 ERNS및 일부 식물 및 진균 RNase-활성 당단백질에 고도로 보존되어 있다(Schneider et al., 1993). 이들 두 영역은 RNase 효소 활성에 특히 중요하다. 첫번째 영역은 295 내지 307 위치의 아미노산에 있는 영역으로 구성되고, 두번째 영역은 CSFV의 알포트 균주에 대해 도 1에 예 시된 바와 같은 상기 바이러스 폴리단백질의 338 내지 357의 위치에 있는 아미노산으로 구성된다(CSFV 균주 알포트의 공개된 추론된 아미노산 서열에 따라 넘버링(Meyers et al., 1989)). 상기 언급된 RNase 활성에 특히 중요한 아미노산은 결코 CSFV의 알포트 균주에 대해 정의된 바와 같은 정확한 위치로 제한되지 않으나, 그위치에 있거나 일반적으로 BVDV, BDV 및 페스티바이러스에서 발견된 바와 같은 다른 균주의 그위치에 상응하는 바람직한 아미노산을 지적하기 위하여 예시적인 방법으로 간단히 사용된다. 그이유는 이들이 고도로 보존되어 있기 때문이다. CSFV 알포트 균주이외의 페스티바이러스에서는, 바람직한 아미노산의 위치의 넘버링이 종종 다르나 페스티바이러스의 분자 생물학 분야에서 숙련된자는 상기 당단백질의 고도로 보존된 아미노산에 대한 상대적인 위치에 의해 이들 바람직한 아미노산을 쉽게 동정할 것이다. 한 특별한 비-잘적인 예에서, CSFV 알포트 346의 위치는 BVDV 균주 cp7의 349위치와 동일하다.
결과로서, 본 발명은 보다 바람직한 구체예에서 상기 불활성화 결실 및/또는 돌연변이가 예를들어 당단백질의, CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기술된 바와 같은 295 내지 307 위치 및/또는 338 내지 357 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 본 발명의 백신에 관한 것이다.
매우 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 당단백질의 346위치에서의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의한 상기 RNase 활성의 불활성화가 특히 유용한 생백신에 이르게 된다는 것을 예시한다. 그러므로, 본발명은 상기 RNase 활성이 상기 단백질의, 예를들어 상기 당단백질의, CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에서 기술 된 바와같은 346 위치 또는 다른 균주에서의 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.
본 발명은 페스티바이러스가 생존성이고, ERNS RNase의 보존된 추정된 활성 부위 잔기의 하나를 나타내는 바이러스 당단백질의 346위치(CSFV alfort/Tuebingen의 공표된 서열에 따른 넘버링(Meyers et al., 1989))의 히스티딘 잔기가 결실됐을 때의 RNase 활성이 없는 ERNS 단백질을 코딩하는 것을 입증한다. BVD 페스티바이러스의 ERNS에 있는 각 히스티딘(위치 349, BVDV Cp7 GenBank/EMBL 데이타 라이브러리(수탁번호 U63479)의 서열에 따라 넘버링))의 결실이 ERNS 당단백질이 RNase 활성을 손실하는 생존성 바이러스를 가져오는 것이 본 발명에 경우 입증됐다. 한 아미노산을 또다른 아미노산으로 변화시키는 점 돌연변이에 대조해서, 결실 돌연변이체는 일반적으로 복귀돌연변이체에 대해 훨씬 보다 안정하다. 상기 결실을 갖고, ERNS를 발현하는 병인성 CSFV Alfort/Tuebingen 돌연변이체로 돼지를 감염하면 열 또는 CSFV 감염의 다른 전형적인 임상적 증상이 나타나지 않은 반면에, 야생형 바이러스 감염경우 열, 설사, 식욕부진, 무감각, B-세포의 결핍 및 중추 신경 질환을 일으켰다. 이들 돼지는 접종후 14일후 피부 및 내부 기관에서 심각한 출혈을 나타내는 죽어가는(moribund) 단계에서 죽였다. 돌연변이체로 감염된 돼지는 감염하고 3, 5, 7, 10, 14일후 시험된 바 바이러스 혈증 또는 B-세포 결여를 나타내지 않았고, 한편, 야생형 바이러스가 접종된 돼지로부터 유래된 혈액 샘플로부터 CSFV가 쉽게 단리되었다. 결실 돌연변이는 항체의 중화 유도에 의해 나타나는 바와 같이 명백히 동물에서 복제했다(참조, 실시예 3, 표 3c). 돌연변이체 바이러스에 대한 면역 반응은 알포트 균주에 이종성인 CSFV 균주 Eystrup(Koenig, 1994)로 2 x 105 TCID50의 고도의 병원성 감염에도 치사 챌린지후 살아남게 하였다. 더구나, 시험된 동물은 열, 설사, 출혈, B-세포 결핍 또는 챌린지 감염후의 식욕부진과 같은 CSFV 감염에 대한 전형적인 임상적 표시를 나타내지 않는다. 이 데이타는 결실 돌연변이체로 돼지를 감염시키는 것은 엄격한 챌린지에 대한 보호에 충분한 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다.
그러므로, 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에서 기술된 바와 같은 위치 346 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실로 불활성화된 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.
추가의 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 BVDV 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 BVDV 백신에 관한 것이다.
또다른 면에서, 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성화되고, 단, CSFV에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 상기 당단백질의 297 및/또는 346번 위치의 아미노산이 라이신이 아닌 약독화된 바이러스에 관한 것이다. 상기 당단백질의 297 및/또는 346 위치에 있는 아미노산이 라이신인 재조합 페스티바이러스는 1998년에 Hulst 등에 의해 기술되었다. 이들 특별한 페스티바이러스는 돼지 신장 세포에서 세포 변성 효과를 나타냈다. 지금까지, ERNS 효소 활성의 불활성화에 기인하여 놀라웁고 혁신적인 약독화 특징은 완전히 인식되지 않았다.
백신에 대한 상기 언급된 이유로 바람직한 구체예에서, 본 발명은 또한 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 및/또는 338 내지 357 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 페스티바이러스에 관한 것이다.
백신에 대해 상기 언급된 이유로 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명은 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 페스티바이러스에 관한 것이다.
백신에 대해 상기 언급된 이유에 대한 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 또한 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 페스티바이러스에 관한 것이다.
추가의 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 BVDV 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 BVDV 페스티바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 백신의 약독화된 페스티바이러스 및 활성 성분은 당단백질 ERNS중에 돌연변이체 아미노산 서열의 발현을 가져오는 핵산-변형 재조합 기술에 의해 쉽게 제조될 수있다. 그러므로 본 발명의 추가의 면은 당단백질에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성화되고, 단 당단백질의, CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 297 및/또는 346번 위치의 아미노산이 라이신이 아닌, 당단백질 ERNS를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 이유로 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 및/또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
보다 바람직한 구체예에서, 본 발명은 백신에 대해 언급된 이유로, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다. .
추가의 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 BVDV 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 본 발명에 따른 BVDV 핵산에 관한 것이다. .
뉴클레오타이드, 예를들어 DNA 또는 RNA가 DNA-, RNA- 및/또는 벡터 백신을 제조하는데에 또한 유용하다. 이들 백신에서, 뉴클레오타이드는 동물에 직접적으로 또는 본래 바이러스이외의 벡터를 통해 간접적으로 적용된다. 뉴클레오타이드 백신 및 벡터 백신은 본 분야의 현재 상태에서 잘 알려져 있고, 추가로 힘들여 마무리되고 있지는 않다.
추가의 면에서, 본 발명은 뉴클레오타이드- 및/또는 벡터-백신을 제조하기위해 본 발명의 핵산의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백신, 약독 페스티바이러스, 및/또는 핵산은 약제학적 조성물의 제조에 특히 유용하다.
결과적으로, 본 발명의 추가의 면은 본 발명에 따른 백신을 포함하는 약제학적 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 및/또는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 단지 예시 목적으로 주어지는 이러한 약제학적 조성물의 하나의 비-제한적인 예는 다음과 같이 제조될 수있다: 감염된 세포 배양 물의 세포 배양물 상등액을 안정화제(예를들어 스퍼미딘 및/또는 BSA(소 혈청 알부민))와 혼합하고 혼합물을 이어서 냉동건조시키고 다른 방법에 의해 탈수시킨다. 백신접종전에, 상기 혼합물을 이어서 수성(예를들어 염수, PBS(포스페이트 완충된 염수)) 또는 비-수성 용액(예를들어, 오일 유제, 알루미늄 기초 어쥬번트)중에서 재수화시킨다.
본 발명의 추가의 면은 페스티바이러스를 약독화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성을 불활성화시키는 것을 특징으로 하는 페스티바이러스를 약독화시키기기 위한 독특하고 예상되지 않은 방법을 제공한다.
