HU228471B1 - Methods for detectable labeling of pestiviruses - Google Patents

Methods for detectable labeling of pestiviruses Download PDF

Info

Publication number
HU228471B1
HU228471B1 HU1200537A HUP1200537A HU228471B1 HU 228471 B1 HU228471 B1 HU 228471B1 HU 1200537 A HU1200537 A HU 1200537A HU P1200537 A HUP1200537 A HU P1200537A HU 228471 B1 HU228471 B1 HU 228471B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lys
thr
gly
arg
asp
Prior art date
Application number
HU1200537A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregor Meyers
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmed filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmed
Publication of HU228471B1 publication Critical patent/HU228471B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás pestivirusok [«gyengítésére a glikoprotem-ESNSben lévő ribonukleáz-aktivitás (RNáz-aktivitás) inaktiválásával. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerint legyengített pestivírusok, ilyen pestivírusok előállítására szolgáló nnkleinsavak, valamint a találmány szerinti legyengített pesti vírusokat tartalmazó vakcinák és gyógyszerkészítmények. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti legyengített vírusok és patogén vírusok megkülönböztetésére szolgáló eljárások.
háttere
A pestivirusok gazdaságilag jelentős, állatokban világszerte sok országban előforduló betegségek kórokozó ágensei. Jelenleg ismert, vírusizolá.tumokat. három. különböző fajba csoportosítjuk,, amelyek együtt egy nemzetséget alkotnak a Flavivíridae -családban.
I. Marhában előforduló hasmenés (diarrhoea) vírusa (BVDV) marhában, vírusos hasmenést (BVD) és nyálkabetegséget (MD) okoz [Baker, J. Am. Vet. Med. Assoc. 190. 1449-1458 (1987); Moennig and Plagemann, Adv. Vírus Rés. 41, 53-91 (1.992); Thiel et al.., “The Pestiviruses’y “Fields Virology* c. könyvben, szerk. Fields, B. N, et ai., Líppincott-Raven, Philadelphia, 1059-1073. old. 11996)1,
Π. Klasszikus sertésláz vírusa (CSFV). melyet korábban sertéskolera-virusnak is neveztek, felelős a klasszikus sertéslázért (CSF) vagy serÉéskoleráért (HC) [Moennig and Plagemann, Adv. Vírus Rés. 41, 53-91 (1992); Thiel et al., “The Pestivirusesri “Fields Virology” c, könyvben, szerk. Fields, B. N. et al., Lippineott-Raven, Philadelphia, 1059-1073. old. (1996) (1996)),
HL Border-befcegség vírusa (BDV), amely tipikusan sertésben fordul elő és border-betegséget (BD) okoz. A szímptömák hasonlóak a. marhában előforduló MD-hez, és leírták annak előfordulását bárányok mé bében fellépő BDV-fertőzés után (Moennig and Plagemann, Adv, Vírus Rés, 41, 53-91. (1992); Thiel et al, The Pestiviruses”, Pields Virology” c, könyvben, szerk. Fielás, B. N. et ak, tippmeott-Raven, Philadelphia, 1059-1073. old. (1996) (1996)],
Becher és munkatársai (Virology 209. 200-206 (1995)1 vagy mások létrehozták a pes.tivírusok. egy alternatív osztályozását.
A pestivírusok kisméretű, becsomagolt vírusok, amelyek egyszálú, pozitív polaritása RNS-genomot tartalmaznak, amelyből hiányzik az S-’-végi cap-szekvencia és a 3’-végí poii(A)-szekven.cía. A virusgenom körülbelül 4000 amino savból álló polifehérjét kódol, a végső hasítási termékek ko- és poszttranszlációs processzálás útján jönnek létre celluláris és vírusproteázok közreműködésével. A vírusíbhérjék polifehérjébe rendeződnek az alábbi sorrendben: NH2-N^ö~O-Brns-Eí-E2-p7-NS2-VS3-NS4A-NS4B-NS5-NS5B-COOH (Rice, “The Pesnviruses”, “Pields Virology e. könyvben, szerk. Fíelds, B. N. et ak, Líppincott-Raven, Philadelphia, 931-959. old. (19961). Protein-C és az B^-,. El- és E2-glíkoproteinek alkotják a pestívírus-virion strukturális komponenseit (Thiel et ak, d. Virol. 65, 4705-4712 (1991)1. Azt találták, hogy E2 és kisebb mértékben ERNS képezi az antitest-semlegesítés célpontjait (Donis et ak, J. Gén. Virol, 69, 77-86 (1998); Paton et ak, Virology 190, 763-772 (1992); van Rijn et al., d. Gén, Virol. 74, 2053-2060 (1993); Weiland et ak, J. Virology 64, 3563-3569 (1990); Weiland et al., d. Virology 66, 3677-3682 (1992)]. Az ERNS-höl hiányzik a membrán-horgony, és jelentős mennyiségben szekretálódik a fertőzött sejtekből; leírták, hogy ez a fehérje RNáz-aktiviíással rendelkezik (Hulst et al,., Virology 200, 558-565 (1994); Schneiáer et al., Science 261, 1169-1171 (1993); Wlndisch et al., J. Virol. 70, 352-358 (1996)]. Ezen enzim?oan.<s/?A?;
aktivitás funkciója a virális életciklusban jelenleg ismeretlen. CSFV-vakcínatŐrzs esetén leírták az RNáz-aktivitás kísérleti megszűntetését belyspecífikus mutagenezis alkalmazásával, amely citopatogén vírust eredményezett, amelynek növekedési tulajdonságai sejttenyészetben megegyeztek a vad típusú vírussal (Hulst et al.» J. Virol. 72, 151-157 (1998)], Az enzim aktívi tás két aminosav-szakasz jelenlététől függ, amelyek konzervatívak pestivirus-:ERNS-ben és. különböző ismert növényi és gombaeredetü RNázokban. Az említett mindkét konzervatív szekvencia egy hísztídint tartalmaz (Schneíder et ah, Science 261, 1169-1171 (1993)].. A CSFV-vakcinatörzsből származó EXNS-fehérjében ezen aminosav cseréje lizinre az RNáz-aktivitás megszűnését eredményezi ÍHulst et al., 3. Vírol. 72. 151-157 (199-8)). ílven mutációk bevitele a CSFV-vakeínaiőrzs genomjába nem befolyásolta a vírus életképességét vagy növekedési tulajdonságait, viszont olyan vírushoz vezetett, amely enyhén citopatogén fen-otípust mutatott (HulstetaL, J. Vírol. 72, 151-157 (1998)]..
Előállítottak legyengített vagy elpusztított vírusokat, vagy heterológ expressziós rendszerben expresszált vírusfehérjéket tartalmazó vakcinákat CSFV~re és BVDV-re, és jelenleg ezeket alkalmazzák. Élő vakcinaként alkalmazott, említett vírusok gyengítésének strukturális alapja nem ismert. Ez előre nem látható visszafejlődések kockázatához vezet a vakeináciöt követő reverz mutáció vagy rekombináció által.. Másrészt ínaktíváit vakcinák vagy heterológ expresszált vírusfehérjék (alegységvakcinák) hatékonysága immunitás índukál'ására inkább alacsony .
Gyengítés alapjaként definiált mutációkat tartalmazó, élő vakcinák általában lehetővé tennék a jelenleg alkalmazott vakcina-generáció hátrányainak kiküszöbölését. Pesti-vírusokban jelenleg nem állnak rendelkezésre potenciális célpontok gyengítő mutációkra.
Az említett gyengítő mutációk további előnye molekuláris egyediségükben
Ui-i n/?.A3 van, amely lehetővé teszi azok alkalmazását megkülönböztethető jelölőként gyengített pestivírusokban, valamint lehetővé teszi azok megkülönböztetését a természetes körülmények között található pesti vírusoktól.
Pestivírus-fertőzések hatékony és biztonságos valamint detektálható profilaxisának és kezelésének jelentősége miatt határozott igény van élő és specifikusan legyengített vakcinákra» amelyek nagy hatékonysággal képesek immunitást indukálni, valamint igény van definiált alapon létrehozott gyengítésre, amelyet továbbá meg lehet különböztetni patogén pestivírusoktól.
,4 ia/á/mány fe/rása
Az előbbiekben ismertetett technikai probléma megoldását a leírásban közölt és az igénypontokban jellemzett megvalósításokkal értük el.
Meglepő módon, azt találtuk, hogy pestívírusokat specifikusan le lehet gyengíteni glíköproteín-ER^s-hen lévő ribonukleáz-aktivitás inaktiválásával.
A legyengített pestivirusok most már nagy hatékonyságú, immunogenitást biztosító, élő vakcinaként alkalmazhatók.
Ezért egy itt közóit egyik vonatkozásban egy pestivírust tartalmazó, élő vakcinát bocsátunk rendelkezésre, amelyben a. glikoprotein-ERNS-ben lévő ribonukleáz-aktivitás inaktiválva van.
A „vakcina” kifejezés az itt használt értelemben olyan gyógyszerkészítményre utal, amely legalább egy, ímmunolögí&ilag aktív komponenst tartalmaz, amely immunválaszt képes indukálni, és lehetőség szerint, de nem. szükségszerűen tartalmaz egy vagy több további komponenst, amely az aktív komponens. immunológiai aktivitását képes fokozni, A vakcina tartalmazhat gyógyszerkészítményekben tipikusan alkalmazható, további komponenseket. Egy vakcina ímmunoiőgiaílag aktív komponense tartalmazhat élő szervezeteket eredeti formájukban vagy gyengített szervezet formájában, úgynevezett módosított élő vakcinaként (MLV), vagy olyan szervezetek formájában, melyek megosnuxíi* felelő módszerekkel inaktiválva vannak, úgynevezett elölt vakcinaként (KV). Egy vakcina immunológiáiig aktív komponensének másik formája tartalmazhat a. szervezetből származó megfelelő elemeket (alegységvakcinák), amely elemekhez egyrészt a teljes szervezet elpusztításával juthatunk, vagy ilyen szervezetek tenyészetben való növesztésével és azt követő tisztításával# amely a kívánt struktúrá(ka)t eredményezi, vagy szintetikus eljárással, alkalmas rendszer, például baktériumok, rovarok, emlősök vagy más fajok megfelelő manipulálásával. ezt követően izolálás! és tisztítási eljárásokkal, vagy ilyen szintetikus eljárások indukálásávai az ilyen vakcinára szoruló állatban úgy, hogy alkalmas gyógyszerkészítményeket alkalmazunk genetikai anyag közvetlen bevitelére (polmukleotíd-vakcínáció). Egy vakcina tartalmazhat egy vagy egyidejűleg egynél több, fentebb leirt elemet.
Immunválasz tokozására képes további komponenseket együttesen, adjuvár.soknak nevezünk, ilyenek például aluminium-hidroxid, ásványi és -egyéb olajok vagy a vakcinához adagolt járulékos molekulák vagy ilyen, további, komponensekkel előidézett, megfelelő indukálás után a test által termelt járulékos molekulák, például interferonok, interleukínek vagy növekedési faktorok.
A „gyógyszerkészítmény” lényegében egy vagy több olyan alkotórészből áll, amelyek képesek annak a szervezetnek fiziológiai, például immunológiai funkcióit módosítani, amelynek beadjuk, vagy amely szervezetben él vagy felszínén van, például antibiotikumok vagy antiparazíükumok, valamint más hozzáadott alkotórészből áll abból a célból, hogy bizonyos más célokat elérjünk, például egyedi jellegzetességek kezelése, sterilitás, stabilitás, a készítmény beadhatösága enterális vagy parenterálls utakon, például orálisan, intranazálisan, intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, intraderrnálisan vagy más alkalmas úton, tolerancia a beadás után, szabályozott felszabadulást biztosító tulajdonságok.
♦ * « V · * »>* « * * « «* ♦
Találmány szerinti vakcinán ériünk olyan fentebb definiált vakcinát, amelyben egy vagy több, immunolögiaílag aktív komponens pestivírus vagy pesűvirus-ereáetű.
Az „élő vakcina5’ kifejezés olyan vakcinára utal, amely élő, különösen, virális élő aktív komponenst tartalmaz.
A „pestivirus” kifejezés· a leírásban valamennyi pestívírusra utak melyeket az jellemez, hogy ugyanahhoz a nemzetséghez tartoznak, mint BVDV, CSFV és BDV a Plavivirídae-családban, és glikoproteÍn-SR^s-t expresszálnak. Természetesen. a kifejezésen értünk minden olyan pestivirust, melyet Becher és munkatársai jVirology 209, 200-206 {1995)] vagy mások jellemeztek; és amelyek glikoproteln-ERNS-t expresszálnak, Az „RNáz-aktivitás” kifejezés a leírásban azt jelenti, hogy a glikoprotein-RNS-t. képes hidrolizálni,
Megjegyzendő, hogy a glikoprotein-EC) kifejezés gyakran szerepel közleményekben gbkoproíein-ERRS szinonimájaként.
A „glikoproteinben lévő RNáz-aktivitás inaktiválása’ kifejezés arra utal. hogy módosított glikoprotein-S:^8 nem képes vagy csökkent mértékben képes RNS-t hidrolizálni.. a módosítatlan giikoprotein-ERÍ5S vad típusához viszonyítva.
Glikoprotein-ERNfe-ben lévő RNáz-aktivitás inaktiválása elérhető a glikoproteínben lévő legalább egy aminosav deléciöjáv&i és/vagy mutációjával, amint azt a leírásban bemutatjuk, valamint Hulst és munkatársai jJ. Virol. 72, 151-157 (1998)] leírták. Tehát a találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik élő vakcinák, amelyekben a glikopro tein-gRHS„ben lévő RNáz-aktivitás a gükoproteinben lévő legalább egy aminosav deléeiőjával és/vagy mutációjával inaktiváiva van, kimutatták, hogy a glíkeproteín~ERNS körülbelül 97 kD méretű, diszulüd-kőtéssel kapcsolódé homodimer, amelyben az egyes monomerek 227 aminosavból állnak, ami megfelel a CSFV-poíífehérte 268-494. amínosavainak, '? 03 U s/SSA
Rümenapf és munkatársai által leírtak szerint kJ, Virol. 67, 3288-3294 (1993)]. Az 1, ábrán csak hivatkozás céljából,, bemutatjuk az első 495 amínosavat, ahogyan a CSFV-Alfort-törzs expresszálja.. A. CSFV Aliért-törzs genomíális szekvenciája, rendelkezésre áll a GenBank/EfoBL-könyvtárham J0435S. nyilvántartási számon; ezzel párhuzamosan a CP7-BVDV-törzs aminosav-szekvenciája. elérhető a GonBank/EMBL-könyvtárban 3363479. nyilvántartási számon). A glikoprotein-ERNS-ben két aminosav-régíó nagymértékben, konzervatív, valamint néhány növényi és gombaeredetű RNáz-akíivitást mutató fehérjében is [Schneíder et ah, Science 261, 1169-1171 (!993)j. Ez a két régió különösen jelentős az RNáz enzimaktivitáshoz. Az első régió a virus-pofifehérjében lévő, 296-307. helyzetben lévő amínosavakből áll, és a második régió a 338-357. aminosavakböi áll, ahogyan az 1, ábrán a. CS'FV-Aífort-törzsre bemutatjuk (számozás a CSFV-Alfort-törzs közölt, levezetett aminosav-szekvenoiája szerint történt; Meyers et ab, Virology 1.71, 555-567 (1989H. Az RNáz-aktivitáshoz különösen jelentős, fentebb említett aminosavak semmiképpen nem korlátozódnak a CSFV-Alíbrt-törzs esetén definiált pontos helyzetre, egyszerűen szemléltetés céljából mutattuk be ebben a helyzetben vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő, előnyös aminosavakat, ahogyan SVDV-ben, BDV-ben is és általában pestívírusokban megtalálhatók, mivel általában, ezek nagymértékben konzervatívak.. CSFV-Aifort-törzstöl különböző pestiviru sokra az előnyös aminosavak számozása gyakran eltér, de pestivirusok molekuláris biológiája területen jártas szakember könnyen képes azonosítani ezeket az előnyös aminosavakat a glikoprotein nagymértékben konzervatív aminosavaihoz viszonyított helyzetük alapján. Ez adott példában, a CSFV-Alfort 346, helyzete megegyezik a BVDV-cp7-törzs 349. helyzetével.
Következésképpen egy itt közölt előnyösebb megvalósítási mód egy itt rendelkezésre bocsátott olyan vakcina, amelyben az inaktiválő deléciők és/vagy
JíiiUU/RAS.
ff *ff
X » ff V ♦ ff ff * • •ff ffff'ff
A ff mutációk az említett glikoproteinnek a példaképpen az 1. ábrán a CSFV-Alíbrt- törzsre leírt 295-307. helyzetében és/vagy 338-357. helyzetében, lévő amino savak, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő amino-savaknál vannak.
Egy nagyon előnyös megvalósítás azt közli, hogy a giikoprotein 346,. aminosav-helyzetéfoen delécióvaJ vagy mutáoiövai előidézett, BNáz-aktívás inaktiválása különösen hasznos élő vakcinákhoz vezet. Ezért a találmány itt rendelkezésre bocsátott olyan vakcinákra, vonatkozik, amelyekben az ENáz-aktivitás az említett glikoproteinnek a példaképpen az 1. ábrán a CSFV-Alferi-törzsre leirt 346, helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav delé-ciójával vagy mutációjával van inaktiválva.
A jelen leírás bemutatja, hogy pesti vírusok életképesek, és ENáz-akti vitással nem rendelkező ERNS-fehésjét kódolnak, ha. a. vitális polifeh-érje- 346, helyzetében, lévő hiszti dint deletáljuk [számozás a CSFV-Alfort/Tübingen-törzs közölt, levezetett aminosav-szekvenciája szerint történt; Meyers et al., Virology 171, 555-567 (198915 amely hísztidín megfelel az ESNS-RNáz egyik konzervatív, feltételezett aktív helyének. A találmány szerinti megoldásban bemutatjuk, hogy BVD-pestivírus-bán lévő ERNS-hen a megfelelő hisztidin (349. helyzet, a számozás a GenBank/EMEL-könyvtárban lévő BVDV-CP7 szekvenciája szerint törtöm, nyilvántartási száma; U634791 deléciőia. olyan életképes vírust eredményez, amelyben az E^^-glíkoprotein elvesztette az RNáz-aktívítását, Egyik aminosavat másikra változtató pontmutáciőkkal szemben egy deléeiös mutáns általában sokkal stabilabb visszaalakulá.s tekintetében. Sertések fertőzése patogén, ezen deléciőt tartalmazó E^S-t expresszaló CSFV-Alfert/Tübingen-mutánssal nem vezet lázhoz vagy más, CSFV-fertőzésekre tipikus klinikai jelekhez, míg vad típusú vírusfertőzés lázat, hasmenést, anorexiát, apátiát, B-sejtek kimerülését és a központi idegrendszer rendellenességeit eredményezi. Ezeket a vasi ·o/í-a::
·*♦* sertéseket haldokló állapotban elpusztítottuk, amikor súlyos vérzések voltak a bőrben és belső szervekben a fertőzés utáni 14, napon, -A mutánssal fertőzött sertések nem mutattak sem virémiát, sem S-sejt-kimerülést, a fertőzés utáni 3., 5,, 7,, 10. és. 14. napon, míg CSFV-t könnyen lehetett Izolálni a vad típusú vírussal oltott sertésekből származó vérmintákból. A deléciós mutáns látszólag replikálödott az állatokban, melyet semlegesítő antitestek indukálődása jelzett (lásd 3. példát, 3,e táblázatot). A mutáns vírusra adott immunválasz kielégítő volt ahhoz, hogy lehetővé tegyen túlélést nagymértékben patogén CSFV-Eystrup-törzs IKörng, “Vírus dér klassischen Schvzeinepest Untersuobungen zúr Pathogenese und zűr Induktlon emer protektiven Immnnan.twortA Dissertation, Tierárztliohe Hochschuie Hannover, Németország (19947 2 χ IO5 TCIDso letáiis fertőzése esetén, amely törzs heterológ az Alfort-törzsre nézve. Továbbá a tesztelt állatok nem mutattak tipikus CSFV-fertözésre utaló jeleket, például lázat, hasmenést, vérzéseket, B-sejt-kimerülést vagy anorexiát a fertőzés után. Ezek az adatok alátámasztják azt, hogy sertések fertőzése a deléciós mutánssal olyan immunválaszt Indukál, amely elegendő súlyos fertőzéssel szembeni védelemre.
Ennélfogva egy itt közölt legelőnyösebb megvalósítás a találmány szerinti olyan vakcinákra vonatkozik, amelyekben az RNáz-aktivitás a ghkoproteinnek például az 1. ábrán a CSFV-Aifőrt-törxsre leírt 346. helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hísztidín deléciójával van inaktiválva.
Egy itt közölt további legelőnyösebb megvalósítás a találmány szerinti olyan BVDV-vakeinákra vonatkozik, amelyekben az RNáz-aktivitás a giikoprolemnek például az 1. ábrán a CSFV-Alfert-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más BVDV-törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin deléciójával van ínaktiválva.
Egy itt közölt másik vonatkozásban a találmány olyan legyengített pesti7Ö8U -3 /852 vírusokra vonatkozik, amelyben a. glíkoprotein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás a glíkoproteinfoen lévő legalább egy aminosav deléclöiávaí és/vagy mutációjával inaktíválva. van, azzal a fenntartással., hogy a glikeproteirmek például az 1, ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 297, és/vagy 346, helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosav líziniol eltérő, Hulst és munkatársai 1998-ban leírtak olyan rekombináns pestivírust, amelyben a giikoproteln 297. és/vagy 346. aminosav-helyzetében lián van. Ezek a konkrét pestivirusok citopatikus hatást mutattak sertésből származó vesesejtekben. Egészen mostanáig teljesen ismeretlen volt az ERNS enzimaktívitás inaktiválására következtében létrejövő, meglepő és innovatív gyengíthetöségi tulajdonság.
Egy itt közölt előnyös megvalósítás a vakcinák esetében lentebb említett okok miatt itt .rendelkezésre bocsátott olyan, pestívírusokra is vonatkozik, amelyekben, az EKáz-aktivitás a giikoproteinnek például az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 295-307. helyzetében és,/vagy 338-357. helyzetében lévő amínosavak, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosavak öeléciójával és/vagy mutációjával van inaktiválva.
Egy itt közölt előnyösebb megvalósítás a fentebb a vakcinákra említett okok miatt olyan pestivírusokra is vonatkozik, amelyekben az R Máz-aktivitás a giikoproteinnek például az 1, ábrán a CSFV-AIfort-törzsre leírt 346, helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő 'helyzetben lévő aminosav deléciójáv&l vagy mutációjával van inaktiválva.
Egy itt közölt legelőnyösebb megvalósítás a fentebb a vakcinákra említett okok miatt olyan pestívírusokra Is vonatkozik, amelyekben az említett RNáz-aktivitás a giikoproteinnek például az 1, ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 346, helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hísztidín deléciójáv&l van inaktíválva.
Egy további itt közölt legelőnyösebb megvalósítás olyan. BVDV-pestivíru70 SU Ü / SAS « « « sokra vonatkozik, amelyekben az említett RNáz-aktivitás a glikoproteinnek például az 1. ábrán a CSFV-Alfort-tőrzsre leirt 346. helyzetében, vagy más BVDV-törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hísztidín deléciójával van inakti válva,
A legyengített pestivirusok és a találmány szerinti vakcinák hatóanyagai könnyen, elöáilithatók nukleinsav-módosításra szolgáló rekombináns technikák alkalmazásával, amelyek glik'oprotéi:n-ERNS-ben mutáns amínosav-szekvencia expressziőját eredményezik. Ezért a találmány egy itt közölt további szempont szerint glikoproíein-E^M kódoló olyan nukleinsavakra vonatkozik, amelyekben a glikoproteinben lévő RNáz-aktivitás a glikoproteinben. lévő legalább egy aminosav deléciójával és/vagy mutációjává; ínaktiválva van, azzal a fenntartással, hogy a glikoproteinnek a példaképpen az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt. 297. és/vagy 346. helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosav lizintől eltérő.
Egy itt közölt előnyös megvalósítás fentebb említett okok miatt itt rendelkezésre bocsátott olyan nukleinsavakra vonatkozik, amelyekben az RNáz-aktivitás az említett glikoproteinnek a példaképpen az 1, ábrán a CSFV- Alfort-törzsre leírt 295-307, helyzetében és/vagy 333-357, helyzetében lévő aminosavak, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosavak deléciójával és/vagy mutációjával van ín akti válva.
Egy itt közölt, előnyösebb megvalósítás a fentebb a vakcinákra említett okok miatt itt rendelkezésre bocsátott olyan nukleinsavakra. vonatkozik, amelyekben az RNáz-aktivitás az említett glikoproteinnek a példaképpen az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törz'sre leírt 346. helyzetében levő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciójával vagy mutációjával van inaktiválva.
Egy itt. közölt legelőnyösebb megvalósítás itt rendelkezésre bocsátott olyan a u/sv ♦ ♦X nukleínsava-kra. vonatkozik, amelyekben az RNáz-aktivitás az említett glikoproteinnek például az 1, ábrán, a CSFV-Alfort-torzsre leírt 346. helyzetében., vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidín delécíójával van inaktiválva.
Egy itt közölt további legelőnyösebb megvalósítás olyan BVDV-uuklemsavakra vonatkozik, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoproteinnek a példaképpen az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más BVDV-törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő bisztidin delécíójával van inaktiválva.
Nukleotidok, például DNS vagy RNS, szintén alkalmasak DNS-, RNSés/vagy vektor-vakcinák előállítására. Ezekben a. vakcinákban a nukleotídokat vagy közvetlenül adják be állatnak,vagy közvetve, az eredeti vírustól különböző vektorokon keresztül. Nukleotid-vakemák és vektor-vakcinák szakember a számára jól ismertek, és továbbiakban nem. tárgyaljuk, ezeket.
Egy további itt közölt szempontból a találmány vonatkozik a találmány szerinti nukleínsavak nukleotid- és/vagy vektor-vakcinák előállítására való alkalmazására.
Az itt közölt vakcinák, legyengített pestivirusok és/vagy nukleínsavak különösen alkalmasak gyógyszerkészítmény előállítására.
