SK287626B6 - Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov - Google Patents

Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov Download PDF

Info

Publication number
SK287626B6
SK287626B6 SK50019-2009A SK500192009A SK287626B6 SK 287626 B6 SK287626 B6 SK 287626B6 SK 500192009 A SK500192009 A SK 500192009A SK 287626 B6 SK287626 B6 SK 287626B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
csfv
virus
infection
glycoprotein
animals
Prior art date
Application number
SK50019-2009A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregor Meyers
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Publication of SK287626B6 publication Critical patent/SK287626B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Je opísaný spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, pri ktorom je inaktivovaná RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, s podmienkou, že aminokyselinami v polohách 297 a/alebo 246, ako sú znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch, nie sú lyzíny, pričom inaktivovanie RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je ERNS glykoproteín, vedie k oslabenému pestivírusu.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu detegovateľného značenia pestivírusov inaktiváciou ribonukleázovej aktivity (RNázovej aktivity), ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS.
Doterajší stav techniky
Pestivírusy sú príčinnými agensmi ekonomicky dôležitých ochorení zvierat v mnohých krajinách po celom svete. Doteraz známe vírusové izoláty boli rozdelené do troch odlišných druhov skupín, ktoré spolu tvoria rod v čeľadi Flaviridae.
I. Bovinný virálny hnačkový vírus (BVDV) spôsobuje vírusovú hnačku hovädzieho dobytka (BVD) a ochorenie sliznice (MD) teliat (Baker, 1987; Moennig a Plagemann, 1992; Thiel a ďalší, 1996).
II. Vírus klasickej horúčky ošípaných (CSFV), predtým nazývaný vírus cholery ošípaných, je zodpovedný za klasickú horúčku ošípaných (CSF) alebo choleru ošípaných (HC) (Moennig a Plagemann, 1992, Thiel a ďalší, 1996).
III. Vírus hraničnej choroby (BDV) sa typicky vyskytuje u oviec a spôsobuje hraničnú chorobu (BD). Podobné symptómy ako pri MD teliat boli opísané aj po intrauterinnej infekcii jahniat s BDV (Moennig a Plagemann, 1992, Thiel a ďalší, 1996).
Alternatívna klasifikácia pestivírusov sa nachádza v Becher a ďalší (1995) alebo inde.
Pestivírusy sú malé obalené vírusy s jednoreťazcovým RNA genómom s kladnou polaritou, ktorým chýba tak sekvencia 5' čiapočky, ako aj sekvencia 3' poly(A). Vírusový genóm kóduje polyproteín s dĺžkou približne 4000 aminokyselín, z ktorého vznikajú finálne štiepne produkty prostredníctvom kotranslačného a posttranslačného spracovania, na ktorých sa podieľajú bunkové a vírusové proteázy. Vírusové proteíny sú zoradené v polyproteíne v nasledujúcom poradí NH2-Npro-C-ERNS-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Rice, 1996). Proteín C a glykoproteíny ERNS, El a E2 predstavujú štrukturálne zložky pestivírusového viriónu (Thiel a ďalší, 1991). Zistilo sa, že E2 a v menšom rozsahu ERNS sú cieľmi protilátkovej neutralizácie (Donis a ďalší, 1988; Paton a ďalší, 1992; van Rujn a ďalší, 1993; Weiland a ďalší, 1990, 1992). ERNS nemá membránové ukotvenie a je vylučovaný v značných množstvách z infikovaných buniek. O tomto proteíne sa publikovalo, že vykazuje RNázovú aktivitu (Hulst a ďalší; 1994; Schneider a ďalší, 1993; Windisch a ďalší 1996). Funkcia tejto enzymatickej aktivity v životnom cykle vírusu nie je v súčasnosti známa. V prípade CSFV vakcínového kmeňa sa publikovalo, že výsledkom experimentálnej deštrukcie RNázy miestne špecifickou mutagenézou je cytopatogénny vírus, ktorého rastové charakteristiky v bunkovej kultúre sú rovnaké ako rastové charakteristiky divého typu vírusu (Hulst a ďalší, 1998). Enzymatická aktivita závisí od prítomnosti dvoch aminokyselinových sekvencii, ktoré sú konzervované medzi pestivírusovou ERNS a rôznymi známymi RNázami rastlinného a hubového pôvodu. Obe tieto konzervatívne sekvencie obsahujú histidínový zvyšok (Schneider a ďalší, 1993). Výsledkom zámeny každého z týchto zvyškov za lyzín v ERNS proteíne CSFV vakcínového kmeňa bola deštrukcia RNázovej aktivity (Hulst a ďalší, 1998). Zavedenie týchto mutácií do genómu CSFV vakcínového kmeňa neovplyvnilo životaschopnosť vírusu alebo jeho rastové vlastnosti, ale viedol k vírusu, ktorý vykazoval mierne cytopatogénny fenotyp (Hulst a ďalší, 1998).
Generovali sa a v súčasnosti sa používajú CSFV a BVDV vakcíny, ktoré obsahujú oslabené alebo usmrtené vírusy alebo vírusové proteíny exprimované v heterológnych expresných systémoch. Štrukturálny základ oslabenia týchto vírusov používaných ako živé vakcíny nie je známy. To vedie ku riziku nepredpokladateľných revertantov po vakcinácii spätnou mutáciou alebo rekombináciou. Na drahej strane je schopnosť inaktivovaných vakcín alebo hetorológne exprimovaných vírusových proteínov (podjednotkové vakcíny) vyvolať imunitu dosť nízka.
Vo všeobecnosti by živé vakcíny s definovanými mutáciami ako základom oslabenia, mohli eliminovať nevýhody súčasnej generácie vakcín. V súčasnosti nie sú dostupné potenciálne ciele pre oslabovacie mutácie v pestivírusoch.
Ďalšia výhoda uvedených oslabovacích mutácií spočíva v ich molekulovej unikátnosti, ktorá umožňuje ich použitie ako rozlišovacích značiek pre oslabené pestivírusy a na ich odlíšenie od pestivírusov z prostredia.
Keďže je dôležitá účinnosť a bezpečnosť, ako aj detegovateľná profylaxia a liečba pestivírasových infekcií, existuje silná potreba živých a špecificky oslabených vakcín s vysokým potenciálom indukovať imunitu, ako aj s definovaným základom oslabenia, ktorý umožní aj ich odlíšenie od patogénnych pestivírusov.
Preto je technickým problémom, ktorý rieši predložený vynález, poskytnúť špecificky oslabené a detegovateľne značené pestivírusy na použitie ako živé oslabené vakcíny s veľkou schopnosťou indukovať imunitu, ktoré, ako výsledok tejto metódy, môžu byť aj odlíšiteľné od patogénnych pestivírusov z prostredia.
Podstata vynálezu
Prekvapujúco sa zistilo, že pestivírusy je možné špecificky oslabiť inaktiváciou RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS.
Predmetom vynálezu je spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, pri ktorom je inaktivovaná RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, s podmienkou, že aminokyselinami v polohách 297 a/alebo 346, ako sú znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch, nie sú lyzíny, pričom inaktivovanie RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je ERNS glykoproteín, vedie k oslabenému pestivírusu.
Vo výhodnom uskutočnení sú delécie a/alebo mutácie lokalizované v aminokyselinových polohách 295 až 307 a/alebo 338 až 357, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch.
V ešte výhodnejšom uskutočnení je RNázová aktivita inaktivovaná deléciou alebo mutáciou aminokyseliny v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch.
V ďalšom výhodnom uskutočnení je RNázová aktivita je inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch.
Výraz „inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je uvedený glykoproteín“ znamená, že modifikovaný glykoproteín ERNS nie je schopný alebo má zníženú schopnosť hydrolyzovať RNA v porovnaní s nemodifikovaným divým typom uvedeného glykoproteínu ERNS.
Inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS sa môže dosiahnuť deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, ako bolo demonštrované tu a v publikácii Hulst a ďalší (1998). Preto sa výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu týka živých vakcín, v ktorých je uvedená RNázová aktivita inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu.
