DE69929544T2 - Attenuierte Pestiviren - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abschwächen von Pestiviren durch Inaktivieren der Ribonuclease-Aktivität (RNase-Aktivität), die in Glycoprotein ERNS enthalten ist. Die Erfindung betrifft auch Pestiviren, die erfindungsgemäß abgeschwächt worden sind, Nucleinsäuren zur Herstellung derartiger Pestiviren, Impfstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen abgeschwächten Pestiviren enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zum Unterscheiden zwischen den erfindungsgemäßen abgeschwächten Viren und pathogenen Viren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Pestiviren verursachen weltweit in zahlreichen Ländern Tierkrankheiten, die von wirtschaftlicher Bedeutung sind. Derzeit bekannte Virusisolate werden in drei unterschiedliche Spezies eingeteilt, die zusammen eine Gattung innerhalb der Familie Flaviviridae bilden.
    • I. Boviner viraler Diarrhoe-Virus (BVDV) verursacht bovine virale Diarrhoe (BVD) und Schleimhautkrankheit ("mucosal disease") (MD) bei Rindern (Baker, 1987; Moennig und Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
    • II. Klassisches Schweinepest-Virus (CSFV), früher auch als Schweinecholera-Virus bezeichnet, ist für die klassische Schweinepest (CSF) oder für Schweinecholera (HC) verantwortlich (Moennig und Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
    • III. Das Border-Disease-Virus (BDV) tritt typischerweise bei Schafen auf und verursacht die Border-Disease (BD). Symptome, die ähnlich wie MD bei Rindern sind, wurden auch nach intrauteriner Infektion von Lämmern mit BDV beschrieben (Moennig und Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
  • Eine alternative Klassifikation von Pestiviren findet sich bei Becher et al. (1995) oder bei anderen Autoren.
  • Pestiviren sind kleine, umhüllte Viren mit einem einzelsträngigen RNA-Genom von positiver Polarität, denen sowohl 5'-cap als auch 3'-poly(A)-Sequenzen fehlen. Das virale Genom kodiert für ein Polyprotein von etwa 4 000 Aminosäuren, das durch co- und posttranslationale Prozessierung unter Beteiligung von zellulären und viralen Proteasen zu endgültigen Spaltungsprodukten führt.
  • Die viralen Proteine sind im Polyprotein in der Reihenfolge NH2-Npro-C-ERNS-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Rice, 1996) angeordnet. Protein C und die Glycoproteine ERNS, E1 und E2 stellen strukturelle Komponenten des Pestivirus-Virions dar (Thiel et al., 1991). Es wurde festgestellt, dass E2 und in geringerem Umfang ERNS Ziele für die Antikörper-Neutralisation darstellen (Donis et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijn et al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). Bei ERNS fehlt ein Membrananker. Es wird in erheblichen Mengen aus den infizierten Zellen sezerniert. Es wurde berichtet, dass dieses Protein RNase-Aktivität aufweist (Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). Die Funktion dieser enzymatischen Aktivität für den viralen Lebenszyklus ist derzeit unbekannt. Im Fall eines CSFV-Impfstoffstammes wurde über eine experimentelle Zerstörung der RNase durch positionsgerichtete Mutagenese berichtet, die zu einem zytopathogenen Virus führt, dessen Wachstumseigenschaften in Zellkultur mit denen des Wildtypvirus gleichwertig sind (Hulst et al., 1998). Die enzymatische Aktivität hängt von der Anwesenheit von zwei Strecken von Aminosäuren ab, die zwischen Pestivirus ERNS und verschiedenen bekannten RNasen pflanzlichen oder pilzlichen Ursprungs konserviert sind. Diese beiden konservierten Sequenzen enthalten einen Histidinrest (Schneider et al., 1993). Ein Austausch eines jeden dieser Reste gegen Lysin im ERNS-Protein eines CSFV-Impfstoffstammes führte zur Zerstörung der RNase-Aktivität (Hulst et al., 1998). Eine Einführung dieser Mutationen in das Genom des CSFV-Impfstoffstammes beeinflusste nicht die virale Lebensfähigkeit oder die Wachstumseigenschaften, führte jedoch zu einem Virus, das einen leicht zytopathogenen Phänotyp aufwies (Hulst et al., 1998).
  • Impfstoffe, die abgeschwächte oder abgetötete Viren oder virale Proteine, die in heterologen Expressionssystemen exprimiert werden, umfassen, wurden für CSFV und BVDV erzeugt und werden derzeit eingesetzt. Die strukturelle Basis für die Abschwächung dieser Viren, die als Lebendimpfstoffe verwendet werden, ist nicht bekannt. Daraus ergibt sich das Risiko von unvorhersagbaren Revertanten durch Rückmutation oder Rekombination im Anschluss an eine Impfung. Andererseits ist die Wirksamkeit von inaktivierten Impfstoffen oder heterolog exprimierten viralen Proteinen (Untereinheits-Impfstoffe) bei der Induktion von Immunität recht gering.
  • Im allgemeinen würden es Lebendvakzine mit definierten Mutationen als Basis für eine Abschwächung ermöglichen, die Nachteile der derzeitigen Generation an Impfstoffen zu vermeiden. Mögliche Ziele für abschwächende Mutationen bei Pestiviren sind derzeit nicht verfügbar.
  • Ein weiterer Vorteil dieser abschwächenden Mutationen liegt in ihrer molekularen Einzigartigkeit, die es ermöglicht, sie als unterscheidungskräftige Markierungen für abgeschwächte Pestiviren zu verwenden und sie von in der Natur vorkommenden Pestiviren zu unterscheiden.
  • Aufgrund der Bedeutung einer wirksamen und sicheren sowie nachweisbaren Prophylaxe und Therapie von Pestivirus-Infektionen besteht ein starkes Bedürfnis nach lebenden und speziell abgeschwächten Impfstoffen mit einem hohen Potential zur Induktion von Immunität sowie mit einer definierten Basis der Abschwächung, wobei auch eine Unterscheidung von pathogenen Pestiviren möglich ist.
  • Daher besteht das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem in der Bereitstellung von spezifisch abgeschwächten und nachweisbar markierten Pestiviren zur Verwendung als lebende, abgeschwächte Impfstoffe mit einem hohen Wirkungsgrad der Induktion von Immunität, wobei die Pestiviren als Ergebnis dieses Verfahrens auch von pathogenen Pestiviren aus der Natur unterschieden werden können.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Lösung des vorstehenden technischen Problems ergibt sich aus der Beschreibung und den in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen.
  • Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Pestiviren spezifisch durch Inaktivierung der RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, abgeschwächt werden können.
  • Die abgeschwächten Pestiviren ergeben nunmehr Lebendvakzine von hoher Immunogenizität.
  • Somit wird gemäß einem Aspekt ein Lebendimpfstoff bereitgestellt, der ein Pestivirus umfasst, wobei die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert ist.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Impfstoff" bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine immunologisch aktive Komponente umfasst, die eine immunologische Reaktion bei einem Tier hervorruft, sowie möglicherweise, jedoch nicht notwendigerweise eine oder mehrere weitere Komponenten, die die immunologische Aktivität dieser aktiven Komponente verstärken. Ein Impfstoff kann zusätzlich weitere Komponenten enthalten, die typisch für pharmazeutische Zusammensetzungen sind. Die immunologisch aktive Komponente eines Impfstoffes kann vollständige lebende Organismen entweder in ihren ursprünglichen Form oder in Form von abgeschwächten Organismen in einem sogenannten modifizierten Lebendimpfstoff (MLV) oder Organismen, die durch geeignete Verfahren inaktiviert worden sind, in einem sogenannten abgetöteten Impfstoff (KV) umfassen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die immunologisch aktive Komponente eines Impfstoffes geeignete Elemente dieser Organismen umfassen (Untereinheit-Impfstoffe), wobei diese Elemente erzeugt werden, entweder durch Zerstörung des vollständigen Organismus oder der Wachstumskulturen von derartigen Organismen und anschließende Reinigungsstufen, die zu den erwünschten Strukturen führen, oder durch Syntheseverfahren, die durch eine geeignete Manipulation eines entsprechenden Systems, wie (ohne Beschränkung hierauf) Bakterien, Insekten, Säugetiere oder andere Spezies, induziert worden sind, und durch anschließende Isolations- und Reinigungsverfahren oder durch Induktion dieser synthetischen Verfahren im Tier, das eines Impfstoffes bedarf, unter direkter Einverleibung von genetischem Material, wobei man geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet (Polynucleotid-Impfung). Ein Impfstoff kann eines der vorstehend beschriebenen Elemente oder gleichzeitig mehr als eines dieser Elemente enthalten.
  • Bei zusätzlichen Komponenten zur Verstärkung der Immunreaktion handelt es sich um Bestandteile, die üblicherweise als Adjuvantien bezeichnet werden, wie Aluminiumhydroxid, Mineralöle oder andere Öle oder Hilfsmoleküle, die dem Impfstoff zugesetzt oder vom Körper nach entsprechender Induktion durch derartige zusätzliche Komponenten erzeugt werden, wie (ohne Beschränkung hierauf) Interferone, Interleukine oder Wachstumsfaktoren.
  • Eine "pharmazeutische Zusammensetzung" besteht im wesentlichen aus einem oder mehreren Bestandteilen, die zu einer Modifikation von physiologischen, z. B. immunologischen, Funktionen des Organismus, dem sie verabreicht werden, oder von Organismen, die im Organismus oder an dessen Oberfläche leben, befähigt sind, wie (ohne Beschränkung hierauf) Antibiotika und Antiparasitika, sowie aus anderen Bestandteilen, die zugesetzt werden, um bestimmte andere Ziele zu erreichen, wie (ohne Beschränkung hierauf) Verarbeitungsmerkmale, Sterilität, Stabilität, Eignung zur Verabreichung der Zusammensetzung auf enteralem oder parenteralem Wege, wie oral, intranasal, intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal oder auf einem anderen geeigneten Wege, Verträglichkeit nach der Verabreichung und kontrollierte Freisetzungseigenschaften.
  • Ein erfindungsgemäßer Impfstoff bezieht sich auf einen Impfstoff gemäß der vorstehenden Definition, wobei es sich bei einer immonologisch aktiven Komponente um ein Pestivirus oder um eine Komponente pestiviralen Ursprungs handelt.
  • Der Ausdruck "Lebendimpfstoff" bezieht sich auf einen Impfstoff, der eine lebende und insbesondere eine lebende, virale aktive Komponente enthält.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Pestivirus" bezieht sich auf sämtliche Pestiviren, die durch ihre Zugehörigkeit zur gleichen Gattung, wie BVDV, CSFV und BDV, innerhalb der Familie Flaviviridae und durch ihre Expression von Glycoprotein ERNS gekennzeichnet sind. Selbstverständlich bezieht sich der Ausdruck auch auf sämtliche Pestiviren gemäß der Charakterisierung von Becher et al. (1995) oder andere Pestiviren, die Glycoprotein ERNS exprimieren.
