JP2002517250A - 弱毒化ペスチウイルス - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は糖タンパク質ERNSにあるそれらの酵素活性が不活性化されていることを特徴とする弱毒化ペスチウイルス、これらの調製方法、使用方法及び検出方法に関する。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は糖タンパク質ERNSにあるリボヌクレアーゼ活性（RNase活性）を不活
性化することによるペスチウイルスの弱毒化方法に関する。また、本発明は本発
明に従って弱毒化されたペスチウイルス、このようなペスチウイルスを調製する
ための核酸、本発明の弱毒化ペスチウイルスを含むワクチン及び医薬組成物に関
する。更に、本発明は本発明の弱毒化ウイルスと病原ウイルスとを区別する方法
に関する。
性化することによるペスチウイルスの弱毒化方法に関する。また、本発明は本発
明に従って弱毒化されたペスチウイルス、このようなペスチウイルスを調製する
ための核酸、本発明の弱毒化ペスチウイルスを含むワクチン及び医薬組成物に関
する。更に、本発明は本発明の弱毒化ウイルスと病原ウイルスとを区別する方法
に関する。
【０００２】 （背景技術） ペスチウイルスは世界中の多くの国で経済的に重要な動物の疾患の原因物質で
ある。現在知られているウイルス分離物はフラビウイルス科中の一つの属を一緒
に形成する三つの異なる種にグルーピングされていた。 Ｉ ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)はウシにウシウイルス性下痢(BVD)及び
粘膜病(MD)を引き起こす(Baker, 1987; Moennig及びPlagemann, 1992; Thielら,
1996)。 II 以前には豚コレラウイルスと称された古典的ブタ熱病ウイルス(CSFV)は古典
的ブタ熱病(CSF)又は豚コレラ(HC)の原因である(Moennig及びPlagemann, 1992;
Thielら, 1996)。 III ボーダー病ウイルス(BDV)は典型的にはヒツジに見られ、ボーダー病(BD)を
引き起こす。ウシのMDと同様の症候がまたBDVによる子ヒツジの子宮内感染後に
生じることが記載されていた(Moennig及びPlagemann, 1992; Thielら, 1996)。 ペスチウイルスの別の分類がBecherら(1995)その他により提示されている。
ある。現在知られているウイルス分離物はフラビウイルス科中の一つの属を一緒
に形成する三つの異なる種にグルーピングされていた。 Ｉ ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)はウシにウシウイルス性下痢(BVD)及び
粘膜病(MD)を引き起こす(Baker, 1987; Moennig及びPlagemann, 1992; Thielら,
1996)。 II 以前には豚コレラウイルスと称された古典的ブタ熱病ウイルス(CSFV)は古典
的ブタ熱病(CSF)又は豚コレラ(HC)の原因である(Moennig及びPlagemann, 1992;
Thielら, 1996)。 III ボーダー病ウイルス(BDV)は典型的にはヒツジに見られ、ボーダー病(BD)を
引き起こす。ウシのMDと同様の症候がまたBDVによる子ヒツジの子宮内感染後に
生じることが記載されていた(Moennig及びPlagemann, 1992; Thielら, 1996)。 ペスチウイルスの別の分類がBecherら(1995)その他により提示されている。
【０００３】 ペスチウイルスは5'キャップ配列及び3' poly(A)配列の両方を欠いている陽極
性の一本鎖RNAゲノムを有する小さいエンベロープウイルスである。ウイルスゲ
ノムは細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼを伴う同時翻訳プロセシング
及び後翻訳プロセシングにより最終開裂産物を生じる約4000アミノ酸のポリタン
パク質をコードする。ウイルスタンパク質は順位NH2-Npro-C-ERNS-E1-E2-p7-NS2
-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOHでポリタンパク質中に配置されている(Rice, 19
96)。プロテインＣ並びに糖タンパク質ERNS、E1及びE2がペスチウイルスのウイ
ルス粒子の構造成分に相当し（Thielら, 1991）、E2及び少ない程度でERNSが抗