특이적으로 약독화된 페스티바이러스는 백신의 제조에 특히 유용하다. 그러므로, 추가의 면에서, 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화되는 것을 특징으로 하는 특별히 약독화된 페스티바이러스 백신을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성의 불활성화는 페스티바이러스를 검출가능하게 표지하기 위한 놀랍고 새로운 방법을 제공한다. 추가의 면에서, 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화되는 것을 특징으로하는 페스티바이러스를 검출가능하게 표지화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 페스티바이러스의 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성의 부재 특징은 지금 이들 페스티바이러스를 검 출가능하게 표지화하는 것을 가능하게 한다. 신체 유체중의 페스티바이러스 감염된 세포로부터 분비된 ERNS의 표지 및 비표지된 페스티바이러스는 당단백질 ERNS의 RNase 활성의 부재 또는 존재에 의해서 및 이러한 효소 활성의 분석에 의해 분명하게 구별될 수있다.
결실 및/또는 돌연변이에 의해 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase활성이 불활성화된 페스티바이러스의 경우, 다수의 다른 기술이 사용될 수 있다. 이러한 페스티바이러스는 이러한 결실 및/또는 돌연변이로부터 연유하는 구조적 결과때문에 쉽게 검출될 수 있다. 예를들어, 변형된 당단백질 ERNS의 핵산 서열의 서열 차이가 실시예 8에서 입증된 바와 같이 핵산 서열 분석 또는 PCR-기법(폴리머라제-연쇄반응)에 의해 검출가능하다; 변형된 단백질 서열은 비변형된 단백질을 인식하지 않는 특이적 모노클로날 항체에 의해 검출될 수 있다. 역으로 변형되어 구조적으로 표지된 단백질을 페스티바이러스의 존재가 달리 설정될 수 있는 한하에서 변형되지 않은 당단백질 ERNS을 인식하는 특이적 모노클로날 항체에의 결합의 부재에 의해 검출하는 것이 가능하다. 물론, 표지된 바이러스에서 RNase 활성을 폐기하는 결실 및/또는 돌연변이는 비표지된 페스티바이러스로부터 연유하는 반응과 비교했을 때 동물에서 상이한 면역 반응을 가져온다.
본 발명에 따른 페스티바이러스를 약독화하기 위한 방법, 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 제조하는 방법 및 페스티바이러스를 검출가능하게 표지화하기 위한 방법을 참고화한 모든 면에 대한 바람직한 구체예는 상기 RNase 활성이 당단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성된 당단백질 ERNS의 불활성에 관련된 방법이다.
본 발명에 따른 페스티바이러스를 약독화하기 위한 방법, 특이적으로 약독화된 페스티바이러스 백신을 제조하기위한 방법 및 페스티바이러스를 검출가능하게 표지화하는 방법을 참고로한 모든 면에 대한 보다 바람직한 구체예는 상기 결실 및/도는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 예시된 바와 같은 위치 295 내지 307 및/또는 위치 338 내지 357 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 당단백질 ERNS의 불활성화에 관련된 방법이다.
본 발명에 따른 페스티바이러스 약독화 방법, 특이적으로 약독화된 페스티바이러스 백신의 제조방법 및 페스티바이러스를 검출가능하게 표지화한 방법을 참고로한 모든면에서의 매우 바람직한 구체예는 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 제 1 도에 예시된바와 같은 346 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 당단백질 ERNS의 불활성에 관련된 방법이다.
본 발명에 따른 페스티바이러스 약독화 방법, 특이적으로 약독화된 페스티바이러스 백신의 제조방법 및 페스티바이러스를 검출가능하게 표지화한 방법을 참고로한 모든면에서의 가장 바람직한 구체예는 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 제 1 도에 예시된 바와 같은 346 위치 또는 다른 균주 에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 당단백질 ERNS의 불활성에 관련된 방법이다.
본 발명은 동물에서 페스티바이러스 감염의 예방 및 치료에 특히 유용한 백신 및 다른 약제학적 조성물을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 추가의 면은 본 발명에 따른 백신 또는 본 발명에 따른 또다른 약제학적 조성물을 예방 및 치료를 필요로하는 동물에 적용하는 것을 특징으로 하는 동물에서 페스티바이러스의 예방 및 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
또다른 면에서, 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 특정적으로 약독화된 페스티바이러스의 제조 방법을 제공한다.
한면에서, 본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 특이적으로 표지화된 페스티바이러스의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 제조하는 방법, 및 특정하게 표지된 페스티바이러스를 제조하는 방법을 참고화한 모든 면에 대한 바람직한 구체예는 상기 RNase 활성이 당단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성된 당단백질 ERNS의 불활성에 관련된 방법이다.
본 발명에 따른 특이적으로 약독화된 페스티바이러스의 제조 방법, 및 특정하게 표지된 페스티바이러스를 제조하는 방법을 참고로한 모든 면에 대한 보다 바 람직한 구체예는 상기 결실 및/또는 돌연변이가 상기 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 도 1에 예시된 바와 같은 위치 295 내지 307 및/또는 위치 338 내지 357에 있는 아미노산 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 당단백질 ERNS의 불활성화에 관련된 방법이다.
본 발명에 따른 특이적으로 약독화된 페스티바이러스의 제조방법, 및 특정하게 표지된 페스티바이러스를 제조하는 방법을 참고로한 모든면에서의 매우 바람직한 구체예는 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 제 1 도에 예시된바와 같은 346 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 당단백질 ERNS의 불활성에 관련된 방법이다.
본 발명에 따른 특이적으로 약독화된 페스티바이러스의 제조방법, 및 특정하게 표지된 페스티바이러스의 제조방법을 참고로한 모든면에서의 가장 바람직한 구체예는 상기 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 CSFV 알포트 균주에 대해 제 1 도에 예시된 바와 같은 346 위치 또는 다른 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 당단백질 ERNS의 불활성에 관련된 방법이다.
본 발명의 백신 또는 다른 약제학적 조성물은 동물에서 페스티바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용하다.
그러므로, 한 면에서, 본 발명은 동물에서 페스티바이러스 감염의 예방 및 료용의 본 발명에 따른 백신의 용도에 관한 것이다. 또다른면에서, 본 발명은 동물에서 페스티바이러스의 예방 및 치료용의 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용 도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 페스티바이러스 및/또는 핵산은 약제학적 조성물 또는 백신의 유용한 활성 성분이다. 그러므로, 본 발명은 추가의 면에서 백신 또는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 페스티바이러스 및/또는 본 발명의 핵산의 용도에 관한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성은 페스티바이러스를 표지화하기위한 놀라웁고 새로운 방법을 제공한다.
결과로서, 본 발명의 한면은 비표지되고 가능하게는 병원성의 페스티바이러스로부터 본 발명에 따른 검출가능하게 표지된 페스티바이러스를 구별하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 특히 동물에서 표지된 페스티바이러스의 효능을 추적하는데에 특히 유용하다. 백신 처리된 동물은 이러한 동물의 샘플을 얻어 상기 표지를 분석한후 표지-양성인 것으로 나타난다. 비표지된 동물,특히 페스티바이러스 양성으로 나타나는 비표지된 동물은 다른 동물에 병원성 감염을 전파하는 긴급한 위험을 제거하기 위하여 즉각적으로 분리시키거나 고립시키거나 도살할 수 있다.
본 발명은 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불화성화 된 것을 특징으로 하는 페스티바이러스를 검출가능하게 표지하는 방법을 제공한다. 본 발명의 페스티바이러스의 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성의 부재의 특성은 이들 페스티바이러스를 검출가능하게 표지화할 수있다. 결과로서, 표지되고 비표지된 페스티 바이러스는 단리하고 이러한 효소 활성의 분석시 당단백질 ERNS의 RNase 활성의 부재 또는 존재에 의해 분명히 구별될 수 있다. 흥미로운 페스티바이러스 또는 그의 물질을 함유하는 샘플을 입수시 상기 효소 활성의 존재 또는 부재의 결정을 예를들어 실시예 2 또는 Hulst 등(1994)에 기술된 표준 방법에 따라 수행할 수 있다.
그러므로, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따라 특이적으로 약독화된 페스티바이러스로 백신접종된 동물로부터 페스트바이러스-감염된 동물을 구별하는 방법에 관한 것이다:
(1) 페스트바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 동물 또는 백신접종된 동물로부터 샘플을 수득하고;
(2) 상기 샘플중의 당단백질 ERNS의 RNase 활성의 부재 또는 존재를 결정하며;
(3) 당단백질 ERNS의 RNase 활성의 부재를 백신접종된 동물과 상호연관시키고 상기 활성의 존재를 상기 동물의 페스티바이러스 감염과 상호연관시킨다.