Következésképpen, egy további itt közölt szempontból a találmány vonatkozik egy itt rendelkezésre bocsátott vakcinát és/vagy itt rendelkezésre bocsátott pestivírust és/vagy itt rendelkezésre bocsátott uukleotid-szekvenciát tartalmazó gyógyszerkészítményekre.
Egy ilyen gyógyszerkészítmény kizárólag bemutatás céljából megadott példája a következők szerint készíthető el: Egy fertőzött sejttenyészet felülhaszérumból származó album.in.nal) keverjük, és azután a keveréket líonüzálúszóját egy stabilizátorral (például spermldinnel és/vagy BSA-val, azaz marvaum juk. vagy más módszerrel dehidratáljnk. Vakeinálás előtt a. keveréket azután vizes oldatokkal (például sóoldattal; PBS-el, azaz foszfát-pufíerolt sóoldattal) vagy nem-vizes oldatokkal (például olajos emulziókkal, alumínium-alapú adjuánssal) rehidratáljuk.
A találmány tárgya egy további szempont szerint eljárás pestivirusok legyengítésére. A találmány egyedülálló és várakozáson felüli eljárást bocsát .rendelkezésre pestivirusok Ír-gyengítésére, amelyre az jellemző, hogy a glikorotein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitást ínaknváljuk.
A specifikusan gyengített pestivírusok különösen alkalmasak vakcinák preparálására. Ezért a találmány tárgyát képezik egy további szempont szerint eljárások specifikusan legyengített pestivirus-vakcinák előállítására, melyeket az jellemez, hogy a gliköproteín-ERNS-ben lévő ENáz-aktivitás inaktiválva van,
A glikopTOtein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás inaktiválása meglepő és új módszert biztosít pestivírusok detektálható jelölésére. A találmány rendelkezésre bocsát egy eljárást pestivírusok, detektálható jelölésére, amelyre az jellemző, hogy a gIikoproiein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitást maktiváljuk, Ez a jellemző·, az RNáz-aktívítás hiánya a találmány szerinti pestivírusokban levő glikoproteinERNS-bens teszi lehetővé ezen pestivirusok detektálható jelölését. Jelölt és jelöletlen pestivírusok vagy pestivírussal fertőzött sejtekből testfolyadékokba, székrotált BRNS egyértelműen megkülönböztethető a glikoprotein.-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás hiánya vagy megléte alapján, izolálás és ilyen, enzímaktivásra való vizsgálat után.
Glikoproteín-ERNS-ben lévő RNáz-aküvitásukban delécióval és/vagy mutációval in aktivált pestivírusok esetében számos más technikát lehet alkalmazni. Ilyen pestívirusokat könnyen lehet detektálni ilyen deléeiök és/vagy mutációk eredményeként kialakult strukturális következmények miatt. Például a megváltoztatott ghkoproteín-ERNö nukleínsav-szekvenciájának szekvencia
768114 M2
eltérései nukieínsav-szekvenálő technikák vagy PC'R-technikák (polimeráz láncreakció), alkalmazásával detektálhatok, a 8. példában bemutatottak szerint; a megváltoztatott fehérjeszekveneíát olyan specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával lehet detektálni, amelyek nem képesek felismerni az eredeti fehérjéket. Fordítva, a megváltoztatott és ezáltal strukturálisan jelölt fehérjéket is lehet detektálni olyan specifikus monoklonális antitestek kötődésének hiányával, amelyek az eredeti glik.oprotein.-ERNS-fehé.rjéket képesek felismerni azzal a kikötéssel, hogy pestivirusok jelenléte más okra vezethető vlszsza. És természetesen, a jelölt vírusokban lévő RNáz-aktivítást megszüntető deléciók. és/vagy mutációk eltérő immunválaszt váltanak ki állatokban, jelöletlen pestivírus fertőzés eredményeként létrejött válaszokhoz viszonyítva.
A találmány előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárások biztosítása specifikusan legyengített pestivirus-vakcínák előállítására, valamint eljárások biztosítása pestivirusok találmány szerinti detektálható jelölésére, amelyek a giikoprotein-ER?ÍS inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben az R'Náz-aktivitást a. giikoprotein. ben lévő legalább egy amínosav deiéeiójával és/vagy mutációjával inaktiváljuk.
A találmány előnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárások biztosítása specifikusan gyengített pestivírus-vakcinák előállítására, valamint eljárások biztosítása pestivirusok találmány szerinti detektálható jelölésére, amelyek a glikoproteín-ER^s inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben a giikoprotein például az 1, ábrán a CSFV-Alfort-íörzsre leírt 295-307. helyzetében és/vagy 338-357. helyzetében lévő amínosavaknál vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosa.va.k.ná.1 deléciót és/vagy mutációt hozunk létre.
A találmány nagyon előnyös megvalósítási módja szerint, a. találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárások biztosítása specifikusan iegyen';SSV 4/SAS * φ * * φφ gített. pestivirus-vakcinák előállítására, valamint eljárások pestivírusok találmány szerinti detektálható jelölésére, amelyek a glikoprotein-ERNS inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben az RNáz-aktivitást a glikoprotein például az 1, ábrán a CSFV-Alfort.-törzsre leírt 346. helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciojával vagy mutációjával inaktívátjük.
A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja, szerint, a találmány tárgya. valamennyi vonatkozásában eljárások biztosítása specifikusan gyengített pestivírus-vakolnák előállítására, valamint eljárások biztosítása pestivírusok. találmány szerinti detektálható jelölésére, amelyek a glíkoproteín-ERNS inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben az RNáz-aktivitást a glikoproteínnek például az 1. ábrán a CSFV-Aífort-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin deléciojával inaktíváljuk,
A jelen találmány közöl olyan vakcinákat és más gyógyszerkészítményeket, amelyek különösen hasznosak pestivirus-fértőzések. megelőzésére és kezelésére állatokban. Ennélfogva, a. találmány egy itt közölt további szempont szerint vonatkozik állatokban pestivirus-fértőzések megelőzésére és kezelésére szolgáló eljárásokra, ahol a. találmány szerinti vakcinát vagy gyógyszerkészítményt adunk be ilyen megelőzésre vagy kezelésre szoruló állatnak.
Egy további szempont szerint az itt közöltek vonatkoznak olyan specifikusan legyengített pestivírusok előállítására szolgáló eljárásra, amelyekre az jellemző, hogy a glikoprotein-£RNS~ben lévé RNáz-aktivitás inaktiválva, van.
Egy másik itt közölt szempont szerint vonatkozik olyan, specifikusan legyengített pestivírusok előállítására, szolgáló eljárásra, amelyekre az jellemző, hogy a glikoprotcin-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás ínaktiválva van.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárás specifikumán gyengített pestivírusok előálh?C3 · η/?·.?·.;:
fására, valamint eljárás a találmány szerinti specifikusan jelölt pestívírusok előállítására, amelyek a glikoprotein-ERNS inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben az RNáz-afctivitást. a ghkoproteinben léve legalább egy aminosav deléciójával és/vagy mutációjával inaktiváljuk.
A találmány előnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárás specifikusan gyengített pestívírusok előállítására, valamint eljárás a találmány szerinti, specifikusan jelölt pestivírusok előállítására, amelvek a gIikoproteín~ERNS inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben a glikoprotein például az 1. ábrán a CSFV-AIfort-törzsre leírt 295-307. helyzetében és/vagy 338-357. helyzetében levő amino savaknál, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosavaknál deléciőt és/vagy mutációt hozunk létre,
A találmány egy nagyon előnyös megvalősitásl módja szerint, a találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárás specifikusan legyengített pestivírusok előállítására, valamint eljárás a találmány szerinti specifikusan jelölt, pestivírusok előállítására, amelyek a glikoprotein-ERN* inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben az RNáz-aktivitást a glikoprotein például az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciójával vagy mutációjával inaktiváljuk.
A találmány egyik legelőnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya valamennyi vonatkozásában eljárás specifikusan gyengített pestívírusok előállítására, valamint eljárás a találmány szerinti -specifikusan jelölt pestívírusok előállítására, amelyek a gkköprotein-ERNS inaktiválására vonatkozó eljárások, amelyekben az RNáz-aknvítást a glikoprotein például az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében., vagy m-ás törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin deléciójával inaktiváljuk.
7Í5S1 iV?.A£
Az itt közölt vakcinák és más gyógyszerkészítmények alkalmasak pestivírus-fertőzések megelőzésére és kezelésére állatokban.
Tehát az irt közölt egy szempontból a találmány egy itt közölt vakcina állatokban pestivirus-fertőzés megelőzésére és kezelésére való alkalmazására vonatkozik. Egy további szempont szerint a találmány egy rendelkezésre bocsátott itt közölt gyógyszerkészítmény állatokban pesti vírus- fertőzés megelőzésére és kezelésére való alkalmazására vonatkozik.
Az itt közölt pestivírusok és/vagy nukieinsavak egy gyógyszerkészítmény vagy vakcina hasznos hatóanyagai. Ezért egy további szempont szerint az itt közöltek egy rendelkezésre bocsátott találmány szerinti pestivirus és/vagy nukleinsav vakolna vagy gyógyszerkészítmény előállítására, előállítására való alkalmazására vonatkoznak.
A fentebb említettek szerint, a glíkopröteín~ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás inaktiválása meglepő és új módszert biztosított pestivlrusok jelölésére.
Az itt közöltek egyik vonatkozásának következményeként a találmány vonatkozik a találmány szerinti detektálhatóan jelölt pestivírusok és jelöletlen, esetlegesen patogén pestivírusok megkülönböztetésére szolgáló eljárásokra, Ilyen eljárások különösen hasznosak jelölt pestivlrusok hatékonyságának nyomon követésére állatokban. Vakcinával kezelt állat jelölésre pozitívnak bizonyul, miután mintát vettünk ilyen állatból és vizsgálatot végeztünk a jelölőre, Jelöletlen állatokat, és különösen pestívírusra pozitívnak bizonyuló, jelöletlen állatokat azonnal el lehet választani, izolálni vagy levágni, hogy megszüntessük patogén fertőzés más állatokra való átterjedésének fenyegető veszélyét,
A jelen találmány rendelkezésre bocsát egy eljárást detektálhatóan jelölt pestivírusok előállítására, amelyekre az jellemző, hogy glikoprotein-ERNS~hen lévő RNáz-aktivitás ínaktivált. Ez a. tulajdonság, a glikoprotein-ERK~-ben lévő RNáz-aktivitás hiánya az itt rendelkezésre bocsátott pestivírusokban lehetősé·· ?0»U4/firt2 get. nyújt ezen pestivirusok detektálható jelölésére. Ennek eredményeként a jelölt és jelöletlen pestivírusokat egyértelműen meg lehet különböztetni a ghkoprotein~ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás hiánya vagy megléte alapján, izolálás és ilyen, enzímakti vitásra való vizsgálat után. Ilyen enzímakti vitás meglétének. vagy hiányának meghatározását a kérdéses pestivírust vagy abbéi származó anyagot tartalmazó mintában standard módszerek szerint végezzük, például a 2. példában leírtak szerint vagy Húst és munkatársai által leírtak szerint (Virology 200. 558-565 (1994}]..
Ennélfogva egy itt közölt előnyös megvaíösitá.s vonatkozik egy pestivírussal fertőzött állatok Itt leírtak szerinti specifikusan legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló eljárásra, amely magában foglalja a kővetkező lépéseket:
(1) minta nyerése egy pestívírus-fertőzésfoen szenvedőnek gyanított állatból vagy .egy vakcináit állatból;
(2) glikoprotein-ER^s RNáz-aktivitás hiányának vagy meglétének meghatározása az illető mintában;
(3) a glíkoprotein-ERNS' RNáz-aktivítása hiányának kölcsönös megfeleltetése egy vakcináit állattal, és az aktivitás meglétének kölcsönös megfeleltetése egy említett állat pestivírus-íertőzéséveL
A jelen leírás rendelkezésre bocsát glikoprotein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivításukban deléelöval és/vagy mutációval inaktívak pestivírusokat. Ilyen pestivírusok könnyen kimutathatók ilyen deléciók és/vagy mutációk eredményeként kialakult strukturális következmények alapján. Megváltoztatott glikoprotein-ERN's~t kódoló ERRS~génben lévő szekveneiakülönbségek szekvenalö technikákkal vagy PCR-technikákkal detektálhatok. Ennek eredményeként egy itt leírt előnyös megvalósítás vonatkozik egy pestivírussal fertőzött állatoknak itt közölt specifikusan legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való
7fi«nUtiAK megkülönböztetésére szolgáló eljárásra, amely magában, foglalja a következő lépéseket:
(1) minta nyerése egy pestivírus-fortózésben szenvedőnek gyanított állatból vagy egy vakcináit állatból;:
(2) egy pestivírus genom nukleotíd-szekvenciájának vagy egy proteinnek az azonosítása az említett mintában;
(31 az ERNS~nukÍeotid-'Szekvenciájában lévő deléciök és/vagy mutációk — ahogy a vakcinában jelen vannak. — kölcsönös megfeleltetése egy oltott állattal, és az említett deléciök és/vagy mutációk hiányának kölcsönös megfeleltetése egv említett állott pestivirus-fertözésével.
Továbbá, az itt rendelkezésre bocsátott pestivirusok glikoproteín-ERNSének megváltoztatott fehérje-szekvenciájából eredő strukturális· változások kimutathatók olyan specifikus monoklonális vagy poliklonális antitestekkel, amelyek nem. képesek felismerni a változtatás nélküli fehérjéket. Ennélfogva a jelen leírás egy további megvalósításban vonatkozik egv pestivírussal fertőzött állatoknak itt rendelkezésre bocsátott legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló eljárásra is, amely magában foglalja, a következő lépéseket::
(11 minta nyerése egy pestivírus-fcrtözésben szenvedőnek gyanított állatból vagy egy vakcináit állatból;
(2) egy legyengített pestivírus módosított. ERNS-gli.k.oprotemjónek azonosítása. monoklonális vagy poliklonális antitesteknek a mintában lévő ERNö-glikoproteinekhez való specifikus kötődésével, a glíko proteinek egy itt leírt eljárással módosítottak, ezáltal a monoklonális vagy poliklonális antitestek nem kőtödnek a módosítatlan ERNS-glikoproteí n ékhez:
(3) az említett monoklonális vagy poliklonális antitestek specifikus kötő7C3UU8ííí:
désének kölcsönös megfeleltetése egy vakcináit .állattal, és az antitestkötődés hiányának kölcsönös megfeleltetése az említett állat pestivírusfertőzésével, azzal a fenntartással, hogy a pestivírus anyag jelenléte az említett állatban és/vagy mintában másképp meghatározott.
Ezt megfordítva, a megváltoztatott és ezáltal strukturálisan jelölt fehérjék olyan specifikus monoklonális vagy poliklonális antitestekhez való kötődés hiányával is detektálhatok, amelyek csak a változtatás nélküli glikoproteín-BRNS-t képesek felismerni, ha a pestivírusok, jelenléte másképp megállapítható. Egy itt közölt előnyös megvalósítás egy pestivírussal fertőzött állatok specifikusan legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló elírásra, vonatkozik, amely magában foglalja a következő lépéseket:
(1) minta, nyerése egy pestivírus-fertőzésben. szenvedőnek gyanított állatból vagy egy vakcináit állatból;
(21 egy pestivírus módosítatlan ERN:S-glikoproteiniének azonosítása monoklonálís vagy poliklonális antitesteknek as említett mintában lévő ERNS~glikoproteÍnekh.ez való specifikus kötődésével, az említett glikoproteinek nem módosítottak egy itt rendelkezésre bocsátott eljárás sál, ezáltal az említett monoklonális vagy poliklonális antitestek nem kötődnek a módosított ERNS-gIikoproíeinekhez;
(3) az említett monoklonális vagy poliklonális antitestek specifikus kötődésének kölcsönös megfeleltetése egy említett állatban levő pestivírus fertőzéssel, és az antitest-kötődés hiányának kölcsönös megfeleltetése egy vakcináit állattal,: azzal a fenntartással, hogy a pestivírus anyag jelenléte az említett állatban és/vagy az említett mintában másképp meghatározott.
Természetesen az itt rendelkezésre bocsátott jelölt vírusokban a strukturális módosítás és az RNáz-aktivitás hiánya eltérő immunválaszokat eredményez állatokban jelöletlen pestívírus-ferfőzések eredményeként létrejövő vála » «
szókhoz viszonyítva. Az itt rendelkezésre bocsátott pestivirusok eltérő és megkülönböztethető,. oelluláris valamint humoraiig immunválaszt képesek kiváltani, amely eltér a módosítatlan és valószínűleg patogén immunválaszoktól.' Például az itt rendelkezésre bocsátott giikoproteln-ERNö-ek olyan pohklonális antitesteket eredményeznek, amelyek kötési specifításukban különböznek olyan poliklonális antitestektől, amelyek módosítatlan glikoproteinek ellen termelődtek. Ez a kötési specifításban levő különbség lehetővé tesz a találmány szerinti pestivírusokkal való jelölést vakcináit állatok és természetes körülmények között előforduló pestivirussal fertőzött állatok megkülönböztetésére. Leírtak [Kit et al., Veterinary Idicrobíology 28, 141-155 (199111 szérumok szűrésére szolgáló tesztelést specifikus pohklonális antitestekre, amelyek vagy vad típusú epltópboz vagy ezen epitóp marker-deléoiős mutánsaihoz képesek kötődni, fertőzött és oltott állatok megkülönböztetése céljából.
Egy itt közölt előnyös megvalósítás egy pestivírussal fertőzött állatoknak az itt rendelkezésre bocsátott legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló eljárásra vonatkozik, amely magában foglalja a következő lépéseket:
(Íj poliklonális antitestek mintájáak nyerése egy pestivírus-fertözésben szenvedőnek gyanított állatból vagy egy vakcináit állatból;
(2) az említett poliklonális antitestek módosítatlan E&^-glikoproíeinhez vagy a jelen leírás szerint módosított EK'NS~gíikoprofceinhez való bármilyen kötődésének azonosítása;
(3) az említett poliklonális antitestek módosítatlan ERNS-gliko proteinhez való kötődésének kölcsönös megfeleltetése egy pestívírus-fertőzéssel, és az említett poliklonális antitestek jelen leírás szerint módosított ERNS-glíko-proteinhez való kötődésének kölcsönös megfeleltetése egy vakcinálttal.
χ<
♦ · .♦ » « ♦ Λ- » * χ «·« ♦ ♦♦: χ ν > « « *** «·> »» *««
Példák
I. példa: RNáz-negatív pestivírus-mutánsok előállítása
A teljes hosszúságú pA/CSFV-cDNS-klönból (Meyers et ah, J. Virol, 67. 7Ö88--7Ö95 (1996)] vagy ρΑ/BVDV-klönból (Meyers et ah, J. Virol 67, 70887095 (1996)| kiindulva, melyekből fertőző: c.RMS-t lehet előállítani in vitro transzkripcióval előállítottunk szubklónokah CSFV esetén, a pA/CSFV-ből származó XhoI/SspMragmehtumot Xhol- és Smahenzimekkel hasított, pBluesoript SK.+ plazmidba klónoztuk. BVDV esetén, pA/BVDV-ből származó Xho/Bghl-fragmentumot ugyanezen enzimekkel emésztett pC17S-2C~pIazmi.tíba klónoztuk. Ezekből a konstrukciókból egyszálú plazm.id-DNS-1 állítottunk elő a Kunkel által leírt módszer szerint [Kunkéi et ah, Methods Enzyrnoh 154, 367-392 (1987):}, E. coll GJ236-sej teket (BioRad) és VCMS egyszálú. tagot (Stratagene) alkalmazva. Az egyszálú DNS-t dupla szálúvá konvertáltuk „Fhagemid in vitro Mutagenesís Kit” (BioRadi alkalmazásával. A kívánt pestlvirus-mutánsok előállítására primerkent alkalmazott, szintetikus oligonukleotldok közül néhányat példaként felsorolunk az alábbiakban:
C-297-L; AGGAGCTTACTTGGGATCIG C-34S-L; GGAACAAACTTGGATGGTGT C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA
8-348-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAÁCTGC
A kettős szálú. plazmid-DNS-t alkalmaztuk E. coli XLl-BIue-sejtek (Stratagene) transzformálására . A plazmidot tartalmazó bakteriumkolöniákat ampicillin-szelekció alkalmazásával izoláltuk. Plazmid-DNS-t preparáltunk, és tovább analizáltuk nukleoíidszekvenálással T7-polimerázt tartalmazó, szekvenálő reagenskészlet. (Pharmacia) alkalmazásával, A kívánt mutációkat tartalmazó és második, cserét nem tartalmazó plazmidokat alkalmaztuk teljes hosszúságú cDFS-klönok előállítására. CSFV esetén a mutagenizáit piazmidbói származó·
7CS Ι j RA 2.
Xhol/Nd.el-fragmentumot ínszertáítuk S78-plazmidhól (pCITE 2A, pA/CSFV-böi származó Xho.I/B.gUI’-fragment.umot tartalmaz) származó Ndel/SglH-fragmentómmal együtt Xhol- és BglH-enzimekkel hasított pA/CSFV-be, BVDV-CP7mutáns előállítása, céljából a deléciőt tartalmazó Xhol/Bglíl-fragmentumot Xhol- és Ncol-enzimekkel hasított pA/BVBV-be ínszertáítuk pA/BVDV/lnsplazmidböl izolált Bglll/Ncol-fragmentummal együtt A pA/BVDV/ms- konstrukcióból egy olyan cRNS-t írtunk át, amely egy nem-oitopatogén BVDV-t hozott létre alkalmas sejtekbe való transzfekciö esetén {Meyers et al.,. d, Virol, 67, 7()38-7095 (1996)1. A különböző, teljes hosszúságú klönokat amplifíkáltuk, és a plazmidokat izoláltuk. A kívánt mutációk jelenlétét DNS-szekvenálással igazoltuk. Sríl- (CSFV teljes hosszúságú kiónok esetén) vagy Smal(BVDV teljes hosszúságú kiónok esetén) enzimmel való iinearizáiás után cRNS-t átírtuk korábban leírtak szerint [Meyers et al., J. Virol, 67, 7088-7095 (1996); Meyers et ab, J. Virol. 70, 8606-8613 (1996)), Az RNS-t gélszúréssel és fenol/kloroíormos extrakeioval tisztítottuk, és sertésveséből származó sejtek (PX15) vagy marbaveséből származó sejtek (MDBK B2~kión) transzfekciójára. alkalmaztuk azokat (CSFV- vagy BVDV-konstrukdókat, ebben a sorrendben), A transzíékciókat immunfluoreszoencíával analizáltuk, vírusspeclfikus antiszérum alkalmazásával. Azokban az esetekben, ahol a kívánt mutánsokat ki lehetett nyerni Ummunduoreszcenelásan pozitív), a vírusokat úgy amplifikáltűk, hogy a transzfekcíós kísérletekhez alkalmazott sejtvonalakba passzáltók, A CSFV-mutánsokat a továbbiakban úgy analizáltuk, hogy meghatároztunk egylépéses növekedési görbéket, és a virális RHS-t Northern-blottal jellemezünk virusspecífikus cDNS-próbák alkalmazásával., valamint reverz transzkripcióval polimeráz láncreakcióban (RT-PCR), és azt követően, szekvenáltuk a PCR-fragmerhumokat a kívánt mutációk virusgenomban való jelenlétének igazolása. céljából. Valamennyi esetben igazoltuk a kívánt mutáció jelenlétét.
Mindegyik kinyert vírus egyformán jól növekedett, és hasonló mennyiségű RNS-t termelt, mint a vad típusú szekvenciát tartalmazó plazmídből származó vírus.
A BVDV-mutáns életképességét úgy mutattuk ki, hogy a megfelelő
♦ X ♦ « cRNS-t transzfektáituk» és 3 nappal később a -sejteket több .részre osztottuk. A sejtek egy részét 3,5 cra átmérőjű edénybe oltottuk, egy nappal később acélon/ metanollal fixáltuk, és ímmurmuoreszceneíával analizáltuk BVDV-speciílkus monoklonális antitest-keverék alkalmazásával [Weiland et. al., d. Vírol. Metnods 24. 237-244 (1989)]. Valamennyi sejtet pozitívnak találtunk, míg nem-fertőző RNS-ei transzfektált, kontroll, sejtek nem mutattak jelet, A megfelelő cRNS-el transzfektált sejtek egy részéből előállítottunk extraktumot egy ciklus, fagyasztás/felolvasztással. Friss sejteket megfertőztünk ezzel a sejtextraktummal, amelyekről 3 nappal, a fertőzés- után, BVDV-specifikus immunfluoreszcencia alkalmazásával bebizonyosodott, hogy BVDV-pozltívak.
Az 1, táblázatban összefoglaljuk az ERNS-be-n lévő, feltételezett RNáz aktív helynek megfelelő, konzervatív szekvenciába bevitt, különböző változtatásokat, mélyeket a jelölt vírus-mutánsok kódoltak.
1, táblázat
Név Szekvencia RNáz- RNáz Mutáns
-motívumban. aktivitás éfetkápesséqe
pA/CSFV ...SLHG1WPEKÍC.. . ...RHEWNKHGWCNW,, 4- 'T'
C-2S7-L ...SLLGlWPEKiC.. ... R Η E WN KH G WC N W. - - -e
C-346-L ...SLHGÍWPEKIC.. . ...RHEWNKLGWCNW.. -
C-297-LZ346-L ...SLLGlWPEKiC.. ...RHEWNKLGWCNW.. - +
C-2S7-K ...SLKGIWPEKIC.. .... RHEWNKHGWCNW. -
C-346-K ...SLHGÍWPEKIC.. .....RHEWNKKGWCNW - i-
C-297-d ...SL„G1WPEKÍC.. ...RHEWNKHGWCNW,, - -
C-346-ő ...SLHGÍWPEKIC.. ...RHEWNKjGWCNW.. - *
C-296/7/3-d ...S IWPEKIC. .....RHEWNKHGWCNW.. - *
€-345/8/7-0 ...SLHGÍWPEKIC, ........RHEWN WCNW.,- - -
C-345/8-d ...SLHGÍWPEKIC. . ...RHEWN__GWCNW.. - -
C-343/7-d ...SLHGÍWPEKIC. .....R Η E WN K_ WCN W . - -
C-342-d ...SLHGÍWPEKIC. .......RHJ/7NKRGWCNW.. - -
C-342/5-d ...SLHGÍWPEKIC. ......RH WNK GWCNW..
