CZ301570B6 - Utlumený pestivirus - Google Patents

Utlumený pestivirus Download PDF

Info

Publication number
CZ301570B6
CZ301570B6 CZ20090293A CZ2009293A CZ301570B6 CZ 301570 B6 CZ301570 B6 CZ 301570B6 CZ 20090293 A CZ20090293 A CZ 20090293A CZ 2009293 A CZ2009293 A CZ 2009293A CZ 301570 B6 CZ301570 B6 CZ 301570B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lys
leu
thr
gly
glycoprotein
Prior art date
Application number
CZ20090293A
Other languages
English (en)
Inventor
Meyers@Gregor
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Publication of CZ301570B6 publication Critical patent/CZ301570B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Podstatu rešení tvorí utlumený pestivirus, v nemž je deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E.sup.RNS.n. delecemi a/nebo mutacemi alespon jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, pricemž uvedené delece a/nebo mutace k deaktivaci RNázové aktivity se nacházejí v polohách 295 až 307 a/nebo v polohách 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na Obr. 1 v prípade kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech za predpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu. Soucást rešení tvorí rovnež príslušná kódující nukleová kyselina. Dále se rešení týká použití popsaného utlumeného pestiviru pro prípravu farmaceutického prostredku pro profylaxi nebo lécení pestivirové infekce.

