ES2257476T3 - Pestivirus atenuados. - Google Patents
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Abstract
Un método para marcar de forma detectable pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína ERNS, en donde dicha actividad de RNasa se inactiva por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína no sean lisina, y en donde la inactivación de dicha actividad de RNasa que reside en la glicoproteína ERNS resulta en un pestivirus atenuado.
Description
Pestivirus atenuados.
La invención se refiere a un método para atenuar
pestivirus al inactivar la actividad de ribonucleasa (actividad de
RNasa) que reside en la glicoproteína E^{RNS}. La invención
también se refiere a pestivirus atenuados de acuerdo con la
invención, a ácidos nucleicos para preparar pestivirus de este
tipo, a vacunas y a composiciones farmacéuticas que comprenden los
pestivirus atenuados de la invención. La invención se refiere,
además, a métodos para distinguir entre los virus atenuados de la
invención y virus patógenos.
Los pestivirus son los agentes causantes de
enfermedades de animales económicamente importantes en muchos
países de todo el mundo. Materiales aislados de virus actualmente
conocidos han sido agrupados en tres diferentes especies que,
juntas, forman un género dentro de la familia Flaviviridae.
- I
- Virus de la diarrea viral bovina (VDVB) causa la diarrea viral bovina (DVB) y la enfermedad de la mucosa (EM) en ganado (Baker, 1987; Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
- II
- Virus de la fiebre porcina clásica (VFPC), llamado anteriormente virus del cólera porcino, es el responsable de la fiebre porcina clásica (FPC) o cólera porcina (CP) (Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
- III
- El virus de la enfermedad de la frontera (VEF) se encuentra típicamente en ovejas y provoca la enfermedad de la frontera (EF). Se ha descrito también que síntomas similares a EF en ganado se producen después de la infección intrauterina de corderos con VEF (Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
Una clasificación alternativa de pestivirus se
proporciona por Becher et al. (1995) u otros.
Los pestivirus son pequeños virus provistos de
una cubierta con un genoma de ARN de cadena sencilla de polaridad
positiva que carece tanto de las secuencias 5' cap como 3'
poli(A). El genoma vírico codifica una poliproteína de
aproximadamente 4000 aminoácidos dando lugar a productos de
escisión finales mediante tratamiento de
co-traducción y post-traducción que
implican proteasas celulares y víricas. Las proteínas víricas
están dispuestas en la poliproteína en el orden
NH_{2}-N^{pro}-C-E^{RNS}-
E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH
(Rice, 1996). La proteína C y las glicoproteínas E^{RNS}, E1 y E2
representan componentes estructurales del virión del pestivirus
(Thiel et al., 1991). Se encontró que E2 y, en menor medida,
E^{RNS}, eran dianas para la neutralización de anticuerpos (Donis
et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijn et
al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). E^{RNS} carece
de un anclaje de la membrana y se secreta en cantidades
considerables a partir de las células infestadas; se ha informado
que esta proteína exhibe una actividad de RNasa (Hulst et
al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et
al., 1996). La función de esta actividad enzimática para el
ciclo vital del virus es actualmente desconocida. En el caso de una
cepa de vacuna contra VFPC se ha informado que una destrucción
experimental de la RNasa mediante mutagénesis dirigida al sitio da
como resultado un virus citopatógeno que tiene características de
crecimiento en el cultivo de células equivalentes al virus de tipo
salvaje (Hulst et al., 1998). La actividad enzimática depende
de la presencia de dos extensiones de aminoácidos conservadas
entre la E^{RNS} del pestivirus y diferentes RNasas conocidas de
origen vegetal y fúngico. Estas dos secuencias conservadas
contienen un residuo histidina (Schneider et al., 1993). El
intercambio de cada uno de estos residuos por lisina en la proteína
E^{RNS} de una cepa de vacuna de VFPC dio como resultado la
destrucción de la actividad de RNasa (Hulst et al., 1998). La
introducción de estas mutaciones en el genoma de la cepa de vacuna
de VFPC no influía sobre la viabilidad viral o las propiedades de
crecimiento, sino que conducía a un virus que exhibía un fenotipo
ligeramente citopatogénico (Hulst et al., 1998).
Han sido producidas para VFPC y VDVB, y
actualmente se utilizan, vacunas que comprenden virus atenuados o
exterminados o proteínas víricas expresadas en sistemas de expresión
heterólogos. La base estructural de la atenuación de estos virus
utilizados como vacunas vivas es desconocida. Esto conduce al
riesgo de revertantes impredecibles mediante retromutación o
recombinación después de la vacunación. Por otra parte, la eficacia
de vacunas inactivadas o proteínas víricas heterólogamente
expresadas (vacunas subunidad) en la inducción de la inmunidad es
más bien baja.
En general, las vacunas vivas con mutaciones
definidas como base de la atenuación permitiría evitar las
desventajas de la presente generación de vacunas. Actualmente, no
están disponibles dianas potenciales para atenuar mutaciones en
pestivirus.
Una ventaja adicional de dichas mutaciones
atenuantes estriba en su singularidad molecular que permite
utilizarlas como marcadores distintivos para un pestivirus atenuado
y para distinguirlas de pestivirus procedentes del campo.
Debido a la importancia de una profilaxis eficaz
y segura, así como detectable, y del tratamiento de infecciones
por pestivirus, existe una fuerte necesidad de vacunas vivas y
específicamente atenuadas con un elevado potencial para la
inducción de la inmunidad, así como una base definida de atenuación
que también se puede distinguir de pestivirus patógenos.
Por lo tanto, el problema técnico en el que se
basa la presente invención consiste en proporcionar pestivirus
específicamente atenuados y marcados de forma detectable para uso
como vacunas atenuadas vivas con una elevada eficacia para la
inducción de inmunidad que, como resultado de este método, también
se pueden distinguir de pestivirus patógenos procedentes del
campo.
La solución al problema técnico anterior se
consigue mediante la descripción y las realizaciones
caracterizadas en las reivindicaciones.
Se ha encontrado, sorprendentemente, que los
pestivirus se pueden atenuar específicamente mediante la
inactivación de la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína
E^{RNS}.
Los pestivirus atenuados proporcionan ahora
vacunas vivas de elevada inmunogenicidad.
Por lo tanto, un aspecto descrito en esta memoria
proporciona una vacuna viva que comprende un pestivirus, en la que
está inactivada la actividad de RNasa que reside en la
glicoproteína E^{RNS}.
El término "vacuna", tal como se utiliza en
esta memoria, se refiere a una composición farmacéutica que
comprende al menos un componente inmunológicamente activo que induce
una respuesta inmunológica en un animal y, posiblemente pero no
necesariamente, uno o más componentes adicionales que refuerzan la
actividad inmunológica de dicho componente activo. Una vacuna puede
comprender, adicionalmente, componentes adicionales típicos de
composiciones farmacéuticas. El componente inmunológicamente activo
de una vacuna puede comprender organismos vivos completos en su
forma original o en forma de organismos atenuados en una denominada
vacuna viva modificada (VVM) u organismos inactivados por métodos
apropiados en una denominada vacuna exterminada (VE). En otra
forma, el componente inmunológicamente activo de la vacuna puede
comprender elementos apropiados de dichos organismos (vacunas
subunidad), siendo estos elementos generados al destruir el
organismo completo o el crecimiento de cultivos de organismos de
este tipo y proporcionando las subsiguientes etapas de purificación
la o las estructuras deseadas, o por procesos de síntesis inducidos
por una manipulación apropiada de un sistema adecuado tal como,
pero no limitado a bacterias, insectos, mamíferos u otras especies,
más subsiguientes procesos de aislamiento y purificación, o por
inducción de dichos procesos de síntesis en el animal que necesita
una vacuna por incorporación directa de material genético
utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas (vacunación de
polinucleótidos). Una vacuna puede comprender uno, o simultáneamente
más de uno de los elementos antes descritos.
Componentes adicionales para reforzar la
respuesta inmune son constituyentes a los que habitualmente se les
alude como adyuvantes tales como, por ejemplo, hidróxido de
aluminio, aceite minerales u otros aceites o moléculas auxiliares
añadidas a la vacuna o generadas por el cuerpo después de la
respectiva inducción por parte de componentes adicionales de este
tipo, tales como, pero no limitados a interferones, interleuquinas
o factores de crecimiento.
Una "composición farmacéutica" consiste
esencialmente en uno o más ingredientes capaces de modificar las
funciones fisiológicas, por ejemplo inmunológicas, del organismo al
que se administra a, o de organismos que viven en o sobre su
superficie tales como, pero no limitados a antibióticos o
antiparasitarios, así como otros constituyentes añadidos a la misma
con el fin de lograr otros determinados objetivos tales como, pero
no limitados a cualidades de tratamiento, esterilidad, estabilidad,
capacidad de administrar la composición por vías enteral o
parenteral tales como la vía oral, intranasal, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intradermal u otra vía adecuada,
tolerancia después de la administración, propiedades de liberación
controlada.
Una vacuna de la invención se refiere a una
vacuna según se define anteriormente, en donde un componente
inmunológicamente activo es un pestivirus o un componente de origen
pestivírico.
La expresión "vacuna viva" se refiere a una
vacuna que comprende un componente vivo, en particular un
componente activo vírico vivo.
El término "pestivirus", tal como se utiliza
en esta memoria, se refiere a todos los pestivirus caracterizados
por pertenecer al mismo género, tales como VDVB, VFPC y VEF dentro
de la familia Flaviviridae y por su expresión de la glicoproteína
E^{RNS}. Naturalmente, dicho término también se refiere a todos
los pestivirus según se caracterizan por Becher et al.
(1995) u otros que expresan la glicoproteína E^{RNS}.
"Actividad de RNasa", tal como se utiliza en esta memoria, se
refiere a la capacidad de la glicoproteína E^{RNS} de hidrolizar
ARN.
Ha de hacerse observar que en las publicaciones
el término glicoproteína E0 se utiliza a menudo como sinónimo a la
glicoproteína E^{RNS}.
La expresión "inactivación de la actividad de
RNasa que reside en dicha glicoproteína" se refiere a la
incapacidad o a la capacidad reducida de una glicoproteína E^{RNS}
modificada de hidrolizar ARN en comparación con el tipo salvaje no
modificado de dicha glicoproteína E^{RNS}.