Ukázalo sa, že glykoproteín ERNS vytvára homodimér viazaný disulfidovou väzbou s veľkosťou približne 97 kD, pričom každý monomér pozostáva z 227 aminokyselín zodpovedajúcich aminokyselinám 268 až 494 CSFV polyproteínu, ako bol opísaný v Rumenapf a ďalší (1993). Prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimované Alfort kmeňom CSFV je znázornených na obrázku 1 len z referenčných dôvodov. Genómová sekvencia Alfort kmeňa CSFV je dostupná v GeBank/EMBL databáze pod prístupovým číslom J04358; alternatívne je možné zistiť aminokyselinovú sekvenciu BVDV kmeňa CP7 v GenBank/EMBL databáze (prístupové číslo U63479). V glykoproteíne ERNS, ako aj v niektorých rastlinných a hubových proteínoch s RNázovou aktivitou sú značne konzervované dve oblasti aminokyselín (Schneider a ďalší, 1993). Tieto dve oblasti sú veľmi dôležité pre RNázovú enzymatickú aktivitu. Prvá oblasť pozostáva z oblasti aminokyselín v polohe 295 až 307 a druhá oblasť pozostáva z aminokyselín v polohe 338 až 357 uvedeného vírusového proteínu, ako je ilustrovaný na obrázku 1 znázorňujúcom Alfort kmeň CSFV (číslovanie podľa publikovanej odvodenej aminokyselinovej sekvencie CSFV kmeňa Alfort (Meyers a ďalší, 1989). Aminokyseliny, ktoré sú výnimočne dôležité pre RNázovú aktivitu, ako bolo uvedené, v žiadnom prípade nie sú obmedzené presnou polohou, ako je definovaná pre Alfort kmeň CSFV, ktorý je len použitý ako príklad na uvedenie výhodných aminokyselín, ktoré sú v polohe zodpovedajúcej polohe v iných kmeňoch, ako napríklad v BVDV, BDV a všeobecne v pestivírusoch, keďže táto sekvencia je vysoko konzervatívna. Pri pestivírusoch, ktorými nie je CSFV Alfort kmeň, sa číslovanie polôh výhodných aminokyselín často líši, ale priemerný odborník v oblasti molekulárnej biológie pestivírusov bude vedieť jednoducho identifikovať tieto výhodné aminokyseliny prostredníctvom polohy vysoko konzervatívnych aminokyselín daného glykoproteínu. V jednom konkrétnom, neobmedzujúcom príklade poloha CSFV Alfort 346 zodpovedá polohe 349 v BVDV kmeni cp7.
Predložený vynález demonštruje, že pestivírusy sú životaschopné a kódujú ERNS proteín bez RNázovej aktivity, keď je histidínový zvyšok v polohe 346 vírusového proteínu (číslovanie podľa publikovanej sekvencie CSFV Alfort/Tubingen (Meyers a ďalší, 1989)), ktorý predstavuje jedno z konzervatívnych možných aktívnych zvyškov Erns RNázy, deletovaný. V tomto vynáleze sa tiež demonštrovalo, že výsledkom deletovania zodpovedajúceho histidínu v ERNS BVD pestivíruse (poloha 349, číslovanie podľa sekvencie BVDV CP7 GenBank/EMBL databáze (prístupové číslo U63479)) je životaschopný vírus, v ktorom ERNS glykoproteín stratil RNázovú aktivitu. Na rozdiel od bodových mutácií zamieňajúcich jednu aminokyselinu za inú, delečný mutant je vo všeobecnosti oveľa viac stabilný, čo sa týka tvorby revertantov. Infekcia ošípaných s mutantom patogénneho CSFV Alfort/Tubingen exprimujúcim ERNS s deléciou neviedla k horúčke alebo iným typickými klinickými príznakom CSFV infekcie, zatiaľ čo výsledkom infekcie divým typom vírusu bola horúčka, hnačka, anorexia, apatia, zníženie počtu B-buniek a poruchy centrálneho nervového systému. Ošípané boli usmrtené 14 dní po inokulácii, v štádiu umierania, pričom silno krvácali z pokožky a z vnútorných orgánov. Ošípané infikované mutantom nevykazovali ani virémiu, ani zníženie počtu B-buniek, čo bolo testované na 3, 5,
7, 10, 14 deň po infekcii, zatiaľ čo CSFV sa jednoducho izoloval zo vzoriek krvi odobratých ošípaným, ktoré boli inokulované divým typom vírusu. Delečný mutant sa zjavne replikoval v živočíchoch, čo vyplýva z indukcie neutralizačných protilátok (pozri príklad 3, tabuľka 3 c). Imunitná odpoveď na mutantný vírus bola dostatočná na to, aby umožnila prežitie letálnej dávky s 2x105 TCID50 vysokopatogénnej infekcie s CSFV kmeňom Eystrup (Kônig, 1994), ktorý je heterológny vzhľadom na kmeň Alfort. Navyše testované zvieratá nemali po vyzývacej infekcii žiadne klinické príznaky CSFV infekcie, ako horúčku, hnačku, krvácanie, znižovanie počtu B-buniek alebo anorexiu. Tieto údaje demonštrujú, že infikovanie ošípaných s delečným mutantom indukuje imunitnú odpoveď, ktorá je dostatočná na ochranu proti silnej dávke.
Inaktivácia RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je glykoproteín E10'15, poskytuje prekvapujúci a nový spôsob na detegovateľné značenie pestivírusov. Ďalší predmet predloženého vynálezu poskytuje spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, ktorý spočíva v tom, že sa inaktivuje RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS. Znak, že chýba RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS pestivírusov podľa vynálezu, teraz umožňuje detegovateľné značenie týchto pestivírusov. Označené a neoznačené pestivírusy alebo vylučovanie ERNS z pestivírusových infikovaných buniek do telesných tekutín je možné zrejmým spôsobom odlíšiť tým, že chýba alebo je prítomná RNázová aktivita glykoproteínov ERNS pri ich izolácii a testovaní tejto enzymatickej aktivity.
Množstvo ďalších technik je možné použiť pre pestivirusy s inaktivovanou RNázovou aktivitou, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, prostredníctvom delécie a/alebo mutácie. Takéto pestivirusy je možné jednoducho detegovať, vďaka štrukturálnym dôsledkom, ktoré sú výsledkom delécií a/alebo mutácií. Napríklad rozdiely v sekvencii nukleovej kyseliny zmeneného glykoproteínu ERNS je možné detegovať technikami sekvenovania nukleovej kyseliny alebo PCR technikami (polymerázová reťazová reakcia), ako je demonštrované v príklade 8. Zmenenú proteínovú sekvenciu je možné detegovať špecifickými monoklonálnymi protilátkami, ktoré nerozoznávajú nezmenené proteíny. Vice verša, je možné detegovať zmenené, a tým Štrukturálne značené proteíny aj tým, že sa na ne neviažu špecifické monoklonálne protilátky, ktoré rozoznávajú nezmenené glykoproteíny ERNS s tou podmienkou, že prítomnosť pestivírusov je možné stanoviť iným spôsobom. A samozrejme výsledkom delécií a/alebo mutácií rušiacich RNázovú aktivitu v označených vírusoch budú odlišné imunitné odpovede živočíchov v porovnaní s odpoveďami, ktoré sú výsledkom infekcií neoznačeným pestivírusom.
Stručný prehľad obrázkov
Obrázok 1
Prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimované Alfort kmeňom CSFV
Sekvencia znázorňuje prvých 495 aminokyselín, ako sú exprimované Alfort kmeňom CSFV (Meyers a ďalší, 1989). Jeden monomér glykoproteínu ERNS uvedeného kmeňa zodpovedá aminokyselinám 268 až 494, ako boli opísané v Rumenapf a ďalší (1993). Podčiarknuté sú zvyšky 295 až 307 a 338 až 357, ktoré predstavujú oblasti homologické s rastlinnými a hubovými RNázami (Schneider a ďalší, 1993).
Obrázok 2
Krivka rektálnej teploty zvierat po testovacej infekcii
Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 2. do 18. dňa po infekcii. Podrobne sú uvedené krivky rektálnej teploty pre každé zviera skupiny infikovanej vírusom V(pA/CSFV) (neprerušovaná čiara) odvodeným od plazmidu pA(CSFV), alebo vírusom V(pA/C-346-d) odvodeným od plazmidu pA/C-346-d (čiarkovaná čiara).
Obrázok 3
Krivka rektálnej teploty zvierat po vyzývacej infekcii
Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 1. do 21. dňa po vyzývacej vírusovej infekcii. Zvieratá, ktoré boli infikované vyzývacími letálnymi dávkami CSFV vyzývacieho kmeňa Eystrup, boli 69 dní predtým infikované mutantným kmeňom C-346-d (V(pA/C-346-d)), ako je podrobne uvedené v texte. Krivka rektálnej teploty je uvedená podrobne pre každé zviera skupiny, ktoré bolo infikované 2x105 TCID50 CSFV vyzývacím infekčným kmeňom Eystrup.
Obrázok 4
Krivka rektálnej teploty zvierat po testovacej infekcii
Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 0. do 18. dňa po infekcii. Krivka rektálnej teploty je podrobne uvedená pre každé zviera dvoch skupín infikovaných buď C-346-d (V(pA/C-346-d)) (čiarkovaná čiara), alebo opraveným vírusom C-346-d/RS (V(pA/C-346-d/RS) (spojitá čiara).