'«OOíSS ff ff.· ff ff ff ff
X * ffff ff ff - ffff V V ff ff g ff ff 5 ♦ ff# Xffff ff ff ff ff ff * x » ff ff ff
C-301-d .SLHGiW EKIC... ...RHEWNKHGWCNW..
C-285-S/G ..GLMGÍWFEKÍC.. . RHEWNKHGWCNW.. ff-
C-30Ö-W/G .SLHGIGPEKIC... ......RHEWNKHGWCNW.. - ff
C-302-E/A .SLHGIWPAKÍC... ....RHEWNKHGWCNW.. - -
C-30S-C/G .SLHGIWPEKIC... ......RHEWNKHGWCNW.. -
C-30Ö-W/G-302-E/A SLHGIGPAKÍC... ...RHEWNKHGWCNW.. - -
C-340-R/G .SLHGIWPEKIC... ...GHEWNKHGWCNW.., - -
C-343-W/G ..SLHGIWPEKIC. . ...RHEGNKHGWCNW. - ...
C-345-K/A. ..SLHGIWPEKIC... ...RHEWNAHGWCNW.. - -
C-2S7-K/346-K ..SLKGÍWPEKÍC... ...RHEWNKKGWCNW. ff
C-297-K/348-L ..SLKGÍWPEKÍC.. ... RHEWNKKGWCNW.. - ff
pA/BVDV ..SLHGIWPEKIC... .....RHEWNKHGWCNW.. + ff-
8-346-d ..SLHGIWPEKIC... ......RHEWNKHGWCNW., - ff·
Jelmagyarázat az I. táblázathoz; Az RNáz-aktívitást tranziens vizsgálati eljárásban határoztuk meg. BHK21-sejteket fertőztünk vTF7-3 tehénhimlő-vírussal [Puerst et al., Proc, Natl. Aoad. Sói. USA 83, 8122-8126 (1.9861], és azután a megfelelő cDNS-konstrukciőval transzfekt.áltuk azokat (5- ng plazmid-DNS, transzfekcíö Superfect alkalmazásával, a gyártó, Qiagen ajánlásai szerint). Mintán 10 óra hosszáig ínkubáituk 37°C-on, szén-díoxid-inkubátorban, a transzfektáit sejteket Hzisnek vetettük alá. és meghatároztuk az RNáz-aktívitást a lentebb leírtak szerint. Az életképességet az alábbiakban leírtak szerint határoztuk meg.
2. példa; Különböző mutációk hatása E™5 RNáz-akfcivítására
Különböző mutációk ERNS RNáz-aktívitására kifejtett hatásainak tesztelése céljából megfelelő sejteket fertőztünk a mutáns vírusokkal. CSFV esetén a fertőzést 0,01 fertőzési -egységgel (m.o.k) végeztük. Vad típusú vírussal való fertőzés szolgáit pozitív kontrollként, míg nem-fertőzött sejteket alkalmaztunk negatív kontrollként. 48 órával a fertőzés után a sejteket kétszer mostuk foszfát-pufferolt sóoldattal, és lízísnek vetettük alá 0,4 ml üzís-pufíerben (20 mM
* » * « »** ** ·*« **<
Tris/HCl; 100 mM NáCI, 1 mM EDTA, 2 mg/ml marhaszérum-aifoumin; 1% Triton X.10Ö; 0,1% dezoxí-köls&v; 0,1% nátrium-dodecil-szulfát). A lizárumot
1,5 nü-es reakcióé só vekre töltöttük, és ultrahangos kezelésnek vetettük alá (Branson szoníkátor ΒΓ2, 120 Watt, 20 másodperc, tölcsér alakú, ultrahangos kezeléshez tervezett edényben, vízfürdőben), eentrifugádással (5 perc, 14,000 rpm, Eppendorf centrifugában, 4°C-on) tisztítottuk, és a felülüszöt ultracentrifugáltuk (Beekmann asztali ultracentrifuga, 60 percig, 4%1-on és 45.000 rpmnél. TLA45 rotorban). Az RNáz-aktivitást 200 μ) össztérfogatban határoztuk meg, amely 5 vagy 50 ul felühiszöt. tartalmazott a második centrifugálási lépésből, és SÖ ug. Poly(rU)-t (Pharmacia) RNáz-vízs-gálati pufíérben (40 mM Tris-acetát, pH 6.5, 0,5 mM BDTA, 5 mM ditiotreitol, DTT). A reakciókeveréket 37~C~on Inkubáltuk 1 éra hosszáig, majd hozzáadtunk 200 μΐ, 1,2 M perklörsavaí és 20 mM LaSCM-et. A keveréke t jégen Inkubáltuk 15 percig, azután centrifugáltuk 1.5 percig, 4°C~on és 14,000 rpm-en Bppendorí-centrlíugában. A íélülűssóhos 3 térfogat vizet adtunk, és a keverék egy alikvotját optikai denzltásra vizsgáltuk 260 nm-en, Dhrospec 3000 (Pharmacia) spektrofotométerben, Valamennyi esetben mutációk bevitele as E5X!S-génbe teljesen megszüntette az RNáz-aktivitást (1. táblázat),
BVDV-mutáns esetén az RNáz-aktivitást olyan anyaggal teszteltük, melyhez RNS-transzfekciő után jutottunk, a helyreállított vírusok passzálása nélkül. A. megfelelő RN'S-el transzfekta.lt sejteket 72 órával a transzíekcio után megfeleztük, és két edénybe leoltottuk' azokat, 24 óra elteltével az egyik edényből sejtextraktumokat preparáltunk, és RNáz-aktivitásra teszteltük a fentebb leírtak -szerint A fertőzés megerősítése céljából, a második edényből származó sejteket immunSuoreszeeneiával analizáltuk, BVDV-re specifikus monokionálís antitestek alkalmazásával [Weiland et al, J. Virol Methods 24, 237-244 (1939)1, és 100%-ban pozitívnak találtuk azokat. A transzfekelót olyan RHS-el végeztük, melyet (pA/BVDV/Ins-)bői és ρΑ/Β-346-d-ből irtunk át, ez utóbbi plazmid ekvivalens a fpA/BVDV/Ins-)-plazmiddal, kivéve azt, hogy a CSFV-Alfort-genom 346, kődonjával ekvivalens kódon deletálva van. Nem-transzfoktáit MDBK-sejtek szolgáltak negatív kontrollként, «« «* β♦ « « .» # « «« 4f «
X Φ *
ΦΦ Φ» ΦΦΦ
2Α. táblázat
Különböző vírusok RNáz-aktivitásának meghatározása
Alfort j C-WT j C-297-L C-346-11 C-346-d C-346-d/Rs kontroll
OÖ260 2,4 j 2,3 1,1 ti | i,i 2.3 ¥
Alfort ) C-WT 1 C-297-L C-346-1 |C-297-R C-346-K 0297-1/346-17
ÖD260 2,09' | 2,16 1 0,715 0,77 | 0.79 0,766 1 0,77
C -297-K/346-L C-297-K/346-K C-346-d 1 kontroll
00260 0,725 0,835 0,80 j 0,84
A 2A. 'táblázat magyarázata:
PKIS-sejteket fertőztünk a jelölt vírusokkal ö.Ol fertőzési egységgel 37°C-on inkubáltuk 48 óra hosszáig szén-dioxídos inkubátorban, és azután lízisnek. és RNáz-tesztnek vetettük alá azokat. A különböző sejtextraktumok inkubáiása eredményeként keletkezett, savban oldható RNS-t az optikai denzítás 260 nm-en való mérésével határoztuk meg. Az RNáz-aktívitásban megfigyelt különbségek oka nem a mintákban lévő eltérő mennyiségű ERNS-fehérje volt,, mivel hasonló értékeket kaptunk az ERNS meghatározására úgy, hogy radioaktív jelölés és immunpreeipítáeiő után a radioaktivitást meghatároztuk „phosphorimager” alkalmazásával. Továbbá az Erns-koncentráció csökkentése a szokásos mennyiség egy tizedére a vizsgálati eljárásban nem változtatta meg jelentésen az eredményül kapott OD-ket, ami azt mutatja, hogy a vizsgálati eljárás választott körülményeiben az Ems telítésben volt.
CSFV-Alíott-törzs; a többi összes vírust plazmidokból ín vitro átírt RNS-bol állítottuk elő: például C-WT-t pA/CSFV-bőI; C-297-L-t pA/C-297-L-ből, stb.; C-346-d/Rs-virust pA/C-346~d/Rs-hőÍ fpA/C-346-d-ben lévő mutáció visszafordításával állítottuk elő ügy, hogy kicseréltük a megfelelő cDNS-fragmentumoi pA/CSFV-ből származó ekvivalens fragmentumra) állítottunk elő; kontroll: nem.··fertőzött PK15-sejtek extaktuma.
: | .........·(·· l B-WT | Β-346-d kontroll
I OÖ260 1 2,5 | 1,1 1,1
mi» z&az
A 2B. táblázat magyarázata;
MDBK-sejteket Fertőztünk ín vitro átírt RNS-ei, 72 órával a transzfekció után több részre osztottuk, és 24 órával később RNáz-aktivitásra analizáltuk. A sejtek fertőzését ImmunOuoreszcens analízissel igazoltuk, a szövegben leírtak szerint,
B-WT: pA/BVDV/ins- -bői előállított vírus; Β-346-d; ρΑ/Β-346-d-bőí előállított vírus;, kontroll; nem-fertőzött MDBK-sej lekből készült extraktum.
3. példa: CSFV patogessitása RNáz-inaktiválás után
Annak vizsgálata céljából hogy vajon az RNáz-akti vitán megszűntetése befolyásolja-e pestivírusok patogenitását természetes gazdaszervezetükben, állatkísérletet végeztünk a V{pA/C-346-dj-mutánssal (a táblázatokban C346-d), A CSFV teljes hosszúságú, mutáció nélküli klőnjábói fVfpA/CSFV)] előállított, vírus szolgált pozitív kontrollként. Az egyes mutációkhoz három fiatal sertést (fajta; „Germán land raee”, körülbelül 25 kg testtömeg) alkalmaztunk. Az infekció s dózis 1 x 10s TCIDso volt állatonként; az: oltás kétharmadát intranazáiísan adtuk be (egy-egy harmadét orrlyukanként), egy-harmadát intramuszkuíárisan. A két csoportot elkülönített izolációs egységben tartottuk. Vérmintát vettünk az állatoktól a fertőzés előtt és a 3, 5., 7., 10,, 12. és 14, napon.. Továbbá naponta feljegyeztük a testhőmérsékleteket (2. ábra), A vad típusú vírussal fertőzött adatok klasszikus sertéslázra jellemző klinikai szimptómákat mutattak, mint például laz, ataxia, anorexia, hasmenés, központi idegrendszer rendellenességek vérzések a borben. (3.a táblázat). Vírust tudtunk a vérből izolálni a 3-. napon (#68. állat) és az 5., 7., 10... 14. napon (#68., #73., #121. állat) (3,b táblázat). A haldokló állatokat elpusztítottuk a fertőzés utáni 14. napon. Ekkor vírust semlegesítő antitesteket nem tudtunk detektálni. Eszel ellentétben, a mutánssal fertőzött állatokban nem fejlődtek klinikai szimptömák (3,a táblázat). A hőmérséklet normális maradt (2. ábra): a vizsgálat teljes ideje alatt és az állatok nem hagyták abba a. táplálkozást. Egyik időpontban sem tudtunk vírust kinyerni a vérből. Az állatok mégis egyértelműen fertőzöttek voltak, és
3a. táblázat: Tesztfertőzés utáni klinikai jelek nagyon valószínű, hogy a vírus replikálódott, mivel valamennyi állatban semlegesítő antitestek fejlődtek ki (3.c táblázat).
1. állatkísérlet
klini kai jelek
Szám (Fertőzés | iá‘Z hasme- | CMS ) ano- (vérzések nés | rendeli, irexiaj bőrben apátia Ά :
#68 IC-WT #78 C-WT -í- + i e 1 e ; 4· 1 ΐ ; e 4 4
4- ...........S......................’ j: -r .4 | 4
* Az eutanázia napján haldoklóit az állat. ** Vérzés szervekben necropsía esetén.
A 3.a táblázat magyarázata;
fiatal sertést („Germán land raee”, körülbelül 25 kg testtömeg) két csoportra osztva (az egyes csoportokat elkülönítve, izolált körülmények között tartottunk) alkalmaztunk ebben a kísérletben. Három állatot CSFV-WT~vel (1 χ 100 TClDso) és 3 állatot C-34ö~d. mutánssal (1 x tö5 TCIDso) fertőztünk. A rektális hőmérsékletet és a klinikai jeleket rögzítettük és összesítettük a táblázatban; ma.: nem végeztünk neoropsiát.
3b. táblázat: Vérsejfcvirémla tesztfertözés után
1. állatkísértet
Állat száma Fertő- zés Virémia a fertőzés utáni napon
3 5 7 10 14
#68 C-WT -r 4- 4
#78 C-WT - + -i-. 4- 4
#121 C-WT - -4* 4
#70 C-346-ά - - - - -
#72 C-346-d - - · - -
#74 C-346-d - - - · -
'V8UVÍS2
A 3 b. táblázat magyarázata;
Vérsejtvirémiát ügy detektáltunk, hogy a vért FKlS-sejtekkel tenyésztettük együtt, A sejteket 37cC-on,: 72 óra hosszáig inkubáltuk, PBS-sel mostuk, jéghideg acélon/metanollal fixáltuk és a fertőzést immuníluoreszcenicával analizáltuk glikoproleín--E2~re specifikus monoklonális antitest alkalmazásával ÍmAb A18, Weiland: et at, J, Virology 64, 3563-3560 {1990IJ,
c.
CSFV-specifikus szérum semlegesítő titer kifejlődése
Napok fertőzés után -3 O 17 25 69 76 79 87
#70. sertés - - 1:1.8 1:162 1:162 1:162 1:486 1:1458
#72. sertés - - 1:18 1:54 1:486 1:1458 1:1458 1:4374
#74, sertés - - 1:6 1:54 1:162 1:486 1:486 1:1458
A 3.c táblázat magyarázata:
Meghatároztuk a C~346~d mutáns vírussal fertőzött sertésekben lévő antitest-litereket az állatkísérlet különböző időpontjaiban:
id hígított szérumot összekevertünk 50 pl, 30 TCIDso vírust (CSFV Alfort/Tübingen} tartalmazó tápközeggel. 90 percig inkubáltuk 37°C-on, maid hozzáadtunk 100 td sejtet (1,5 x lö4 sejt}, és a keveréket 96 tenyésztohelyeí tartalmazó tálcákra oltottuk. 72 óra elteltével a sejteket jéghideg acélon/metanollal fixáltuk és a fertőzést immunfluoreszceneiával analizáltuk, glikoproteín-B2-re specifikus rnonoklonáíls antitest alkalmazásával [mAb A1S, Weiland et al., u, Virology 64, 3563-3569 (1990)}. A fertőzés utáni 69, napon- az állatokat 2 x 10s TCIDso Eystrup-CSFV-tőrzzsel fertőztük. A táblázatban megadjuk azt a legmagasabb szérumhígítást, amely a bevitt vírus teljes semlegesítését eredményezte, 4. példa; Protektív immunitás indukálása RNáz-negatív vírus fertőzésével
Annak analizálása céljából, hogy a mutáns vírussal való fertőzés protektív immunitáshoz vezet, nagymértékben pategén, heterológ CSEV-íörzzsel (Eystrup törzs, Behring cégtől származik} fertőzési kísérletet végeztünk körülbelül 9 hétsSSÍV/iíV
3' tel a CSFV-mutánssal való vakeináciő után. 2 κ lös TCIDso vírust alkalmaztunk a fertőzéshez. Számos korábbi kísérletben azt találták, hogy ez a vírusmennyiség elegendő letális betegség indukálásáboz [Köriig. “Vírus dér klassíschen Schweinepesú Untersuchungen zűr Pathogenese und zűr Induktion einer protektíven Immunantwort.” I3issert.at.ion, Tierárztliche Hochsehule Hannover, Németország (1994)1. Azonban előzőleg a. CS FV-RNáz-mutánssal oltott állatok nem mutattak betegségre utaló szírnpíömákat fertőzés után. Nem lehetett detektálni lázat (3. ábra) vagy vírémiát, viszont semlegesítő antitestek megnövekedett mennyisége produktív fertőzésre és a fertőző vírus replikáciöiára utalt,
5. példa: A fegyengífcési. elv igazolása
Annak kimutatása céljából, hogy a mutáns vírus megfigyelt gyengítése valóban a polifehérje 346. helyzetében lévő hisztidin deléciőja következtében jön létre, és nem azonos:tatlan. második helyen létrejövő mutáció következtében, helyreállítottuk a vad típusú szekvenciát úgy, hogy a teljes hosszúságú pA7 C-346-d-klőn 1.6 kb méretű XhoI/Ndeí-fragmentumál kicseréltük a vad típusú szekvenciával rendelkező pA/CSFV megfelelő fragmentumával, A pA/C-346-d-ből kivágott fragmentumot nukleotidszekvenálással azonosítottuk mutációk vonatkozásában. A polifehérje 346. hisztídinjét kódoló triplet deléciőja kivételével nem találtunk különbséget a vad típusú szekvenciához viszonyítva. A helyreállított mutánst tartalmazó cDNS-konstrukcióból V(pA/C-346-d/Rs)~vírust lehetett izolálni, amely azonosan jól növekedett és ekvivalens RNáz-aktivitást mutatott (2,A táblázat).
Egy második állatkísérletben a helyreállított vírust alkalmaztuk sertések fertőzésére. Kontrollként a. deléclős mutánst alkalmaztuk. Mivel ezek az állatok .fiatalabbak voltak („Germán land raceK körülbelül 20 kg testtömeg) az első kísérletben alkalmazott állatokhoz képest. 5 z KÜ TCIDso vírust alkalmaztunk fertőzésre ebben az esetben. A mutánssal fertőzött állatok ismét nem mutattak klinikai jeleket (5. táblázat. 4, ábra). Csak az egyik állatnak volt láza az egyik napon. Ennek ellenére ezek az állatok semlegesítő antitesteket termeitek, és védettek voltak letális CSFV-fertőzés ellen. A fertőzést megismételtük 2 x ÍÖ5
7QSIU :/S£Z * ♦ ♦♦ # *» φφ Φχ φ * φ φ φ X Φ Φ Φ » V φ φ φ φ φ χ Φ > Φ X « Λ· ♦ φφ ΦΧΛ ΦΦ ΦΦ Φφ»
TCIDso fertőző Eystrup törzzsel Az állatok fertőzés után nem mutattak klinikai jeleket, és a hőmérséklet normális maradt (5. ábra), A. -deléciós mutánssal fertőzött sertésekkel ellentétben, a helyreállított vad típusú vírussal oltott állatokban kifejlődött, fatális, klasszikus sertésláz. Egy állatot el kellett pusztítani a fertőzés utáni 11.. napon, a többit 3 nappal később. Valamennyi állat mutatta a klasszikus sertésláz tipikus szímptömáit, azaz lázat, hasmenést, anorexia, patológiai jeleket, mint például vérzéseket különböző szervekben, például vesében.
S.a táblázat; Tesztfertőzés utáni klinikai jelek
5a. táblázat;
fiatal sertést („Germán land race”, körülbelül 20 kg testtömeg) két csoportra osztva (az egyes csoportokat elkülönítve, Izolált körülmények között tartottunk) alkalmaztunk ebben a kísérletben. Három állatot C-346-d (5 x lö'4 TCIDso) mutánssal és 3 állatot C-346-d/RS-el (5 χ. 104 TCIDso.) fertőztünk, A C-346-d/RS a C-346-d-mutánsből származott ügy, hogy helyreállítottuk a vad típusú ERfíS-gén szekvenciáját. A rektálís hőmérsékletet és a klinikai jeleket rögzítettük és összegeztük; ma.: nem. végeztünk necropsíát,
5b, táblázat:
Diagnosztikai RNáz-teszt fertőzött állatokbólvirémia közben kinyert vírusokkal
Alfort 43. állat C-297-K #S. állat C-297-K 427. állat C-346d/RS #28, állat C.-346d/RS : #30. állat C-346d/RS Kont- roll
ODrso i 1>84 0,60 0,5 6 ........~ . 1,84 1,93 1,94 0,49
Vírusokat a 3, és 5. számú állat véréből a fertőzés utáni 5. napon, és a 2, állatkísérletben (az 5, példában leírtak szerinti alkalmazott, 27,, 28. és 30. számú állat véréből nyertünk ki a fertőzés utáni 7. napon, szövettenyészetben szaporítottuk azokat, Ütráltuk és RNáz-aktivltásra teszteltük a. fentebb leírtak, szerint. Nem-fertőzött PK15-sejtek, és vad típusú. CSFV (Alfort)-törzzsel fertőzött sejtek szolgáltak kontrollként. A 3, és 5. számú állatokat C-297-Kmutánssal fertőztük, míg a 27., 28. és 30. számú állatot C-346~d/RS~rnutánssal fertőztük, a táblázatban jelöltek szerint.
ZO mutáció hatásai
ERNS-ben lévő dupla mutáció hatásait teszteltük az adott vírus természetes gazdaszervezetben való rspkkátíöjára és patogerütására, ebből a célból állatkísérletet végeztünk V(pA/ü-297~L/346~b)~mntánssaI, A CSFV teljes hosszúságú, mutáció nélküli klánjából |V(pA./CSFV)| előállított vírus szolgált pozitív kontrollként. Az egyes mutációkhoz három fiatal sertést (fajta: „Germán land race”, körülbelül 25 kg testtömeg) alkalmaztunk. Az infekcíós dózis 1 x 10b TCIDso volt állatonként; az oltás kétharmadát intranazálisán adtuk be (egy-egy harmadol. orrlyukanként), egy-harmadáí intramuszkulárisan. Vérmintát vettünk az: állatoktól a fertőzés előtt (0. napon) és az 5, 8., 1.2. és 20. napon. Továbbá naponta feljegyeztük a testhőmérsékleteket (6. ábra). A dupla mutánssal fertőzött állatok nem mutattak semmilyen klinikai szímptőmát, és az állatok nem hagyták abba a táplálkozást. Az állatok (45/2. és 45/3. állat) lázmentesek voltak a kísérlet teljes Ideje alatt, kivéve a 45/1. állatot a 8. napon, melyet valószínűleg bakteriális sérülés okozott a jobb hátsó láb sérülése következtében. Miután ez az állat antibiotikumos kezelést kapott a 10. napon, a. hőmérséklet egy napon belül visszatért a normái értékekre (6. ábra). Valamennyi állat vérmintáiból vírust izoláltunk az 5. napon, míg későbbi időpontokban nem detektáltunk virémiát. (6.a táblázat). Valamennyi. állat semlegesítő antitesteket termelt fö.b táblázat). A 45/1. állat esetén a semlegesítő ötért újra meghatároztuk a fertőzés után 4,5 hónappal, és 1:4374-nek találtuk. Tehát a dupla mutánssal való fertőzés hosszan tartó immunológiai memóriát eredményezett,
6„a táblázat;
Teszt vízé miára
Napok fertőzés után 5 8 12
45/1. sertés 4- - -
45/11. sertés V - -
45/111. sertés + - -
6,b táblázat:
Semlegesítési titerek
Állat 0. nap 20. nap fertőzés után
45/1. - 1:128
4-5/H. - 1:256
45/ΪΠ. - 1:256
7. példa; *B~346~dw>jeba BVBV-vírus immunogenitása es gyengítésének elve
A kísérletet arra a célra terveztük, hogy vizsgáljuk a gyengítési elvet és a pA/B~346~d-bőI helyreállított ,,Β-346-u’’-jeIű BV'DV-vírus ímmunogenítását, „pA/BVDV/lns-”-höl helyreállított wB~WT”--hez viszonyítva. A ,,B~346~d”~vírus az eredeti 349, BVDV-helyzetben mutáns, de „B~34ő”-nak nevezzük, utalva az 1, ábrán bemutatott CSFV-Alíort 346. helyzethez viszonyított helyzetre.
Kiválasztottunk három, csoport BVDV-szeronega.ttv, 3-6 hónapos állatot. Az 1, és 2. csoport 5 állatot tartalmazott, míg a 3, csoport 3 állatot tartalmazott. Az 1. és 2. csoportban lévő állatokat megfertőztük 2x lö6 TCIDso Β-346-d (1. csoporti vagy B-WT (2. csoporti beadásával, 5 ml térfogatban beadási módonként. Az állatokat intramuszkulárisan jíarízomhah intranazálisan és szubkután (lapocka fölött) fertőztük. A fertőzés utáni 14, napig terjedő idoperiödusban mindkét csoportban követtük a virémiát olyan paramétereken keresz35
mint a vérsej tvírémia és víruskíáramlás orrkenethen. Továbbá klinikai paramétereket követtünk, úgymint rektálís hőmérsékletet, fehérvérsejt-számot és általános -egészségre jellemző paramétereket.
Protektív immunitást vizsgáltunk antigenlkus&n heterológ és virulens BVDV-izolátummal (#13) szembeni fertőzéssel, 77 nappal azután, hogy az 1. csoporthoz tartozó állatokat Β-346-d-vel fertőztük. A 3:. csoporthoz tartozó állatok szolgáltak fertőzési kontrollként, és ugyanolyan eljárás szerint fertőztük azokat, mint az 1. csoporthoz tartozó állatokat a virulens BVDV-izolá.tummal. A BVDV-vírus (#13) eltérő anügenikus (II. típus) csoporthoz tartozik, mig a Β-346-vírus Pellerin, C. és munkatársai (Viroiogy 203, 260-268 (1994)] által leírt osztályozás szerinti anügenikus (I. típusú) csoporthoz tartozik.