La inactivación de la actividad de RNasa que
reside en la glicoproteína E^{RNS} se puede conseguir por
deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha
glicoproteína, según se demuestra en esta memoria y por parte de
Hulst et al. (1998). Por lo tanto, en una realización
preferida la presente invención se refiere a vacunas vivas, en
donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o
mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína.
Se ha demostrado que la glicoproteína E^{RNS}
forma un homodímero unido por disulfuro de aproximadamente 97 kD,
en donde cada monómero consiste en 227 aminoácidos correspondientes
a los aminoácidos 268 a 494 de la poliproteína de VFPC según se
describe por Rümenapf et al. (1993). Los primeros 495
aminoácidos, según se expresan por parte de la cepa Alfort de VFPC,
se muestran en la figura 1 solamente con fines de referencia. La
secuencia del genoma de la cepa Alfort de VFPC está disponible en la
genoteca GenBank/EMBL bajo el número de acceso J04358;
alternativamente, la secuencia de aminoácidos para la cepa CP7 de
VDVB es accesible en la genoteca GenBank/EMBL (número de acceso
U63479). Dos regiones de aminoácidos están muy conservadas en la
glicoproteína E^{RNS}, así como en algunas proteínas de plantas y
hongos con actividad RNasa (Schneider et al., 1993). Estas
dos regiones son de particular importancia para la actividad
enzimática de RNasa. La primera región consiste en los aminoácidos
en las posiciones 295 a 307, y la segunda región consiste en los
aminoácidos en las posiciones 338 a 357 de dicha poliproteína
vírica, según se ejemplifica por la figura 1 para la cepa Alfort
de VFPC (numeración de acuerdo con la secuencia de aminoácidos
deducida publicada la cepa Alfort de VFPC (Meyers et al.,
1989)). Los aminoácidos de particular importancia para la actividad
de RNasa según se ha mencionado anteriormente no están limitados de
modo alguno por la posición exacta según se define para la cepa
Alfort de VFPC, sino que simplemente se utilizan de una manera
ejemplar para indicar los aminoácidos preferidos que se encuentran
en esa posición o que corresponden a esa posición en otras cepas
tales como se encuentran en VDVB, VEF y pestivirus en general, ya
que están muy conservadas. Para pestivirus distintos de la cepa
Alfort de VFPC, la numeración de las posiciones de los aminoácidos
preferidos es a menudo diferente, pero un experto en el campo de
la biología molecular de pestivirus identificará fácilmente estos
aminoácidos preferidos por su posición con relación a los
aminoácidos muy conservados de dicha glicoproteína. En un
ejemplo
particular, no limitante, la posición de Alfort 346 de VFPC es idéntica a la posición 349 de la cepa CP7 de VDVB.
particular, no limitante, la posición de Alfort 346 de VFPC es idéntica a la posición 349 de la cepa CP7 de VDVB.
Como consecuencia, una realización más preferida
descrita con la presente se refiere a una vacuna tal como se
proporciona con la presente, en donde dichas deleciones y/o
mutaciones inactivantes están situadas en los aminoácidos en las
posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se
describe en la figura 1, para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar, correspondiente a las mismas en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización muy preferida describe que la
inactivación de dicha actividad de RNasa por deleción o mutación
del aminoácido en la posición 346 de dicha glicoproteína conduce a
vacunas vivas particularmente útiles. Por lo tanto, la presente
invención se refiere a vacunas provistas de acuerdo con la
presente, en donde dicha actividad de RNasa es inactivada por la
deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
La presente descripción demuestra que los
pestivirus son viables y codifican una proteína E^{RNS} sin
actividad de RNasa cuando está suprimido el residuo histidina en la
posición 346 de la poliproteína vírica (numeración de acuerdo con
la secuencia publicada de Alfort de VFPC/Tübingen (Meyers et
al., 1989)), que representa uno de los residuos del sitio
activo putativo conservados de la RNasa de E^{RNS}. Se ha
demostrado también para esta invención que la deleción de la
respectiva histidina en la E^{RNS} de un pestivirus VEB (posición
349, numerado de acuerdo con la secuencia de CP7 de VDVB de la
genoteca GenBank/EMBL (número de acceso U63479)) da como resultado
un virus viable en el que la glicoproteína E^{RNS} ha perdido la
actividad de RNasa. En contraposición con las mutaciones puntuales
cambiando un aminoácido por otro, un mutante por deleción es
generalmente mucho más estable con respecto a los revertantes. La
infestación de cerdos con un mutante de Alfort de VFPC/Tübingen
patogénica que expresa E^{RNS} con esta deleción no condujo a
fiebre ni a otros síntomas clínicos típicos de infecciones por
VFPC, mientras que la infestación con el virus de tipo salvaje dio
como resultado fiebre, diarrea, anorexia, apatía, agotamiento de
células B y trastornos nerviosos centrales. Estos cerdos fueron
exterminados en una fase moribunda mostrando graves hemorragias en
la piel y órganos internos 14 días después de la inoculación. Los
cerdos infestados con el mutante no mostraban ni viremia ni
agotamiento de células B según se ensayó en los días 3, 5, 7, 10,
14 después de la infección, mientras que el VFPC se aisló
fácilmente de muestras de sangre derivadas de los cerdos inoculados
con el virus de tipo salvaje. El mutante por deleción se replicaba
aparentemente en los animales según se indicaba por la inducción de
anticuerpos neutralizantes (véase el Ejemplo 3, Tabla 3c). La
respuesta inmune al virus mutante era suficiente para permitir que
sobreviviera un enfrentamiento letal con 2x10^{5} TCID_{50} de
la infección muy patógena con la cepa Eystrup de VFPC (König,
1994) que es heteróloga a la cepa Alfort. Además, los animales
sometidos a ensayo no mostraron síntomas clínicos típicos de la
infección por VFPC tales como fiebre, diarrea, hemorragias,
agotamiento de células B o anorexia después de la infección por
enfrentamiento. Estos datos demuestran que la infección de cerdos
con el mutante por deleción induce una respuesta inmune suficiente
para la protección frente a un enfrentamiento estricto.
Por lo tanto, una realización más preferida
descrita con la presente se refiere a vacunas, en donde dicha
actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo
histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para
la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera
correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización más preferida adicional descrita
con la presente se refiere a vacunas de VDVB, en donde dicha
actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo
histidina en la posición 346 según se describe en la figura 1 para
la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a
la misma en otras cepas de VDVB, de dicha glicoproteína.
Otro aspecto descrito con la presente se refiere
a pestivirus atenuados, en los que la actividad de RNasa que
reside en la glicoproteína E^{RNS} está inactivada por deleciones
y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína,
con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó
346 de dicha glicoproteína, según se describe en la figura 1 para
VFPC, no sean lisina. Un pestivirus recombinante, en el que los
aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de dicha glicoproteína
son lisina ha sido descrito por Hulst et al. en 1998. Estos
pestivirus particulares demostraron efectos citopáticos en células
del riñón de cerdo. Hasta ahora, ha habido un total desconocimiento
del rasgo atenuante, sorprendente e innovativo, debido a la
inactivación de la actividad enzimática de E^{RNS}.
Una realización preferida descrita con la
presente, por las razones anteriormente establecidas para vacunas,
también se refiere a pestivirus según se proporcionan con la
presente, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por
deleciones y/o mutaciones localizadas en los aminoácidos en las
posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
Una realización más preferida descrita con la
presente, por las razones establecidas anteriormente para vacunas,
también se refiere a pestivirus de la invención, en donde dicha
actividad de RNasa está inactivada por deleción o mutación del
aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1
para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera
correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización más preferida descrita con la
presente, por las razones establecidas anteriormente para vacunas,
también se refiere a pestivirus, en donde dicha actividad de RNasa
está inactivada por la deleción del residuo histidina en la
posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort
de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la
misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.
Una realización más preferida adicional descrita
con la presente se refiere a pestivirus VDVB, en donde dicha
actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo
histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para
la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera
correspondiente a la misma en otras cepas de VDVB, de dicha
glicoproteína.
Los pestivirus atenuados y los componentes
activos de las vacunas de la presente invención se pueden preparar
fácilmente mediante técnicas recombinantes modificadoras de los
ácidos nucleicos que dan como resultado la expresión de una
secuencia de aminoácidos mutante en la glicoproteína E^{RNS}. Por
lo tanto, un aspecto adicional descrito con la presente se refiere
a ácidos nucleicos que codifican una glicoproteína E^{RNS}, en
donde la actividad de RNasa que reside en dicha glicoproteína es
inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido
de dicha glicoproteína, con la condición de que los aminoácidos en
las posiciones 297 y/ó 346 de la glicoproteína según se describe en
la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC no sean lisina.
Una realización preferida descrita con la
presente, por las razones mencionadas anteriormente, se refiere a
ácidos nucleicos según se proporcionan con la presente, en donde
dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o
mutaciones que están localizadas en los aminoácidos en las
posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
Una realización más preferida descrita con la
presente, por las razones mencionadas para vacunas, se refiere a
ácidos nucleicos según se proporcionan con la presente, en donde
dicha actividad de RNasa está inactivada por deleción o mutación
del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1
para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera
correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización más preferida descrita con la
presente, se refiere a ácidos nucleicos según se proporcionan con
la presente, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por
la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
Una realización más preferida adicional, descrita
con la presente, se refiere a ácidos nucleicos de VDVB de acuerdo
con la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada
por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas VDVB,
de dicha glicoproteína.
Nucleótidos, por ejemplo ADN o ARN, son también
útiles para preparar vacunas de ADN, ARN y/o vector. En estas
vacunas, los nucleótidos se aplican directamente al animal, o
indirectamente a través de vectores distintos del virus original.
Las vacunas de nucleótidos y vacunas de vector son bien conocidas
por el estado actual de la técnica y no necesitan ser elaboradas
adicionalmente.
Un aspecto adicional, descrito con la presente,
se refiere al uso de ácidos nucleicos de la presente invención
para preparar vacunas de nucleótidos y/o vectores.
Las vacunas, los pestivirus atenuados y/o los
ácidos nucleicos descritos con la presente son particularmente
útiles para la preparación de una composición farmacéutica.