Description

Oblast techniky 5
Vynález se týká utlumeného (oslabeného, atenuovaného) pestivirů, v němž je deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein Ε^δ delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu. Vynález se dále týká odpovídající nukleové kyseliny, farmaceutického prostředku s obsahem popsaného pestivirů a použití utlumeného pestivirů pro io přípravu tohoto prostředku.
Dosavadní stav techniky
Pestiviry jsou kauzativní agens ekonomicky významných onemocnění zvířat v mnoha zemích po celém světě. V současné době známé virové izoláty se děli do tří různých druhů, které společně tvoří jeden rod v čeledi Flavivirídae.
I. Virus bovinní virové diarhey (BVDV) způsobuje bovinní virové průjmové (BVD) a one20 mocnění sliznic (MD) u telat (popisuje se v publikaci Baker, 1987; Moenning and Plagemann, 1992, Thiel et al., 1996).
II. Virus klasické prasečí horečky (CSFV), který se nazývá virus cholery suis (CSF), odpovídá za klasickou prasečí horečku (CSF) nebo choleru suis (HC) (popisuje se v publikaci
Moenning and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).
III. „Border disease virus*4 (BDV) se v typickém případě vyskytuje u ovcí a způsobuje „Border disease** (BD). Uvádí se, Že symptomy podobné MD u telat se také objevují po intrauterinní infekci u jehňat s BDV (popisuje se v publikacích Moenning and Plagemann, 1992, Thiel et al., 1996).
Za použití jiné klasifikace se pestiviry popisují v publikaci Becher, P., Konig, M., Paton, D. J., Thiel, H. J., 1995, Futher characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pestivirus. Virology 209 (1), 200-206 nebo v jiných publikacích.
Pestiviry jsou malé viry s obalem a s genomem tvořeným jednořetězcovou RNA pozitivní polarity, které chybí sekvence čepičky na 5'-konci a 3'poly(A). Virový genom kóduje polyprotein, který obsahuje přibližně 4 000 aminokyselin, přičemž úpravami při a po translaci vzniká konečný produkt Štěpení. Uvedené postupy zahrnuji buněčné a virové proteázy. Virové proteiny se uspořádaly do polyproteinu za účelem vzniku NH^H^-C- ERNS-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4ANS4B-NS5A-NS5B-COOH (popisuje se v publikaci Rice, C. M. 1996. The pestiviruses. ín Fields Virology, eds. Fields, Β. N., Knipe, D. M., and Howley, Ρ. M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 931-959). Protein C a glykoproteiny E™8, El a E2 reprezentují strukturální kompo45 nenty pestivirových virionú (Thiel, H. Jstark, R., Weiland, E., Rumenapf, T. and Meyers, G. 1991. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus. J. Virol. 65: 47054712.31). Zjistilo se, že E2 a v menším rozsahu E™8 tvoří cíle neutralizačních protilátek (popisuje se v publikaci Donis, R. O., Corapi, W., and Dubovi, E. J. 1988. Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus bind to the 56K to 58K glycoprotein. J. Gen. Virol. 69: 7750 86, Paton, D. J., Lowings, J. P., Barrett, A. D. 1992. Epitop mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763-772, van Rijn, P. A., van Gennipi, H. G., de Meijer, E. J., Moormann, R. J. 1993. Epitope mapping of envelope glycoprotein El of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Virol, 74: 2053-2060, Weiland, E„ Starte, R„ Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64,3563-3569).
-1CZ 301570 B6
Glykoproteinu ErnS chybí membránová kotva a vylučuje se v podstatném množství z infikovaných buněk. Uvádí se, že uvedený protein vykazuje aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., Himes, G., Newbigin, E:, Moormann, R. J. M. 1994. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and Identification as a ríbonuclesa. Virology 200: 558-565, Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoproteinn of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169— 1171, Windish, J. M,, Schneider, R., Stark, R., Weiland, E., Meyers, G. and Thiel, H. J. 1996. Rnase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virusio neutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: 352-358). Funkce uvedené enzymatické aktivity ve virovém životním cyklu nejsou známy. V případě vakcinačního kmene CSFV dochází k experimentálnímu poškození RNázy místně řízenou mutagenezí a vede ke vzniku cytopatogenního viru, který vykazuje růstové charakteristiky v buněčné kultuře shodné s virem divokého typu (popisuje se v publikaci Hulst, Μ, M,, F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and
Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein Em5 of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). Enzymatická aktivita závisí na přítomnosti dvou pruhů aminokyselin, které jsou konzervativní mezi pestivirem Erns a různými RNázami rostlinného nebo fungálního původu. Obě uvedené konzervativní sekvence obsahují histidinový zbytek (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark,
E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171). Záměna každého ztěchto zbytků v proteinu Erns vakcinačního kmene CSFV za lyzin vede k destrukci aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A, Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E™ of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). Zavedení těchto mutací do genomu vakcinačního kmene CSFV neovlivňuje schopnost viru nebo jeho růstové vlastnosti, ale vede to ke vzniku viru, který vykazuje slabě cytopatogenní fenotyp (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E™ of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157).
Vakcíny obsahují utlumené a usmrcené viry nebo virové proteiny exprimované v heterogenních expresívních systémech, které se vytvořily pro CSFV a BVDV a v současné době se používají. Strukturální základ utlumení těchto virů, které se používají jako živé vakcíny není znám. To vede k nebezpečí nepředpokládaných revertantů vznikajících zpětnou mutací nebo rekombínací, k čemu může dojít po vakcinaci. Na druhé straně účinnost deaktivovaných vakcín nebo heterologně exprimovaných virových proteinů (podjednotkové vakcíny) při indukci imunity je spíše nízká.
V obecném případě živé vakcíny s definovanými mutacemi, jako základ pro utlumení, umožní obejít nevýhody vytvoření vakcín. Potencionální cíle tlumicích mutací u pestivirů nejsou v současné době dostupné. Další výhodou uvedených tlumicích mutací je jejich molekulová jedinečnost, která umožňuje je použít jako jednoznačné značení v případě utlumených pestivirů a ty se odlišují od obecných pestivirů.
Vzhledem k důležitosti účinnosti a bezpečnosti stejně jako detekovatelné profylaxe a léčbě pestivirových infekcí existuje nutnost vytvořit živé a specificky utlumené vakcíny s vysokým potencionálem indukce imunity stejně jako nutnost definovat základy utlumení, které utlumené viry odlišují od patogenních pestivirů.
so Proto základní řešený problém uvedeného vynálezu je vytvořit specifiky utlumené a detekovatelné značené pestiviry vhodné při použití jako živé utlumené vakcíny s vysokou účinností při indukci imunity, což jako výsledek této metody je odlišuje od patogenních obecných pestivirů.
-2CZ 301570 B6
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří utlumený pestivirus, v němž je deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein ERNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, přičemž uvedené delece a/nebo mutace k deaktivaci RNázové aktivity se nacházejí v polohách 296 až 307 a/nebo v polohách 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na Obr. 1 v případě kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech, za předpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu. Součást řešení tvoří rovněž příslušná kódující nukleová kyselina. Dále se řešení týká použití popsaného utlumeio ného pestivirů pro přípravu farmaceutického prostředku pro profylaxi nebo léčení pestivirové infekce.
Termín „vakcína“ znamená farmaceutickou kompozici obsahující alespoň jeden imunologicky aktivní komponent, který indukuje imunologickou odezvu u zvířat a je možné nikoli nezbytné použít jeden nebo více dalších komponentů, které zesilují imunologickou aktivitu uvedeného aktivního komponentu. Vakcína může dále obsahovat další komponenty, které jsou typické pro farmaceutické kompozice. Imunologicky aktivní komponent vakcíny může obsahovat celý živý organizmus buď v jeho původní formě, nebo jako utlumené organizmy v tak zvané upravené živé vakcíně (MLV) nebo v organizmech deaktivovaných vhodnými metodami v tzv. mrtvých vakcí20 nach (K.V). V jiné formě imunologicky aktivního komponentu vakcíny mohou být obsaženy vhodné elementy uvedených organizmů (podjednotkové vakcíny), přičemž jejich elementy se tvoří buď porušením celého organizmu, nebo kultivací kultury uvedených organizmů a následnými kroky čištění, které vedou ke vzniku požadované struktury nebo vhodnou manipulací podobného vhodného systému, přičemž použití není omezeno na bakterie, hmyz nebo jiné druhy a nás25 lednou izolaci a čištění nebo indukci uvedeného syntetického postupu u zvířete nebo vytvoření vakcíny přímým zavedením genetického materiálu za použití vhodných farmaceutických prostředků (polynukleotidová vakcína). Vakcína může obsahovat jeden nebo současně více elementů, které se popisují shora v textu.
Další komponenty pro zvýšení imunitní odezvy jsou konstituenty, které se běžně nazývají adjuvans, jako je například hydroxid hlinitý, minerální nebo jiné oleje nebo podpůrné molekuly přidané do vakcíny nebo vytvořené v těle po indukci takovými dalšími komponenty, kterými jsou například interferony, interleukiny nebo růstové faktory.
Termín „farmaceutický prostředek“ v podstatě obsahuje jeden nebo více ingrediencí schopných modifikovat fyziologické například imunologické funkce organizmu. Tento prostředek se aplikuje do živého organizmu nebo na jeho povrch. Mohou to být například antibiotika nebo antiparazitika stejně jako konstituenty knim přidané za účelem dosáhnout jiných jevů, jako jsou znaky zpracování, sterility, stability, možnosti aplikace prostředku enterální nebo parenterální cestou, jako je orální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, podkožní, intradermální nebo jinou vhodnou cestou, tolerance po aplikaci a řízené uvolněné vlastnosti.
Vakcína podle vynálezu znamená vakcínu popsanou shora v textu, kde jeden imunologicky aktivní komponent je pestivirus neboje pestivirového původu.
Termín „živá vakcína“ znamená vakcínu obsahující živý zvláště pak živý virový aktivní komponent.
Termín „pestivirus“ znamená všechny pestiviry charakterizované tím, že patří do stejného rodu jako BVDV, CSFV a BDV v čeledi Flaviviridae a exprimují glykoprotein ERNS. Uvedený termín samozřejmě také znamená všechny pestiviry, jak se popisují v publikaci Becher et al., (1995) nebo jiné, které exprimují glykoprotein ERN . Termín „aktivita RNázy“ znamená schopnost glykoproteinu E^ hydrolyzovat RNA.
-3CZ 301570 B6
Je nutné poznamenat, že termín „glykoprotein EO“ se často používá současné s glykoproteinem Erns, jak se popisuje v uvedených publikacích.
Termín „deaktivace RNázové aktivity nacházející se v uvedeném glykoproteinu“ znamená neschopnost nebo omezenou schopnost upraveného glykoproteinu ERNShydro lyžovat RNA, což se porovnává s nemodifikovaným divokým typem uvedeného glykoproteinu ERNS.
Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu Erns se muže dosáhnout delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, jak se uvádí zde a v publikaci
Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E™ of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J, Virol. 72: 151-157), V preferovaném provedení vynálezu se popisují živé vakcíny, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.
Ukázalo se, že glykoprotein ErnS tvoří homodimér vázaný na disulfid o molekulové hmotnosti 97 000, kde každý monomér obsahuje 227 aminokyselin, které odpovídají aminokyselinám 268 až 494 polyproteinu CSFV, jak se popisuje v publikaci Rumenapf et al. (1993). Prvních 495 aminokyselin exprimovaných Alfortovým kmenem CSFV je zobrazeno na obrázku č. 1.
Genomová sekvence Alfortova kmene CSFV je dostupná v GenBank/knihovna dat EMBL s číslem uložení J04385. V jiném případě aminokyselinová sekvence v případě kmene CP7 BVDV se může najít v GenBank/knihovně dat EMBL (s číslem uložení U63479). Dvě oblasti aminokyselin jsou v glykoproteinu ERNS vysoce konzervativní stejně jako v některých rostlinných a fungálních proteinech, které vykazují RNázovou aktivitu (popisuje se v publikaci Schneider, R„
G. Unger, R. Stark, E. Sehneider-Scherzer, and H. J, Thiel. 1993. Identification of a struetural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171). Tyto dvě oblasti jsou zvláště důležité pro RNázovou enzymatickou aktivitu. První oblast obsahuje oblast aminokyselin v polohách 295 až 307 a druhá oblast obsahuje aminokyseliny v poloze 338 až 357 uvedeného virového proteinu, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě Alfortova kmene CSFV (číslování se provádí podle publikované dedukované aminokyselinové sekvence Alfortova kmene CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Aminokyseliny, které jsou důležité při RNázové aktivitě, jak se uvádí shora v textu, nejsou žádným způsobem omezeny na přesné polohy, jak se definuje v případě Alfortova kmene CSFV, ale používají se jednoduchým způsobem, aby se ukázalo, že preferované aminokyseliny jsou v uvedené poloze nebo odpovídají aminokyselinám v uvedené poloze jiných kmenů jak je možné zjistit v obecném případě u BVDV, BDV a pestivirů, protože jsou vysoce konzervativní. V případě pestivirů, které jsou jiné než Alfortův kmen CSFV, číslování poloh preferovaných aminokyselin se často liší, ale odborník v oboru molekulární biologie pestivirů jednoduše identifikuje tyto preferované amino40 kyseliny na základě jejich polohy vztažené vůči vysoce konzervativním aminokyselinám uvedeného glykoproteinu. V jednom určitém nelimitujícím příkladu je poloha CSFV Alfort 346 identická s polohou 349 kmene cp7 BVDV.
Vynález popisuje ve více preferovaném provedení vynálezu vakcínu podle vynálezu, kde uvede45 né deaktivuj ící delece a/nebo mutace se nacházejí v aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene nebo odpovídá polohám aminokyselin uvedeného glykoproteinu v jiných kmenech.
Ve velmi preferovaném provedení vynálezu se uvádí, že deaktivace uvedené RNázové aktivity deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu vede ke vzniku zvláště použitelné živé vakcíny. Vynález dále popisuje vakcíny podle vynálezu, kde RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.
-4CZ 301570 B6
Vynález demonstruje, že pestiviry jsou dostupné a kódují protein ERNS bez RNázové aktivity, v případě, že se deletuje histidinový zbytek v poloze 346 virového polyproteinu (číslování se provádí v souladu s publikovanou sekvencí CSFV Alfort/Tubingen (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567), který reprezentuje jeden z konzervativních zbytků putatívního místa ERNS RNázy. Vynález dále popisuje, že delece histidinů v proteinu ERNS pestivirů BVD (v poloze 349, číslováno v souladu se sekvencí BVDV CP7 GenBank/EMBL (číslo uložení U63479) vede ke vzniku dostupného viru, kde glykoprotein ERNS ztratil RNázovou aktivitu. Na rozdíl od bodových mutací, kde dochází k záměně jedné aminoío kyseliny za jinou, deleění mutanti jsou v obecném případě daleko stabilnější s ohledem na revertanty. Infekce prasat mutantem patogenního kmene CSFV Alfort/Tubingen exprimujícím ERNS s touto deleci nevede k horečce ani k jiným typickým klinickým příznakům infekcí CSFV, zatímco infekce virem divokého typu způsobuje horečku, průjem, anorexii, apatyi, depleci B-buněk a poruchy centrálního nervového systému. Tyto prasata se usmrtila 14 dní po inokulaci ve fázi umírání, kdy se objevilo silné krvácení kůže a vnitřních orgánů. Infikovaná prasata nevykazují ani viremii ani depleci B-buněk, jak se ukázalo v testech provedených 3., 5., 7., 10. a 14 den po infekci, zatímco CSFV se jednoduše izolovaly ze vzorků krve získaných z prasat inokulovaných virem divokého typu. Deleční mutant se zjevně replikuje ve zvířatech, jak se indikuje indukcí neutralizujících protilátek (popisuje se v příkladu 3, tabulka č. 3c). Imunní odezva na mutantní virus je dostatečná, aby umožnila přežít smrtelnou dávku 2x103 TCID50 vysoce patogenní infekce kmenem CSFV Eystrup (Konig, 1994), který je heterologní s kmenem Alfort. Testovaná zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce CSFV, jako je horečka, průjem, krvácení, deplece B-buněk nebo anorexie, po opakované infekci. Tato data demonstrují, že infekce prasat s delečními mutanty indukuje imunitní odezvu dostatečnou pro ochranu proti přísné vakcinaci.
V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivovala deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.
V dalším preferovaném provedení vynálezu se popisují BCDV vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku Č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.
V jiném provedení vynálezu se popisují utlumené pestiviry, kde RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu ERNS se deaktivuje deleci a/nebo mutací alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v polohách 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV, nejsou lyzin. Rekombinantní pestivirus, kde aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu jsou lyzin, se popisují v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann,
R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein Eins of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157. Tyto zvláštní pestiviry demonstrovaly cytopatické účinky v ledvinových buňkách prasat. Až do dnešního dne nedošlo ke zhodnocení nových tlumicích rysů způsobených deaktivací enzymatické aktivity proteinu ERNS.
V preferovaném provedení vynálezu popisuje pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi provedenými na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.
so Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.
-5CZ 301570 B6
V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry, kde RNázová aktivita je potlačena delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.
s V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry BVDV, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.
Utlumené pestiviry a aktivní komponenty vakcín podle vynálezu se mohou jednoduše připravit io rekombinantními metodami modifikace nukleové kyseliny, které vedou k expresi mutantní aminokyselinové sekvence v glykoproteinu ERNS, Vynález dále popisuje nukleové kyseliny kódující glykoprotein ERNS, kde RNázová aktivita obsažená v uvedeném glykoproteinu se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č. 1 v prípat5 dě CSFV Alfortova kmene, nejsou lyzin.
V preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi, které se nacházejí v aminokyselinách v poloze 296 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene
CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č, 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech ao uvedeného glykoproteinu.
V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny BVDV podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
Nukleotidy, například DNA nebo RNA je možné také použít při přípravě vakcín tvořených DNA, RNA nebo vektory. V těchto vakcínách se nukleotidy aplikují přímo do zvířete nebo nepřímo prostřednictvím vektorů, které v tomto případě nepochází z původního viru. Nukleotidové a vektorové vakcíny jsou dobře známy v oboru.
Dále vynález popisuje použití nukleových kyselin podle vynálezu vhodných pro přípravu nukleotidových a/nebo vektorových vakcín.
Vakcíny, utlumené pestiviry a nebo nukleové kyseliny podle vynálezu je možné zvláště použít při přípravě farmaceutického prostředku.
Dále vynález popisuje farmaceutické prostředky obsahující vakcínu podle vynálezu a/nebo pestivírus podle vynálezu a/nebo nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. Jeden neomezující příklad takového farmaceutického prostředku se připravuje následujícím způsobem: supematant infikované buněčné kultury se smíchá se stabilizátorem (například spermidin) a/nebo BSA (albumin bovinního séra) a směs se následně lyofilizuje nebo dehydratuje jinými metodami. Před vakcinaci se uvedená směs opětně hydratuje vodou (například fyziologickým roztokem), PBS (fyziologickým roztokem pufřovaným fosforečnanem) nebo nevodnými roztoky (například emulzí, adjuvans založeným na hliníku).
-6CZ 301570 B6
Vynález se dále popisuje způsob tlumení pestivirů. Vynález dále popisuje jedinečnou a nepředvídatelnou metodu tlumení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita v glykoproteinu ERNS.
Specificky utlumené pestiviry je zvláště výhodné použít pri přípravě vakcín. Vynález dále popisuje metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita glykoproteinu ER .
Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu ERNS poskytuje novou metodu detekovatelně značených pestivirů. Vynález dále popisuje metodu detekovatelného značení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu ER . Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu ERNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelné značení uvedených pestivirů. Značené a neznačené pestiviry nebo ĚRNS vylučo15 váné z buněk infikovaných pestivirem v tělních tekutinách se mohou jasně odlišit přítomností a nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinů ERNS po izolaci a testování uvedené enzymatické aktivity.
V případě pestivirů deaktivace jejich RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu ERNS deleci a/nebo mutací se může provést řadou jiných způsobů. Takové pestiviry se mohou jednoduše detekovat vzhledem ke struktuře vzniklé na základě takových deleci a/nebo mutací. Sekvenční rozdíl sekvence nukleové kyseliny změněného glykoproteinu ERNS je detekovatelný sekvenováním nukleové kyseliny nebo metodou PCR, jak se popisuje v příkladu 8. Změněná proteinová sekvence se mohou detekovat specifickými monoklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměně25 né proteiny. Je také možné detekovat změněný a tím také strukturálně značené proteiny tím, že se naváží specifické monoklonální protilátky, které nerozeznávají nezměněné glykoproteiny ERNS za podmínek, že se přítomnost pestivirů může stanovit jiným způsobem. Delece a/nebo mutace odstraňující RNázovou aktivitu u značených virů povede k různým imunitním odezvám u zvířat, kdy se porovnávají s odezvou, která je výsledkem infekcí neznačenými pestiviry.
Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, způsoby produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a způsoby vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu, přičemž jde o metody vztahující se k deaktivaci glykoproteinu E , kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvede35 ného glykoproteinu.
Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto metody souvisí s deaktivací glykoproteinu ERNS, kde uvedené delece a/nebo mutace se provedly na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 a/nebo 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pesti45 virové vakcíny a metod vhodných pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteinu ERNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku ě. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteinu ERNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
-7CZ 301570 B6