Az I. és 3. csoportban lévő állatokat megfertőztük 2 x 10ö TCIDso BVDV-izolátum (#13) beadásával. 5 ml térfogatban beadási módonként. Az állatokat intramuszkulárisan (karizomba), ín-tranazálisan és szubkután (lapocka fölött) fertőztük. A fertőzés utáni 14. napig terjedő időperiődnsfoan mindkét csoportban követtük a virémiát olyan paramétereken keresztül, mint a vérsejtvirémia és víruskiáramlás orrkenetben. Továbbá, klinikai paramétereket követtünk, úgymint rektálís hőmérsékletet, fehérvér sejt-számot és általános egészségre jellemző paramétereket.
B--346-d-vel való fertőzés után az állatok nem mutattak semmilyen BVDV-re jellemző, tipikus klinikai szimptömát, például megnövekedett rektálís hőmérsékletet (7.a táblázat) vagy légzőrendszert érintő bármilyen klinikai szimptömát (nem mutatjuk be).
A csökkent verseitvírémia (7,b táblázat) és orrkenetben való víruskiáramlás (7x táblázat) egyértelműen jelezte a Β-346-d gyengítettségét a B-WT-hez képest.
A virulens #13-BVDV-ízolátum a 3. csoporthoz tartozó állatokban erős virémiát indukált BVDV-fertőzés tipikus jeleivel: úgymint rektálís hőmérséklet megemelkedésével néhány napos időtartam alatt (7,d táblázat), erős leukopéniával (7,e táblázat), kiterjedt vérsejt-virémiával (7,f táblázat) és víruskiáramlással az orrkenet-fblyadékban (7,g táblázat). Ezzel ellentétben, az 1. csoporthoz tartozó állatok, amelyek 13-346-d-vei lettek oltva, nem mutatták BVDV-fertőzés tipikus klinikai szimptómáit virulens #13-BVDV-ízoIá.tummai
WWW
ν <· X «* ν» való fertőzés után. Nem volt szignifikáns· növekedés fertőzés után a rektálís hőmérsékletben (7,d táblázat). A megfigyelt Ieukopénia nagyon jelentéktelen volt nagyságában és időtartamában í7.e táblázat). BVDV-t. nem tudtunk izolálni a vérből (7.f táblázat), és csak egy állatban tudtunk detektálni víruskiáramlást az orrkenet-váladékban (7,g táblázat).
Ennélfogva Β-346-d-vel való fertőzés erős immunitást Indukál, amely egyértelműen csökkent klinikai jeleket, viruskiáramlásf és vérsejt-virémi&l heterológ BVDV-izolátummal való fertőzés után.
vei, mig a 2. csoportban lévő állatokat 6 x KP TCIDso B-WT-vel fertőztük. 7„b táblázat:
Csooort
Ahat
Víruskiáramiás .orrkenetben
napja í (napoK)
Időtartam adagi (napol
I Első napja [
1 6 6 1. i 1 j
2 4 6
··> 5 5 I
í O :
1,4
öSiu/KAr * # » * φ φ-ft «Λ Φ Φ
Vérmintákat vettünk EDTA. alkalmazásával Β-346-d-vel és B-WT~vel való· fertőzés utáni 1.0. napig, naponta. 0,2 ml vért adtunk borjúból származó here sejtek iCíe? 3 tenyészetének mindegyikéhez, amelyek heparínt (1 egység/mi véralvadás gátlása céljából) tartalmazó tápkőzegben voltak. Egy éjszakás inkubálás után az inokulum-tápközeget lecseréltük friss, heparinmentes tápközegre. 4-6 napos inkubálás után a BVDV-fertőzött sejteket immunfiuoreszoenciával detektáltuk, BVDV-re .specifikus poliklonális szérummal.
A negatív tenyészeteket lefagyasztottuk, és azt követően felolvasztottuk.. Ezekből 0,2 ml-t második passzálásra vittünk Cte-sejtekre, BVDV hiányának megerősítése -céljából.
zódések eltávolítása céljából. A felülúszó-folyadékot kivettük, és 0,2 ml-t ráoltottunk a három sejttenyészet mindegyikére. Egy éjszakás inkubálás után. az inokulum-tápközeget lecseréltük 2 ml friss tápközegre. 4-6 napos inkubálás után a BVDV-fertőzött sejteket ímmunfiuores-zeeneiával detektáltuk, BVDV-re specifikus poliklonális· szérummal.
iűSUí/KAZ
♦ Φ φ φ X X Φ ♦Λ* ΧΦΦ Φ
Φ Φ Φ ♦ φ ΦΦ » ΦΦ
7.d táblázat:
ís rektálís hőmérséklet az 1. és 3, csoportban
Napok -2 -.1. 0 1 ·-> 3 4
Les. 38,4 38,6 38,5 38,5 38,6 38,4 38,4
3.cs, 38,8 39,1 38,8 39,1 33,4 39,7 40,2
Napok 5 6 7 8 9 10 12 14
kos. 38,4 38,3 38,4 38,4 38,4 38,4 38,4 38,5
3-.es. 40,2 40,4 41,3 40,2 40,1 40,2 40,8 40,4
A rektálís hőmérsékleteket/a fertőzés utáni 16, napig követtük. Az 1. és csoportban, lévő állatokat a 0. napon fertőztük 6 x ICA TCIDso virulens #13 BVDV-izolátummal.
7,e táblázat:
Átlagos fehérvérsejt-számok:
Vérmintákat vettünk mindkét csoportban lévő állatokból EDTA alkalmazásával naponta a fertőzéshez képest -2-t.bl 14, napig. Az EDTA-vérmintákban lévő fehérvérsejt-számokat Sysmex Mícro-Cd! Counter E800 alkalmazásával határoztuk meg.
7C81U/SAS a ο
V .♦.««
X <.
Vérmintákból izolált BVDV
Csoport Állat Vírus detektálása vérben Időtartam átlaga (napok)
Első napja Utolsó napja Tartama (napok)
1 1 - - 0 0
2 - ... 0
3 - - 0
4 - - 0
5 - - 0
3 11. 3 10 8 9,7 ;
1.2 3 14 12
13 3 9 9
Vérmintákat vettünk EDTA alkalmazásával a fertőzés utáni 10. napig, naponta. 0,2 ml vért adtunk borjúból származó heresejtek (Cte): 3 tenyészetének mindegyikéhez, amelyek heparint (1 egység/ml véralvadás gátlása céljából) tartalmazó tápközegben voltak. Egy éjszakás ínkubálás után az tnokulum-tápközeget lecseréltük, friss, heparinmentes tápközegre, 4-6 napos ínkubálás után a BVDV-fertőzött sejteket immunfiuoreszcenciávaí detektáltuk, BVDV-re specifikus poiikionális szérummal,
A negatív tenyészeteket lefagyasztottuk, és azt kővetően felolvasztottuk. Ezekből 0.2 mi~t második passzálásra vittünk Cte-sejtekre, BVDV hiányának me ger ö sí té se cé Íj ából.
φ > ·»
VIrasR1 áram 1 ás orrfolyadékbaa
Csoport Állat Viruskiáramlás orrkenetben Időtartam átlaga (napok)
Első napja Utolsó napja Tartama. (napok)
1 I 3 4 2 0.8
2 - - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 4 5 2
3 11 3 14 12 10
12 3 14 12
13 3 8 6
Orrváladékot lecentrifugáltuk (lööö g) a durva. törmelékek és szennyeződések eltávolítása céljából, A felülúsző-folyadékot kivettük., és 0,2 ml-t ráoltottunk a három .sejttenyészet mindegyikére. Egy éjszakás inkubálás után az ínokulum-tápközeget lecseréltük. 2 ml friss tápközegre. 4-6 napos inkubálás után a BVDV-fertőzőtt sejteket immuníluoreszcenciával detektáltuk, BVDV-re. specifikus polikionális szérummal
8. példa: C-346-d és CSFV megkülönböztetése a 346. bisztidin-kódon
RT-PCR alkalmazásával
A CSFV-glikoprotein~ERNS-ben lévő konzervatív RNáz-motívumot kódoló RNS-szekvencia nagymértékben konzervatív. Az összes ismert CSFV-szekvencia közül egyikben sem találtunk nukléotid-cseréket. a CSFV-Alfort- törzs közölt {Meyers et al.. (1987)] szekvenciájában, a 1387-141,6. nukleotidoknak megfelelő régióban.. Tehát a genom ezen konzervatív régiójából származó oligonukleotid-primereket lehet alkalmazni RT-FCR vizsgálati eljárásban, valamennyi CSFV-izolátum detektálására (lásd 7. ábrát). Ennek, következtében a
** -*♦« <« ♦ ·> «,,
346, hisztidint kódoló triplet (1399-1401. nukfeotidok) hiányát megfelelően tervezett primer alkalmazásával lehet detektálni. A konzervatív régiót lefedő, különböző oligonukleoadókat szintetizáltunk, amelyek a hísztjdin-kódont tartalmazták vagy nem. Ezek az oligonukleotidok. szolgáltak 5-végi primőrként RT-PCR--reakciókban, amelyekben 3-végi primerként ERN's-8top-oligonukleotidot alkalmaztunk. C-346-ά-, C-WT-, C-346-L- vagy C-346-K-val fertőzött sejtek szövettenyészetéiből izolált RNS-t alkalmaztunk templátként 2 ug hődenaturált RNS (2 percig 92°C~on, 5 percig jégen .11,5 μί vízben 30 pmol reverz primer jelenlétében) reverz transzkripcióját úgy végeztük, hogy hozzáadtunk 8 ul RT-keveréket (125 mM Tris/HCÍ pH 8,3, 182,5 mM KCI, 7,5 mM MgCh, 25 mM ditiotreitol, egyenként 1,25 mM dÁTP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard-ot (Pharmacia Freíburg, Németország) és 50 U Superseript-et (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Németország) 45 percre, 37C-on. A reverz transzkripció befejeződése után a csöveket jégre helyeztük, és hozzáadtunk 30 ul PCR-keveréket (8,3 mM Tris/HCl pH 8,3; 33.3 mM KCÍ;. 2,2 mM MgCb; egyenként 0,42 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0,17% Triton X-100; 0,03% marhaszérum-albumin; 5 U Taq-polimeráz, Applígene, Heideiberg, Németország), és 16;,7% DMSO-t. Ha. „Ol H*3*-primert alkalmaztunk, az amplifikációs reakciókeverék nem tartalmazott DMSO-t Az ampliflkáciöt. 36 ciklusban végeztük (30 másodperc 94’C-on; 30 másodperc 57cC~on; 45 másodperc 74°C-on). Az amplifikációs .reakciókeverékből 1 μΐ-t felvittünk 1%-os agaróz-gélre, az amplifikáit termékeket elektroforézissel elválasztottuk, és etídíum-bromíddal megfestettük. A 7, ábrán bemutatottak szerint, az „Ol H~34/OI En5SStop” primer-pár lehetővé tett egy csík specifikus ampliftkálását a 346. kódon delécióját tartalmazó RNS-hől. míg két más primer kombinációjával olyan termékeket ampliflkáltunk, amelyek tartalmazták a 346. kódont, és nem figyeltünk meg csíkot akkor, ha templátként olyan RNS-t. alkalmaztunk, amelyben ez a kódon, deletálva volt,
»* ♦ » φ· φ ΦφΦ «ΓΟΦ
X * *
Primerek RT-PCR-hez:
5’-végi (upstreamk
O1R-3: TGGAACAAAGGATGGTGT
Hv2; TGGAACAAACATGGATGG
01H*3: GAATGGAACAAACATGGA
3’-végi (dovv.nst.ream):
Ot EmsStop:
Az ábrák rövid ismertetése;
1, ábra; A CSFV-Aifort-törzs által expresszált első 495 aminosav
A szekvenciái;sta az első 495 aminosavat mutatja, ahogyan a CSFV-Alfort-törzsben expresszálödik [Meyers et al., Viroíogy 171, 555-567 (1989)1. Az említett törzsből származó glikoprotein-ERNS egy monomerje megfelel a Rümenapf és munkatársai (J. Virol, 67, 3288-3294 (1993)1 által leírt 268-494, aminosavaknak. A 295-307. és 338-357. aminosavak (aláhúzva) megfelelnek azoknak a régióknak, amelyek homológiát mutatnak növényi és gombaeredetü RNázokkal jSchneíder et ab, Science 261, 1169-1171 (1993)].
2. ábra: Álatok rektális hőmérsékletének görbéi tesztfertőzés után
Naponta rögzített rektális hőmérséklet vírusfertőzés előtti 2, naptól a vírusfertőzés. utáni 1.8. napig. A rektális hőmérséklet görbéit részletesen fölvettük azokban a csoportokban lévő állatokra, amelyeket pA/CSFV-plazmídböl származó V(pA/CSFV)-vírussal (folyamatos vonal), vagy pA/C-346-d~piazrmd~ bői származó V(pA/C-346--d)~ vírussal (szaggatott vonal) fertőztünk.
3» ábra: Állatok rektális hőmérsékletének görbéi fertőzés után
Naponta rögzített rektális hőmérséklet vírusfertőzés utáni 1-21. napokon. 69 nappal korábban C-346-d-mutánssal )VfpA/C-346~d)j oltott állatokat fertőző CSFV-Eystrup-tőrzs letális dózisával fertőztünk a szövegben részletesen leírtak szerint. A rektális hőmérséklet görbéit részletesen felvettük abban a csoportban lévő állatokra, amelyeket 2 x lö5 TCIDso, fertőző CSFV-Kystruptörzzsel fertőztünk.
·♦ ** V* * X * * »
Naponta rögzített rektális hőmérséklet vírusfertőzés utáni 1-18, napokon. A rektális hőmérséklet görbéit részletesen- felvettük azokban a -csoportokban lévő állatokra, amelyeket C-346-d-vel (V(pA/C-346-d)l (szaggatott vonal), vagy helyreállított C-346~d/RS-vÍrussal tV(pA/C-346-d/Rs)] (folyamatos vonal) fertőztünk.
5, ábra: Rektális hőmérsékletek fertőzés nfcán a 2. állatkísérletben
Naponta rögzített rektális hőmérséklet vírusfertőzés utáni 1-10. napokon. 37 nappal korábban C-346~d-mutánssal oltott állatokat fertőző CSFV- Eystrup- törzs letális dózisával (2 x lö5 TCIDso) fertőztünk, mérsékletei
Naponta rögzített rektális hőmér való vírusfertőzés előtt és után.
klet VípA/C-297~L/34ö~L)~mvíánssal ciőja nélkül, RT-FCR alkalmazásával a 8. példában leírtak szerint
a) Az „01 H-3*/*OI EmsS-top* primer-pár lehetővé teszi egy sáv specifikus ampiífikálását a 346. deléeíős kódon (C-346-d) deléoiőját tartalmazó RNSből. részletesen a. 8. példában leírtak: szerint. Ezzel ellentétben, ezt a deléeiót nem tartalmazd RNS nem lépett reakcióba, a primer-párrái (C-WT, C-346-L. C-346-R),
b) és c) A két másik primer kombinációjával (Ol H+2 és öl H+3) -olyan terméket amplifikáltunk, amely olyan RNS-böi származott, amely nem tartalmazta a 346. delécíós kód-ont (Ol H+2 és ΟΙ H+3), Nem figyeltünk meg sávot akkor, ha templátként olyan RNS-t alkalmaztunk, amely a C-346-d 346-delécíós mutánsból származott.
oai n/·>&;:
ÍSZ * * X * * 9^ #* Λ 9
S * * » > 9 » « 9
9 «»* *99 9 » 9 9 9 9 » X 9 99 » 9 9 *r i »9
KVENCIÁK
SEQUENCE
JEGYZEKE
LtSTING <1 W> Soehdnger Ggeiheím Vetmediea GmbH <12G> Áttenu&ted pestíwuses <130> 1-1039 A <140 02003408.8 <141 > 2002-02-14 <150> 02003408.8 <151> 2002-02-14 <18Ö> 28 <1 -7Ö:> PetertG Ver. 2.1 <210 1 <211 > 20 <212> DNA <213> Adri dal Sequence <220>
<223> Desenption of Artificiai Sequence: Primer <400> 1 isggsigccsxe fc£.ggig»&<s<;§ ZÖ <2i0> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Áríífciat Sequen.ce<22Ö>
<223> Osscnpiion of Artificiai Sequers-ce: Primer <400 2 c?cs a a <? a a ss a. sí tgg* & ggtír %·
2:0 rsaüí /ka 3 * **♦ Φ ΛΑ x* * ν* Φ φΦ χ. 9 Φ Φ Λ ·♦» φ* « Μ * « Φ »t ΦΦΦ Φ φ Λ» <21 G> 3 <211> 24 <212> ÖNA <213> Artificiaí Sequence <22δ>
<223> Descríptíon oí Ariiflciat Sequence: Primer <400 3 acaggageTC aaaaq-ggsfce Ogye <210 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artlficlai Sequence <220>
<223> Description of Artificiaí Sequence: Primer <400 4 <2105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificiaí Sequence <220>
<223> Description of Artificiaí Sequence: Primer <400 5
O-ac 24 <2106 <211 >30 <212> DNA <213> Artificiaí Sequence
ΑΑ *·*♦* » «9 ,.»
ΦΦΦ « * Φ * W * ft ΦΦ* 4>»& .* »· Φ 4 < « y ** Φ $·* »fk ΦΦ φχρ <22ö>
<223> Descriptiön of Artifíoisi Sequance: Primer <400> 6 c«ígostttoa gwea&ötyg lö <21ö> ?' <211 >495 <212> PRT <213> Artifida; Seqvence <22Q>
<223> Descriptiön of Artifeial Seqtwce: CSFV mutant <4ÖÖ> 7
Met Cbi Lsi:\; Asm Kis ph-e Cl u 1.«·;;. b?.:„: Tyr Lys Thr Go r Ly® Gl n Lys
1. Μ» 10 i -T
Pro Val Gly Vsl Sb ζ>Λ ’úl Pro Val Tyr Asp Thr Ara Gly Arg Trö i^ítí
2C 13 30
Gly Asm rro S»r ?ΖΛ •' í ’·»*< >* Val *y >> A Φ, 'Ά Gin Ser Thr Leu Lys Leu 1 re
35 TÜ 4 5
yia Asp Arg Gly Arg Giy Asp :b Ary Thr Thr l«u Arg Asp Lc«· Tro
s a 55 G0
Arg Lys niy Asp Cys Arg Sor Gly Asn Kis- Lóé Gly val Sec Giy
55 ló 75 00
íls Tyr Hé Lys Tro Giy SVO Val Tyr Tyr Sin Asp- Tyr Thr Gly ?ro
35 50 9S
Val Tyr his Arg Alá 2ro LöU élv 3hv The Asp Gla Ars. Cm Dhs Cys
ISO
205 ,10
Glo Val Thr Lys Arg Xl« Gly Arg Val The Gly Ser Asp Gly Lys Leu it5
0
5
Tyr his He Tyr Val Cys Val Axp Gly Cys Hír L&U L&u Lys L«:_ Alá
130
Í3S
Lys Aly Giy Thr i?ro Arg Thr L&u Lys Trp Ilc Arg Aüs ?'he Thr Aa.^ 145 X.50 155 160 ? 0 3 ii4/RA2 «φ φ φ φ φ Φ ο Α Φφ* » β # ·» « *$Φ Φ* λ» ΦΦφ «W ‘ϊ'.
ρ Val Thr Sex Cvr Ser Asp M.p Gly Sár Giy
165 ‘ 3?Ö ' 175
J. ys Asp LV ?’> Lycs Fm Asp Arg Két Asrt Lys Gly ISO * 185- L»y 5 Leu Lys J.le M4 ISO
?í-o- .brg CIO 135 111$ Cle Lys Asp Srx Lys Tht Lys 330 i*rs Frc- 255 tep Ala Th r
Hé vai 210 Val Olú Gly Val Lys Tyr 81» IX& tyr 2.15 Lys 223 Lys Gly Lys Vai
Lys Gly 335 Lys Ar-h Thr Gin Asp Gly Lse Tyr 4is 230 ' 235 Asíj Lyu A su Lys Áré 24 0
Fro SA Sec Asg Lys Lys Léé Glo Lys AJ 3 Leu 245 254 Le« Alis Trp Ma Val •><;g s.' X* -3
th Thr 1 la leu L®u Tyr -81a Fra Val Ma Alá ?.6O 2§L \3 l.U As U Xle Thr Öln 270
Trp Asn Ivén, 378 3«r tep Aun Giy Tbc Asn Giy Sle ο λ e Gin Arg 203 Alá Ktet. Tyr
Lee Arq 240 oly \Asl ten Arg Oly L&u llis Gly Xle 2?S a rp 300 Fxo Cl« Lys Xie
Cys Lys 30$ Sly Val S*£<> Thr H£s L«v A.1& Thr As» 31Ö 31.5 ’V' U w A 5 <·$» u lg Löu Lys Clu 323
11 é Arg Oly wt Kel. Asp Alá Ser Glu Arg Thr 325 330 7\ί£Τϊ •Tyr Th? Cyu Cys '-! 'IC -f v>—> s3
&£g Le-u Gla Arg Kis &Iu Trp Asn Lys Kis Gly 340 54$ Trp Cys Asn Trp Tyr 350
Aso uc Asp ίϊϊ, Vi-'W*· V Fro Trp lle -Sin Leu MeT -Asn- Arg 350 rhr cin 305 Tót Asn L«u
Tor Gly 33 δ Oly fyo F,re Asp Lys Slu CVS- Alu Vai 375 Thr 380 cys Arg Tyr Asj>
Lys Asn 386 í' Asp Vai Asn Val Val Th? Gin Alá 353 34$ Arg Asn Arg étű Thr 400
'’-Fhr · »íí χ. φ i· mm :v>’55 \í Thr Gly cys Lys tys Cly Lys Asn éhe 4 05 410 Sex Fhc Alá Giy Thr 415
Val Lle Gin Sly éra Cys Asm Fh«- tea Val s«x Vai Glu Asp lle Leu 42-Ó 43$ O0
Tyr Gly tep h'is Öle Cys Sly S«X Lsu Leu Gin tep thr Alá Léé 43$ 4<0 4 45
Leu he-u Asp Gly fe£ Thx &sa Tbc He Glu Aísn ?ü.a Ac-g őíb Gly M? 4-S& 456 sec «ν»« » *» « *' *-* « « , « V « * ««· ««« » ♦ e Jb- « $ 3 »* «»» «» <* *:«<
Alá Arg vsi Thr Ser Trp Leó Gly Arg Leu Ser Thr Ma Gly Ly M 4?Ö .yjr /·»
BÖ
Lys Leu Cm Aig «rg sár Ly:
4GS>
ar Lat Ths Tr» Ph» 6h Alá Tyr Alá, Len <2108 <211> 492 <212> PRT <213» Artitóal Sequence ' xUJU V** <223> Descri n of Anificial Sáqusnce: CSFV mutant í400> 8
UiS- <5,tu Leu Asn Ki;: The C-ia Levj Leu Tyr Lys Thr Ser lys· Cin Lys Ί: 5 IC 15 ro Vei Siy Vai Glu Glu pro Val. Tyr Asp Thr Alá Gly Arg Pro 1«;
The Giy AT Tr« Ser Glv Vai Kis Pr« Sin Sor Thr Leu lys Leu Pro 35 i δ 45
Mi,<s Asp Arg Gly Arg Gly Asp 11« Arg The Thr tea Axg Asp leu Pro ' SS CÖ
Arg Lys Gly Asp Cya Arg 5ur Qy Asn Hi.8 L&u Gly Ρχ» Val 5«r Gly
70 75 Sö lie Tyr lir Lys Pre Giy Pro Vei Tyr Tyr Sin A.sp Tyr Thr Gly Fra
SS
SÖ
Vai Tyr His Arg Alá Pro L«u: Glu Phe Phe Asp Glu Alá Gio phe Cys
IM
110
Glu Vai Thr Lys &r.g Ti a Gly Arg V«1 Thr Giy Set Ahp Gly Lys LoU
115
125
Tyr His ΣΙ·© Tyr V'al Gys Vai Asp Gly Cys li& Leu í,«u Lys l,wy Alá .30
140
Lys Arg Sly Thr Pír Mg The leu Lys Trp Tle Arg Asn Ohe Thr Asi
MS
ISO
1GÖ
Cys Fí'h Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp .Asp Gly Alá Ser Gly Ser
X'J-A * V
5
Lys Μ» I>V& Lys Pro Asp Arg Hét As« Lys Gly Lys Leü Lyá lle Alá ISO 1SS ISO
165 ? vő L v 4 /&&£
Pro árg G|.ö his Sitt Lys Asp Ser hyn Thr Lys ?:s Asp Alá Thr
165 200 205
n« Val. Val Sitt Sly Val Lys Tyr Gin lle Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr iXls Asn Lys Asn Lys Pro
210 235 24 0
Pr:o Gitt Ser Arg Lys Lys Leu S.lu Lys Alá Les L«u Ali? Trp Alis VAX
245 2S0 255
lle ’ Thr lle. : Leu : tea ’ Tyr Gin Pro Val j Alá Als C Sitt Asn l.U ’ Thr Gin
2GS 2£5 270
Trp Aon Lcv ser Mg> Αλα síy Thr Asn. Gly Xle GL; Arc Alá Tyr
275 230 265
Lfen Arg Gi y Val Asn Arg Ser ΐ ie Tír 2 re Giu Lys Xle Cys Lys Gly
29Ö 205 300
VAL Pro Thr His X.eu Álé Thr Asp Thr i 51 u λ.»:?·.. Lys Giu lle Arg Gly
305 toü 315 320
Met Mer Asp Alá id Gitt Arg Thr As n Tyr Thr C ys Cys .üc Leu Gin
325 333 33-5
Arg his Gitt Trp Asn Lys őls Gly Trn Cys Asn Trp Tyr Asn lle Aup
340 34 3 350
VtO Trp lle Gin Len Heh Asn Arg Thr Gin Thr Asn Len Th r Gin oly
253 3 6-0 SS 5
Pro Br-n Asp Lys Glu Cys Alá Vél Thx: Cys Arg Tyr Asp Lys Aun Thr
201 375 330
Asp- Uhl Asn Val Vél Thr Sin Al.a Arg Asn Afg Tro Thr thr: hé» Thr
lS 3 39 Ö 335 4 00
Gly Cys Lys Lys Gív Lys Asn L'h« Ser The Alá Gly Thr Val lle Glu
405 410 415
Gly Pro Cys A»n Thü Asn Val Gér Val Glu Asp Jlr Lett Tyr Gly Asp
420 4 25 430
His Giu Cys Gly Ssr leu Len Gin Asp Thr Alá Leu Tyr Len Leu Asp
435 UG 445
Gly Hat Thr Asn The in Glu AAn Als Arg Sin Gly Alá Als Arg Vss.1
452 455 450
Thr Ser Trp Lett Gly Arg Sin Leu Ser Thr Alá Gly Lyn Lys Lett Gitt
465 470 475 4 50
Axg Arg Ser Lys Thr Trp The Gly Alá Tyr Alá Leu
4SS 4Sö
70SH4/'?AS <210 S <211>4Ö4 <212» PRT <213> Arti-fíctal Sequence <228» <223» Description of Artsficiai Sequence.’ CSFV múlani <40Q> 9
-Glu neO Asn jJis- éhe Glu Lsu Lh.g Tyr Ly§ Thr Ser Lys Lvs
X 3 10 1.5
Vax Gly Val 71a GI« Tts Val Tyr Asp Thr Alá Gly Arc prc Lcu
20 25 30
Gly Asn ?rp Ser Sin Val Kí.s ?r~:· < il.n Aey Thr Leu Lys Len. Pro
40 AG
Kis Asp Arg -Gly Arg Gly Asp ÍTe Arg Tbr Thr L&U Arg A.«p Lew Pro
5ö
&£$ Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn H>.& i.ers Gly Fc&<· Val Ser Gly
Ő*X5 78 75 S7
Tyr Ile Lyr, he §5 Gly Arc v&j. Lyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Fre FT 35
Ta L •Tyr 3is Arg .AO P*ís Geo GIí-í Lho Phe Asp Glu Alá Gin Ffee Cys
10 Ö Λ ΐ Λ
,>. \4 3 Λ. a. V
4lu Val Thr lys Arg TIa Gly Arg Va) Thz Gly Sh* Asy Gly Lys Len
·$?}:£ Ύ *W x ; Λ
1 &V X. Z. ^»·
Tyr His ne Tyr Va! Cys Val Asp Gly Cys íle Lég Leu Lys Geo Al*
no ns 140
L-h'- Arg Gly Thr ?íö Arg Thr Geo Lys Trp ile Arg Asn ?hn Thr Asai
145 ISO 255 140
Cys Fro Usu. Trp Val ISS Thr Ser Cys Sor Asp Asp Gly Alá Sex Gly ser 170 175
Lys Asp Lys Lys Fro Asp Arg Ηή. As-« Lys Gly Lys Len Lys tle Ale
ISO 185 1F0
'Arc Arg GIw Kis Giv Lys Mp ser Lys Thr Lys Fre Pro Asp Alá Thr
105 20&
11« Val Val Glu Gly v.al Lys Tyr Gin. Xle Lys Lys Lys Gly Lys V»X
210 21S 220
Lyr Gly Lys Asn Thr * Gin Asp Gly Lsv Tyr Bis Arn. Lys Mft Lys Pro
£ £ «. 77ö 235 243
'?ü:6 ΐ.;.4 /&£2,
51 * Φ x 9 ír * „ « A*. j. * * »* X * * * * * ♦ ♦ » ., , x‘‘ ’·· » •‘ ··· »♦
Pr'U GlU Ser Arg Lys lys &eu Olu Lys Alá Leu .?,«« Áls 245 250 Trp Alá Val 255
Ile Thr lie Leu leu Tyr Glu ?ro Val Alá Als Olu Asm 250 265 llo Thr Gin 2 70
Trp Ain Leu Ser Asm Asm Sly Thr Asm Gly Jl« SS a Árg 213 280 285 Ai» Heh Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser leu Gly II» Trp Áro slu 295 .300 Lys He cys
Lys 305 Oly Val 2ro Thr Mis Leu Álo Thr Asp Thr Glu Leu 310 Ü 3 Lys Cin liu 520
Arc Gly Mrt H«t Asp Ála S-ec Glu Arg Thr Asn Tyr Thr 32δ 330 Cys Cys Arg *j **& L/ i> 3
USU Öt. Λ Árg Hl κ Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Gys Asn 340 315 Trp Tyr Asr. 350
Ile Asp Áré Trp Ile Gin Leu Két Áw Arg Thr: Glu Thr 335 3§0 5hh Asm lm Thr
Glu Oly w 2r-:> i?sö Ásp Lys Glu Cys Asm Val Thr Gys Arc 375 380 Tyr Asp Lys
Ásn Thr Ásp Vei A” Val Val Thr Glh Ali Arg Asn Arg Őre Thr Thr
335 383 335 400
Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn ?hfi· Ser The Alá COS <10 Gly Thr Val 415
Ile Glu Gly 9ro Cys Asn khu Asm Val Ser Val Glu A&p LI 425 Xle Leu Tyr 430
iá.ly Ásp Mis Giw Cys Gly Sej? Ls« Leu Sir, Asp Thr Ál a 435 140 443 lea Tyr Len
Ásp 4 50 Gly Mer Thr .Asn Thr Ile Glu As-n Alá Arg Cin 455 450 Gly Alá AU
Arg 4 »5 v«> Thr Ser Trp Leu Gly Arc Gin Leu Ser Thr Al..a <W ' <73 ; Gl y Lys Lys 4 8C
Lsu Glh Arg Axo 3hl Lys Thr Trp The Gly Alá Tyr Aiu 435 490 Leh
♦ χ« <21ö> 10 <211> 495 <212> PRT <213> Art'rficiai Sequence ?esnvM2 *♦ <22ö>
Descripííon of Acificia! Sequence; CSFV rontani <400> 10
Hat Őla 1 Leu Asn Ci.s The Sle Leu 5· Xk?u Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin &·«χ3 Lys
S>r<5 Val Giy Vél Sie Glu Fro Vél Ty £ Asp Thr Al a S i. y Arg Pro Lee
20 25 30
?ha Giy Asa Frö Ser Glu Val Bis Pro Cin Ser Thr Lse Lys Leu ?xo
35 4 0 45
Kis Áss Arg Cl.y Arg Oly Asp íle Arg ííslv t. a ·: a r Thr Lee Arc Asp Len F r o
SS SS Sö
Arg Lys GXy Asp Cys Arg Sér Giy ASfs. s~b.s U Gi y ?x« Val Ser Oly
55 7Ö 7.6 30
n« Tyr 11c Lys Feo GXy Rre Val f$í»y Tyr Gin .Asp Ty t T'hr Cly Lrs·
85 VÖ 55
Val Tys Kis Arg Alá Fxo Lse öle Fhé Fhé Mt Cie Ma Slrs Tha Cys
1 ü>5 195 110
Giu Val Thr Lys Arg lle Sly Arg Vél Thr Giy Ser Asp Oly T >/v L««·
1X5 ’ ISO 125
Tyr hrs lie Tyr Val cys Val Asp G ί 5 Cys He Lee Lse Lys Aia
ISO 135 140
Lys Atg Slj Thr Tro Arg Thr Leu Lys Trp 11« Arg Asn 8he Thr Asn
14 5 ISO γ χ. . 5 100
Cys gro L&e Trp Val Thr Ser. Cys Sei As|' » Aa j > S.H / A.V3 Ser Ö5 Se. r
IC 5 3 7( 176
Lyh Asp Lys Lys Tu Asp Arg Ar-n syé Ol y Lys Le^ Lys I .1«!