Obrázok 5
Rektálna teplota po vyzývacej infekcii v živočíšnom experimente 2
Denne sa zaznamenávala rektálna teplota od 1. do 10. dňa po vyzývacej vírusovej infekcií. Zvieratá, ktoré boli infikované letálnou dávkou (2x105 TCID50) CSFV vyzývacieho kmeňa Eystrup, boli 37 dní predtým infikované mutantom C-346-d.
Obrázok 6
Rektálna teplota zvierat ošetrených dvojitým mutantom podľa príkladu 6
Denne sa zaznamenávala rektálna teplota pred vyzývacou vírusovou infekciou a po vyzývacej vírusovej infekcii s mutantom V(pA/C-297-L/346-L).
Obrázok 7
Rozlíšenie medzi C-346-d a CSFV bez delécie histidínového kodónu 346 prostredníctvom RT-PCR podľa príkladu 8
a) Pár primérov ΟΙ H-3/OI EmsStop umožňuje špecifickú amplifikáciu pásu odvodeného od RNA, v ktorej je deletovaný kodón 346 (C-346-d), ako je podrobne opísané v príklade 8. Na rozdiel od toho, RNA, ktorá nemá túto deléciu, neinteraguje s týmto párom primérov (C-WT, C-346-L, C-346-K).
b) a c) Iné dve kombinácie primérov (ΟΙ H+2 a ΟΙ H+3) amplifikujú pásy odvodené od RNA, v ktorej nie je deletovaný kodón 346. Ak je ako templát použitá RNA z 346-delečného mutantu C-346-d, nie je pozorovaný žiaden pás.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Generovanie RNáza-negatívnych pestivírusových mutantov
Subklony sa generovali vychádzajúc z kompletnej cDNA klonov pA/CSFV (Meyers a ďalší, 1996a) alebo pA/BVDV (Meyers a ďalší, 1996b), z ktorých je možné získať infekčnú cRNA in vitro transkripciou. Pri CSFV sa klonoval Xhol/SspI fragment pA/CSFV do pBluescript SK+, ktorý bol poštiepený s Xhol a Smal. Pri BVDV sa klonoval Xhol/BglII fragment z pA/BVDV do plazmidu pCITE-2C, ktorý bol poštiepený rovnakými enzýmami. Z týchto konštruktov sa vyrobila jednoreťazcová DNA spôsobom podľa Kunkela (Kunkel a ďalší, 1987) použitím E. coli CJ 236 buniek (BioRad) a VCMS jednoreťazcového fága (Stratagene). Jednoreťazcová DNA sa konvertovala na dvojreťazcovú použitím „Phagemid in vitro Mutagenesis Kit“ (fagemidového in vitro mutačného kitu) (BioRad). Niektoré syntetické oligonukleotidy, ktoré boli použité ako priméry na generovanie požadovaných pestivírusových mutantov, sú uvedené neskôr, pričom sú uvedené ako príklady:
C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG
C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT
C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC
C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA
C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC
Β-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG
Dvojvláknová plazmidová DNA sa použila na transformáciu E. coli XLl-Blue buniek (Stratagene). Bakteriálne kolónie nesúce plazmidy sa izolovali prostredníctvom ampicilínovej selekcie. Pripravila sa plazmidová DNA a ďalej sa analyzovala nukleotidovým sekvenovaním použitím T7 polymerázového sekvenačného kitu (Pharmacia). Plazmidy, ktoré obsahovali požadované mutácie a nemali žiadne zmeny na iných miestach, sa použili na konštrukciu kompletných cDNA klonov. V prípade CSFV sa Xhoí/Ndel fragment z mutovaného plazmidu začlenil spolu s Ndel/Bglll fragmentom odvodeným od plazmidu 578 (pCITE 2A, obsahujúci Xhol/BglII fragment z pA/CSFV) do pA/CSFV poštiepeného Xhol a Bglll. Na získanie BVDV CP7 mutantu sa Xhol/BglII fragment obsahujúci deléciu zaviedol do pA/BVDV poštiepeného s Xhol a Ncol spolu s Bglll/Ncol fragmentom izolovaným z pA/BVDV/Ins-. Z konštruktu pA/BVDV/Ins- sa transkribovala cRNA, z ktorej, keď sa transfekuje do vhodných buniek, vzniká necytopatogénny BVDV (Meyers a ďalší, 1996b).
Amplifikovali sa rôzne klony s úplnou dĺžkou a izolovali sa plazmidy. Prítomnosť požadovaných mutácií sa dokázala DNA sekvenovaním. Po linearizovaní so Srfl (CSFV klony s úplnou dĺžkou) alebo so Smal (BVDV klony s úplnou dĺžkou) sa transkribovala cRNA, ako bolo predtým opísané (Meyers a ďalší, 1996ab). RNA sa purifíkovala gélovou filtráciou a fenol/chloroformovou extrakciou a použila sa na transfekciu obličkových buniek ošípaných (PK15) alebo obličkových buniek hovädzieho dobytka (MDBK kloň B2) (CSFV, respektíve BVDV konštrukty). Transfekcie sa analyzovali imunofluorescenciou antisérami špecifickými pre vírus. V prípadoch, keď sa mohli izolovať vírusy (pozitívny výsledok imunofluorescencie), sa tieto amplifikovali pasážovaním na rovnakej bunkovej línii, ako bola použitá na transfekčné experimenty. Ďalšia analýza CSFV mutantov zahŕňala stanovenie jednokrokových rastových kriviek a charakterizáciu RNA Northern blotom s cDNA sondami špecifickými pre vírus, ako aj transkripčnú polymerizačnú reťazovú reakciu (RT-PCR) a následné sekvenovanie PCR fragmentov, aby sa overila prítomnosť požadovaných mutácií vo vírusovom genóme. Vo všetkých prípadoch sa potvrdila prítomnosť požadovanej mutácie. Všetky izolované vírusy rástli rovnako dobre a produkovali rovnaké množstvo RNA presne ako vírus odvodený od plazmidu s divým typom sekvencie.
Životaschopnosť BVDV mutantu sa dokazovala transfekciou príslušnej cRNA a 3 dni potom visiatím buniek. Časť buniek sa vysiala na misky s priemerom 3,5 cm, jeden deň potom sa fixovala zmesou acetónu a metanolu a imunofluorescenčne sa analyzovala zmesou BVDV-špecifických monoklonálnych protilátok (Weiland a ďalší, 1989). Zistilo sa, že všetky bunky boli pozitívne, zatiaľ čo kontrolné bunky transfekované neinfekčnou RNA nedávali žiadny signál. Z časti buniek transfekovaných príslušnou cRNA sa vyprodukoval extrakt jedným cyklom zmrazenia a roztopenia. Týmto extraktom sa infikovali čerstvé bunky a dokázalo sa BVDV špecifickou imunofluorescenciou 3 dni po infekcii, že sú BVDV pozitívne.
Tabuľka 1 sumarizuje rôzne zmeny zavádzané do konzervatívnych sekvencií ĽRNS predstavujúcich pravdepodobné aktívne miesto RNázy, ktoré sú kódované uvedenými vírusovými mutantami.
Tabuľka 1
Meno Sekvencia v RNázovom motíve Aktivita RNázy Životaschopnosť mutantu
pA/CSFV ...SLHGIWPEKIC... .„RHEWNKHGWCNW... + +
C-297-L ...SLLGIWPEKIC... .. .RHEWNKHGWCNW... - +
C-346-L ...SLHGIWPEKIC... .. .RHEWNKLGWCNW... - +
C-297-L/346-L ...SLLGIWPEKIC... .. .RHEWNKLGWCNW... - +
C-297-K ...SLKGIWPEKIC... .. .RHEWNKHGWCNW... - +
C-346-K ...SLHGIWPEKIC... .. .RHEWNKKGWCN W... - +
C-297-d ...SL GIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - -
C-346-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNK GWCNW... - +
C-296/7/8-d ...S IWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... - -
C-345/6/7-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWN WCNW... - -
C-345/6-d ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWN GWCNW... - -
C-346/7-d ...SLHGIWPEKIC... .. ,RHEWNK_WCNW... - -
C-342-d ...SLHGIWPEKIC... ...RH WNKHGWCNW... - -
C-342/6-d ...SLHGIWPEKIC... ...RH WNK GWCNW... - -
C-301-d ...SLHGIW EKIC... .. .RHEWNKHGWCNW... - -
C-295-S/G ...GLHGIWPEKIC... . „RHEWNKHGWCNW... - +
C-300-W/G ...SLHGIGPEKIC... . „RHEWNKHGWCNW... - +
C-302-E/A ...SLHGIWPAKIC... . „RHEWNKHGWCNW... - -
C-305-C/G ...SLHGIWPEKIG... ...RHEWNKHGWCNW... - -
C-300-W/G-302-E/A ...SLHGIGPAKIC... . „RHEWNKHGWCNW... - -
C-340-R/G ...SLHGIWPEKIC... .„GHEWNKHGWCNW... - -
C-343-W/G ...SLHGIWPEKIC... .. .RHEGNKHGWCNW... - -
C-345-K/A ...SLHGIWPEKIC... .„RHEWNAHGWCNW... - -
C-297-K/346-K ...SLKGIWPEKIC... .„RHEWNKKGWCNW... - +
C-297-K/346-L ...SLKGIWPEKIC... . „RHEWNKLGWCNW... - +
pA/BVDV ...SLHGIWPEKIC... ...RHEWNKHGWCNW... + +
Β-346-d ...SLHGIWPEKIC... .. ,RHEWNK GWCNW... - +
Legenda k tabuľke 1:
Test RNázovej aktivity sa uskutočňoval v prechodnom teste. BHK21 bunky sa infikovali vakcínovým vírusom TF7-3 (Fuerst a ďalší, 1986 a potom sa transfekoval príslušným cDNA konštruktom (5 /zg DNA, transfekcia použitím Superfectu podľa odporúčaní dodávateľa (Qiagen)). Po 10 hodinách inkubovania pri 37 °C v CO2 inkubátore sa transfekované bunky lyžovali a spracovali sa na stanovenie RNázovej aktivity, ako je opísané. Životaschopnosť sa stanovila, ako je opísané.