En consecuencia, un aspecto adicional descrito
con la presente se refiere a composiciones farmacéuticas que
comprenden una vacuna según se proporciona con la presente, y/o un
pestivirus según se proporciona con la presente, y/o una secuencia
de nucleótidos según se proporciona con la presente.
Un ejemplo no limitante de una composición
farmacéutica de este tipo, únicamente dado con fines de
demostración, se podría preparar como sigue: el material
sobrenadante de un cultivo de células infestado se mezcla con un
estabilizador (por ejemplo espermidina y/o BSA (albúmina de suero
bovino)), y la mezcla se liofiliza o deshidrata subsiguientemente
por otros métodos. Antes de la vacunación, dicha mezcla se
rehidrata entonces en soluciones acuosas (por ejemplo solución
salina, PBS (solución salina tamponada con fosfato)) o no acuosas
(por ejemplo emulsión en aceite, adyuvante basado en aluminio).
Un aspecto adicional descrito con la presente se
refiere a un método para la atenuación de pestivirus. La invención
proporciona un método único e inesperado para atenuar pestivirus,
caracterizado porque se inactiva la actividad de RNasa que reside
en la glicoproteína E^{RNS}.
Los pestivirus específicamente atenuados son
especialmente útiles para la preparación de vacunas. Por lo tanto,
un aspecto adicional descrito con la presente se refiere a métodos
para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuados,
caracterizados porque se inactiva la actividad de RNasa en la
glicoproteína E^{RNS}.
La inactivación de la actividad de RNasa que
reside en la glicoproteína E^{RNS} proporciona un método
sorprendente y nuevo para marcar de forma detectable pestivirus. La
presente invención proporciona un método para marcar de forma
detectable pestivirus, caracterizado porque se inactiva la
actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}. La
característica de la ausencia de actividad de RNasa que reside en
la glicoproteína E^{RNS} de pestivirus según se proporciona con
ello permite ahora marcar de forma detectable estos pestivirus.
Pestivirus marcados y no marcados o la E^{RNS} secretada de
células infestadas con pestivirus en fluidos corporales pueden
distinguirse claramente por la ausencia o presencia de actividad de
RNasa de las glicoproteínas E^{RNS} tras el aislamiento y el
ensayo de tal actividad enzimática.
Para pestivirus inactivados en su actividad de
RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} por deleción y/o
mutación se puede utilizar un cierto número de otras técnicas.
Pestivirus de este tipo se pueden fácilmente detectar debido a las
consecuencias estructurales que resultan de deleciones y/o
mutaciones de este tipo. Por ejemplo, la diferencia de secuencia de
la secuencia de ácidos nucleicos de la glicoproteína E^{RNS}
alterada es detectable por técnicas de secuenciación de ácidos
nucleicos o técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa),
según se demuestra en el Ejemplo 8; la secuencia de proteínas
alterada se puede detectar por anticuerpos monoclonales específicos
que no reconocen proteínas inalteradas. A la inversa, también es
posible detectar las proteínas alteradas y, con ello,
estructuralmente marcadas mediante la ausencia de la unión a
anticuerpos monoclonales específicos que reconocen glicoproteínas de
E^{RNS} inalteradas, bajo la condición de que se pueda
establecer de otro modo la presencia de pestivirus. Y,
naturalmente, las deleciones y/o mutaciones que avalan la actividad
de RNasa en los virus marcados darán como resultado diferentes
respuestas inmunes en animales cuando se comparan con las
respuestas que resultan de infecciones por pestivirus no
marcados.
Una realización preferida para todos los aspectos
referentes a métodos para atenuar pestivirus, métodos para
producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y
métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se
proporcionan con ello son los métodos que se refieren a la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha
actividad de RNasa es inactivada por deleciones y/o mutaciones de
al menos un aminoácido de dicha glico-
proteína.
proteína.
Una realización más preferida para todos los
aspectos referidos a los métodos para atenuar pestivirus, métodos
para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y
métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se
proporcionan con ello son los métodos relacionados con la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dichas
deleciones y/o mutaciones están situadas en los aminoácidos en las
posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
Una realización muy preferida para todos los
aspectos referidos a los métodos para atenuar pestivirus, métodos
para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y
métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se
proporcionan con ello son los métodos relacionados con la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha
actividad de RNasa es inactivada por deleción o mutación del
aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1
para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera
correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización más preferida para todos los
aspectos referidos a los métodos para atenuar pestivirus, métodos
para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y
métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se
proporcionan con ello son los métodos relacionados con la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha
actividad de RNasa es inactivada por la deleción del residuo
histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para
la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera
correspondiente a la misma en otras cepas de dicha
glicoproteína.
La presente invención describe vacunas y/u otras
composiciones farmacéuticas que son particularmente útiles para la
profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en
animales. Por lo tanto, un aspecto adicional descrito con la
presente se refiere a métodos para la profilaxis y el tratamiento
de infecciones por pestivirus en animales, caracterizados porque
una vacuna según se proporciona con la presente u otra composición
farmacéutica según se proporciona con la presente se aplica a un
animal que necesita de una profilaxis o un tratamiento de este
tipo.
Un aspecto adicional descrito con la presente se
refiere a un procedimiento para la preparación de pestivirus
específicamente atenuados, en el que dicho procedimiento se
caracteriza porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en
la glicoproteína E^{RNS}.
Otro aspecto descrito con la presente se refiere
a un procedimiento para la preparación de pestivirus
específicamente marcados, caracterizado porque se inactiva la
actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}.
Una realización preferida para todos los aspectos
referentes a un procedimiento para la preparación de pestivirus
específicamente atenuados, un procedimiento para la preparación de
pestivirus específicamente marcados de acuerdo con la invención son
los procedimientos relacionados con la inactivación de la
glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa se
inactiva por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido
de dicha glicoproteína.
Una realización más preferida para todos los
aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de
pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la
preparación de pestivirus específicamente marcados de acuerdo con
la invención son los procedimientos relacionados con la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dichas
deleciones y/o mutaciones están localizadas en los aminoácidos en
las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se
describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera
ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización muy preferida para todos los
aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de
pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la
preparación de pestivirus específicamente marcados de acuerdo con
la invención son los procedimientos relacionados con la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha
actividad de RNasa es inactivada por deleción o mutación del
aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1
para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o
correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha
glicoproteína.
Una realización más preferida para todos los
aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de
pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la
preparación de pestivirus específicamente marcados de acuerdo con
la invención son los procedimientos relacionados con la
inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha
actividad de RNasa es inactivada por la deleción del residuo
histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para
la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a
la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.
Las vacunas u otras composiciones farmacéuticas
descritas con la presente son útiles para la profilaxis y el
tratamiento de infecciones por pestivirus en animales.
Por lo tanto, un aspecto descrito con la presente
se refiere al uso de una vacuna según se proporciona con la
presente para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por
pestivirus en animales. Un aspecto adicional descrito con la
presente se refiere al uso de una composición farmacéutica según se
proporciona con la presente para la profilaxis y el tratamiento de
infecciones por pestivirus en animales.
Pestivirus y/o ácidos nucleicos según se
proporcionan con la presente son útiles componentes activos de una
composición farmacéutica o una vacuna. Por lo tanto, un aspecto
adicional descrito con la presente se refiere al uso de un
pestivirus de la invención y/o un ácido nucleico según se
proporciona con la presente para la preparación de una vacuna o una
composición farmacéutica.
Tal como se ha mencionado antes, la inactivación
de la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}
proporciona un método sorprendente y nuevo para marcar
pestivirus.
Como consecuencia, un aspecto descrito con la
presente se refiere a métodos para distinguir los pestivirus
marcados de forma detectable de acuerdo con la invención de
pestivirus no marcados y, posiblemente, patógenos. Métodos de este
tipo son especialmente útiles para investigar la eficacia de
pestivirus marcados en animales. Un animal tratado con una vacuna
demostrará ser marcador-positivo después de obtener
una muestra de dicho animal y someter a ensayo dicho marcador. Los
animales no marcados y los animales especialmente no marcados que
demuestran ser pestivirus-positivos, pueden ser
inmediatamente separados, aislados o sacrificados para eliminar el
inminente riesgo de propagar la infección patógena a otros
animales.
La presente invención proporciona un método para
marcar de forma detectable pestivirus, caracterizado porque se
inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína
E^{RNS}. Esta característica de la ausencia de actividad de RNasa
que reside en la glicoproteína E^{RNS} de pestivirus según se
proporciona con la presente permite ahora marcar de forma
detectable estos pestivirus. Como resultado, los pestivirus
marcados y no marcados se pueden claramente distinguir por la
ausencia o presencia de la actividad de RNasa de la glicoproteína
E^{RNS} tras el aislamiento y el ensayo de una actividad
enzimática de este tipo. La determinación de la presencia o
ausencia de esta actividad enzimática tras obtener una muestra que
contiene un pestivirus de interés o un material del mismo se puede
efectuar de acuerdo con métodos estándares tales como, por
ejemplo, se describe en el Ejemplo 2 o en Hulst et al.
(1994).
Por lo tanto, una realización preferida descrita
con la presente se refiere a un método para distinguir animales
infestados con pestivirus de animales vacunados con un pestivirus
específicamente atenuado según se describe en esta memoria, que
comprende las siguientes etapas:
- (1)
- obtener una muestra de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o de un animal vacunado;
- (2)
- determinar la ausencia o presencia de actividad de RNasa de una glicoproteína E^{RNS} dentro de dicha muestra;
- (3)
- correlacionar la ausencia de actividad de Rnasa de la glicoproteína E^{RNS} con un animal vacunado y correlacionar la presencia de dicha actividad con una infección por pestivirus de dicho animal.
