MXPA00011971A

MXPA00011971A - Pestivirus atenuados

Info

Publication number: MXPA00011971A
Application number: MXPA/A/2000/011971A
Authority: MX
Inventors: Meyers Gregor
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2002-06-05

Abstract

La presente invención se refiere a pestivirus atenuado caracterizado porque se inactiva su actividad enzimática que reside en la glicoproteína ERNS, con métodos para la preparación uso y detección de la misma.

Description

PESTIVIRUS ATENUADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para atenuar pestivirus al inactivar la actividad de ribonucleasa (reactividad de ARNasa) gue reside en la glicoproteína Ews . La invención también se relaciona con pestivirus atenuados de acuerdo con la invención, ácidos nucleicos para preparar tales pestivirus, vacunas y composiciones farmacéuticas gue comprenden a los pestivirus atenuados de la invención. La invención se relaciona además con métodos para distinguir entre virus atenuados de la invención y virus patogénicos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los pestivirus son agentes causales de enfermedades económicamente importantes de animales en muchos países en todo el mundo. Actualmente los aislados de virus conocidos se han agrupado en tres especies diferentes las cuales juntas forman un género dentro de la familia Flaviviridae. I El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) provoca diarrea viral bovina (BVD) y enfermedad en las mucosas (MD) en ganado (Baker, 1987; Moenig and Plagemann, 1992; Thiel et al. , 1996) .

Ref: 125320 II El virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) , anteriormente denominado virus de cólera hog, es responsable de la fiebre porcina clásica (CSF) o cólera hog (HC) (Moenig and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). III El virus de la enfermedad del límite (BDV) típicamente se encuentra en borregos y provoca la enfermedad del límite (BD) . También se han descrito la presentación de síntomas similares a MD en ganado después de infección intrauterina de borregos con BDV (Moennig and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). Una clasificación alternativa de pestivirus se proporciona por Becher et al. (1995) u otros. Los pestivirus son virus envueltos pegúenos con un genoma de ARN de cadena única de polaridad positiva gue carecen de las secuencias de remate 5' y 3' poli (A) . El génoma viral codifica para una poliproteína de aproximadamente 4000 aminoácidos lo gue da lugar a productos de separación final por procesamiento cotraduccional y postraduccional gue involucran proteasas celulares y virales. Las proteínas virales están dispuestas en la poliproteína en el orden NH2-Npro-C-ERNS-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-C00H (Rice, 1996) . La proteína C y las glicoproteínas ERNS, El y E2 representan componentes estructurales del virión de pestivirus (Thiel et al., 1991). Se ha encontrado gue E2 y en menor grado ERNS son objetivos de la neutralización de anticuerpos (Donis et al., 1988; Patón et al., 1992; van Rijn et al., 1993; eiland et al., 1990, 1992) . E*1"3 carece de un anclaje de membrana y es secretado en cantidades considerables a partir de células infectadas; se ha reportado ue esta proteína muestra actividad de ARNasa (Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; indisch et al., 1996). La función de esta actividad enzimática por el ciclo de vida viral actualmente se desconoce. En el caso de una cepa de vacuna CSFV, la destrucción experimental de la ARNasa por mutagénesis dirigida al sitio ha sido reportada gue resulta en un virus citopatogénico gue tiene características del crecimiento en cultivo celular eguivalentes a la del virus de tipo silvestre (Hulst et al., 1998). La actividad enzimática depende de la presencia de dos cadenas de aminoácidos conservadas entre el pestivirus ERNS y diferentes ARNasas conocidas de origen vegetal y micótico. Las dos secuencias conservadas contienen un residuo histidina (Schneider et al., 1993) . El cambio de estos residuos contra lisina en la proteína ERNS e ur?a cep de vacuna CSFV resulta en la destrucción de la actividad de ARNasa (Hulst et al., 1998) . La introducción de estas mutaciones en el genoma de la cepa de vacuna CSFV no influye en la viabilidad viral o en las propiedades de crecimiento sino gue lleva a un virus gue muestra un fenotipo ligeramente citopatogénico (Hulst et al., 1998). Las vacunas constituidas de virus atenuado o muerto o bien proteínas virales expresadas en sistemas de expresión heterólogos se han generado para CSFV y BVDV y actualmente son las gue se utilizan. La base estructural de la atenuación de estos virus utilizados como vacunas vivas no se conoce. Esto lleva al riesgo de reversiones impredecibles por retroestimulación o recombinación subsecuente a la vacunación. Por otra parte, la eficacia de las vacunas inactivadas o las proteínas virales expresadas de manera heteróloga (subunidades de vacuna) en la inducción de inmunidad es más bien baja. En general, las vacunas vivas con mutaciones definidas como una base para atenuación deben permitir evitar las desventajas de la presente generación de vacunas. Actualmente no están disponibles objetivos potenciales para atenuar mutaciones en pestivirus . Una ventaja adicional de tales mutaciones atenuantes se basa en la condición única molecular lo gue permite utilizarlas como etiguetas distintivas para un pestivirus atenuado y para distinguirlos de pestivirus del campo. Debido a la importancia de una profilaxis y tratamiento de infecciones pestivirales efectiva y segura así como detectable, existe una fuerte necesidad por vacunas vivas y específicamente atenuadas con un alto potencial para inducción inmunidad así como una base definida de atenuación la cual también pueda ser diferenciada de pestivirus patógenos. Por lo tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar pestivirus específicamente atenuados y etiguetados detectablemente para uso en vacunas atenuadas vivas con una alta eficiencia por la inducción de inmunidad la. cual, como resultado de este método, se pueda también diferenciar de pestivirus patógenos del campo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La solución al problema técnico anterior se obtiene por la descripción y las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones . Sorprendentemente se ha encontrado gue los pestivirus pueden ser atenuados específicamente por la inactivación de la actividad de ARNasa gue reside en la glicoproteína ERNS. Los pestivirus atenuados ahora proporcionan vacunas vivas de alta inmunogenicidad. Por lo tanto, en un aspecto la presente invención proporciona una vacuna viva gue comprende un pestivirus, en donde se ha inactivado la actividad de ARNasa gue reside en la glicoproteína ERNS. El término "vacuna", como se utiliza en la presente, se refiere a una composición farmacéutica gue comprende por lo menos un componente inmunológicamente activo gue induce una respuesta inmunológica en un animal y posiblemente, aungue no de manera necesaria, uno o más componentes adicionales gue mejoran la actividad inmunológica del componente activo. Una vacuna adicionalmente puede comprender componentes adicionales típicos para composiciones farmacéuticas. El componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender organismos vivos completos ya sea en su forma original o como organismos atenuados en lo gue se denomina vacuna viva modificada (MLV) u organismos inactivados por métodos apropiados en lo gue se denomina vacuna muerta (KV) . En otra forma, el componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender elementos apropiados de tales organismos (vacunas de subunidad) por lo gue estos elementos se generan ya sea al destruir el organismo completo o los cultivos en crecimiento de tales organismos y etapas de purificación subsecuente lo gue proporciona la estructura o estructuras deseadas, o bien por procesos sintéticos inducidos por una manipulación apropiada de un sistema adecuado como, pero sin restringirse a bacterias, insectos, mamíferos u otras especies más los procedimientos subsecuentes de aislamiento y purificación o por inducción de los procesos sintéticos en el animal gue necesita una vacuna por incorporación directa del material genético utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas (vacunación polinucleotídica) . Una vacuna puede comprender uno o simultáneamente más de uno de los elementos descritos antes. Los componentes adicionales para mejorar la respuesta inmune son cons ituyentes denominados comúnmente como adyuvantes, como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, aceite mineral u otros aceites o moléculas auxiliares agregadas a la vacuna o generadas por el cuerpo después de la inducción respectiva de tales componentes adicionales similares, pero sin restringirse a interferones, interleucinas o factores de crecimiento . Una "composición farmacéutica" consiste esencialmente de uno o más ingredientes capaces de modificar las funciones fisiológicas, por ejemplo la inmunológica del organismo al gue se le administra o, de organismos vivos en o sobre su superficie como por ejemplo, pero sin restringirse a antibióticos o antiparasitarios, así como otros constituyentes agregados al mismo con el fin de obtener ciertos objetivos adicionales, como, pero sin limitarse a rasgos de procesamiento, esterilidad, estabilidad, factibilidad para administrar la composición por vía enteral o parenteral tal como por vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea intradérmica u otra vía adecuada, tolerancia después de la administración y propiedades de liberación controlada. Una vacuna de la invención se refiere a una vacuna como se define en lo anterior, en donde un componente inmunológicamente activo es un pestivirus o es de origen pestiviral .