*<· s· c. > óz n
ί Λ $ >· 1 j? V
?iő Arc 5iu-Sis -Gitt Lys Asp· Ser V Λ t Thr Lys ζ5 Τ' .··-< x i, V Fto Asp· AU Tfe£
19 S 2δ8 -> •‘h £ <C V sz
Es Vél Vél OX« ’Siy Vél Lys Tyr Cin lle Lys Lys rya GXy Lys val
ϋ i a 215 ..· a. y
Lys Giy Lys Asn Thr Gin Asp Giy Lee Tyr nls Asn Lys Asa Lyr s?£O
225 211 '> A <»' X* \Z 2<Ö
Τχο SÍ a Ser Mg Lys lya Lw Clu Lys Alá Lee Aia Tiy Aia V <; 1
MS 260 A
lle Thr lle Lee Lev tyx SlA Frö Wi AU Ma Gle Α::ά lie Thr' Gin
2SÖ 2S5 270
'J06 i 14/?A3 ♦ X « ;p Ass> Leu Ser Asp Asn Gly Thr fen Gly 11« Gin Ary Alá Set
280
55
Leu .Arg Gly Val Aso Arc Ser Leu Lys Gly 250 235
Ά'Ρ Ixo '·.: 1 ’Á Ly:·. ϊ. 1. e seb
Cys Lvs Gly Vei ?r* Thr Pfe Lsu AU Thr AsL Thr Gly Lys Glu
Ί ö; ¢.
.310
315
AZ ?n íle Arg Gly fost Mét Asp Alá S«K Gitt Axg Thr A.Srs Tyr Thr Cys Cys
S
30
335
Arg L«u Gle Arg Kis Giu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
34.0
34L
350
Asn lie Asp Orv Tép He Ön L«e SSefc Asn Ara Thr C'tns Thr Asn Leu .355
3$0
30:
Thr Glu Gly ?p Pro Asp Lys Gitt Cys Alá Val Thr Cys Áru Tyr Asp s
37!
XLO
Lys Asn ThP .fep Vei fen Vai Vai Thr Sí» AU Arg fen Arg ?ro The 3$ 5 130 135 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys öy Lys Asn Ohe Gc-r ?he Alá Gly Thr
405
410
Val He Sitt Oly Oro Cys fen ?fee Asn Val Ser Val vlu Asp 5le Le
4r0
430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Oly ur Lav hau Gin Asp The Alá Leu Tyr
440
445
Lett Leu Asp Oly Mer Thr Asn Thr JJe Glu fen Alá Arg Gly Gly tóa
450 th5
Alá Arg Val Thr Ser Trp Lett Gly Arg Gin Leu Ser Thr AU Gly Lys
Ló 5
475
Sí
Lys L«tt Glo Arg Arg Sér Lys Thr Trp hhu Oly AU 'Tyr Alá Leu ’íS
4S0
435 <210 TI <211 >495 <212> PRT <213> Artificiai Ssqoence <220 <223> öescríption of Artifíoíai Sequence; CSFV mutant <4öQ> 11
Met Glu Leu Ásn 8Í$ Vha <31 u Leu Leu Tyr 5 10 Lys Thr Ser Lys 41 n Lys 13
P t n Vei Gly Val OlL <31 u Pro Val Tyr Asp Thr Alá Gly Ar<? Pro Leu
20 85 30
Phe 41 y Asn Pro lel Glu Val Kir pro Gin Set Thr Lsu Lys Le;.!· Pro
35 40 x y·.
Ki,2 Asp Arg <SLy Arg Liy .Asp Ile Arg Thr Thr I>a« Ax-g Asp Leu Pro
50 55 38
Arg Lys Gly Asp Cye Azé Ser 4,1 y Asn Kis Leu Gly Pro Val Ser Sly
δ» ?ő 75 80
Xle <ϊ»ΧΪ·»· X- Jf J~ Ile Lys Kro Gly Pro Val Tyr Tyr Kin Asp Tyr Thr Gly Pro
85' 3Ö 0,3
Val Tyr His Arg Alii Pro Leu CÜv he Phe Asp Glu Alá «In Phe Cys
100 X85 no
, V A? .»»LÍ VAl Thr Lys Ari ' K Oly Arg Val Thr Oly Ser Asp Gly χ»ν« Leu
ns ivó 125
Tyr S is íi«s Tyr Val Cys V«1 Asp 41 y Cys He Leu LeL Lys Lr;.i A.le
llő 135 ·$ Λ Ά i kV
Lys Arg Oly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Tle Arg Asn Ftee Tht Aan
145 155 138 ’ 15Ö
cys ptO Mu TCP Val Tht Sex cys Sex Asp Asp Gly Alá Ser 4ly Ser
15$ no 3 7S;
Lys Asp Lys Lys Arc- .Asp Azg két Asn Lys Gly Lys l.»w Lys íl® Alá
180 18 5 180
?X» Arg Glu Kis 51« Lys Asp Sár Lys Thr Lys Pm Km Asp Alá Thr
103 150 205
IU Val Val Gly Oly Val Lys Tyr 4lo I3e Lys Lys Lys Kly Lys Val
UÖ 215 28 0
Lys d y Lys A$n Thr Kio A.sp Cly Lég Tyr Sís Asn Lys Asn Lys ?xo
£25 230 235 W
Pre SIu Ser Arg Lys .Lys Lsaí Glu Lys AJ a 'Lw Leu Ma Tip Alá Val
245 ' 2$0 25S
Ils Thr H.p Leu Leó Tyr Gl» Kro Val Jú« &13 Sia Asn lie Thr Síj>
2 30 2-6S A>'7 Λ ή» > \y
Trp Asn Leu sex Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Al® Hét. Tvr
205 280 283
Leu Arg Sly Val M Arg ,$at Lys Gly :le Trp m> CIP Lys tl«
2$ö 235 300
QSils/iUZ
Cys LyS Gly V&l érő Thr His Us Al a X h r Asp Thr Gl© LM Lys g x ©
305 Π 315 320
He. Arg Giy kar Mer As p Al a 3 e r Gi© Arg TM Áss Tyr The Cys Cys
•ii 3 330 3 35
Agg Lett >31 h Arg lílá 3Íu Trp Asrs Lys Lys ·** ! ©M Trp Cys Asn Trp Tyr
> Λ Λ Ο;*λ v :>n 350
Asn 11« Asp ?ro Trp ih Cin Leu Met Asn Arg Thr Cin Thr Asn Len
355 303 3hS
Thr Glu Gly pro j?rr> Asp lyr C.1.U Cys Als Val Thr Cys· Arg Tyr Asp
3?Ő 375· 330
tya A.;3B Thr Asp Val Asn %1 Val Thr Gin AH Arg Asn Arg ^rö Thr
3§·^' 33ö 333 4 00
Thr Les Thr Gly Cys pys Lys Gly Lys Asn éhe O<5 £ The Alá Cly Thr
4 OS 410 415
H j .l is de Giy Pro Cys Asrs Ph& Asn Val S *- Vei Glu Asp He Le©
$ Zs. -sí- 4 30
Tyr Gly Asp Mis H Cys Gly Ser Le© Gin Asn Thr Alá Le© Tyr
43 5 M 4A3
Les Lee Asp G'Jy ;m. TM Ah ή Thr II-e Cl© Asn Ai a Ace Ciη Cly AI s
45 3 x « c *30 4SÖ
Alá Arg Val Thr Ser Trp JLSf'ú \5 Λ y Arg Gin Les Ser Thr Alá dy Xys
4A5 H 415 Λ & A \ Et V
X*V .3 Leu Glu Agg Ang 5te£ bys Thr Trp ΪΜ Cly Alá Tyr Hs. Leu
4S5 4 §>ö 4 Ή
<2í O> 12 <21 ί >495 <212> PRT <213> Artificiaí Sequeoc® <220>
<223> De&cnptk »n of Artsfía ál Sequence: CSFV múlani
<400 12
Met. űie Lm Asn His Lha Glu La© Leu Tyz X»ys Th e Sas Lys lty&
't y V
V· X.
0r© WI Gly Vet €1« Cl© Ho Val Tyr Asp Thr Ma Gly Arg Pm Leu
25 lö
Fha öiy A.ís<“í Arp Sor Glu Val 35 His Arc 40 • Gin S«?£ The leu Ly» Le? 4 5 ~ Pro
Asp Arg Gty Arg Gly Asp 50 5 5 lf Arg rhr Thr Lee Arg Asn leu Tro 50
Arg í$ 5 Lys Gly Asp Cys Arg 3ey ?0 Gly As.ft Hús Lep Gly Pro Val Ser Sly 7 5 SG
Ile Tyr Ile Lys. Pro Gly Fta Val Tyr Tyr Gin Ásp Tyr The Gly Pro
33 go 3 s
Val Tyr His Arg XU Ars- leu ; Glu yhr -be Xso 1.1 o Ain Gin Th-s r< , , _ AU
100 105 Ili
Glu Val Ths lys Arg 11«·· Gly ·< t ς Arg Val 120 Thr Gly Ser Asn Gly Lys Lfo Leu
Tyr Hl» Uö Tyr Vari Cys Val Asp Gly Cys Lle ben Leu Lyu Wu AU
13Ö %S 140
Lys Arg Gly Tu Pro Arg Thr Leu lys Trp 73« Arg Asa The Thr Asn
145 151 lőS 1GÖ
<,- 'y «5 Pro Lúu Trp ΤλΙ Tőr Ser Gys L«r .Xsp Asp Gly Alá Ser &Iy Ír:Si t'
1 SS 170 1.7 5
Ly» Asp Lys Lys Tr» Aap Arg Lys Gly Lys Leu Ly« 11« Xls
131 U5 ÍVÓ
?ro Arg Glu Air Glu lys A»p Ser lyr Thr Lys 3ro 8rh Asp Alá Thr
135 2 G0 2SS
u® val ΆΤ, Glu Gö y vu Lys Tyr Gia íle Lya Ly» Lys Gly Lys VSsl
·? ·> a v i a *«W ί λ-' <μλ ί.Λ.ν
lys Gly tyr- Xsn Thr Gin Asp G,;. y Ipa Tyr ifi»· Aa-tt Lys Asn Lys erő
‘5 A A A. ·.«? 230 235 240
TP3 Glu Ser Arg Lys lys Leu Glu. lys Alá Loa Leu Alá Trp Alá V a 1
245f 050 255
i I «: Thr 1;.« h«su Leu Tyr Gin Tro val. Alá Alá, G.l« A»o Ile Thr Glíl
?:85 215 270
Trp Asn leu Sex Asp A&x Gly T.h.r Asn Gly Π« Gia Arg Alá Met Tyr.
275 281 295
Leu Ara Gly Val Aöh Áru Ger leu Lvs Gly Ile Trp i?r& Glu Lys I le
230 ” 335 330
Vyr. Xyp Gr y vsí. 7xo Ihr His leu Al-s i Thr Asp Thr ÓXu. Usr Lys Glu
305 510 31$ 120
lle Arc Gly Met Met Arp Al» Sex Glu Arg Tor 5 70 Asn Tvr Thx Cys Cys 335
Arq leu Gi n Arq HiS 340 Giu Trp Asn Lys Leu Gly 745 Trp Cys Am Trp Tyr 350
Asn. Us. A?p Pro Trp 1 le Gin. Leu Mes, Áss, Arg 303 Thr Gin Thr Asn L«u sé-5
The Giv Giy Orr 9» $?0 Asp T«ys 31S Glu Cyo AU val Thr y? Arg Tyr Asp 380
Lys As» Tér Asp Vai 5^3 A-O'i Vő! Táö Val Thr Gin .Aia 395 Arg Mis Xxg rt® Thr 4 00
Thr ku Tfef Sly Cys 408 Lys I-yF Giy Lys Aon 2n« 418 $ Spr ího Alá Gly Thr 4 15
val Π© Glu Sly Pra Cys Ás-a Phe Asn Vei Ser Vll Glu Asp He Leu
42b / ~< C '$ Z v 4 2 0
Tyt Gly Asp HU- Glu £/>$, Cys Gly Ser Leu Leu Pm 4 40 j->.s ρ λ o í /ri e o A u *'yx 445
Le« Leu Asp Gly éter 450 Thr Asn 4 SS Thr Jl« Glu A~sn Aia Arg Sin Gly Alá 488
Alá Arg Vei Ths S«r 4 £5 T rp Leu 478 Gly Ár® Gin Len 4?S Ser Thr Aia Gly Ly$ 480
Lys I-eu Slu Arg Arg 4S5 SOS Lys Thr Trp Phe Gly <90 Aia Tyr Aia Leu 4 S $
<210> 13
<211> 495
<212> PRT
<213> Artífíoiai Seguence
<220>
<223> Descríptíon of Artifícíat Sequenoec CSFV múlani
<400> 13
Mc?t Glu Ixu Asn Ars 1 5 aho Glu Lo« Lsu Tyr Lys •S ί\ Λ \J Thr Ser Lys Gin Ly$ 3/5
Tr* Val Gly Val G.lu Ό \V·. Z V G .ÍU F:r.o Val Tyr Asp Thr 25 Aia Gly Arg Pro Leu 3Ő
Phé Gly Asn Pto Sex 35 y* i λ % V·. í •UilU Vsía Kis Pro Gio Ser 40 Thr Lee Lys Leu s?m 45
« 1 5 Asp 50 Mg Gly Arp Gly- Jtóp lls- Arg Thr ' 53 thr ϊ Ar\£ Asp· &Í3 Leu Fos
Arg Ly;; cl y Asp. Cys .Arg Ser Oly Asn iüs Leu Gly Pro Val LeK Oly
65 70 7 5 80
Tyr Ile lys Pro oly Pre Val Ty.c Tyr . 01 h ; -Vp Tyr Thr Gly Ara
85 AO $5
V&X jTy’S’ Kis Arg Alá Frss Lee Glu Phe Phe ; Asp i i»í v Al a GX ü Phe Cys
100 1.05 113
Glu vei Thr Lys Arg líe Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Oly Lys Leu
115 130 125
Tyse Ms. 11 « Tyc Val Cya Val Asp Gly Cys lla Leu. Lee Ly£ leu Ma
130 135 IS δ
Lys Axg —1 ,, Th.s ?C0 Αε-e Thr l*«í lys Trp J la Mg Ars Phe Th n Aan
145 150 15 3 *} .e· ,·*\ Ixsu
Cys P£ö Lm; Trp Val Thr Ser Cya Ser Asp Asp Gly Als Ser £ly S^r
l’SS no Π5
.Lys Asp lys Lys iírc Asp Arg Heh Asn Lys Oly rys Lm Lys Ile Ale
1TC ISO ISO
Pro Arg Glu His Glv: Lys Asp Sex Lys Thr Lys hö Pw Asp Ma Thr
135 200 20 5
ne Val W) ois ®iy Vsi Lya Tyr Gin £1« Lys Lys rys oly Lys Val
>, n A. --A·' 215 •χ· χ» V
Lys Oly tiVíS Alá Thr Gin Asp Gly Lev Tyr 6? \ <£ Mn Lys Asn uy s ; r tt
22S 230 £35 240
δ re Slu S&£ Arg Lys Lys Leu sin Lys Alá Lee Leu Ma Trp Alr> Val
24 3 250 255
n« Thr II e L&Q Leu tyr Gin Pro Vsl Ma Alá Gitt Asn 11« thr Gin
260 255 270
*·»»·»» s » p Asn jLí) V Sás Asp Aén Oly Thr Asn Gly Ile Gin Arq Alá Köt Tyr
2TS 2S0 > * rv
Leu Arq r-1 V Val Asm Arg Ser leu Lei Gly Ile Trp Trc Glu Lys He
230 .\lA ..< .310
Cys lys ζ?Λ V Val Tra Thr Kia Le-u Als Thr Asp Thr sU ley Lys* Glu
305 310 315 323
llc Arg Gly Kpt Rpr M Ma Ser Sle Arq Thr An Tyr Thr ; Cys Cys
32 5 330 33$
Π os u «/m
4* »
Arg b«su. Llh Arg His Giu no si* V··*·^ ÁZFt lys .345 His Oly Trp Cys As π 350 <P>. t 1 p Tyr
Asc lle. Asp 3SS Fro 'Trp lle Sin Leu SS-ó $φ»ί* Asx Arg thr Gla 3 95 Thr A s ifi Leu
T' X; Slu Gly 420 Aro Frs Asp •Ly .¾ 3Ϊ5 Glu Cys A.n VA.l. thr Cys 3« Arc Tyr Asp
Lys 30 Asn. Tfer Asp V»i Asn 300 Va í *> -\5f Val Thr •G1 r Ar..?. Arg A κ n 335 Arg Fro Thr o
Ajs ψ. ·ίΛ ·*: L«u The Gly Cys Lys <05 Lys Gly Lys Asn The Ser ph« 410 Aj <t Gly 415 thr
Vei Ue Rio L-L y 3 ε £? Cys 420 As r, Fhe Asn <23 Val Ser Val Slu Asp •m ~ie Lsa
Tyr δ-ly Asp 43-.S His ele cys vr y Ser 440 O Leu tr; Asp Thr 4 45 Alá Leó Tyr
L«V Leu Asp 4 50 Gly Μή W Asn 4 SS thr ι n Clu Asn .Alá Arq X .ff ff» SStU Gin ciy AU
Alu 465 Arg Val Thx Ser Trp nő Lee Gly Arg Gin Leu Sex Thr 4 7-S Au <$. Gly Lys no
Lys Leu Giu Arg Arq S-ai Lys TAr Tcp Phe Siy Ab Tyr AU Leu
<21 Q> 14 <211 >495 <212> PRT <213> ArSOdaS Sequence
<220 <223> DssO: pöon of Aríifidaí Sequence : CSFV muisni
<40ö> 14
Hét 1 Giu .oLL A.® η ürs 2í'jú tel U Leu Leu Tyr U jLV-Íí Thr Sex Lys <*V5· 1,5
F'Iö Vél <51 y Val· Glu Glu *5 í’i V Tro Vsi Tyr 25 AS.p χ- 1 ti Γ AU Gly Arq .4 ·ν» ?£© Le a
Fhe C<y Asn 8rs Ser Giu 35 Val his ?n <4 Gin Oer Thr L^u Lys 45 33« n Fí'ö
•30
Mis ASO 50 Arg Gly Arq Gly A.sp Ue Arq Thr Thr L«« Arg Asp X.«n Pro
55 6Ό
Aiq Lys Oly Asp Cys Arq Sár oly Asa His Laa Gly Pro Vél Ser Gly
íGG. 7;) ' s. <* n
.-.·
X Tyr 2 Is tys Pro Oly Pro Ch Tyr Tyr Sin Asp Tyr Thr Gly Tre
SS 50 ' 05
Val Tyr Kis Arq Ms Pro Le:; C.i. o Phe Phe Asp· Gin Alá Gin Phe Cys
ιοέ •OS .11.0
Gl u v a i Thr 'Lys Atq Πκ Gly Arg Val Thr: Gly Ser Asp Gly Cys Len
115 120 ΐ S £. íi ··' X*
i. Υ£ His IU Ty* Val Cys Val Asp Gly Cys lle Leu Len Lys Len tóa
i.30 135 140
JLys A .·... ·-' Gly Thr 2m Arq Thr Len Lys Trp 21« Arg. Asn Phe Thr tea
*4.5 ISO 153 2GQ
Cys érc Len Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Alá Syr Gly Ser
1S5 170 * 175
Gys Asp Lys Lys Pro Aap Arq Met Aso Lys Gly Ly« Len Lys lle Alá
·: SA í h h Ϊ Q<!