体中和の標的であることがわかった(Donisら, 1988; Patonら, 1992; van Rijn
ら, 1993; Weilandら, 1990, 1992)。ERNSは膜アンカーを欠いており、感染細胞
からかなりの量で分泌される。このタンパク質はRNase活性を示すことが報告さ
れていた（Hulstら, 1994; Schneiderら, 1993; Windischら, 1996）。ウイルス
生活環に関するこの酵素活性の機能は現在知られていない。CSFVワクチン株の場
合、部位誘導突然変異誘発によるRNaseの実験的分解は野生型ウイルスと同等の
細胞培養中の増殖特性を有する細胞変性ウイルスをもたらすと報告されていた（
Hulstら, 1998）。その酵素活性はペスチウイルスERNSと植物起源及び菌類起源
の異なる既知のRNaseとの間に保存されたアミノ酸の二つのストレッチの存在に
依存する。これらの保存配列の両方がヒスチジン残基を含む(Schneiderら, 1993
)。CSFVワクチン株のERNSタンパク質中のリシンに対するこれらの残基の夫々の
交換がRNase活性の分解をもたらした（Hulstら, 1998）。CSFVワクチン株のゲノ
ムへのこれらの突然変異の導入はウイルス生存度又は増殖性に影響しなかったが
、わずかに細胞変性の表現型を示すウイルスをもたらした（Hulstら, 1998）。
性の一本鎖RNAゲノムを有する小さいエンベロープウイルスである。ウイルスゲ
ノムは細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼを伴う同時翻訳プロセシング
及び後翻訳プロセシングにより最終開裂産物を生じる約4000アミノ酸のポリタン
パク質をコードする。ウイルスタンパク質は順位NH2-Npro-C-ERNS-E1-E2-p7-NS2
-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOHでポリタンパク質中に配置されている(Rice, 19
96)。プロテインＣ並びに糖タンパク質ERNS、E1及びE2がペスチウイルスのウイ
ルス粒子の構造成分に相当し（Thielら, 1991）、E2及び少ない程度でERNSが抗
体中和の標的であることがわかった(Donisら, 1988; Patonら, 1992; van Rijn
ら, 1993; Weilandら, 1990, 1992)。ERNSは膜アンカーを欠いており、感染細胞
からかなりの量で分泌される。このタンパク質はRNase活性を示すことが報告さ
れていた（Hulstら, 1994; Schneiderら, 1993; Windischら, 1996）。ウイルス
生活環に関するこの酵素活性の機能は現在知られていない。CSFVワクチン株の場
合、部位誘導突然変異誘発によるRNaseの実験的分解は野生型ウイルスと同等の
細胞培養中の増殖特性を有する細胞変性ウイルスをもたらすと報告されていた（
Hulstら, 1998）。その酵素活性はペスチウイルスERNSと植物起源及び菌類起源
の異なる既知のRNaseとの間に保存されたアミノ酸の二つのストレッチの存在に
依存する。これらの保存配列の両方がヒスチジン残基を含む(Schneiderら, 1993
)。CSFVワクチン株のERNSタンパク質中のリシンに対するこれらの残基の夫々の
交換がRNase活性の分解をもたらした（Hulstら, 1998）。CSFVワクチン株のゲノ
ムへのこれらの突然変異の導入はウイルス生存度又は増殖性に影響しなかったが
、わずかに細胞変性の表現型を示すウイルスをもたらした（Hulstら, 1998）。
【０００４】 弱毒化もしくは死滅されたウイルス又は異種発現系中で発現されたウイルスタ
ンパク質を含むワクチンがCSFV及びBVDVについて生成され、現在使用されている
。ライフワクチンとして使用されるこれらのウイルスの弱毒化の構造上の基礎は
知られていない。これはワクチン注射後の逆突然変異又は組換えにより予測でき
ない復帰突然変異体のリスクをもたらす。一方、免疫の誘導中の不活化ワクチン
又は異種発現されたウイルスタンパク質（サブユニットワクチン）の効力はかな
り低い。 一般に、弱毒化の基礎としての特定の突然変異を含む生ワクチンはワクチンの
現在の世代の欠点を回避することを可能にするであろう。ペスチウイルス中の弱
毒化突然変異に潜在的な標的は現在利用できない。 前記弱毒化突然変異の更なる利点はそれらを弱毒化ペスチウイルスに特有な標
識として使用し、それらを現場からのペスチウイルスから区別することを可能に
するそれらの分子上の特異性にある。 ペスチウイルス感染症の有効かつ安全並びに検出可能な予防及び治療の重要性