El término "vacuna viva" se refiere a una vacuna gue comprende un componente vivo, en particular un componente activo viral vivo. El término "pestivirus" como se utiliza en la presente, se refiere a todos los pestivirus, caracterizados por pertenecer al mismo género gue "BVDV, CSFV y BDV dentro de la familia Flaviviridae y su expresión de glicoproteína ERNS. Por supuesto, tal término también se refiere a todos los pestivirus como son caracterizados por Becher et al. (1995) u otros gue expresan glicoproteína E1^ . El término "actividad de ARNasa" como se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad de la glicoproteína ERNS para hidrolizar ARN. Se debe hacer notar gue el término glicoproteína EO con frecuencia se utiliza de manera sinónima a glicoproteína ERNS en -j_as publicaciones. El término "inactivación de la actividad de ARNasa gue reside en las glicoproteínas" se refiere a la incapacidad o capacidad reducida de una glicoproteína modificada ERNS para hidrolizar ARN en comparación con el tipo silvestre no modificado de la glicoproteína ERNS. La inactivación de la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS se puede obtener por supresiones o mutaciones, o ambas cosas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína como se demuestra en la presente y por Hulst et al. (1988). Por lo tanto, en una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con vacunas vivas, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína. Se ha demostrado gue la glicoproteína ERNS forma un homodímero unido por disulfuro de aproximadamente 97 kD, en donde cada monómero consiste de 227 aminoácidos gue corresponden a los aminoácidos 268 a 494 de la poliproteína de CSFV como se describe por Rümenapf et al. (1993) . Los primeros 495 aminoácidos como se expresan para la cepa Alfort de CSFV se muestran en la figura 1 únicamente con el propósito de referencia. La secuencia de genoma de la cepa Alfort de CSFV está disponible en la biblioteca de datos GenBank/EMBL bajo el número de acceso J04358; alternativamente, se puede tener acceso a la secuencia de aminoácidos para la BVDV cepa CP7 en la biblioteca de datos GenBank/EMBL (número de acceso U63479) . Dos regiones de aminoácidos están altamente conservadas en la glicoproteína ERNS así como en algunas proteínas activas de ARNasa vegetales y micóticas (Schneider et al., 1993). Estas dos regiones son de importancia particular para la actividad enzimática de ARNasa. La primera región consiste de la región en los aminoácidos en la posición 295 a 307 y la segunda región consiste de los aminoácidos en la posición 338 a 357 de la poliproteína viral como se ejemplifica por la figura 1 de la cepa Alfort de CSFV (numeración de acuerdo con la secuencia deducida publicada de aminoácidos de CSFV cepa Alfort (Meyers et al., 1989) . Los aminoácidos de importancia particular para la actividad de ARNasa como se mencionan antes de ninguna manera se limitan a la posición exacta como se define para la cepa Alfort de CSFV sino gue simplemente se utilizan de una manera ejemplar para resaltar los aminoácidos preferidos gue están en una posición o gue corresponden a esa posición, u otras cepas tales como se encuentran en BVDV, BDV y pestivirus en general puesto gue están altamente conservadas. Para pestivirus diferentes a CSFV cepa Alfort, la numeración de las posiciones de los aminoácidos preferidos con frecuencia es diferente pero un experto en el campo de la biología molecular de pestivirus identificará fácilmente estos aminoácidos preferidos por su posición en relación a los aminoácidos altamente conservados de tal glicoproteína. En un ejemplo no limitante particular, la posición de CSFV Alfort 346 es idéntica a la posición 349 de BVDV cepa cp7. Como una consecuencia, la presente invención se relaciona en una modalidad más específica con una vacuna de la invención, en donde las supresiones inactivantes o mutaciones, o ambas se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína. La presente invención demuestra gue pestivirus están disponibles y codifican para una proteína de ERNS sin actividad de ARNasa cuando el residuo histidina en la posición 346 de la poliproteína viral (numerada de acuerdo con la secuencia publicada de CSFV Alfort/Tübingen (Meyers et al., 1989)), la cual representa uno de los residuos de sitio activo putativo conservado de la ARNasa de E*1*3 se suprime . También se ha demostrado para esta invención que la supresión de la histidina respectiva en E™ de un pestivirus BVD (posición 349, numerado de acuerdo con la secuencia de BVDV CP7 con la biblioteca de datos GenBank/EMBL (número de acceso U63479) ) resulta en un virus viable en el cual la glicoproteína ERNS ha perdido la actividad de ARNasa. En contraste con las mutaciones puntuales gue cambian de un aminoácido a otro, un mutante por supresión generalmente es mucho más estable con respecto a las reversiones. La infección de cerdos con un mutante de CSFV patogénico de Alfort/Tübingen gue expresa ERNS con esta supresión no lleva a la fiebre u otros signos clínicos típicos de infecciones por CSFV mientras gue la infección con el virus de tipo silvestre resulta en fiebre, diarrea, anorexia, apatía, supresión de células B y trastornos del sistema nervioso central . Estos cerdos son inactivados en un estado moribundo gue muestra hemorragias graves en la piel y órganos internos 14 días después la inoculación. Los cerdos infectados con el mutante no muestran viremia ni supresión de células B cuando se prueban en los días 3, 5, 7, 10, 14 posterior a la infección mientras gue CSFV se aisla fácilmente de muestras de sangre derivadas de cerdos inoculados con el virus de tipo silvestre. El mutante por supresión aparentemente se replica en los animales como se indica por la inducción de anticuerpos neutralizantes (véase Ejemplo 3, Tabla 3c) . La respuesta inmune de los virus mutantes es suficiente para permitir sobrevivir a una exposición letal con 2 x 105 TCID50 de una infección altamente patogénica con CSFV cepa Eystrup (Kónig, 1994) la cual es heteróloga a la cepa Alfort. Además, estos animales no muestran signos clínicos de infección por CSFV como fiebre, diarrea, hemorragias, supresión de células B o anorexia después de la infección de exposición. Estos datos demuestran gue la infección de cerdos con el mutante por supresión induce una respuesta inmune suficiente para protección contra una exposición astringente. Por lo tanto, en una modalidad más preferida, la invención se relaciona con vacunas de acuerdo con la invención, en donde se inactiva la actividad de ARNasa por la supresión del residuo histidinc. en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. En una modalidad más preferida, la invención se relaciona con vacunas para BVDV, de acuerdo con la invención, en donde se inactiva la actividad de ARNasa por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas BVDV, de tal glicoproteína. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con pestivirus atenuados, en donde se inactiva la actividad de ARNasa gue reside en la glicoproteína ERNS por supresiones o mutaciones, o ambas cosas, de por lo menos un aminoácido de la glicoproteína con la condición de gue los aminoácidos en la posición 297 o 346, o ambas de tal glicoproteína como se describe en la figura 1 de CSFV no sean lisina. Un pestivirus recombinante, en el gue los aminoácidos en la posición 297 o 346, o ambas de tal glicoproteína son lisina, ha sido descrito por Hulst et al. en 1998. Este pestivirus particular demostró efectos citopáticos en células de riñon porcinas. Hasta ahora, no ha habido un desconocimiento total de la característica de atenuación sorprendente e innovadora debido a la inactivación de la actividad enzimática de E*1*8. En una modalidad preferida, por las razones establecidas antes para vacunas, la presente invención también se relaciona con pestivirus de acuerdo con la invención, en donde la actividad de ARNasa se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, localizadas en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína . En una modalidad preferida adicional por las razones establecidas antes para vacunas, la presente invención también se relaciona con pestivirus de la invención, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. En una modalidad más preferida por las razones establecidas antes para vacunas, la presente invención también se relaciona con pestivirus, en donde la actividad de ARNasa se inactiva por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. En una modalidad más preferida adicional, la presente invención se relaciona con pestivirus BVDV, en donde la actividad de ARNasa se inactiva por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas BVDV de tal glicoproteína. El pestivirus atenuado y los componentes activos de las vacunas de la presente invención se pueden preparar fácilmente por técnicas recombinantes modificadoras de ácido nucleico gue resultan en la expresión de una secuencia mutante de aminoácidos en glicoproteína E™s . Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con ácidos nucleicos gue codifican para una glicoproteína E*13, en donde la actividad de ARNasa gue reside en la glicoproteína se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de la glicoproteína con la condición de que los aminoácidos en la posición 297 ó 346 de la glicoproteína, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort, no sean lisina. En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona, por razones como se mencionan antes, con ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, en donde la actividad de ARJSTasa es inactivada por supresiones o mutaciones, o ambas cosas, gue se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. En una modalidad más preferida, la presente invención se relaciona, por las razones mencionadas para vacunas, con ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

En una modalidad más preferida, la presente invención se relaciona con ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346 como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o gue corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. En una modalidad más preferida adicional, la presente invención se relaciona con ácidos nucleicos BVDV de acuerdo con la invención, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas BVDV, de tal glicoproteína. Los nucleótidos, por ejemplo ADN o ARN también son útiles para preparar vacunas de ADN, ARN y/o vector. En estas vacunas, los nucleótidos se aplican directamente al animal o indirectamente vía los vectores diferentes al virus original . Las vacunas nucleotídicas o vacunas de vector son bien conocidas en el estado actual de la técnica y no se mencionarán más. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de ácidos nucleicos de la presente invención para preparar vacunas nucleotídicas o de vectores, o ambas .