Φ, ví Y*
Sw Arq Glu Kis Gly Lys Asp Ser Lys Thr Lys Tro Pro Ai;p ALs Thr
195 2 OS 205
lle Val val. Slu 'Άϊ' Val Lys Tyr Gló Lle Lys Lys Lys Oly lys. Val
no 215 m -G ,'Y X-. .»» Y·
Uy.s Gly X Lys Asn. Thr Glo Asp O l y Len Tyr His Asn lys Asn Lys Pro
225 230 «C ± Λ •ikü-Xí
Pro Gin Ser Arq Lyh Lys Les Gin Lys Ai» Len Len Ma Trp Ma Val
245 230 255
Χ» X - xx$ THr 1.1 a Len len Tyr Gin Pro Vei Ma Ma Gin Asn lia Thr Gin
'5· jí? ft ‘‘^ίΟ,Α ·> T5 ,,V
4··ν v ÍL & 2 / j·
Trp Asn I.m Ser O.sp Aso Gly Thr Asa Gly He Gin &rg Alá Kei Tyr
2?S 2G0 28 5
ί~ρ£ 'Λ Arq Gly Val Asn Arg Ser Len His Gly lle Trp Pro Sin lys Xle
290 >«i4 -X. -v *k? 300
ÜV3 Lyo Gly Val Tró Thr His Len Alá Tar Asp Thr Gly L&u Lys Gly
3W 3 IS 315 120
Xle Arg Gly Kst Hst Asp Alá S«r Glu Arg Thr Asrs Tvx Thr Cys Cys
32ö 3 39 T35
Arg !«U Gin Gly his Cin Trp Asn Lys Kis Gly Trp Cys Asn Trp Typ
3 4 0 345 35ö
08Λ: 14
Asn lle Αίψ Ft© Trp- Ile Gin Lse Met Asn Arg Thr Glft Thr Asn Let
3SÖ
35:
Thr Glo Oly ?£» Crv Asp Lys Glu Cy;.· Alá Vaj Thr Cys Arg Tyr Asp
370
375
3BÖ
Lys As-n Thr Asp Val &»« Val Val Thr sin Ma §5
3>0
3S5
Asn Ar<r Fi© Thr 400
Thr ást; Thr Gly Cys Lys Lys Gly lys Asn Phe Ser ?he Alá Gly Thr
405
50
Glu Gly Őre Cys Asn Phe Asn Val Sex Val Gitt Asp II® Let 42 δ 425 4 30
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser L«n Létt Gin Asp Thr Alá Leu Tv;
4.35
Ö
4.$ lan Leu Asp· Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Alá. Arg Gin Gly Als
450
455
SO
Alá. Arr? Val Thr s«r Trp lett Gly &xg Gin Leu Ser Thr Alá Gly Lys
450
Lys Líju Gitt Ar-g Arg Oer Lys Thr Τερ Phe Oly 3Α.1.» Tyr Alá Leu
455
30
435 <210> 15 <211> 495 <212> PRT <213> Ardhda; Sequsnce <220>
<223> Descrípbon of Artífidaí Sequence: CSFV muíant <4ÖG> 15
Mafc Glu &tv Asn His Phe. Glu Leu Leu Tyr Lys Thf Ser Lys Gin Lys 1 5 50 * 15
Tro Val Gly Vei Gitt 20
Bre Val Tyr Asp The Alá Gi.y Ar<j «>m Lav 25 3 δ i?he Gly Aá-« Pro Ser Glu Val tt$ Prn Gin Ser Thr Lett Lys Lett Pto
4Ö his Asp Ax§ Gly Αΐψ Gly Asp lle Ar^ Thr Thr Lőtt Ary Asp tea Fro
3» $'.Λ
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Sht Gly Asa Mis Lett Oly Oro Val Ser Gly fcS
SÖ
7ű?/1íá/’ra:·;
♦ * * X «
Tle Tyr Iic Ly;; Pro Gly Pro VhX Tyr 1 SS Tyr Gin Asp 30 Tyr Thr í Ily Pro 35
Vei Tyr Al s Arg Als Fxo Leu ölé Ele Phe Asp Glü ftla Sxe Fhe Cvs
10Ö 105 no
ulti VO1 Thr Lys Arg Xle Gly Alg Wl Thr Gly Ser Asp Gly ’ Lys Leu
> 3 A 130 ί -\< sr ιό.
?y.t Kis Xlc Tyr Val uys Val Ρ.ορ oly Cys XX e Leu Leu Lys Leu Alá
130 135 W
Lys Arg Glv z Thr Pro Arg Thr leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe T’br Asn
ί a o I 3 0 1 s s 1 %S
Cys Pro Lóé Trp Vnl. Thr Ser Cyr Ser Asp Asp Gly Alá Ser Gly Per
iOS no 175
Tys Asp ,.ys Lys Pro Asp Arg Hót A»h 'Lys Gly './<:. I-e-u Lys 1.1 δ Ara
ISO ' ' 105 HO
Tro Arg Glu Hxs- GX« Lys Asjs Per Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ás Thr
195 : ne •>en
1 ο o
Xiá V>ú u« y ,, Giy V&X TVa GÍTí • * «* .S ile Lys Lys Lés Gly Lys V«tl
P3Ö 2 15> 2PÖ
Uy ii· \y <iy Lys Ássn Thr Gin Mp Gly Leu Tyr Ars Asn Lys Asn Lys éré
Λ ‘‘A >* Λ<*> <·** •£\?V P 2ó 340
Gle Ser Arg Lys Lys L«n Glu Lye Alá Leu Leu Ma Trp AT a Var.
.245 250 355
Xle Thr ile Len, L«u Tyr Glu Pro Val .Alá Ál a Glu Asn Ha Thr Gin
TfíSO jí.4 ven
és V>\J Ά v>;> <U i V
Ttss Aon Len Ser Asp .Asn Gly Thr Asn Oly He Gin Arg Alá Hét Tyr
27 S 3 M ·?$**·. Ajt '# ·*»
Leu Arg & t y Val Asn Arg Löt: Leu M« Gly Ile Gry érő Glu Lys Xie
2TO 2 PL .30 S
Gye Ly,íi Gly Vai Pro Thr kis Leu AJ a Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
3 ΟΧ- 310 315 320
Ι U Ar g Oly Hat S4et Asp Ali? W GXu . Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
\? « V- 13 0 035
Ary Leu Cin Arg Alá Glu. Trp Asn Lys his Oly Trp > Cys Asn Trp Tyr
δ
3TS
330 ása Xle Ásp lep Ha Glh te Hét Asn Arg Thr Pln Thr Asn Len
3U
3$0
6α·, ο
thr Glu uly Pr« FfO Asp i*y <> Glu Cys Alá V a i Thr Cys λ V .·« rvi-g Tyr Asp
370 3 Aí:.S ISO
Lys &»r$ Thr Op Vü 1. A&ö val Vsl Thr Gin AÍ« Arg A.'íp Arg ilo Thr
18$ 3 s δ Tű 5 4 DG
Thr Lsa Tár Gl.y Cys Lys Lys Gly T.y.« Asn Pha Ser Phe >Á>i Oly Tfcs
4őS 4 ί 0 413
vai lle Oly -Gly P EO A^Á The Ms V&i Ser Ί& :. Gtu Asp lle Leü
420 433 410
Tyr Gl y M His Glu Cya Gly Ser Lesi J.nu Gin Asp TÁV Am Tájíí Tyr
435 440 U5
űeu Aip Gl y K?í Thr Asn Thr Tl« Glu Asn Ál a Arg G)r. G t. y Al»
ISO 4 55 -¾ -r» 1/
A ί & Arg >. $'2,- ' ►'S*'* » V ·&.!. XvXi. Se Trp UíU Gly p, r s'x Gin Lsu S*x £ v· 1 ·! 1 X Al« Oly Lys
478 415 .·* i' A b M
by g C? A-f 2 Ser Lys Thr Trp Tbc Gly Ál a Tyr Al a Leu
* ö r '$ v d 4 43 40 5
<210> 16 <211 >494 <212> PRT
<213> Artificiai Sec <220> <223> Descríptson <400> 16 ;8<2CC Of An se tiífcíál Sequence; CSFV mufanf
>Set ö u Leu ASO HÍ5 pfee 5 S j. sí LeC Len Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Cin 15 Lys
?ro Va 1 Oly L'n.r ’S. 5<3 J. ti Pro Val Tyr ?·£ 5- Asp Thr Alá Gly Ar g 30 ? Í-U Léu
Phe Gly Ax? R 30 ?rg :S&2 Val Hls 40 Lse Gin Tar Thr Leu 45 Lys Lau PtZs
Hlő Asp os Ary Oly Ax’í^ Gly ASp 5$ a« Arg Thr Thr Len 00 Arg Asp Leu b jtej.
Arg 43 S· Gly Alp Cys Ar<§ 7Í Ser Oly Aőii Mis Lse 75 Gly Pro Val Ser Gly 8Ö
lle Tyr He Lys Px£> Gly 85 Pro Vei Tyr Tyr 30 Gin Asp Tyr Th r; Siy SS Ár»
η 'vQ 4 < Λ Λ'*' Λ ·? • ‘..·X Λ J. ·} / ** ♦ Λ ♦ » *X#
VM Tyr His Arg AU s? re Lse Gx.il ?h® ϊ'ΐϊί:'. Asp C.: ‘.2 Ars Gin Hhe Cys
iga 103 110
Glü: Val Thr Lys Á£^' He Gly Arg Vh 1 Thr Gly Ser Asp Gly Lys Lev
11$ 12Ö 225
Tyr His Ha Tyr Val Cys Vad ASP Gly Cys Ile „n, Lee Lys Lee Al«
uc 115 140
Lys ÁCS Gly THs Olás Arp Thr Lse. Lys Trp 11« Ara Asn 7h« Ths Asrs
245 158 l5'3 ISO
Cys ?»o Lsv Trp Wl The Ser Cys 6er Asp Ása Gly Alá S«r G i y Saí
103 170 125
Lys &3ξ» Gys Lys Tso Asp ÁTÍf K&r Asn ϊκ Gly Lí'YVS ii-^Xí· Lys- ILe ÁÍ3
UO 185 133
Ara Árq C.lc Hív ts.i.W Lys Asp Ser Lys Ttu T '->JÍ *' ?» Pro Áyp Ms Thr
1VS 260 305
Ik Vsl Vei GÍv Gly v«l lys 1 V £ sin 1 1<í Lys Lys wye Gl y: Lyá· Val
9 í A\ -a· v 213 223
T -,· ,- <j, Gly Lys Ás ή Thr öle Asp Gly le is Tyr his Áss Lys Asn Lys JJ: , .-:
225 234 235 240
Prr Ur á?3 Lys nys e®e Giv ey s áíá LVO Lsü Ma Trp Ál·« '·*& 1
245 230: 253
Ile Tőr 1la L©u jLíSbJ Ty r Sin ?r<> Val ÁU Ál 3 Gl« Asn lle Thr Gin
246 255 270
Trp Asn Leu Ser ÁSÖ X Ásft Gly Thr ás. n Oly •V Ί _ J. X. λ£ -Sin Ára Alá >2ep Tyr
275 230 ?s c k. A? v*
Lee -?\.X g Sly Val ÁSÖ Arg Svy Us ói s siy -v > US Trp ?r® G.íu Lys Us
·> ώ 235 360
Cys Lys VI ν Va .1 Lre Thr 8is l.ea Ál. 3 ·*?··*}·. ».· Asp Thr Glu Lee Lys Gin
305 A V 315 320
II.® ΛΧ9 Gl y Ή®r hst Á5p Al-3 0' bv A- Lle Ary Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Áry Lsu His Trp Ars Lys Fh.« el y Trp Cys Á-SP Trp Tyr Asn
34 ó 345 3S0
2I.e Asp Tro Trp LU Gin. Lee Asn Ara Thr Cin Thr ÁAG Lee ‘*Ρ ^.. £
355 <^W 385
Gin Gly íl2 ?*C· Ásp Lys Glu Cys Λ.1 a V.3.I Thr Cys Ar4 Lys
340 375 380
Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gla Alá Arp As n Ar g; fsa Thr Thr
385 364 385 4 00
teo ♦ ·« <e ♦ * * * * »♦ * ♦ * * 4 ♦ ·· B * * « ·« ·», λϊϊ Thr Giy Cys Lys Lys Gly Lys, Asn Pa-s Ser pha Ai &
X -Tj s ’ί L- x
41C
Thr Val 415
Tla Glu Gly í’rc Cys Asn Phe Asn Val Tár Val Glu Asp l la Vau Tyr
425 .« '3 <' <5; 4'W
Gly Asp Kis Glv Cyg Siy Ser Leu L&u Glo Asp· 7LS Alá Leu Tyr Ls-u
C A £L > J> í>
40
X -5 ·.< *S · 5-.>
Leu Asp Gly Hot Thr Asn Tar lle Glu .Asn Alá Arg Gin Giy Ara. Alá
57 «55
460
Arg ν»! Thr Ser Trp Leu Sly Arg Gin 'Leu Ser Thr Alá Gly Lys Lys
70
475
4S0
Len Glu Arg Arg Ser Lys Thr TCP ThP Giy Alá Tyr Alá Len ,í ;<r
DL <210> 17 <211 >495 <212> PRT <213> Arttftöaí Sec uenee <22G>
<22S> Deseription of Artsfídal 'Sequence: CSFV rontani <40Ö> 17
Hat 1. Glu Lan Asn Ma S S Phe Gin Leu len Tyr XV Lya Thr Ser £/V5S Gin 15 Lys
Ρΐο Wl Giy Val A A, r u &.X.U Glu Pro Vai x y a 1 5 Asp Thf Alis Giy so Pro
Bhe Gi y Am 35 2xg S&r es i 'x3 Val Kis 4 0 Pro Gin 5 c Thr Lón 45 Lyv Leu Pro
Mr Atg 30 Arg Gly Gly Aon SS Ha Arg Thr Thr Lfen L0 Arg Aáp Leu íC* £ Ό
Arg 5S Lys ui y Asp Cys 1h »~,-x ΛΛ.§ 7 0 Ser Giy As á Ki. 4 Len 75 Gly Bse Víd Sor Giy 5G
Ik Tyr T \ Λ ai- A lvó ? ro §5 G.ly Pro Val w Tyr 20 Cin .Arg Tyr Thr Giy SS Pro
Val ».j> ·>- HIS Arg 10 0 ΑΧίϊ Frs Len Glu Pb,a JÖS Phe Aon Glu Alá Gih 110 éhe Cys
elv Var <?>}* β k»-.\ Lys ÁSS? Xie Gly Arg Val Thr Gly ser ASp Giy Lys. Lan.
Tyr His 135 X J. V * X* Vá) Cys. Var. —Öv i.ya x 1 a 133 Lőtt Leu Lys Leu Alá 140
Lys Arg 145 Gly Thr Tro Arg TSÖ Thr Lett Lys Trp Ha 155 Arg Asn éh a Thr Asa ISO
Cys Leu Trp Val l§5 Thr G«r Cys Ger Aap Asp· n$ Gly Alá Ser Gly Ser 17 3
Lys As ρ Lys Lys 180 ér.·» fep Arg Méh Asn· Lys Gly 155 Lys Lőtt LyS llö Alá 130
Tre Arg Gitt Kis 155 Gitt Lys Asp Ser Lys· Thr Lys 200 ?r··.:· Pm Axa A.ltt Thr 205
lk val. 210 v Sii tt Itt Gly Var Lys Tyr Gin 11a Lys 215 Lys Lys Gly Lys 'Vai 220
Lys Gl y 2 2'5 Lys Ακη T'fc r Glü 230 Ars Gly Leu Tyr Hi.s 235 Áss Ly.« Asv Lys ?ro 240
rm Gitt Ser Arg Lys 245 Lys Lőtt. Glu Lys Alő Lőu 255 Leu Alá Trp Alá Val 255
H« Thr Us Leu 2 SS Lse Tyr Gin Áru Vai Aly AU 255 Giu Asn Ii« Thr Gin 270
Try Asn Lett S-fcc 275 Asp A~* í v Gly Thr Asn Gry Xle 280 Gin Arg Alá »L Tyr 2 §5
Leu Arg 2&Ö Gly Val Asn Arg Ser Ua Ms Gly He 2S'ó Tr& Pr« Glu Lys lie 300
Cys Lvs 315 G.l y Val Prs Thr 33.0 M# M-ö Ma Thr Asp «$·$ 5 Thr Gitt Lőtt, Lys- Glu 320
Xle Arg Gly Mer hőt 32 S Asp Alá Ser Gitt Arg Thr 530 Asn Tyr íny Cys Cyr 335
Arg Leu Gin Arg Ή· Mis Gl« Gly As:-; Lys his· Gly 345 Trp Gys As« Trp Tyr 350
fen He Asp Trö 355 Του 11« Gin Lőtt. heh Asn Arg 30 Thr. Cin Thr Asn Lőtt: 305
Thr Gitt 375 Gly Bro Pro Asp Lys Gitt Cys AU Vél 375 Thr Cys Mg Tyr Asp 330
Lys Asn 385 ÍW a «Τ'. ►*'), ''—ő Val ISO Vai Val. Thr Gin Ma 35 5 Arg Asn Arg ?r« Thr 405
Thr Lee Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn Phő 410 Ser Pfes Alá Gly Thr 4 IS
Vs.l Xle Gitt. Gly 425 Gs& Cys Asn The Asn Val Ser 425 Val Glu Asp iie Lett •á- Λ
0/ * w ♦·*»
Tyx <Sly Asp His 435 Gi'U Gye Gly 09 L&ü Leu Girs Asp £ 4-0 Als Leu T”x,f y
Leu Teu Asp ciy 450 H&t- Thr Asn 455 T\> ~ Ha Glu A$n Alá 09 Arg Gin Giy Alh
als 465 Arg V'hl Thr Ί^ίχν V rp Leu 470 Gly Arg Glh Leu 478 Ser Thr Alá Oly Lys 450
i, . Λ, Leu Giu Arg Arg Ser Lyr Thr Trp Zha Giy AU Tyr •?da Leú
4δ5- 49δ 05 <210 18 <211 >492 <210 PRT <213> Artificial Sequence
<220
<223> Descri pilon, of A?' Kosi. Seq< osncí r. CSFV m utáni
<400 18
Mai Glu Leu Asm his 8 Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser 10 uys dm ih Lys
Pro Vei Gly Vsl Giu 29 Gb.s O Vsl Tyr 25 Asp T 5 r Al & δ 1 y Arg Tro 30 Lau
Fhe G1 y Asm 35 S?í'ö 5sr ·.<«.* r., LyK/i ti Vei Mis « Tre Sin Ser Thr Lse 45 Lys Leu Fri
uis Arg Árm 53 Sí y Arg Gly As» lle 58 Arg Thr Thr Lau Arg 88 Asp Lau
Arg 65 Lys Giy Asp Cys Arg ?Ö 5«r Gly Asp Kis Leu Gly ?rs 75 Vei Se r Gly 89
He Tyí 1 Lé Lys Tra $8 Gly Pro· Val Tyr Tyr 91» Asp Tyr 30 Thr Gly 35 Pro
Vál Tyr His Aíe AU ISO Pso Leu Glo Bhe 105 Phe Áhp Glu Al4 Gl 5 ?hS 113 Cyz
Giu Wl Thr 115 Lys .Arg He Gly Arg 120 Vad Thr Gly Ssr Asp 125 G3.y Lys Laií
Tyr Mis He 2 30 Tyr Vi) Cys Ve1 Ár r - gg s·. ·>? X* Gly Cys 11« Leu Leu XO Lys Leu Alá
lys Arg Gly Thr 2 re W Thr Lőv L y 5 Trp U« Arg Asn ? he Thr Asn
Y >í. x >* —·'- 158 t SS ISO
7081x4/RAS * ft
Cys 8~h LSU Irp Vsl Thr Sor cys 3c~ Á5>L A^Ti &£ y Λ < v<s. Ser Gly 5 «
155 170 Π5
Ly.s Asp Lys Lys Pru Asp Árg mát Asn Lys Oly Lys Lys I Is Ara
OO ÍS5 130
Áré Arg Glu Mlu Gin Lys A&p s»r Lys Thx lys ?ε» ho Ásp Ál 8 Thr
1T5 200 205
Ik Val Viü. Glu Gly Val Lys -rut- Gin 11a lys -uy& Gly Lys Var
210 ai 3 *,:£· V
Lys Clv Lys Asn Thr Sin Asp öly Un Tyr His jtiO*x T <,<£· < vx 3<5 \? 7» Asm. Lys 2r,é
226 S 3 & 235 240
Fio Glu Ser Arg Lys Lys Lcis Cl;.. t ,,.. Kft X í .. .<, i/yS í\ie. L-bíií. Láss AT a Trp Álé Vaj.
24 5 260 253
T1& Thr iie Luu .tűn Ty r Gin ?ru Ví$,x Aa.& Gin Asn i.u T'l >' a ;· ί í. GU
250 £6» 5 270
Trp Árn Lnu & ·& £ aOí £> Gly Thr &&£>' £i.V £ 1¾ Gin Arg Álé Met Tyr
280 28 5
Leu Arg Gly V;sl Asm Arg S«i Leu 3ÜS <U.y Ik Trp Áru Glu Lys Tia
'290
235
300 ί?/· ο ys lys Gly Val Pro Thr Si« Len Alá Thr Asp Th< (Jk Luu Lys CXu
310
SIS ö
XX© Arg Gly KáL Mát Aan Ma Lát' Glu Mg- Thr Asa Tyr Thr Cya Cys 325 33 ö .J35
Arg Lau Gin Arg His Glu Trp Asm Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ik Ásp
340
345
360
Tru Trp 11© öln leu H«r Mn Arg Thr Gin Thr Asa Len Thr Glu. Gly
355
36?)
355
Pr» h?n Asp X»y« Slu Cys Alá Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asm
310
315
3Sö
Asp Val Ásn Val Val Thr Gin Alá Árg áss Arg Frs> Thr Thr Len Tht
385 330 ’ 3§S <05
Gly cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser. Phe Alá Gly Tor Val. 1.1« Gl.&s
OS 410' «15
Ily ξ?χο Cys Asn Fhe Asn Val Ser Val Glv Asp Π© L©« Tyr gly m rs
Mis Glu Cys Gly Sas Lsu Lau Gia Ásp Thr Alá Lau Tyr Leu Len Asp
435 •00
Gly Wt Thr Asfe Thr Ufc Glu Asn Alá Arg Glu Oly Alá Ale Arg val
450 'hiUl-í/KAS oy
Thr Sas Ttp Le» Oly Arg «.fis Leu Ser Thr Ale 4 63 ' 47Ö «5
Arg Mg Se r Lvs
7M »p Fh« Gly Als Tyr .Als 48 S dy Lys Ly.*í Leu Ölu Mi
L-ht <21ö> 19 <211> 493 <212> PRT <213> Adstóaí Sequsnce <220>
<223> Descrbtbn ófArtífícíai Seouence: CSFV rohant
fc $ Gitt Leu Asrs His Phe -Cin. Lep Lss Tyr IC Lyi Thr Ser Lys GTrs Lys 1S
P£S5 Val Gly v&i 20 SÍP Gitt Tí'» Val Tyr Asp 25 Thx A.í,3 Cly Arg Lro Lev 30
Fhs Gly Asn 35 Tít-rs -X *. W Ser Giu Vél Kis Tro- Cin 4 0 |Í \M V. Thr CPU 45 Lys Lett Fro
Fi<s Áss Arg ST Ciy Agg Cly Asp 55 Üt .Arg Thr Thr Lég 4Ö M5 Asp Xttsu T.íp
Arg Sá- Lys Gly Asp Cys Arg 6«r > v G l y .Asn H ss Les 75 Giy Irt Val Lak Gly SO
lié Tyr Xle Lys Pro Gly 85 Val Tyr 'Tyr 90 Gin Asp Λ Thr Gly Fro 95
Vél Tyr Kis Arg 100 Alá Tro Lett Glu The Fhe *< Z'j £ i. V «·' Asp Cl u Alá Gig The Cys in
Gitt Val Thr 115 Lys Arg lle Ciy Arg Vei Thr 126 Cjy X £· Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr Fis lle 130 Tyr Val Cys Val ns Asp Gly Cys· lla Lry Í4C Leu Lys Leu Al®
Lys 145 Arg Gly Thr Fí-o Arg Thr 15 Ó Lén lys Trp He J.S5 Arg Asp The Thr Asp 10C
Cys Tro Leu Trp Val Thr L«r 165 Cys Ser Agp no Asp Ciy Álé Két Gly Ser 175
L-yé Asp lys Lys ISO ?r>a Asp Arg: Hét Asn Lys 13 5 Gly Lys Leu Lys 21& Al® 153
Pro Árg Gin 195 his \>1 . u Lys Asp SA£ 200 Lys Thr Lys Pro 2 re 203 AAp Aia Thr
11a Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lysí Gly ly.3 V&l
218 215 223
Lys Gly lys í-es-r Thr Gin Asp Gly Lau Tyr Hia Mo Lys Asn l«ye Tro
22:3 7 W: 2.J* 240
Pár© Gin Ser Arg Lys Lyh LAP Gin Lys Alá Lm, Lsg Aia Trp Alá Val
245 250 255
Ile Thr Ile Len Len Tyr Gin Fpg val Aia Ara uln A$n Ile ?hr Gl n
263 2 Se 270
Trp Asn Lett Ser Asp A.S.--S Gly — 3 3 i Λ. •X· ~ ~ ? M? < } Gly ile Gin Al 3 két Tyr
27¾ 230 > 8 5
Lev Arg Gly va 1 Am Arg Ser Len hi s Gly Ile Trp ?.K<* Cl ii i ' V:o> V I le
2 33 285 300
Cys Lys Gly vei Lra The His Lev Alá Thr Asp Thr G l.U Lse ΐ ,;.y $5 Gly
335 313 315 323
Ile Arg Gly R3C. Aat Arg Alá Ser .1 <jj Arg Thr Arn Tyr ¥ h r Cys c y s
325 333 3-3 S [
Arg Lep Sin Arg: Ai.s Gla • Trp Asn siy Trp 'Cys Ma Trp i ; y. • Arm ί Ile
348
345
35Í
Aso P'ro Trp Ile Gla Leu Met Asn Arg thr Gin Thr Xsn Lati Tfer ölti
355
SS
555
Gly Tro Pro Asp Lys öXu Cys Alá Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn
370
373
320
Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Alá Arg Asn Arg 2re Thr Thr lan
385
350
37*
400
Thr Gly Cys Lys· Lys Gly Ly& Asn phe Ser Phe Ale Gly Thr Val Ile
OS «
415
Clu Gly Pro Cys Asn ?he Asn Vál Ser Val Glu Asp fon L*ru Tyr Gly
425
30
Asp Brr- Gin Cys Gly Ser Leu Len Gin Asp Thr Aia lau Tyr Len Len 435 440 445
Asp Gly hfet Thr Arn Thr Xle cin Asn Alá Ax§ Gin Gly Alá Alá Arg
435 íS3
Val Thr Sár Trp Lee «Gly M·^ Gin L4sv Ser Thr Al« Gly Lys Lys Lan
SS
70
475
80
Gin Arn Arg Ser Lys Thr Trp 2he Gly Alá Tyr Aia Leu
485
43Ö <21ö>2ö <211 >495 <212> PRT <215> AíTmei&i Sequence <220>
<223> Description of Artificiaf Secjuence: CSFV mutant <4Q0> 20
Két 4 Clu Leu Asn Kis Hhé Glu Leu Leu S Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys IC .15
?XÖ Vsi Gly Vai felu Giv érő Val Ty·? 20 2$ Asp Thr Ale Gly Arg F'So Le3 70
The Giy ASP 3$ Pro Sér Glu Val His ?j£0 U Gin Ser Thr Lhu Lys Leu Pro n
Mis Asp Sö Axg Giv Arg Gly Asp Hu Áxg SS Thr Thr Les Arg Asp Leu Pro «&
Arg SÖ Lys Gly Asp Cys Arg Sa.r: Sly Asn 70 His Len Gly frss Vei Gar Gly n so
He Tys lle lys Pro Gly pr«. vH. Tyr SS Tyr Sir tep Tyr Thr Cly ?ro 3 5 35
Vél Tyr Kis Arg AU Pro Leu &j« Bhe ne ·α$ The Asp Glu Ale Clc The Gys liö
81 ύ V S>.5. Thr US Lys Axg He Gly Arg Vai 12 0 Thr Gly Ser Ai;p Gly Lys Láv 125
?y£ Mi» ne De Tyr vai cys Vai Asp Giy ni Cys lle Leu Leu Lvs Leu AU 1 lö
hu 14 S Axg Gly TU Uu Arg Thr Leu Lyr. 150 Tip TU Are Asn ?h« Thr Asn .155 ISO
Cys Pro u« Trp Val Thr Ser Cy.s Ser 16$ Asp A»p Gly AH S«r Gly Ser i?$ m
i?ys Asp lys Lys Tro &$p Acg Met Asn ISO 185 Lys Gly Lys Leu lys lia Aia ??n
Ars Glu 155 Kis Gin Lys Asp Ser Lys 20 0 Thr Lys Fro Tru Asp A.U Thr 2C5
Lys Vél lle WL Va,! GJ.Ü Giy Val. Lys Tyr Gin lle Lys Lys Lys Gly é χ Λ J $ s, 7- 1 «!