  • Der hier verwendete Ausdruck "RNase-Aktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit von Glycoprotein ERNS zur Hydrolyse von RNA.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass der Ausdruck Glycoprotein E0 in Publikationen häufig als Synonym für Glycoprotein ERNS verwendet wird.
  • Der Ausdruck "Inaktivierung der RNase-Aktivität, die in diesem Glycoprotein enthalten ist", bezieht sich auf die Unfähigkeit oder verringerte Fähigkeit eines modifizierten Glycoproteins ERNS zur Hydrolyse von RNA im Vergleich zum unmodifizierten Wildtyp dieses Glycoproteins ERNS.
  • Die Inaktivierung der RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, kann durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure des Glycoproteins erreicht werden, wie hier sowie von Hulst et al. (1998) gezeigt wird. Somit bezieht sich eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf Lebendimpfstoffe, wobei die RNase-Aktivität durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure dieses Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Es ist bekannt, dass das Glycoprotein ERNS ein disulfidgebundenes Homodimeres von etwa 97 kD bildet, wobei jedes Monomere aus 227 Aminosäuren besteht, die den Aminosäuren 268 bis 494 des CSFV-Polyproteins gemäß der Beschreibung von Rümenapf et al. (1993) entsprechen. Die ersten 495 Aminosäuren, die vom Alfort-Stamm von CSFV exprimiert werden, sind in 1 lediglich zu Vergleichszwecken dargestellt. Die Genomsequenz des Alfort-Stammes von CSFV ist bei der Datenbank GenBank/EMBL unter der Hinterlegungsnummer J04358 erhältlich. Alternativ ist die Aminosäuresequenz für den BVDV-Stamm CP7 bei der Datenbank GenBank/EMBL erhältlich (Hinterlegungsnummer U63479). Zwei Regionen von Aminosäuren sind in Glycoprotein ERNS hochgradig konserviert, sowie in einigen pflanzlichen und fungalen RNase-aktiven Proteinen (Schneider et al., 1993). Diese beiden Regionen sind von besonderer Bedeutung für die enzymatische RNase-Aktivität. Die erste Region besteht aus der Region der Aminosäuren in den Positionen 295 bis 307 und die zweite Region besteht aus den Aminosäuren in den Positionen 338 bis 357 dieses viralen Polyproteins gemäß der beispielhaften Darstellung in 1 für den Alfort-Stamm von CSFV (Nummerierung entsprechend der veröffentlichten abgeleiteten Aminosäuresequenz des CSFV-Stammes Alfort (Meyers et al., 1989).
  • Die vorstehend erwähnten Aminosäuren von besonderer Bedeutung für die RNase-Aktivität sind keinesfalls auf die genaue Position gemäß der Definition für den Alfort-Stamm von CSFV beschränkt, sondern werden lediglich in beispielhafter Weise verwendet, um auf die bevorzugten Aminosäuren hinzuweisen, die sich in diesen Positionen oder in Entsprechung zu diesen Positionen bei anderen Stämmen befinden, wie sie in BVDV, BDV und Pestiviren im allgemeinen auftreten, da sie hochgradig konserviert sind. Für Pestiviren, die sich vom CSFV-Alfort-Stamm unterscheiden, ist die Nummerierung der Positionen der bevorzugten Aminosäuren häufig unterschiedlich, jedoch kann ein Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie von Pestiviren leicht diese bevorzugten Aminosäuren aufgrund ihrer Position relativ zu den hochgradig konservierten Aminosäuren dieses Glycoproteins identifizieren. In einem speziellen, nicht-beschränkenden Beispiel ist die Position 346 von CSFV-Alfort identisch mit der Position 349 von BVDV-Stamm cp7.
  • Infolgedessen betrifft eine hier beschriebene besonders bevorzugte Ausführungsform einen Impfstoff, bei dem sich diese inaktivierenden Deletionen und/oder Mutationen an den Aminosäuren in den Positionen 295 bis 307 und/oder den Positionen 338 bis 357, gemäß den Angaben in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise oder an entsprechenden Positionen bei anderen Stämmen, dieses Glycoproteins befinden.
  • Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform beschreibt, dass die Inaktivierung dieser RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346 dieses Glycoproteins zu besonders wertvollen Lebendimpfstoffen führt. Daher betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoffe, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser in anderen Stämmen entspricht, dieses Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Die vorliegende Beschreibung zeigt, dass Pestiviren lebensfähig sind und für ein ERNS-Protein ohne RNase-Aktivität kodieren, wenn der Histidinrest in Position 346 des viralen Polyproteins (Nummerierung gemäß der veröffentlichten Sequenz von CSFV-Alfort/Tübingen (Meyers et al., 1989)), der einen der konservierten, mutmaßlichen Reste des aktiven Zentrums der ERNS-RNase darstellt, deletiert ist. Ferner wurde für die Erfindung nachgewiesen, dass die Deletion des entsprechenden Histidins in ERNS eines BVD-Pestivirus (Position 349, Nummerierung gemäß der Sequenz von BVDV CP7 GenBank/EMBL-Datenbank (Hinterlegungsnummer U63479)) zu einem lebensfähigen Virus führt, bei dem das ERNS-Glycoprotein die RNase-Aktivität verloren hat. Im Gegensatz zu Punktmutationen, bei denen eine Aminosäure gegen eine andere ausgetauscht wird, ist eine Deletionsmutante im allgemeinen in Bezug auf Revertanten wesentlich stabiler. Eine Infektion von Schweinen mit einer Mutante des pathogenen CSFV-Alfort/Tübingen, der ERNS exprimiert, mit dieser Deletion führte nicht zu Fieber oder anderen typischen klinischen Anzeichen für CSFV-Infektionen, während die Infektion mit Wildtypvirus zu Fieber, Diarrhoe, Anorexie, Apathie, Verarmung an B-Zellen und Störungen des Zentralnervensystems führte. Diese Schweine wurden 14 Tage nach der Inokulation in einem moribunden Zustand getötet. Dabei zeigten sie schwere Hämorrhagien in der Haut und inneren Organen. Die mit der Mutante infizierten Schweine zeigten bei Tests an den Tagen 3, 5, 7, 10 und 14 nach der Infektion weder eine Virämie noch eine Verarmung an B-Zellen, während CSFV leicht aus Blutproben von Schweinen, die mit dem Wildtypvirus inokuliert worden waren, isoliert werden konnte. Die Deletionsmutante vermehrte sich offensichtlich in den Tieren, wie die Induktion von neutralisierenden Antikörpern zeigt (vergl. Beispiel 3, Tabelle 3c). Die Immunreaktion auf das mutante Virus reichte aus, um ein Überleben bei einer letalen Belastung mit 2 × 105 TCID50 der hochgradig pathogenen Infektion mit dem CSFV-Stamm Eystrup (König, 1994), der heterolog zum Alfort-Stamm ist, zu ermöglichen. Außerdem zeigten die getesteten Tiere nach der Belastungsinfektion keine typischen klinischen Anzeichen für eine CSFV-Infektion, wie Fieber, Diarrhoe, Hämorrhagien, Verarmung an B-Zellen oder Anorexie. Diese Daten zeigen, dass eine Infektion von Schweinen mit einer Deletionsmutante eine Immunreaktion induziert, die für einen Schutz gegen eine stringente Belastung ausreichend ist.
  • Somit betrifft eine hier beschriebene, besonders bevorzugte Ausführungsform erfindungsgemäße Impfstoffe, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser in anderen Stämmen entspricht, dieses Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine weitere, hier beschriebene, besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft erfindungsgemäße BVDV-Impfstoffe, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser in anderen Stämmen entspricht, dieses Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft abgeschwächte Pestiviren, wobei die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure dieses Glycoproteins inaktiviert ist, mit der Maßgabe, dass es sich bei den Aminosäuren in Position 297 und/oder 346 des Glycoproteins, die in 1 für CSFV dargestellt sind, nicht um Lysin handelt. Ein rekombinantes Pestivirus, bei dem es sich bei den Aminosäuren in Position 297 und/oder 346 des Glycoproteins um Lysin handelt, wurde von Hulst et al. im Jahre 1998 beschrieben. Diese speziellen Pestiviren zeigten zytopathische Effekte in Schweinenierenzellen. Bis heute war man sich des überraschenden und innovativen, abschwächenden Merkmals aufgrund der Inaktivierung der enzymatischen ERNS-Aktivität nicht bewusst.
  • Eine hier beschriebene bevorzugte Ausführungsform betrifft aus den Gründen, die vorstehend für Impfstoffe angegeben wurden, ferner die hier bereitgestellten Pestiviren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletionen und/oder Mutationen der Aminosäuren in Position 295 bis 307 und/oder Position 338 bis 357, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt sind oder diesen in anderen Stämmen entsprechen, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine hier beschriebene, besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ferner aus den Gründen, die vorstehend für Impfstoffe angegeben wurden, die hier bereitgestellten Pestiviren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine hier beschriebene, ganz besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft aus den Gründen, die vorstehend für Impfstoffe angegeben wurden, ferner Pestiviren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine weitere, hier beschriebene, ganz besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft BVDV-Pestiviren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen BVDV-Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Die abgeschwächten Pestiviren und aktiven Komponenten der erfindungsgemäßen Impfstoffe lassen sich leicht durch rekombinante Nucleinsäure-Modifikationstechniken herstellen, die zur Expression einer mutanten Aminosäuresequenz in Glycoprotein ERNS führen. Daher betrifft ein weiterer, hier beschriebener Aspekt Nucleinsäuren, die für ein Glycoprotein ERNS kodieren, wobei die RNase-Aktivität, die im Glycoprotein enthalten ist, durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure des Glycoproteins inaktiviert ist, mit der Maßgabe, dass es sich bei den Aminosäuren in Position 297 und/oder 346 des Glycoproteins, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm dargestellt sind, nicht um Lysin handelt.
  • Eine hier beschriebene bevorzugte Ausführungsform betrifft aus den Gründen, die vorstehend erwähnt wurden, die hier bereitgestellten Nucleinsäuren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletionen und/oder Mutationen von Aminosäuren, die sich in den Positionen 295 bis 307 und/oder den Positionen 338 bis 357, die in 1 in beispielhafter Weise für den CSFV-Alfort-Stamm dargestellt sind oder diesen in anderen Stämmen entsprechen, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine weitere, hier beschriebene, bevorzugte Ausführungsform betrifft aus den vorstehend für Impfstoffe erwähnten Gründen die hier bereitgestellten Nucleinsäuren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine hier beschriebene, besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft die hier bereitgestellten Nucleinsäuren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine weitere, hier beschriebene, besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft erfindungsgemäße BVDV-Nucleinsäuren, bei denen die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Nucleotide, z. B. DNA oder RNA, eignen sich auch zur Herstellung von DNA-, RNA- und/oder Vektor-Impfstoffen. Bei diesen Impfstoffen werden die Nucleotide direkt auf das Tier oder indirekt über Vektoren, die sich vom ursprünglichen Virus unterscheiden, angewandt. Nucleotid-Impfstoffe und Vektor-Impfstoffe sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden hier nicht weiter erläutert.
  • Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Nucleinsäuren zur Herstellung von Nucleotid- und/oder Vektor-Impfstoffen.
  • Die hier beschriebenen Impfstoffe, abgeschwächten Pestiviren und/oder Nucleinsäuren eignen sich insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Demzufolge betrifft ein weiterer hier beschriebener Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Impfstoff der hier bereitgestellten Art enthalten, und/oder ein hier bereitgestelltes Pestivirus und/oder eine hier bereitgestellte Nucleotidsequenz.
  • Ein nicht-beschränkendes Beispiel für eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung, die hier lediglich zu Erläuterungszwecken angegeben wird, lässt sich folgendermaßen herstellen: Zellkulturüberstand einer infizierten Zellkultur wird mit einem Stabilisator (z. B. Spermidin und/oder BSA (Rinderserumalbumin)) vermischt und das Gemisch wird anschließend lyophilisiert oder durch andere Verfahren dehydratisiert. Vor der Impfung wird das Gemisch sodann in wässrigen Lösungen (z. B. Kochsalzlösung, PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)) oder nicht-wässrigen Lösungen (z. B. Ölemulsionen, Adjuvans auf Aluminiumbasis) rehydratisiert.
  • Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft ein Verfahren zur Abschwächung von Pestiviren. Die Erfindung stellt ein besonderes und überraschendes Verfahren zum Abschwächen von Pestiviren bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird.
  • Die spezifisch abgeschwächten Pestiviren eignen sich insbesondere zur Herstellung von Impfstoffen. Daher betrifft ein weiterer hier beschriebener Aspekt Verfahren zur Herstellung eines spezifisch abgeschwächten Pestivirus-Impfstoffes, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird.
  • Die Inaktivierung der RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, ergibt ein überraschendes und neues Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird. Das Merkmal der fehlenden RNase-Aktivität in Glycoprotein ERNS von erfindungsgemäßen Pestiviren ermöglicht nunmehr eine nachweisbare Markierung dieser Pestiviren. Markierte und unmarkierte Pestiviren oder ERNS, das aus mit dem Pestivirus infizierten Zellen in Körperflüssigkeiten sezerniert wird, lassen sich leicht durch Abwesenheit oder Anwesenheit von RNase-Aktivität der Glycoproteine ERNS nach Isolieren und Testen dieser enzymatischen Aktivität unterscheiden.
  • Für Pestiviren, deren RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, durch Deletion und/oder Mutation inaktiviert ist, lassen sich eine Anzahl von weiteren Techniken heranziehen. Derartige Pestiviren lassen sich leicht aufgrund der strukturellen Konsequenzen, die sich aus derartigen Deletionen und/oder Mutationen ergeben, nachweisen. Beispielsweise ist der Sequenzunterschied der Nucleinsäuresequenz von verändertem Glycoprotein ERNS durch Nucleinsäure-Sequenzierungstechniken oder PCR-Techniken (Polymerase-Kettenreaktion) nachweisbar, wie in Beispiel 8 belegt ist. Die veränderte Proteinsequenz lässt sich durch spezifische monoklonale Antikörper nachweisen, die unveränderte Proteine nicht erkennen. Umgekehrt ist es auch möglich, die veränderten und dadurch strukturell markierten Proteine aufgrund des Fehlens der Bindung an spezifische monoklonale Antikörper, die unveränderte Glycoproteine ERNS erkennen, nachzuweisen mit der Maßgabe, dass die Anwesenheit von Pestiviren auf andere Weise festgestellt werden kann. Ferner führen selbstverständlich die Deletionen und/oder Mutationen, die in den markierten Viren die RNase-Aktivität aufheben, zu unterschiedlichen Immunreaktionen bei Tieren, verglichen mit den Reaktionen, die sich aus unmarkierten Pestivirus-Infektionen ergeben.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf Verfahren zum Abschwächen von Pestiviren, auf Verfahren zur Herstellung eines spezifisch abgeschwächten Pestivirus-Impfstoffes und auf Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoprotein ERNS, wobei die RNase-Aktivität durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure des Glycoproteins inaktiviert wird.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf Verfahren zum Abschwächen von Pestiviren, auf Verfahren zur Herstellung eines spezifisch abgeschwächten Pestivirus-Impfstoffes und auf Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die Deletionen und/oder Mutationen sich an den Aminosäuren in den Positionen 295 bis 307 und/oder den Positionen 338 bis 357, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt sind oder diesen in anderen Stämmen entsprechen, des Glycoproteins befinden.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf Verfahren zum Abschwächen von Pestiviren, auf Verfahren zur Herstellung eines spezifisch abgeschwächten Pestivirus-Impfstoffes und auf Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf Verfahren zum Abschwächen von Pestiviren, auf Verfahren zur Herstellung eines spezifisch abgeschwächten Pestivirus-Impfstoffes und auf Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt Impfstoffe und/oder weitere pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich insbesondere zur Prophylaxe und Therapie von Pestivirus-Infektionen bei Tieren eignen. Daher betrifft ein weiterer hier beschriebener Aspekt Verfahren zur Prophylaxe und Therapie von Pestivirus-Infektionen bei Tieren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass ein hier bereitgestellter Impfstoff oder ein anderes hier bereitgestelltes pharmazeutisches Präparat bei einem Tier, das einer derartigen Prophylaxe oder Therapie bedarf, angewandt wird.
  • Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch abgeschwächten Pestiviren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird.
  • Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch markierten Pestiviren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch abgeschwächten Pestiviren und auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch markierten Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die RNase-Aktivität durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure des Glycoproteins inaktiviert wird.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch abgeschwächten Pestiviren und auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch markierten Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die Deletionen und/oder Mutationen sich an den Aminosäuren in den Positionen 295 bis 307 und/oder den Positionen 338 bis 357, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt sind oder diesen in anderen Stämmen entsprechen, des Glycoproteins befinden.
  • Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch abgeschwächten Pestiviren und auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch markierten Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für sämtliche Aspekte, die sich auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch abgeschwächten Pestiviren und auf ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch markierten Pestiviren gemäß der Erfindung beziehen, betrifft Verfahren zur Inaktivierung des Glycoproteins ERNS, wobei die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidinrestes in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser Position in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert ist.
  • Die hier beschriebenen Impfstoffe oder anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen eignen sich zur Prophylaxe und Therapie von Pestivirus-Infektionen bei Tieren.
  • Daher betrifft ein hier beschriebener Aspekt die Verwendung eines hier bereitgestellten Impfstoffes zur Prophylaxe und Therapie von Pestivirus-Infektionen bei Tieren. Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft die Verwendung einer hier bereitgestellten pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe und Therapie von Pestivirus-Infektionen bei Tieren.
  • Die hier bereitgestellten Pestiviren und/oder Nucleinsäuren stellen wertvolle aktive Komponenten einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Impfstoffes dar. Daher betrifft ein weiterer hier beschriebener Aspekt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Pestivirus und/oder einer hier bereitgestellten Nucleinsäure zur Herstellung eines Impfstoffes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Wie vorstehend erwähnt, führt die Inaktivierung der RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, zu einem überraschenden und neuen Verfahren zur Markierung von Pestiviren.
  • Infolgedessen betrifft ein hier beschriebener Aspekt Verfahren zum Unterscheiden der erfindungsgemäßen, nachweisbar markierten Pestiviren von unmarkierten und möglicherweise pathogenen Pestiviren. Derartige Verfahren eignen sich insbesondere zur Feststellung der Wirksamkeit von markierten Pestiviren bei Tieren. Ein mit einem Impfstoff behandeltes Tier erweist sich in Bezug auf die Markierung als positiv, nachdem eine Probe aus einem derartigen Tier erhalten und auf die Markierung getestet worden ist. Unmarkierte Tiere und insbesondere unmarkierte Tiere, die sich in Bezug auf das Pestivirus als positiv erweisen, können sofort ausgesondert, isoliert oder geschlachtet werden, um die drohende Gefahr der Ausbreitung der pathogenen Infektion auf andere Tiere zu beseitigen.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird. Das Merkmal, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, fehlt, ermöglicht nunmehr eine nachweisbare Markierung dieser Pestiviren. Infolgedessen lassen sich markierte und unmarkierte Pestiviren klar durch Abwesenheit oder Anwesenheit von RNase-Aktivität des Glycoproteins ERNS unterscheiden, indem man eine Isolierung und einen Test auf eine derartige enzymatische Aktivität vornimmt. Die Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit dieser enzymatischen Aktivität nach Gewinnen einer Probe, die ein Pestivirus von Interesse oder Material davon enthält, kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise gemäß den Angaben in Beispiel 2 oder gemäß Hulst et al. (1994).
  • Daher betrifft eine bevorzugte, hier beschriebene Ausführungsform ein Verfahren zum Unterscheiden von Pestivirus-infizierten Tieren von Tieren, die mit einem hier beschriebenen, spezifisch abgeschwächten Pestivirus geimpft worden sind, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
    • (1) Eine Probe aus einem Tier von Interesse, bei dem ein Verdacht auf eine Pestivirus-Infektion besteht, oder aus einem geimpften Tier wird gewonnen;
    • (2) die Anwesenheit oder Abwesenheit von RNase-Aktivität von Glycoprotein ERNS in der Probe wird bestimmt;
    • (3) die Abwesenheit von RNase-Aktivität von Glycoprotein ERNS korreliert mit einem geimpften Tier und die Anwesenheit dieser Aktivität korreliert mit einer Pestivirus-Infektion dieses Tiers.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Pestiviren bereit, deren RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, durch Deletion und/oder Mutation inaktiviert ist. Derartige Pestiviren lassen sich leicht aufgrund der strukturellen Konsequenzen, die sich aus derartigen Deletionen und/oder Mutationen ergeben, nachweisen. Der Sequenzunterschied des ERNS-Gens, das für das veränderte Glycoprotein ERNS kodiert, ist durch Sequenzierungstechniken oder PCR-Techniken nachweisbar. Infolgedessen betrifft eine hier beschriebene bevorzugte Ausführungsform ein Verfahren zum Unterscheiden von Pestivirus-infizierten Tieren von Tieren, die mit einem hier bereitgestellten, spezifisch abgeschwächten Pestivirus geimpft worden sind, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
    • (1) Eine Probe aus einem Tier von Interesse, bei dem ein Verdacht auf eine Pestivirus-Infektion besteht, oder aus einem geimpften Tier wird erhalten;
    • (2) die Nucleotidsequenz eines Pestivirus-Genoms oder ein Protein in der Probe werden identifiziert;
    • (3) die Deletionen und/oder Mutationen der ERNS-Nucleotidsequenz, die im Impfstoff vorliegen, korrelieren mit einem geimpften Tier und die Abwesenheit dieser Deletionen und/oder Mutationen korreliert mit einer Pestivirus-Infektion des Tiers.