Las vacunas, pestivirus atenuados y/o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención son particularmente útiles para la preparación de una composición farmacéutica. En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas gue comprenden una vacuna de acuerdo con la invención o un pestivirus de acuerdo con la invención, o una secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención. Un ejemplo no limitante de tal composición farmacéutica, suministrado únicamente para propósitos de demostración, se puede preparar como sigue: el sobrenadante de cultivo celular de un cultivo de células infectadas se mezcla con un estabilizante (por ejemplo espermidina y/o BSA (albúmina sérica bovina)) y la mezcla se liofiliza subsecuentemente o se deshidrata por otros métodos. Antes de la vacunación, la mezcla después se rehidrata en soluciones acuosas (por ejemplo solución salina PBS (solución salina amortiguada con fosfato) ) o soluciones no acuosas (por ejemplo una emulsión oleosa, adyuvante basado en aluminio) . Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método de atenuación para pestivirus . La invención proporciona un método único e inesperado para atenuar pestivirus, caracterizado porgue se inactiva la actividad de ARNasa gue reside en la glicoproteína ERNS.

El pestivirus atenuado específicamente es especialmente útil para la preparación de vacunas. Por lo tanto, en un aspecto adicional extra, la presente invención se relaciona con métodos para producir una vacuna de pestivirus atenuada específicamente caracterizada porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína Ews . La inactivación de la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ?RNS proporciona un método sorprendente y nuevo para etiquetar detectablemente pestivirus . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para etiquetar detectablemente pestivirus caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ENS. La característica de ausencia de actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS de pestivirus de la invención ahora permite el etiquetado detectable de estos pestivirus. Los pestivirus etiquetados y no etiquetados de E1^ secretados de células infectadas por pestivirus en fluidos corporales se puede diferenciar claramente por la ausencia o presencia de actividad de ARNasa de las glicoproteínas ERNS ante aislamiento y ensayo de tal actividad enzimática. Para los pestivirus inactivados en su actividad de ARNasa que reside en glicoproteína ERNS por supresión o mutación, o ambas, se pueden utilizar muchas otras técnicas. Tales pestivirus pueden detectarse fácilmente debido a las consecuencias estructurales que resultan de tales supresiones o mutaciones o ambas. Por ejemplo, la diferencia de secuencia de la secuencia de ácido nucleico o la glicoproteína ERNS alterada es detectable por técnicas de secuenciado de ácido nucleico o técnicas de PCR (reacción en cadena de polimerasa) como se demuestra en el ejemplo 8; la secuencia alterada de proteína se puede detectar por anticuerpos monoclonales específicos gue no reconocen proteínas no alteradas. De manera inversa, también es posible detectar las proteínas alteradas y por lo tanto etiguetadas estructuralmente por ausencia de unión a anticuerpos monoclonales específicos gue reconocen glicoproteínas E™s no alteradas con la condición de gue se pueda establecer de otra manera la presencia de pestivirus. Por supuesto, las supresiones o mutaciones gue suprimen la actividad de ARNasa en el virus marcado resultarán en respuestas inmunes diferentes en animales cuando se comparan con las respuestas gue resultan infecciones por pestivirus no marcados . Una modalidad preferida para todos los aspectos gue hacen referencia a métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus atenuada específicamente y métodos para etiquetar detectablemente pestivirus de acuerdo con la invención son aquéllos métodos que se relacionan con la inactivación de la glicoproteína ERNS, en donde tal actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína.

Una modalidad preferida adicional para todos los aspectos que hacen referencia a los métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus atenuada específicamente y métodos para detectar pestivirus etiquetado de acuerdo con la invención, son aquéllos métodos en relación a la inactivación de la glicoproteína en ERNS en donde las supresiones o mutaciones, o ambas, se localizan en los aminoácidos 295 a 307 o en la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. Una modalidad muy preferida para todos los aspectos con referencia a los métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus atenuada específicamente y métodos para etiquetar detectablemente pestivirus de acuerdo con la invención, son aquéllos métodos en relación a la inactivación de la glicoproteína ERNS, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína. Una modalidad más preferida para todos los aspectos con referencia a los métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir vacuna de pestivirus atenuada específicamente y métodos para marcar detectablemente pestivirus de acuerdo con la invención son aquéllos métodos en relación a la inactivación de glicoproteína E*1"3, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1, para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. La presente invención proporciona vacunas y otras composiciones farmacéuticas las cuales son particularmente útiles para la profilaxis y tratamiento de infecciones de pestivirus en animales. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con métodos para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales, caracterizada porque se aplica una vacuna de acuerdo con la invención, u otra composición farmacéutica de acuerdo con la invención, a un animal en necesidad de tal profilaxis o tratamiento. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de un pestivirus atenuado específicamente, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína E^A En un aspecto, la presente invención proporciona un p ro c e s o pa ra l a p repa ra c i ón de p e s t ivi ru s ma rc ado específicamente, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS .

Una modalidad preferida para todos los aspectos con referencia a un proceso para la preparación de pestivirus atenuado específicamente, un proceso para la preparación de pestivirus marcado específicamente de acuerdo con la invención son aquéllos procesos en relación a la inactivación de la glicoproteína ERNS, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones, o ambas cosas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína. Una modalidad más preferida para todos los aspectos con referencia a un proceso para la preparación de pestivirus atenuado específicamente, un proceso para la preparación de pestivirus marcado específicamente de acuerdo con la invención son aquéllos procesos en relación a la inactivación de la glicoproteína E™3, en donde las supresiones o mutaciones, o ambas cosas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort, de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. Una modalidad muy preferida para todos los aspectos con referencia a un proceso para la preparación de pestivirus atenuado específicamente, un proceso para la preparación de pestivirus marcado específicamente de acuerdo con la invención son aquéllos procesos en relación a la inactivación de la glicoproteína ERNS, en donde se inactiva la actividad de ARNasa por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. Una modalidad más preferida para todos los aspectos con referencia a un proceso para la preparación de pestivirus atenuado específicamente, un proceso para la preparación de pestivirus marcado específicamente de acuerdo con la invención son aquéllos procesos en relación a la inactivación de la glicoproteína E1*13, en donde se inactiva la actividad de ARNasa por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para CSFV cepa Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína. Las vacunas u otras composiciones farmacéuticas de la presente invención son útiles para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales. Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se relaciona con el uso de una vacuna de acuerdo con la invención para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales . Los pestivirus o ácidos nucleicos, o ambos, de acuerdo con la invención, son componentes activos útiles de una composición farmacéutica o una vacuna. Por lo tanto, la presente invención se relaciona en un aspecto adicional con el uso de un pestivirus de la invención o un ácido nucleico de la invención, o ambos, para la preparación de una vacuna o una composición farmacéutica. Como se mencionó antes, la inactivación de la actividad de ARNaea que reside en la glicoproteína ERNS proporciona un método nuevo y sorprendente para marcar pestivirus . Como una consecuencia, un aspecto de la presente invención se relaciona con métodos para distinguir los pestivirus marcados detectablemente de acuerdo con la invención de los no marcados y posiblemente de pestivirus patógenos. Tales métodos son especialmente útiles para trazar la eficacia de los pestivirus mercados en animales. Un animal tratado con la vacuna proporcionará una etiqueta positiva después de obtener una muestra de tal animal y realizar un ensayo para determinar la presencia de tal etiqueta. Los animales no marcados y especialmente animales no marcados que demuestren ser positivos para pestivirus se pueden separar de inmediato, se pueden aislar o sacrificar para eliminar el daño eminente de dispersar la infección patógena a otros animales. La presente invención proporciona un método para marcar detectablemente pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína E^A Esta característica de ausencia de actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína E™3 de pestivirus de la invención ahora permite marcar detectablemente estos pestivirus . Como un resultado, se pueden diferenciar claramente los pestivirus marcados de los no marcados por ausencia o presencia de actividad de ARNasa de la glicoproteína ERNS mediante aislamiento y realización de un ensayo tal como el de actividad enzimática. La determinación de presencia o ausencia de esta actividad enzimática al obtener una muestra que contiene un pestivirus de interés o un material del mismo, se puede realizar de acuerdo con métodos estándar, tales como por ejemplo los descritos en el Ejemplo 2 o Hulst et al. (1994) . Por lo tanto, en una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con un método para distinguir animales infectados con pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado específicamente de acuerdo con la invención que comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Determinar la ausencia o presencia de actividad de ARNasa de una glicoproteína ERNS dentro de tal muestra; (3) Correlacionar la ausencia de actividad de ARNasa de la glicoproteína ERNS con un animal vacunado y correlaciona la presencia de tal actividad con una infección por pestivirus de tal animal.