본 발명은 결실 및/또는 돌연변이에 의해 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화된 페스티바이러스를 제공한다. 이러한 페스티바이러스는 결실 및/또는 돌연변이로부터 유래되는 구조적 결과때문에 쉽게 검출된다. 변형된 당단백질 ERNS를 코딩하는 ERNS 유전자의 서열 차이는 서열화 기법 또는 PCR 기법에 의해 검출가능하다. 결과로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 특이적 으로 약독화된 페스티바이러스로 백신접종된 동물로부터 페스티바이러스-감염된 동물을 구분하는 방법을 바람직한 구체예에서 제공한다:
(1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 동물 또는 백신접종된 동물로부터 샘플을 수득하고;
(2) 상기 샘플안의 페스티바이러스 게놈 또는 단백질의 뉴클레오타이드 서열을 동정하며;
(3) 백신안에 존재하는 ERNS 뉴클레오타이드 서열의 결실 및/또는 돌연변이를 백신접종된 동물과 상호연관시키고, 상기 결실 및/또는 돌연변이의 부재를 상기 동물의 페스티바이러스와 상호연관시키는 단계.
또한, 본 발명의 페스티바이러스의 당단백질 ERNS의 변형된 단백질 서열로부터 유래된 구조적 변화가 비변형된 단백질을 인식하지 못하는 특이적 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 의해 검출될 수 있다.
그러므로, 추가의 구체예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 약독화된 페스티바이러스로 백신접종된 동물로부터 페스티바이러스-감염된 동물을 구별하는 방법에 관한 것이다:
(1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 동물 또는 백신접종받은 동물로부터 샘플을 얻고;
(2) 샘플중에 존재하는, 본 발명의 방법에 의해 변형된 ERNS 당단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합에 의해, 모노클로날 또는 폴리클 로날 항체가 비변형된 ERNS 당단백질에는 결합하지 않는 것에 의해 약독화된 페스티바이러스의 변형된 ERNS 당단백질을 동정하며;
(3) 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합을 백신접종받은 동물과 상호연관시키고 항체 결합의 부재를 동물의 페스티바이러스 감염에 상호연관시키며, 단 동물 및/또는 샘플중의 페스티바이러스성 물질의 존재는 다른 방법으로 확립되는 단계.
역으로, 페스티바이러스의 존재가 달리 설정될 수있다면, 비변형된 당단백질 ERNS 인식하는 특이적 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에의 결합의 부재에 의해 변형되고, 이에의해 구조적으로 표지된 단백질을 검출하는 것이 가능하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 약독화된 페스티바이러스로 백신접종된 동물로부터 페스티바이러스-감염된 동물을 구분하기위한 방법에 관한 것이다:
(1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 동물 또는 백신접종받은 동물로부터 샘플을 얻고;
(2) 샘플중에 존재하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 변형되지 않은 ERNS 당단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합에 의해, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 변형된 ERNS 당단백질에는 결합하지 않는 것에 의해 페스 티바이러스의 비변형된 ERNS 당단백질을 동정하며;
(3) 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합을 동물의 페스티바이러스 감염과 상호연관시키고 항체 결합의 부재를 백신접종받은 동물에 상호연관시키며, 단 동물 및/또는 샘플중의 페스티바이러스성 물질의 존재는 다른 방법으로 확립되는 단계.
물론, 본 발명의 표지된 바이러스에 있는 구조적 변형 및 RNase의 활성의 결여는 비표지된 페스티바이러스 감염으로부터 생성되는 반응과 비교할 때 동물에서 상이한 면역 반응을 가져온다. 본 발명의 페스티바이러스는 비변형된 및 가능하게는 병원성 면역 반응과는 상이한 세포 및 체액의 상이하고 특징적인 면역반응을 유도한다. 예를들어, 본 발명에 따른 당단백질 ERNS는 비변형된 당단백질으로부터 생기는 폴리클로날 항체와 비교할 때, 결합 특이성에서 상이한 폴리클로날 항체를 가져온다. 결합 특이성에서의 이 차이는 본 발명에 따른 페스티바이러스로 백신접종된 동물을 페스티바이러스 분야 감염된 동물로부터 구별하기위한 표지를 제공한다. 감염되고 백신접종된 동물을 차별화할 목적으로 야생형 에피토프에 결합하거나 그 에피토프의 마커 결실 돌연변이체에 결합하는 특이적 폴리클로날 항체에 대해 혈청을 스크리닝하는 시험이 예를들어 슈도라비즈 감염되고(pseudorabies-infected) 백신접종된 돼지에 대해 기술되었다(Kit et al., 1991).
바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 약독화된 페스티바이러스로 백신접종된 동물로부터 페스티바이러스-감염된 동물을 구분 하기 위한 방법에 관한 것이다.
(1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상인 동물 또는 백신접종된 동물로부터 폴리클로날 항체의 샘플을 수득하고, .
(2)본 발명에 따라 변형된 당단백질 ERNS 또는 비변형된 당단백질 ERNS에 상기 폴리클로날 항체의 어떤 특이적 결합을 동정하며,
(3) 비변형된 당단백질 ERNS에의 상기 폴리클로날 항체의 결합을 페스티스바이러스 감염과 상호연관시키고, 본 발명에 따라 변형된 당단백질 ERNS에 상기 폴리클로날 항체의 결합을 백신접종과 상호연관시키는 단계.
참고문헌
Figure 112000025772524-pct00001
Figure 112000025772524-pct00002
Figure 112000025772524-pct00003
Figure 112000025772524-pct00004
실시예 1
RNase-음성 페스티바이러스 돌연변이체의 제조
감염성 cRNA가 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있는 완전한 길이의 cDNA 클론 pA/CSFV(Meyers et al., 1996a) 또는 pA/BVDV(Meyers et al., 1996b)로부터 출발하여, 서브클론이 제조되었다. CSFV경우, pA/CSFV의 Xhol/Sspl 단편을 pBluescript SK+에 클로닝시키고, Xhol 및 Smal로 절단했다. BVDV경우, pA/BVDV로부터의 Xhol/BgIII 단편을 플라스미드 pCITE-2C에 클로닝시키고, 동일한 효소로 절단했다. 동일한 가닥의 플라스미드 DNA를 이.콜라이 CJ 236 세포(BioRad) 및 VCMS 단일 가닥 파지(Stratagene)를 사용하여 Kunkel의 방법(Kunkel et al., 1987)에 따라 이들 제작물로부터 제조하였다. 이 단일 가닥 DNA를 'Phagemid in vitro Mutagenesis Kit'(BioRad)를 사용하여 이중 가닥으로 전환시켰다. 원하는 페스티바이러스 돌연변이체를 제조하기 위한 프라이머로서 사용되는 합성 뉴클레오타이드 의 일부를 예시적으로 하기에 열거한다:
Figure 112000025772524-pct00005
이중 가닥 플라스미드 DNA를 이.콜라이 XL1-Blue 세포(Stratagene)의 형질전환을 위해 사용하였다. 플라스미드를 갖는 박테리아 콜로니를 앰피실린 선택을 통해 단리했다. 플라스미드 DNA를 제조하고, T7 폴리머라제 시퀀싱 키트(Pharmacia)를 사용하여 뉴클레오타이드 서열화에 의해 추가로 분석했다. 원하는 돌연변이를 갖고, 두번째 부위 변화가 없는 플라스미드를 완전한 길이의 cDNA 클론의 제작을 위해서 사용하였다. CSFV 경우에, 돌연변이된 플라스미드로부터의 Xhol/Ndel 단편을 플라스미드 578(pCITE 2A, pA/CSFV로부터의 Xhol/BgIII 단편을 함유하는)로부터 유래된 Ndel/BgIII 단편과 함께 Xhol 및 BgIII로 절단된 pA/CSFV에 삽입시켰다. BVDV CP7 돌연변이체를 얻기위하여, 결실을 함유하는 Xhol/BgIII 단편을 pA/BVDV/Ins-로부터 단리된 BgIII/Ncol 단편과 함께 Xhol 및 Ncol으로 절단된 pA/BVDV에 삽입시켰다. 제작물 pA/BVDV/Ins-로부터, 적절한 세포에 트랜스펙션(transfection)시 비세포변성 BVDV를 일으키는 cRNA를 전사했다(Meyers et al., 1996b). 다른 완전한 길이의 클론을 증폭시키고, 플라스미드를 단리했다. 원하는 돌연변이의 존재가 DNA 서열화에의해 입증되었다. Srfl(CSFV 완전 길이 클론) 또는 Smal(BVDV 완전 길이 클론)로 선형화한후, cRNA를 상기 기술된 바와 같이 전사했다(Meyers et al., 1996ab). RNA를 겔여과 및 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제하고, 돼지 신장(PK15) 세포 또는 소 신장(MDBK 클론 B2) 세포(각각 CSFV 또는 BVDV 제작물)의 트랜스펙션을 위해 사용하였다. 트랜스펙션을 바이러스 특이적 항혈청을 사용한 면역형광으로 분석하였다. 원하는 돌연변이체가 회수될 수 있는 경우에(면역형광 양성), 바이러스를 트랜스펙션 실험에 사용된 동일한 세포주를 계대배양하여 증폭시켰다. CSFV 돌연변이체의 추가의 분석은 한단계 성장 곡선의 결정 및 바이러스 특이적 cDNA 프로브에 의한 노던 블로트 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 바이러스 RNA의 특성화 및 바이러스 게놈중의 원하는 돌연변이의 존재를 입증하기위하여 PCR 단편의 이어진 서열화를 포함하였다. 모든 경우에, 원하는 돌연변이의 존재가 입증되었다. 모든 회수된 바이러스는 동등하게 잘 성장하였고, 야생형 서열을 나타내는 플라스미드로부터 생성된 바이러스와 같이 유사한 양의 RNA를 생산하였다.