Príklad 2
Účinok rôznych mutácií na RNázovú aktivitu ERNS
Na testovanie účinku rôznych mutácií na RNázovú aktivitu ERNS sa príslušné bunky infikovali mutantnými vírusmi. Pri CSFV sa infekcia uskutočňovala viacnásobnou infekciou (m.o.i.) s hodnotou 0,01. Infekcia divým typom vírusu slúžila ako pozitívna kontrola, pričom neinfikované bunky boli použité ako negatívna kontrola. V 48. hodine po infekcii sa bunky premyli dvakrát fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom a lyžovali sa 0,4 ml lyzačného tlmivého roztoku (20mM Tris/HCl; lOOmM NaCl, lmM EDTA, 2 mg/ml hovädzieho sérového albumínu 1 % Triton X100; 0,1 % kyselina deoxycholová; 0,1 % dodecylsulfát sodný). Lyzát sa dal do l,5ml reakčných skúmaviek, sonifikoval sa (Branson sonifikátor B12, 120 Wattov, 20 sekúnd vo vodnom kúpeli), vyčistil sa centrifugáciou (5 min., 14000 ot./min., Eppendorfová centrifúga, 4 °C) a supematant sa ultracentrifugoval (Beckmann stolová ultracentrifuga, 60 min. pri 4 °C a 45 000 ot./min. v TLA 45 rotore). Stanovovanie RNázovej aktivity sa uskutočňovala v celkovom objeme 200 /zl obsahujúcom 5 alebo 50 /tl supematantu z druhého centrifugačného kroku a 80 /tg Poly(rU) (Pharmacia) v RNázovom testovacom tlmivom roztoku (40mM Tris-octan (pH 6,5), 0,5mM EDTA, 5mM ditiotreitol (DTT)). Po inkubovaní reakčnej zmesi pri 37 °C 1 hodinu sa pridalo 200 /tl 1,2M kyseliny perchlórovej a 20mM NaSO4. Po 15 minútach inkubovania na ľade sa zmes centrifugovala 15 minút pri 4 °C a 14 000 ot./min. v Eppendorfovej centrifúge. Ku supematantu sa pridali 3 objemy vody a analyzovali sa alikvóty zmesi meraním optickej hustoty pri 260 nm použitím Ultrospec 3000 spektrofotometra (Pharmacia). Vo všetkých prípadoch mutácie zavedené do Ems génu úplne zmšili RNázovú aktivitu (tabuľka 1).
BVDV mutantná RNázová aktivita sa testovala s materiálom získaným po transfekcii RNA bez pasážovania izolovaných vírusov. Bunky transfekované príslušnou RNA sa vysiali 72 hodín po transfekcii na dve misky. O 24 hodín neskôr sa z jednej misky pripravili bunkové extrakty a analyzovala sa ich RNázová aktivita, ako je opísané. Na dôkaz infekcie sa bunky z dmhej misky analyzovali imunoflurescentiou s BVDV špecifickými monoklonálnymi protilátkami (Weiland a ďalší, 1989) a zistilo sa, že 100 % bolo pozitívnych. Transfekcia sa uskutočňovala s RNA transkribovanou z pA/BVDV/Ins- a z ρΑ/Β-346-d, čo je plazmid ekvivalentný s pA/BVDV/Ins- s tým rozdielom, že obsahuje deléciu kodónu zodpovedajúceho kodónu 346 v CSFV Alfort genóme. Netransfekované MDBK bunky slúžili ako negatívna kontrola.
Tabuľka 2a - Stanovenie RNázovej aktivity rôznych vímsov
Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-346-d C-346-d/Rs kontrola
OD» 2,4 2,3 1,1 1,1 1,1 2,3 1,1
Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-297-K C-346-K C-297-L/346-L
od260 2,09 2,16 0,715 0,77 0,79 0,766 0,77
C-297-K/346-L C-297-K/346-K C-346-d kontrola
OD260 0,725 0,835 0,8 0,84
Opis tabuľky 2a:
PK15 bunky sa infikovali uvedenými vírusmi v m.o.i (viacnásobná infekcia) s hodnotou 0,01, inkubovali sa pri 37 °C 48 hodín v CO2 inkubátore a potom sa lyžovali a podrobili sa RNázovému testu. Kyslá rozpustná RNA, ktorá bola výsledkom inkubovania s rôznymi bunkovými extraktmi, sa kvantifikovala meraním optickej hustoty pri 260 nm. Pozorované rozdiely v RNázovej aktivite neboli spôsobené rôznymi množstvami ERNS proteínu vo vzorkách, pretože po kvantifikácii ERNS rádioaktívnym značením, imunoprecipitáciou a analýzou rádioaktivity s fosforimagerom sa získali podobné hodnoty. Okrem toho zníženie Ems koncentrácie v teste až na jednu desatinu zvyčajného množstva významne nezmenilo výsledné OD hodnoty, z čoho vyplýva, že za zvolených podmienok bol test saturovaný s EnK.
CSFV kmeň Alfort; všetky ostatné vírusy sa izolovali z RNA transkribovanej in vitro z plazmidov: napr. C-WT z pA/CSFV; C-297-L z pA/C-297-L; a pod.; C-346-d/Rs vírus sa izoloval z pA/C-346-d/Rs (generovaný reverziou mutácie v pA/C-346-d zámenou zodpovedajúceho cDNA fragmentu za ekvivalentný fragment odvodený od pA/CSFV); kontrola: extrakt neinfikovaných PK15 buniek.
Tabuľka 2b
B-WT Β-346-d kontrola
OD260 2,5 1,1 1,1
Opis tabuľky 2b:
MDBK bunky sa infikovali in vitro transkribovanou RNA, vysiali sa 72 hodín po transfekcii a o 24 hodín neskôr sa analyzovala ich RNázová aktivita. Infekcia buniek sa dokázala imunoíluorescenčnou analýzou, ako je opísané v texte.
B-WT: vírus izolovaný z pA/BVDV/Ins-; Β-346-d: vírus izolovaný z ρΑ/Β-346-d; kontrola: extrakt z neinfikovaných MDBK buniek.
Príklad 3
Patogenita CSFV po inaktivácii RNázy
Na testovanie toho, či deštrukcia RNázovej aktivity ovplyvňuje patogenitu pestivírusov v ich prirodzenom hostiteľovi, konali sa živočíšne experimenty s mutantom V(pA/C-346-d) (C346-d v tabuľkách). Vírus 5 izolovaný z klonu CSFV s kompletnou dĺžkou bez mutácie (V(pA/CSFV)) slúžil ako pozitívna kontrola (C-WT v tabuľkách). Pre každý mutant sa použili tri mladé ošípané (plemeno: Nemecký landrace; telesná hmotnosť približne 25 kg). Infekčná dávka bola lxlO5 TCID50 na zviera; dve tretiny inokulátu sa podávalo intranazálne (jedna tretina do každej nosnej dierky), jedna tretina sa podávala intramuskuláme. Dve skupiny prebývali v oddelených izolačných jednotkách. Krv sa odoberala zo zvierat dvakrát pred infekciou a na 3., 5., 10 7., 10., 12. a 14. deň. Okrem toho sa denne merala teplota (obrázok 2). Zvieratá infikované divým typom vírusu mali typické symptómy klasickej horúčky ošípaných, ako horúčku, ataxiu, anorexiu, hnačky, poruchy centrálneho nervového systému, krvácanie kože (tabuľka 3a). Vírus bolo možné z krvi izolovať na 3 deň (zviera č. 68) a na 5., 7., 10. a 14. deň (zvieratá č. 68, č. 78, č. 121) (tabuľka 3b). Zvieratá sa usmrtili v štádiu umierania na 14. deň po infekcii. V tom čase nebolo možné detegovať žiadne protilátky neutralizujúce vírus. 15 Na druhej strane, zvieratá infikované mutantom nemali klinické symptómy (tabuľka 3a). Teplota ostala normálna (obrázok 2) počas celého experimentu a zvieratá nikdy neprestali prijímať potravu. Z krvi nebolo možné izolovať vírus. Napriek tomu bolo zrejmé, že zvieratá boli infikované a vírus sa pravdepodobne replikoval, keďže všetky zvieratá produkovali neutralizujúce protilátky (tabuľka 3c).