La presente descripción proporciona pestivirus
que están inactivados en su actividad de RNasa que reside en la
glicoproteína E^{RNS} por deleción y/o mutación. Pestivirus de
este tipo se detectan fácilmente debido a las consecuencias
estructurales que resultan de deleciones y/o mutaciones de este
tipo. La diferencia en la secuencia del gen E^{RNS} que codifica
la glicoproteína E^{RNS} alterada se puede detectar mediante
técnicas de secuenciación o técnicas de PCR. Como resultado, una
realización preferida descrita con ello se refiere a un método
para distinguir animales infestados por pestivirus de animales
vacunados con un pestivirus específicamente atenuado proporcionado
con ello, que comprende las siguientes etapas:
- (1)
- obtener una muestra de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o un animal vacunado;
- (2)
- identificar la secuencia de nucleótidos de un ge- noma de pestivirus o proteína dentro de dicha muestra;
- (3)
- correlacionar las deleciones y/o mutaciones de la secuencia de nucleótidos de E^{RNS} tal como se presenta en la vacuna con un animal vacunado y correlacionar la ausencia de dichas deleciones y/o mutaciones con una infección por pestivirus de dicho animal.
Además, los cambios estructurales que resultan de
la secuencia de proteínas alterada de la glicoproteína E^{RNS}
de pestivirus según se proporcionan con la presente se puede
detectar mediante anticuerpos monoclonales o policlonales
específicos, que no reconocen proteínas inalteradas. Por lo tanto,
en una realización adicional, la presente descripción se refiere a
un método para distinguir animales infestados por pestivirus de
animales vacunados con un pestivirus atenuado según se proporcionan
con la presente, que comprende las siguientes etapas:
- (1)
- obtener una muestra de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o de un animal vacunado;
- (2)
- identificar una glicoproteína E^{RNS} modificada de un pestivirus atenuado mediante la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas E^{RNS} presentes en dicha muestra, siendo modificadas dichas glicoproteínas por un método según se describe en esta memoria, con lo que dichos anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteínas E^{RNS} no modificadas;
- (3)
- correlacionar la unión específica de dichos anti-cuerpos monoclonales o policlonales con un animal vacunado, y correlacionar la ausencia de anticuerpos que se unen a una infección por pestivirus de dicho animal, bajo la condición de que la presencia de material pestivírico en dicho animal y/o dicha muestra se establezca de otro modo.
A la inversa, también es posible detectar las
proteínas alteradas y, con ello, estructuralmente marcadas,
mediante la ausencia de la unión a anticuerpos monoclonales o
policlonales específicos que reconocen solamente glicoproteínas
E^{RNS} inalteradas, si la presencia de pestivirus se puede
establecer de otro modo. Una realización preferida descrita con la
presente se refiere a un método para distinguir animales infestados
por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado
según se proporciona con la presente, que comprende las siguientes
etapas:
- (1)
- obtener una muestra de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o de un animal vacunado;
- (2)
- identificar una glicoproteína E^{RNS} no modificada de un pestivirus mediante la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas E^{RNS} presentes en dicha muestra, no siendo modificadas dichas glicoproteínas por un método según se proporciona con la presente, con lo que dichos anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteínas E^{RNS} modificadas;
- (3)
- correlacionar la unión específica de dichos anticuerpos monoclonales o policlonales con una infección por pestivirus en dicho animal, y correlacionar la ausencia de anticuerpos que se unen a un animal vacunado, bajo la condición de que la presencia de material pestivírico en dicho animal y/o dicha muestra se establezca de otro modo.
Naturalmente, la modificación estructural y la
ausencia de la actividad de RNasa en los virus marcados según se
proporcionan con la presente dará como resultado diferentes
respuestas inmunes en animales cuando se comparan con las
respuestas que resultan de infecciones por pestivirus no marcados.
Los pestivirus según se proporcionan con la presente producen una
respuesta inmune diferente y distinta, celular así como humoral,
que difiere de respuestas inmunes no modificadas y, posiblemente,
patógenas. Por ejemplo, glicoproteínas E^{RNS} según se
proporcionan con la presente darán como resultado anticuerpos
policlonales que son diferentes en su especificidad de unión cuando
se comparan con anticuerpos policlonales que resultan de
glicoproteínas no modificadas. Esta diferencia en la especificidad
de unión proporciona un marcador para distinguir animales
vacunados con pestivirus según se proporciona con la presente de
animales infestados con pestivirus en el campo. Ensayos para el
rastreo de sueros en cuanto a anticuerpos policlonales específicos
que se unen a un epítopo de tipo salvaje o una mutación por
deleción del marcador de ese epítopo para el fin de diferenciar
animales infestados y vacunados han sido descritos, por ejemplo,
para cerdos infestados con pseudorrabia y vacunados (Kit et
al., 1991).
Una realización preferida descrita con la
presente se refiere a un método para distinguir animales
infestados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus
atenuado según se proporcionan con la presente, que comprende las
siguientes etapas:
- (1)
- obtener una muestra de anticuerpos policlonales de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o de un animal vacunado;
- (2)
- identificar cualquier unión específica de dichos anticuerpos policlonales a la glicoproteína E^{RNS} no modificada o a la glicoproteína E^{RNS} según se modifica según la presente descripción;
- (3)
- correlacionar la unión de dichos anticuerpos policlonales a la glicoproteína E^{RNS} no modificada con una infección por pestivirus y correlacionar la unión de dichos anticuerpos policlonales a la glicoproteína E^{RNS} según se modifica de acuerdo con la presente descripción con uno vacunado.
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Partiendo de los clones pA/VFPC (Meyers et
al., 1996a) o pA/VDVB (Meyers et al., 1996b) de ADNc de
longitud completa, a partir de los cuales se puede obtener ARNc
infeccioso mediante transcripción in vitro, se generaron
subclones. Para VFPC, un fragmento XhoI/SspI de pA/VFPC se clonó en
pBluescript SK+ y se cortó con XhoI y SmaI. Para VDVB, un fragmento
XhoI/BglII de pA/VDVB se clonó en el plásmido
pCITE-2C cortado con las mismas enzimas. A partir
de estas construcciones se produjo ADN del plásmido de cadena
sencilla de acuerdo con el método de Kunkel (Kunkel et al.,
1987), utilizando células CJ 236 de E. coli (BioRad) y el
fago de cadena sencilla VCMS (Stratagene). El ADN de cadena
sencilla se convirtió en cadenas dobles utilizando el "estuche
de mutagénesis" in vitro "Phagemid" (BioRad). Alguno
de los oligonucleótidos sintéticos que se utilizaron como
cebadores para generar los mutantes de pestivirus deseados se
enumeran a continuación de una manera ejemplar:
- C-297-L:
- AGGAGCTTACTTGGGATCTG
- C-346-L:
- GGAACAAACTTGGATGGTGT
- C-297-K:
- ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC
- C-346-K:
- ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA
- C-346-d:
- GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC
- B-346-d:
- CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG
El ADN del plásmido de cadena doble se utilizó
para la transformación de células XL-1 Blue de
E. coli (Stratagene). Plásmidos que albergan colonias
bacterianas se aislaron a través de la selección por ampicilina.
El ADN del plásmido se preparó y se analizó adicionalmente mediante
la secuenciación de nucleótidos utilizando el estuche de
secuenciación de T7 polimerasa (Pharmacia). Los plásmidos que
contenían las mutaciones deseadas y ningún cambio en los segundos
sitios se utilizaron para la construcción de clones de ADNc de
longitud completa. En el caso de VFPC, un fragmento XhoI/NdeI del
plásmido mutagenizado se insertó junto con un fragmento NdeI/BglII
derivado del plásmido 578 (pCITE 2A, que contiene el fragmento
XhoI/BglII de pA/VFPC) en pA/VFPC cortado con XhoI y BglII. Para
obtener el mutante CP7 de VDVB, un fragmento XhoI/BglII que
contenía la deleción se insertó en pA/VDVB cortado con XhoI y NcoI
junto con un fragmento BglII/NcoI aislado de pA/VDVB/Ins-. A
partir de la construcción pA/VDVB/Ins- se transcribió un ARNc que da
origen a un VDVB no citopatogénico tras la transfección en células
adecuadas (Meyers et al., 1996b). Los diferentes clones de
longitud completa se amplificaron y los plásmidos se aislaron. La
presencia de las mutaciones deseadas se demostró mediante
secuenciación de ADN. Después de la linearización con SrfI (clones
de longitud completa de VFPC) o SmaI (clones de longitud completa
de VDVB), el ARNc se transcribió según se ha descrito previamente
(Meyers et al., 1996ab). El ARN se purificó mediante
filtración en gel y extracción con fenol/cloroformo y se utilizó
para la transfección de células de riñón porcinas (PK15) o células
de riñón bovinas (clon B2 de MDBK) (construcciones de VFPC o VDVB,
respectivamente). Las transfecciones se analizaron mediante
inmunofluorescencia con antisueros específicos del virus. En los
casos en los que los mutantes deseados se podían recuperar
(inmunofluorescencia positiva), los virus se amplificaron mediante
el paso sobre las mismas líneas de células utilizadas para los
experimentos de transfección. El análisis adicional de los mutantes
de VFPC incluía la determinación de curvas de crecimiento de una
etapa y la caracterización de ARN vírico mediante transferencia de
Northern con sondas de ADNc específicas del virus así como la
reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa
(RT-PCR) y la subsiguiente secuenciación de los
fragmentos de PCR para verificar la presencia de las mutaciones
deseadas en el genoma vírico. En todos los casos se demostró la
presencia de la mutación deseada. La totalidad de los virus
recuperados se desarrolló igualmente bien y producían cantidades
similares de ARN al igual que los virus que resultan del plásmido
que exhibe la secuencia de tipo salvaje.
La viabilidad del mutante de VDVB se demostró
mediante transfección del ARNc respectivo y del desdoblamiento de
las células 3 días después. Parte de las células se sembró en una
placa de 3,5 cm de diámetro, se fijó con acetona/ metanol el día
siguiente y se analizó mediante inmunofluorescencia con una mezcla
de anticuerpos monoclonales específicos de VDVB (Weiland et
al., 1989). Se encontró que todas las células eran positivas,
mientras que un control de células transfectadas con ARN no
infeccioso no mostró ninguna señal. A partir de una parte de las
células transfectadas con el ARNc respectivo, se produjo un
extracto mediante un ciclo de congelación y descongelación. Las
células de reciente aportación se infestaron con este extracto de
células y se demostró que eran VDVB positivas mediante
inmunofluorescencia específica de VDVB 3 días después de la
infección.