BVDV 돌연변이체의 생존성은 각각의 cRNA의 트랜스펙션 및 3일후의 세포의 분해로 나타났다. 세포의 일부분을 3.5 cm 직경의 접시에 파종하고, 그다음날 아세톤/메탄올로 고정시키고, BVDV-특이적 모노클로날 항체의 혼합물을 사용하여 면역형광에 의해 분석하였다. 모든 세포는 양성으로 밝혀졌고, 반면에 비감염성 RNA로 트랜스펙션(transfection)된 대조군은 어떤 신호도 나타내지 않았다. 각각의 cDNA로 트랜스펙션된 세포의 일부분으로부터 한 사이클 냉동 및 해동에 의해 추출물을 생성하였다. 새로운 세포가 이 세포 추출물로 감염되고 감염 3일후 BVDV 특 이적 면역형광에 의해 BVDV 양성으로 나타났다.
표 1은 나타내진 바이러스 돌연변이체로 암호화되는 RNase의 추정상의 활성 부위를 나타내는 ERNS의 보존된 서열에 도입된 상이한 변화들을 요약한다.
표 1
Figure 112000025772524-pct00006
표 1에 대한 설명: RNase활성에 대한 시험은 일시적 분석으로 수행하였다. BHK21 세포를 백시니아 바이러스 vTF7-3(Fuerst et al., 1986)으로 감염시키고, 이 어서 각각의 cDNA 제작물로 트랜스펙션시켰다(5 ㎍의 플라스미드 DNA, 공급자(Qiagen)에 의해 권장된대로 Superfect를 사용한 트랜스펙션). CO2 인큐베이터에서 37℃에서 10시간 인큐베이션후, 트랜스펙션된 세포는 용해되고, 하기 기술되는 바와 같이, RNase 활성의 결정을 위해 처리. 생존성은 하기 기술되는 바와 같이 측정되었다.
실시예 2 E RNS 의 RNase 활성에 대한 상이한 돌연변이의 효과
ERNS의 RNase 활성에 대한 상이한 돌연변이의 효과를 시험하기 위하여, 적절한 세포를 돌연변이 바이러스로 감염시켰다. CSFV경우, 감염은 0.01의 다중 감염(m.o.i.)으로 수행하였다. 야생형 바이러스로 감염은 양성 대조군으로 하였고, 반면에 비감염된 세포는 음성 대조군으로 사용하였다. 감염 48시간후, 세포를 포스페이트 완충된 염수로 2회 세척하고, 0.4 ml의 용해 버퍼(20 mM Tris/HCl; 100 mM NaCl, 1mM EDTA, 2 mg/ml 소 혈청 알부민; 1% 트리톤 x 100; 0.1% 데옥시콜산; 0.1% 소듐 도데실 설페이트)에서 용해시켰다. 용해물을 1.5 ml 반응 튜브에 넣고, 소니파이하고(sonified)(Branson sonifier B12, 120 Watt, 컵 혼(horn) 물 배쓰에서 20 s), 원심분리하여 맑게하며(5분, 14,000 rpm, Eppendorf Centrifuge, 4℃), 상등액을 초원심분리하였다(Beckmann table top ultracentrifuge, 4℃에서 60분 및 45,000 rpm in a TLA 45 rotor). RNase 활성의 측정은 2차 원심분리 단계의 5 또는 50 ㎕ 상등액 및 RNase-분석 버퍼(40 mM Tris-acetate(pH 6.5), 0.5 mM EDTA, 5 mM 디티오트레이톨(DTT)중의 80 ㎍의 폴리(rU)(Pharmacia)를 함유하여 총 부피 200 ㎕로 수행하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 인큐베이션후, 1.2 M 퍼클로르산 200 ㎕, 20 mM LaSO4를 첨가하였다. 얼음상에서 15분간 인큐베이션후, 혼합물을 4℃에서 15분간 및 Eppendorf centrifuge에서 14,000 rpm으로 원심분리했다. 상등액에 3배 부피의 물을 첨가하고, 혼합물의 분취량을 Ultrospec 3000 스펙트로미터(Pharmacia)를 사용하여 260 nm에서 광 밀도를 측정하여 분석하였다. 모든 경우에, ERNS 유전자에 도입된 돌연변이는 완전히 RNase 활성을 폐기하였다(표 1).
BVDV 돌연변이체 경우, RNase 활성을 회수된 바이러스를 계대배양하지 않고 RNA 트랜스펙션후 수득된 물질에 대해 시험하였다. 적절한 RNA로 트랜스펙션된 세포가 트랜스펙션 72시간후 분해되었고, 이를 두개의 접시(dish)에 파종했다. 24시간후, 한 접시로부터, 세포 추출물을 제조하고, 상기 기술된 바와 같이 RNase 활성에 대해 분석했다. 감염을 입증하기 위하여, 두번째 접시의 세포를 BVDV 특이적 모노클로날 항체를 가지고 면역형광에 의해 분석하고(Weiland et al., 1989), 100% 양성인 것을 확인하였다. 트랜스펙션을 pA/BVDV/Ins- 및 pA/BVD/Ins-에 동등하나 CSFV 알포트 게놈의 코돈 346에 동등한 코돈이 결실된 플라스미드 pA/B-346-d로부터 전사된 RNA로 수행하였다. 비트랜스펙션된 MDBK 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
표 2A 상이한 바이러스의 RNase 활성의 측정
Figure 112000025772524-pct00007
표 2A의 설명:
PK15 세포를 0.01의 m.o.i.(감염 다중도)로 나타내진 바이러스로 감염하고, CO2 인큐베이터에서 48시간동안 인큐베이션한후, 용해되고, RNase 시험을 거쳤다. 상이한 세포 추출물과 함께 인큐베이션하여 생성된 산 가용성 RNA를 260 nm에서 광밀도를 측정하여 정량화하였다. RNase 활성에서의 관찰된 차이는 샘플중의 ERNS단백질의 상이한 양에 기인하지 않았다. 그 이유는 유사한 값이 방사성 표지, 면역 침전 및 포스포리마거(phosphorimager)로 방사성 분석후 얻어졌기 때문이다. 더구나, 분석중 ERNS 농도가 평상시 양의 10분의 1로 감소되도 OD 값을 상당히 변화시키지 않아, 선택된 조건에서 분석은 ERNS로 포화됐음을 나타냈다.
CSFV 균주 알포트; 플라스미드로부터 시험관에서 전사된 RNA로부터 모두 다른 바이러스가 회수되었다: 예를들어 pA/CSFV로부터 C-WT; pA/C-297-L로부터 C-297-L; 등; C-346-d/Rs 바이러스가 pA/C-346-d/Rs(pA/CSFV로부터 유래된 동등한 단편에 대한 각각의 cDNA 단편의 교환에 의해 pA/C-346-d/Rs에서의 돌연변이의 역전에 의해 생성된)로부터 회수되었다; 대조군: 비-감염된 PK15 세포의 추출물.
표 2B
Figure 112000025772524-pct00008
표 2B의 설명
MDBK 세포를 시험관내 전사된 RNA로 감염시켰고, 트랜스펙션 72시간후 분해되고 24시간후 RNase 활성에 대해 분석하였다. 세포의 감염은 본 명세서에 기술된바와 같은 면역형광에 의해 입증했다.
B-WT: pA/BVDV/Ins-로부터 회수; B-346-d: pA/B-346-d로 부터 회수된 바이러스; 대조군; 비감염된 MDBK 세포로부터의 추출물.