  • Ferner lassen sich die strukturellen Änderungen, die sich aus der veränderten Proteinsequenz des Glycoproteins ERNS der hier bereitgestellten Pestiviren ergeben, leicht durch spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper, die unveränderte Proteine nicht erkennen, nachweisen. Daher betrifft eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Beschreibung ein Verfahren zur Unterscheidung von Pestivirus-infizierten Tieren von Tieren, die mit einem hier bereitgestellten abgeschwächten Pestivirus geimpft worden sind, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
    • (1) Eine Probe aus einem Tier von Interesse, bei dem ein Verdacht auf eine Pestivirus-Infektion besteht, oder aus einem geimpften Tier wird gewonnen;
    • (2) ein modifiziertes ERNS-Glycoprotein eines abgeschwächten Pestivirus wird durch die spezifische Bindung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern an ERNS-Glycoproteine, die in der Probe vorhanden sind, identifiziert, wobei die Glycoproteine durch ein hier beschriebenes Verfahren modifiziert worden sind, wobei die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper nicht an unmodifizierte ERNS-Glycoproteine binden;
    • (3) die spezifische Bindung der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper korreliert mit einem geimpften Tier und das Fehlen einer Antikörperbindung korreliert mit einer Pestivirus-Infektion des Tiers, mit der Maßgabe, dass die Anwesenheit von pestiviralem Material im Tier oder in der Probe anderweitig festgestellt wird.
  • Umgekehrt ist es ferner möglich, die veränderten und dadurch strukturell markierten Proteine aufgrund der Abwesenheit der Bindung an spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper, die nur unveränderte Glycoproteine ERNS erkennen, nachzuweisen, wenn die Anwesenheit von Pestiviren auf andere Weise festgestellt werden kann. Eine hier beschriebene bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren, mit dem Pestivirus-infizierte Tiere von Tieren, die mit einem hier bereitgestellten abgeschwächten Pestivirus geimpft worden sind, unterschieden werden, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
    • (1) Eine Probe wird von einem Tier von Interesse, bei dem ein Verdacht auf eine Pestivirus-Infektion besteht, oder von einem geimpften Tier gewonnen;
    • (2) ein unmodifiziertes ERNS-Glycoprotein eines Pestivirus wird durch die spezifische Bindung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern an ERNS-Glycoproteine, die in der Probe vorhanden sind, identifiziert, wobei die Glycoproteine nicht durch ein hier bereitgestelltes Verfahren modifiziert worden sind, wobei die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper nicht an die modifizierten ERNS-Glycoproteine binden;
    • (3) die spezifische Bindung der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper korreliert mit einer Pestivirus-Infektion im Tier und die fehlende Antikörperbindung mit einem geimpften Tier, mit der Maßgabe, dass das Vorliegen von pestiviralem Material im Tier und/oder der Probe auf andere Weise festgestellt werden kann.
  • Selbstverständlich führt die strukturelle Modifikation und das Fehlen der RNase-Aktivität in markierten Viren zu unterschiedlichen Immunreaktionen in Tieren, verglichen mit den Reaktionen, die sich aufgrund von unmarkierten Pestivirus-Infektionen ergeben. Die hier bereitgestellten Pestiviren rufen eine unterschiedliche und ausgeprägte Immunreaktion (sowohl zellulär als auch humoral) hervor, die sich von unmodifizierten und möglicherweise pathogenen Immunreaktionen unterscheidet. Beispielsweise führen die hier bereitgestellten Glycoproteine ERNS zu polyklonalen Antikörpern, die sich in ihrer Bindungsspezifität im Vergleich zu polyklonalen Antikörpern, die sich aus unmodifizierten Glycoproteinen ergeben, unterscheiden. Dieser Unterschied in der Bindungsspezifität ergibt eine Markierung zur Unterscheidung zwischen Tieren, die mit den hier bereitgestellten Pestiviren geimpft worden sind, und Tieren, die mit natürlichem Pestivirus infiziert worden sind. Tests zum Absuchen von Seren auf spezifische polyklonale Antikörper, die entweder an ein Wildtyp-Epitop oder an eine Marker-Deletionsmutation des Epitops binden, um zwischen infizierten und geimpften Tieren zu unterscheiden, wurden beschrieben, beispielsweise für mit Pseudotollwut infizierte und geimpfte Schweine (Kit et al., 1991).
  • Eine hier beschriebene bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Unterscheiden von Pestivirus-infizierten Tieren von Tieren, die mit einem hier bereitgestellten abgeschwächten Pestivirus infiziert worden sind, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
    • (1) Eine Probe von polyklonalen Antikörpern eines Tiers von Interesse, bei dem ein Verdacht auf eine Pestivirus-Infektion besteht, oder von einem geimpften Tier wird erhalten;
    • (2) eine etwaige spezifische Bindung der polyklonalen Antikörper an unmodifiziertes Glycoprotein ERNS oder Glycoprotein ERNS, das gemäß der vorliegenden Beschreibung modifiziert worden ist, wird identifiziert;
    • (3) die Bindung der polyklonalen Antikörper an unmodifiziertes Glycoprotein ERNS korreliert mit einer Pestivirus-Infektion und die Bindung der polyklonalen Antikörper an Glycoprotein ERNS, das gemäß der vorliegenden Beschreibung modifiziert worden ist, korreliert mit einem geimpften Tier.
  • References
    • 1. Baker, J.C. 1987. Bovine viral diarrhea virus: a review. J. Am. Vet. Med.Assoc. 190: 1449–1458.
    • 2. Becher, P., König, M., Paton, D.J., Thiel, H.J., 1995, Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pesivirus. Virology 209 (1), 200–206.
    • 3. Donis, R.O., Corapi, W., and Dubovi, E.J. 1988. Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus bind to the 56K to 58K glycoprotein. J. Gen. Virol. 69: 77–86.
    • 4. Fuerst T.R. et al. 1986. Eukaryotic transient expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8122–8126.
    • 5. Hulst, M.M., Himes, G., Newbigin, E., Moormann, R.J.M. 1994. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclease. Virology 200: 558–565.
    • 6. Hulst, M.M., F.E. Panoto, A. Hooekmann, H.G.P. van Gennip., and Moormann, R.J.M. 1998. Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Erns of classical swine fever virus results in a cytopathogenic virus. J. Virol. 72: 151–157.
    • 7. Kit, M. and S. Kit. 1991. Sensitive glycoprotein gIII blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease) -infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiology 28:141–155.
    • 8. Kunkel, T. A., J. D. Roberts, and R. A. Zakour. 1987. Rapid and efficient sitespecific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154:367–392.
    • 9. König, Matthias, 1994, Virus der klassischen Schweinepest: Untersuchungen zur Pathogenese und zur Induktion einer protektiven Immunantwort. Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, Germany.
    • 10. Meyers, G., Rümenapf, T. and Thiel, H.-J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555–567.
    • 11. Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H.-J., & Kümmerer, B.M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606–8613.
    • 12. Meyers, G., Thiel, H.-J., and Rümenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67:7088–709526.
    • 13. Moennig, V. and Plagemann, J. 1992. The pestiviruses. Adv. Virus Res. 41: 53–91.
    • 14. Paton, D.J., Lowings, J.P., Barrett, A.D. 1992. Epitope mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763–772.
    • 15. Pellerin, C. et. al. Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities, Virology 203, 1994:260–268.
    • 16. Rice, C.M. 1996. The pestiviruses. In Fields Virology, eds. Fields, B.N., Knipe, D.M., & Howley, P.M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 931–959.
    • 17. Rümenapf, T., Unger, G., Strauss, J.H., and Thiel, H.-J. 1993. Processing of the evelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67: 3288–3294
    • 18. Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H.-J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169–1171.
    • 19. Thiel, H.-J., Plagemann, G.W., & Moennig, V. 1996. The pestiviruses. In Fields Virology, eds. Fields, B.N., Knipe, D.M., & Howley, P.M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 1059–1073.
    • 20. Thiel, H.-J., Stark, R., Weiland, E., Rümenapf, T. & Meyers, G. 1991. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus. J. Virol. 65: 4705–4712.31.
    • 21. van Rijn, P.A., van Gennip, H.G., de Meijer, E.J., Moormann, R.J. 1993. Epitope mapping of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Virol. 74: 2053–2060.
    • 22. Weiland, E., Thiel, H.-J., Hess, G., and Weiland, F. (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies agaist bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237–244.
    • 23. Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rümenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H.-J. (1990). Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563–3569.
    • 24. Weiland, E., Ahl, R., Stark, R., Weiland, F. and Thiel, H.-J. (1892). A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus. J. Virology 66, 3677–3682.
    • 25. Windisch, J.M., Schneider, R., Stark, R., Weiland, E., Meyers, G., and Thiel, H.-J. 1996. RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: 352–358
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Erzeugung von RNase-negativen Pestivirus-Mutanten
  • Ausgehend von den cDNA-Klonen von voller Länge, nämlich pA/CSFV (Meyers et al., 1996a) oder pA/BVDV (Meyers et al., 1996b), aus denen sich infektiöse cRNA durch in vitro-Transkription erhalten lässt, wurden Subklone erzeugt. Für CSFV wurde ein XhoI/SspI-Fragment von pA/CSFV in pBluescript SK+, das mit XhoI und SmaI geschnitten war, kloniert. Für BVDV wurde ein XhoI/BglII-Fragment aus pA/BVDV in das Plasmid pCITE-2C, das mit den gleichen Enzymen geschnitten war, kloniert. Einzelsträngige Plasmid-DNA wurde aus diesen Konstrukten gemäß dem Verfahren von Kunkel (Kunkel et al., 1987) unter Verwendung von E. coli CJ 236-Zellen (BioRad) und des einzelsträngigen VCMS-Phagen (Stratagene) erzeugt. Die einzelsträngige DNA wurde unter Verwendung des "Phagemid in vitro Mutagenesis Kits" (BioRad) in Doppelstränge umgewandelt. Einige der synthetischen Oligonucleotide, die wir als Primer für die Erzeugung der angestrebten Pestivirus-Mutanten verwendeten, sind nachstehend in beispielhafter Weise aufgeführt:
    Figure 00200001
  • Die doppelsträngige Plasmid-DNA wurde zur Transformation von E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene) verwendet. Bakterielle Kolonien, die die Plasmide enthielten, wurden durch Ampicillin-Selektion isoliert. Plasmid-DNA wurde hergestellt und weiter durch Nucleotidsequenzierung unter Verwendung des T7-Polymerase-Sequenzierungskits (Pharmacia) analysiert. Plasmide, die die angestrebten Mutationen und keine weiteren Veränderungsstellen enthielten, wurden für die Konstruktion von cDNA-Klonen von voller Länge verwendet. Im Fall von CSFV, wurde ein XhoI/NdeI-Fragment aus dem mutagenisierten Plasmid zusammen mit einem NdeI/BglII-Fragment, das vom Plasmid 578 (pCITE 2A, enthaltend das XhoI/BglII-Fragment aus pA/CSFV) abgeleitet war, in pA/CSFV, das mit XhoI und BglII geschnitten war, inseriert. Um die BVDV-CP7-Mutante zu erhalten, wurde ein XhoI/BglII-Fragment, das die Deletion enthielt, in pA/BVDV, das mit XhoI und NcoI geschnitten war, zusammen mit einem BglII/NcoI-Fragment, das aus pA/BVDV/Ins– isoliert worden war, inseriert. Aus dem Konstrukt pA/BVDV/Ins– wurde eine cRNA transkribiert, die bei Transfektion in geeignete Zellen zu einem nicht-zytopathogenen BVDV führt (Meyers et al., 1996b).