* ♦ * *« Λ .· *
Lvs 22$ Gly .Lys A»» Thr Gin 23 ö Asp L«u Tyr: jírs Asn Lys 235 As» ’->·'.:· Γ'Χ-.Ο 240
?rc· Glu $«s Arp Lys Lys Len GJL ki Lys Alá ben Leu Alá Trp Al-3. Vili
215 2SG 255
Íré Thr Ile ί· «., ... & > *. Gír Pro Val &S* & Ma Gin Asn lie TLL Gin
,á.W 265 2 ·: V
Trp, Asn Leu .;*$?£* £ Ά.,>. Αυτί Gly Thr Asss wy 1 üí Glís Arg Alá Hűt Tyr
27 3 730 285
Le» Arg Cl.y Vri Asn Arg 5/ φ· Γ Lnn Gly Ile Trp Pr<? Glu Lys He
,z> Q 335 3Ö0
cys Lys Gly V.31 r'to Thr Mis Lés. Alá !?'X v* i. « X Asp Thr Glu Lett Lys Glu
31 ö 3Ő 720
Ile A tg Gly Met Mt C ÁSP ÁA S Sec Örltt •htq Thr A-sn Tyr Thr v.y.& -,-yS
«s. 330 335
Arg Len Gin Arg hl 7 Gl u Trp Asíí. 7,17 His Gly Trp Cys: Am Trp Tyr
MG 345 3&ő
XXe Asp Pro Trp Ilc Sin Len Msfc Asn Arg Thr Gin Thr (ÁS»i jL,é:U
2 5,5 388 3Ő5
Thx Gin G-iy 370 Kro Krcs Asp Lys 27 5 Gin Cys j'klé VM Thr Cys MO Arg Tyr Aap
igr- Asn Tbr ASP vnl Asn Vei V&l Thr Gin Alá Arg Asn Arg Pr© Thr
ici 135 40 Q
Thr Leu Ths •Sly Cys Lyr Lys g 1 y Lys Aísn Kh« Ser Phe Alá Gly Tht
4 7 5 41& 11S-
Val He Glu Gly ?iö Cys Asn Phe ÁSK Val Ser Val Glu Asp II a Leu
427 121 4 30
Tyr ,?, y Asp MinS Glu ~ y oiy Ser Len LeU Gin Asp Thr Alá Len Tyr
05 ví 445
Lse £á&a Asp- Gly M« fc: •’rx ** Asn Thr 11« \3X kS Asn Ai» /Arg Sin Gly 7.1.x
450 455 «0
A1 & Arg Val Thr Str Trp Leu Oly Arg G) íj Lse Ser Thr Alá Gly Lys
4 65 470 4 75 480
Lys Leu G .17 Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Aia Tyr A ί 7 Lea
4 §3 4 50 4 §5
<210> 21 <211> 493 <212> PRT
73'§ 5.1A 7 Sfi 2;
<213> Artíííeíai Sequence <220>
<22.3> öesonpllon of Artificíai Ssquence: CSFV rouíant <400> 21
Hat Glu Leu Asn Kis Fhe 5 Gi ·< Leu I«eu Tyr Is Lys Th £ Ser Lys Gin Lys 15
Pro val Gly Val Glu Sitt Pre Val Tyr Asp Thr Alá Gly Arg Pro Leu
2 δ -5 < <.· ·> 3G
Fhs Gly Asn Pro Val His Pro Gin s« r Thr Leu Lys Len. Pro
35 40 45
His Asp Arg Gly Arg &iy Asp Ue Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro
SS 55 SO
A r y Lys Gly Asp cys Arg Gtt» Gly Asn Kis Leu. Gly Pro- Val Sec Gly
SS 7Ö 75 9 0
lle Tyr lle Lys Sso Gly y ro Vei Tyr Tyr Gin Ty r Thr Oly Pro
85 90 SS
Va.1 Tyr Ki» Arg Aló Pro ku Glu bha Pha Arp Glu Alá őla Phe Cy»
1O0 105 110
gk Val Tbr Ly» Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp űr y uy :.< r.-e u
ns 120 125
Tyr Kis Ile tyr < <j 1 Tvr Var Arp Gly cya ile Lati Leu Lys Leu Alá
130 135 KG
Lys Arg Gly Thr Lro Arg Thr Leu ly.% Trp íle Árts Asn Phe Thr Asn
14 5 ISO 155 ISO
Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Sor A&p Ars V Gly Alá Ser Gly Sex
1SS 170 17 5
lys· Asp lys Lys Pro Asp Arg Heh Asn Lys Gly Lys Leu Ly» Ile Alá
ISO 153 130
S’ro Arg Gl'« Kis Glu Lys Asp Ser Lys Th r lys Pro Pro Asp Alá Thr
1$S 200 205
íis Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin IU Lys Lys Ly.$ Lry ryr Val
2U 215 220
Lys Gly lys A«r Thr Gin Asp Gly Lw * Ti Kis Asn Lys Asn Lys Pro
Glu Ser Arg lys Lys Leu Glu Lys Alis Leu Leu Aj.a Trp Aia Vei
250
55 lle Thr lle L&« LhU Tyr Gin Ttn Val Alá Alá Glu Asn lle Thr GXr 200.
250 253
Trp Asn Leu ser Asp Asn Gly 275 Thr 298 Asn öly
L e u Ar g 290 Gly Val Arn Arg Ser 27> Leu L r r <τΛ ... 'Mji·
Cys Lys 303 Giy Vaj ?rn Thr 310 LnU Al a Thr
lle Arg Gly Met hsr Asp Alá 325 Ser Glu Arg 3 30
A.rg Lnu Gin Arg Kis Glu Trp· 340 Asn Lys 343
AíSö Px'ö Trp lle Gin Leu Méh 555 Asn 300 Arg •Thr
Gly Pro· 370 3rP A£p Lys Glu Cys. 375 Alá. Vnl Thr
Thr Asp 305 Val Asn Val Val Thr 358 Gin Ma Arg
Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys 4 ŐS Aga Phr Ser 410
G1 U Sl y Fx:o Cys Asrs Phu Asn X Λ W? Val 3«jr 425 Vhl
A»p Mis ..Ί-x cy.ís \yl y .-</x Le «λ 4 35 Leu 440 Gin Ά.<φ
Asp Gly 4 SS Aet- Thr Arn Thr lin 4S5 Gin te Alá
Vál Thr 465 Ser Trn Leu Gly AíXí 470 Gin Leu. Tér
\sTű Arg Arg Sex Lys Thr Trp 435 hhy Oly Alá 4H-
lle Trp Pra Glu Lys lle 128
155
308
33!
350
320
400
415 <sp XXa Leu Tyc Gly <30·
43 i&Ö <210> 22 <211 >494 <212> PRT <213> Artificisl Sequence * * * * * * ♦ * « # Λ * * * * · * * ♦ » * » *-» X * * χ , • ♦ * « * « * * * * * « « <220 <223> DescdpUon of Artifícíal Sequence:. CSFV 'rautant <400> 22
Hét Glu Leu Asn 1 Mis 5 &'4ViS: \«„kUí L-r’SíXl Leu Tyr 10 Lys Thr Set Lys Ol© 15 Lys
Pro Vél s)y Val 7 Γ: <L 'SXu Gl© Ho Val Tyr Asp 2 5 ihr Alá Giy Arg Pro 30 Leu
éhe Gly Asn Ha 25 Ses d© Val Hl© 40 •:r© Gin Ser Th r Lev ©ys Le© 43 ?£O·
Kis Arg őly 5Ö &. ;* ÍT Gly Asp Ile 56 r < r ~. >Λ». y ..' · Thr LM 60 Arg Asp Leu Vro·
Mg Lys Gly Asp & Cys Arg 7D Ser 5.1? Asn His Leu Cly 7S· Pro Val. Ser r * </ vXkL y 80
He Tyr Ilé Lys ?» SS Gly éra Val Tyr Tyr 30 cin As? Tyr Thr Gly 55 Pro
VáL Tyr Kis Arg 106 da Pro Leu d© X05 Asp Glu Alá d© The 110 Cys
Gitt V«l Thr Lyé 315 Mg T > tó λ & * Gly .Mg· 12 Ö Va1 TL r Giy Se.r Asp Giy tya 125 Le©
Tyr His tle Tyr 13 0 Vei L y r Val. Asp 135 Gly Cys lie Lé© 140 Lé© Lys Le© Al a
Lys Arg Giy Thr 145 Pro Arg 150 Thr Le© Lys Trp T · £ 155 As,n Phe Thr Asn 3 60
Cys ?r* Lee Trp Va.l 165 Thr Sár Cys Ser Asp r 70 Aí>p Oly Alá Ser Gly -5 el 3>- í -x5 Let
Lys Asp Lys Lys ISO P r o Asp Arg Ver Asn Lys 1S5 Gly Lys L&u Lyn X1e 130 A1 :Í5.
Pro Arg -Glu Fis Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro Asp Aia 205 Thr
lie Val Val Glu <C vJ©L? Giy <# Val Lys Tyr 215 gin lie Lys Ly« ?? o £f <ζ· Lys Oly Lys Val
Lys Gly Ly< ASh 223 Thr ©l A 23 0 Asp Gly Le© Tyr His Asn 235 Lys Asn Lys Pro 24 0
Bra Glu Set A£§ 24 $ ©ys Lé© Gitt Lys Alá 230 Leu leu A.U Trp Alá 255 Val
11« Thr 11« Leu 260 &»'·§? 1: Tyr 51« Tra val Alá 265 A-δ d© Ara He Thr 270 Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Sly Thr 28 □ Asr. Gly Ile Gin. Arg 205 Alá Hét Tyt
Leu. Arg 'd y val Asn Arg Sex Lou Hi.s Gly Ile Trp 2 re Glu l y » He
290 235 300
Cys Lys Gly Val Fis Thr His Leu Aln Ths Asp Thr Glu Leu Lys ele
305 -l T « d X. Ví 315 320
He. Arg G.t y Mát Met Asp Alá Ser Glu Arg Thr Áss Tyr Thr cys Gys
31S 330 335
Am Len G i rs· Λ r ír Mis Glu Trp Am ly*» Ciy Trp As í! év ff1· «·«, A Jv Íwí ’f ‘.ír' - J ÁíSii
34Ó 315 J J *,?
Ile Asp Pro Trp lle Gin ls'..i f* \ Asn. Axp Thr Gin Thr Aon. L®« 'T'by xi. >3
3 3 5 T; £ * J> v.· .a 3 SS
Glu 'G iy Tro Hó Asp Lys Glu vys XLcS Ή Thr Cys Ar g Tyr As μ Lys
l'?5 3S8
Asn Asp Val Asn. >. < Λ ! í„ \ VS3-íe V&X Thr í~ % V< 01X L X, ·« -J jrt-LKl A.rg Asn Arg Fx ö Th r Thr?
385 330 333 4 00
140 Thr Gly Cys. Lvs Lys Sly Ly» Asn ?*Hí Ser ?be Alá Gly Thr Va]
Λ:λΛ >« V UG λ * : c; X: £ J'
Ue Gin Gly 2 rs cys Asn He Asp. Va] Sex Val ííiu Asp He lXíV Tyr
420 425 438
Oly Asp Η£.?*·· Glu Gly Sec Leu hí Gin .Asp Thr Aj. a Leu Tyr L&0.
435 440 44 5
J>í£l£ Asp Oly Hét Thr Asn Thr X .1 e Glu Asn Ar. 3. Ar$ Gin hl y ÁJ. Alá
458 4 35 4 SŐ
Arg Vei Thr Ser Trp Leu Gly Xxg Glt Leu. Sí-r Thr Alá Gly Lys Ly»
•C55 4?Ő Ό5 4 8Ö
Lön A le Arg Ar^ Sv r Lys Th r Trp 2hé Gly XI a Tyr Alá Len
tóS 4<«ö
<21Q> 23
<211 > 495
<212> PRT
<213> Artmcia) Sequance <220>
<223> öescriptfen of Ártmda! Sequence: CSFV mufant <400> 23
ÍÖSiIS/SAS
Met I Giu Leu Afít His s Bbe Glu Leu Let Tyr \ í\ -A lí Lys Thr Sér f ·.«·«· xyyS Gin 15 Lys
Pro Val. Gly Vei 20 Giu ?th Vá5l Tyr Asp Thr Ars Giy Arg Tö 2rg Leu
Gly Asn 3S Pro Ser Glu tel 40 Pr® Gin Ser Thr Lau 45 lyy ·$· Lssu Tro
Kis Asp 50 Arq SÍ y Ara V* Gly Asp 55 τ H Arg Thr Thr Leu SÖ Arg Asp Pré
At'g £,< Lys Gly Asp Á-CCf ? ö Ser Gly Asn HÍZ Letf Gly 75 ?re> VI Ser Gi y 60
11? Tyr Ik Lys F t o Η 'Λ Ά \z Sl y X* T «> Vei Tyr Tyr θδ Gin Asp τ yr Thr Giy s5t ζ. ?£«
v'a 1 Tyr ?U» A£SJ 100 Álé h'Q Leu 51 u Phe l'hc 105 i Λ-5-Ρ GL .3 Ai, i Gl 11 n Ph ö e Cy
Glu Vél Thr Lys Arg Xl® oly Arg Val Tht Gly 2*r Ahp Gly Lys Lw
US Ί ·*> í$ Λ <L\í : 7 S Λ.Ά-. w5
Tyr Ki» Tie Tyr Val Cys- Val Asp Oly Cys Ϊle Lee Leu Lys Leu χχ».
130 .135 HO
Lys Arg Sly Tteh ?ro Arg Thr Leu Lys Trp lle Arg Asn PA* Thr Asn
H5 ISO 155 HL
cys Pro Lse Trp Val Thr Ser lys űct A.sp Asp Gly Ais Ser Gly Ser
165 •75 .175
Lys Asp Lys Lys Pre Asp Arg Hat Asn L. y s 0 1 y Lys La a Lys lle Alá
ISO 163 ő 9'í)
Pre Arg Glu Mis Glu Lys Asp Se f Lys Thr Lys Ars Pro Asp Alá Thr
Ή5 20 Ö 205
lle Val Val Glu Gly Vei ly» Tyr Gih U« Lys sys Lyr Guy Lys Vu.r
210 ·>·$ <s Χλ λ. Κ· 220
Lvs Sly Lys Asp Thr Gin Aap Síy Leu Tyr Kis Apu Lys Asn Lys Píő
225 230 335 240
Tre Glu Ser Arq Lys Lys Len Glu Lyn Alu Le« Leu .Alá Trp ΆΙΑ Val
245 250 25 S
U« Thr :k Lan I®« Tyr Gin •*\ •ί'Ή Pro Vei. 26b Alá Alá Glu Aas Tie Tbr Gin 235
Trp .Asn Len S«s Asp Asn Ciy Thr Ann Gly 71c Gin Arg Al« Mr 6 Tyr
275 25ö ?a < X·. >X‘
L*u Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu. His Gly lle '£. j'p Ciu .Lys· Ili?
240 295 VOÖ
·; ! < ί / Μ ί»
Cya Lyg öly Vei Pw Thr His Len 305 3X0 Alá Thr AíJjö 315 Thr Gr r Len 'hys GJj$ Ö
11« Arg Giy Met Met Asp Aie Sf?r Cin Arg Tb x Asn •K*. „ , y i Thr Cys cys
125 310 335
Mg Len sin Atg Kis Glu Trp Asn Lys c 1 y Trp Cys Trp Tyr
34 Ű 34 S 350
&$« lie Asp Pro· Trp ile Gin Cet M«fe Asn Arg Thr Gin Thr Asn Céw
353 368 305
Thr Gin Glv Pro Pro Asp Lys t.l u Cys ATé Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 373 180
Lys Mn Thr Asp Val Asn val Val Thr wt Alá Arg Asn Arg Tro Thr
135 350 3.95 40Ö
Thr Lan Tht Giy Cys Lys Lys Oly Ly s Asn The Se. e 8hs '***.! <á& Giy Thr
4 Öl «0 415
Vai XXís Sin GXy Pxo Cys Asn Ahr Asn Vál S«r Vei Sir Asp ί £ e Len
420 425 no
Tyr CXv As-ρ Kis Cin Cys Giy Ser Lhn Seu r,.Xa Asp Thr Aia 1,-au Tyr
43$ 4 Í0 4 45
Len Len Asp Giy Met Thx Asn TH r II® SÍ ·χ3 Aha Al A Arg cin Giy AXa
450 4 $5 4 &$
Ais Arg V»X Thr Ser Trp Len d .y Arg Gin Lőtt Ser Thr Alá Giy Lys
405 ' <70 ATS 4S0
Lys L«'« Sin Are Arg Ser Lys Thr Trp Fhe GXy A in *T s ί ν' j. y c Alá T ·» - ö •iA· M
18 5 450 4 35
<2W> 24 <210 495 <2Í2> PRT <213> Ariddal Sequenc© <220>
<223> Descnptíon of Artlfoat-Sequence·. CSFVmuíant e* 4 ΓνΛ-ν, •'J .4 &efc Giu Jésg A«» Kis Fhs Glu Len Len Tyr Lys Thr Sex Lys Sin Lys
Pro V«.l GXy Val Gin Gin frh Val Tyx Msp Thr Al a Giy Arg Pro Leu
2C 25· 3ö>
♦ X ♦ ·« ” ♦ K A * * * ff *: w* ** *** ** »« χχΑ * ff ff ff ♦ ff
Pha Gly Asft 33 PKP Ser Glu Val His 43 Gin Ser Thr Lnú 45 Lys: Leu 2.te
his Asp Arg 50 Gly Arg öl.y Asp SS llc Arg Thr Thr Leu Arg 60 ’up Leu Pro
Arg Lys Gly OS Asp Cys Arg 5ur 7 o Gly to Leu <31 y Zro va.l Set Giy so
Ha Tyr ile Lys Fro Gly Pro SA v..i 1 Tyr Tyr 33 Cin Aap- Tyr Thr Gly Pro 53
Val Tyr Kis .Arg .Alá Pro Lo'u 100 Gitt ph« 105 Phu As p· Cl u A.l a Slss Phe Cys 1L3
Glő: Val Thr 113 Lys Asp Ile Gly Arg Val 120 7’-.· *- >a a. Gly Sgr As& 125 Gly Lys: Lúú
Tyr Kis Ha 13-0 Tyr Vsl -Cys Val 3,35 Asp Gly Cys Ile Leu Leu 140 Lya LuU Al u
Lys A tg Gly 185 Thr Pro Arg Thr ISO Leu Lys Trp Ile Arg Aeu. tss 8ba Thr no
Cys Pro Leó Trp Val Thr Ser 165 Cys Sas Asp 17Ö .Asp Gly Alá Ser Gly Ser 175
Lys Asp Lys Lys s?ru Asp Arg ISO hol Asu; TG 5 uys Gly Lys Leit Lys Ha Alá 100
-io Arg Glu 135 His Glu Lys Asp Ssc Lys 200 Thr Lys Fco Őre > · · í *v V Asp Alá Thr
11a Wi Val Glu Gly val Lys Tyr Gin IIS: Lys Lys Lys Gly Lyg val
210 215 *· 2 Λ
Lys Gly Lys 22 5 A,sí; Thr Gin Asp 230 Gly Leu Tyr His Asn Ly& T? ’Υίϊ Λ. ..· s-·' Asn Lys 2r.o 240
?ro Glu Sár Arg Lys Lys Leu 24 3 Grú Ly*' Als* 250 Lúu uuu Ai-s Trp· Ma Vei 2&3
'21 a Thr Ile Leu leu Tyr Gin. 2 G0 Pro Val 263 •&X3fc Alá. Gru A&rs íle Thr Glp 270
Trp Ás-n Leu 275 Ser Asp Aon Gly Thr Asu 280 Gly Hí Gin Arg 285 Alá Két Tyr
Leu Arg Gly val Apu Arg ser 25 S Leu Kis vly ile Trp Prg 30 S Glu Lys Hí-
Cys Ly$ Gly 305 Val Pro Thr Kis 313 l~ C li ÁL& Thr Asp· Thr Gly '515 Leu Lys Glu 323
lle Arg ί'*' ! · <· u· i y Met Hoc <25 Asp Aló, S«r Óla. .330 Thr A S Ώ Tyr Thr •Cys Cys 335
Arg Lea Gin Arg 3 4 L Fis Cin Trp Asn Lys 345 leu Gly Trp A. ΛΑ^.·. Gys Am 350 Trp Tyr
Asn Xlfe Asp 355 Fro Trp :k Gin lm Mót 360 Asn Arg* Thr Y*x£l j- s s< Thr Aisn L«a
Thr Sin Λ. νφ ,Λ ,5 Í Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys 23 5 Ali Val Thr 38$ Cys Arg Tyr Asp
Lys Asn .3 $5 Thr A;;:> VA L Asn 390 :,L 5.r Vs 1 Tor Gin Ar>s 355 .arg Asn Atg Pro Thr 400
Thr Len !* G ly Cys 4C5 ly s Lys Oly L'm Asn 410 Phe Ser The Alá Giy Thr 4 15
Val 11« Cl il Cl v 420 Pro Cys Asn 8&e. Asn 4 23 Vá ί £«:£* £ Val Glo Asp 434 II e Leu
Tyr Sly Asp 435 KU Aló Cys Gly Ser Lou 440 tsu Gin Asp Thr 448 Alá leu Tyr
Len Len 450 M p Gly éfet Thr Asn Thr lle 455 Glu Am Alá 490 Arg 4 k ! *\ X* X» ΧΦ Gly Álé
Ma Arg 453 val Thr Ser Trp 400 Leu Gly Arc GI o Less 47 5 Ser Tht Alá d y vys 4 80
Lys Leu Cl \$ Arq: Arg S-£ £ Lys Thr Trp Pht Oly Alá Tyr Alá LéV
485 <90 43>8 <210> 25 <211 >495 <212>PRT <213> Artiíicisí Sequence· <220>
<223> Descripíicn of ArtsfseisS Sequence:'. CSFV műteni <400> 25
Sic Lsu Asn Fi a LL; L&n Leu Tyr lys Tbc Ser Lys Gin i 5 10 15
Pro Gly Vei Glu Gin Pro Vei. Tyr Asp 7Lr Ara Oly Ara Pro Lég
The Gly Fen Τέο Ser Glu. Vei FI 4 5¼ Ser Thr Leu Lys Ley vre
kis ASp 50 Arg Gly Arg Gly ΛΛφ SS u« Arg Thr Thr Lfen Ar g APL Less CÖ Pre
A.cg Lys Gly Aap Cys Arg Ser Oly &8Π H.i.”· iA'fe hly 8rg Val ser Giy
SS ~Y ?*< < \< TS 80
ile Tyr Ile Lys Pro Gly ?iő> val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro
as 95
val T y r Öle Arg M;s Pro G.I« ?hc ?he. fcsjs Glu Alá. Glu éhe Cy.7
Ή i*S
.χ. 0 0 <1.0
Giu Val Thr Lys. Arg He • A. y Arg Val Thr ily Ser Asp oly Ly-·; Len
US: Ϊ2& '125
Tyr ití.'i 1 X é Tv r Va I G ys va i W Oly Cys 1 Ή La« Lm Lys. Leu Aia
110 X 3 5
lys Arg Sly Thr Pm Arg Thr χ,&«. L-ys Trp Ή« Arg As-n éhe Thr Aon
14 1 S«fi vi >xS LSI 1¾
Gye ?ÍS Lan T.rp val Thr Sfel Cys Ser Asp- Arg· Giy Ma Ser ily Sár
155 170 175
Lys Asp Ly s Ly s Pro Asp Arg Két As.n Lys ily Lys Leu Lys xle AL-cs
1A0 IBS ISO
In? Arg Gin &Ls· Llu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pre Sro Asp Ma Thr
IBS SCO •2 OS
Xle Val Vaj Gip Giy Vei l.yn Tyr Gin Ho Lys Lys lys ily Lys Vs 1
2 IQ V> 2 29
Lys ily Lys. Asn Thr óin Ang Gly •w*S? 1-5 Tyr Ms Asn L-yss Lys P'ró
225 210 2 15 2«
Am Glu Ser Arg Lys Lys len f < ϊ V Lys Ara Leu Len Ars Trp Alá Wl
245 250 iSÖ
Ilö Thr XI« Lfen. Len Tyr giü n:ö· VfeL Ali Als Glu Asn Iá Tbr Gle
160 2 SS Ü? 0
Tép Asn Leu Ser Asp Asn vw x· ·.· «*¥ Thr Asrs ily ile €lu Arg Alá Kefe. Tyr
«s 5 «ν '28.3 m
Leu Arg Gly val Asn Arg Sár Len. 4 rSx Gly 1.U Trp Pro Glu Lys Ue
ege eng
Λ» ,3 ‘J •sL. 5 A? •Λ <í vl
cw lys Gly val Tbr Kis -W’dvt Al A Thr Arp Thr Glu Χ,&η, Lys Gr U
3Ő5- 110 .ns 370
11Ö Arg Gly üst Mát áss Mi+s ^-r? y VJ.· V ΐ» GlU .Arg Thr Asp Tyr Thr Cys Cys
éop X? &.x> 330 33 S
* »« * » 4* * 9 « ♦ 9 χ * »*♦ *·*« χ
Arg Leu ölh Arg Kis Glu Τχρ: Áss Lys kis -Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 ·$·.> V
Ka® US- Asp Frö Trp Ha öl» Len {tet Asn Arg Thr Cin Thr A»n Leu
355 'S· ÍT f\
Thr Sin Gly ?£-s ?ro Asp Lys Glu Cys Alá Val. Thr < 375 375 3S3 lys Arg Tyr Asp
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Vei Thr Gin Alá Arg Asn .Arg Trc Thr s85
350
00
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn £he S«K ?he Alá Gly Thr
405
410
415
Vhi Xle Cl’.i Gly Pre Cys Asn .phe Asn Val Ser Val Sin Asp lle Lep
420
L'3 <
?yr Gly Asp His Glu Cys Gly Sex Leu Leu Gin Asp Thr Aie Leu Tyr
440
HS
Leu Leu Asp Gly Me* Thr' Asn Thr He Glu Asn Ale. Arg: Gin, <XXy Alá
430
155
ISO
Alá Axg Val Thr Ser Trp Len Gly Arg Gin Len Ser Thr Alá Gly Lys
0 ?5
450
Lse Clu Axg Aig Ser lys Thr Trp The Gly Alá. Tyr &4á Leu
485
430
95 <210> 26 <211 >494 <212> PRT <2.13> Ahtficíai Sequence <220>
<223> DeschpUon of Artificiai -Sequence: BVDV metánt <400> 26