실시예 3 RNase 불활성후 CSFV의 병원성
RNase 활성의 파괴가 천연 숙주내의 페스티바이러스의 병원성에 영향을 끼치는 지의 여부를 시험하기 위하여, 동물 실험을 돌연변이체 V(pA/C-346-d)(표의 C346-d)를 갖고 수행하였다. 돌연변이가 없는 CSFV 완전길이의 클론(V(pA/CSFV))으로부터 회수된 바이러스를 양성 대조군(표에서 C-WT)으로 사용하였다. 각 돌연변이체 경우, 세개의 새끼 돼지(품종: German landrace; 약 25kg 체중)를 사용하였다. 감염 투여량은 동물당 1 x 105 TCID50이었다. 접종물의 3분의 2를 비강내 투여하고(각 콧구멍에 3분의 1 씩), 3분의 1은 근육내 투여하였다. 두 그룹을 별도의 분리 유니트에 수용하였다. 혈액을 감염시키전 및 3, 5, 7, 10, 12 및 14일에 두차례 채취했다. 또한 온도를 매일 기록하였다(도 2). 야생형 바이러스로 감염된 동물은 열, 사지의 기능장애, 식욕부진, 설사, 중추신경 질환, 피부에서의 출혈등과 같은 클래시컬 돼지 콜레라의 전형적인 증상을 나타냈다(표 3a). 바이러스를 3일째(동물 #68) 및 5, 7, 10, 14일째(동물 #68, #78, #121)(표 3b) 혈액으로부터 수집했다. 동물을 감염 14일째 죽어가는 단계에서 죽였다. 이 단계에서, 어떤 바이러스 중화 항체도 검출할 수 없었다. 대조적으로, 돌연변이체로 감염된 동물은 임상적 증상을 발달시키지 않았다(표 3a). 온도는 전 실험기간동안 내내 정상으로 머물렀고(도 2), 동물은 음식물 섭취를 중지하지 않았다. 어떤 때에도, 바이러스를 혈액으로부터 회수 할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 동물은 분명히 감염되었고 바이러스는 대부분 복제하는 것 같았다. 그이유는 모든 동물이 중화 항체를 발달시켰기 때문이다(표 3c).
표 3a 감염후 임상적 신호
Figure 112000025772524-pct00009
표 3a의 설명:
두 그룹의 6마리 새끼 돼지(German land race; 약 25 kg 체중)(각 그룹은 별개로 수용하였다)를 연구했다. 3마리는 CSFV-WT(1·105 TCID50)으로 감염시켰고, 3마리는 C-346-d(1·105TCID50)으로 감염시켰다. 직장 온도 및 임상적 신호를 기록하 여 표에 상세히 요약했다; n.a: 검시를 수행하지 않음.
표 3b: 시험 감염후 혈액 세포 바이러스 혈증
Figure 112000025772524-pct00010
표 3b의 설명:
혈액 세포 바이러스 혈증(viremia)을 PK15 세포와 함께 혈액을 공동 배양하여 검출하였다. 37℃에서 72시간 인큐베이션후, 세포를 PBS로 세척하고, 얼음으로 차갑게한 아세톤/메탄올로 고정시켜 당단백질 E2에 특이적인 모노클로날 항체를 갖고한 면역형광에 의해 감염에 대해 분석하였다(mAb A18, Weiland et al., 1990).
표 3c: CSFV 특이적 혈청 중화 역가의 발달
Figure 112000025772524-pct00011
표 3c의 설명:
동물 실험기간동안 상이한 시간에 측정된 바이러스 돌연변이체 C-346-d로 감염된 돼지의 항체 역가:
50 ㎕의 희석된 혈청을 30 TCID50의 바이러스(CSFV 알포트/Tuebingen)를 함유하는 50 ㎕의 배지와 혼합했다. 37℃에서 90분간 인큐베이션후, 100 ㎕의 세포(1.5x104)를 첨가하고, 혼합물을 96웰 플레이트에 파종했다. 72시간후, 세포를 얼음으로 냉각된 아세톤/메탄올로 고정시키고 당단백질 E2에 특이적인 모노크로날 항체(mAb A18, Weiland et al., 1990)를 가지고 면역형광에 의해 감염에 대해 분석하였다. 감염후 69일째, 동물을 CSFV 균주 Eystrup의 2x105으로 챌린지하였다. 표는 넣어진 바이러스의 완전한 중화를 가져오는 가장 높은 혈청 희석을 제공한다.
실시예 4 RNase 음성 바이러스에 의한 감염에 의해 보호 면역의 유도
돌연변이체 바이러스에 의한 감염이 보호 면역에 이르는 지를 분석하기 위하여, 고도의 병원성 이종성 CSFV 균주(균주 Eystrup, Behring 기원)를 이용한 CSFV 돌연변이체로 감염하고 약 9주후 챌린지 실험을 수행하였다. 2x105 TCID50 바이러스를 감염에 사용하였다. 바이러스의 양은 수개의 선행 실험에서 치사 질병을 유도하는데에 충분한 것으로 밝혀졌다(Koenig, 1994). 그러나, CSFV RNase 돌연변이체로 미리 감염된 동물은 챌린지 감염후 어떤 질병 증상도 나타내지 않았다. 열(도 3) 및 바이러스 혈증 어느것도 검출할 수 없었으며, 중화 항체의 증가가 챌린지 바이러스의 생산적 감염 및 복제를 나타냈다.
실시예 5 약독 원리의 확인
돌연변이체 바이러스의 관찰된 약독화가 정말로 폴리단백질 346위치의 히스 티딘의 결실에 기인하고 동정되지 않은 2차 부위 돌연변이의 결과가 아님을 나타내기 위하여, 야생형 서열을 야생형 서열을 나타내는 pA/CSFV의 상응하는 단편에 대한 완전길이 클론 pA/C-346-d의 1.6 kb Xhol/Ndel 단편의 교환에 의해 회복시켰다. pA/C-346-d로부터 절개된 단편을 돌연변이에 대해 뉴클레오타이드 서열화에 의해 분석하였다. 폴리단백질의 히스티딘 346을 코딩하는 트리플리트(triplet)의 결실외에는 야생형 서열과 관련하여 어떤 차이도 발견되지 않았다. 구조된(rescued) 돌연변이체를 갖는 cDNA 제작물로부터, 야생형 바이러스와 동등하게 잘 성장하고 동등한 RNase 활성을 나타내는 바이러스 V(pA/C-346-d/Rs)가 회수될 수있었다(표 2A).
두번째 동물 실험에서, 구조된 바이러스를 돼지 감염에 사용하였다. 대조군으로서, 결실 돌연변이체를 사용하였다. 다시 3 마리의 동물로 구성된 두개의 그룹을 사용하였다. 동물이 첫번째 실험에서 보다 어리므로(German land race), 이번에는 5 x 104 TCID50의 바이러스를 감염을 위해 사용하였다. 다시, 돌연변이체로 감염된 동물은 어떤 임상학적 신호도 나타내지 않았다(표 5, 도 4). 오직 한마리만 하루동안 열을 가졌다. 그럼에도 불구하고, 이들 동물은 중화하는 항체를 발달시켰고, 치사적 CSFV 챌린지에 대해 보호되었다. 다시 챌린지를 2x105 TCID50 챌린지 균주 Eystrup로 감염시켜 수행하였다. 동물들은 챌린지후 임상학적 신호를 나타내지 않았고, 온도는 정상적이었다(도 5). 결실 돌연변이체로 감염된 돼지와 대조해서, 구조된 야생형 바이러스로 접종된 동물은 치명적인 클래시컬 돼지 콜레라 를 발달시켰다. 한 마리는 감염시키고 11일후 죽여야했고, 다른 두마리는 3일후 죽여야했다. 모든 동물은 클래시컬 돼지 콜레라의 전형적인 증상, 즉, 열, 설사, 식욕부진, 및 신장을 포함하는 상이한 기관에서의 출혈과 같은 병리학적 신호를 나타냈다.
표 5a 시험감염후 임상적 신호
Figure 112000025772524-pct00012
표 5a:
두 그룹의 6 마리의 새끼 돼지(German land race; 약 20 kg 체중)(각 그룹은 단절된 상태로 별개로 수용하였다)를 연구에 사용하였다. 3 마리의 동물을 돌연변이체 C-346-d(5·104 TCID50)로 감염시키고 3 마리는 C-346-d/RS(5·104 TCID50)으로 감염시켰다. C-346-d/RS는 ERNS 유전자의 야생형 서열을 복원시켜 돌연변이체 C-346-d로부터 유래됐다. 직장 온도 및 임상적 신호를 기록하여 요약하였다; n.a.: 검시를 수행하지 않았다.
표 5b 바이러스 혈증동안 감염된 동물로부터 회수된 바이러스에 의 한 진단학적 RNAase 시험
Figure 112000025772524-pct00013
감염 5일째의 동물 3 및 5 및 감염 7일째의 동물 실험#2(실시예 5에 기술된)의 동물 27, 28 및 30의 혈액으로부터 회수된 바이러스를 조직 세포에 전파시키고, 적정하며, 상기 기술된 바와같이 RNase 활성에 대해 시험하였다. 비-감염된 PK15 세포 및 야생형 CSFV(알포트)으로 감염된 세포(대조군)를 대조군으로 사용하였다. 동물 3 및 5는 돌연변이체 C-297-K로 감염시켰고, 반면에 동물 27, 28 및 30은 표에 나타낸 바와 같이 돌연변이체 C-346-d/RS로 감염시켰다.