Vynález dále popisuje vakcíny a/nebo jiné farmaceutické prostředky, které je možné částečně použít při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Vynález dále popisuje metody použitelné při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat charakterizovaných tím, že vakcína podle vynálezu nebo jiný farmaceutický prostředek podle vynálezu se aplikuje zvířeti, který potřebuje takovou profylaxi nebo léčbu.
Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E .
Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu ERNS.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů a způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby ís příbuzné aktivaci glykoproteinu ERNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu ERNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi aminokyselin v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu ERNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí a/nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu ERNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí a/nebo mutací histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteinu.
Vakcíny nebo jiné farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou použitelné při profylaxi a léčbě pestivirové infekce u zvířat.
Vynález popisuje použití vakcíny podle vynálezu při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Dále vynález popisuje použití farmaceutického prostředku podle vynálezu vhodného pro profylaxi a léčbu pestivirových infekcí u zvířat.
Pestiviry a/nebo nukleové kyseliny podle vynálezu jsou použitelné aktivní komponenty farmaceutického prostředku nebo vakcíny. Vynález se proto popisuje použití pestivirů podle vynálezu a/nebo nukleové kyseliny podle vynálezu pri přípravě vakcíny nebo farmaceutického prostředku.
Jak se popisuje shora v textu deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu ERNS posky50 tuje novou metodu značení pestivirů.
Vynález dále popisuje způsoby vhodné pro rozlišení detekovatelné značených pestivirů podle vynálezu od neznačených a pravděpodobně patogenních pestivirů. Takové metody jsou zvláště použitelné při stanovení účinnosti značených pestivirů u zvířat. Prokázalo se, že zvíře, kterému se aplikovala vakcína, vykazuje, po získání vzorku z takového zvířete a testování, pozitivní značení.
-8CZ 301570 Bó
Neoznačená a specificky neznačená zvířata, které vykazují přítomnost pestivirů se mohou ihned oddělit, izolovat nebo usmrtit, aby se předešlo rozšíření patogenní infekce na další zvířata.
Vynález popisuje metodu detekovatelně značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu ERNS. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu ERNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelné značení těchto pestivirů. Výsledné značené a neznačené pestiviry se mohou jasně odlišit přítomností nebo nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinu ERNS na izolaci a testování takové enzymatické aktivity. Stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti této enzymatické aktivity na získání vzorku obsahující pestivirus nebo jeho materiál se může uskutečnit za použití standardních metod, jak se například popisuje v příkladu 2 nebo v publikaci Hulst, Μ. M., Himes, G., Newbigin, E., Moormann, R. J. M. 1994. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and Identification as a ribonucleasa. Virology 200: 558-565.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob vhodný pro odlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat vakcinovaných specificky utlumeným pestivirem podle vynálezu, který obsahuje následující kroky:
(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se předpokládá pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení absence nebo přítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu ERNS v uvedeném vzorku, (3) korelace nepřítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^ $ vakcinovaným zvířetem a korelace přítomnosti uvedené aktivity s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.
Vynález popisuje pestiviry, kde se deaktivovala jejich RNázová aktivita v glykoproteinu delecí a/nebo mutací. Takové pestiviry je možné jednoduše detekovat na základě jejich struktury, která vzniká uvedenými delecemi a/nebo mutacemi. Sekvenční rozdíl genu ERNS, který kóduje změněný glykoprotein E1^8, je detekovatelný sekvenační metodou nebo PCR. Vynález popisuje preferované provedení metody vhodné pro odlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat, kterým se aplikovala vakcína se specificky utlumenými pestiviry podle vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky:
(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nukleotidové sekvence pestivirového genomu nebo proteinu v uvedeném vzorku, (3) korelace delecí a/nebo mutací nukleotidové sekvence proteinu ERNS přítomné ve vakcíně s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti uvedených delecí a/nebo mutací s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.
Strukturální změny, které jsou výsledkem změněné proteinové sekvence glykoproteinu ERNS pestivirů podle vynálezu, se mohou detekovat specifickými monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny.
-9CZ 301570 B6
Další provedení vynálezu popisuje způsob odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:
(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikos vala vakcína, (2) stanovení modifikovaného glykoproteinu ERNS utlumeného pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteinu ERNS přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se modifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž io uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na nemodifikované glykoproteiny Erns, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na pestivirovou infekci uvedeného zvířete za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.
Je možné detekovat změněné a strukturálně značené proteiny pomocí neschopnosti vázat specifické nebo polyklonální protilátky, které rozeznávají pouze nezměněné glykoproteiny ERNS, při20 čemž přítomnost pestivirů se může stanovit jiným způsobem. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje metoda pro odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:
(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se apliko25 vala vakcína, (2) stanovení modifikovaného glykoproteinu ERNS pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteinu ERNS přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se nemodifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž uvede30 né monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na modifikované glykoproteiny £RNS (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na vakcinované zvíře za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.
Výsledkem modifikace struktury a nepřítomnosti RNázové aktivity ve značených virech podle vynálezu ve srovnání s odezvami vycházejícími z neznačených pestivirových infekcí budou růz40 né imunitní odezvy u zvířat. Pestiviry podle vynálezu vyvolávají různou a zřetelnou imunitní odezvu, buněčnou stejně jako humorální, které se liší od nemodifikované stejně jako patogenní imunitní odezvy. Výsledkem aplikace glykoproteinů ERnS podle vynálezu jsou polyklonální protilátky, které se liší svojí vazebnou specifitou, když se porovnávají s polyklonálními protilátkami vzniklými aplikací nemodifikovaných glykoproteinů. Tyto rozdíly ve vazebné specifitě poskytují značení vhodné pro rozlišení zvířat vakcinovaných pestiviry podle vynálezu od zvířat infikovaných obecnými pestiviry. Popisují se testy, které se používají pro zjištění specifických polyklonálních protilátek v testovacím séru, které se buď váží na epitop divokého typu, nebo značí deleční mutaci uvedeného epitopu za účelem diferenciace infikovaných a vakcinovaných zvířat. V publikaci Kit, M. and S. Kit, 1991. Sensitive glykoprotein glll blocking ELISA to distrinquish between pseudorabies (Aujeszky's disease)-infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiology 28: 141-155 se například popisují testy použitelné v případě prasat infikovaných a vakcinovaných pseudorabies.
- 10CZ 301570 B6
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob rozlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje následující kroky:
1) získání vzorku polyklonálních protilátek ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nespecifického navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoproteín nebo na glykoproteiny ERNS upravený podle vynálezu, io (3) korelace navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoproteín Erns s pestivirovou infekcí a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na uvedené polyklonální protilátky proti glykoproteinu ERNS, kteiý se upravit podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Na obrázku č. 1 je zobrazeno prvních 495 aminokyselin exprimovaných kmenem Alfort CSFV. Zobrazená sekvence ukazuje prvních 495 aminokyselin jak se exprimují kmenem Alfort CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Jeden monomer glykoproteinu E“® uvedeného kmene odpovídá aminokyselinám 268 až 494, jak se popisuje v publikaci Rumenapf, T., Unger, G., Strauss, J. H. and Thiel, H. J. 1993. Processing ofthe evelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67: 3288-3294. Podtrženy jsou zbytky 295 až 307 a 338 a 357 reprezentující oblasti vykazující homologii s rostlinnými a fungálními RNázami (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171).
Na obrázku č. 2 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci.
Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 2. dne až do 18. dne po infekcí. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem V(pA/CSFV) (nepřetržitá čára) získaného z plazmidu pA/CSFV nebo virem V(pA/C-346d) získaným z plazmidu pA/C-346-d (tečkovaná čára).
Na obrázku č. 3 je znázorněna křivka tělesné teploty zvířat po infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 21. dne po infekci. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d [V-{pA/C-346-d)] se po 69 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene Eystrup. Detaily se popisují v textu. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem CSFV kmene Eystrup v koncentraci 2xl05TCID50.
Na obrázku č. 4 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 0. dne až do 18. dne po infekci. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve dvou skupinách infikovaných buď C-346-d [VpA/CSFV)] (tečkovaná čára), nebo znovu získaného viru
C-346-d/RS [VpA/C-346-d)] (nepřetržitá čára).
Na obrázku č. 5 je zobrazena tělesná teplota zvířat měřená v rektu po infekci v experimentu č. 2. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 10. dne po infekci virem. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d se po 37 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene Eystrup (2xl03TCIDso).
Na obrázku č. 6 je zobrazená tělesná teplota zvířat měřená v rektu, která se ošetřila dvojitým mutantem popsaným v příkladu 6 dále v textu. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně před a po infekci virem s mutantem V(pA7C-297-L/346-L).
- II CZ 301570 B6
Na obrázku č. 7 je zobrazena diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje delecí histidinového kodonu 346, pomocí RT-PCR podle příkladu 8.
a) Primer Ol H-3/OI Em<,Stop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahují5 cí deleci kodonu 346 (C-346—<1), jak se popisuje detailněji v příkladu 8. Naopak RNA, která neobsahuje uvedenou deleci nereaguje s uvedeným párem primerů (C-WT, C-346-L, C-346-K).
b) a c) Další dvě kombinace primerů (ΟΙ H+2 a ΟΙ H+3) umožní amplifikovat pruhy získané io z RNA, které neobsahují deleci kodonu 346 (ΟΙ H+2 a ΟΙ H+3). Žádný pruh není možné pozorovat v případě, že se jako templát použije RNA z 346 delečního mutantu C-346-d,
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Vytvoření pestivirových mutantů, které neobsahují RNázu
Při tvorbě subklonů se jako počáteční materiál použily klony cDNA v plné délce pA/CSV (popi20 suje se v publikaci Meyers, G., Thiel, H. J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swíne fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67: 7088-709526) nebo pA/BVDV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recoveiy of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine víral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol.,
70: 8606-8613), ze kterých je možné získat infekční cRNA transcripcí in vitro. V případě CSFV se fragment Xhol/SspI pA/CSFV klonoval do plazmidu pBluescript SK+, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Smál. V případě BVDV se fragment Xhol/BglII z pA/BVDV klonoval do plazmidu pCITE-2C, který se štěpil stejnými restrikčními enzymy. Z těchto konstrukcí vznikla jednořetězcová plazmidová DNA za použití Kunkelovi metody (popisuje se v publikaci Kun30 kel, T. A., J. D. Roberts, and R. A. Zakour. 1987. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods Enzymol. 154: 367-392), přičemž se používají buňky E. coli CJ 236 (BioRad) a jednořetězcové fágy VCMS (Stratagene). Jednořetězcová DNA se přeměnila na dvouřetězcovou za použití sady „Phagemid in vitro Mutagenesis Kit“ (BioRad). Některé ze syntetických oligonukleotidů, které se používají jako primery při přípravě požadova35 ných pestivirových mutantů, jsou uvedeny dále v textu:
C-297-L; AGGAGCTTACTTGGGATCTG
C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT
C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC
C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA
C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC
B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG
Při transformaci buněk mikroorganizmu E, coli XL-1 Blue (Stratagene) se použila dvouřetězcová plazmidová DNA. Kolonie bakterií, které nesou plazmidy, se izolovaly selekcí na ampicilinu. Připravila se plazmidová DNA a dále se analyzovala sekvenováním nukleotidů za použití sekve40 načni sady s polymerázou T7 (Pharmacia). Plazmidy obsahující požadované mutace a nevykazující žádné další změny na druhém místě se použily při konstrukci klonů cDNA v plné délce. V případě CSFV sc fragment Xhol/Ndel z mutagenizovaného plazmidu začlenil spolu s fragmentem Ndel/BglII odvozeného z plazmidu 578 (pCITE 2A, obsahující fragment Xhol/BglII z pA/CSFV) do plazmidu pA/CSFV štěpeného restrikčními enzymy Xhol a BglII. Za účelem získání mutantu BVDV CP7 se fragment Xhol/BglII obsahující deleci začlenil do pA/BVDV,
-12CZ 301570 Bó který se štěpil restrikěními enzymy Xhol a Ncol, spolu s fragmentem BglII/NcoI izolovaným pA/BVDV/lns-. cRNA se transkribovala z konstrukce pA/BVDV/Ins- za vzniku BVDV, který není cytopatogenní a je vhodný pro transkripci do vhodných buněk (popisuje se v publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613). Amplifíkovaly se různé délky klonů a izolovaly se jednotlivé plazmidy. Přítomnost požadovaných mutací se prokázala sekvenováním DNA. Po linearizaci DNS restrikčním enzymem Srfl (klony CSFV plné délky) nebo Smal/klony BVDV plné délky) se cRNA přepsala, jak se popisuje shora v textu v publikacích publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., io Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol. 70: 8606-8613, Meyers, G., Thiel, H. J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67: 7088-709526. RNA se Čistila gelovou filtrací a extrakcí směsí chloroformu a fenolu a použila se při transfekci buněk prasečích (PK15) nebo bovinních ledvin (MDBK klon B2) (konstrukce CSFV nebo BVDV). Transfekce se analyzovala imunofiuorescencí se sérem specifickým pro virus. V případě, kde se mohl získat požadovaný mutant (je pozitivní imunofluorescenČním testu), se viry amplifíkovaly pasážováním ve stejné buněčné linii za použití transfekčních experimentů. Další analýza mutantů CSFV zahrnuje stanovení jednokrokových růstových křivek a charakterizaci virové RNA Northemovým blotem za použití sond cDNA, které jsou specifické pro virus, stejně jako reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR) a následné sekvenování fragmentů PCR, aby se ověřila přítomnost požadovaných mutací ve virovém genomu. Ve všech případech se prokázala přítomnost požadovaných mutací. Všechny získané viry rostly dobře a produkovaly podobné množství RNA právě tak jako virus, který vznikl z plaz25 midu, jenž vykazuje sekvenci divokého typu.
Schopnost mutantů přežít se prokázala transfekci cRNA a oddělením buněk po třech dnech. Část buněk se nanesla na plotny o průměru 3,5 cm, den poté se fixovaly směsí aceton/methanol a pak se analyzovaly imunofiuorescencí za použití směsi monoklonálních protilátek specifických pro
BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, Η. I, Hess, G., and Weiland, F., (1989). Development of monoclonal neutralízing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine cells and cyclophosphamide, J. Virol. Methods 24: 237-244). Všechny buňky byly pozitivní, zatímco kontrola buněk transfekovaných neinfekční RNA nevykazuje žádný signál. Zčásti buněk transfekovaných cRNA se produkoval extrakt v jednom cyklu zmražení a tání. Čerstvé buňky se infikovaly tímto buněčným extraktem a za použití imunofluorescence specifické pro BVDV se tři dni po infekci prokázalo, že jsou BVDV pozitivní.
V tabulce č. 1 je uvedeno shrnutí různých změn zavedených do konzervativních sekvencí ERNS reprezentující putativní aktivní místo RNázy, které kóduje určitý virový mutant.
-13CZ 301570 B6
Tabulka č. 1:
název sekvence v motivu RNázy aktivita RNázy schopnost mutantů přežit
pA/CSFV .slhgiwpekic... . .. RHEWNKHGWCNW. . + +
C-297-L .SLLGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW.. - +
C-346-L .SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW.. - +
C-297-L7346-L .SLLGIWPEKIC... ...RHEWNKLGWCNW.. - +
C-297-K .SLKGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW.. - +
C-346-K .SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKKGWCNW.. - +
C-297-d . S L_ G IW P E K I C... ...RHEWNKHGWCNW.. - -
C-346-d .SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW.. - +
C-296/7/B-d ,. .S___IWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW,. - -
C-345/6/7-d .. .SLHGIWPEKIC... ...RHEWN___WCNW.. - -
C-345/6-d .SLHGIWPEKIC... ...RHEWN__GWCNW.. - -
C-346/7-d .SLHGIWPEKIC... ...RHE W NK _ _WCN W., - -
C-342-d .SLHGIWPEKIC... ,..RH_WNKHGWCNW., - -
C-342/6-d .SLHGIWPEKIC... ...RH_WNK _GWCNW.. - -
C-301-d . S L H G I W_ E KI C... ...RHEWNKHGWCNW,. - -
C-295-S/G .GLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW. . -
C-300-W/G .SLHGIGPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW,. - +
C-3O2-E/A . S L H G I W P A K l C. . . ...RHEWNKHGWCNW.. - -
C-305'C/G .SLHGIWPEKIG,,. .. RHEWNKHGWCNW.. - -
C-300-W/G-3Q2-E/A .SLHGIGPAKIC. . ...RHEWNKHGWCNW.. - -
C-340-R/G ..SLHGIWPEKIC... ...GHEWNKHGWCN W.. - -
C-343-W/G ..SLHGIWPEKIC... ...RHEGNKHGWCNW,, - -
C-345-K/A ..SLHGIWPEKIC... ...RHEWNAHGWCNW., - •
C-297-K/346-K , . .SLKGIWPEKIC... ...RHEWNKKGWCNW.. - +
C-297‘K/346-L.. .SLKGIWPEKIC. ...RHEWNKKGWCNW,. - +
pA/BVDV SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW.. + +
B-346-d .SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW.. -
Popis tabulky č. 1: Test aktivity RNázy se provedl v krátkodobém testu. Buňky BHK21 se infikovaly virem vakcínie vTF7-3 (popisuje se v publikaci Fuerst T. R. et ak, 1986. Eukaryotic transient expression systém based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proč. Nati. Acad. Sci. 83: 8122-8126) a pak se transfekovaly konstrukcí cDNA (5 pg plazmidové DNA, transfekce za použití Superfect, jak doporučuje dodavatel firma Qiagen)), Po 10 hodinách inkubace při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO2 se transfekované buňky analyzovaly a stanovila se aktivita RNázy, jak se popisuje dále v textu). Schopnost io buněk přežít se stanovila způsobem popsaným dále v textu.
Příklad 2: Účinek různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu ERNS
Za účelem testování účinku různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu ERNS se vhodné buňky infikovaly mutantními viry. V případě CSFV se provedla infekce při hodnotě multiplicity infekce (m.o.i.) 0,01. Infekce divokým virem sloužila jako pozitivní kontrola, zatímco neinfikované buňky se použily jako negativní kontrola. 48 hodin po infekci se buňky promyly dvakrát fyziologickým roztokem pufřovaným fosforečnanem a lyžovaly se v lyzačním pufru o objemu
-14CZ 301570 B6
0,4 ml (20 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mg/ml albuminu bovinního séra, 1% Triton XI00, 0,1 % deoxycholová kyselina, 0,1% SDS). Lyzát se přenesl do reakční zkumavky o objemu 1,5 ml, sonifikoval se (sonikátor Branson B12, za podmínek 120 W, 20 s ve vodní lázni). Dále se centrifugoval po dobu 5 min. při 14 000 ot./min. v Eppendorfových zku5 mavkách při teplotě 4 °C a supematant se ultracentrifugoval ve stolní ultracentrifuze Beckmann po dobu 60 min., při teplotě 4 °C a otáčkách 45 000 ot./min za použití rotoru TLA 45. Stanovení RNázové aktivity se provedlo v objemu 200 μί, který obsahuje 5 nebo 50 μΐ supematantu z druhého stupně centrifugace a 80 pg Poly/rU (Pharmacia) v pufru, který je vhodný pro RNázový test (40 mM Tris-acetát (hodnota pH je 6,5), 0,5 mM EDTA, 5 mM dithiotreitol (DTT)). Po inkubaci io reakční směsi při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny se přidalo 200 μί 1 M kyseliny perchloristé, 20 mM LaSO4. Po inkubaci na ledu po dobu 15 minut se směs centrifugovala po dobu 15 minut, pří teplotě 4 °C a při otáčkách 14 000 ot./min. V Eppendorfových zkumavkách. K supematantu se přidala voda v množství, které odpovídá 3 objemům a alikvot směsi se analyzoval měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm za použití spektrofotometru Ultrospec 3000 (Pharma15 cia). Ve všech případech mutace zavedená do genu E1“ zcela zrušily RNázovou aktivitu (uvádí se v tabulce č. 1).
V případě mutantu BVDV se RNázová aktivita testovala v materiálu získaným po transfekci RNA bez pasážování získaných virů. Buňky transfekované vhodnou RNA se 72 hodin po trans20 fekci rozdělily a nanesly se na dvě plotny. O 24 hodin později se připravil z jedné plotny buněčný extrakt a analyzovala se RNázová aktivita způsobem, který se popisuje shora v textu. Za účelem prokázat infekci se buňky z druhé plotny analyzovaly fluorescenčním testem s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, H. J., Hess, G., and Weiland, F., (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244), a zjistilo se, že jsou 100 % pozitivní. Transfekce se provedla za použití RNA transkribované z pA/BVDV/Ins- a z pA/B-346-d, což je plazmid ekvivalentní k ρΑ/BVDV/Ins-, ale neobsahuje deleci kodonu ekvivalentního skodonem 346 v genomu CSFV Alfort. Netransfekované buňky MDBK sloužily jako negativní kontrola.
Tabulka ě. 2A: Stanovení RNázové aktivity různých virů
Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-346-d C-346- d/Rs kontrola
od260 2,4 2,3 1,1 1,1 1,1 2,3 1,1
Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-297-K C-346-K C-297- L/346-L
OD26O 2,09 2,16 0,715 0,77 0,79 0,766 0,77
C-297-K/346-L C-297-K/346-K C-346-d kontrola
OD26O 0,725 0,835 0,8 0,84
Popis tabulky č. 2A:
Buňky PK se infikovaly indikovanými viiy při hodnotě m.o.i. (multiplicita infekce) 0,01, inkubovaly se po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO2 a pak se lyžovaly a podrobily testu RNázové aktivity. Rozpustná RNA pocházející z inkubace s různými buněčný40 mi extrakty se kvantifikovala měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm. Pozorované rozdíly RNázové aktivity jsou způsobeny různým množstvím proteinu ERNS ve vzorcích, protože se po kvantifikaci ERNS radioaktivním značením, imunologickým srážením a analýzou radioaktivity za použití fosforimageru získaly stejné hodnoty. Snížení koncentrace ERNS v testu na pouze
-15CZ 301570 B6 jednu desetinu obvyklého množství nezměnilo podstatně výsledné hodnoty optické hustoty, což indikuje, že vybrané podmínky testu se saturovaly vzhledem k Ems.
Kmen CSFV Alfort; všechny ostatní viry se získaly z RNA transkribované in vitro plazmidu: 5 například C-WT zpA/CSFV, C-297-L zpA/C-297-L, atd., viru C-346-d/Rs získaného z pA/C-346-d/Rs (vytvořeného zvrácením mutace v pA/C-346-d záměnou fragmentu cDNA za ekvivalentní fragment získaný z pA/CSFV). Jako kontrol se použil extrakt neinfikovaných buněk
PK15.
Tabulka ě. 2B
B-WT B-346-d kontrola
0^260 2/5 ia bl
Popis tabulky č. 2B: Buňky NDBK se infikovaly in vitro transkribovanou RNA. 72 hodin po transfekci se rozdělily a RNázová aktivita se analyzoval o 24 hodin později. Infekce buněk se prokázala imunofluorescenění analýzou, jak se popisuje v textu.
B-WT je virus získaný z pA/BVDV/Ins-; B-346-dje virus získán z pA/B-346-d; jako kontrola slouží extrakt z neinfikovaných buněk MDBK,
Příklad 3: Patogenita CSFV po aktivací RNázy
Za účelem testování jak poškození RNázové aktivity ovlivňuje patogenicitu pestivirů v jejich přirozeném hostiteli, se provedly experimenty na zvířatech s mutantem V(pA/C-346-d) (v tabul25 ce se uvádí jako C-346-d). Viry získané z klonu plné délky CSFV bez mutace (V(pA/CSFV)) slouží jako pozitivní kontrola (v tabulce označeno jako C-WT). Pro každý mutant se použily tři selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je lxl O5 TCIDso najedno zvíře, přičemž dvě třetiny inokulátu se aplikovalo nasálně (jedna třetina do každé nozdry) a jedna třetina do svalu. Dvě skupiny se ustájily v oddělených izolačních jednotkách.
Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí a 3., 5., 7., 10., 12. a 14. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na Obrázku č. 2). Zvířata infikována virem divokého typu vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky, jako je teplota, ataxie, anorexie, průjem, poruchy centrálního nervového systému, hemoragie na kůži (uvádí se v tabulce č. 3). Virus je možné získat z krve třetí den (zvíře č. 68) a 5., 7., 10., 14., den (zvířata č. 68, 78,
121) (uvádí se v tabulce č. 3B). Zvířata se usmrtila ve fázi odumírání 14. den po infekci. V tuto dobu se detekovaly virové neutralizační protilátky. Naopak u zvířat infikovaných mutantem se neprojevily klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 3a). Tělesná teplota zvířat zůstala v normálu (uvádí se na obrázku č. 2) po celou dobu experimentu a zvířata stále přijímala potravu. Z krve nebylo možné izolovat virus. Zvířata však byla jasně infikována virem a virus se replikoval a u všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 3c).
-16CZ 301570 B6
Tabulka č. 3 a: Klinické příznaky po testované infekci
Experiment č. 1
zvíte e. 1 infekce s klinické příznaky
teplota průjem poruchy CBS anorexie krváce ni kůtě apatie eutanizi e krvácení oi$inů při nekropsii
68 C-WT + + + + + +
78 c-wt + + + + + + + +
121 C-WT + + + + + + +
70 C-346-d - - - - - - - n.a.
72 C-346-d - - - - - - - n.a.
74 C-346-d - - - - - - - n.a.
Popis tabulky č. 3a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: „German land race“, tělesná hmotnost přibližně 25 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata se infikovala CSFV-WT (lxlO5 TC1D5O) a 3 zvířata se infikovala C-346-Λ (1 xl0s TCID50). Zaznamenávala se tělesná teplota v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.
io Tabulka č. 3b: Viremie krevních buněk po testu infekce
Experiment č. 1
svite e. i infekce s klinické příznaky
3 5 7 10 14
68 C-WT + + + + +
78 C-WT - + + + +
121 C-WT - + + + +
70 c-346-d - - - - -
72 C-346-d - - - - -
74 C-346-d - - - -
Popis tabulky č. 3b: Viremie krevních buněk se detekovala společnou kultivací krve s buňkami
PK15. Po inkubaci pri teplotě 37 °C po dobu 72 hodin se buňky promyly PBS, fixovaly se ledem chlazenou směsí aceton/methanol a infekce se analyzovala imunofluorescencí s monoklonálními is protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein E2 (mAb A18, popisuje se v publikaci
Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64,3563-3569).
-17CZ 301570 B6
Tabulka č. 3c: Vývoj neutralizačního titru séra specifického pro CSFV
dny po infekci -3 0 17 25 69 76 79 87
prase č. 70 1:18 1:162 1:162 1:162 1:486 1:1458
prase č. 72 1:18 1:54 1:486 1:1458 1:1458 1:4374
prase č. 74 1:6 1:54 1:162 1:162 1:486 1:1458
Popis tabulky č. 3c: Titry protilátek prasat infikovaných virovým mutantem C-346-d se stanovil v různé časové okamžiky během experimentu:
μΐ ředěného séra se smíchalo s 50 μΐ kultivačního média, které obsahuje 30 TCID50 viru (CSFV Alfort/Tubingen). Po 90 minutách inkubace při teplotě 37 °C se přidalo 100 μΐ buněk (1,5x104 buněk) a směs se nanesla na destičku s 96 prohlubněmi. Po 72 hodinách inkubace se buňky zafixovaly ledem chlazenou směsí acetonu/methanolu a analyzovala se infekce imunofluo10 rescencí s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein E2 (mAb A18, popisuje se v publikaci Weiland, E., Stark, R,, Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569). 69 dní po infekci se zvířatům aplikovalo 2x103 TCID50 CSFV kmen Eystrup. Tabulka uvádí nejvyšší ředění séra, které způsobuje celko15 vou neutralizaci vstupního množství viru.
Příklad 4: Vyvolání ochranné imunity infekcí viru, který nevykazuje RNázovou aktivitu.
Za účelem analyzovat, zda infekce s mutantním virem povede k ochranné imunitě, se přibližně 9 týdnů po infekci s mutantem CSFV za použití vysoce patogenního heterologního kmene CSFV (kmen Eystrup, pocházející od firmy Boehring) provedl vakcinační experiment. Při infekci se použila dávka 2xl05 TCID50 viru. V předchozích několika experimentech se zjistilo, že toto množství viru je dostatečné pro vyvolání letálního onemocnění (popisuje se v publikaci Konig,
Matthias, 1994. Virus der Klassischen Schweinepest: Untersuchungen zuř Pathogenese und zur Induktion einer protektiven Immunoantwort. Dissertation, Tirarztliche Hochschule Hannover, Germany), Zvířata, která se dříve infikovala CSFV RNázovým mutantem, nevykazují klinické příznaky onemocnění, ale zvýšil se jejich titr neutralizačních protilátek, což ukazuje na produktivní infekci a replikaci zavedeného viru.
Příklad 5: Ověření principu utlumení
Aby se ukázalo, že pozorované utlumení mutantního viru je způsobené deleci histidinu v poloze
346 polyproteinu a nikoliv nedefinovanou druhým místem mutace, tak se znovu připravila sekvence divokého typu záměnou fragmenty Xhol/Ndel o velikosti 1,6 kb klonu pAC/C-346-d v plné délce za odpovídající fragment pA/CSFV vykazující sekvenci divokého typu. Fragment vystřižený zpAC/C-346-d se analyzoval sekvenací nukleotidů za účelem najít mutace. S výjimkou delece tripletového kódujícího histidin v poloze 346 polyproteinu se nezjistil žádný rozdíl s ohledem na sekvenci divokého typu. Z konstrukce cDNA s mutantem se mohl získat virus (V(pA/C-346-d/RS), který rostl stejně dobře jako virus divokého typu a vykazuje stejnou RNázovou aktivitu (popisuje se v tabulce č. 2A).
-18CZ 301570 Bó
V druhém experimentu na zvířatech se získaný virus použil pri infekci prasat. Jako kontrola se použil de léční mutant. Opět se použily dvě skupiny obsahující tri zvířata. Tyto zvířata byla mladší (plemeno: „German landrace, přibližná tělesná hmotnost 29 kg) než zvířata použitá v prvním experimentu. Při infekci se použila dávka 5x104 TC1D5O viru. Zvířata infikovaná mutan5 tem nevykazují žádné klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 5, na obrázku ě, 4). Pouze u jednoho zvířete se objevila teplota a trvale jeden den. U těchto zvířat se vyvinuly neutralizační protilátky, které chrání zvíře proti letální dávce CSFV. Další vakcinace se provedla infekcí kmenem Eystrup v dávce 2x105 TCID5o. Zvířata po vakcinaci nevykazují klinické příznaky a tělesná teplota vykazuje normální hodnoty (uvádí se na obrázku Č. 5). Naopak u prasat infikovaných io deleČním mutantem a u zvířat inokulovaných získaným virem divokého typu se vyvinula fatální klasická prasečí horečka. Jedno zvíře se muselo utratit 11 dní po infekci, ostatní dvě o tri dni později. Všechna zvířata vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky. To znamená průjem, anorexie a patologické příznaky, jako je krvácení z různých orgánů, které zahrnují ledviny.
Tabulka č. 5a: Klinické příznaky po testované infekci
Experiment Č. 2
xvlfe č. 1 infekce s klinické pfi2naky
teplota průjem poruchy CHS anorexie krvice ni kůže apatie eutar.izi e krváceni orgánů při nekropeii
43 C-346-d + * - - — - — — n.a.
47 C-346-d - - - - - - - n.a.
87 O34fi-d - - - - - - - n.a.
27 C-346- d/RS + + + + + + + +
28 C-346- d/RS + + + + + + + +
30 C-34G- d/RS + + + + + + + +
* teplota pouze jeden den
Tabulka č. 5a: Ve studií se použilo 6 selat (plemeno: „German Iand race“, tělesná hmotnost 20 přibližně 20 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata se infikovala C-346-d (5xlO4 TCID50) a 3 zvířata se infikovala C-346-d/RS (5xlQ4 TCID50).
C-346-d/RS se získal z mutantu C-346-d znovu získáním sekvence divokého typu genu ERNS. Zaznamenávala se tělesná teplota měřená v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.
Tabulka č. 5b: Diagnostický RNázový test za použití virů získaných z infikovaných zvířat během viremie
Alfort zviře C. 3 C-297-K zvíře e. S C-237-κ zvíře e. 27 C-346-L zviře č. 2β C-346-d/RS zviře č. 30 C-346-d/RS kontrola
QDífiO 1,84 0,60 0,56 1,84 1,93 1,94 0,49
-19CZ 301570 Βδ
Virus se získal z krve zvířat 27, 28 a 30 (jak se popisuje v příkladu 5) a 7. den po infekci se pomnožil v buněčné kultuře, titroval se a testovala se RNázová aktivita, jak se popisuje shora v textu. Neinfikované buňky PK15 a buňky (slouží jako kontrola) infikované CSFV divokého typu (Alford) slouží jako kontroly. Zvířata 3 a 5 se infikovaly mutantem C-297-K, zatímco zvířata 27,28 a 30 se infikovala mutantem C-346-d/RS, jak se uvádí v tabulce.
Příklad 6: Účinky dvojité mutace v glykoproteinu ERNS io Za účelem testování účinků dvojité mutace v glykoproteinu ERNS na schopnost viru se replikovat v jeho přirozeném hostiteli a na jeho patogenitu se provedl experiment na zvířeti s mutantem V(pA/C-297-L/346-L). Virus získaný z klonu CSFV plné délky, který neobsahuje mutaci (V(pA/CSFV) sloužil jako pozitivní kontrola. Pro každý mutant se použily tři selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je lxlO5 TCID50 najedno zvíře, přičemž dvě třetiny inokulátu se aplikovalo nasálně (jedna třetina do každé nozdry) ajedna třetina do svalu. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí (den 0) a 5., 8., 12. a 20. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na obrázku č. 6). Zvířata infikována dvojitým mutantem nevykazují typické symptomy a nikdy nepřestaly přijímat potravu, Zvířata neměla teplotu po dobu celého experimentu (zvířata 45/2 a 45/3) s výjimkou zvířete
45/1, které mělo 8. den teplotu pravděpodobně způsobenou bakteriální infekcí poranění pravé zadní nohy. Po léčbě uvedeného zvířete antibiotiky se 10. den hodnota tělesné teploty vrátila na normální hodnotu (obrázek Č. 6). Z krve všech zvířat se virus izoloval 5. den, zatímco později nebylo možné viremii detekovat (uvádí se v tabulce č. 6a). U všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 6b). V případě zvířete 45/1 se stanovil přibližně
4,5 měsíce po infekci opět neutralizační titr a zjistilo se, že jeho hodnota je 1:4374. Infekce s dvojitým mutantem přešla v dlouhotrvající imunologickou paměť.
Tabulka č. 6a: Test viremie
dny po infekci 5 8 12
prase 45/1 + - -
prase 45/2 + - -
prase 45/3 + -
Tabulka č. 6b: Neutralizační titry
zvíře den 0 | 20. den po infekci
45/1 - 1:128
45/2 - 1:256
145/3 1 - 1:256
Příklad 7: Princip imunogenicity a utlumení víru BVDV „B-346-d“
Tento experiment se navrhl za účelem zjistit princip utlumení stejně jako imunogenicity viru BVDV ,.Β-346-d“ získaného zpA/B-346-d porovnáním s virem „B-WT“, který se získal z pA/BVDV/Ins-. Virus „B-346-d“ nese samozřejmě mutaci v původním BVDV v poloze 349,
-20CZ 301570 B6 ale nazval se „B-346“, aby indikoval polohu relativní k poloze 346 CSFV Alfort zobrazené na obrázku č. 1.
Vybraly se tří skupiny zvířat, které mají séra BVDV negativní ajsou 3 až 6 měsíců stará. Každá skupina l a 2 obsahovala 5 zvířat, zatímco skupina 3 obsahovala 3 zvířata. Zvířata ve skupině 1 a 2 se infikovala aplikací 2x105 TCID50 mutantu B-346-d (skupina 1) nebo B-WT (skupina 2) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranazálně a podkožně (v oblasti lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat monitorovala virémie pomocí parametrů, jako je virémie krevních buněk a výskyt viru v nosních stěrech. Navíc se sledovaly klinicio ké parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.
Za účelem zkoumání ochranné imunity proti infekci antigenně heterologním a virulentním izolátem BVDV (č. 13) se 77. den po infekci opakovala vakcinace zvířat v první skupině mutantem is B-346-d. Zvířata skupiny 3 sloužila jako pozitivní kontrola a infikovala se způsobem popsaným v případě zvířat skupiny 1 s virulentním izolátem BVDV. Virus BVDV (č. 13) patří k odlišné antigenní skupině (typ Π), zatímco virus B-346-d spadá na základě klasifikace popsané v publikaci Pellerin, C., et al., Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities, Virology 203,1994:260-268, do antigenní skupiny I. Zvířata ve skupině 1 a 3 se infikovala dávkou 2x106 TCIDS0 izolátu BVDV (Č. 13) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranazálně a podkožně (v oblasti lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat pozorovala virémie a zaznamenávala se pomocí parametrů, jako je virémie krevních buněk a výskyt viru v nosních stěrech. Navíc se sledovaly klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obec25 né zdravotní parametry.
Po infekci mutantem „B-346-d“ zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce virem BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu (tabulka č. 7a) nebo jiné respirační klinické symptomy (nejsou uvedeny).
Redukovaná virémie krevních buněk (tabulka č. 7b) a přítomnost viru v nosním výtěru (tabulka Č. 7c) neindikuje jasně utlumení B-346-d ve srovnání s B-WT.
Virulentní izolát BVDV ě. 13 vyvolává u zvířat skupiny 3 silnou viremii s typickými příznaky infekce BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu po dobu několika dní (uvádí se v tabulce č. 7c), silnou leukopenií (uvádí se v tabulce Č. 7e), rozsáhlou viremii krevních buněk (uvádí se v tabulce ě. 7ť) a zastoupení viru ve stěru nasální tekutiny (uvádí se v tabulce ě. 7g). Naopak zvířata skupiny 1, která se vakcinovala infekcí s B-346-d, nevykazují po infekci virulentním izolátem BVDV č. 13, skoro žádné klinické příznaky, které jsou typické pro infekci
BVDV. Po infekci nedošlo k podstatnému zvýšení tělesné teploty měřené v rektu (uvádí se v tabulce č. 7d). Pozorovaná leukopenie byla zanedbatelná vzhledem k síle a délce trvání (uvádí se v tabulce Č. 7e). Z krve se neizoloval žádný virus BVDV (uvádí se v tabulce Č. 7f) a pouze u jednoho zvířete bylo možné detekovat virus v nosním stěru (uvádí se v tabulce č. 7g).
Proto infekce mutantem B-346-d vyvolává silnou imunitu, které jasně redukuje klinické příznaky, zastoupení viru a viremii krevních buněk po opakované infekci heterologním izolátem BVDV.
-21 CZ 301570 B6
Tabulka č. 7a: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 (B-346-d) a 2 (B-Wf)
der. stud ie 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
skup ina 1 38,8 39,1 39,0 30,7 38,9 : 38, 7 30,7 38, 5 38,7 38,5 30,5 38,5 38,4 38,9 38,7
a kup ina 2 39,8 39,0 30,9 36,6 38,6 38,7 38, 6 38, 4 39,1 38,4 38,7 38,6 38,7 38, 6 38, 6
Zvířata ze skupiny I se infikovala v den 0 6x 106 TCID50 B-346-d, zatímco zvířata ze skupiny 2 se infikovala 6xl06 TCID50 B-WT.
Tabulka č. 7b: Viremie krevních buněk u zvířat skupiny 1 a 2
skupina zvíře nasální štíry první den naaální štíry poslední den trváni přítomnosti viru v nasilnich štírech (dny) průměrné trváni skupiny (dny)
1 1 6 6 1 1,4
2 4 6 2
3 5 5 1
4 - - 0
5 6 9 3
2 6 4 8 5 4,4
7 4 7 4
8 4 7 4
9 4 7 4
10 4 8 5
Krev zředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci mutanty B-346-d io a B-WT. Do každé ze třech kuitur buněk telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení v koncentraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyktonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a nási5 ledně rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV se 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buňkách Cte.
-22CZ 301570 B6
Tabulka č. 7c: Virus zastoupený v nosní tekutině
skupina ivite nalilni stěry první, den nasální štíry poíledni den trváni přítomnosti viru v v exudátU průměrný počet dní, kdy se virus detekoval ve Skupině
1 1 4 8 4 2,6
2 6 6 1
3 4 4 1
4 5 7 3
5 3 6 4
2 6 6 8 3 3,6
7 5 7 3
8 5 8 4
9 5 6 2
10 3 9 6
Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debris a kontaminanty. Odstranil se supematant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml Čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detakovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.
io Tabulka č. 7d: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 a 3
den stu- die -1 -2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14
sku- pina 1 38,4 38,8 38,5 38,5 38,6 38,4 38,4 38,4 38,3 38,4 38,4 38,4 38,4 38,4 38,5
sku- pina 3 38,8 39,1 38,8 39,1 39,4 39,7 40,2 40,2 40,4 41,3 40,2 40,1 40,2 40,8 40,4
Tělesná teplota měřená v rektu se zaznamenávala až 16 dní po infekci. Zvířata ze skupiny 1 a 3 se infikovala 6x106 TCIDso virulentního izolátu BVDV #13.
Tabulka ě: 7e: Průměrný počet bílých krvinek
den stu- die -1 -2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14
sku- pina 1 11,9 11,9 11,3 10,8 9,2 8,2 8,9 9,9 11,2 11,6 11,6 10,6 10,8 10,8 9,4
sku- pina 3 11,7 15,8 13,8 11,1 7,7 9,8 7,4 6,8 8,7 8,7 7,8 8,1 6,2 6,4 6,2
-23CZ 301570 B6
Vzorky krvinek v EDTA se odebíraly denně ode dne -2 do 14. dne po infekci z každého zvířete v obou skupinách. Počet bílých krvinek ve vzorcích krve v EDTA se stanovil za použití přístroje Sysmex Mikro-Cell Counter F800.
Tabulka č. 7f: BVDV izolovaný ze vzorku krve
skupina zvíře virus detekovaný v krvi první den virus detekovaný v krvi poslední den doba trváni přítomnosti viru v krvi (dny) průměrná doba trváni (dny)
1 1 - - 0 0
2 - - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 - - %
3 11 3 10 8 9,7
12 12 14 12
13 3 9 9
Krev ředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci. Do každé ze třech kultur buněk telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení v konío centraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyk tonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následně rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV, 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buňkách Cte.
Tabulka č. 7g: Virus zastoupený v nosní tekutině
skupina zvíře nasální stěry první den nasální stěry poslední den trváni přítomnosti viru v v nosní tekutině (dny, průměrná doba trvání (dny ve skupině)
1 1 3 4 2 O oo
2 - - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 4 5 2
3 11 3 14 12 10
12 3 14 12
13 3 8 6
Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debris a kontaminanty. Odstra20 nil se supematant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detakovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.
-24Cl 301570 B6
Příklad 8: Diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje delecí histidinového kodonu 346 pomocí RT-PCR
Sekvence RNA kódující konzervativní motiv RNázy v CSFV glykoproteinu ERNS je silně konzer5 vativní. Mezi všemi známými sekvencemi CSFV se nezjistily v oblasti odpovídající zbytkům 1387 až 1416 publikované sekvence CSFV kmene Alfort (Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567) žádné změny nukleotidů. Oligonukleotidové primery získané ztéto konzervativní oblasti genomu se mohou použít v testu RT-PCR za účelem detekce všech izolátů CSFV io (uvádí se na obrázku ě. 7). Následkem toho je možné nepřítomnost tripletu kódujícího histidin 346 (nukleotidy 1399-1401) detekovat RT-PCR s vhodně navrženým primerem. Syntetizovaly se různé oligonukleotidy, které pokrývají konzervativní oblast, které buď obsahovaly, nebo neobsahovaly histidinový kodon. Tyto oligonukleotidy sloužily jako primery proti směru exprese genu při reakcích RT-PCR spolu s oligonukleotidem ERNS-Stop, kteiý sloužil jako primer po směru exprese genu. RNA čištěná z tkáňové kultury buněk se infikovala mutanty C-346-d, CWT, C-346-L nebo C-346-K se použila jako templát. Reverzní transkripce 2 gg teplem denaturované RNA (2 min při teplotě 92 °C, 5 minut na ledu v 11,5 μΐ vody v přítomnosti 30pMol reverzního primerů) se provedla po přidání 8 μΐ směsi RT (125 mM Tris/HCl pH 8,3,182,5 mM Kel, 7,5 mM MgCb, 25 mM dithiotreitol, 1,25 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U
RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Germany) a 50 U Superscript (Life Technologies/BLR, Eggenstein, Germany) po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Po ukončení reverzní transkripce se zkumavky umístily na led a přidalo se 30 μΐ směsi pro PCR (8,3 mM Tris/HCl, pH 8,3, 33,3 mM Kel, 2,2 mM MgCl2, 0,42 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 0,17 % Triton X100,0,03 % albuminu bovinního séra, 5U polymerázy Taq (Appligene, Heidelberg, Germany) a 16,7%
DMSO). V případě, že se použil primer ΟΙ H+3, reakční směs pro amplifikaci neobsahovala DMSO. Amplifikace se provedla v 36 cyklech (30 vteřin při teplotě 94 °C, 30 vteřin při teplotě 57 °C, 45 vteřin při teplotě 74 °C). 1 μΙ amplifikační reakce se nanesl na 1% agarózový gel a amplifikovaný produkt se oddělil na elektroforéze a obarvil se ethidiumbromidem. Jak se uvádí na obrázku č. 7, pár primerů ΟΙ H-3/OI EmsStop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující deleci kodonu 346, zatímco další dva primery umožňují získat produkty obsahující kodon 346. Když se jako templát použila RNA delecí uvedeného kodonu, pak se na elektroforéze nepozoroval žádný pruh.
Primeiy vhodné pro RT-PCR:
primery proti směru exprese genu:
Ol H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT ΟΙ H+2: TGGAACAAACATGGATGG
Ol H+3: GAATGGAACAAACATGGA primery po směru exprese genu:
Ol E^Stop: GGAATTCTGAGGCATAGGCACCAAACCAGG
-25CZ 301570 B6
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová io (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka - BVDV Ems delece v poloze 346/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
Met 1 Glu Leu He Thr 5 Asn Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Tyr Lys Gin 15 Lys
Pro Ala Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Gin Ala Gly Asn 30 Pro Leu
Phe Gly Glu 35 Arg Gly val Ile His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Lys 50 Arg Gly Glu Arg Glu 55 Val Pro Thr Asn Leu 60 Ala Ser Leu Pro