Tabuľka 3a - Klinické znaky po testovacej infekcii_
Živočíšny experiment 1
Č. ZV. infikované Klinické iríznaky
horúčka hnačka poruchy CNS anorexia krvácanie kože apatia umieranie v čase eutanázie pri nekropsii krvá- canie orgánov
68 C-WT + + + + + + + +
78 C-WT + + + + + + + +
121 C-WT + + + + + + + +
70 C-346-d - - - - - - - n.a.
72 C-346-d - - - - - - - n.a.
74 C-346-d - - - - - - - n.a.
Opis tabuľky 3a:
V štúdii bolo zahrnutých 6 mladých ošípaných (nemecká landrace; s približnou telesnou hmotnosťou 25 kg) v dvoch skupinách (každá skupina žila oddelene). 3 zvieratá sa infikovali s CSFV-WT (lxlO5 TCID50) a 3 zvieratá s C-346-d (lxlO5 TCID50). Zaznamenávala sa rektálna teplota a klinické príznaky, ako je podrobne uvedené v tabuľke; n.a.: neuskutočnila sa nekropsia.
Tabuľka 3b - Virémia v krvných bunkách po testovacej infekcii
Živočíšny experiment 1
č. zvieraťa infikované Virémia v uvedený deň po infekcii
3 5 7 10 14
68 C-WT + + + + +
78 C-WT - + + + +
121 C-WT - + + + +
70 C-346-d - - - - -
72 C-346-d - - - - -
74 C-346-d - - - - -
Opis tabuľky 3b:
Virémia v krvných bunkách sa detegovala spoločnou kultiváciou krvi s PK15 bunkami. Po inkubovaní pri 37 °C počas 72 hodín sa bunky premyli s PBS, fixovali sa so studenou zmesou acetónu a metanolu v ľade a analyzovalo sa ich infikovanie imunofluorescenciou s monoklonálnou protilátkou špecifickou pre glykoproteín E2 (mAb A18, Weiland a ďalší, 1990).
Tabuľka 3 c - Vývoj CSFV špecifického sérového neutralizačného titra
deň p. i. -3 0 17 25 69 76 79 87
č. 70 - - 1 : 18 1 : 162 1 : 162 1 : 162 1 : 486 1 :1458
č. 72 - - 1 : 18 1 : 54 1 : 486 1 : 1458 1 : 1458 1 :4374
č. 74 - - 1 : 6 1 : 54 1 : 162 1 : 162 1 :486 1 : 1458
Opis tabuľky 3c:
Protilátkové titre ošípaných infikovaných s vírusovým mutantom C-346-d sa stanovovali v rôznych časových bodoch počas živočíšneho experimentu:
μΐ nariedeného séra sa zmiešalo s 50 μΐ média obsahujúceho 30 TCID50 vírusu (CSFV Alfort/Tiibingen). Po 90 minútach inkubovania pri 37 °C sa pridalo 100 μΐ buniek (1,5x104 buniek) a zmes sa vysiala na 96 jamkové platne. Po 72 hodinách sa bunky fixovali s ľadom vychladenou zmesou acetónu a metanolu, a analyzovalo sa či sú infikované prostredníctvom imunoíluorescencie s monoklonálnou protilátkou špecifickou pre glykoproteín E2 (mAb A18, Weiland a ďalší 1990). Na 69. deň po infekcii sa zvieratá infikovali 2xl05 TCID50 CSFV kmeňa Eystrup. V tabuľke sú uvedené najvyššie sérové riedenia, ktorých výsledkom bola neutralizácia vstupného vírusu.
Príklad 4
Indukcia ochrannej imunity prostredníctvom infekcie s RNáza negatívnym vírusom
Aby sa analyzovalo, či infekcia mutantným vírusom vedie k ochrannej imunite, uskutočnil sa infekčný experiment, približne 9 dní po infekcii s CSFV mutantom, použitím vysoko patogénneho heterológneho CSFV kmeňa (kmeň Eystrup, pôvodne od Behring). Na infekciu sa použilo 2x105 TCID50 vírusu. V niekoľkých predchádzajúcich experimentoch sa zistilo, že toto množstvo vírusu je dostatočné na indukciu letálneho ochorenia (Kônig, 1994). Ale zvieratá, ktoré boli predtým infikované s CSFV RNázovým mutantom, nevykazovali symptómy ochorenia po infekcii. Nemohla byť detegovaná ani horúčka (obrázok 3), ani virémia, ale detegoval sa vzrast neutralizačných protilátok, z čoho vyplýva produktívna infekcia a replikácia infikujúceho vírusu.
Príklad 5
Potvrdenie oslabovacieho princípu
Aby sa dokázalo, že skutočnou príčinou pozorovaného oslabenia mutantného vírusu je delécia histidínu v polohe 346 polyproteínu, a že to nie je následok neidentifikovanej mutácie na inom mieste, znova sa zostavil divý typ sekvencie zámenou l,6kb Xhol/Ndel fragmentu z klonu pA/C-346-d s úplnou dĺžkou za zodpovedajúci fragment z pA/CSFV nesúci divý typ sekvencie. Fragment vystrihnutý z pA/C-346-d sa analyzoval nukleotidovým sekvenovaním, aby sa stanovili mutácie. Okrem delécie tripletu kódujúceho histidín 346 polyproteínu, nezistil sa žiadny rozdiel oproti sekvencií divého typu. Z cDNA konštruktu z opraveného mutantu mohol byť znova vyprodukovaný vírus V(pA/C-346-d/Rs), ktorý rastie rovnako dobre ako divý typ vírusu a má rovnakú RNázovú aktivitu (tabuľka 2A).
V druhom živočíšnom pokuse sa na infekciu ošípaných použil opravený vírus. Ako kontrola bol použitý delečný mutant. Znova sa použili dve skupiny pozostávajúce z troch zvierat. Keďže zvieratá boli mladšie (nemecká landrace, s hmotnosťou približne 20 kg) ako tie v prvom experimente, použilo sa 5x104 TCID50 vírusu na infekciu. Opäť, zvieratá infikované mutantom nemali žiadne klinické príznaky (tabuľka 5, obrázok 4). Len jedno zviera malo jeden deň horúčku. Napriek tomu vytvárali tieto zvieratá neutralizujúce protilátky a boli chránené proti letálnej CSFV infekcii. Infekcia sa uskutočňovala s 2xl05 TCID50 infekčného kmeňa Eystrup. Po infekcii zvieratá nemali klinické príznaky a teplota ostávala rovnaká (obrázok 5). Na rozdiel od ošípaných infikovaných delečným mutantom vykazovali zvieratá inokulované opraveným vírusom divého typu fatálnu klasickú horúčku ošípaných. Jedno zviera muselo byť usmrtené na 11. deň po infekcii a ďalšie dve o tri dni neskôr. Všetky zvieratá mali typické symptómy klasickej horúčky ošípaných, tzn. horúčku, hnačky, anorexiu a patologické znaky ako krvácanie z rôznych orgánov vrátane obličiek.
Tabuľka 5 a
Klinické príznaky po testovacej infekcii
Živočíšny experiment 2
Č. ZV. infikované Klinické príznaky
horúčka hnačka poruchy CNS anorexia krvá- canie kože apatia umieranie v čase eutanázie pri nekropsii krvá- canie orgánov
43 C-346-d +* - - - - - - n.a.
47 C-346-d - - - - - - - n.a.
87 C-346-d - - - - - - - n.a.
27 C-346- d/RS + + + + + + + +
28 C-346- d/RS + + + + + + + +
30 C-346- d/RS + + + + + + + +
* horúčka len jeden deň
Tabuľka 5a:
V štúdii bolo zahrnutých 6 mladých ošípaných (nemecká landrace; s telesnou hmotnosťou približne 20 kg) v dvoch skupinách (každá skupina žila oddelene v podmienkach izolácie). 3 zvieratá sa infikovali mutantom C-346-d (5.104 TCID5o) a 3 zvieratá s C-346/RS (5.104 TCID50). C-346-d/RS bol odvodený od mutanta C-346-d opravením sekvencie ERNS génu na divý typ. Zaznamenávali a sumarizovali sa rektálna teplota a klinické príznaky; n.a.: neuskutočnila sa žiadna nekropsia.