실시예 6 E RNS 내의 이중 돌연변이의 효과
천연 숙주에서 각각의 바이러스의 복제 능력 및 병원성에 대한 ERNS내의 이중 돌연변이 효과를 시험하기 위하여, 동물 실험을 돌연변이체 V(pA/C-297-L/346-L)을 갖고 수행하였다. 돌연변이가 없는 CSFV 완전 길이 클론(V(pA/CSFV)으로부터 회수된 바이러스를 양성 대조군으로 사용하였다. 각 돌연변이체 경우, 3 마리의 새끼 돼지(품종: German land race; 약 25 kg 체중)를 사용했다. 감염 투여량은 동물당 1x105 TCID50이었다. 접종물의 3분의 2를 비강내 투여하고(각 콧구멍에 3분의 1 씩), 3분의 1은 근육내 투여하였다. 혈액을 감염전(0일) 및 5, 8, 12 및 20일에 동물로부터 채취하였다. 또한 온도를 매일 기록하였다(도 6). 이중 돌연변이체로 감염된 동물은 어떤 임상학적 증상도 발달시키지 않고, 동물은 먹이 섭취를 중지하지 않았다. 동물들은 아마도 오른쪽 뒷다리의 상처에 의해 야기된 박테리아 감염에 기인하여 8일째 동물 45/1외에는 전체 실험 기간에 걸쳐 열을 나타내지 않았다(동물 45/2 및 45/3). 10일날 항생제로 이 동물을 치료한후, 온도는 정상치로 하루만에 돌아왔다(도 6). 모든 동물경우, 바이러스가 5일째 혈액으로부터 회수되었고, 한편 어떤 바이러스 혈증도 나중 시간에 검출되지 않았다(표 6a). 모든 동물은 중성화 항체를 발달시켰다(표 6 b). 동물 45/1 경우, 다시 약 4.5개월 p.i. 에 중화 역가가 측정되었고 1:4374인 것으로 확인되었다. 따라서, 이중 돌연변이체로 감염은 오래 지속되는 면역학적 메모리를 가져왔다.
표 6a 바이러스 혈증에 대한 시험
Figure 112000025772524-pct00014
표 6b 중화 역가
Figure 112000025772524-pct00015
실시예 7 BVDV 바이러스"B-346-d"의 면역원성 및 약독화 원리
이 실험을 pA/B-346-d로부터 회수한 BVDV 바이러스, B-346-d'를 pA/BVDV/Ins-로부터 회수된 B-WT' 바이러스와 비교하여 B-346-d의 약독화 원리 및 면역원성을 조사하도록 설계하였다. 바이러스 B-346-d'는 물론 본래의 BVDV 위치 349에서 돌연변이되었으나 도 1의CSFV 알포트 위치 346에 대한 위치를 나타내기 위하여 "B-346"이라고 명명하였다.
3-6개월의 BVDV 세로네가티브(seronegative) 동물의 3 그룹을 선택했다. 그룹 1 및 2는 각각 5 마리의 동물을 포함하고, 한편, 그룹 3은 3 마리의 동물을 포함했다. 그룹 1 및 2의 동물을 경로당 5 ml의 부피로 B-346-d(그룹 1) 또는 B-WT(그룹 2)의 2x106 TCID50의 투여로 감염시켰다. 동물을 근육내(글루테알 근육), 비강내 및 피하(스카플라에 걸쳐) 감염시켰다. 감염하고 14일에 걸쳐, 양쪽 그룹에서 바이러스 혈증을 혈액 세포 바이러스 혈증 및 코 스와브(nasal swabs)에서 흘리는 바이러스와 같은 파라미터를 통해 추적하였다. 또한 직장 온도, 백혈구 세포 계수및 일반적인 건강 파라미터와 같은 임상적 파라미터를 추적하였다.
항원적으로 이종성이고 독성의 BVDV-단리물(#13)에 의한 감염에 대한 보호적 면역을 B-346-d로 그룹 1의 동물을 감염시키고 77일후 챌린지 감염에 의해 조사하였다. 그룹 3의 동물은 챌린지 대조군으로 사용하고 그룹 1의 동물에 대한 과정에 따라 독성의 BVDV-단리물로 감염시켰다. BVDV 바이러스(#13)은 상이한 항원 그룹(타입 II)에 속하나, 반면에 B-346-d 바이러스는 (Pellerin, C. et al., 1994)에 기술된 분류에 따라 항원 그룹(타입 I)에 속한다. 그룹 1 및 3의 동물은 경로당 5 ml의 부피로 2x106 TCID50의 BVDV 단리물(#13)을 투여하여 감염시켰다. 동물은 근육내(글루테알 근육), 비강내 및 피하 경로(스카풀라에 걸쳐)를 통해 감염시켰다. 감염후 14일에 걸쳐, 양쪽 그룹의 바이러스 혈증을 혈액세포 바이러스 혈증 및 코 스와브에서 흘리는 바이러스와 같은 파라미터에 의해서 추적하였다. 또한 직장 온도, 백혈구 세포 계수 및 일반적인 간강 파라미터와 같은 임상적 파라미터를 추적하였다.
B-346-d로 감염후, 동물은 직장 온도 증가(표 7a), 또는 어떤 호흡 임상적 증상(나타나지 않음)과 같은 BVDV 감염의 어떤 전형적인 임상적 증상을 나타내지 않았다. 감소된 혈액 세포 바이러스 혈증(표 7b) 및 코 스와브에 흘리는 바이러스(표 7c)는 B-WT에 비교된 B-346-d의 약독을 분명히 나타냈다.
독성의 BVDV 단리물 #13은 그룹3의 동물에서 수일에 걸쳐 직장 온도의 증가(표 7d), 강한 백혈구 감소(표 7e), 연장된 혈액 세포 바이러스 혈증(표 7f) 및 코 스와브 유체중에 흘리는 바이러스(표 7g)와 같은 BVDV 감염의 전형적인 신호를 갖는 강한 바이러스 혈증을 유도하였다. 대조적으로, B-346-d를 감염시켜 백신접종된 그룹 1의 동물은 독성이 있는 BVDV 단리물 #13으로 챌린지 감염후 BVDV 감염에 대해 전형적인 임상적 증상을 거의 나타내지 않았다. 감염후 직장 온도에서 어떤 유의적인 증가가 없었다(표 7d). 관찰된 백혈구 감소는 크기 및 기간과 관련하여 매우 한계적이다(표 7e). 어떤 BVDV도 혈액으로부터 단리될 수 없고(표 7f), 오직 한마리 동물경우, 코 스와브 삼출물에 흘리는 바이러스가 검출될 수 있었다.
그러므로, B-346-d에 의한 감염은 이종성 BVDV 단리물에 의한 챌린지 감염후 임상적 신호, 바이러스 흘림 및 혈액세포 바이러스 혈증을 유도한다.
표 7a 그룹 1(B-346-d) 및 2(B-WT)에서의 평균 직장 온도
Figure 112000025772524-pct00016
그룹 1의 동물을 0일째 6x106 TCID50 B-346-d로 감염시키고, 반면에 그룹2의 동물은 6x106TCID50 B-WT로 감염시켰다.
표 7b: 그룹 1 및 2의 혈액세포 바이러스 혈증
Figure 112000025772524-pct00017
EDTA 혈액을 B-346-d 및 B-WT를 각각 감염시키고 10일째 까지 매일 샘플링했다. 0.2 ml의 혈액을 헤파린을 함유하는 배지(클로팅을 방지하기 위하여 1유니트/ml)와 함께 소 고환(Cte) 세포의 3개 배양물 각각에 첨가하였다. 밤새 인큐베이션한후, 접종물/배지를 헤파린 없는 새로운 배지로 교체했다. 4 내지 6일동안 인큐베이션한후, BVDV 감염된 세포를 BVDV에 특이적인 폴리클로날 혈청을 사용하여 면역형광에 의해 검출하였다.
음성 배양물을 냉각시키고 이어서 해동시켰다. 그의 0.2 ml를 BVDV의 부재를 확인하기 위하여 Cte 세포상에서 2차 계대배양하였다.
표 7c: 코 액체중의 바이러스 흘림
Figure 112000025772524-pct00018
코 삼출물을 성장 조각 및 오염물을 제거하기위해 원심분리하였다(1000 g). 상등 액체를 제거하고 0.2 ml를 3개의 세포 배양물 각각에 파종했다. 밤새 인큐베이션후, 접종물/배지를 2 ml의 새로운 배지로 대체했다. 4-6 일동안의 인큐베이션후, BVDV 감염된 세포를 BVDV에 특이적인 폴리클로날 혈청을 사용하여 면역형광에 의해 검출하였다.
표 7d: 그룹 1및 3의 평균 직장 온도
Figure 112000025772524-pct00019
직장 온도를 챌린지 감염후 16일까지 기록하였다. 그룹 1 및 3의 동물에 독성의 BVDV 단리물 #13의 6x106 TCID50를 감염시켰다.
표 7e: 평균 백혈구 세포 계수
Figure 112000025772524-pct00020
EDTA 혈액 세포 샘플을 양쪽 그룹에서 각 동물로부터 챌린지하고 -2 내지 14일 매일 채취하였다. EDTA 혈액 샘플중의 백혈구 세포의 계수는 Sysmex Micro-Cell Counter F800을 사용하여 결정하였다.