Lys 65 Arg Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn Ser Lys 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Leu Lys Pro 85 Gly Pro Leu Phe Tyr 90 Gin Asp Tyr Lys Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Glu Glu Ala Ser 110 Met Cys
Glu Thr Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 val Thr Gly Ser Asp 125 Ser Arg Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Ile 135 Asp Gly Cys Ile Ile 140 Val Lys Ser Ala
Thr 145 Lys Asp Arg Gin Lys 150 Val Leu Lys Trp val 155 His Asn Lys Leu Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Ser Ser Cys Ser Asp 170 Thr Lys Asp Glu Gly 175 Val
Val Arg Lys Lys 180 Gin Gin Lys Pro Asp 185 Arg Leu Glu Lys Gly 190 Arg Met
Lys Ile Thr 195 Pro Lys Glu Ser Glu 200 Lys Asp Ser Lys Thr 205 Lys Pro Pro
-26CZ 301570 B6
Asp Ala Thr Ile Val Val Asp Gly Val Lys Tyr Gin Val Lys Lys Lys
210 215 220
Gly Lys Val Lys Ser Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys
225 230 235 240
Asn Lys Pro Gin Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala
245 250 255
Trp Ala Ile Ile Ala Leu Val Phe Phe Gin Val Thr Met Gly Glu Asn
260 265 270
Ile Thr Gin Trp Asn Leu Gin Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gin Arg
275 280 285
Ala Met Phe Gin Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly ile Trp Pro
290 295 300
Glu Lys Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Glu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr
325 330 335
Thr Cys Cys Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Gly Trp Cys Asn
340 345 350
Trp Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Ile Leu Leu Met Asn Lys Thr Gin Ala
355 360 365
Asn Leu Thr Glu Gly Gin Pro Leu Arg Glu Cys Ala val Thr Cys Arg
370 375 380
Tyr Asp Arg Asp Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asp Ser
385 390 395 400
Pro Thr Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala
405 410 415
Gly Ile Leu Val Gin Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val Ser Asp
420 425 430
Val Leu Phe Lys Glu His Asp Cys Thr Ser Val Ile Gin Asp Thr Ala
435 440 445
HÍ3 Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg Gin
450 455 460
Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Arg Gin Leu Gly Ile Leu
465 470 475 480
Gly Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala
485 490
-27CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
io (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka - BVDV Erns mutant 295 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 1 S 10 15 pro Val Gly Val Glu Glu Pro val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30
Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45
His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 30
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser 165 170 175
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220
-28CZ 301570 Bó
Lys
225
Pro
Ile
Trp
Leu
Cys
305
Ile
Arg
Asn
Thr
Lys
385
Thr
Val
Tyr
Leu
Ala
465
Lys
Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
23S 240
Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Arg Gly Val Asn Arg Gly Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Lys Gly Val pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
310 315 320
Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 345 350
Ile Asp Pro Trp ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355 360 365
Glu Gly Pro Pro ASp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 375 380
Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr
390 395 400
Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr
405 410 415
Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu
420 425 430
Gly Asp His Glu cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr
435 440 445
Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450 455 460
Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
470 475 480
Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490 495
-29CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant delece 296-7-8/ is (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Met Glu Leu Asn His Phe Glu
1 5
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr
145 150
Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 10 15
Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 25 30
His Pro Gla Ser Thr Leu Lys Leu Pro 40 45
Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro €0
Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 90 95
Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 105 110
Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 120 125
Asp Gly Cys ile Leu Leu Lys Leu Ala 140
Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 ISO
30CZ 301570 B6
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser
165 170 175
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala
180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr
195 200 205
ile val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Ile Trp Pro Glu Lys He Cys Lys Gly
290 295 300
val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu Ile Arg Gly
305 310 315 320
Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gin
325 330 335
Arg His Glu Trp Asn Lys Hig Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp
340 345 350
Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu Gly
355 360 365
Pro Pro Aep LyS Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn Thr
370 375 380
Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr
385 390 395 400
Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile Glu
405 410 415
Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp
420 425 430
His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu Asp
435 440 445
Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg Val
450 455 460
Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu Glu
465 470 475 480
Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-31CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
s (A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka - CSFV Ems mutant delece v poloze 297/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Met I Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Giu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
-32CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His . 235 Asn Lys Asn Lys
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met
Leu Arg Gly 290 Val Asn Arg Ser 295 Leu Gly Ile Trp Pro 300 Glu Lys Ile
Lys 305 Gly Val Pro Thr His 310 Leu Ala Thr Asp Thr 315 Glu Leu Lys Glu
Arg Gly Met Met Asp 325 Ala Ser Glu Arg Thr 330 Asn Tyr Thr Cys Cys 335
Leu Gin Arg His 340 Glu Trp Asn Lys His 345 Gly Trp Cys Asn Trp 350 Tyr
Ile Asp Pro 355 Trp Ile Gin Leu Met 360 Asn Arg Thr Gin Thr 365 Asn Leu
Glu Gly 370 Pro Pro Asp Lys Glu 375 Cys Ala val Thr Cys 380 Arg Tyr Asp
Asn 385 Thr Asp Val Asn Val 390 Val Thr Gin Ala Arg 395 Asn Arg Pro Thr
Leu Thr Gly Cys Lys 405 Lys Gly Lys Asn Phe 410 Ser Phe Ala Gly Thr 415
Ile Glu Gly Pro 420 Cys Asn Phe Asn Val 425 Ser Val Glu Asp Ile 430 Leu
Gly Asp His 435 Glu Cys Gly Ser Leu 440 Leu Gin Asp Thr Ala 445 Leu Tyr
Leu Asp 450 Gly Met Thr Asn Thr 455 Ile Glu Asn Ala Arg 460 Gin Gly Ala
Arg 465 Val Thr Ser Trp Leu 470 Gly Arg Gin Leu Ser 475 Thr Ala Gly Lys
Leu Glu Arg Arg Ser 485 Lys Thr Trp Phe Gly 490 Ala Tyr Ala Leu
Pro
240
Val·
Gin
Tyr
Cys
Ile
320
Arg
Asn
Thr
Lys
Thr
400
Val
Tyr
Leu
Ala
Lya
430
33CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Erns mutant delece v poloze 297 K/
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr Asp 25 Thr Ala Gly Arg 30 Pro LeU
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu Lys 45 Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly ASp Cys Arg Ser 70 Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140
Lya Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser
165 170 17S
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205
Ile Val Val Clu Gly Val Lys Τ'/r Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220
-34CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys Pro 240
Pro Glu Ser Arg Lye 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr Asn 280 Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu Lys Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys Ile
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 340 His Glu Trp Asn Lys 345 His Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
Asn Ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu Met 360 Asn Arg Thr Gin 365 Thr Asn Leu
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys 375 Glu Cys Ala Val Thr 380 Cys Arg Tyr Asp
Lys 385 Asn Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395 Arg Asn Arg Pro Thr 400
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn 410 Phe ser Phe Ala Gly 415 Thr
Val Ile Glu Gly 420 Pro Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser Val Glu Asp 430 Ile Leu
Tyr Gly Asp 435 His Glu Cys Gly Ser Leu 440 Leu Gin Asp Thr 445 Ala Leu Tyr
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn 455 Thr Ile Glu Asn Ala 460 Arg Gin Gly Ala
Ala 465 Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475 Ser Thr Ala Gly Lys 480
Lys Leu Glu Arg Arg 485 Ser Lys Thr Trp Phe 490 Gly Ala Tyr Ala Leu 495
-35CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY; protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Erns mutant 297 L/
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 12S Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
-36CZ 301570 B6
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys Pro 240
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 235 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu Leu Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys Ile
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 340 His GlU Trp Asn Lys 345 His Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
Asn ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu 360 Met Asn Arg Thr Gin 365 Thr Asn Leu
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys 375 Glu Cys Ala Val Thr 380 Cys Arg Tyr Asp
Lys 385 Asn Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395 Arg Asn Arg Pro Thr 400
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Aen 410 Phe Ser Phe Ala Gly 415 Thr
val Ile Glu Gly 420 Pro Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser Val Glu Asp 430 Ile Leu
Tyr Gly Asp 43S His Glu Cys Gly Ser 440 Leu Leu Gin Asp Thr 445 Ala Leu Tyr
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn 455 Thr Ile Glu Asn Ala 460 Arg Gin Gly Ala
Ala 465 Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475 Ser Thr Ala Gly Lys 480
Lys Leu Glu Arg Arg 485 Ser Lys Thr Trp Phe 490 Gly Ala Tyr Ala Leu 495
(2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 301/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15 10 15
Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30
Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45
His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110
Glu Val Thr Lys Arg Tle Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser
165 170 175
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220
-38CZ 301570 B6
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Glu Lya Ile Cys
290 295 300
Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu Ile
305 310 315 320
Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg
325 330 335
Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn
340 345 350
Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr
355 360 365
Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys
370 375 380
Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr
385 390 395 400
Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val
405 410 415
Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr
420 425 430
Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu
435 440 445
Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala
450 455 460
Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys
465 470 475 480
Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-39CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
io (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka - CSFV Ems mutant 302 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly ASp 55 Ile
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly
Ile Tyr lle Lys Pro 35 Gly Pro Val
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys
Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 10 15
Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 25 30
Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 30
Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 90 95
Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 105 110
Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Trp Ue Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser 170 175
-40CZ 301570 B6
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala
180 185 190
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser Lys 200 Thr Lys Pro Pro Asp 205 Ala Thr
Ile Val Val 210 Glu Gly Val Lys Tyr Gin 215 Ile Lys Lys Lys Gly 220 Lys Val
Lys Gly Lys 225 Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn 235 Lys Pro 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys 245 Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp 250 Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr 260 Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr Asn 280 Gly Ile Gin Arg Ala 285 Met Tyr
Leu Arg Gly 290 Val Asn Arg Ser Leu His 295 Gly Ile Trp Pro Ala 300 Lys Ile
Cys Lys Gly 305 Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu 315 Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met Asp 325 Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr 330 Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg His Glu 340 Trp Asn Lys 345 His Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
Asn Ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu Met 360 Asn Arg Thr Gin Thr 36S Asn Leu
Thr Glu Gly 370 Pro Pro Asp Lys Glu Cys 375 Ala Val Thr Cys Arg 380 Tyr Asp
Lys Asn Thr 3Θ5 Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg 395 Pro Thr 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys 405 Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala 410 Gly 415 Thr
Val Ile Glu Gly Pro Cys 420 Asn Phe Asn 425 Val Ser Val Glu Asp 430 Ile Leu
Tyr Gly Asp 43S His Glu Cys Gly Ser Leu 440 Leu Gin Asp Thr Ala 445 Leu Tyr
Leu Leu Asp 450 Gly Met Thr Asn Thr Ile 455 Glu Asn Ala Arg Gin 460 Gly Ala
Ala Arg Val 465 Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala 475 Gly Lys 480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser 485 Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala 490 Leu 495
-41 CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 305 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly ASp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 12 0 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg GlU 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
-42CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr
Pro Glu Ser Arg Lys 245
Ile Thr Ile Leu 260 Leu
Trp Asn Leu 275 Ser Asp
Leu Arg Gly 290 Val Asn
Gly Lys Gly Val Pro
305
Ile Arg Gly Met Met 325
Arg Leu Gin Arg 340 His
Asn Ile Asp 355 Pro Trp
Thr Glu 370 Gly Pro Pro
Lys 385 Asn Thr Asp Val
Thr Leu Thr Gly Cys 405
Val Ile Glu G.ly 420 Pro
Tyr Gly Asp 435 His Glu
Leu Leu 450 Asp Gly Met
Ala 465 Arg Val Thr Ser
Lys Leu Glu Arg Arg
485
Gin Asp Gly Leu Tyr His
230 235
Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu
Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala
Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile
Arg Ser 295 Leu His Gly Ile
Thr His Leu Ala Thr Asp
310 315
Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr
Glu Trp Asn Lys 345 His Gly
Ile Gin Leu 360 Met Asn Arg
Asp Lys 375 Glu Cys Ala Val
Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395
Lys Lys Gly Lys Asn 410 Phe
Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser
Cys Gly Ser 440 Leu Leu Gin
Thr Asn 455 Thr Ile Glu Asn
Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475
Ser Lys Thr Trp Phe Gly
490
Asn Lys Asn Lys Pro 240
Leu Ala Trp Ala Val 255
Glu Asn Ile Thr Gin 270
Gin Arg Ala Met Tyr 285
Trp Pro Glu Lys Ile 300
Thr Glu Leu Lys Glu
320
Asn Tyr Thr Cys Cys 335
Trp Cys Asn Trp Tyr 350
Thr Gin Thr Asn Leu 365
Thr Cys Arg Tyr Asp 380
Arg Asn Arg Pro Thr 400
Ser Phe Ala Gly Thr 415
Val Glu Asp Ile Leu 430
Asp Thr Ala Leu Tyr 445
Ala Arg Gin Gly Ala 460
Ser Thr Ala Gly Lys 480
Ala Tyr Ala Leu 495
43CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 340 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro val Gly val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn Pro 35 Ser Glu Val HÍS 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu His Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr cys 335
Arg Leu Gin Gly 340 His Glu Trp Asn Lys 345 His Gly Txp Cys Asn 350 Trp
Asn Ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu 360 Met Asn Arg Thr Gin 365 Thr Asn
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys 375 Glu Cys Ala Val Thr 380 Cys Arg Tyr
Lys 38S Asn Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395 Arg Asn Arg Pro
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn 410 Phe Ser Phe Ala Gly 415
Val Ile Glu Gly 420 Pro Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser Val Glu Asp 430 Ile
Tyr Gly Asp 435 His Glu Cys Gly Ser 440 Leu Leu Gin Asp Thr 445 Ala Leu
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn 455 Thr Ile GlU Asn, Ala 460 Arg Gin Gly
Ala 465 Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475 Ser Thr Ala Gly
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490 495
Pro
240
Val
Gin
Tyr
Ile
Glu
320
Cys
Tyr
Leu
Asp
Thr
400
Thr
Leu
Tyr
Ala
Lys
480
-45CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA; 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Erns mutant delece 342-6/ is (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1 5 10 15
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile Arg 155 Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg GlU 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly LyS Val
-46CZ 301570 B6
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys 245 Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 250 255
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro val Ala Ala Glu Asn 265 Ile Thr Gin 270
Trp Asn Leu Ser 275 Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg 280 285 Ala Met Tyr
Leu Arg Gly Val 290 Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro 295 300 Glu Lys Ile
Cys Lys Gly Val 305 Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp Thr Glu 315 Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met Asp 325 Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr 330 Thr Cys Cys 335
Arg Leu Gin Arg 340 His Trp Asn Lys Gly Trp Cys Asn Trp 345 Tyr Asn Ile 350
Asp Pro Trp Ile 355 Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn 360 365 Leu Thr Glu
Gly Pro Pro Asp 370 Lys Glu Cys Ala Val Thr cys Arg Tyr 375 380 Asp Lys Asn
Thr Asp Val Asn 385 Val Val 390 Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro 395 Thr Thr Leu 400
Thr Gly Cys Lys Lys Gly 405 Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly 410 Thr val Ile 415
Glu Gly Pro cys 420 Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile 425 Leu Tyr Gly 430
Asp His Glu Cys 435 Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu 440 445 Tyr Leu Leu
Asp Gly Met Thr 450 Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly 455 460 Ala Ala Arg
Val Thr Ser Trp 465 Glu Arg Arg Ser Leu Gly 470 Lys Thr Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu 475 480 Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-47CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 342/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
Met Glu 1 Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg ASp Leu Pro
Arg Lys 65 Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys Arg 145 Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 He Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Tle Val 210 val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
-48CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys Pro 240
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ue Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser ASp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu His Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys Ile
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 340 His Trp Asn Lys His 345 Gly Trp Cys Asn Trp 350 Tyr Asn
Ile Asp Pro 355 Trp Ile Gin Leu Met 360 Asn Arg Thr Gin Thr 365 Asn Leu Thr
Glu Gly 370 Pro Pro ASp Lys Glu 375 Cys Ala val Thr Cys 380 Arg Tyr Asp Lys
Asn Thr Asp Val Agn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr
385 390 395 400
Leu Thr Gly Cys Lys 405 Lys Gly Lys Asn Phe 410 Ser Phe Ala Gly Thr 415 Val
Ile Glu Gly Pro 420 Cys Asn Phe Asn Val 425 Ser Val Glu Asp Ile 430 Leu Tyr
Gly Asp His 435 Glu Cys Gly Ser Leu 440 Leu Gin Asp Thr Ala 445 Leu Tyr Leu
Leu Asp 450 Gly Met Thr Asn Thr 455 Ile Glu Asn Ala Arg 460 Gin Gly Ala Ala
Arg 465 Val Thr Ser Trp Leu 470 Gly Arg Gin Leu Ser 475 Thr Ala Gly Lys Lys 480
Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-49CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 343 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Met 1 Glu Leu Asn HÍS 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn HiS Leu 7S Gly Pro val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
-50CZ 301570 B6
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr
195 200 205.
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 230 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
2 90 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr HÍS Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met ASp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Gly Asn Lyg HiS Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 345 350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355 360 365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 375 380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr
385 3 90 395 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr
405 410 415
Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser val Glu Asp Ile Leu
420 425 430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin ASp Thr Ala Leu Tyr
435 440 445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
46S 470 475 480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
435 490 495
-51 CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka - CSFV Ems delece v poloze 346-7/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lye
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 1Ú0 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 12 5 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 13 5 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn. Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 135 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Giu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys ΊΟ η Lys Gly Lys Val
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 ASp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys Pro 240
-52CZ 301570 B6
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser Leu 295 His Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys Ile