La Tabla 1 resume los diferentes cambios
introducidos en las secuencias conservadas de E^{RNS} que
representan los sitios activos putativos de la RNasa que son
codificados por los mutantes del virus indicados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| \begin{minipage}[t]{155mm} Leyendas de la Tabla 1: el ensayo de la actividad de RNasa se efectuó en un ensayo transitorio. Las células BHK21 se infestaron con el virus de la vacuna vTF7-3 (Fuerst et al., 1986) y luego se transfectaron con la respectiva construcción de ADNc (5 \mu g de ADN de plásmido, transfección utilizando Superfect según se recomienda por el suministrador (Qiagen)). Al cabo de 10 horas de incubación a 37^{o}C en una incubadora de CO_{2}, las células transfectadas se lisaron y trataron para la determinación de RNasa según se describe a continuación. La viabilidad se determinó según se describe a continuación.\end{minipage} |
Para someter a ensayo el efecto de las diferentes
mutaciones sobre la actividad de RNasa de E^{RNS}, células
apropiadas se infestaron con los virus mutantes. Para VFPC, la
infección se llevó a cabo con una multiplicidad de infecciones
(m.d.i.) de 0,01. La infección con el virus de tipo salvaje servía
como un testigo positivo, mientras que como testigo negativo se
utilizaron células no infestadas. Al cabo de 48 h después de la
infección, las células se lavaron dos veces son solución salina
tamponada con fosfato y se lisaron en 0,4 ml de tampón de lisis
(Tris/HCl 20mM; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 2 mg/ml de albúmina de suero
bovino; 1% de Triton X100; 0,1% de ácido desoxicólico; 0,1% de
dodecilsulfato de sodio). El material lisado se añadió a tubos de
reacción de 1,5 ml, se trató con ultrasonidos (dispositivo de
ultrasonidos Branson B12, 120 vatios, 20 s en un baño de agua de
cuerno de copa), se aclaró mediante centrifugación (5 min, 14.000
rpm, centrífuga Eppendorf, 4ºC) y el material sobrenadante se
sometió a ultracentrifugación (ultracentrífuga superior de mesa
Beckmann, 60 min a 4ºC y 45.000 rpm en un rotor TLA 45). La
determinación de la actividad de RNasa se efectuó en un volumen
total de 200 \mul que contenía 5 ó 50 \mul de material
sobrenadante de la segunda etapa de centrifugación y 80 \mug de
poli(rU) (Pharmacia) en tampón de ensayo de RNasa
(Tris-acetato 40 mM (pH 6,5), EDTA 0,5 mM,
ditiotreitol (DTT) 5 mM). Después de la incubación de la mezcla de
reacción a 37ºC durante 1 hora, se añadieron 200 \mul de ácido
perclórico 1,2 M, LaSO_{4} 20 mM. Después de 15 min de incubación
sobre hielo, la mezcla se centrifugó durante 15 min a 4ºC y 14.000
rpm en una centrífuga Eppendorf. Al material sobrenadante se
añadieron 3 volúmenes de agua, y una parte alícuota de la mezcla se
analizó midiendo la densidad óptica a 260 nm utilizando un
espectrofotómetro Ultrospec 3000 (Pharmacia). En todos los casos,
las mutaciones introducidas en el gen E^{ms} anularon
completamente la actividad de RNasa (Tabla 1).
Para el VDVB, la actividad de RNasa mutante se
sometió a ensayo con material obtenido después de la transfección
con ARN sin el paso de los virus recuperados. Las células
transfectadas con el ARN apropiado se escindieron 72 h después de
la transfección y se sembraron en dos placas. 24 h más tarde, de
una placa se prepararon extractos de células y se analizaron en
cuanto a la actividad de RNasa tal como se ha descrito antes. Para
demostrar la infección, las células de la segunda placa se
analizaron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos
monoclonales específicos de VDVB (Weiland et al., 1989) y se
encontró que eran 100% positivas. La transfección se llevó a cabo
con ARN transcrito a partir de pA/VDVB/Ins- y a partir de
pA/B-346-d, el plásmido equivalente
a pA/VDVB/Ins-, pero que contiene la deleción del codón equivalente
al codón 346 en el genoma de Alfort de VFPC. Células MDBK no
transfectadas servían como testigo negativo.
| Alfort | C-WT | C-297-L | C-346-L | C-346-d | C-346-d/RS | testigo | |
| DO_{260} | 2,4 | 2,3 | 1,1 | 1,1 | 1,1 | 2,3 | 1,1 |
| Alfort | C-WT | C-297-L | C-346-L | C-297-K | C-346-K | C-297-L/346-L | |
| DO_{260} | 2,09 | 2,16 | 0,715 | 0,77 | 0,79 | 0,766 | 0,77 |
| C-297-K/346-L | C-297-K/346-K | C-346-d | Testigo | ||||
| DO_{260} | 0,725 | 0,835 | 0,8 | 0,84 |
Células pK15 se infestaron con los virus
indicados a una m.d.i. (multiplicidad de infección) de 0,01, se
incubaron a 37ºC durante 48 h en una incubadora de CO_{2} y luego
se lisaron y sometieron a ensayo de RNasa. El ARN soluble en
ácidos resultante de la incubación con los diferentes extractos de
células se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm. Las
diferencias observadas en la actividad de RNasa no eran debidas a
las diferentes cantidades de proteína E^{RNS} en las muestras, ya
que se obtenían valores similares después de la cuantificación de
E^{RNS} mediante marcaje radiactivo, inmunoprecipitación y
análisis de radiactividad con un fosforimager. Además, la reducción
de la concentración de E^{ms} en el ensayo hasta sólo un décimo
de la cantidad habitual no cambiaba los valores DO resultantes de
forma considerable, indicando que con las condiciones elegidas, el
ensayo estaba saturado con E^{ms}.
Cepa Alfort de VFPC; todos los otros virus se
recuperaron de ARN transcrito in vitro a partir de
plásmidos: por ejemplo, C-WT a partir de pA/VFPC;
C-297-L a partir de pA/C-
297-L; etc.; el virus
C-346-d/Rs se recuperó a partir de
pA/C-346-d/Rs (generado por
inversión de la mutación en
pA/C-346-d por intercambio del
respectivo fragmento de ADNc frente al fragmento equivalente
derivado de pA/CFVP); testigo: extracto de células PK15 no
infestadas.
\vskip1.000000\baselineskip
| B-WT | B-346-d | Testigo | |
| DO_{260} | 2,5 | 1,1 | 1,1 |
Células MDBK se infestaron con ARN transcrito
in vitro, se escindieron 72 h después de la transfección y
se analizaron 24 h más tarde en cuanto a la actividad de RNasa. La
infección de las células se demostró mediante análisis por
inmunofluorescencia según se describe en el texto.
B-WT: virus recuperado a partir
de pA/VDVB/Ins-; B-346-d: virus
recuperado a partir de pA/B-346-d;
testigo: extracto de células MDBK no infestadas.
Para someter a ensayo si la destrucción de la
actividad de RNasa influye sobre la patogenicidad de pestivirus en
su hospedante natural, se efectuaron experimentos con animales con
el mutante V(pA/C-346-d)
(C346-d en las tablas). El virus recuperado a partir
del clon de longitud completa de VFPC sin mutación
(V(pA/VFPC)) servía como testigo positivo
(C-WT en las tablas). Para cada mutante se
utilizaron tres cochinillos: (cría: raza de cerdo alemana;
aproximadamente 25 kg de peso corporal). La dosis de infección era
de 1 x 10^{5} TCID_{50} por animal; dos tercios del material
inoculado se administraron por vía intranasal (un tercio en cada
ventana de la nariz), un tercio por vía intramuscular. Los dos
grupos se alojaron en unidades de aislamiento separadas. Se tomó
sangre de los animales dos veces antes de la infección y los días
3, 5, 7, 10, 12 y 14. Además, la temperatura se registró
diariamente (figura 2). Los animales infestados con el virus de
tipo salvaje mostraron síntomas típicos de fiebre similar a la
fiebre porcina clásica, ataxia, anorexia, diarrea, trastornos
nerviosos centrales, hemorragias en la piel (Tabla 3a). El virus se
pudo recuperar a partir de la sangre el día 3 (animal nº 68) y los
días 5, 7, 10, 14 (animales nº 68, nº 78, nº 121) (Tabla 3b). Los
animales se sacrificaron en una fase moribunda el día 14 después de
la infección. En este momento, no se pudo detectar ningún
anticuerpo neutralizante del virus. En contraposición, los animales
infestados con el mutante no desarrollaron síntomas clínicos
(Tabla 3a). La temperatura se mantuvo normal (figura 2) a lo largo
de todo el período experimental y los animales nunca pararon de
ingerir comida. En ningún instante se pudieron recuperar virus de
la sangre. No obstante, los animales estaban claramente infestados
y lo más probablemente es que el virus se replicara, ya que la
totalidad de los animales desarrolló anticuerpos neutralizantes
(Tabla 3c).
| Experimento con animales 1 | |||||||||
| Anim. | infestado | síntomas clínicos | |||||||
| nº | con | ||||||||
| fiebre | diarrea | trastornos | anorexia | hemorragias | apatía | moribundo | hemorragias | ||
| del SNC | en la piel | el día de la | en los órga- | ||||||
| eutanasia | nos en la | ||||||||
| necropsia | |||||||||
| nº 68 | C-WT | + | + | + | + | + | + | + | + |
| nº 78 | C-WT | + | + | + | + | + | + | + | + |
| nº 121 | C-WT | + | + | + | + | + | + | + | + |
| nº 70 | C-346-d | - | - | - | - | - | - | - | n.a. |
| nº 72 | C-346-d | - | - | - | - | - | - | - | n.a. |
| nº 74 | C-346-d | - | - | - | - | - | - | - | n.a. |
\vskip1.000000\baselineskip
6 cochinillos (raza de cerdos alemana;
aproximadamente 25 kg de peso corporal) en dos grupos (cada grupo
estaba alojado por separado) se incluyeron en el estudio. 3 animales
se infestaron con VFPC-WT (1\cdot10^{5}
TCID_{50}) y 3 animales con
C-346-d (1\cdot10^{5}
TCID_{50}). La temperatura del recto y los síntomas clínicos se
registraron y se resumen según se detalla en la Tabla; n.a.: no se
efectuó ninguna necropsia.
| Experimento con animales 1 | ||||||
| Número de animal | infestado con | viremia en los días después de la infestación | ||||
| 3 | 5 | 7 | 10 | 14 | ||
| nº 68 | C-WT | + | + | + | + | + |
| nº 78 | C-WT | - | + | + | + | + |
| nº 121 | C-WT | - | + | + | + | + |
| nº 70 | C-346-d | - | - | - | - | - |
| nº 72 | C-346-d | - | - | - | - | - |
| nº 74 | C-346-d | - | - | - | - | - |
La viremia de las células de la sangre se detectó
mediante co-cultivo de la sangre con células PK15.