  • Die verschiedenen Klone von voller Länge wurden amplifiziert und die Plasmide wurden isoliert. Das Vorliegen der angestrebten Mutationen wurde durch DNA-Sequenzierung nachgewiesen. Nach Linearisierung mit SrfI (CSFV-Klone von voller Länge) oder SmaI (BVDV-Klone von voller Länge) wurde die cRNA gemäß Literaturangaben transkribiert (Meyers et al., 1996ab). RNA wurde durch Gelfiltration und Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und für die Transfektion von Schweinenierenzellen (PK15) oder Rindernierenzellen (MDBK-Klon B2) verwendet (CSFV- bzw. BVDV-Konstrukte). Die Transfektionen wurden durch Immunofluoreszenz mit virusspezifischen Antiseren analysiert. In Fällen, bei denen die angestrebten Mutanten gewonnen werden konnten (Immunofluoreszenz-positiv), wurden die Viren durch Passage an den gleichen Zelllinien, die für die Transfektionsexperimente verwendet worden waren, amplifiziert. Eine weitere Analyse der CSFV-Mutanten umfasste die Bestimmung von einstufigen Wachstumskurven und die Charakterisierung von viraler RNA durch Northern-Blot mit virusspezifischen cDNA-Sonden sowie die reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und die anschließende Sequenzierung der PCR-Fragmente, um das Vorliegen der angestrebten Mutationen im viralen Genom zu bestätigen. In sämtlichen Fällen wurde das Vorliegen der angestrebten Mutation nachgewiesen. Alle gewonnenen Viren wuchsen gleichermaßen gut und erzeugten ähnliche Mengen an RNA, ebenso wie das Virus, das sich aus dem Plasmid mit der Wildtypsequenz ergab.
  • Die Lebensfähigkeit der BVDV-Mutante wurde durch Transfektion der entsprechenden cRNA und durch Aufteilung der Zellen nach 3 Tagen nachgewiesen. Ein Teil der Zellen wurde auf eine Schale von 3,5 cm Durchmesser überimpft, am nächsten Tag mit Aceton/Methanol fixiert und durch Immunofluoreszenz mit einem Gemisch von BVDV-spezifischen, monoklonalen Antikörpern analysiert (Weiland et al., 1989). Sämtliche Zellen erwiesen sich als positiv, während eine Kontrolle mit Zellen, die mit nicht-infektiöser RNA transfiziert worden waren, kein Signal ergab. Aus einem Teil der Zellen, die mit der entsprechenden cRNA transfiziert waren, wurde ein Extrakt durch einen einzigen Einfrier- und Auftauzyklus erzeugt. Frische Zellen wurden mit diesem Zellextrakt infiziert. Sie erwiesen sich 3 Tage nach der Infektion bei BVDV-spezifischer Immunofluoreszenz als BVDV-positiv.
  • In Tabelle 1 sind die verschiedenen Veränderungen dargestellt, die in die konservierten Sequenzen von ERNS eingeführt worden sind, die das mutmaßliche aktive Zentrum der RNase, die durch die angegebenen Virusmutanten kodiert wird, repräsentieren. Tabelle 1
    Figure 00230001
  • Legende zu Tabelle 1:
  • Der Test auf RNase-Aktivität wurde in einem transienten Test durchgeführt. BHK21-Zellen wurden mit Vaccinia-Virus vTF7-3 (Fuerst et al, 1986) infiziert und sodann mit dem entsprechenden cDNA-Konstrukt transfiziert (5 μg Plasmid-DNA, Transfektion unter Verwendung von Superfect gemäß den Empfehlungen des Lieferanten (Qiagen)). Nach 10-stündiger Inkubation bei 37 °C in einem CO2-Inkubator wurden die transfizierten Zellen lysiert und zur Bestimmung der RNase-Aktivität gemäß den nachstehenden Angaben verarbeitet. Die Lebensfähigkeit wurde auf die nachstehend angegebene Weise bestimmt.
  • Beispiel 2
  • Einfluss von verschiedenen Mutationen auf die RNase-Aktivität von ERNS
  • Um den Einfluss der verschiedenen Mutationen auf die RNase-Aktivität von ERNS zu testen, wurden entsprechende Zellen mit den mutanten Viren infiziert. Für CSFV wurde die Infektion mit einem MOI-Wert ("multiplicity of infection") von 0,01 durchgeführt. Eine Infektion mit Wildtyp-Virus diente als positive Kontrolle, während nicht-infizierte Zellen als negative Kontrolle verwendet wurden. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen 2-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 0,4 ml Lysispuffer (20 mM Tris/HCl; 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mg/ml Rinderserumalbumin; 1 % Triton X100; 0,1 % Desoxycholsäure; 0,1 % Natriumdodecylsulfat) lysiert. Das Lysat wurde in 1,5 ml fassende Reaktionsröhrchen gegeben, einer Ultraschallbehandlung unterzogen (Branson-Ultraschallgerät B12, 120 Watt, 20 s in einem "cup horn"-Wasserbad), durch Zentrifugation geklärt (5 min, 14 000 U/min, Eppendorf-Zentrifuge, 4 °C). Der Überstand wurde einer Ultrazentrifugation unterworfen (Beckmann-Tischultrazentrifuge, 60 min bei 4 °C und 45 000 U/min in einem TLA 45-Rotor). Die Bestimmung der RNase-Aktivität wurde in einem Gesamtvolumen von 200 μl mit einem Gehalt an 5 oder 50 μl Überstand der zweiten Zentrifugationsstufe und 80 μg Poly(rU) (Pharmacia) in RNase-Testpuffer (40 mM Tris-Acetat (pH-Wert 6,5), 0,5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreit (DTT)) durchgeführt. Nach 1-stündiger Inkubation des Reaktionsgemisches bei 37 °C wurden 200 μl 1,2 M Perchlorsäure und 20 mM LaSO4 zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurde das Gemisch 15 Minuten bei 4 °C und 14 000 U/min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 3 Volumenteilen Wasser versetzt. Ein Aliquotanteil des Gemisches wurde durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm unter Verwendung eines Ultrospec 3000-Spektrophotometers (Pharmacia) analysiert. In sämtlichen Fällen beseitigten die in das ERNS-Gen eingeführten Mutationen vollständig die RNase-Aktivität (Tabelle 1).
  • Für die BVDV-Mutante wurde die RNase-Aktivität mit Material getestet, das nach RNA-Transfektion ohne Passage der gewonnenen Viren erhalten worden war. Zellen, die mit der entsprechenden RNA transfiziert waren, wurden 72 Stunden nach der Transfektion aufgeteilt und auf zwei Schalen überimpft. 24 Stunden später wurden aus einer Schale Zellextrakte hergestellt und auf RNase-Aktivität gemäß den vorstehenden Angaben analysiert. Zum Nachweis der Infektion wurden die Zellen der zweiten Schale durch Immunofluoreszenz mit BVDV-spezifischen, monoklonalen Antikörpern analysiert (Weiland et al., 1989). Sie wurden zu 100 % als positiv befunden. Eine Transfektion wurde mit RNA, die aus pA/BVDV/Ins– und aus pA/B-346-d (Plasmidäquivalent zu pA/BVDV/Ins–, jedoch mit der Deletion des Codons, entsprechend dem Codon 346 im CSFV-Alfort-Genom) transkribiert worden war, durchgeführt. Nicht-transfizierte MDBK-Zellen dienten als negative Kontrolle. Tabelle 2A Bestimmung der RNase-Aktivität von verschiedenen Viren
    Figure 00250001
    Figure 00250002
  • Beschreibung von Tabelle 2A:
  • PK15-Zellen wurden mit den angegebenen Viren mit einem MOI-Wert (multiplicity of infection) von 0,01 infiziert, 48 Stunden bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert und sodann lysiert und einem RNase-Test unterworfen. Die säurelösliche RNA, die sich aus der Inkubation mit den verschiedenen Zellextrakten ergab, wurde quantitativ durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm analysiert. Die festgestellten Unterschiede in der RNase-Aktivität waren nicht auf unterschiedliche Mengen an ERNS-Protein in den Proben zurückzuführen, da ähnliche Werte nach quantitativer Bestimmung von ERNS durch radioaktive Markierung, Immunopräzipitation und Analyse der Radioaktivität mit einem Phosphorimager-Gerät erhalten wurden. Außerdem veränderte eine Verringerung der ERNS-Konzentration im Test auf nur 1/10 der üblichen Menge nicht die erhaltenen OD-Werte in erheblichem Umfang, was zeigt, dass bei den gewählten Bedingungen der Test mit ERNS gesättigt war.
  • CSFV-Stamm-Alfort; sämtliche übrigen Viren wurden aus RNA gewonnen, die in vitro aus Plasmiden transkribiert worden war: z. B. C-WT aus pA/CSFV; C-297-L aus pA/C-297-L; und dergl.; C-346-d/Rs-Virus wurde aus pA/C-346-d/Rs (erzeugt durch Umkehr der Mutation in pA/C-346-d durch Austausch des entsprechenden cDNA-Fragments gegen das äquivalente Fragment, abgeleitet von pA/CSFV) gewonnen; Kontrolle: Extrakt von nicht-infizierten PK15-Zellen. Tabelle 2B
    Figure 00250003
  • Beschreibung der Tabelle 2B
  • MDBK-Zellen wurden mit in vitro-transkribierter RNA infiziert, 72 Stunden nach der Transfektion aufgeteilt und 24 Stunden später auf RNase-Aktivität analysiert. Eine Infektion der Zellen wurde durch Immunofluoreszenzanalyse gemäß den Angaben im Text nachgewiesen.
  • B-WT: Virus, gewonnen aus pA/BVDV/Ins–; B-346-d: Virus, gewonnen aus pA/B-346-d; Kontrolle: Extrakt von nicht-infizierten MDBK-Zellen.