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Tle Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp
340 345 350
Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu Gly
355 360 365
Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn Thr
370 375 380
Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr
385 390 395 400
Gly Cys Lys bys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile Glu
405 410 415
Gly Pro cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp
420 425 430
His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu Asp
435 440 445
Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg Val
450 455 460
Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu Glu
465 470 475 480
Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-53CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Erns mutant v poloze 345-6/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1 5 10 15
Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu
20 25 30
Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro
35 40 45
His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro
50 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly
65 70 75 80
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro
85 90 95
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe cys
100 105 110
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu
115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys val Asp Gly cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala
130 135 140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp ile Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 i$q
-54CZ 301570 B6
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser
165 170 175
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala
180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro ASp Ala Thr
195 200 205
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 230 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg HÍS Glu Trp Asn Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile
340 345 350
Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu
355 360 365
Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn
370 375 380
Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu
385 390 395 400
Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile
405 410 415
Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly
420 425 430
Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu
435 440 445
Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg
450 455 460
Val Thr ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu
465 470 475 480
Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-55CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 345 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 ASp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val HÍ3 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn. His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Zle Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val cyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp val 165 Thr ser Cys ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
-56CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn ; Thr Gin 230 : Asp Gly Leu 1 . Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys pro 240
Pro Glu Ser • Arg f Lys 245 i Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu 260 . Leu Tyr ’ Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr Asn 280 Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu His Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys Ile
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 340 His Glu Trp Asn Ala 345 His Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
Asn Ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu Met 360 Asn Arg Thr Gin 365 Thr Asn Leu
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys 375 Glu Cys Ala Val Thr 380 Cys Arg Tyr Asp
Lys 385 Asn Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395 Arg Asn Arg Pro Thr 400
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn 410 Phe ser Phe Ala Gly 415 Thr
Val ile Glu Gly 420 Pro Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser Val Glu Asp 430 Ile Leu
Tyr Gly Asp 435 His Glu Cys Gly Ser Leu 440 Leu Gin Asp Thr 445 Ala Leu Tyr
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn 455 Thr Ile Glu Asn Ala 460 Arg Gin Gly Ala
Ala 465 Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475 Ser Thr Ala Gly Lys 480
Lys Leu Glu Arg Arg 485 Ser Lys Thr Trp Phe 490 Gly Ala Tyr Ala Leu 495
-57CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 346-7/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cy3 Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
-58CZ 301570 B6
Lys Gly Lys 225 Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile
340 345 350
Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu
355 360 365
Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn
370 375 380
Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu
385 390 395 400
Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile
405 410 415
Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly
420 425 430
Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu
435 440 445
Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg
450 455 460
Val Thr ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu
465 470 475 480
Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-59CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant v poloze 346/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
Met 1 Glu Leu Asn HiS 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin IS Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 14 0 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
-60CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys Pro 240
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu His Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys ile
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 340 His Glu Trp Asn Lys 345 Gly Trp Cys Asn Trp 350 Tyr Asn
Ile Asp Pro 355 Trp Ile Gin Leu Met 360 Asn Arg Thr Gin Thr 365 Asn Leu Thr
Glu Gly 370 Pro Pro Asp Lys Glu 375 Cys Ala val Thr Cys 380 Arg Tyr Asp Lys
Asn 3 85 Thr Asp Val Asn Val 390 Val Thr Gin Ala Arg 395 Asn Arg Pro Thr Thr 400
Leu Thr Gly Cys Lys 405 Lys Gly Lys Asn Phe 410 Ser Phe Ala Gly Thr 415 Val
Ile Glu Gly Pro 420 Cys Asn Phe Asn Val 425 Ser Val Glu Asp Ile 430 Leu Tyr
Gly Asp His 435 Glu Cys Gly Ser Leu 440 Leu Gin Asp Thr Ala 44 5 Leu Tyr Leu
Leu Asp 450 Gly Met Thr Asn Thr 455 Ile Glu Asn Ala Arg 460 Gin Gly Ala Ala
Arg 465 Val Thr Ser Trp Leu 470 Gly Arg Gin Leu ser 475 Thr Ala Gly Lys Lys 480
Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490
-61 CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 346 K7 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15 10 15
Pro val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30
Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45
His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly
70 75 30
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro
90 95
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp He Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser
165 170 175
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220
-62CZ 301570 B6
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Lys Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 345 350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355 360 365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 375 380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg pro Thr
385 390 395 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr
405 410 415
Val ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu
420 425 430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr
435 440 445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
465 470 475 480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490 495
-63CZ 301570 Bó (2) Informace o SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
ío (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Olu Val His 40 Pra Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 15 0 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
-64CZ 30157« B6
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser
165 170 175
Lys Asp Lys Lys Pro ASp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala
100 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys ASp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr
195 200 205
Ile Val val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 2S0 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Leu Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 345 350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355 360 365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 375 380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr
385 390 395 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr
405 410 415
Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu
420 425 430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr
435 440 445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
465 470 475 480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490 495
-65CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 297 K 346 K/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21 :
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1 5 10 15
Pro Val Gly Val Glu Glu Pro 20 Val Tyr Asp 25 Thr Ala Gly Arg Pro 30 Leu
Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val 35 His Pro Gin 40 Ser Thr Leu Lys Leu 45 Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu 60 Pro
Arg Lys 65 Gly Asp Cys Arg Ser 70 Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser 75 Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro 85 val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu 100 Glu Phe Phe 10S Aep Glu Ala Gin phe 110 Cys
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr 115 120 Gly Ser Asp Gly Lys 125 Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu HO Ala
Lys Arg 145 Gly Thr Pro Arg Thr 150 Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr 155 Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser 165 Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg 130 Met Asn Lys 185 Gly Lys Leu Lys Ile 190 Ala
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp 195 Ser Lys Thr 200 Lys Pro Pro Asp Ala 205 Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys 220 val
-66CZ 301570 B6
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu Lys Gly Ile Trp Pro Glu
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu
3 05 310 315
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr
325 330
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Lys Gly Trp Cys Asn
340 345 350
Asn Ile ASp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr
355 360 365
Thr Glu Gly Pro Pro ASp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg
370 375 380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg
385 390 395
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala
405 410
Val ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp
420 425 430
Tyr Gly Asp HÍS Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala
435 440 445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin
450 455 460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala
465 470 475
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala
255
335
415
485
490
320
400
480
495
-67CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 22;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 297 K 346 L/ !5 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His Pro 40 Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg Val 120 Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn IBS Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser Lys 200 Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
-68CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Lev. iyr His 235 Asn Lys Asn Lys Pro 240
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255 Val
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr Gin
Trp Asn Leu 275 ser Asp Aen Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met Tyr
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu Lys Gly Ile Trp 300 Pro Glu Lys Ile
Cys 305 Lys Gly VaJ Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 340 His Glu Trp Asn Lys 345 Leu Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
Asn Ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu 360 Met Asn Arg Thr Gin 365 Thr Asn Leu
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys 375 Glu Cys Ala Val Thr 380 Cys Arg Tyr Asp
Lys 385 Asn Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395 Arg Asn Arg Pro Thr 400
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn 410 Phe Ser Phe Ala Gly 415 Thr
Val Ile Glu Gly 420 Pro Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser val Glu Asp 430 Ile Leu
Tyr Gly Asp 435 His Glu Cys Gly Ser 440 Leu Leu Gin Asp Thr 445 Ala Leu Tyr
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn 455 Thr Ile Glu Asn Ala 460 Arg Gin Gly Ala
Ala 465 Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475 Ser Thr Ala Gly Lys 480
Lys Leu , Glu Arg Arg 485 Ser Lys Thr Trp Phe 490 Gly Ala Tyr Ala Leu 495
69CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
to (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 297 L 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly ASp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 13Ξ Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Aep Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys Lys 220 Lys Gly Lys val
-70CZ 301570 B6
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys 245 Leu Glu Lys Ala Leu Leu 250 Ala Trp Ala Val 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr 260 Gin Pro Val Ala Ala Glu 265 Asn Ile Thr Gin 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn 275 Gly Thr Asn Gly Ile Gin 280 Arg Ala Met Tyr 235
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser Leu Leu Gly Ile Trp 295 300 Pro Glu Lys Ile
Cys Lys 305 Gly Val Pro Thr 310 His Leu Ala Thr Asp Thr 315 Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg Gly Met Met Asp 325 Ala Ser Glu Arg Thr Asn 330 Tyr Thr Cys Cys 335
Arg Leu Gin Arg His Glu 340 Trp Asn Lys Leu Gly Trp 345 Cys Asn Trp Tyr 350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile 355 Gin Leu Met Asn Arg Thr 360 Gin Thr Asn Leu 365
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr 375 380 Cys Arg Tyr Asp
Lys Asn 385 Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala Arg 395 Asn Arg Pro Thr 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys 405 Lys Gly Lys Asn Phe Ser 410 Phe Ala Gly Thr 415
Val Ile Glu Gly Pro Cys 420 Asn Phe Asn Val Ser Val 425 Glu Asp Ile Leu 430
Tyr Gly Asp His Glu Cys 435 Gly Ser Leu Leu Cln Asp 440 Thr Ala Leu Tyr 445
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala 455 460 Arg Gin Gly Ala
Ala Arg 465 Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu Ser 475 Thr Ala Gly Lys 480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser 435 Lys Thr Trp Phe Gly Ala 490 Tyr Ala Leu 495
-71 CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = BVDV protein Ems/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
Met Glu Leu Ile Thr Asn Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Lys Gin Lys
1 5 10 15
Pro Ala Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Gin Ala Gly Asn Pro Leu
20 25 30
Phe Gly Glu Arg Gly Val Ile His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro
40 45
His Lys 50 Arg Gly Glu Arg Glu 55 Val Pro Thr Asn Leu 60 Ala Ser Leu Pro
Lys 65 Arg Gly ASp Cys Arg 70 Ser Gly Asn Ser Lys 75 Gly Pro val ser Gly 80
Ile Tyr Leu Lys Pro 85 Gly Pro Leu Phe Tyr 90 Gin Asp Tyr Lys Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Glu Glu Ala ser 110 Met Cys
Glu Thr Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Ser Arg Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Ile 135 Asp Gly Cys Ile ile 140 val Lys ser Ala
Thr 145 Lys Asp Arg Gin Lys 150 val Leu Lys Trp Val 155 HÍ3 Asn Lys Leu Asn 160
Cys Pro Leu Trp val L65 Ser Ser Cys Ser Asp 170 Thr Lys Asp Glu Gly 175 Val
Val Arg Lys Lys 180 Gin Gin Lys Pro Asp 185 Arg Leu Glu Lys Gly 190 Arg Met
Lys Ile Thr 195 Pro Lys Glu Ser Glu 200 Lys Asp Ser Lys Thr 205 Lys Pro Pro
Asp Ala 210 Thr Ile Val Val Asp 215 Gly Val Lys Tyr Gin 220 Val Lys Lys Lys
-72CZ 301570 B6
Gly Lys Val 225 Lys Ser Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys
230 235 240
Asn Lys Pro Gin Glu Ser Arg Lys Ly3 Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala
245 250 255
Trp Ala He Ile Ala Leu Val Phe Phe Gin Val Thr Met Gly Glu Asn
260 265 270
Ile Thr Gin Trp Asn Leu Qln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gin Arg
275 280 285
Ala Met Phe Gin Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro
290 295 300
Glu Lys Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Glu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr
325 330 335
Thr cys Cys Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys
340 345 350
Asn Trp Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Ile Leu Leu Met Asn Lys Thr Gin
355 360 365
Ala Asn Leu Thr Glu Gly Gin Pro Leu Arg Glu Cys Ala val Thr Cys
370 375 390
Arg Tyr Asp Arg Asp Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asp
385 390 395 400
Ser Pro Thr Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe
405 410 415
Ala Gly Ile Leu Val Gin Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val Ser
420 425 430
Asp Val Leu Phe Lys Glu His Asp Cys Thr Ser Val Ile Gin Aep Thr
435 440 445
Ala His Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg
450 455 460
Gin Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Arg Gin Leu Gly Ile
4 65 470 475 480
Leu Gly Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala
485 490 495
-73CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV protein Ems/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
-74CZ 301570 B6
Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Aan Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala
180 185 190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr
195 200 205
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Tle Trp Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 345 350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355 360 365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 375 380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr
385 390 395 400
Thr Leu Thr Gly Cys Ly3 Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr
405 410 415
val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu
420 425 430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr
435 440 445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
465 470 475 480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490 495
-75CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 300 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lya Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 12 5 Gly Lys Leu
Tyr His 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 14 0 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165 Thr Ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val 210 Val Glu Gly Val Lys 215 Tyr Gin Ile Lys bys 220 Lys Gly Lys Val
-76CZ 301570 B6
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
22S 230 235 240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
245 250 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
260 265 270
Trp Asn Leu Ser ASp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275 280 285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ile
290 295 300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 310 315 320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
325 330 335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
340 345 350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355 360 365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370 375 380
Lys Asn Thr Asp Val Asn val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr
385 390 395 400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr
405 410 415
Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu
420 425 430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr
435 440 445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
465 470 475 480
Lys Leu Glu Arg Arg ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu
485 490 495
-77CZ 301570 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:
io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:
/poznámka = CSFV Ems mutant 300 G 302 A/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val 20 Glu Glu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Ala Gly Arg 30 Pro Leu
Phe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Val His 40 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leu Pro
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Asp 55 Ile Arg Thr Thr Leu 60 Arg Asp Leu Pro
Arg 65 Lys Gly Asp Cys Arg 70 ser Gly Afin His Leu 75 Gly Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Ile Lys Pro 85 Gly Pro val Tyr Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr Gly 95 Pro
Val Tyr His Arg 100 Ala Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr 115 Lys Arg Ile Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr His 13 0 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Leu 140 Leu Lys Leu Ala
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 150 Thr Leu Lys Trp Ile 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Cys pro Leu Trp Val 165 Thr ser Cys Ser Asp 170 Asp Gly Ala Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 180 Pro Asp Arg Met Asn 185 Lys Gly Lys Leu Lys 190 Ile Ala
Pro Arg Glu 195 His Glu Lys Asp Ser 200 Lys Thr Lys Pro Pro 205 Asp Ala Thr
Ile Val Val Glu Gly val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val
210 215 220
-78CZ 301570 B6
Lys 225 Gly Lys Asn Thr Gin 230 Asp Gly Leu Tyr His 235 Asn Lys Asn Lys
Pro Glu Ser Arg Lys 245 Lys Leu Glu Lys Ala 250 Leu Leu Ala Trp Ala 255
Ile Thr Ile Leu 260 Leu Tyr Gin Pro Val 265 Ala Ala Glu Asn Ile 270 Thr
Trp Asn Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 280 Asn Gly Ile Gin Arg 285 Ala Met
Leu Arg 290 Gly Val Asn Arg Ser 295 Leu His Gly Ile Gly 300 Pro Ala Lys
Cys 305 Lys Gly Val Pro Thr 310 HÍS Leu Ala Thr Asp 315 Thr Glu Leu Lys
Ile Arg Gly Met Met 325 Asp Ala Ser Glu Arg 330 Thr Asn Tyr Thr Cys 335
Arg Leu Gin Arg 340 His Glu Trp Asn Lys 345 His Gly Trp Cys Asn 350 Trp
Asn Ile Asp 355 Pro Trp Ile Gin Leu 360 Met Asn Arg Thr Gin 365 Thr Asn
Thr Glu 370 Gly Pro Pro Asp Lys 375 GlU Cys Ala Val Thr 380 Cys Arg Tyr
Lys 385 Asn Thr Asp Val Asn 390 Val Val Thr Gin Ala 395 Arg Asn Arg Pro
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn 410 Phe Ser Phe Ala Gly 415
Val Ile Glu Gly 420 Pro Cys Asn Phe Asn 425 Val Ser Val Glu Asp 430 Ile
Tyr Gly Asp 43S His Glu Cys Gly Ser 440 Leu Leu Gin Asp Thr 445 Ala Leu
Leu Leu 450 Asp Gly Met Thr Asn 455 Thr Ile Glu Asn Ala 460 Arg Gin Gly
Ala 465 Arg Val Thr Ser Trp 470 Leu Gly Arg Gin Leu 475 Ser Thr Ala Gly
Lys Leu Glu Arg Arg 485 Ser Lys Thr Trp Phe 490 Gly Ala Tyr Ala Leu 495
Pro
240
Val
Gin
Tyr
Ile
Glu
320
Cys
Tyr
Leu
Asp
Thr
400
Thr
Leu
Tyr
Ala
Lys
480
-79CZ 301570 B6