표 7f: 혈액 샘플로부터 단리된 BVDV
Figure 112000025772524-pct00021
EDTA 혈액을 챌린지후 10일까지 매일 샘플링했다. 0.2 ml의 혈액을 헤파린을 함유하는 배지(클로팅을 방지하기 위하여 1유니트/ml)와 함께 소 고환(Cte) 세포의 3개 배양물 각각에 첨가하였다. 밤새 인큐베이션한후, 접종물/배지를 헤파린 없는 새로운 배지로 교체했다. 4 내지 6일동안 인큐베이션한후, BVDV 감염된 세포를 BVDV에 특이적인 폴리클로날 혈청을 사용하여 면역형광에 의해 검출하였다.
음성 배양물을 냉동 및 이어서 해동시켰다. 그의 2ml를 BVDV의 부재를 확인하기 위하여 Cte 세포상에서 2차 계대배양하였다.
표 7g: 코 유체중의 흘리는 바이러스
Figure 112000025772524-pct00022
코 삼출물을 성장 조각 및 오염물을 제거하기위해 원심분리하였다(1000 g). 상등 액체를 제거하고 0.2 ml를 3개의 세포 배양물 각각에 파종했다. 밤새 인큐베이션후, 접종물/배지를 2 ml의 새로운 배지로 대체했다. 4-6 일동안의 인큐베이션후, BVDV 감염된 세포를 BVDV에 특이적인 폴리클로날 혈청을 사용하여 면역형광에 의해 검출하였다.
실시예 8 RT-PCR에 의해 히스티딘 코돈 346이 결여되어 있지 않은 CSFV와 C-346-d사이의 분별
CSFV 당단백질 ERNS중의 보존된 RNase 모티프를 코딩하는 RNA 서열이 고도로 보존되어 있다. 모든 공지된 CSFV 서열중에서, 어떤 뉴클레오타이드 교환도 CSFV 알포트 균주의 공개된 서열(Meyers et al., 1987)의 잔기 1387 내지 1416에 상응하는 영역에서 발견되지 않았다. 따라서, 게놈의 보존된 영역으로부터 유래된 올리 고뉴클레오타이드 프라이머를 모든 CSFV 단리물의 검출을 위해 RT-PCR 분석에서 사용할 수있다(도 7 참조). 결과로서, 히스티딘 346을 코딩하는 트리플리트(뉴클레오타이드 1399-1401)의 부재가 적절히 설계된 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석에 의해 검출할 수 있었다. 히스티딘 코돈을 함유하거나 하지않는 보존된 영역을 커버하는 상이한 올리고뉴클레오타이드가 합성되었다. 이들 올리고뉴클레오타이드가 하류 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 ERNS-Stop을 갖는 RT-PCR 반응에서 상류 프라이머로서 사용되었다. 각각 C-346-d, C-WT, C-346-L 또는 C-346-K에 의해 감염된 조직 배양물로부터 정제된 RNA를 주형으로서 사용하였다. 2 ㎍ 열 변성된 RNA의 역전사(92℃에서 2분, 30 pMol 역 프라이머의 존재하에서 11.5 ㎕의 물중의 얼음상에서 5분)를 8 ㎕ RT mix(125 mM Tris/HCl pH 8.3, 182.5 mM KCl, 7.5 mM MgCl2, 25 mM 디티오트레이톨, 1.25 mM의 각각의 dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U의 RNAguard(Pharmacia, Freiburg, Germany) 및 50 U의 슈퍼스크립트(Superscript)(Life Technologies/BRL, Eggenstein, Germany)를 첨가한후 37℃에서 45분간 수행하였다. 역전사를 마무리한후, 튜브를 얼음상에 위치시키고, 30 ㎕의 PCR mix(8.3 mM Tris/HCl, pH8.3; 33.3 mM KCl; 2.2 mM MgCl2; 0.42 mM의 각각의 dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0.17% TritonX 100; 0.03% 소 혈청 알부민; 5 U의 Taq 폴리머라제(Appligene, Heidelberg, Germany) 및 16.7% DMSO)를 첨가했다. 프라이머 Ol H+3이 사용했을 때, 증폭용 반응 mix는 DMSO를 함유하지 않았다. 증폭을 36사이클로 수행하였다(94℃에서 30초; 57℃에서 30초; 74℃에서 45초). 1 ㎕의 증폭 반응을 1% 아가로즈 겔에 적재시키고, 증폭된 생성물을 전기영동에 의해 분리하고, 브롬화 에티듐으로 염색했다. 도 7에 나타난바와 같이, 프라이머 쌍 Ol H-3/Ol ERNS Stop은 코돈 346이 결여된 RNA로부터 유도된 밴드를 특이적으로 증폭시키고, 반면에 다른 두개의 프라이머 배합물경우, 코돈 346을 함유하는 생성물이 증폭되고, 상기 코돈이 결실된 RNA가 주형으로 사용됐을 때 밴드가 관찰되지 않았다.
RT-PCR용 프라이머
Figure 112000025772524-pct00023
도 1: CSFV의 알포트 균주에 의해 발현되는 처음 495개 아미노산
서열 목록은 CSFV의 알포트 균주에 의해 발현되는 처음 495개 아미노산을 나타낸다(Meyers et al., 1989). 상기 균주의 당단백질 ERNS의 하나의 모노머는 Ruemenapf et al.(1993)에 의해 기술된 아미노산 268 내지 494에 상응한다. 식물 및 진균 RNase(Schneider et al., 1993)에 상동성을 보여주는 영역을 나타내는 잔기 295 내지 307 및 338 내지 357이 밑줄쳐져 있다.
도 2: 시험 감염후 동물의 직장 온도 곡선
매일의 직장 온도가 감염전 2일부터 감염후 18일까지 기록되었다. 직장 온도는 플라스미드 pA/CSFV로부터 유래된 바이러스 V(pA/CSFV)(연속선) 또는 플라스미드 pA/C-346-d로부터 유래된 바이러스 V9pA/C-346-d)(점선)로 감염된 그룹의 각 동물에 대해 상술 되어 있다.
도 3: 챌린지 감염후 동물의 직장 온도 곡선
매일의 직장 온도가 챌린지 바이러스 감염후 1-21일에 기록되었다. 치사 투여량의 CSFV 챌린지 균주 Eystrup로 챌린지된 동물을 본 명세서에 상세히 기술된 바와같이 69일전 돌연변이체 C-346-d[V(pA/C-346-d)]로 감염되었었다. 직장 온도 곡선은 CSFV 챌린지 균주 Eystrup로부터의 2x105TCID50으로 챌린지된 각 동물 그룹에 대해 상술되어 있다.
도 4: 시험 감염후 동물의 직장 온도 곡선
매일의 직장 온도가 감염후 0-18째에 기록되었다. 직장 온도 곡선은 C-346-d[V(pA/C-346-d)](점선) 또는 회복된 바이러스 C-346-d/RS[V(pA/C-346-d/Rs)](실선)으로 감염된 두 그룹의 각 동물에 대해 상술되어 있다.
도 5: 챌린지 감염 동물 실험 #2후의 직장 온도
매일 직장 온도를 챌린지 바이러스 감염후 1-10일에 기록하였다. CSFV 챌린지 균주 Eystrup의 치사 투여량(2x105 TCID50)으로 챌린지된 동물을 37일전에 돌연변이체 C-346-d 37로 감염되었었다.
도 6: 실시예 6에 따라 이중 돌연변이체로 처리된 동물의 직장 온도
매일 직장 온도를 돌연변이체 V(pA/C-297-L/346-L)로 챌린지 바이러스 감염전 및 후 기록하였다.
도 7: 실시예 8에 따라 RT-PCR에 의해 히스티딘 코돈 346의 결여가 없는 CSFV 및 C-346-d사이의 분별
a) 프라이머 쌍 Ol H-3/Ol ERNSStop은 실시예 8에 상세히 기술된 바와 같이 코돈 346(C-346-d)의 결여를 갖는 RNA로부터 유래된 밴드를 특이적으로 증폭시킨다. 대조적으로, 상기 결여를 갖지않는 RNA는 상기 프라이머 쌍과 반응하지 않는다(C-WT, C-346-L, C-346-K).
b) 다른 두개의 프라이머 조합물은 코돈 346의 결여를 갖지 않는 RNA(Ol H+2 및 Ol H+3)로 부터 유래된 밴드를 증폭시킨다. 346-결실 돌연변이체 C-346-d로부터의 RNA가 주형으로서 사용됐을 때, 어떤 밴드도 관찰되지 않았다.