Después de la incubación a 37ºC durante 72 h, las células se lavaron
con PBS, se fijaron con acetona/metanol enfriado con hielo y se
analizaron en cuanto a la infección por inmunofluorescencia con un
anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína E2 (amc A18,
Weiland et al. 1990).
| días p.i. | -3 | 0 | 17 | 25 | 69 | 76 | 79 | 87 |
| cerdo nº 70 | - | - | 1:18 | 1:162 | 1:162 | 1:162 | 1:486 | 1:1458 |
| cerdo nº 72 | - | - | 1:18 | 1:54 | 1:486 | 1:1458 | 1:1458 | 1:4374 |
| cerdo nº 74 | - | - | 1:6 | 1:54 | 1:162 | 1:486 | 1:486 | 1:1458 |
Títulos de anticuerpos de cerdos infestados con
el mutante C-346-d del virus
determinados a diferentes instantes durante el experimento con
animales:
50 \mul del suero diluido se mezclaron con 50
\mul de medio que contenía 30 TCID_{50} de virus (Alfort
VFPC/Tübingen). Al cabo de 90 minutos de incubación a 37ºC, se
añadieron 100 \mul de células (1,5 x 10^{4} células), y la
mezcla se sembró en placas de 96 pocillos. Después de 72 h, las
células se fijaron con acetona/metanol enfriado con hielo y se
analizaron en cuanto a la infección por inmunofluorescencia con un
anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína E2 (amc A18,
Weiland et al. 1990). El día 69 después de la infección, los
animales se enfrentaron con 2 x 10^{5} TCID_{50} de la cepa
Eystrup de VFPC. La tabla da la dilución del suero más elevada que
da como resultado una neutralización completa de virus de
entrada.
Para analizar si la infección con el virus
mutante había conducido a una inmunidad protectora, se efectuó un
experimento de enfrentamiento aproximadamente 9 semanas después de
la infección con el mutante de VFPC utilizando una cepa VFPC
heteróloga muy patógena (cepa Eystrup, procedente de Behring). Para
la infección se utilizaron 2 x 10^{5} TCID_{50} de virus. Se
encontró que esta cantidad de virus es suficiente para inducir una
enfermedad letal en varios experimentos precedentes (König, 1994).
Sin embargo, los animales previamente infestados con el mutante de
RNasa de VFPC no mostraron síntomas de enfermedad después de la
infección de enfrentamiento. No se podía detectar ni fiebre (figura
3) ni viremia, pero un aumento en los anticuerpos neutralizantes
indicó una infección productora y una replicación del virus de
enfrentamiento.
Para demostrar que la atenuación observada del
virus mutante se debe de hecho a la deleción de la histidina en la
posición 346 de la poliproteína y no es una consecuencia de una
segunda mutación puntual no identificada, la secuencia de tipo
salvaje se reestableció por intercambio de un fragmento XhoI/NdeI
de 1,6 kb del clon pA/C-346-d de
longitud completa por el correspondiente fragmento de pA/VFPC que
exhibe la secuencia de tipo salvaje. El fragmento escindido a
partir de pA/C-346-d se analizó
mediante secuenciación de los nucleótidos en cuanto a mutaciones.
Exceptuando la deleción del triplete que codifica la histidina 346
de la poliproteína, no se encontró ninguna diferencia con respecto a
la secuencia de tipo salvaje. A partir de la construcción de ADNc
con el mutante recuperado, se pudo recuperar el virus
V(pa/C-346-d/Rs) que se
desarrollaba igualmente bien que el virus de tipo salvaje y
mostraba una actividad de RNasa equivalente (Tabla 2A).
En un segundo experimento con animales, el virus
rescatado se utilizó para la infestación de cerdos. Como testigo
se utilizó el mutante de deleción. De nuevo se utilizaron dos
grupos que consistían en tres animales. Dado que los animales eran
más jóvenes (raza de cerdos alemana de aproximadamente 20 kg) que
los del primer experimento, esta vez se utilizaron para la
infestación 5 x 10^{4} TCID_{50} de virus. De nuevo, los
animales infestados con el mutante no mostraron síntomas clínicos
(Tabla 5, figura 4). Sólo un animal tuvo fiebre durante un día. No
obstante, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y
estaban protegidos frente a un enfrentamiento letal con VFPC. El
enfrentamiento se efectuó de nuevo por infestación con 2 x 10^{5}
TCID_{50} de la cepa Eystrup de enfrentamiento. Los animales no
mostraron síntomas clínicos después del enfrentamiento, y la
temperatura se mantuvo normal (figura 5). En contraposición con los
cerdos infestados con el mutante de deleción, los animales
inoculados con el virus de tipo salvaje rescatado desarrollaron una
fiebre porcina clásica fatal. Un animal tuvo que ser sacrificado 11
días después de la infección y los otros dos 3 días más tarde.
Todos los animales mostraron típicos síntomas de fiebre porcina
clásica, es decir
fiebre, diarrea, anorexia y síntomas patológicos similares a hemorragias en diferentes órganos, incluido el riñón.
fiebre, diarrea, anorexia y síntomas patológicos similares a hemorragias en diferentes órganos, incluido el riñón.
| Experimento con animales 2 | |||||||||
| Anim. nº | infestado con | síntomas clínicos | |||||||
| fiebre | diarrea | trastornos | anorexia | hemorragias | apatía | moribundo | hemorragias | ||
| del SNC | en la piel | el día de la | en los órga- | ||||||
| eutanasia | nos en la | ||||||||
| necropsia | |||||||||
| nº 43 | C-346-d | +* | - | - | - | - | - | - | n.a. |
| nº 47 | C-346-d | - | - | - | - | - | - | - | n.a. |
| nº 87 | C-346-d | - | - | - | - | - | - | - | n.a. |
| nº 27 | C-346- | ||||||||
| d/RS | + | + | + | + | - | + | + | + | |
| nº 28 | C-346- | ||||||||
| d/RS | + | + | + | + | - | + | + | + | |
| nº 30 | C-346- | ||||||||
| d/RS | + | + | + | + | - | + | + | + | |
| * fiebre sólo durante 1 día |
6 cochinillos (raza de cerdos alemana;
aproximadamente 20 kg de peso corporal) en dos grupos (cada grupo
se alojó por separado bajo condiciones de aislamiento) se incluyeron
en el estudio. 3 animales se infestaron con
C-346-d mutante (5\cdot10^{4}
TCID_{50}) y 3 animales con
C-346-d/Rs (5\cdot10^{4}
TCID_{50}). C-346-d/Rs se derivó
de C-346-d mutante reestableciendo
la secuencia de tipo salvaje del gen E^{RNS}. Se registraron y
resumieron la temperatura del recto y los síntomas clínicos; n.a.:
no se efectuó ninguna necropsia.
| Alfort | animal nº 3 | animal nº 5 | animal nº 27 | animal nº 28 | animal nº 30 | Testigo | |
| C-297-K | C-297-K | C-346-d/RS | C-346-d/RS | C-346-d/RS | |||
| DO_{260} | 1,84 | 0,60 | 0,56 | 1,84 | 1,93 | 1,94 | 0,49 |
Los virus recuperados de la sangre de los
animales 3 y 5 en el día 5 después de la infección y los animales
27, 28 y 30 del experimento con animales nº 2 (descrito en el
Ejemplo 5) el día 7 después de la infección se propagaron en
cultivo tisular, se titularon y se sometieron a ensayo en cuanto a
la actividad de RNasa tal como se ha descrito antes. Como testigos
servían células PK15 no infestadas y células (testigo) infestadas
con VFPC (Alfort) de tipo salvaje. Los animales 3 y 5 habían sido
infestados con C-297-K mutante,
mientras que los animales 27, 28 y 30 habían sido infestados con
C-346-d/RS mutante, tal como se
indica en la tabla.
Para someter a ensayo los efectos de una doble
mutación dentro de E^{RNS} sobre la capacidad del virus
respectivo de replicarse en su hospedante natural y sobre la
patogenicidad, se efectuó un experimento con animales con el
mutante
v(pA/C-297-L/346-L).
Los virus recuperados a partir del clon de longitud completa de
VFPC sin mutación (V(pA/VFPC)) servían como testigo positivo.
Para cada mutante se utilizaron tres cochinillos (cría: raza de
cerdo alemana; aproximadamente de 25 kg de peso corporal). La dosis
de infección era 1 x 10^{5} TCID_{50} por animal; dos tercios
del material inoculado se administraron por vía intranasal (un
tercio en cada ventana de la nariz), un tercio por vía
intramuscular. La sangre se tomó de los animales antes de la
infección (día 0) y los días 5, 8, 12 y 20. Además, la temperatura
se registró diariamente (figura 6). Los animales infestados con el
doble mutante no desarrollaban ningún síntoma clínico y los
animales nunca pararon de ingerir comida. Los animales no mostraron
fiebre a lo largo de todo el período del experimento (animales
45/2 y 45/3), excepto el animal 45/1 el día 8, probablemente debido
a la infección bacteriana provocada por lesión de la pata trasera
derecha. Después del tratamiento de este animal con un antibiótico
el día 10, la temperatura volvió a valores normales en el espacio
de un día (figura 6). Para todos los animales el virus se recuperó
de la sangre del día 5, mientras que no se detectó viremia en
momentos posteriores (Tabla 6a). Todos los animales desarrollaron
anticuerpos neutralizantes (Tabla 6b). Para el animal 45/1, el
título de neutralización se determinó de nuevo aproximadamente 4,5
meses después de la infección (d.i.) y se encontró que era 1:4374.
Así, la infección con el doble mutante dio como resultado una
memoria inmunológica de larga
duración.
duración.