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Utlumený pestivirus, vyznačující se tím, že je deaktivována RNázová aktivita,
    5 kterou vykazuje glykoprotein ERNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, přičemž uvedené delece a/nebo mutace k deaktivaci RNázové aktivity se nacházejí v polohách 295 až 307 a/nebo v polohách 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech za předpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu.
    io
  2. 2. Pestivirus podle nároku 1, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    15
  3. 3. Pestivirus podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    20
  4. 4. Pestivirus podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného glykoproteinu na leucín, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    25 5, BVDV pestivirus podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že
    RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    30 6. BVDV pestivirus podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2 nebo 4, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného glykoproteinu na leucin, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech BVDV.
    35 7. Nukleová kyselina, kódující glykoprotein ERNS podle nároku 1, vyznačující se tím, že je deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein ERNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, přičemž uvedené delece a/nebo mutace k deaktivaci RNázové aktivity se nacházejí v polohách 295 až 307 a/nebo v polohách 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene
    40 Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech za předpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu.
    8. Nukleová kyselina podle nároku 7, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je
    45 zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech,
    9. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoprotei50 nu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    10. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 7až9, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného
    -80CZ 301570 B6 glykoproteinu na leucin Jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    11. BVDV nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 7až9, vyznačující se tím,
  5. 5 že RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech BVDV.
    12. BVDV nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 7 až 8 nebo 10, vyznačující io se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného glykoproteinu na leucin, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
    13. Použití nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 7 až 12 pro přípravu nukleotidových
    15 a/nebo vektorových vakcín.
    14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje pestivirus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 7 až 12.
    20 15. Použití pestivirů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 7 až 12 pro přípravu farmaceutického prostředku pro profylaxi nebo léčení pestivirové infekce u živočichů.
    16. Použití podle nároku, při němž se farmaceutický prostředek podává živočichům, u nichž je
    25 nutno zajistit profylaxi nebo léčení.
    17. Použití pestivirů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 7 až 12 pro výrobu vakcíny nebo farmaceutického prostředku.
CZ20090293A 1998-06-05 1999-05-26 Utlumený pestivirus CZ301570B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98110356A EP0965639A1 (en) 1998-06-05 1998-06-05 Attenuated pestiviruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ301570B6 true CZ301570B6 (cs) 2010-04-21