のために、免疫の誘導についての高い可能性並びに病因ペスチウイルスから区別
し得る弱毒化の特定の基礎を有する生の特異的に弱毒化されたワクチンに対する
強い要望がある。 それ故、本発明の基礎となる技術上の問題は、この方法の結果として、現場か
らの病因ペスチウイルスから区別し得る免疫の誘導について高い効力を有する生
の弱毒化ワクチンとしての使用のための特異的に弱毒化され、かつ検出可能に標
識されたペスチウイルスを提供することである。
ンパク質を含むワクチンがCSFV及びBVDVについて生成され、現在使用されている
。ライフワクチンとして使用されるこれらのウイルスの弱毒化の構造上の基礎は
知られていない。これはワクチン注射後の逆突然変異又は組換えにより予測でき
ない復帰突然変異体のリスクをもたらす。一方、免疫の誘導中の不活化ワクチン
又は異種発現されたウイルスタンパク質（サブユニットワクチン）の効力はかな
り低い。 一般に、弱毒化の基礎としての特定の突然変異を含む生ワクチンはワクチンの
現在の世代の欠点を回避することを可能にするであろう。ペスチウイルス中の弱
毒化突然変異に潜在的な標的は現在利用できない。 前記弱毒化突然変異の更なる利点はそれらを弱毒化ペスチウイルスに特有な標
識として使用し、それらを現場からのペスチウイルスから区別することを可能に
するそれらの分子上の特異性にある。 ペスチウイルス感染症の有効かつ安全並びに検出可能な予防及び治療の重要性
のために、免疫の誘導についての高い可能性並びに病因ペスチウイルスから区別
し得る弱毒化の特定の基礎を有する生の特異的に弱毒化されたワクチンに対する
強い要望がある。 それ故、本発明の基礎となる技術上の問題は、この方法の結果として、現場か
らの病因ペスチウイルスから区別し得る免疫の誘導について高い効力を有する生
の弱毒化ワクチンとしての使用のための特異的に弱毒化され、かつ検出可能に標
識されたペスチウイルスを提供することである。
【０００５】 （発明の開示） 上記の技術上の問題の解決はこの記載及び特許請求の範囲に特定された実施態
様により達成される。 驚くことに、ペスチウイルスが糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化
により特異的に弱毒化し得ることがわかった。 弱毒化ペスチウイルスは高い免疫原性の生ワクチンを与える。 それ故、一局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNaseが不活性化
されているペスチウイルスを含むことを特徴とする生ワクチンを提供する。
様により達成される。 驚くことに、ペスチウイルスが糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化
により特異的に弱毒化し得ることがわかった。 弱毒化ペスチウイルスは高い免疫原性の生ワクチンを与える。 それ故、一局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNaseが不活性化
されているペスチウイルスを含むことを特徴とする生ワクチンを提供する。
【０００６】 （発明を実施するための最良の形態） 本明細書に使用される“ワクチン”という用語は動物に免疫応答を誘導する少
なくとも一種の免疫活性成分とおそらく前記活性成分の免疫活性を増進する必ず
しも必要ではない一種以上の付加的な成分とを含む医薬組成物を表す。ワクチン
は医薬組成物に典型的な更なる成分を更に含んでもよい。ワクチンの免疫活性成
分は完全生生物をその初期の形態で、又は所謂修飾生ワクチン(MLV)中の弱毒化
生物もしくは所謂死滅ワクチン(KV)中の適当な方法により不活性化された生物と
して含んでもよい。別の形態において、ワクチンの免疫活性成分は前記生物の適
当な要素（サブユニットワクチン）を含んでもよく、それによりこれらの要素が
全生物もしくはこのような生物の増殖培養物の分解及びその後の所望の一つ以上
の構造を生じる精製工程により、又は細菌、昆虫、哺乳類もしくはその他の種（
これらに限定されない）のような好適な系の適当な操作により誘導される合成方
法＋その後の分離操作及び精製操作により、或いは好適な医薬組成物を使用する
遺伝子物質の直接のとり込みによるワクチンを必要とする動物中の前記合成方法
の誘導（ポリヌクレオチドワクチン注射）により生成される。ワクチンは上記の
要素の一種を含んでもよく、又は一種より多い要素を同時に含んでもよい。
なくとも一種の免疫活性成分とおそらく前記活性成分の免疫活性を増進する必ず
しも必要ではない一種以上の付加的な成分とを含む医薬組成物を表す。ワクチン