\vskip1.000000\baselineskip
| Días d.i. | 5 | 8 | 12 |
| cerdo 45/I | + | - | - |
| cerdo 45/II | + | - | - |
| cerdo 45/III | + | - | - |
\vskip1.000000\baselineskip
| Animal | día 0 | día 20 p.i. |
| 45/1 | - | 1:128 |
| 45/2 | - | 1:256 |
| 45/3 | - | 1:256 |
Este experimento se diseñó para investigar el
principio de atenuación así como la inmunogenicidad del virus VDVB
"B-346-d" recuperado a partir
de pA/B-346-d comparándolo con el
virus "B-WT" recuperado a partir de
pA/VDVB/Ins-. El virus
"B-346-d" está, naturalmente,
mutado en la posición 349 del VDVB original pero se denomina
"B-346" para indicar la posición con relación a
la posición 346 de Alfort de VFPC de la figura 1.
Se seleccionaron tres grupos de animales VDVB
seronegativos de 3-6 meses de edad. Los grupos 1 y
2 comprendían 5 animales cada uno, mientras que el grupo 3
comprendía 3 animales. Los animales de los grupos 1 y 2 se
infestaron por administración de 2 x 10^{6} TCID_{50} de
B-346 (grupo 1) o B-WT (grupo 2) en
un volumen de 5 ml por vía de administración. Los animales se
infestaron por vía intramuscular (músculo glúteo), por vía
intranasal y por vía subcutánea (por encima de la escápula). A lo
largo de un período de 14 días después de la infestación, la
viremia en los dos grupos se vigiló mediante parámetros tales como
viremia de las células de la sangre y derramamiento de los virus en
bastoncillos para la nariz. Además, se vigilaron parámetros
clínicos tales como las temperaturas del recto, los recuentos de
leucocitos y parámetros de salud generales.
La inmunidad protectora frente a una infección
con un material aislado de VDVB antigenéticamente heterólogo y
virulento (nº 13) se investigó mediante infección de enfrentamiento
77 días después de la infección de los animales del grupo 1 con
B-346-d. Los animales del grupo 3
servían como testigo de enfrentamiento y se infestaron de acuerdo
con el proceso para los animales del grupo 1 con el material
aislado de VDVB virulento. El virus VDVB (nº 13) pertenece a un
grupo antigenético diferente (tipo II), mientras que el virus
B-346-d pertenece al grupo
antigenético (tipo I) de acuerdo con la clasificación descrita (por
Pellerin, C. et al., 1994). Los animales de los grupos 1 y 3
quedaron infestados mediante la administración de 2 x 10^{6}
TCID_{50} de material aislado de VDVB (nº 13) en un volumen de 5
ml por vía de administración. Los animales se infestaron a través
de la vía intramuscular (músculo glúteo), intranasal y subcutánea
(por encima de la escápula). A lo largo de un período de 14 días
después de la infección, se vigiló la viremia en los dos grupos
mediante parámetros tales como la viremia de las células de la
sangre y el derramamiento de los virus en bastoncillos para la
nariz. Además, se vigilaron parámetros clínicos tales como las
temperaturas del recto, los recuentos de leucocitos y los
parámetros de salud generales.
Después de la infección con
B-346-d, los animales no mostraron
ningún síntoma clínico típico de una infección por VDVB tal como
un aumento de la temperatura del recto (Tabla 7a) o cualesquiera
síntomas clínicos respiratorios (no mostrados).
La viremia reducida de las células de la sangre
(Tabla 7b) y el derramamiento de los virus en bastoncillos para la
nariz (Tabla 7c) indicaban claramente una atenuación de
B-346-d en comparación con
B-WT.
El material aislado de VDVB virulento nº 13
inducía en los animales del grupo 3 una fuerte viremia con
síntomas típicos de una infección por VDVB, tal como un aumento de
la temperatura del recto a lo largo de un período de varios días
(Tabla 7d), fuerte leucopenia (Tabla 7e), una viremia de las
células de la sangre extendida (Tabla 7f) y un derramamiento de los
virus en el fluido de los bastoncillos para la nariz (Tabla 7g).
En contraposición, los animales del grupo 1, que habían sido
vacunados por infección con
B-346-d, no mostraron casi ningún
síntoma clínico típico para una infección por VDVB después de la
infección de enfrentamiento con el material aislado de VDVB
virulento nº 13. No existía ningún aumento significativo en las
temperaturas del recto después de la infección (Tabla 7d). La
leucopenia observada era muy marginal con respecto a la magnitud y
duración (Tabla 7e). No se pudo aislar VDVB a partir de la sangre
(Tabla 7f) y sólo para un animal se pudo detectar un derramamiento
de los virus en el material exudado del bastoncillo para la nariz
(Tabla 7g).
Por lo tanto, la infección con
B-346-d induce una fuerte inmunidad
que reduce claramente síntomas clínicos, derramamiento de los
virus y viremia de las células de la sangre después de la infección
por enfrentamiento con un material aislado de VDVB heterólogo.
| Día de | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| estudio | |||||||||||||||
| Grupo | |||||||||||||||
| 1 | 38,8 | 39,1 | 39,0 | 38,7 | 38,8 | 38,7 | 38,7 | 38,5 | 38,7 | 38,5 | 38,5 | 38,5 | 38,4 | 38,9 | 38,7 |
| Grupo | |||||||||||||||
| 2 | 38,8 | 39,0 | 38,9 | 38,6 | 38,6 | 38,7 | 38,6 | 38,4 | 39,1 | 38,4 | 38,7 | 38,6 | 38,7 | 38,6 | 38,6 |
Los animales del grupo 1 se infestaron el día 0
con 6 x 10^{6} TCID_{50} de
B-346-d, mientras que los animales
del grupo 2 se infestaron con 6x10^{6} TCID_{50} de
B-WT.
| Grupo | Animal | Primer día de | Ultimo día de | Duración registrada del | Duración media del |
| derramamiento | derramamiento | derramamiento | grupo (días) | ||
| nasal registrado | nasal registrado | nasal (días) | |||
| 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 1,4 |
| 2 | 4 | 6 | 2 | ||
| 3 | 5 | 5 | 1 | ||
| 4 | - | - | 0 | ||
| 5 | 6 | 9 | 3 | ||
| 2 | 6 | 4 | 8 | 5 | 4,4 |
| 7 | 4 | 7 | 4 | ||
| 8 | 4 | 7 | 4 | ||
| 9 | 4 | 7 | 4 | ||
| 10 | 4 | 8 | 5 |
Se tomaron muestras de sangre EDTA diariamente
hasta 10 días después de la infección con
B-346-d y B-WT,
respectivamente. Se añadieron 0,2 ml de sangre a cada uno de 3
cultivos de células de testículos de ternero (Cte) en medio que
contenía heparina (1 unidad/ml para evitar la formación de
coágulos). Después de una incubación durante una noche, el
inóculo/medio se reemplazó por medio de reciente aportación sin
heparina. Después de la incubación durante 4 a 6 días, las células
infestadas con VDVB se detectaron por inmunofluorescencia con un
suero policlonal específico para VDVB. Los cultivos negativos se
congelaron y subsiguientemente se descongelaron. 0,2 ml de los
mismos se hicieron pasar a un segundo paso sobre células Cte para
confirmar la ausencia de VDVB.
| Grupo | Animal | Primer día de | Ultimo día de | Número de días de | Número medio de días |
| derramamiento | derramamiento | virus detectado en | de virus detectado | ||
| nasal registrado | nasal registrado | el material exudado | por grupo | ||
| 1 | 1 | 4 | 8 | 4 | 2,6 |
| 2 | 6 | 6 | 1 | ||
| 3 | 4 | 4 | 1 | ||
| 4 | 5 | 7 | 3 | ||
| 5 | 3 | 6 | 4 | ||
| 2 | 6 | 6 | 8 | 3 | 3,6 |
| 7 | 5 | 7 | 3 | ||
| 8 | 5 | 8 | 4 | ||
| 9 | 5 | 6 | 2 | ||
| 10 | 3 | 9 | 6 |
El material exudado nasal se centrifugó (1000 g)
para separar los desechos toscos y los contaminantes. El fluido
sobrenadante se retiró y 0,2 ml se sembraron en cada uno de tres
cultivos de células. Después de incubación durante una noche, el
inóculo/medio se reemplazó por 2 ml de medio de reciente
aportación. Después de incubación durante 4-6 días,
las células infestadas con VDVB se detectaron por
inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para
VDVB.
| Día de | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 12 | 14 |
| estudio | |||||||||||||||
| Grupo | |||||||||||||||
| 1 | 38,4 | 38,6 | 38,5 | 38,5 | 38,6 | 38,4 | 38,4 | 38,3 | 38,4 | 38,4 | 38,4 | 38,4 | 38,4 | 38,4 | 38,5 |
| Grupo | |||||||||||||||
| 3 | 38,8 | 39,1 | 38,8 | 39,1 | 39,4 | 39,7 | 40,2 | 40,2 | 40,4 | 41,3 | 40,2 | 40,1 | 40,2 | 40,8 | 40,4 |
Las temperaturas del recto se registraron hasta
16 días después de la infección de enfrentamiento. Los animales de
los grupos 1 y 3 se infestaron mediante 6 x 10^{6} TCID_{50}
del material aislado de VDVB virulento nº 13.