La presente invención proporciona pestivirus inactivado en su actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína E™3 por supresión o mutación, o ambas. Tales pestivirus se detectan fácilmente debido a las consecuencias estructurales que resultan de tales supresiones o mutaciones, o ambas. La diferencia en la secuencia del gen ERNS que codifica para la glicoproteína E™ alterada es detectable por técnicas de secuenciado o técnicas de PCR. Como un resultado, la presente invención proporciona en una modalidad preferida un método para diferenciar animales infectados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado específicamente de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas : (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de presentar infeccioso por pestivirus o un animal vacunado ; (2) Identificar la secuencia nucleotídica de un genoma de pestivirus o proteína dentro de tal muestra; (3) Correlacionar las supresiones o mutaciones, o ambos, de la secuencia de nucleótidos para ER S como está presente en la vacuna con un animal vacunado y correlacionar la ausencia de tales supresiones o mutaciones, o ambas, con una infección por pestivirus de tal animal . Además, los cambios estructurales que resultan de la secuencia de proteína alterada de glicoproteína ERNS de pestivirus de la invención se puede detectar por anticuerpos específicos monoclonales o policlonales, que no reconocen proteínas no alteradas . Por lo tanto, en una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con un método para distinguir animales infectados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Identificar una glicoproteína ERNS modificada de un pestivirus atenuado por la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a la glicoproteína ERNS presente en la muestra, las glicoproteínas están modificadas por un método de acuerdo con la invención, por lo que los anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteínas ERNS no modificada; (3) Correlacionar la unión específica de los anticuerpos monoclonales o policlonales con un animal vacunado y correlacionar la ausencia de anticuerpo que se une por infección por pestivirus, de un animal bajo la condición de que la presencia de material pestiviral en el animal o en la muestra, o en ambas, se establece de otra manera. Y a la inversa, también es posible detectar las proteínas alteradas y por lo tanto etiquetadas estructuralmente por la ausencia de unión a anticuerpos específicos monoclonales o policlonales que reconocen únicamente glicoproteínas ERNS no alteradas, sin la presencia de pestivirus se puede establecer de otra manera. En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con un método para distinguir animales infectados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado,- (2) Identificar una glicoproteína ERNS no modificada de un pestivirus por la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas E™3 presentes en la muestra, las glicoproteínas no son modificadas por un método de acuerdo con la invención, por lo que los anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteína E™3 modificadas; (3) Correlacionar la unión específica de los anticuerpos monoclonales o policlonales con una infección por pestivirus en el animal y correlacionar la ausencia de unión de anticuerpo a un animal vacunado bajo la condición de que la presencia del material pestiviral en el animal o la muestra, o en ambas, se establezca de otra manera. Por supuesto, la modificación estructural y ausencia de actividad de ARNasa en el virus marcado de la invención resultará en respuestas inmunes diferentes en animales cuando se compara con las respuestas que resultan de infecciones por pestivirus no marcados. Los pestivirus de la infección inducen una respuesta inmune diferente y distinta, celular así como humoral, que difiere de las respuestas inmunes no modificadas y posiblemente patogénicas. Por ejemplo, las glicoproteínas E1^ de acuerdo con la invención resultará en anticuerpos policlonales que son diferentes en su especificidad de unión cuando se comparan con anticuerpos policlonales, que resultan de glicoproteínas no modificadas. Esta diferencia en la especificidad de unión proporciona una etiqueta para diferenciar animales vacunados con pestivirus de la invención, de animales infectados en el campo por pestivirus. Las pruebas para analizar sueros para anticuerpos policlonales específicos que se unen a un epitopo de tipo silvestre o una mutación por supresión de marcador de ése epitopo con el propósito de diferenciar animales infectados y vacunados se ha descrito, por ejemplo, para cerdos infectados por seudorrabia y vacunados (Kit et al. , 1991) . En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con un método para distinguir animales infectados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de anticuerpos policlonales de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Identificar cualquier unión específica de los anticuerpos policlonales a glicoproteína Ems no modificada o glicoproteína Ems modificada de acuerdo con la invención. (3) Correlacionar la unión de anticuerpos policlonales con glicoproteína ERNS no modificada con una infección por pestivirus y correlacionar la unión de los anticuerpos policlonales a glicoproteína ERNS modificada de acuerdo con la invención con una vacuna.

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El ADN de cadena sencilla se convierte a cadenas dobles utilizando el "Phagemid in vitro Mutagenesis Kit" (BioRad) . Algunos de los oligonucleótidos sintéticos los cuales se utilizaron como cebadores para generar los mutantes de pestivirus deseados se incluyen a continuación, de una manera ejemplar: C-297-L AGGAGCTTACTTGGGATCTG C-346-L GGAACAAACTTGGATGGTGT C-297-K ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC C-346-K ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA C-346-d GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG El ADN de cadena doble se utilizó para transformación de células E. coli XLl-Blue (Stratagene) . Se aislaron colonias bacterianas que albergan plásmidos por medio de selección con ampicilina. Se preparó ADN plasmídico y se analizó adicionalmente por secuenciado de nucleótidos utilizando el equipo de secuenciado de polimerasa T7 (Pharmacia) . Se utilizaron plásmidos que contienen las mutaciones deseadas sin cambios en el segundo sitio, para la construcción de las clonas de ADNc de longitud completa. En el caso de CSFV, se inserto un fragmento Xhol/Ndel a partir del plásmido mutagenizado, junto con el fragmento Ndel/BglII derivado del plásmido 578 (pCITE 2A, que contiene el fragmento XhoI/BglII de pA/CSFV) dentro de pA/CSFV cortado con Xhol y Bglll. Para obtener el mutante BVDV CP7, se inserta un fragmento XhoI/BglII que contiene la supresión dentro de pA/BVDV cortado con Xhol y Ncol junto con el fragmento BglII/NcoI aislado de pA/BVDV/Ins . - . A partir del constructo pA/BVDV/Ins- , se transcribe un ARNc que da lugar a BVDV no citopatogénico cuando se somete a transfección en células adecuadas (Meyers et al., 1996b). Se amplifican las diferentes clonas de longitud completa, y se aislan los plásmidos. Se demuestra la presencia de las mutaciones deseadas por secuenciado de ADN. Después de la linealización con Srfl (clonas de longitud completa CSFV) o ARNc Smal (clonas de longitud completa BVDV) , se transcribe como se describe previamente (Meyers et al., 1996ab) . Se purifica ARN por filtración en gel y extracción con fenol/cloroformo y se utiliza para transfección de células renales porcinas (PK15) o células renales bovinas (MDBK clona B2) (constructos CSFV y BVDV, respectivamente) . Las transfecciones se analizaron por inmunofluorescencia con antisueros específicos para el virus. En los casos en que se pudieron recuperar los mutantes deseados (inmunofluorescencia positiva) , los virus se amplificaron por pasaje en las mismas líneas celulares utilizadas para los experimentos de transfección. Un análisis adicional de los mutantes CSFV incluye la determinación de las curvas de crecimiento de una etapa y la caracterización del ARN viral por transferencia Northern (Northern blot) con sondas de ADNc específicas para virus así como reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) y secuenciado subsecuente de los fragmentos PCR para verificar la presencia de las mutaciones deseadas en el genoma viral . En todos los casos se demostró la presencia de la mutación deseada. Todos los virus recuperados crecieron igualmente bien y produjeron cantidades similares de ARN igual gue el virus resultante del plásmido que muestra la secuencia de tipo silvestre. Se demostró la viabilidad del mutante BVDV por transfección de ARNc respectivo y división de las células 3 días después. Parte de las células se sembraron en frascos de 3.5 cm de diámetro, se fijaron con acetona/metanol en el día posterior y se analizaron por inmunofluoresencia con una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos para BVDV (Weiland et al., 1989) . Todas las células se encontraron positivas mientras que los controles de las células transfectadas con ARN no infeccioso no mostraron señal . A partir de una parte de las células transfectadas con el ARNc respectivo, se produjo un extracto por un ciclo de congelamiento y recalentamiento. Se infectaron células frescas con este extracto celular y demostró que es BVDV positivo mediante inmunofluorescencia específica para BVDV 3 días después de la infección. La tabla 1 resume los diferentes cambios introducidos en las secuencias conservadas de E1^ que representan el sitio activo putativo de la ARNasa los cuales son codificados por los mutantes de virus indicados .

Tabla 1 Nombre Secuencia en el motivo de ARNasa actividad de Viabilidad del ARNasa mutante pA/CSFV ...S LHGIWPEKIC, ... H E NKHüWCNW.. C-297-L ...S LLGIWPE IC. ...R HEWN EU CN W... C-346-L ..SLHG1 PE 1C. ...R HE N L.CWCN W... C-297-L 46-L ...S L L. G I W P E I C... . HEWN LGWCN W... C-297-K ...S KGIWPE IC. ...R HEWNKHüWCNW.. C-346- ...S LflGIWPE IC. ...R H E W N K ü. G W C N W.. C-297-d ...S L _ G I W P E K I C... ...R HEWN KHGWCN W„. C-36-d ...S LBGIWPE IC. ...R HEWNK_ÜWCN W... C-296/7/8-d ...S IWPEKI C... ..RHEWNKHGWCN W... C-345/6/7-d ...S LHG1WPEKIC. ...R HEWN WCN W... C-345/6-d ...S LHGIWPEKIC. ...R HEWN__GWCN W... C-346/7-d ...S L H G I W P E K 1 C. ...R HEWNK WCN W...

C-342-d „.S L H G I W P E K I C... ...R H_WNKHGWCN W... C-342/6-d _.S L G 1 W P E K I C... ...R H_WNK_GWCN W... C-301-d ...S L H G I W _ E K 1 C... ...R HEWNKHGWCN W... C-295-S/G ...G LHGIWPEKIC. ...R HEWNKHGWCN W... C-302-E/A ...S LHGIWPEK1 C... ...R HEWNKHGWCN W... C-305-C'G ...S LfiGIWPEKI C... ...R HEWNKgGWCN W... C-300-W/O-302-E/A ...S L H G I G P A K I C... ...R HEWNKHGWCN W... C--S40-R/G ...S L H G I W P E K I C... ...G HEWNKHGWCN W... C-343-W/G ...S LflGIWPEKI C... ...R HEWNKH.G CN W... C-345-K/A ...S LHGIWPEKI C... ._R H E W N A ü G W C N W... C-297-K/-546-K ...S LKGIWPEKIC. ..R H E W N K K_ G W C N W... C-297-K/346-L ...S LKGIWPEKI C... ..EHEWNKÜG CN W... pA/BVDV ...S LHGIWPEK! C... ...R H'EWNKHGWCN W... B-346-d ...S LHGIWPEKI C... ...R HEWNK GWCN W...