  • Beispiel 3
  • Pathogenizität von CSFV nach RNase-Inaktivierung
  • Um zu testen, ob die Zerstörung der RNase-Aktivität die Pathogenizität von Pestiviren in ihrem natürlichen Wirt beeinflusst, wurden Tierexperimente mit mutantem V(pA/C-346-d) (C346-d in den Tabellen) durchgeführt. Virus, das aus dem CSFV-Klon von voller Länge ohne Mutation (V(pA/CSFV)) gewonnen worden war, wurde als positive Kontrolle verwendet (C-WT in den Tabellen). Für jede Mutante wurden drei Ferkel (Rasse: deutsche Landrasse; Körpergewicht etwa 25 kg) verwendet. Die Infektionsdosis betrug 1 × 105 TCID50 pro Tier. Zwei Drittel des Inokulats wurden intranasal (jeweils ein Drittel in ein Nasenloch) und das andere Drittel intramuskulär verabreicht. Die beiden Gruppen wurden in getrennten Isolieranlagen gehalten. Blut wurde den Tieren 2-mal vor der Infektion und an den Tagen 3, 5, 7, 10, 12 und 14 entnommen. Ferner wurde die Temperatur täglich aufgezeichnet (2). Die mit dem Wildtyp-Virus infizierten Tiere zeigten typische Symptome der klassischen Schweinepest, wie Fieber, Ataxie, Anorexie, Diarrhoe, Störungen des Zentralnervensystems, Hämorrhagien in der Haut (Tabelle 3a). Virus konnte aus dem Blut an den Tagen 3 (Tier #68) und an den Tagen 5, 7, 10, 14 (Tiere #68, #78, #121) gewonnen werden (Tabelle 3b). Die Tiere wurden in einem moribunden Zustand 14 Tage nach der Infektion getötet. Zu diesem Zeitpunkt konnten keine Virus-neutralisierende Antikörper nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu entwickelten die mit der Mutante infizierten Tiere keine klinischen Symptome (Tabelle 3a). Die Temperatur blieb während der gesamten Versuchsdauer normal (2) und die Tiere stoppten ihre Futteraufnahme nicht. Zu keinem Zeitpunkt konnte Virus aus dem Blut gewonnen werden. Trotzdem waren die Tiere klar infiziert und das Virus hatte sich höchstwahrscheinlich vermehrt, da sämtliche Tiere neutralisierende Antikörper entwickelten (Tabelle 3c). Tabelle 3a Klinische Anzeichen nach einer Testinfektion:
    Figure 00270001
  • Beschreibung zur Tabelle 3a:
  • 6 Ferkel (deutsche Landrasse; Körpergewicht etwa 25 kg) wurden in zwei Gruppen (jede Gruppe wurde getrennt gehalten) in die Studie aufgenommen. 3 Tiere wurden mit CSFV-WT (1 × 105 TCID50) und 3 Tiere mit C-346-d (1 × 105 TCID50) infiziert. Die rektale Temperatur und klinische Symptome wurden aufgezeichnet und sind in der Tabelle angegeben. n.a.: es wurde keine Nekropsie durchgeführt. Tabelle 3b Blutzellen-Virämie nach Testinfektion
    Figure 00270002
  • Beschreibung zu Tabelle 3b:
  • Blutzellen-Virämie wurde durch gemeinsame Züchtung von Blut mit PK15-Zellen nachgewiesen. Nach einer 72-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit eiskaltem Aceton/Methanol fixiert und durch Immunofluoreszenz mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für Glycoprotein E2 (mAb A18, Weiland et al., 1990) ist, analysiert. Tabelle 3c Entwicklung des CSFV-spezifischen Serumneutralisationstiters
    Figure 00280001
  • Beschreibung zu Tabelle 3c:
  • Antikörpertiter von Schweinen, die mit der Virus-Mutante C-346-d infiziert worden waren, bestimmt zu verschiedenen Zeitpunkten während des Tierversuchs:
    50 μl verdünntes Serum wurden mit 50 μl Medium mit einem Gehalt an 30 TCID50 des Virus (CSFV Alfort/Tübingen) vermischt. Nach 90-minütiger Inkubation bei 37 °C wurden 100 μl der Zellen (1,5 × 104 Zellen) zugegeben und das Gemisch wurde auf Platten mit 96 Vertiefungen überimpft. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit eiskaltem Aceton/Methanol fixiert und in Bezug auf eine Infektion durch Immunofluoreszenz mit einem für Glycoprotein E2 (mAb A18, Weiland et al., 1990) monoklonalen Antikörper analysiert. 69 Tage nach der Infektion wurden die Tiere mit 2 × 105 TCID50 des CSFV-Stammes Eystrup belastet. In der Tabelle ist die höchste Serumverdünnung, die zu einer vollständigen Neutralisation von zugesetztem Virus führt, angegeben.
  • Beispiel 4
  • Induktion von schützender Immunität durch Infektion mit RNase-negativem Virus
  • Um zu analysieren, ob die Infektion mit dem mutanten Virus zu einer schützenden Immunität geführt hat, wurde 9 Wochen nach der Infektion ein Belastungsversuch mit der CSFV-Mutante unter Verwendung eines hochgradig pathogenen, heterologen CSFV-Stammes (Stamm Eystrup, Herkunft: Behring) durchgeführt. 2 × 105 TCID50 Virus wurden für die Infektion verwendet. Diese Virusmenge erwies sich in mehreren vorhergehenden Versuchen als ausreichend, um eine letale Krankheit zu induzieren (König, 1994). Jedoch zeigten die Tiere, die vorher mit der CSFV-RNase-Mutante infiziert worden waren, nach Belastungsinfektion keine Krankheitssymptome. Es konnten weder Fieber (3) noch Virämie nachgewiesen werden, jedoch stellte eine Zunahme an neutralisierenden Antikörpern einen Hinweis auf eine produktive Infektion und auf eine Replikation des Belastungsvirus dar.
  • Beispiel 5
  • Bestätigung des Abschwächungsprinzips
  • Um zu zeigen, dass die beobachtete Abschwächung des mutanten Virus tatsächlich auf die Deletion des Histidins in Position 346 des Polyproteins zurückzuführen ist und nicht eine Folge einer nicht-identifizierten Mutation einer zweiten Stelle ist, wurde die Wildtypsequenz durch Austausch eines 1,6 kb-XhoI/NdeI-Fragments des Klons pA/C-346-d von voller Länge gegen das entsprechende Fragment von pA/CSFV, das die Wildtypsequenz aufweist, wiederhergestellt. Das aus pA/C-346-d ausgeschnittene Fragment wurde durch Nucleotidsequenzierung auf Mutationen analysiert. Mit Ausnahme der Deletion des Tripletts, das für Histidin 346 des Polyproteins kodiert, wurde kein Unterschied zur Wildtypsequenz festgestellt. Aus dem cDNA-Konstrukt mit der wiederhergestellten Mutante konnte Virus V(pA/C-346-d/Rs) gewonnen werden, der ein ebenso gutes Wachstum wie das Wildtyp-Virus und eine gleichwertige RNase-Aktivität aufwies (Tabelle 2A).
  • In einem zweiten Tierversuch wurde das wiedergewonnene Virus zur Infektion von Schweinen verwendet. Als Kontrolle wurde die Deletionsmutante verwendet. Es wurden erneut zwei Gruppen, die jeweils aus 3 Tieren bestanden, herangezogen. Da die Tiere (deutsche Landrasse, etwa 20 kg) jünger als die Tiere beim ersten Versuch waren, wurde dieses Mal 5 × 104 TCID50 für die Infektion verwendet. Erneut zeigten die mit der Mutante infizierten Tiere keine klinischen Symptome (Tabelle 5, 4). Nur ein Tier litt 1 Tag an Fieber. Dennoch entwickelten diese Tiere neutralisierende Antikörper und waren gegen eine letale CSFV-Belastung geschützt. Die Belastung wurde erneut durch Infektion mit 2 × 105 TCID50 des Belastungsstammes Eystrup vorgenommen. Die Tiere zeigten nach der Belastung keine klinischen Symptome und ihre Temperatur blieb normal (5). Im Gegensatz zu den mit der Deletionsmutante infizierten Schweinen entwickelten die mit dem wiedergewonnenen Wildtyp-Virus inokulierten Tiere letale klassische Schweinepest. 1 Tier musste 11 Tage nach der Infektion getötet werden, die beiden übrigen Tiere 3 Tage später. Sämtliche Tiere zeigten typische Symptome von klassischer Schweinepest, d. h. Fieber, Diarrhoe, Anorexie und pathologische Zeichen, wie Hämorrhagie in verschiedenen Organen, einschließlich den Nieren. Tabelle 5a Klinische Zeichen nach der Testinfektion
    Figure 00300001
  • Beschreibung zur Tabelle 5a:
  • 6 Ferkel (deutsche Landrasse; Körpergewicht etwa 20 kg) wurden in zwei Gruppen (jede Gruppe wurde getrennt unter Isolierbedingungen gehalten) in die Studie einbezogen. 3 Tiere wurden mit der Mutante C-346-d (5 × 104 TCID50) und 3 Tiere mit C-346-d/RS (5 × 104 TCID50) infiziert. C-346-d/RS wurde von der Mutante C-346-d durch Wiederherstellung der Wildtypsequenz des ERNS-Gens abgeleitet. Die rektale Temperatur und klinische Symptome wurden aufgezeichnet und zusammengestellt; n.a.: es wurde keine Nekropsie durchgeführt. Tabelle 5b Diagnostischer RNAse-Test mit Viren, die aus infizierten Tieren während der Virämie gewonnen wurden
    Figure 00300002
  • Viren, die 5 Tage nach der Infektion aus den Tieren 3 und 5 und 7 Tage nach der Infektion aus den Tieren 27, 28 und 30 beim Tierversuch #2 (beschrieben in Beispiel 5) gewonnen worden waren, wurden auf die vorstehend angegebene Weise in Gewebekultur vermehrt, titriert und auf RNase-Aktivität getestet. Nicht-infizierte PK15-Zellen und Zellen, die mit Wildtyp CSFV (Alfort) infiziert worden waren (Kontrolle) dienten als Kontrollen. Die Tiere 3 und 5 waren mit der Mutante C-297-K infiziert worden, während die Tiere 27, 28 und 30 mit der Mutante C-346-d/RS infiziert worden waren, wie in der Tabelle angegeben ist.