\vskip1.000000\baselineskip
| Día de | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 12 | 14 |
| estudio | |||||||||||||||
| Grupo | |||||||||||||||
| 1 | 11,9 | 11,9 | 11,3 | 10,8 | 9,2 | 8,2 | 8,9 | 9,9 | 11,2 | 11,6 | 11,6 | 10,6 | 10,8 | 10,8 | 9,4 |
| Grupo | |||||||||||||||
| 3 | 11,7 | 15,8 | 13,8 | 11,1 | 7,7 | 9,8 | 7,4 | 6,8 | 7,5 | 8,7 | 7,0 | 8,1 | 6,2 | 6,4 | 6,2 |
Muestras de células de sangre EDTA se tomaron
diariamente desde los días -2 a 14 después del enfrentamiento de
cada animal en los dos grupos. Los recuentos de leucocitos en
muestras de sangre EDTA se determinaron utilizando un contador de
microcélulas Sysmex F800.
| Grupo | Animal | Primer día de virus | Ultimo día de virus | Duración registrada | Duración media |
| detectado en la | detectado en la | de virus en la | (días) | ||
| sangre | sangre | sangre (días) | |||
| 1 | 1 | - | - | 0 | 0 |
| 2 | - | - | 0 | ||
| 3 | - | - | 0 | ||
| 4 | - | - | 0 | ||
| 5 | - | - | 0 | ||
| 3 | 11 | 3 | 10 | 8 | 9,7 |
| 12 | 3 | 14 | 12 | ||
| 13 | 3 | 9 | 9 |
Se tomaron muestras de sangre EDTA diariamente
hasta 10 días después del enfrentamiento. 0,2 ml de sangre se
añadieron a cada uno de 3 cultivos de células de testículos de
ternero (Cte) con medio que contenía heparina (1 unidad/ml para
evitar la formación de coágulos). Después de incubación durante una
noche, el inóculo/medio se reemplazó por medio de reciente
aportación sin heparina. Después de la incubación durante 4 a 6
días, células infestadas con VDVB se detectaron por
inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para
VDVB.
Los cultivos negativos se congelaron y
subsiguientemente se descongelaron. 0,2 ml de los mismos se
hicieron pasar a un segundo paso sobre células Cte para confirmar la
ausencia de VDVB.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Animal | Primer día de | Ultimo día de | Duración registrada de | Duración media |
| derramamiento | derramamiento | derramamiento | (días, por grupo) | ||
| nasal registrado | nasal registrado | nasal (días) | |||
| 1 | 1 | 3 | 4 | 2 | 0,8 |
| 2 | - | - | 0 | ||
| 3 | - | - | 0 | ||
| 4 | - | - | 0 | ||
| 5 | 4 | 5 | 2 | ||
| 3 | 11 | 3 | 14 | 12 | 10 |
| 12 | 3 | 14 | 12 | ||
| 13 | 3 | 8 | 6 |
\vskip1.000000\baselineskip
El material exudado nasal se centrifugó (1000 g)
para separar los desechos toscos y los contaminantes. El fluido
sobrenadante se separó y 0,2 ml del mismo se sembraron en cada uno
de tres cultivos de células. Después de incubación durante una
noche, el inóculo/medio se reemplazó por 2 ml de medio de reciente
aportación. Después de la incubación durante 4-6
días, células infestadas con VDVB se detectaron mediante
inmunofluorescencia con suero policlonal específico para VDVB.
La secuencia de ARN que codifica el motivo de
RNasa conservado en la glicoproteína E^{RNS} de VFPC está muy
conservada. Entre todas las secuencias de VFPC conocidas, no se
encontraron intercambios de nucleótidos en la región
correspondiente a los residuos 1387 a 1416 de la secuencia
publicada de la cepa Alfort de VFPC (Meyers et al., 1987).
Así, los cebadores de oligonucleótidos derivados de esta región
conservada del genoma se pueden utilizar en un ensayo de
RT-PCR para la detección de todos los materiales
aislados de VFPC (véase la figura 7). En consecuencia, se pudo
detectar la ausencia del triplete que codifica la histidina 346
(nucleótidos 1399-1401) mediante un ensayo de
RT-PCR con un cebador apropiadamente diseñado. Se
sintetizaron diferentes oligonucleótidos que cubrían la región
conservada que contenían el codón histidina o no lo contenían.
Estos oligonucleótidos servían como cebadores dispuestos más arriba
en reacciones de RT-PCR con el oligonucleótido
E^{RNS}-Stop como cebador situado más abajo. El
ARN purificado a partir de células del cultivo tisular infestadas
con C-346-d, C-WT,
C-346-L o
C-346-K, respectivamente, se
utilizaron como moldes. La transcripción inversa de 2 \mug de
ARN desnaturalizado por calor (2 min 92ºC, 5 min en hielo en 11,5
\mul de agua en presencia de 30 pmol de cebador inverso) se
efectuó después de la adición de 8 \mul de mezcla de RT (Tris/HCl
125 mM pH 8,3, KCl 182,5 mM, MgCl_{2} 7,5 mM, ditiotreitol 25 mM,
1,25 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U de RNAguard
(Pharmacia, Freiburg, Alemania) y 50 U de
Super-script (Life Technologies/BRL, Eggenstein,
Alemania) durante 45 min a 37ºC. Después de finalizar la
transcripción inversa, los tubos se colocaron sobre hielo y se
añadieron 30 \mul de mezcla de PCR (Tris/HCl 8,3 mM pH 8,3; KCl
33,3 mM, MgCl_{2} 2,2 mM; 0,42 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP,
dGTP; 0,17% de TritonX100; 0,03% de albúmina de suero bovino; 5 U
de Taq polimerasa (Appligene, Heidelberg, Alemania) y 16,7% de
DMSO). Cuando se utilizó el cebador OI H+3, la mezcla de reacción
para la amplificación no contenía DMSO. La amplificación se llevó
a cabo en 36 ciclos (30 s 94ºC; 30 s 57ºC; 45 s 74ºC). 1 \mul de
la reacción de amplificación se cargó sobre un gel de agarosa al
1%, los productos amplificados se separaron por electroforesis y se
tiñeron con bromuro de etidio. Tal como se demuestra en la figura
7, el par de cebadores OI H-3/OI E^{ms}Stop
permitía amplificar específicamente una banda derivada de ARN que
contenía la deleción del codón 346, mientras que los otros dos
productos de combinaciones de cebadores que contenían el codón 346
se amplificaron y no se observó ninguna banda cuando el ARN con la
deleción de este codón se utilizó como molde.
Situados más arriba:
- OI H-3:
- TGGAACAAAGGATGGTGT
- OI H+2:
- TGGAACAAACATGGATGG
- OI H+3:
- GAATGGAACAAACATGGA
Situados más abajo:
- OI E^{ms}Stop:
- GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
El listado de la secuencia muestra los primeros
495 aminoácidos, según son expresados por la cepa Alfort de VFPC
(Meyers et al., 1989). Un monómero de la glicoproteína
E^{RNS} de dicha cepa corresponde a los aminoácidos 268 a 494,
según se describe por Rümenapf et al. (1993). Los residuos
295 a 307 y 338 a 357 que representan las regiones que muestran
homología con RNasas de plantas y hongos (Schneider et al.,
1993) están subrayados.
Figura
2
La temperatura del recto se registró diariamente
a partir del día 2 antes hasta el día 18 después de la infección.
La curva de la temperatura del recto está detallada para cada
animal del grupo infestado con el virus V(pA/VFPC) (línea
continua) derivado a partir del plásmido pA/VFPC o con el virus
V(pA/C-346-d) derivado a
partir del plásmido pA/C-346-d
(línea discontinua).
Figura
3
La temperatura del recto se registró diariamente
los días 1-21 después de la infección con virus de
enfrentamiento. Los animales a los que se había enfrentado con una
dosis letal de cepa de enfrentamiento Eystrup de VFPC habían sido
infestados con el mutante
C-346-d[V(pA/C-346-d)]
69 días antes, según se detalla en el texto. La curva de la
temperatura del recto se detalla para cada animal del grupo
enfrentado con 2 x 10^{5} TCID_{50} procedentes de la cepa de
enfrentamiento Eystrup de VFPC.
Figura
4
La temperatura del recto se registró diariamente
los días 0-18 después de la infección. La curva de
la temperatura del recto se detalla para cada animal de los dos
grupos infestados con
C-346-d[V(pA/C-346-d)]
(línea discontinua) o con el virus reestablecido
C-346-d/RS[V(pA/C-346-d/RS)]
(línea continua).
Figura
5
La temperatura del recto se registró diariamente
los días 1-10 después de la infección con virus de
enfrentamiento. Los animales enfrentados con una dosis letal (2 x
10^{5} TCID_{50}) de la cepa de enfrentamiento Eystrup de VFPC
habían sido infestados con el mutante
C-346-d 37 días antes.
\newpage
Figura
6
La temperatura del recto se registró diariamente
antes y después de la infección con virus de enfrentamiento con el
mutante
V(pA/C-297-L/346-L).
Figura
7
- a)
- El par de cebadores OI H-3/OI E^{MS}Stop permite amplificar específicamente una banda derivada de ARN que contiene la deleción del codón 346 (C-346-d) según se describe en detalle en el Ejemplo 8. En contraposición, el ARN que no contiene dicha deleción no interactúa con dicho par de cebadores (C-WT, C-346-L, C-346-K).
- b)
- y c) Las otras dos combinaciones de cebadores (OI H+2 y OI H+3) amplifican bandas derivadas de ARN que no contiene la deleción del codón 346 (OI H+2 y OI H+3). No se pudo observar ninguna banda cuando como molde se utiliza ARN procedente del mutante de deleción de 346 C-346-d.
<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica
GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Pestivirus atenuados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1-1039 B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 02003408.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-02-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 02003408.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-02-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggagcttac ttgggatctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaacaaact tggatggtgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaggagctt aaaagggatc tggc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaacaaa aagggatggt gtaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatggaaca aaggatggtg taac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgaatgga acaaaggttg gtgcaactgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 492
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 12
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<211> 495
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 495
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<400> 13
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<211> 495
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 495
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<400> 15
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<211> 494
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 16
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 495
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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Artificial: mutante de VFPC
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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<212> PRT
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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Artificial: mutante de VFPC
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Artificial: mutante de VFPC
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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Artificial: mutante de VDVB
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: mutante de VFPC
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Claims (4)
1. Un método para marcar de forma detectable
pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad
de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}, en donde dicha
actividad de RNasa se inactiva por deleciones y/o mutaciones de al
menos un aminoácido de dicha glicoproteína, con la condición de que
los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346, según se describe en
la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o
correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína
no sean lisina, y en donde la inactivación de dicha actividad de
RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} resulta en un
pestivirus atenuado.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dichas deleciones y/o mutaciones están situadas en los aminoácidos
en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según
se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una
manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicacionesd 1 a 2, en el que dicha actividad de RNasa se
inactiva por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346,
según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una
manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha actividad de RNasa se
inactiva por la deleción del residuo histidina en la posición 346,
según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una
manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de
dicha glicoproteína.
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