Leyenda para la tabla 1: La prueba para la actividad de ARNasa se realizó en un ensayo transitorio. Se infectaron células BHK21 con virus Vaccina con vTF7-3 (Fuerst et al, 1986) y después se transíectaron con el constructo respectivo de ADNc (5 µg de ADN plasmídico, en la transfección se utiliza Superfect como lo indica el proveedor (Qiagen) ) : Después de 10 horas de incubación a 37°C en un incubador de C02, las células transfectadas se lisan y se procesan por determinación de actividad de ARNasa como se describe en lo siguiente. La viabilidad se determinó como se describe a continuación.

Ejemplo 2 Efecto de diferentes mutaciones en la actividad de ARNasa de E 8 Para probar el efecto de las diferentes mutaciones sobre la actividad de ARNasa de E™3, se infectaron células apropiadas con los virus imitantes . Para CSFV, la infección se llevo a cabo con una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0.01. La infección con el virus de tipo silvestre sirvió como un control positivo mientras que las células no infectadas se utilizaron como un control negativo. A las 48 h posteriores a la infección, las células se lavaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfato y se Usaron en 0.4 ml de amortiguador de lisis (Tris-HCl 20 mM; NaCl 100 mM, EDTA y 1 mM, 2 mg/ml de albúmina sérica bovina,- Tritón X100 1%; ácido desoxicólico 0.1%; dodeciisulfato de sodio 0.1%) . El lisado se suministró en tubos de reacción de 1.5 ml , se sometió a sonicado, (sonificador Branson B12, 120 watts, 20 s en un baño de agua con cuerno de copas) , y se aclaro por centrifugación (5 min, 14,000 rpm, centrífuga, Eppendorf, 4°C) y el sobrenadante se sometió a ultracentrifugación (ultracentrifuga de gabinete Beckman, 60 min a 4°C y 45,000 rpm en un rotor TLA 45) . La determinación de actividad de ARNasa se realizó en un volumen total de 200 µl que contiene 5 o 50 µl de sobrenadante de la segunda etapa de centrifugación y 80 µg de Poly(rU) (Pharmacia) en amortiguador de ensayo ARNasa (Tris-acetato 40 mM (pH 6.5), EDTA 0.5 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM) . Después de la incubación de la mezcla de reacción a 37°C durante 1 hora, se agregaron 200 µl de ácido perclórico 1.2M, LaS04 20 mM. Después de 15 min de incubación en hielo, la mezcla se centrifuga durante 15 min a 4°C y 14 rpm en una centrífuga Eppendorf. Al sobrenadante se la agregaron 3 volúmenes de agua y se analizó una alícuota de la mezcla al medir la densidad óptica a 260 nm utilizando un espectrofotómetro Ultrospec 3000 (Pharmacia) . En todos los casos las mutaciones introducidas en el gen Ems suprimieron por completo la actividad de ARNasa (tabla 1) . Para el mutante BVDV, se probó la actividad de AR?asa con material obtenido después de la transfección de AR? sin pasaje de los virus recuperados. Las células transfectadas con el AR? apropiado se dividieron 72 h posterior a la transfección y se sembraron en dos recipientes. 24 h después, de un recipiente se prepararon extractos celulares y se analizaron para determinar actividad de AR?asa como se describe en lo anterior. Para demostrar la infección, las células del segundo recipiente se analizaron por inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos para BDVD (Weiland et al . , 1989) y se encontraron 100% positivos. La transfección se llevó a cabo con AR? transcrito a partir de pA/BVDV/Ins- y a partir de pA/B-346-d, el plásmido equivalente a pA/BVDV/Ins- pero que contiene la supresión del codón equivalente al codón 346 en el genoma CSFV Alfort. Las células MDBK no transfectadas sirvieron como un control negativo.

Tabla 2A Determinación de actividad de ARNasa de diferentes virus Descripción de la Tabla 2A: Se infectaron células PK15 con los virus indicados a una m.o.i. (multiplicidad de infección) de 0.01, se incubaron a 37°C durante 48 h en un incubador de C02 y después se lisaron y sometieron a la prueba de ARNasa. El ARN soluble en ácido resultado de la incubación con extractos celulares diferentes se cuantificó al medir la densidad óptica a 260 nm. Las diferencias observadas en la actividad de ARNasa no se deben a cantidades diferentes de proteína ERNS muestras, puesto que se obtienen similares después de la cuantificación de ERNS por marcado radioactivo, inmunoprecipitación y análisis de radioactividad con una sustancia formadora de imágenes por fósforo. Además, la reducción de la concentración de Ems en el ensayo desciende a únicamente un décimo de su cantidad habitual y no cambia los valores de DO resultantes de manera considerable, lo que indica que con las condiciones elegidas, el ensayo se satura con Ems. CSFV cepa Alfort; todos los demás virus se recuperaron de ARN transcrito in vitro a partir de plásmidos; por ejemplo C-WT a partir de pA/CSFV; C-297-L a partir de pA/C-297-L; etc.; el virus C-346-d/Rs se recupera de pA/C-346-d/Rs (generado por reversión de mutación en pA/C-346-d por intercambio del fragmento respectivo de ADNc contra el fragmento equivalente derivado de pA/CSFV) ,- control : extracto de células PK15 no infectadas Tabla 2B Descripción de la tabla 2B Se infectaron células MDBK con ARN transcrito in vitro, se dividieron 72h posterior a la transfección y se analizaron 24h después para determinar actividad de ARNasa. Se demostró la infección de las células por análisis de inmunofluoresencia como se describió en el texto. B.WT: virus recuperado de pA/BVDV/Ins- ,- B-346-d: virus recuperado de pA/B-346-d; control; extractos de células MDBK no infectadas .

Ejemplo 3 Patogenicidad de CSFV después de una inactivación de ARNasa Para probar si la destrucción de la actividad de ARNasa influye en la patogenicidad de los pestivirus en su huésped natural, se llevaron a cabo experimentos en animales con mutante V (pA/C-346 -d) (C346-d en las tablas) . El virus recuperado de una clona de longitud completa de CSFV sin mutación (V(pA/CSFV)) sirve como un control positivo (C-WT en las tablas) . Para cada mutante se utilizaron tres lechones (raza: Germán landrace,- de aproximadamente 25 kg de peso corporal) . La dosis de infección fue de 1 x 105 TCDI50 por animal; dos tercios del inoculado se administraron intranasalmente (un tercio en cada fosa) , y un tercio intramuscularmente. Los dos grupos se alojaron en unidades de aislamiento separadas. Se tomó sangre de los animales dos veces antes de la infección y los días 3, 5, 7, 10, 12 y 14. Además, se registró la temperatura diariamente (figura 2) . Los animales infectados con el virus de tipo silvestre mostraron síntomas típicos de la fiebre porcina clásica como fiebre, ataxia, anorexia, diarrea, trastornos en el sistema nervioso central, hemorragias cutáneas (tabla 3a) . El virus se puede recuperar de la sangre en los días 3, (animal #69) y en los días 5, 7, 10, 14 (animales #68, #78, #121) (Tabla 3b) . Los animales fueron sacrificados en un estado moribundo a los 14 días posteriores a la infección. En este momento, no se pudo detectar anticuerpos neutralizantes de virus. En contraste, los animales infectados con el mutante no desarrollaron síntomas clínicos (tabla 3a) . La temperatura permaneció normal (figura 2) durante todo el período experimental y los animales nunca dejaron de ingerir alimento. En ningún momento se pudo recuperar virus de la sangre. No obstante, los animales claramente estaban infectados y el virus es muy probable que se haya replicado puesto que todos los animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes (tabla 3c) .

Tabla 3a: Signos clínicos después de la infección de prueba : Descripción de la tabla 3a: Se incluyeron 6 lechones (raza Germán land; de aproximadamente 25 kg de peso corporal) en dos grupos (cada grupo se alojó por separado) en el estudio. Se infecto a 3 animales con CSFV-WT (1 - 105 TCDI50) y 3 animales con C-346-d (un - 105 TCDI50) . La temperatura rectal y los signos clínicos se registraron y se resumen como se indica en la tabla,- n.a. : no se realizó necropsia.

Tabla 3b: Viremia en células sanguíneas después de la infección de prueba Descripción de la tabla 3b: Se detectó viremia en células sanguíneas por cocultivo de sangre con células PK15. Después de la incubación a 37°C durante 72h las células se lavan con PBS, se fijan con acetona enfriada con hielo/metanol y se analizan para infección por inmunofluoresencia con un anticuerpo monoclonal específico para glicoproteína E2 (mAb A18, Weiland et al. 1990) .