Family

ID=8232074

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004533A CZ301494B6 (cs) 1998-06-05 1999-05-26 Živá vakcína
CZ20090293A CZ301570B6 (cs) 1998-06-05 1999-05-26 Utlumený pestivirus
CZ20090294A CZ301569B6 (cs) 1998-06-05 1999-05-26 Zpusob detekovatelného znacení pestiviru

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004533A CZ301494B6 (cs) 1998-06-05 1999-05-26 Živá vakcína

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090294A CZ301569B6 (cs) 1998-06-05 1999-05-26 Zpusob detekovatelného znacení pestiviru

Country Status (23)

Country Link
EP (5) EP0965639A1 (cs)
JP (3) JP4632540B2 (cs)
KR (1) KR100637940B1 (cs)
CN (2) CN101085346A (cs)
AR (3) AR020084A1 (cs)
AT (3) ATE311193T1 (cs)
AU (1) AU769823C (cs)
BR (2) BRPI9917787B1 (cs)
CA (1) CA2330241C (cs)
CO (1) CO5050392A1 (cs)
CZ (3) CZ301494B6 (cs)
DE (3) DE69928700T2 (cs)
DK (3) DK1084251T3 (cs)
ES (3) ES2253457T3 (cs)
HU (3) HU228469B1 (cs)
NZ (1) NZ509228A (cs)
PE (1) PE20000552A1 (cs)
PL (2) PL202161B1 (cs)
PT (2) PT1084251E (cs)
SI (3) SI1084251T1 (cs)
SK (3) SK287014B6 (cs)
TR (3) TR200103666T2 (cs)
WO (1) WO1999064604A2 (cs)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
EP1104676A1 (en) 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
PT1149901E (pt) 2000-04-21 2006-08-31 Akzo Nobel Nv Mutantes de pestivirus e vacinas contendo os mesmos
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
UY29915A1 (es) * 2005-11-15 2007-06-29 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna combinada que comprende un virus atenuado de la diarrea viral bovina
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
UY31930A (es) 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
US8815255B2 (en) 2008-10-31 2014-08-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of Mycoplasma bovis antigen
US8846054B2 (en) 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
UY32570A (es) 2009-04-24 2010-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna viva modificada de mycoplasma bovis mejorada
CN101915837B (zh) * 2010-07-28 2013-07-03 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
EP2618841B1 (en) 2010-09-21 2016-10-19 Intervet International B.V. Bvdv vaccine
CN103882051B (zh) * 2014-03-20 2016-04-06 北京市农林科学院 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒
EP3956439A4 (en) * 2019-04-18 2023-05-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. RECOMBINANT CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0794257A1 (en) * 1986-01-27 1997-09-10 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino aced sequence and vaccine containing same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0794257A1 (en) * 1986-01-27 1997-09-10 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino aced sequence and vaccine containing same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hulst M.M. et al.: " Inactivation of the RNase activity of Glycoprotein Erns of Classical Swine Fever Virus results in a cytopathogenic virus", J. Virol., Vol. 72(1), 151-157, 1998 *
Windisch J.M. et al.: "RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies", J. Virol., Vol. 70(1), 352-358, 1996 *

Also Published As

Publication number Publication date
TR200003622T2 (tr) 2001-06-21
TR200103666T2 (tr) 2002-03-21
PT1084251E (pt) 2005-03-31
JP2010259445A (ja) 2010-11-18
ES2257476T3 (es) 2006-08-01
DE69928700T2 (de) 2006-06-22
PL202509B1 (pl) 2009-06-30
HU228468B1 (en) 2013-03-28
CN1304452A (zh) 2001-07-18
BR9911619B1 (pt) 2013-11-12
SK287626B6 (sk) 2011-04-05
EP1203813A2 (en) 2002-05-08
SK18232000A3 (sk) 2001-05-10
CA2330241A1 (en) 1999-12-16
DE69929544D1 (de) 2006-04-13
EP1614423A2 (en) 2006-01-11
ES2253457T3 (es) 2006-06-01
WO1999064604A2 (en) 1999-12-16
ATE286131T1 (de) 2005-01-15
JP2013099357A (ja) 2013-05-23
AR020084A1 (es) 2002-04-10
EP1614423A3 (en) 2008-01-30
EP1084251A2 (en) 2001-03-21
PL348019A1 (en) 2002-05-06
BRPI9917787B1 (pt) 2016-09-06
HU228469B1 (en) 2013-03-28
PL202161B1 (pl) 2009-06-30
SK287014B6 (sk) 2009-09-07
EP1203812A3 (en) 2004-02-04
CN101085346A (zh) 2007-12-12
CO5050392A1 (es) 2001-06-27
DK1203812T3 (da) 2006-04-10
HU228471B1 (en) 2013-03-28
EP1203813A3 (en) 2004-02-04
CZ20004533A3 (cs) 2001-07-11
JP5755265B2 (ja) 2015-07-29
EP1203812A2 (en) 2002-05-08
AR071880A2 (es) 2010-07-21
WO1999064604A3 (en) 2000-01-27
CZ301494B6 (cs) 2010-03-24
SI1203812T1 (sl) 2006-04-30
AU769823B2 (en) 2004-02-05
ATE316380T1 (de) 2006-02-15
CZ301569B6 (cs) 2010-04-21
DK1203813T3 (da) 2006-05-22
DE69928700D1 (de) 2006-01-05
CN100374563C (zh) 2008-03-12
NZ509228A (en) 2003-12-19
DK1084251T3 (da) 2005-04-11
DE69922953D1 (de) 2005-02-03
TR200103664T2 (tr) 2002-06-21
EP1084251B1 (en) 2004-12-29
ES2235488T3 (es) 2005-07-01
PE20000552A1 (es) 2000-07-14
HUP0102707A2 (hu) 2001-11-28
CA2330241C (en) 2010-09-21
ATE311193T1 (de) 2005-12-15
DE69929544T2 (de) 2006-07-20
EP1203813B1 (en) 2006-01-25
SI1203813T1 (sl) 2006-06-30
AU4369299A (en) 1999-12-30
JP2002517250A (ja) 2002-06-18
KR100637940B1 (ko) 2006-10-23
EP1203812B1 (en) 2005-11-30
JP5247770B2 (ja) 2013-07-24
SI1084251T1 (cs) 2005-08-31
SK287625B6 (sk) 2011-04-05
DE69922953T2 (de) 2005-05-19
AU769823C (en) 2004-11-25
EP0965639A1 (en) 1999-12-22
HUP0102707A3 (en) 2008-04-28
JP4632540B2 (ja) 2011-02-16
BR9911619A (pt) 2001-10-02
PT1203813E (pt) 2006-06-30
KR20010071406A (ko) 2001-07-28
AR071881A2 (es) 2010-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5755265B2 (ja) 弱毒化ペスチウイルス
US8895286B2 (en) Attenuated pestiviruses
US6610305B1 (en) Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
MXPA00011971A (en) Attenuated pestiviruses

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20190526