íAn- Clu '1 Leu lle Thr 5 Asn Glu. leu Les Tyr 16 Lys 4» 4 $ Tyr Lys nln 1, 15
Örs Ál.a Sly Val \> A U -&>, u ?» Val Tyr Asp Gla V» > ,**k4 « &ly Asp, Ti'ö Le u
20 25 30
?he Gly Clv. Arg Gly Val XXa His Oro GlP Se £ Thr Lys Leu fsa
35 4 0 45
Mis Lys Alö §ly Glu Arg Glö vai Fiú Thr A4L LhU Alá Ser U4h.· Ki λ A <-
50 55 40
.1··’ /&& £
Lys Arg Gly A»p Cys Arg SS ' * 7 0 Ser Gly Asn Ser Ly$ Giy Tre, 75 Val Ser Gly §0
íle Tyr Leu Lyr Fro Gly Fro Len Sebe Tyr Gin Asp Tyr Lys Gly Tre
85 SÖ 95
Vai Tyr Kiz Arg Ah Frn Len Glu Fbw Thn viu ι.·λr Ara Ser Bet Cys
iqq 1SS ilO
Glu Thr Th,r Cys Arg 11« Gr y Ar g V&l. Thr Giy Ser. Asp Ser Arg Lan
115 120 125
Tyr His Üfe Tyr Val Gye lift Árp- Cys • le TU vei Lyr Ser Alá
1c iin 140
Thr tyr Asp Arg Gin Lys Vei Len Lys Trp Val Kis AiSh Lys Len Arn
r‘: 25Ö 155 ISO:
Cvs Fro Leu Trp v&1 ·.- Ser Cys 3 5» £ Asp Thx Lys Asp Glu Oly Var
ICO iTö Π5
Val Arg Lys Lys Gin Gin Gye- ?ía A&:£ Arg Len Gin Lys Gly Arg két
180 IS 5 ISO
Lys: I.le Thr Fre Lys Glu Ser Glu Lya Asp Sár Lys Thr Lyu X? y ~4 & r ,'. X- -X- XX A <. «M«
IS 5 200 205
Áss Alá Thr 21© Vai Val Asp Giy Var jj vs Tyr ni:*: ’/&! Lys Lys ~>y$
21 Ö 215 220
Gly Lys Val Lys Ser Lys- Asn Thr Cin Asp Gly Len Tyr Ki s Mn Lys
225 230 235 24ö
Asn Lys érc Cin Sin .5&r ί’ί.ίΖ.ε^ Xi-y>x r-ys L«r Gin Lys Ai« iX3 ÍX Len. Al a
? Λ fc. ?> R R; M· R fcí
X - 0 t» '·?’·· Ji. „f
Trp Ais 11« Xle Al-a L«« Vő1 PLe Pha 74 Val Thr Műt Gly Cin Asn
·> sir « “? 0,
d W <w Λ- .· V
11« Thr Gin Trp Asn Lm: Gin Asp Asn Giy Thr Gin Gly 7 lé Cin Arg
275 280 285
Alá Ftet Fh« Cin Arg Gly Val Asn Arg Ser Len Kis Cl y lle Trp é£6
290 Z-sO TŐ δ
Glv Lyr lio Cyr Thr Gly V$i Fre S-er HL r L»« Aln Thr Arp Thr Glu
335 310 31S ΐ -5 n
Len Lys Air lle Hi« Gly Mefe kei Asp Ara ser Sin Lya Thr Asn Tyr
32 S· 330 335
Thr
Trp
Cys Cys Arg Len Gin Axg 34 3 'Tyr Asn lle Glu 2 re Trp 3SS
Kis Sin Trp Asn Ly$
i.k 1« Leu Két Asp 760
Gly Trp 35 0
Lys Thr 5GS y $ asp
Ή Alá
fen Tyr 33 S Leu 37 ö Asp Thr Arg Giu Á&ö Gly Ser Gin Asp 330 Fro 375 Len. Leu Áss feg V&.1 Vn.1 Cys Thr 335 Alü 3$0 Gin VH Alá Thr Arg Cys fep Arg Ser 400
? re Thr érh Τ,Λϊ-s Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn éhe Se, e Aha A.J.&
405 Hö Ή
Gly Xle Leu vai Gin Gly érő Cys Asn Fhn t?l.tt 1 l«s Ala Vei S-'Cí'í Asp
420 4 2 5 410
Vei Lat} Aha Lys Sic Kis A.-.p Cys Thr « „ ·*? t.. Λ. Vei. He Gin Áss Thr Ál a
435 440 445
Kis Tyr Leu Víii Asp Gly Met Thr •non S & £ L«tt Glu Ser Al.-s Arg Gü.n
4 SÓ 455 9 Se
Gry 'r n -' Alá Lys Leu ‘Τη. r Thr Trp Lett s:ty Arg Gin Lett Gr y í 1«
4 SS· 470 4 75 0-0
Gly Lys Lys Leu Glu Am T <VVM Sók Lyá Th £ Trp ths- Gly Als
4 85 «0
<21Ö> 27 <211>4S5 <212> PRT <213> Artificiai Sequence '220>
:223> Descnpiion of Artificiai Sequence: BVDV muíanf ;400> 27
Két Sl.u L«u Xle Thr Asn Glu Len Lau Tyr Lys Thr Ty* Lys Gin. Lys t $ lö * 15 ?r® Alá Gly Val sin Glu érő· v&l Tyr fep Gin .AU Gly A.sn Leó Lsrs
The Gly Glu Arg Gly Val. 11« His Fco Gin Ser Thr Lau Lyn Leu érő
3$
His Lys Arg Gly Glu A&g Glu Val érc Thx: fen Lou Ale Ser Lau Fth
SO lys Arg Gly Asp Lys Arg Ser Gly Asn Ser Lys Gly ?ro Val Ser Gly
G5
7Ö
SO §5
Áh
Sic*. Tyr L«« Ly» Zro Gly Fr« Lau The. Tyr Gl.”·. As-js Tyr Lys Gly ?&'» *ί »» /' ·' • »· < «X * X Λ • » .»»
Val Tyr Kis Arg Ma Pro Leu Glu The Phe clh 105 Glu Aia Ser Met 120 Ser Arg Cys Leu
Giu Thr Thr 115 100 Lys .Arg He Gly Arg 22 ö
Val Thr Gly Ser A$p 125
Tyr his HO He Tyr Val cys? He 235 Asp Sly Cys He He H8 Val Lys SSí Al a
Thr 145 T.yS Asp Arg Gin Lys 150 Vei Leu Lys Trp Val 155 Kis Asn. Lys Leu Asn 150
Cys Pro Leu Trp Vei IS5 Ser Sár Cys Ser Asp HO Thr Lys Asp Giu Gly L?5 Val
Val Arg Lys Lys 130 Gin Gin Lys Βϊο Asp 135 Arg Le« Glu Lys Gly 290 A rg Kar
Lys Ils Thr 1S5 Pro Lys Glu Ser Giu 280 Lys A» Ser Lys Thr 2 05 Lys ?£« ?»
Asp Alá 210 Thr He Val Vd ASp 215 Giy Ή .·. is Tyr Gin 328 VH Lys Lys Lys
Cl v 225 Lys Val Lys.· Sár Lys 230 Asn Thr. G i ?A Gly 233 Leu Tyr Kis .Asp Lys 248
Asn lys Pro •Sin Glu Ser Arg Lys Lys Leu Gl u Lys Alá Leu Lee .«u e.
245 250 253
Trp Alá lle 11« 250 Al a Lou Val 9 be OLe 2.5:5 Gin V.sl Th r Ket Gly 2 Ή «1 u .Asp
He Thr Gla 2B T rp Asn. Len Gin Asp 25 2 Asn Gi y Thr 01« Gly 285 Π« Glrs Arg
Alá Met 290 Phe Sin Arg Gly Val 235 Asn Arg: 3er Leu His 380 Giy Ha Trp Brv
Glu 3 SS Ha Cys Thr Giy 220 Val 2 re Ser Ki s Lee 325 Alá Thr Asp Thr Glu 320
Lee Ly.s Aia He Kis 32 S Gly K«S& Kát Asp Alá. 330 Sex Gle Lys Thr Asn 335 Tyr
Thr Cys Cys Arg. 340 Leu Gin H'V his Giu 345 Trp Asn Lys His Oly 333 Trp Cys
Asn w Tyr 353 Asn 11« sle P íc· Trp 36Ö He Leu Ls« Hat .Asn 553 Lys Thr Gl ex
Ab Asn HÓ Leu Thr 51« Gly Gin 375 9 he L&s Aeg Giu Cya HL AH Val Thr Cys
Arg 3®:5 Tyr Asp .Arg Asp Sey 380 Aép Lee As··; Val Val 335 Thr Gin Alá Arg Asp 4 00
WHVEAS
» »» » » t „ « \ * *♦ £ *** .♦ *Χ* Φφ «« Φ>φ
S e K Ara Thr Fre Leu Thr Oly Cys Lys Vys Giy Lys : 4 53 ’ 410 Áru 7he Ser hhe 415
Alá Giy He Leu 4 20 vei aló Gly Pro Cys Asn Fhe Glu 425 Tie Alá v«l Ser 4 30
Asp- V& i. Leu She 435 Lyr Glu. Gís Asp Cys Thr G«r V&i 44 0 Ile Gin Asp Thr 44 5
Alá His »51 Tyr Leu Vei Asp Gly Mfefc Thr Asn Ser Leu 4SS 450 Gla Ser. Al« Arg
Gin Gly •IS 5 Thr Aih Lys Leu Thr Thr Trp Lse Gly Arg 470 ’ 475 Glo Leu Giy He· 4 50
Leu Gly Lyo tyu Leu Giu Asn Lys Ser Lyr Thr Trp 05 - ?5 9hí.>. Giy 4b 49$
<2íö> 28
<211> 495
<212> PRT
<213> Artificial Se quence
<220>
<223> Dsscriphon of Artiftóal Sequenea: Part of CSFV Alfort
<4Q:Q> 28
Mét Glu I • Lau As? i £,;hs.v Glu Leu- Tyr Ly$; Thr 5 1 $$ Ser tyr Gin Lys 15
?Γί$ vsl Giy v <·> l 2.C . GIí.3 Glu Fso Vei Tyr Asp Thr Aie í 25 Gly Arg ?,re L»u Ή
$hé Gly Áss ΡΎ0 i S Ser Glu Val Kis Fre Gin Ser Thr 4*3 w K· Lfiu Lyu Lí«u Tro 4 5
Kis Asp 50 Ary Gly Arg Giy Asp ile Arg Thr Thr Leu 55 LG Arg Aöp Lau Zf'e
Arg Lys 55 Gi v Asρ Cys Arg ser Oly Asn His· Leu Giy 70 75 pra Val Ser Sly TŐ
í!e Tyr lle Lys Fre Gly Tro Vei Tyr Tyr Gin Asp 35 90 Tyr thr Gly 9ro 95
Vei Tyr Kis Arg 100 A.le ?:c· Lau Glu hh« The Asp Glm IÖS A’.s Gin Öhe Cys. 110
Glu. Vei Tor Lys 115 Arg He Gly Arg Val Thr Oly Ser 110 Asp Giy Lys Leó 1 9 A
**·*Λ 5» β,χ
V ♦ ♦ « Φ . * * «»♦
-#·« « *· * X ** *».»
Tyr 'Hi* V Γγ lle Tyr Val Cys Val Asp Cly Cys lle Leu Leu Lys Leu Alá 135 ' 1-4 5
lys Mg 145 Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp lle Arg Mú Ph«· Thr Asn 155 ‘ ISO
Cys 2r« X-i^ U Trp Val Thr ÍSS Ser Cys Ser Asp Asp Gly .Alá Ser Cly Ser 170 ' * 175
Lys Asp Lys lys Pro Asp HO Arg Hét Asn Lys Gly Lys iw Lys 11« Alá 18 5 1.90
Tro Arg Glu 195 His Clu Lys Mp Ser Lys Thr Lys F,to Oro Asp Alá Thr 200 205
2le Val 210 Vei őr }, u .& y V a 1 Lyr 'Tyr Gin He Lys Lys Lys Gly Lys Val 3H ' 220
Lys Gly 221 I..· y $ As-ft Thr Cin 230 Asp Oly Leu Tyr His Asn Lys -Asn 'Lys ?ra 235 240
Pro c-iu Se r Arc Lys Lys 245 Leu slu Lys Alá. Le« Leu Alá Trp Alá Val 250 ' 256
lio Thr i Leu L«« Tyr HO Óin 8ε«» Val Alá Alá Glu Asn 11 a Thr sin 2S-5 270
TfP Asn ,3>'S 'Jt ?7 tí, Ser Asp Aon •Gly Ήζ Asn Oly lle Gin Arg Alá Mer Tyr 330 285
Lou Arg 2 40 &jty Val Asn. Arg Ser Hitt his Gly 1.1« Trp Lm Glu Lvs Xle 206 300
Cys Lys 305 Gly Val ?ro 'Thr 316 Hih Leu Alá Thr Asp Thr S3u Leu Lys Gle 315 ' 320
ll.c Ar-íj 51 y He t Hét Asp 33 5 Alá sex Oiu. Ars Thr Asn tyr Thr cys. Cys v0 335
Arg ku Sin Arg his elv .340 Trp Asn Lys 81$ Cly Trp Cys Asa Trp Tyr 345 35v
Asn 2ie Asp Κεο Trp lia Cin Leu Kefe Asn Mg Thr Cin Thr A»» Lesi
315
3S0
365
Thr Sla Oly Pro X»ro Aép Lys Cia Cys Ara Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380
Lys Asri Thr Asp Vél Asn Val Val Thr Sin AH Ar-g Asn Arg Fro Thr
5 3SC 773 4 00
Thr L>«u ThS Gly Cys lys Lys Cly Lys· Asn Lh® Ssr Phe. Álé gly Thr
Val lle ííltt Gly Pro Cys Asö The Asn Vei Ser Vél Glu Λκρ lle Leu
420
425 no ?S6n<;/'?A3
Φ
Φ ♦
<**» *♦ * Φ Φ*φ «« * • φ •Φ* »
** >>*
Φ Φ
Tyr Giy tes 435 Kis (X··’ UF.rU Cys Giy S-er 's 5 ö L«u Leu G.U ASp· Thr 445 Aia Leu Tyr
Lsu Χ»& ς·$ 45Q Asn « Gly fet Thr .Asn 4 35 Thr Lle G)ú As π Aia 460 Arg Cin Giy A1 a
Λ η 4S-S Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Giy Arg Gin Leu. 475 Kft r; Thr &u Giy Lys 480
Lys Leu öiu Arg Arg Ger Ly í3 Th r W GX y Al a Tyr λ : a Leu
•1S5 ·Ηϋ 4§S

Claims (4)

  1. Szabadalmí igénypontok
    L Eljárás· pestivírusok detektálható jelölésére, azzal jellemezve, hogy a glíkoproteín-E^fehen lévő RNáz-aktivitást gátoljuk, ahol az említett RNáz-aktivitás gátlása az említett glikoprotein legalább egy aminosavának deléciojával és/vagy mutációjával történik, azzal a fenntartással, hogy az említett glikoproteínnek az 1. ábrában példaképpen a CSFV-AJfert törzsre bemutatott 297. és/vagy 346. helyzetben, vagy más törzsekben, ezeknek megfelelő helyzetekben levő aminnsavai lízíntol eltérők, és ahol a glikoprotein-E^^-ben lévő RNáz-aktivitás gátlása legyengített pestivírust eredményez.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett, déléciők és/vagy mutációk az említett glikoproteínnek az 1. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatott 295-307. és/vagy 338-357. helyzetben., vagy más törzsekben ezeknek megfelelő helyzetekben levő aminosavainál fordulnak elő.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az RNáz-aktivitás az említett glikoproteínnek az 1. ábrában, példaképpen a CSEV-Alfort törzsre bemutatott 346. helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben levő aminosav deiécíójával és/vagy mutációjával gátolt.
  4. 4. Az 1 - 3, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az RNáz·· -aktivitás az említett glikoproteínnek az 1, ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatott. 346. helyzetben, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben levő hisztídm-maradék deiécíójával gátolt.
HU1200537A 1998-06-05 1999-05-26 Methods for detectable labeling of pestiviruses HU228471B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98110356A EP0965639A1 (en) 1998-06-05 1998-06-05 Attenuated pestiviruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU228471B1 true HU228471B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=8232074

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1200536A HU228469B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses, their use, and nuclein acids for their production
HU1200537A HU228471B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Methods for detectable labeling of pestiviruses
HU0102707A HU228468B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1200536A HU228469B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses, their use, and nuclein acids for their production

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0102707A HU228468B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses

Country Status (23)

Country Link
EP (5) EP0965639A1 (hu)
JP (3) JP4632540B2 (hu)
KR (1) KR100637940B1 (hu)
CN (2) CN101085346A (hu)
AR (3) AR020084A1 (hu)
AT (3) ATE311193T1 (hu)
AU (1) AU769823C (hu)
BR (2) BRPI9917787B1 (hu)
CA (1) CA2330241C (hu)
CO (1) CO5050392A1 (hu)
CZ (3) CZ301494B6 (hu)
DE (3) DE69928700T2 (hu)
DK (3) DK1084251T3 (hu)
ES (3) ES2253457T3 (hu)
HU (3) HU228469B1 (hu)
NZ (1) NZ509228A (hu)
PE (1) PE20000552A1 (hu)
PL (2) PL202161B1 (hu)
PT (2) PT1084251E (hu)
SI (3) SI1084251T1 (hu)
SK (3) SK287014B6 (hu)
TR (3) TR200103666T2 (hu)
WO (1) WO1999064604A2 (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
EP1104676A1 (en) 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
PT1149901E (pt) 2000-04-21 2006-08-31 Akzo Nobel Nv Mutantes de pestivirus e vacinas contendo os mesmos
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
UY29915A1 (es) * 2005-11-15 2007-06-29 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna combinada que comprende un virus atenuado de la diarrea viral bovina
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
UY31930A (es) 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
US8815255B2 (en) 2008-10-31 2014-08-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of Mycoplasma bovis antigen
US8846054B2 (en) 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
UY32570A (es) 2009-04-24 2010-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna viva modificada de mycoplasma bovis mejorada
CN101915837B (zh) * 2010-07-28 2013-07-03 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
EP2618841B1 (en) 2010-09-21 2016-10-19 Intervet International B.V. Bvdv vaccine
CN103882051B (zh) * 2014-03-20 2016-04-06 北京市农林科学院 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒
EP3956439A4 (en) * 2019-04-18 2023-05-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. RECOMBINANT CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE342996T1 (de) * 1986-01-27 2006-11-15 Schering Plough Ltd Attenuierte herpesviren, herpesviren die eine aminosäuresequenz kodierende fremde dna enthalten,und diese enthaltende impfstoffe

Also Published As

Publication number Publication date
TR200003622T2 (tr) 2001-06-21
TR200103666T2 (tr) 2002-03-21
PT1084251E (pt) 2005-03-31
JP2010259445A (ja) 2010-11-18
ES2257476T3 (es) 2006-08-01
DE69928700T2 (de) 2006-06-22
PL202509B1 (pl) 2009-06-30
HU228468B1 (en) 2013-03-28
CN1304452A (zh) 2001-07-18
BR9911619B1 (pt) 2013-11-12
SK287626B6 (sk) 2011-04-05
EP1203813A2 (en) 2002-05-08
SK18232000A3 (sk) 2001-05-10
CA2330241A1 (en) 1999-12-16
DE69929544D1 (de) 2006-04-13
EP1614423A2 (en) 2006-01-11
ES2253457T3 (es) 2006-06-01
WO1999064604A2 (en) 1999-12-16
ATE286131T1 (de) 2005-01-15
JP2013099357A (ja) 2013-05-23
AR020084A1 (es) 2002-04-10
EP1614423A3 (en) 2008-01-30
EP1084251A2 (en) 2001-03-21
PL348019A1 (en) 2002-05-06
BRPI9917787B1 (pt) 2016-09-06
HU228469B1 (en) 2013-03-28
CZ301570B6 (cs) 2010-04-21
PL202161B1 (pl) 2009-06-30
SK287014B6 (sk) 2009-09-07
EP1203812A3 (en) 2004-02-04
CN101085346A (zh) 2007-12-12
CO5050392A1 (es) 2001-06-27
DK1203812T3 (da) 2006-04-10
EP1203813A3 (en) 2004-02-04
CZ20004533A3 (cs) 2001-07-11
JP5755265B2 (ja) 2015-07-29
EP1203812A2 (en) 2002-05-08
AR071880A2 (es) 2010-07-21
WO1999064604A3 (en) 2000-01-27
CZ301494B6 (cs) 2010-03-24
SI1203812T1 (sl) 2006-04-30
AU769823B2 (en) 2004-02-05
ATE316380T1 (de) 2006-02-15
CZ301569B6 (cs) 2010-04-21
DK1203813T3 (da) 2006-05-22
DE69928700D1 (de) 2006-01-05
CN100374563C (zh) 2008-03-12
NZ509228A (en) 2003-12-19
DK1084251T3 (da) 2005-04-11
DE69922953D1 (de) 2005-02-03
TR200103664T2 (tr) 2002-06-21
EP1084251B1 (en) 2004-12-29
ES2235488T3 (es) 2005-07-01
PE20000552A1 (es) 2000-07-14
HUP0102707A2 (hu) 2001-11-28
CA2330241C (en) 2010-09-21
ATE311193T1 (de) 2005-12-15
DE69929544T2 (de) 2006-07-20
EP1203813B1 (en) 2006-01-25
SI1203813T1 (sl) 2006-06-30
AU4369299A (en) 1999-12-30
JP2002517250A (ja) 2002-06-18
KR100637940B1 (ko) 2006-10-23
EP1203812B1 (en) 2005-11-30
JP5247770B2 (ja) 2013-07-24
SI1084251T1 (hu) 2005-08-31
SK287625B6 (sk) 2011-04-05
DE69922953T2 (de) 2005-05-19
AU769823C (en) 2004-11-25
EP0965639A1 (en) 1999-12-22
HUP0102707A3 (en) 2008-04-28
JP4632540B2 (ja) 2011-02-16
BR9911619A (pt) 2001-10-02
PT1203813E (pt) 2006-06-30
KR20010071406A (ko) 2001-07-28
AR071881A2 (es) 2010-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5755265B2 (ja) 弱毒化ペスチウイルス
US8895286B2 (en) Attenuated pestiviruses
US6610305B1 (en) Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
MXPA00011971A (en) Attenuated pestiviruses