Tabla 3c: Desarrollo del titulo de neutralización de suero especifico para CSFV Descripción de la Tabla 3c : Los títulos de anticuerpo de cerdos infectados con virus mutante C-346-d determinados en puntos de tiempo diferentes durante el experimento animal : Se mezclaron 50 µl del suero diluido con 50 µl de medio que contiene 30 TCDI50 de virus (CSFV alfort/Tübingen) . Después de incubación durante 90 minutos a 37°C, se agregaron 100 µl de células (1.5 x 104 células) y la mezcla se siembra en placas de 96 pozos. Después de 72 h, las células se fijan con acetona enfriada con hielo/metanol y se analizan para infección por inmunofluoresencia con un anticuerpo monoclonal específico para glicoproteína E2 (mAb A18, Weiland et al. 1990) . En el día 69 posterior a la infección se expone a los animales con 2 x 105 TCDI50 de CSFV cepa Eystrup. La tabla proporciona la dilución de suero más alta que resulta en neutralización completa del virus introducido .

Ejemplo 4 Inducción de inmunidad protectora por infección con virus ARNasa negativa Para analizar si la infección con el virus mutante lleva a una inmunidad protectora, se realizó un experimento de exposición aproximadamente 9 semanas después de la infección con el mutante CSFV utilizando una cepa de CSFV heteróloga altamente patógena (cepa Eystrup, originada de Behring) . Se utilizaron para la infección 2 x 10s TCDIS0 de virus. Se encontró que esta cantidad de virus es suficiente para inducir una enfermedad mortal en varios experimentos precedentes (Kónig, 1994) . Sin embargo, los animales previamente infectados con CSFV ARNasa mutante no muestran síntomas de enfermedad después de la infección por exposición. No se pudo detectar fiebre (figura 3) ni viremia, pero un incremento en los anticuerpos neutralizantes indica una infección productiva y la replicación del virus de exposición.

Ejemplo 5 Confirmación del principio de atenuación Para demostrar que la atenuación observada del virus mutante en realidad se debe a la supresión de la histidina en la posición 346 de la poliproteína y no como una consecuencia de un segundo sitio de mutación no identificado, se restauró la secuencia de tipo silvestre por intercambio de un fragmento Xhol/Ndel de 1.6 kb de la clona de longitud completa pA/C-346-d contra el fragmento correspondiente de pA/CSFV que muestra la secuencia de tipo silvestre. Se analizó el fragmento cortado de pA/C-346-d por secuencia de nucleótidos para mutaciones. Excepto para la supresión del triplete que codifica para histidina 346 de la poliproteína, no se encontró diferencia con respecto a la secuencia de tipo silvestre. A partir del ADNc constructo con el mutante resultante, el virus V(pA/-346-d/Rs) se puede recuperar creciendo igualmente bien que el virus de tipo silvestre y muestra una actividad equivalente de ARNasa (tabla 2A) . En un segundo experimento en animales, se utilizó el virus rescatado para infección de cerdos. Como un control, se utilizó el mutante de supresión. Nuevamente, se utilizaron dos grupos que consisten de tres animales. Puesto que los animales eran más jóvenes (raza Germán landrace, de aproximadamente 20 kg) a los del primer experimento, esta vez se utilizaron para infección 5 x 104 TCDIS0 de virus. Nuevamente, los animales infectados con el mutante no mostraron signos clínicos (tabla 5, figura 4) . Únicamente un animal presentó fiebre durante un día. No obstante, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y estuvieron protegidos contra una exposición mortal de SCFV. La exposición se realizó nuevamente por infección con 2 x 105 TCDIS0 de cepa de exposición Eystrup. Estos animales no mostraron signos clínicos después de la exposición y la temperatura permaneció normal (figura 5) . En contraste con los cerdos infectados con el mutante de supresión, los animales inoculados con el virus de tipo silvestre rescatado desarrollaron fiebre porcina clásica mortal . Un animal tuvo que ser sacrificado 11 días después de la infección, y los otros dos, tres días después. Todos los animales mostraron síntomas típicos de la fiebre porcina clásica, es decir, fiebre, diarrea, anorexia y signos patológicos como hemorragias en diferentes órganos que incluyen al riñon.

Tabla 5a: Signos clínicos después de la infección de prueba Tabla 5a: Se incluyeron en el estudio 6 lechones (raza Germán land; de aproximadamente 20 kg de peso corporal) en dos grupos (cada grupo se alojó por separado bajo condiciones de aislamiento) en el estudio. Se infectó a 3 animales con C-346-d mutante (5 - 104 TCDIS0) y 3 animales con C-346-d/Rs (5 - 104 TCDI50) . Se derivo a C346-d/RS del mutante C-346-d al restaurar la secuencia de tipo silvestre del gen para ERNS. Se registraron y se resume la temperatura rectal y los signos clínicos,- n.a. : no se realizó necropsia.

Tabla 5b Prueba de ARNasa diagnóstica con virus recuperados de animales infectados durante viremia Los virus se recuperaron de la sangre de los animales 3 y 5 en el día 5 posterior a la infección y de los animales 27, 28 y 30 del experimento en animales #2 (descrito en el ejemplo 5) en el día 7 posterior a la infección y se propagaron en cultivo de tejido, se titularon y probaron para determinar la actividad de ARNasa como se describe en lo anterior. Células PK15 no infectadas y células (control) infectadas con CSFV (Alfort) tipo silvestre sirvieron como controles. Los animales 3 y 5 se infectaron con C-297-K mutante, mientras que los animales 27, 28 y 30 se infectaron con C-346-d/Rs mutante, como se describe en la tabla.

Ejemplo 6 Efectos de la mutación doble dentro de EE Para probar los efectos de una mutación doble dentro de E™3 en la capacidad del virus respectivo para replicarse en su huésped natural y en patogenicidad, se llevó a cabo un experimento en animales con V(pA/C-297-L/346-L) mutante. El virus recuperado de CSFV la clona de longitud completa sin mutación (V(pA/CSFV) sirvió como un control positivo. Para cada mutante (cepa: raza: Germán land; de aproximadamente 25 kg de ' peso corporal) . La dosis de infección fue de 1 x 105 TCDI50 por animal; dos tercios del inoculado fueron administrados intranasalmente (un tercio en cada fosa) y un tercio intramuscularmente. Se tomo sangre de los animales antes de la infección (día 0) y en los días 5, 8, 12 y 20. Además, se registró la temperatura diariamente (figura 6) . Los animales infectados con el mutante doble no desarrollaron ningún síntoma clínico y los animales nunca dejaron de ingerir alimento. Los animales no mostraron fiebre durante todo el período experimental (animales 45/2 y 45/3) excepto el animal 45/1, en el día 8, debido probablemente a una infección bacteriana causada por daño en la planta de la pata derecha. Después del tratamiento de este animal con un antibiótico en el día 10, la temperatura regresó a los valores normales al siguiente día (figura 6) . Para todos los animales, se recuperó virus de la sangre en el día 5 mientras que no se detectó viremia en los puntos de tiempo posteriores (tabla 6a) . Todos los animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes (tabla 6b) . Para el animal 45/1, el título de neutralización se determinó nuevamente aproximadamente a los 4.5 meses p.i. y se encontró que es de 1:4374. Por lo tanto, la infección con el mutante doble resultó en una memoria inmunológica de larga duración.

Tabla 6a prueba para viremia Tabla 6b Neutralización de títulos Ejemplo 7 Principio de inmunogenicidad y atenuación del virus BVDV "B-346-d" Este experimento se diseñó para evaluar el principio de atenuación así como la inmunogenicidad del virus BDVD, B-346-d' recuperado de pA/B-346-d al compararlo con el virus "B- WT" recuperado de pA/BVDV/Ins- . El virus "B-346-d" por supuesto ha mutado en su posición 349 original BDVD pero se le ha denominado "B-346" para indicar la posición relativa respecto a la posición 346 de CSFV Alfort de la figura 1. Se seleccionaron tres grupos de animales seronegativos a BDVD de 3-6 meses de edad. Los grupos 1 y 2 estaban constituidos cada uno de 5 animales mientras que el grupo 3 comprendería 3 animales . Los animales del grupo 1 y 2 fueron infectados por administración de 2 x 106 TCDIS0 de B-346-d (grupo 1) o B-WT (grupo 2) en un volumen de 5 ml por ruta. Los animales fueron infectados intramuscularmente (músculo glúteo) , intranasalmente por vía subcutánea (sobre la escápula) . Durante un período de 14 días después de la infección, se monitoreo la viremia en ambos grupos a través de parámetros como la viremia en células sanguíneas y la recolección de virus en los hisopos nasales. Además se monitorearon parámetros clínicos como temperatura rectal, cuenta de células sanguíneas blancas y parámetros de salud general . Se investigó la inmunidad protectora contra una infección con un aislado de BVDV antigénicamente heterólogo y virulento (#13) por infección por exposición 77 días después de la infección de los animales del grupo 1 con B-346-d. Los animales del grupo 3 sirvieron como control de exposición y se infectaron de acuerdo con el procedimiento para estos animales del grupo 1 con el aislado de BVDV virulento. El virus BVDV (#13) pertenece a un grupo antigénico diferente (tipo II) , mientras que el virus B-346-d pertenece al grupo antigenético (tipo I) de acuerdo con la clasificación descrita por (Pellerin, C. et al., 1994). Los animales del grupo 1 y 3 se infectaron por administración de 2 x 106 TCDI50 de aislado BVDV (#13) en un volumen de 5 ml por día. Los animales fueron infectados por vía intramuscular (músculo glúteo) , intranasal y subcutánea (sobre la escápula) . Durante un período de 14 días después de la infección se monitoreo la viremia en ambos grupos por parámetros como la viremia en células sanguíneas y recuperación de virus en hisopos nasales. Además, se monitorearon parámetros clínicos, temperatura rectal, cuenta de células sanguíneas blancas y parámetros de salud general . Después de la infección con B-346-d los animales no mostraron ningún síntoma clínico de una infección por BDVD tal como incremento en la temperatura rectal (tabla 7a) o algún síntoma clínico respiratorio (no mostrado) . La viremia de células sanguíneas reducidas (tabla 7b) y la recuperación de virus en los hisopos nasales (tabla 7c) indica claramente una atenuación de B-346-d en comparación con B-WT. El aislado de BVDV virulento #13 indujo en los animales del grupo 3 una viremia fuerte con signos típicos de una infección por BVDV, como incremento en la temperatura rectal durante un período de varios días (tabla 7d) , leucopenia fuerte (tabla 7e) , viremia extendida en células sanguíneas (tabla 7f) y dispersión de virus en fluido con un hisopo nasal (tabla 7g) .