は医薬組成物に典型的な更なる成分を更に含んでもよい。ワクチンの免疫活性成
分は完全生生物をその初期の形態で、又は所謂修飾生ワクチン(MLV)中の弱毒化
生物もしくは所謂死滅ワクチン(KV)中の適当な方法により不活性化された生物と
して含んでもよい。別の形態において、ワクチンの免疫活性成分は前記生物の適
当な要素（サブユニットワクチン）を含んでもよく、それによりこれらの要素が
全生物もしくはこのような生物の増殖培養物の分解及びその後の所望の一つ以上
の構造を生じる精製工程により、又は細菌、昆虫、哺乳類もしくはその他の種（
これらに限定されない）のような好適な系の適当な操作により誘導される合成方
法＋その後の分離操作及び精製操作により、或いは好適な医薬組成物を使用する
遺伝子物質の直接のとり込みによるワクチンを必要とする動物中の前記合成方法
の誘導（ポリヌクレオチドワクチン注射）により生成される。ワクチンは上記の
要素の一種を含んでもよく、又は一種より多い要素を同時に含んでもよい。
【０００７】 免疫応答を増進するための付加的な成分はワクチンに添加される、例えば、水
酸化アルミニウム、鉱油もしくはその他の油又は補助的分子のようなアジュバン
トと普通称される成分又はインターフェロン、インターロイキンもしくは成長因
子（これらに限定されない）のようなこのような付加的な成分による夫々の誘導
後に生体により生成される成分である。 “医薬組成物”は本質的には抗生物質又は駆虫薬（これらに限定されない）の
ような、それが投与される生物又はその表面に生きている生物の生理学的機能、
例えば、免疫機能を変更することができる一種以上の成分、並びにプロセシング
形質、滅菌、安定性、腸内経路もしくは非経口経路、例えば、経口経路、鼻内経
路、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、経皮経路もしくはその他の経路により
組成物を投与することのしやすさ、投与後のトレランス、徐放性（これらに限定
されない）のような或る種のその他の目的を達成するためにそれに添加されるそ
の他の成分からなる。 本発明のワクチンは先に特定されたワクチンを表し、一種の免疫活性成分がペ
スチウイルス又はペスチウイルス起源のものである。 “生ワクチン”という用語は生物、特に、生ウイルス活性成分を含むワクチン
を表す。 本明細書に使用される“ペスチウイルス”という用語はフラビウイルス科中の
BVDV、CSFV及びBDVと同じ属に属すること及び糖タンパク質ERNSのそれらの発現
を特徴とする、全てのペスチウイルスを表す。勿論、前記用語はまたBecherら(1
995)により特性決定された全てのペスチウイルス又は糖タンパク質ERNSを発現す
るその他のペスチウイルスを表す。本明細書に使用される“RNase活性”はRNAを
加水分解する糖タンパク質ERNSの能力を表す。 用語糖タンパク質E0は刊行物中に糖タンパク質ERNSと同義でしばしば使用され
ることが注目されるべきである。 “前記糖タンパク質にあるRNase活性の不活性化”という用語は前記糖タンパ
ク質ERNSの未修飾野生型と較べて修飾糖タンパク質ERNSがRNAを加水分解するこ
とができないこと又は低下されたその能力を表す。 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化は本明細書及びHulstら(1998)に
より実証されるような前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び
／又は突然変異により達成し得る。それ故、好ましい実施態様において、本発明
は前記RNase活性が前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／
又は突然変異により不活性化されている生ワクチンに関する。
酸化アルミニウム、鉱油もしくはその他の油又は補助的分子のようなアジュバン
トと普通称される成分又はインターフェロン、インターロイキンもしくは成長因
子（これらに限定されない）のようなこのような付加的な成分による夫々の誘導
後に生体により生成される成分である。 “医薬組成物”は本質的には抗生物質又は駆虫薬（これらに限定されない）の
ような、それが投与される生物又はその表面に生きている生物の生理学的機能、
例えば、免疫機能を変更することができる一種以上の成分、並びにプロセシング
形質、滅菌、安定性、腸内経路もしくは非経口経路、例えば、経口経路、鼻内経
路、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、経皮経路もしくはその他の経路により