Tabuľka 5b - Diagnostický RNázový test s vírusmi izolovanými z infikovaných zvierat počas virémie
Alfort zv. č. 3 C-297-K zv. č. 5 C-297-K zv. č. 27 C-346d/RS zv. č. 28 C-346d/RS zv. č. 30 C-346d/RS kontrola
od260 1,84 0,60 0,56 1,84 1,93 1,94 0,49
Vírusy izolované z krvi zvierat 3 a 5 na 5. deň po infekcii a z krvi zvierat 27, 28 a 30, čo boli zvieratá živočíšneho experimentu 2 (opísaný v príklade 5), na 7 deň po infekcii sa množili v tkanivovej kultúre, túrovali sa a testovala sa ich RNázová aktivita, ako bolo opísané. Neinfikované PK15 bunky a bunky (kontrola) infikované s divým typom CSFV (Alfort) slúžili ako kontroly. Zvieratá 3 a 5 boli infikované mutantom C-297-K, zatiaľ čo zvieratá 27, 28 a 30 boli infikované mutantom C-346-d/RS, ako je uvedené v tabuľke.
Príklad 6
Účinky dvojitej mutácie ERNS
Na testovanie účinkov dvojitej mutácie E1^5 z hľadiska schopnosti príslušného vírusu replikovať sa v jeho prirodzenom hostiteľovi a z hľadiska patogenicity, uskutočnil sa živočíšny experiment s mutantom V(pA/C-297-L/346-L). Vírus izolovaný z klonu kompletného CSFV bez mutácie (V(pA/CSFV) slúžil ako pozitívna kontrola. Pre každý mutant sa použili tri mladé ošípané (plemeno: nemecký landrace; telesná hmotnosť približne 25 kg). Infekčná dávka bola lxlO5 TCID50 na zviera; dve tretiny inokulátu sa podávalo intranazálne (jedna tretina do každej nosnej dierky), jedna tretina sa podávala intramuskuláme. Krv sa odoberala zo zvierat pred infekciou (deň 0) a na 5., 8., 12. a 20. deň. Okrem toho sa denne merala teplota (obrázok 6). Zvieratá infikované dvojitým mutantom nemali žiadne klinické symptómy a nikdy neprestali prijímať potravu. Počas celého experimentu zvieratá nemali horúčku (zvieratá 45/2 a 45/3) okrem zvieraťa 45/1, ktoré malo na 8. deň horúčku pravdepodobne kvôli bakteriálnej infekcii spôsobenej poranením na pravej zadnej nohe. Po ošetrení tohto zvieraťa s antibiotikami na 10. deň sa teplota vrátila na normálnu hodnotu do jedného dňa (obrázok 6). Z krvi všetkých zvierat sa na 5. deň izoloval vírus, zatiaľ čo neskoršie sa už nedetegovala žiadna virémia (tabuľka 6a). Všetky zvieratá tvorili neutralizačné protilátky (tabuľka 6b). U zvieraťa 45/1 sa neutralizačný titer stanovoval znova po približne 4,5 mesiaci po infekcii a zistilo sa, že je 1:4374. Takže výsledkom infekcie dvojitým mutantom je dlhotrvajúca imunologická pamäť.
Tabuľka 6a - Test virémie
Dni po infekcii 5 8 12
ošípaná 45/1 + - -
ošípaná 45/11 + - -
ošípaná 45/III + - -
Tabuľka 6b - Neutralizačné titre
Zviera deň 0 20. deň po infekcii
45/1 - 1 : 128
45/2 - 1 : 256
45/3 - 1 : 256
Príklad 7
Imunogénnosť a oslabovací princíp BVDV vírusu „Β-346-d“
Tento experiment bol navrhnutý, aby sa preskúmal oslabovací princíp, ako aj imunogénnosť BVDV vírusu „Β-346-d“ izolovaného z ρΑ/Β-346-d jeho porovnaním s „B-WT“ vírusom izolovaným z pA/BVDV/Ins-. Je samozrejmé, že vírus „Β-346-d“ je mutovaný v pôvodnej BVDV polohe 349, ale je označený „Β-346-d“, aby bola uvedená poloha vo vzťahu k CSFV Alfor polohe 346 na obrázku 1.
Vybrali sa tri skupiny BVDV sérumnegatívnych zvierat vo veku 3 až 6 mesiacov. Skupiny 1 a 2 obsahovali po 5 zvierat a skupina 3 obsahovala 3 zvieratá. Zvieratá skupiny 1 boli infikované podaním 2x106 TCID5o Β-346-d a zvieratá skupiny 2 boli infikované podaním 2xl06 TCID50 B-WT v objeme 5 ml na podanie. Zvieratá sa infikovali intramuskulárne (gluteálny sval), intranazálne a subkutánne (nad lopatkou). V priebehu 14 dní po infekcii sa monitorovala virémia oboch skupín prostredníctvom parametrov ako virémia v krvných bunkách a rozšírenie vírusu v nosných steroch. Okrem toho boli monitorované klinické parametre ako rektálna teplota, počet bielych krviniek a všeobecné zdravotné parametre.
Ochranná imunita proti infekcii s antigeneticky hetorológnym a virulentným BVDV izolátom (č. 13) sa skúmala prostredníctvom vyzývacej infekcie 77 dní po infekcii zvierat skupiny 1 s Β-346-d. Zvieratá skupiny 3 slúžili ako kontrola vyzývacej infekcie a boli infikované v súlade s postupom použitým pre zvieratá skupiny 1 s virulentným BVDV izolátom. BVDV vírus (č. 13) patrí do odlišnej antigenetickej skupiny (typ II), zatiaľ čo Β-346-d vírus patrí do antigenetickej skupiny typu I podľa klasifikácie opísanej v Pellerin, C. a ďalší, 1994. Zvieratá skupiny 1 a 3 boli infikované podaním 2xl06 TCID50 BVDV izolátu v objeme 5 ml na podanie. Zvieratá sa infikovali intramuskulárne (gluteálny sval), intranazálne a subkutánne (nad lopatkou). V priebehu 14 dní po infekcii sa monitorovala virémia oboch skupín prostredníctvom parametrov ako virémia v krvných bunkách a rozšírenie vírusu v nosných steroch. Okrem toho boli monitorované klinické parametre ako rektálna teplota, počet bielych krviniek a všeobecné zdravotné parametre.
Po infekcii s Β-346-d zvieratá nemali žiadne typické klinické symptómy BVDV infekcie, ako napríklad zvýšenie rektálnej teploty (tabuľka 7a), ani žiadne respiračné klinické symptómy (neuvedené).
Zo zníženia virémie v krvných bunkách (tabuľka 7b) a z redukovaného výskytu vírusu v nosných steroch (tabuľka 7c) zrejmým spôsobom vyplýva oslabenie Β-346-d v porovnaní s B-WT.
Virulentný BVDV izolát č. 13 indukoval u zvierat skupiny 3 silnú virémiu s typickými známkami BVDV infekcie, ako sú zvýšenie rektálnej teploty počas niekoľkých dní (tabuľka 7d), silná leukopénia (tabuľka 7e), rozšírená virémia krvných buniek (tabuľka 7f) a rozšírenie vírusu v nosnej sterovej tekutine (tabuľka 7g). Na rozdiel od toho, zvieratá skupiny 1, ktoré boli vakcinované infikovaním s Β-346-d, nemali takmer žiadne klinické príznaky typické pre BVDV infekciu po vyzývacej infekcii s BVDV izolátom č. 13. Nevyskytol sa žiadny významný vzrast rektálnej teploty po infekcii (tabuľka 7d). Pozorovaná leukopénia bola veľmi okrajová čo do rozsahu a trvania (tabuľka 7e). Z krvi nebolo možné izolovať žiadny BVDV (tabuľka 7f) a len jedno zviera malo vírus rozšírený v nosnom sterovom sekréte (tabuľka 7g).
Z toho vyplýva, že infekcia s Β-346-d indukuje silnú imunitu, ktorá zrejmým spôsobom redukuje klinické príznaky, rozšírenie vírusu a virémiu krvných buniek po vyzývacej infekcii heterológnym BVDV izolátom.
Tabuľka 7a - Priemerné rektálne teploty v skupine 1 (Β-346-d) a 2 (B-WT)
Deň štúdie 0 1 2 3 4 5 6
skúp. 1 38,8 39,1 39,0 38,7 38,8 38,7 38,7
skúp. 2 38,8 39,0 38,9 38,6 38,6 38,7 38,6
Deň štúdie 7 8 9 10 11 12 13 14
skúp. 1 38,5 38,7 38,5 38,5 38,5 38,4 38,9 38,7
skúp. 2 38,4 39,1 38,4 38,7 38,6 38,7 38,6 38,6
Zvieratá skupiny 1 sa infikovali v deň 0 s 6xl06 TCID50 Β-346-d, zatiaľ čo zvieratá skupiny 2 sa infikovali s 6x106 TCID50 B-WT.