  • Beispiel 6
  • Einflüsse einer Doppelmutation innerhalb von ERNS
  • Um die Einflüsse einer Doppelmutation innerhalb von ERNS auf die Fähigkeit des jeweiligen Virus zur Replikation in seinem natürlichen Wirt und auf die Pathogenizität zu testen, wurde ein Tierversuch mit mutantem (V(pA/C-297-L/346-L) durchgeführt. Virus, das aus dem CSFV-Klon von voller Länge ohne Mutation gewonnen war (V(pA/CSFV), diente als positive Kontrolle. Für jede Mutante wurden drei Ferkel (Rasse: deutsche Landrasse; Körpergewicht etwa 25 kg) eingesetzt. Die Infektionsdosis betrug 1 × 105 TCID50 pro Tier; zwei Drittel des Inokulats wurden intranasal (ein Drittel in jedes Nasenloch) und ein Drittel intramuskulär verabreicht. Blut wurde den Tieren vor der Infektion (Tag 0) und an den Tagen 5, 8, 12 und 20 entnommen. Ferner wurde die Temperatur täglich aufgezeichnet (6). Die mit der Doppelmutante infizierten Tiere entwickelten keinerlei klinische Symptome und die Tiere stoppten ihre Futteraufnahme nie. Bei den Tieren trat während der gesamten Versuchsdauer kein Fieber auf (Tiere 45/2 und 45/3) mit Ausnahme beim Tier 45/1 am Tag 8, vermutlich aufgrund einer bakteriellen Infektion, die durch eine Verletzung an der rechten Hinterpfote verursacht worden war. Nach Behandlung dieses Tiers mit einem Antibiotikum am Tag 10 kehrte die Temperatur innerhalb von 1 Tag auf Normalwerte zurück (6). Bei sämtlichen Tieren wurde Virus aus dem Blut am Tag 5 gewonnen, während zu späteren Zeitpunkten keine Virämie nachgewiesen wurde (Tabelle 6a). Sämtliche Tiere entwickelten neutralisierende Antikörper (Tabelle 6b). Für das Tier 45/1 wurde der Neutralisationstiter erneut etwa 4,5 Monate nach der Infektion bestimmt. Es wurde ein Wert von 1:4374 festgestellt. Somit führte die Infektion mit der Doppelmutante zu einem lange anhaltenden immunologischen Gedächtnis. Tabelle 6a Test auf Virämie
    Figure 00310001
    Tabelle 6b Neutralisationstiter
    Figure 00310002
  • Beispiel 7
  • Immunogenizität und Abschwächungsprinzip des BVDV-Virus "B-346d"
  • Dieses Experiment war dazu bestimmt, das Abschwächungsprinzip sowie die Immunogenizität des BVDV-Virus "B-346-d" zu untersuchen, das aus pA/B-346-d gewonnen worden war, indem man ihn mit dem aus pA/BVDV/Ins– gewonnenen "B-WT"-Virus verglich. Das Virus "B-346-d" ist selbstverständlich in der ursprünglichen BVDV-Position 349 mutiert, jedoch als "B-346" bezeichnet, um die Position relativ zur CSFV-Alforf-Position 346 von 1 anzugeben.
  • Drei Gruppen von BVDV-seronegativen Tieren im Alter von 3–6 Monaten wurden ausgewählt. Die Gruppen 1 und 2 umfassten jeweils 5 Tiere, während die Gruppe 3 aus 3 Tieren bestand. Die Tiere der Gruppen 1 und 2 wurden durch Verabreichung von 2 × 106 TCID50 B-346-d (Gruppe 1) oder B-WT (Gruppe 2) in einem Volumen von 5 ml pro Verabreichungsweg infiziert. Die Tiere wurden intramuskulär (Glutealmuskel), intranasal und subkutan (über der Skapula) infiziert. Über einen Zeitraum von 14 Tagen nach der Infektion wurde die Virämie in beiden Gruppen durch Parameter, wie Blutzell-Virämie und Virus-Ablösung in nasalen Abstrichen überwacht. Zusätzlich wurden klinische Parameter, wie rektale Temperatur, Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen und allgemeine Gesundheitsparameter überwacht.
  • Die Schutzimmunität gegen eine Infektion mit einem antigenetisch heterologen und virulenten BVDV-Isolat (#13) wurde durch Belastungsinfektion 77 Tage nach der Infektion der Tiere der Gruppe 1 mit B-346-d untersucht. Tiere der Gruppe 3 dienten als Belastungskontrolle und wurden gemäß dem Verfahren für die Tiere von Gruppe 1 mit dem virulenten BVDV-Isolat infiziert. Das BVDV-Virus (#13) gehört zu einer unterschiedlichen antigenetischen Gruppe (Typ II), während das B-346-d-Virus zur antigenetischen Gruppe (Typ I) gemäß der Klassifikation von C. Pellerin et. al. (1994) gehört. Tiere der Gruppen 1 und 3 wurden durch Verabreichung von 2 × 106 TCID50 BVDV-Isolat (#13) in einem Volumen von 5 ml pro Verabreichungsweg infiziert. Die Tiere wurden auf intramuskulärem (Glutealmuskel), intranasalem und subkutanem Weg (über der Skapula) infiziert. Über einen Zeitraum von 14 Tagen nach der Infektion wurde die Virämie in beiden Gruppen durch Parameter, wie Blutzell-Virämie und Virus-Ablösung in nasalen Abstrichen überwacht. Zusätzlich wurden klinische Parameter, wie rektale Temperatur, Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen und allgemeine Gesundheitsparameter überwacht.
  • Nach der Infektion mit B-346-d zeigten die Tiere keine typischen klinischen Symptome einer BVDV-Infektion, wie einen Anstieg der rektalen Temperatur (Tabelle 7a) oder irgendwelche klinischen Atmungssymptome (nicht dargestellt).
  • Die verringerte Blutzell-Virämie (Tabelle 7b) und die Virus-Ablösung in nasalen Abstrichen (Tabelle 7c) deutete klar auf eine Abschwächung von B-346-d im Vergleich zu B-WT hin.
  • Das virulente BVDV-Isolat #13 induzierte bei den Tieren der Gruppe 3 eine starke Virämie mit typischen Anzeichen einer BVDV-Infektion; wie Anstieg der rektalen Temperatur innerhalb einer Zeitspanne von mehreren Tagen (Tabelle 7d), starke Leukopenie (Tabelle 7e), verlängerte Blutzell-Virämie (Tabelle 7f) und Virus-Ablösung in nasaler Abstrichflüssigkeit (Tabelle 7g). Im Gegensatz dazu zeigten Tiere der Gruppe 1, die durch Infektion mit B-346-d vakziniert worden waren, nach Belastungsinfektion mit dem virulenten BVDV-Isolat #13 fast keine klinischen Symptome, die für eine BVDV-Infektion typisch sind. Es gab keinen signifikanten Anstieg der reaktalen Temperaturen nach der Infektion (Tabelle 7d). Die beobachtete Leukopenie war in Bezug auf Stärke und Dauer nur marginal (Tabelle 7e). Aus dem Blut konnte kein BVDV isoliert werden (Tabelle 7f) und nur bei einem Tier konnte eine Virus-Ablösung im nasalen Abstrichexsudat nachgewiesen werden (Tabelle 7g).
  • Somit induziert eine Infektion mit B-346-d eine starke Immunität, was klinische Anzeichen, die Virus-Ablösung und die Blutzell-Virämie nach Belastungsinfektion mit einem heterologen BVDV-Isolat klar verringert. Tabelle 7a Durchschnittliche rektale Temperaturen in Gruppe 1 (B-346-d) und 2 (B-WT)
    Figure 00330001
  • Die Tiere der Gruppe 1 wurden am Tag 0 mit 6 × 106 TCID50 B-346-d infiziert, während die Tiere der Gruppe 2 mit 6 × 106 TCID50 B-WT infiziert wurden. Fig. 7b Blutzell-Virämie der Gruppen 1 und 2
    Figure 00340001
  • EDTA-Blut wurde täglich bis zum Tag 10 nach der Infektion mit B-346-d und B-WT in Form einer Probe entnommen. 0,2 ml Blut wurden jeweils zu drei Kulturen von Kälber-Testiszellen (Cte) mit Medium mit einem Gehalt an Heparin (1 Einheit/ml zur Verhinderung der Gerinnung) gegeben. Nach Inkubation über Nacht wurde das Inokulum/Medium durch frisches Medium ohne Heparin ersetzt. Nach einer Inkubation von 4 bis 6 Tagen wurden mit BVDV infizierte Zellen durch Immunofluoreszenz mit einem für BVDV spezifischen polyklonalen Serum nachgewiesen. Negative Kulturen wurden eingefroren und anschließend aufgetaut. 0,2 ml davon wurden einer zweiten Passage an Cte-Zellen unterzogen, um das Fehlen von BVDV zu bestätigen. Tabelle 7c Virus-Ablösung in nasaler Flüssigkeit
    Figure 00350001
  • Nasales Exsudat wurde zentrifugiert (1000 × g) um große Bruchstücke und Verunreinigungen zu entfernen. Überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und 0,2 ml wurden jeweils auf drei Zellkulturen überimpft. Nach Inkubation über Nacht wurde das Inokulum/Medium durch 2 ml frisches Medium ersetzt. Nach 4- bis 6-tägiger Inkubation wurden BVDV-infizierte Zellen durch Immunofluoreszenz mit einem für BVDV spezifischen polyklonalen Serum nachgewiesen. Tabelle 7d Durchschnittliche rektale Temperaturen der Gruppen 1 und 3
    Figure 00350002
  • Die rektalen Temperaturen wurden 16 Tage lang nach der Belastungsinfektion aufgezeichnet. Die Tiere der Gruppen 1 und 3 wurden mit 6 × 106 TCID50 des virulenten BVDV-Isolats #13 infiziert. Tabelle 7e Durchschnittliche Anzahl an weißen Blutkörperchen
    Figure 00350003
  • EDTA-Blutzellproben wurden vom Tag -2 bis 14 Tage nach der Belastung von jedem Tier beider Gruppen entnommen. Die Zählergebnisse der weißen Blutkörperchen in EDTA-Blutproben wurden unter Verwendung eines Sysmex Micro-Cell Counters F800 bestimmt. Tabelle 7f Aus Blutproben isoliertes BVDV
    Figure 00360001
  • EDTA-Blut wurde täglich bis zum Tag 10 nach der Belastung in Form einer Probe genommen. 0,2 ml Blut wurden jeweils zu drei Kulturen von Kälber-Testiszellen (Cte) mit Medium mit einem Gehalt an Heparin (1 Einheit/ml zur Verhinderung der Gerinnung) gegeben. Nach Inkubation über Nacht wurde das Inokulum/Medium durch frisches Medium ohne Heparin ersetzt. Nach einer Inkubation von 4 bis 6 Tagen wurden mit BVDV infizierte Zellen durch Immunofluoreszenz mit einem für BVDV spezifischen polyklonalen Serum nachgewiesen. Negative Kulturen wurden eingefroren und anschließend aufgetaut. 0,2 ml davon wurden einer zweiten Passage an Cte-Zellen unterzogen, um das Fehlen von BVDV zu bestätigen. Tabelle 7g Virus-Ablösung in nasaler Flüssigkeit
    Figure 00370001
  • Nasales Exsudat wurde zentrifugiert (1000 × g), um große Bruchstücke und Verunreinigungen zu entfernen. Überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und 0,2 ml wurden jeweils auf drei Zellkulturen überimpft. Nach Inkubation über Nacht wurde das Inokulum/Medium durch 2 ml frisches Medium ersetzt. Nach 4- bis 6-tägiger Inkubation wurden BVDV-infizierte Zellen durch Immunofluoreszenz mit einem für BVDV spezifischen polyklonalen Serum nachgewiesen.