En contraste, los animales del grupo l los cuales han sido vacunados por infección con B-346-d casi no mostraron síntomas clínicos típicos para una infección por BVDV después de la infección de exposición con el aislado #13 virulento de BVDV.

No hubo un incremento significativo en la temperaturas rectales ¿ después de la infección (tabla 7d) . La leucopenia observada fue muy marginal con respecto a la magnitud y duración (tabla 7e) .

No se pudo aislar BVDV de la sangre (tabla 7f) y únicamente para un animal se pudo detectar dispersión de virus animal en exudado de hisopo nasal (tabla 7g) . Por lo tanto, la infección con B-346-d induce una inmunidad fuerte lo cual reduce claramente los signos clínicos, la dispersión del virus y la viremia en células sanguíneas después de la infección por exposición con un aislado heterólogo de BVDV.

Tabla 7a: Temperatura rectal media en el grupo 1 (B-346-d) y 2 (B-WT) Los animales del grupo 1 se infectaron en el día 0 con 6 x 106 TCDIS0 de B-346-d, mientras que los animales del grupo 2 se infectaron con 6 x 106 TCDI50 de B-WT.

Figura 7b : Viremia en células sanguíneas de los grupos 1 y La sangre con EDTA fue mostra a iariamente hasta el día 10 post-infección con B-346-d y B-WT, respectivamente, se agregaron 0.2 ml de sangre a cada uno de los tres cultivos de células de testículo de ganado (Cte) con medio que contiene haparina (1 unidad/ml para evitar la coagulación) . Después de incubación durante la noche, el inóculo/medio se sustituyó con medio fresco sin heparina. Después de la incubación durante 4 a 6 días, se detectaron células infectadas por BVDV mediante inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para BVDV. Los cultivos negativos se congelaron y subsecuentemente se recalentaron. Posteriormente se hacen pasar 0.2 ml de los mismos a un segundo pasaje en células Cte para confirmar la ausencia de BVDV.

Tabla 7c: Dispersión de virus en fluido nasal: El exudado nasal se centrífugo (1000 g) para remover los residuos gruesos y los contaminantes. El fluido sobrenadante se removió y se sembraron 0.2 ml en cada uno de tres cultivos celulares . Después de incubación durante la noche, el inoculo/medio de sustituye con 2 ml de medio fresco. Después de incubación durante 4-6 días, se infectaron células infectadas por BVDV por inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para BVDV.

Tabla 7d: Temperaturas rectales medias de los grupos 1 y 3 Se registraron las temperaturas rectales hasta por 16 días después de la infección de exposición. Los animales del grupo 1 y 3 se infectaron con 6 x 106 TCDI50 del aislado #13 BVDV virulento .

Tabla 7e: Cuentas de células sanguíneas blancas medias Se tomaron muestras de células sanguíneas con EDTA diariamente del día -2 a 14 posterior a la exposición de cada animal en ambos grupos. Las cuentas de células sanguíneas blancas en muestras de sangre tratada con EDTA se determinaron utilizando un Sysmex Micro-Cell Counter F800.

Tabla 7f : BVDV aislado de muestras sanguíneas Se tomaron muestras diariamente de sangre tratada con EDTA hasta el día 10 posterior a la exposición. Se agregaron 0.2 ml de sangre a cada uno de los tres cultivos en células de testículo de vacuno (Cte) con medio que contiene heparina (1 unidad/ml para evitar la coagulación) . Después de incubación durante la noche, el inoculo/medio de sustituye con medio fresco sin heparina. Después de la incubación durante 4 a 6 días, las células infectadas con BVDV se detectaron por inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para BVDV.

Los cultivos negativos se congelaron y posteriormente se recalentaron. Se hacen pasar 0.2 ml de los mismos a un segundo pasaje en células Cte para confirmar la ausencia de BVDV.

Tabla 7g: Dispersión de virus en fluido nasal El exudado nasal se centrifugó (1000 g) para remover los residuos gruesos y contaminantes . El fluido sobrenadante - ß6 -se removió y se sembraron 0.2 ml del mismo en cada uno de tres cultivos celulares. Después de incubación durante la noche, el inóculo/medio se sustituye con 2 ml de medio fresco. Después de incubación durante 4-6 días, se detectaron células infectadas por BVDV por inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para BVDV.

Ejemplo 8: Diferenciación entre C-346-d y CSFV sin supresión del codón 346 de histidina por RT-PCR La secuencia de ARN que codifica para el motivo de ARNasa conservado en la glicoproteína ERNS de CSFV está altamente conservada. Entre todas las secuencias conocidas de CSFV, no se detectaron cambios de nucleótido en la región que corresponde al residuo 1387 a 1416 de la secuencia publicada de CSFV cepa Alfort (Meyers et al., 1987). Por lo tanto, los cebadores oligonucleot ídicoe derivados de esta región conservada del genoma se pueden utilizar en un ensayo RT-PCR para detección de todos los aislados CSFV (véase la figura 7) . En consecuencia, se puede detectar la ausencia del triplete que codifica para histidina 346 (nucleótidos 1399-1401) por un ensayo RT-PCR con un cebador diseñado apropiadamente. Se sintetizaron oligonucleótidos diferentes que cubren la región conservada los cuales contenían o no el codón histidina. Estos oligonucleótidos sirvieron como cebadores hacia el extremo 5' en reacciones RT-PCR con el oligonucleótido E1"3-detención como cebador hacia el extremo 3 ' . El ARN purificado de células de cultivo de tejido infectadas con C-346-d, C-WT, C-346-L o C-346-K, respectivamente, se utilizaron como plantillas. La transcripción inversa de 2 µg de ARN desnaturalizado por calor (2 min, 92 °C, 5 min en hielo y 11.5 µl de agua en presencia de 30 pmol de cebador inverso) se realizó después de la adición de una mezcla de 8 µl de RT (Tris/HCl 125 mM, pH 8.3, KCl 182.5 mM, MgCl2 7.5 mM, ditiotreitol 25 mM, 1.25 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP) , 15 U de RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Alemania) y 50 U de Superscript (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Alemania) durante 45 min a 37 °C. Después de terminar la transcripción inversa, los tubos se colocan en hielo y 30 µl de mezcla PCR (Tris-HCl 8.3 mM, pH 8.3; KCl 33.3 mM; MgCl2 2.2 mM; 0.42 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP), Tritón X 100 0.17%; albúmina sérica bovina 0.03%; 5 U de polimerasa Taq (Appligene, Heidelberg, Alemania) y DMSO 16.7%) se agregaron. Cuando se utilizó el cebador 01 H+3, la mezcla de reacción para amplificación no contenía DMSO. La amplificación se llevó a cabo en 36 ciclos (30 seg 94°C; 30 seg 57°C; 45 seg 74°C) . Se carga 1 µ l de reacción de amplificación en un gel de agarosa 1%, los productos amplificados se separaron por electroforesis y se tiñeron con bromuro de etilo. Como se demuestra en la figura 7, el par cebador 01 H-3/0I Ems Stop permite amplificar específicamente una banda derivada de ARN que contiene la supresión del codón 346 mientras que con los otros dos productos de combinación de cebador que contienen el codón 346 se amplificaron y no se observa una banda cuando el ARN con la supresión de este codón se utiliza como la plantilla.

Cebadores para RT-PCR: hacia el extremo 5 ' 01 H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT 01 H+2 : TGGAACAAACATGGATGG 01 H+3: GAATGGAACAAACATGGA hacia el extremo 3 ' : 01 EmsStop: GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG Leyendas de las Figuras Figura 1: Los primeros 495 aminoácidos como se expresan por la cepa Alfort de CSFV La lista de secuencia muestra los primeros 495 aminoácidos como se expresaron por la cepa Alfort de CSFV (Meyers et al., 1989) . Un monómero de la glicoproteína Ems de tal cepa corresponde a los aminoácidos 268 a 494 como se describen por Rümenapf et al. (1993). Los residuos 295 a 307 y 338 a 357 representan las regiones que muestran homología con ARNasas vegetales y micóticos (Schneider et al., 1993) y están subrayados .