<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> Attenuated Pestiviruses <130> Attenuated Pestiviruses - PCT/EP <140> PCT/EP99/03642 <141> 1999-05-27 <150> EP 98110356.7 <151> 1998-06-05 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 494 <212> PRT <213> BVDV Erns deletion at Pos 346 <400> 1 Met Glu Leu Ile Thr Asn Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Ala Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Gln Ala Gly Asn Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Glu Arg Gly Val Ile His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Lys Arg Gly Glu Arg Glu Val Pro Thr Asn Leu Ala Ser Leu Pro 50 55 60 Lys Arg Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn Ser Lys Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Lys Pro Gly Pro Leu Phe Tyr Gln Asp Tyr Lys Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Glu Glu Ala Ser Met Cys 100 105 110 Glu Thr Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Ser Arg Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Cys Ile Asp Gly Cys Ile Ile Val Lys Ser Ala 130 135 140 Thr Lys Asp Arg Gln Lys Val Leu Lys Trp 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Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn Arg Thr Gln Thr Asn Leu 355 360 365 Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380 Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asn Arg Pro Thr 385 390 395 400 Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr 405 410 415 Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 420 425 430 Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gln Asp Thr Ala Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala 450 455 460 Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gln Leu Ser Thr Ala Gly Lys 465 470 475 480 Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495

Claims (56)

  1. 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 상기 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화된 페스티바이러스(pestivirus)를 함유하는 생백신.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 결실 또는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스(CSFV: Classical Swine Fever Virus) 알포트(Alfort) 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하고, 상기 돌연변이는 히스티딘(histidine)에서 히스티딘 이외의 아미노산 치환, 세린(serin)에서 세린 이외의 아미노산 치환, 또는 트립토판(tryptophan)에서 트립토판 이외의 아미노산 치환을 의미하는 것을 특징으로 하는 백신.
  4. 제1항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 백신.
  5. 제1항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 백신.
  6. 제1항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV: Bovine Viral Diarrhea Virus) 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 약독화된 소 바이러스성 설사 바이러스 페스티바이러스를 함유하는 백신.
  7. 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되고, 단, 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 297 또는 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산이 라이신이 아닌 약독화된 페스티바이러스.
  8. 제7항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 페스티바이러스.
  9. 제7항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 페스티바이러스.
  10. 제7항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 페스티바이러스.
  11. 제7항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 소 바이러스성 설사 바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 약독화된 소 바이러스성 설사 바이러스 페스티바이러스.
  12. 당단백질에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되고, 단, 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 297 또는 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산이 라이신이 아닌, 당단백질 ERNS를 코딩하는 핵산.
  13. 제12항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 핵산.
  14. 제12항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화된 핵산.
  15. 제12항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 핵산.
  16. 제12항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 소 바이러스성 설사 바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화된 소 바이러스성 설사 바이러스 핵산.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 함유하는 백신.
  18. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 페스티바이러스를 함유하는, 동물에서 페스티바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  19. 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 것을 특징으로 하는 페스티바이러스의 약독화 방법.
  20. 삭제
  21. 제19항에 있어서, 결실 또는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 방법.
  23. 제19항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화되는 방법.
  24. 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화되는 것을 특징으로 하는 특이적으로 약독화된 백신의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 결실 또는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하는 방법.
  27. 제24항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 방법.
  28. 제24항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화되는 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제1항 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 백신을 페스티바이러스 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간을 제외한 동물에게 적용하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에서 페스티바이러스 감염을 예방 및 치료하는 방법.
  35. 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 것을 특징으로 하는 특이적으로 약독화된 페스티바이러스의 제조방법.
  36. 삭제
  37. 제35항에 있어서, 결실 또는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 존재하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되는 방법.
  39. 제35항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 346번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 히스티딘 잔기의 결실에 의해 불활성화되는 방법.
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 제1항 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 백신을 함유하는 동물에서 페스티바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  46. 삭제
  47. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 동물에서 페스티바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  48. (1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 인간을 제외한 동물 또는 백신접종받은 인간을 제외한 동물로부터 샘플을 얻고;
    (2) 샘플내에서 페스티바이러스의 뉴클레오타이드 서열을 동정하며;
    (3) 백신에 존재하는 ERNS 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 돌연변이를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 상호연관시키고 결실 또는 돌연변이의 부재를 인간을 제외한 동물의 페스티바이러스 감염과 상호연관시키는 단계를 포함하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 페스티바이러스-감염 인간을 제외한 동물을 구별하는 방법.
  49. (1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 인간을 제외한 동물 또는 백신접종받은 인간을 제외한 동물로부터 샘플을 얻고;
    (2) 샘플중에 존재하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 변형된 ERNS 당단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합에 의해, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 비변형된 ERNS 당단백질에는 결합하지 않는 것에 의해 약독화된 페스티바이러스의 변형된 ERNS 당단백질을 동정하며;
    (3) 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합을 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 상호연관시키고 항체 결합의 부재를 인간을 제외한 동물의 페스티바이러스 감염에 상호연관시키며, 단 인간을 제외한 동물 또는 샘플중의 페스티바이러스성 물질의 존재는 다른 방법으로 확립되는 단계를 포함하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 페스티바이러스-감염 인간을 제외한 동물을 구별하는 방법.
  50. (1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 인간을 제외한 동물 또는 백신접종받은 인간을 제외한 동물로부터 샘플을 얻고;
    (2) 샘플중에 존재하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 변형되지 않은 ERNS 당단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합에 의해, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 변형된 ERNS 당단백질에는 결합하지 않는 것에 의해 페스티바이러스의 비변형된 ERNS 당단백질을 동정하며;
    (3) 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 특이적 결합을 인간을 제외한 동물의 페스티바이러스 감염과 상호연관시키고 항체 결합의 부재를 백신접종받은 인간을 제외한 동물에 상호연관시키며, 단 인간을 제외한 동물 또는 샘플중의 페스티바이러스성 물질의 존재는 다른 방법으로 확립되는 단계를 포함하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 페스티바이러스-감염 인간을 제외한 동물을 구별하는 방법.
  51. (1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 인간을 제외한 동물 또는 백신접종받은 인간을 제외한 동물로부터 샘플을 얻고;
    (2) 샘플내 당단백질 ERNS의 RNase 활성의 부재 또는 존재를 결정하며;
    (3) 당단백질 ERNS의 RNase 활성의 부재를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 상호연관시키고 활성의 존재를 인간을 제외한 동물의 페스티바이러스 감염과 상호연관시키는 단계를 포함하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 페스티바이러스-감염 인간을 제외한 동물을 구별하는 방법.
  52. (1) 페스티바이러스 감염이 의심되는 관심의 대상이 되는 인간을 제외한 동물 또는 백신접종받은 인간을 제외한 동물로부터 샘플을 얻고;
    (2) 비변형된 당단백질 ERNS, 또는 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 변형된 당단백질 ERNS에 대한 폴리클로날 항체의 어느 특이적 결합을 동정하며;
    (3) 비변형된 당단백질 ERNS에 대한 폴리클로날 항체의 결합을 페스티바이러스 감염과 상호연관시키고 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 변형된 당단백질 ERNS에 대한 폴리클로날 항체의 결합을 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 상호연관시키는 단계를 포함하는, 제19항 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 특이적으로 약독화된 페스티바이러스를 백신접종받은 인간을 제외한 동물과 페스티바이러스-감염 인간을 제외한 동물을 구별하는 방법.
  53. 당단백질 ERNS에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되고, 상기 돌연변이는 히스티딘(histidine)에서 히스티딘 이외의 아미노산 치환, 세린(serin)에서 세린 이외의 아미노산 치환, 또는 트립토판(tryptophan)에서 트립토판 이외의 아미노산 치환을 의미하되, 단, 297 또는 346번 위치 아미노산이 라이신이 아닌 것을 특징으로 하는 약독화된 페스티바이러스.
  54. 당단백질에 존재하는 RNase 활성이 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 돌연변이에 의해 불활성화되고, 상기 돌연변이는 히스티딘(histidine)에서 히스티딘 이외의 아미노산 치환, 세린(serin)에서 세린 이외의 아미노산 치환, 또는 트립토판(tryptophan)에서 트립토판 이외의 아미노산 치환을 의미하되, 단, 297 또는 346번 위치 아미노산이 라이신이 아닌 것을 특징으로 하는, 당단백질 ERNS를 코딩하는 핵산.
  55. 제19항에 있어서, 결실 또는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하고, 상기 돌연변이는 히스티딘(histidine)에서 히스티딘 이외의 아미노산 치환, 세린(serin)에서 세린 이외의 아미노산 치환, 또는 트립토판(tryptophan)에서 트립토판 이외의 아미노산 치환을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제35항에 있어서, 결실 또는 돌연변이가 당단백질의, 예를들어 클래시컬 돼지 콜레라 바이러스 알포트 균주에 대해 도 1에 기재된 바와 같이, 295 내지 307번 위치 또는 338 내지 357번 위치 또는 다른 페스티바이러스 균주에서 그에 상응하는 아미노산에 위치하고, 상기 돌연변이는 히스티딘(histidine)에서 히스티딘 이외의 아미노산 치환, 세린(serin)에서 세린 이외의 아미노산 치환, 또는 트립토판(tryptophan)에서 트립토판 이외의 아미노산 치환을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
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