  • Beispiel 8
  • Unterscheidung zwischen C-346-d und CSFV ohne Deletion des Histidin-Codons 346 durch RT-PCR
  • Die RNA-Sequenz, die für das konservierte RNase-Motiv in CSFV-Glycoprotein ERNS kodiert, ist hochgradig konserviert. Unter sämtlichen bekannten CSFV-Sequenzen wurden keine Nucleotid-Austauschvorgänge in der Region, die den Resten 1387 bis 1416 der veröffentlichten Sequenz des CSFV-Alfort-Stammes entspricht (Meyers et al., 1987), aufgefunden. Somit können Oligonucleotid-Primer, die sich von dieser konservierten Region des Genoms ableiten, in einem RT-PCR-Test zum Nachweis sämtlicher CSFV-Isolate verwendet werden (vergl. 7). Infolgedessen könnte die Abwesenheit des Tripletts, das für Histidin 346 (Nucleotide 1399–1401) kodiert, durch einen RT-PCR-Test mit einem in entsprechender Weise konzipierten Primer nachgewiesen werden. Verschiedene Oligonucleotide, die die konservierte Region abdecken, wurden so synthetisiert, dass sie entweder das Histidin-Codon enthielten oder nicht. Diese Oligonucleotide dienten als strangaufwärtige Primer in RT-PCR-Reaktionen mit dem Oligonucleotid ERNS-Stopp als stromabwärtigem Primer. RNAs, die aus Gewebekulturzellen gereinigt worden waren, die mit C-346-d, C-WT, C-346-L bzw. C-346-K infiziert waren, wurden als Matrizen verwendet. Eine reverse Transkription von 2 μg hitzedenaturierter RNA (2 min 92 °C, 5 min auf Eis in 11,5 μl Wasser in Gegenwart von 30 pmol reversem Primer) erfolgte nach Zugabe von 8 μl RT-Gemisch (125 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,3, 182,5 mM KCl, 7,5 mM MgCl2, 25 mM Dithiothreit, 1,25 mM jeweils an dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) und 50 U Superscript (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Deutschland), und zwar 45 min bei 37 °C. Nach Beendigung der reversen Transkription wurden die Röhrchen auf Eis gestellt und mit 30 μl PCR-Gemisch (8,3 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,3; 33,3 mM KCl; 2,2 mM MgCl2; 0,42 mM jeweils an dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0,17 % Triton X100; 0,03 % Rinderserumalbumin; 5 U Taq-Polymerase (Appligene, Heidelberg, Deutschland) und 16,7 % DMSO) versetzt. Bei Verwendung des Primers OI H+3 enthielt das Reaktionsgemisch für die Amplifikation kein DMSO. Die Amplifikation wurde in 36 Zyklen durchgeführt (30 sec 94 °C; 30 sec 57 °C; 45 sec 74 °C). 1 μl Amplifikationsreaktionsgemisch wurde auf 1 % Agarosegel aufgesetzt. Die amplifizierten Produkte wurden durch Elektrophorese getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Wie in 7 dargelegt, ermöglichte das Primerpaar OI H-3/OI ERNSStopp eine spezifische Amplifikation einer von RNA, die die Deletion des Codons 346 aufwies, abgeleiteten Bande, während bei den übrigen beiden Primerkombinationen Produkte mit einem Gehalt an dem Codon 346 amplifiziert wurden und keine Bande beobachtet wurde, wenn die RNA mit der Deletion dieses Codons als Matrize verwendet wurde.
  • Primer für RT-PCR:
    • strangaufwärtig
    • OI H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT
    • OI H+2: TGGAACAAACATGGATGG
    • OI H+3: GAATGGAACAAACATGGA
    • strangabwärts:
    • OI ERNSStopp: GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG
  • Legende zu den Figuren
  • 1: Die ersten 495 Aminosäuren gemäß Expression durch den Alfort-Stamm von CSFV
  • Die Sequenzliste zeigt die ersten 495 Aminosäuren gemäß Expression durch den Alfort-Stamm von CSFV (Meyers et al., 1989). Ein Monomeres des Glycoproteins ERNS dieses Stammes entspricht den Aminosäuren 268 bis 494 gemäß den Angaben von Rümenapf et al. (1993). Die Reste 295 bis 307 und 338 bis 357, die die Regionen mit Homologie zu Pflanzen- und Pilz-RNasen darstellen (Schneider et al., 1993), sind unterstrichen.
  • 2: Rektale Temperaturkurve von Tieren nach Testinfektion
  • Die tägliche rektale Temperatur wurde 2 Tage vor der Infektion bis 18 Tage nach der Infektion aufgezeichnet. Die rektale Temperaturkurve ist für die einzelnen Tiere der Gruppe, die mit dem Virus V(pA/CSFV) (durchgezogene Linie), abgeleitet vom Plasmid pA/CSFV, oder mit dem Virus V(pA/C-346-d), abgeleitet vorn Plasmid pA/C-346-d (punktierte Linie), transfiziert sind, wiedergegeben.
  • 3: Rektale Temperaturkurve von Tieren nach Belastungsinfektion
  • Die rektale Temperatur wurde täglich an den Tagen 1–21 nach der Belastungsvirusinfektion aufgezeichnet. Tiere, die mit einer letalen Dosis des CSFV-Belastungsstammes Eystrup belastet worden waren, waren gemäß den ausführlichen Angaben im Text 69 Tage vorher mit der Mutante C-346-d [V(pA/C-346-d)] infiziert worden. Die rektale Temperaturkurve ist für die einzelnen Tiere der Gruppe, die mit 2 × 105 TCID50 des CSFV-Belastungsstammes Eystrup belastet worden waren, aufgeführt.
  • 4: Rektale Temperaturkurve von Tieren nach einer Testinfektion
  • Die rektale Temperatur wurde täglich an den Tagen 0–18 nach der Belastungsvirusinfektion aufgezeichnet. Die rektale Temperaturkurve ist für die einzelnen Tiere der beiden Gruppen aufgeführt, die entweder mit C-346-d [V(pA/C-346-d)] (punktierte Linie) oder mit dem wiederhergestellten Virus C-346-d/RS [V(pA/C-346-d/Rs)] (durchgezogene Linie) infiziert worden waren.
  • 5: Rektale Temperatur nach Belastungsinfektion, Tierversuch #2
  • Die rektale Temperatur wurde täglich an den Tagen 1–10 nach der Belastungsvirusinfektion aufgezeichnet. Tiere, die mit einer letalen Dosis (2 × 105 TCID50) des CSFV-Belastungsstammes Eystrup belastet worden waren, waren 37 Tage vorher mit der Mutante C-346-d infiziert worden.
  • 6: Rektale Temperatur von Tieren, die mit einer Doppelmutante gemäß Beispiel 6 behandelt wurden
  • Die rektale Temperatur wurde täglich vor und nach Belastungsvirusinfektion mit der Mutante V(pA/C-297-L/346-L) aufgezeichnet.
  • 7: Unterscheidung zwischen C-346-d und CSFV ohne Deletion des Histidin-Codons 346 durch RT-PCR gemäß Beispiel 8
    • a) Das Primerpaar OI H-3/OI ERNSStopp ermöglicht eine spezifische Amplifikation einer Bande, die von RNA mit Deletion des Codons 346 (C-346-d) abgeleitet ist, wie ausführlich in Beispiel 8 beschrieben ist. Im Gegensatz dazu gibt es bei RNA, die diese Deletion nicht enthält, keine Wechselwirkung mit dem Primerpaar (C-WT, C-346-L, C-346-K).
    • b) und c) Die beiden übrigen Primerkombinationen (OI H+2 und OI H+3) amplifizieren Banden, die sich von RNA, die nicht die Deletion des Codons 346 enthält, ableitet (OI H+2 und OI H+3). Keine Bande lässt sich feststellen, wenn RNA aus der 346-Deletionsmutante C-346-d als Matrize verwendet wird.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
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  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001

Claims (4)

  1. Verfahren zum nachweisbaren Markieren von Pestiviren, dadurch gekennzeichnet, dass die RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, inaktiviert wird, wobei die RNase-Aktivität durch Deletionen und/oder Mutationen von mindestens einer Aminosäure des Glycoproteins inaktiviert wird, mit der Maßgabe, dass es sich bei den Aminosäuren in Position 297 und/oder 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt sind oder diesen in anderen Stämmen entsprechen, des Glycoproteins nicht um Lysin handelt, und wobei die Inaktivierung der RNase-Aktivität, die in Glycoprotein ERNS enthalten ist, zu einem abgeschwächten Pestivirus führt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Deletionen und/oder Mutationen sich an den Aminosäuren in Position 295 bis 307 und/oder Position 338 bis 357, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt sind oder diesen in anderen Stämmen entsprechen, des Glycoproteins befinden.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die RNase-Aktivität durch Deletion oder Mutation der Aminosäure in Position 346, die in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder dieser in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die RNase-Aktivität durch Deletion des Histidin-Restes in Position 346, der in 1 für den CSFV-Alfort-Stamm in beispielhafter Weise dargestellt ist oder diesem in anderen Stämmen entspricht, des Glycoproteins inaktiviert wird.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
EP1104676A1 (de) 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sichere abgeschwächte Rinderdiarrhöeviren zur Verwendung in trächtigen Kühen
PT1149901E (pt) 2000-04-21 2006-08-31 Akzo Nobel Nv Mutantes de pestivirus e vacinas contendo os mesmos
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
UY29915A1 (es) * 2005-11-15 2007-06-29 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna combinada que comprende un virus atenuado de la diarrea viral bovina
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
UY31930A (es) 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
US8815255B2 (en) 2008-10-31 2014-08-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of Mycoplasma bovis antigen
US8846054B2 (en) 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
UY32570A (es) 2009-04-24 2010-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna viva modificada de mycoplasma bovis mejorada
CN101915837B (zh) * 2010-07-28 2013-07-03 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
EP2618841B1 (de) 2010-09-21 2016-10-19 Intervet International B.V. Bvdv-impfstoff
CN103882051B (zh) * 2014-03-20 2016-04-06 北京市农林科学院 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒
EP3956439A4 (de) * 2019-04-18 2023-05-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. Rekombinantes klassisches schweinefiebervirus

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE342996T1 (de) * 1986-01-27 2006-11-15 Schering Plough Ltd Attenuierte herpesviren, herpesviren die eine aminosäuresequenz kodierende fremde dna enthalten,und diese enthaltende impfstoffe

Also Published As

Publication number Publication date
TR200003622T2 (tr) 2001-06-21
TR200103666T2 (tr) 2002-03-21
PT1084251E (pt) 2005-03-31
JP2010259445A (ja) 2010-11-18
ES2257476T3 (es) 2006-08-01
DE69928700T2 (de) 2006-06-22
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CN1304452A (zh) 2001-07-18
BR9911619B1 (pt) 2013-11-12
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CA2330241A1 (en) 1999-12-16
DE69929544D1 (de) 2006-04-13
EP1614423A2 (de) 2006-01-11
ES2253457T3 (es) 2006-06-01
WO1999064604A2 (en) 1999-12-16
ATE286131T1 (de) 2005-01-15
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EP1203812A2 (de) 2002-05-08
AR071880A2 (es) 2010-07-21
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CA2330241C (en) 2010-09-21
ATE311193T1 (de) 2005-12-15
EP1203813B1 (de) 2006-01-25
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DE69922953T2 (de) 2005-05-19
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JP4632540B2 (ja) 2011-02-16
BR9911619A (pt) 2001-10-02
PT1203813E (pt) 2006-06-30
KR20010071406A (ko) 2001-07-28
AR071881A2 (es) 2010-07-21

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