Tabuľka 7b - Virémia krvných buniek v skupine 1 a 2
Sk. Zviera Prvý deň zaznamenania výskytu v nose Posledný deň zaznamenania výskytu v nose Trvanie zaznamenávania v nose (dni) Priemerné trvanie v skupine (dni)
1 1 6 6 1 1,4
2 4 6 2
3 5 5 1
4 - - 0
5 6 9 3
2 6 4 8 5 4,4
7 4 7 4
8 4 7 4
9 4 7 4
10 4 8 5
EDTA vzorky krvi sa odoberali do 10 dňa po infekcii s Β-346-d, respektíve B-WT. 0,2 ml krvi sa pridalo do každej z troch kultúr (Cte) buniek teľacích semenníkov s médiom obsahujúcim heparín (1 jednotka na ml, aby sa zabránilo zrážaniu). Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo čerstvým médiom bez he10 parínu. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špecifickým pre BVDV. Negatívne kultúry sa zmrazili a následne rozmrazili. 0,2 ml z nich sa dvakrát prepasážovalo na Cte bunkách, aby sa potvrdila neprítomnosť BVDV.
Tabuľka 7c - Výskyt vírusu v nosnej tekutine
Sk. Zviera Prvý deň zaznamenania výskytu v nose Posledný deň zaznamenania výskytu v nose Počet dní, kedy bol vírus detegovaný v sekréte Priemerný počet dní, kedy bol vírus detegovaný, na skupinu
1 1 4 8 4 2,6
2 6 6 1
3 4 4 1
4 5 7 3
5 3 6 3
2 6 6 8 3 3,6
7 5 7 3
8 5 8 4
9 5 6 2
10 3 9 6
Nosný sekrét sa centrifugoval (1000 ot./min.), aby sa odstránili veľké nečistoty a kontaminanty. Supematantová tekutina sa odobrala a 0,2 ml z nej sa vysialo do každej z troch bunkových kultúr. Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo čerstvým médiom. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špecifickým pre BVDV.
Tabuľka 7d - Priemerné rektálne teploty skupín 1 a 3
Deň štúdie -2 -1 0 1 2 3 4 5
skúp. 1 38,4 38,6 38,5 38,5 38,6 38,4 38,4 38,4
skúp. 3 38,8 39,1 38,8 39,1 39,4 39,7 40,2 40,2
Deň štúdie 6 7 8 9 10 12 14
skúp. 1 38,3 38,4 38,4 38,4 38,4 38,4 38,5
skúp. 3 40,4 41,3 40,2 40,1 40,2 40,8 40,4
Rektálne teploty sa merali do 16 dní po vyzývacej infekcii. Zvieratá skupiny 1 a 3 sa infikovali 6x106 25 TCID50 virulentného BVDV izolátu č. 13.
Tabuľka 7e - Priemerný počet bielych krviniek
Deň štúdie -2 -1 0 1 2 3 4 5
skúp. 1 11,9 11,9 11,3 10,8 9,2 8,2 8,9 9,9
skúp. 3 11,7 15,8 13,8 11,1 7,7 9,8 7,4 6,8
Deň štúdie 6 7 8 9 10 12 14
skúp. 1 11,2 11,6 11,6 10,6 10,8 10,8 9,4
skúp. 3 7,5 8,7 7,0 8,1 6,2 6,4 6,2
EDTA vzorky krvných buniek sa odoberali derme odo dňa -2 do dňa 14 po vyzývacej infekcii z každého zvieraťa v oboch skupinách. Počty bielych krviniek v EDTA krvných vzorkách sa stanovili použitím Sysmex Micro-Cell Counter F800.
Tabuľka 7f - BVDV izolovaný z krvných vzoriek
Sk. Zviera Prvý deň detegovania vírusu v krvi Posledný deň detegovania vírusu v krvi Trvanie zaznamenávania v krvi (dni) Priemerné trvanie (dni)
1 1 - - 0 0
2 - - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 - - 0
3 11 3 10 8 9,7
12 3 14 12
13 3 9 9
EDTA vzorky krvi sa odoberali do 10 dňa po vyzývacej infekcii. 0,2 ml krvi sa pridalo do každej z troch kultúr (Cte) buniek teľacích semenníkov s médiom obsahujúcim heparín (1 jednotka na ml, aby sa zabránilo zrážaniu). Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo čerstvým médiom bez heparínu. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špecifickým pre BVDV. Negatívne kultúry sa zmrazili a následne rozmrazili. 0,2 ml z nich sa dvakrát prepasážovalo na Cte bunkách, aby sa potvrdila neprítomnosť BVDV.
Tabuľka 7g - Rozšírenie vírusu v nosnej tekutine
Sk. Zviera Prvý deň zaznamenania výskytu v nose Posledný deň zaznamenania výskytu v nose Trvanie výskytu v nose (dni) Priemerné trvanie (dni na skupinu)
1 1 3 4 2 0,8
2 - - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 4 5 2
3 11 3 14 12 10
12 3 14 12
13 3 8 6
Nosný sekrét sa centrifugoval (1000 ot./min.), aby sa odstránili veľké nečistoty a kontaminanty. Supematantová tekutina sa odobrala a 0,2 ml z nej sa vysialo do každej z troch bunkových kultúr. Po inkubovaní cez noc sa inokulum/médium nahradilo 2 ml čerstvého média. Po 4 až 6 dňovej inkubácii sa BVDV infikované bunky detegovali imunofluorescenciou s polyklonálnym sérom špecifickým pre BVDV.
Príklad 8
Rozlíšenie medzi C-346-d a CSFV bez delécie histidínového kodónu 346 prostredníctvom RT-PCR
RNA sekvencia kódujúca konzervatívny RNázový motív v CSFV glykoproteíne ERNS je vysoko konzer30 vovaná. Nezistila sa žiadna nukleotidová zámena medzi všetkými známymi CSFV sekvenciami v oblasti zodpovedajúcej zvyškom 1387 až 1416 zverejnenej sekvencie CSFV Alfort kmeňa (Meyers a ďalší, 1987).
Takže na detekciu všetkých CSFV izolátov je možné použiť oligonukleotidové priméry odvodené od konzervatívnej oblasti genómu na RT-PCR test (pozri obrázok 7). Z toho vyplýva, že neprítomnosť tripletu kódujúceho histidín 346 (nukleotidy 1399 až 1401) mohla byť detegovaná RT-PCR testom s vhodne navrhnutým primérom. Syntetizovali sa rôzne oligonukleotidy pokrývajúce konzervatívnu oblasť, ktoré buď obsahovali, alebo neobsahovali histidínový kodón. Tieto oligonukleotidy slúžili ako predné priméry v RT-PCR reakciách s oligonukleotidovým ERNS-Stop zadným primérom. Ako templáty sa použili RNA purifikované z tkanivovej kultúry buniek infikovaných s C-346-d, C-WT, C-346-L alebo C-346-K. Reverzná transkripcia 2 gg teplom denaturovanej RNA (2 min. 92 °C, 5 min. na ľade v 11,5 μΐ vody v prítomnosti 30pMol reverzného priméra) sa uskutočňovala po pridaní 8 μΐ RT zmesi (125mM Tris/HCl pH 8,3, 182,5mM KC1, 7,5mM MgCl2, 25mM ditiotreitol, l,25mM každý z dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Nemecko) a 50 U Superscript (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Nemecko) 45 minút pri 37 °C. Po ukončení reverznej transkripcie sa skúmavky umiestnili na ľad a pridalo sa 30 μΐ PCR zmesi (8,3mM Tris/HCl, pH 8,3; 33,3mM KC1; 2,2mM MgCl2; 0,42mM každého z dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0,17 % TritonXIOO; 0,03 % hovädzí sérový albumín; 5 U Taq polymerázy (Appligene, Heidelberg, Nemecko) a 16,7 % DMSO). Keď sa použil primér ΟΙ H+3, reakčná zmes na amplifikáciu neobsahovala DMSO. Amplifikácia sa uskutočňovala v 36 cykloch (30 sekúnd 94 °C, 30 sekúnd 57 °C, 45 sekúnd 74 °C). 1 μΐ amplifikačnej reakčnej zmesi sa naniesol na 1 % agarózový gél, amplifikované produkty sa oddelili elektroforézou a vyfarbili etídium bromidom. Ako je demonštrované na obrázku 7, pár primérov ΟΙ H-3/OI EmsStop umožnil špecifickú amplifikáciu pásu odvodeného od RNA s deléciou kodónu 346, zatiaľ čo ďalšie dve kombinácie primérov vytvárali produkty obsahujúce kodón 346 a neamplifikoval sa nimi žiadny pás, keď bola ako templát použitá RNA s deléciou tohto kodónu.