Figura 2 : Curva de temperatura rectal de animales después de la infección de prueba Se registró la temperatura rectal diaria desde el día 2 antes hasta el día 18 posterior a la infección. La curva de temperatura rectal está detallada para cada animal del grupo infectado con el virus V(pA/CSFV) (línea continua) derivada del plásmido pA/CSFV o con el virus V(pA/C-346-d) derivado del plásmido pA/C-346-d (línea discontinua) .

Figura 3 : Curva de temperatura rectal de animales después de la infección de exposición Se registró la temperatura rectal diaria en los días 1-21 posterior a la infección con virus de exposición. Los animales expuestos con una dosis mortal del CSFV de exposición cepa Eystrup han sido identificados con C-346-d[V(pA/C-346-d) ] mutante 69 días en lo anterior y como se detalla en el texto. La curva de temperatura rectal está detallada para cada animal del grupo expuesto con 2 x 105 TCDI50 a partir de CSFV de exposición cepa Eystrup.

Figura 4: Curva de temperatura rectal de animales después de la infección de prueba La temperatura rectal diaria se registró en los días 0-18 posteriores a la infección. La curva de temperatura rectal está detallada para cada animal de los dos grupos infectados ya sea con C-346-d [V (pA/C-346-d) ] (línea discontinua) o con virus restaurado C-346-d/RS [V (pA/C-346-d/RS) ] (línea continua) .

Figura 5 : Temperatura rectal después del experimento #2 en animales de exposición a la infección Se registró la temperatura rectal diaria los días 1-10 posterior a la exposición de la infección de virus. Los animales se expusieron con una dosis letal (2 x 105 TCDI50) de la cepa de exposición CSFV Eystrup que ha sido infectada con el mutante C-346-d 37 días antes.

Figura 6 : Temperatura rectal de animales tratados con el mutante doble de acuerdo con el ejemplo 6 Se registró la temperatura rectal diaria antes y después de la exposición a la infección por virus con el mutante V(pA/C-297-L/346-L) .

Figura 7 : Diferenciación entre C-346-d y SCFV sin supresión del codón histidina 346 por RT-PCR de acuerdo con el ejemplo 8 a) El par cebador de Oí H/01 EmsStop permite amplificar específicamente una banda derivada de ARN que contiene la supresión del codón 346 (C-346-d) como se describe con detalle en el ejemplo 8. En contraste, el ARN que no contiene la supresión, no interactúa con el par cebador (C.WT, C-346-L, C-346-K) . b) y c) Las otras dos combinaciones de cebadores (01 H+2 y 01 H+3) amplifican bandas derivadas de ARN que no contienen la supresión del codón 346 (01 H+2 y 01 H+3) . No se puede observar una banda cuando se utiliza como plantilla ARN del mutante con la supresión 346 C-346-d. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a cabo la presente invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una vacuna viva que contiene un pestivirus, en donde se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína E *13.

2. La vacuna de conformidad con la reivindicación l, caracterizada porque la actividad de RNasa se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de la glicoproteína.

-3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque las supresiones o mutaciones, o ambas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de la glicoproteína.

4. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la actividad de ARNasa se inactiva por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346 como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

5. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la actividad de ARNasa se inactiva por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1, para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

6. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende un pestivirus BVDV, en donde la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1, para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas BVDV de tal glicoproteína.

7. Un pestivirus, en donde la actividad de ARNasa reside en glicoproteína ERNS se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína con la condición de que los aminoácidos en la posición 297 o 346, o ambas, como se describen en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína, no es lisina.

8. El pestivirus de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la actividad de ARNasa se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, localizadas en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura l para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de la glicoproteína.

9. El pestivirus, de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la actividad de ARNasa se inactiva por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

10. El pestivirus, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la actividad de ARJSTasa se inactiva por supresión del residuo histidina en la posición 346 como se describe en la figura 1 para la cepa Alfort CSFV de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

11. Un pestivirus BVDV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa por supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas BVDV, de tal glicoproteína .

12. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica para una glicoproteína E"*1"3, en donde la actividad de ARNasa que reside en tal glicoproteína es inactivadora por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína, con la condición de que los aminoácidos en la posición 297 o 346, o ambos, como se describen en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de. tal glicoproteína, no sea lisina.

13. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones, o ambas, que se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

14. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

15. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

16. Un ácido nucleico de BVDV, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas BVDV de tal glicoproteína.

17. El uso de ácido nucleicos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 para preparar vacunas de nucleótido o vector, o ambas.

18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un pestivirus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, o una secuencia nucleotídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.

19. Un método para atenuar pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS .

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque las supresiones o mutaciones, o ambas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 de la cepa CSFV Alfort, de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la actividad de ARNasa se inactiva por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1, para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

24. Un método para producir una vacuna atenuada específicamente, caracterizada porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS .

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la actividad de ARNasa se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque las supresiones o mutaciones, o ambas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para la cepa CSF Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

29 . Un mé t o do p a r a ma r c a r de t e c t ab l eme nt e pestivirus , caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS .

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína.

31. El método de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque las supresiones o mutaciones, o ambas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 0 la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort, de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort, de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en • la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

34. Un método para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales, caracterizado porque se aplica una vacuna, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, a un animal en necesidad de tal profilaxis o tratamiento.

35. El proceso para la preparación de pestivirus atenuados específicamente, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS.

36. El proceso de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la actividad de ARNasa se inactiva por supresiones o mutaciones, o ambas, de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína.

37. El proceso de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque las supresiones o mutaciones, o ambas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o en la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

38. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

39. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión del residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

40. Un proceso para la preparación de pestivirus marcado específicamente, caracterizado porque se inactiva la actividad de ARNasa que reside en la glicoproteína ERNS.

41. El proceso de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresiones o mutaciones de por lo menos un aminoácido de tal glicoproteína.

42. El proceso de conformidad con la reivindicación 40 ó 41, caracterizado porque las supresiones o mutaciones o ambas, se localizan en los aminoácidos en la posición 295 a 307 o la posición 338 a 357, o ambas, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

43. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por supresión o mutación del aminoácido en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas, de tal glicoproteína.

44. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, caracterizado porque la actividad de ARNasa es inactivada por la supresión de residuo histidina en la posición 346, como se describe en la figura 1 para la cepa CSFV Alfort de una manera ejemplar o que corresponde a la misma en otras cepas de tal glicoproteína.

45. El uso de una vacuna, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se utiliza para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales.

46. El uso de una composición farmacéutica, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque se utiliza para la profilaxis y tratamiento de infecciones por pestivirus en animales.

47. El uso de un pestivirus, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 o una secuencia nucleotídica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, o ambas, caracterizada porque se utiliza para la preparación de una vacuna o una composición farmacéutica .

48. Un método para distinguir animales infectados con pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado específicamente, en donde el pestivirus atenuado específicamente es atenuado de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de presentar infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Identificar la secuencia nucleotídica de un pestivus dentro de la muestra; (3) Correlacionar las supresiones o mutaciones o ambas de la secuencia nucleotídica de ERNS como se presenta en la vacuna con un animal vacunado, y correlaciona la ausencia de las supresiones o mutaciones, o ambas, con una infección por pestivirus de tal animal .

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado,- (2) Identificar una glicoproteína ERNS modificada de un pestivirus atenuado por unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas ERNS presentes en la muestra, las glicoproteínas están modificadas por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, por lo que los anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a las glicoproteínas no modificadas de E™3; (3) Correlacionar la unión específica de los anticuerpos monoclonales o policlonales con un animal vacunado y correlacionar la ausencia de anticuerpo que se une a una infección por pestivirus del animal bajo la condición de que la presencia del material pestiviral en el animal o la muestra, o en ambas, se establece de otra manera.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Identificar una glicoproteína E RNS no modificada de un pestivirus por la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas en E^^S presentes en la muestra, las glicoproteínas no son modificadas por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, por lo que los anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteínas E11^ modificadas; (3) Correlacionar la unión de los anticuerpos monoclonales o policlonales con una infección por pestivirus en el animal y correlacionar la ausencia de unión de anticuerpo a un animal vacunado bajo la condición de que la presencia de material pestiviral en el animal o la muestra, o en ambos, se establezca de otra manera.

51. El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Determinar la ausencia o presencia de actividad de ARNasa de una glicoproteína de ERNS dentro de la muestra; (3) Correlacionar la ausencia de actividad de RNasa de glicoproteína E*^ con un animal vacunado y correlacionar la presencia de tal actividad con una infección por pestivirus en tal animal.

52. El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) Obtener una muestra de anticuerpos policlonales de un animal de interés sospechoso de infección por pestivirus o un animal vacunado; (2) Identificar cualquier unión específica de los anticuerpos policlonales a la glicoproteína ERNS no modificada o la glicoproteína E^S modificada de acuerdo con la invención, (3) Correlacionar la unión de los anticuerpos policlonales con la glicoproteína E^ s no modificada con una infección por pestivirus, y correlacionar la unión de los anticuerpos policlonales a glicoproteína E1^3 modificada de acuerdo con la invención con un vacunado.