Priméry pre RT-PCR:
predné (upstream):
ΟΙ H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT
ΟΙ H+2: TGGAACAAACATGGATGG
OIH+3: GAATGGAACAAACATGGA zadný (downstream):
OI EmsStop GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG

Claims (4)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov, vyznačujúci sa tým, že je pri ňom inaktivovaná RNázová aktivita, ktorej nositeľom je glykoproteín ERNS, pričom RNázová aktivita je inaktivovaná deléciami a/alebo mutáciami najmenej jednej aminokyseliny uvedeného glykoproteínu, s podmienkou, že aminokyselinami v polohách 297 a/alebo 346, ako sú znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch, nie sú lyzíny, pričom inaktivovanie RNázovej aktivity, ktorej nositeľom je ERNS glykoproteín, vedie k oslabenému pestivírusu.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že delécie a/alebo mutácie sú lokalizované v aminokyselinových polohách 295 až 307 a/alebo 338 až 357, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcich polohách glykoproteínu v iných kmeňoch.
  3. 3. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že RNázová aktivita je inaktivovaná deléciou alebo mutáciou aminokyseliny v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch.
  4. 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že RNázová aktivita je inaktivovaná deléciou histidínového zvyšku v polohe 346, ako je znázornené na obrázku 1 pre CSFV Alfort kmeň ako príklad, alebo v zodpovedajúcej polohe glykoproteínu v iných kmeňoch.
    Zoznam sekvencii
SK50019-2009A 1998-06-05 1999-05-26 Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov SK287626B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98110356A EP0965639A1 (en) 1998-06-05 1998-06-05 Attenuated pestiviruses
PCT/EP1999/003642 WO1999064604A2 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK287626B6 true SK287626B6 (sk) 2011-04-05

Family

ID=8232074

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50019-2009A SK287626B6 (sk) 1998-06-05 1999-05-26 Spôsob detegovateľného značenia pestivírusov
SK50018-2009A SK287625B6 (sk) 1998-06-05 1999-05-26 Oslabený pestivírus, nukleová kyselina, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
SK1823-2000A SK287014B6 (sk) 1998-06-05 1999-05-26 Živá vakcína, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, jej použitie, spôsob oslabenia pestivírusov a spôsob odlíšenia pestivírusom infikovaných zvierat od očkovaných

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50018-2009A SK287625B6 (sk) 1998-06-05 1999-05-26 Oslabený pestivírus, nukleová kyselina, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
SK1823-2000A SK287014B6 (sk) 1998-06-05 1999-05-26 Živá vakcína, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, jej použitie, spôsob oslabenia pestivírusov a spôsob odlíšenia pestivírusom infikovaných zvierat od očkovaných

Country Status (23)

Country Link
EP (5) EP0965639A1 (sk)
JP (3) JP4632540B2 (sk)
KR (1) KR100637940B1 (sk)
CN (2) CN101085346A (sk)
AR (3) AR020084A1 (sk)
AT (3) ATE316380T1 (sk)
AU (1) AU769823C (sk)
BR (2) BR9911619B1 (sk)
CA (1) CA2330241C (sk)
CO (1) CO5050392A1 (sk)
CZ (3) CZ301570B6 (sk)
DE (3) DE69928700T2 (sk)
DK (3) DK1084251T3 (sk)
ES (3) ES2253457T3 (sk)
HU (3) HU228469B1 (sk)
NZ (1) NZ509228A (sk)
PE (1) PE20000552A1 (sk)
PL (2) PL202509B1 (sk)
PT (2) PT1203813E (sk)
SI (3) SI1084251T1 (sk)
SK (3) SK287626B6 (sk)
TR (3) TR200003622T2 (sk)
WO (1) WO1999064604A2 (sk)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
EP1104676A1 (en) 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
EP1149901B1 (en) * 2000-04-21 2006-04-05 Akzo Nobel N.V. Pestivirus mutants and vaccines containing the same
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
US20090068223A1 (en) 2005-11-15 2009-03-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
UY31930A (es) 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
JP2012507537A (ja) 2008-10-31 2012-03-29 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド マイコプラズマ・ボビスの抗原を含む種々の抗原の多価ワクチン組成物における使用
US8846054B2 (en) 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
UY32570A (es) 2009-04-24 2010-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna viva modificada de mycoplasma bovis mejorada
CN101915837B (zh) * 2010-07-28 2013-07-03 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
EP2618841B1 (en) 2010-09-21 2016-10-19 Intervet International B.V. Bvdv vaccine
CN103882051B (zh) * 2014-03-20 2016-04-06 北京市农林科学院 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒
WO2020211801A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. Recombinant classical swine fever virus

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122007000004I1 (de) * 1986-01-27 2007-05-24 Schering Plough Ltd Attenuierte Herpesviren, Herpesviren die eine Aminosäuresequenz kodierende fremde DNA enthalten, unddiese enthaltende Impfstoffe

Also Published As

Publication number Publication date
EP1203812B1 (en) 2005-11-30
JP5755265B2 (ja) 2015-07-29
DK1084251T3 (da) 2005-04-11
KR100637940B1 (ko) 2006-10-23
CA2330241A1 (en) 1999-12-16
SI1203813T1 (sl) 2006-06-30
TR200103666T2 (tr) 2002-03-21
JP5247770B2 (ja) 2013-07-24
CZ20004533A3 (cs) 2001-07-11
TR200103664T2 (tr) 2002-06-21
PE20000552A1 (es) 2000-07-14
SI1203812T1 (sl) 2006-04-30
SK287014B6 (sk) 2009-09-07
CZ301570B6 (cs) 2010-04-21
DE69929544T2 (de) 2006-07-20
EP0965639A1 (en) 1999-12-22
ES2235488T3 (es) 2005-07-01
DE69922953D1 (de) 2005-02-03
HUP0102707A2 (hu) 2001-11-28
HU228468B1 (en) 2013-03-28
DK1203812T3 (da) 2006-04-10
CA2330241C (en) 2010-09-21
PT1203813E (pt) 2006-06-30
SK18232000A3 (sk) 2001-05-10
JP2002517250A (ja) 2002-06-18
WO1999064604A2 (en) 1999-12-16
ES2257476T3 (es) 2006-08-01
ATE311193T1 (de) 2005-12-15
JP2010259445A (ja) 2010-11-18
BR9911619A (pt) 2001-10-02
HU228469B1 (en) 2013-03-28
KR20010071406A (ko) 2001-07-28
PL202509B1 (pl) 2009-06-30
DK1203813T3 (da) 2006-05-22
WO1999064604A3 (en) 2000-01-27
TR200003622T2 (tr) 2001-06-21
CN100374563C (zh) 2008-03-12
BRPI9917787B1 (pt) 2016-09-06
HUP0102707A3 (en) 2008-04-28
EP1203813A3 (en) 2004-02-04
CN101085346A (zh) 2007-12-12
CO5050392A1 (es) 2001-06-27
HU228471B1 (en) 2013-03-28
ATE286131T1 (de) 2005-01-15
PL348019A1 (en) 2002-05-06
DE69929544D1 (de) 2006-04-13
CZ301569B6 (cs) 2010-04-21
DE69928700T2 (de) 2006-06-22
JP2013099357A (ja) 2013-05-23
AU769823C (en) 2004-11-25
PL202161B1 (pl) 2009-06-30
AR071880A2 (es) 2010-07-21
EP1084251B1 (en) 2004-12-29
AR020084A1 (es) 2002-04-10
ES2253457T3 (es) 2006-06-01
AR071881A2 (es) 2010-07-21
CZ301494B6 (cs) 2010-03-24
PT1084251E (pt) 2005-03-31
EP1203812A3 (en) 2004-02-04
JP4632540B2 (ja) 2011-02-16
EP1614423A3 (en) 2008-01-30
AU769823B2 (en) 2004-02-05
BR9911619B1 (pt) 2013-11-12
EP1203813A2 (en) 2002-05-08
SK287625B6 (sk) 2011-04-05
DE69922953T2 (de) 2005-05-19
EP1203812A2 (en) 2002-05-08
SI1084251T1 (sk) 2005-08-31
ATE316380T1 (de) 2006-02-15
EP1614423A2 (en) 2006-01-11
CN1304452A (zh) 2001-07-18
EP1203813B1 (en) 2006-01-25
NZ509228A (en) 2003-12-19
AU4369299A (en) 1999-12-30
EP1084251A2 (en) 2001-03-21
DE69928700D1 (de) 2006-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5755265B2 (ja) 弱毒化ペスチウイルス
US8895286B2 (en) Attenuated pestiviruses
US6610305B1 (en) Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
MXPA00011971A (en) Attenuated pestiviruses

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20190526