組成物を投与することのしやすさ、投与後のトレランス、徐放性（これらに限定
されない）のような或る種のその他の目的を達成するためにそれに添加されるそ
の他の成分からなる。 本発明のワクチンは先に特定されたワクチンを表し、一種の免疫活性成分がペ
スチウイルス又はペスチウイルス起源のものである。 “生ワクチン”という用語は生物、特に、生ウイルス活性成分を含むワクチン
を表す。 本明細書に使用される“ペスチウイルス”という用語はフラビウイルス科中の
BVDV、CSFV及びBDVと同じ属に属すること及び糖タンパク質ERNSのそれらの発現
を特徴とする、全てのペスチウイルスを表す。勿論、前記用語はまたBecherら(1
995)により特性決定された全てのペスチウイルス又は糖タンパク質ERNSを発現す
るその他のペスチウイルスを表す。本明細書に使用される“RNase活性”はRNAを
加水分解する糖タンパク質ERNSの能力を表す。 用語糖タンパク質E0は刊行物中に糖タンパク質ERNSと同義でしばしば使用され
ることが注目されるべきである。 “前記糖タンパク質にあるRNase活性の不活性化”という用語は前記糖タンパ
ク質ERNSの未修飾野生型と較べて修飾糖タンパク質ERNSがRNAを加水分解するこ
とができないこと又は低下されたその能力を表す。 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化は本明細書及びHulstら(1998)に
より実証されるような前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び
／又は突然変異により達成し得る。それ故、好ましい実施態様において、本発明
は前記RNase活性が前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／
又は突然変異により不活性化されている生ワクチンに関する。
【０００８】 糖タンパク質ERNSは約97kDのジスルフィド結合されたホモダイマーを形成する
ことが示され、夫々のモノマーはRumenapfら(1993)により記載されたCSFVポリタ
ンパク質のアミノ酸268-494に相当する227アミノ酸からなる。CSFVのアルフォー
ト(Alfort)株により発現された最初の495アミノ酸が参考の目的のみのために図
１に示される。CSFVのアルフォート株のゲノム配列は受理番号J04358としてGenB
ank/EMBLデータライブラリー中で入手し得る。また、BVDV株CP7に関するアミノ
酸配列はGenBank/EMBLデータライブラリー（受理番号U63479）中でアクセスし得
る。アミノ酸の二つの領域は糖タンパク質ERNS中だけでなく、或る種の植物及び
菌類のRNase活性タンパク質中で高度に保存される（Schneiderら, 1993）。これ
らの二つの領域がRNase酵素活性に特に重要である。第一領域はCSFVのアルフォ
ート株について図１により例示されるように位置295-307のアミノ酸の領域から
なり、また第二領域は前記ウイルスポリタンパク質の位置338-357のアミノ酸か
らなる（CSFV株アルフォートの公表された演繹アミノ酸配列(Meyersら, 1989)に
従うナンバリング）。上記RNase活性に特に重要なアミノ酸はCSFVのアルフォー
ト株について特定された正確な位置に何ら限定されないが、その位置又はBVDV、
BDV及び一般のペスチウイルスに見られるその他の株中のその位置に相当する位
置にある好ましいアミノ酸を指摘するために単に例示様式で使用される。何とな
らば、それらが高度に保存されるからである。CSFVアルフォート株以外のペスチ
ウイルスについて、好ましいアミノ酸の位置のナンバリングはしばしば異なるが
、ペスチウイルスの分子生物学の分野の専門家は前記糖タンパク質の高度に保存
されたアミノ酸に対するそれらの位置によりこれらの好ましいアミノ酸を容易に
同定するであろう。一つの特別な非限定例において、CSFVアルフォートの位置34
6はBVDV株cp7の位置349と同じである。
ことが示され、夫々のモノマーはRumenapfら(1993)により記載されたCSFVポリタ
ンパク質のアミノ酸268-494に相当する227アミノ酸からなる。CSFVのアルフォー
ト(Alfort)株により発現された最初の495アミノ酸が参考の目的のみのために図
１に示される。CSFVのアルフォート株のゲノム配列は受理番号J04358としてGenB
ank/EMBLデータライブラリー中で入手し得る。また、BVDV株CP7に関するアミノ
酸配列はGenBank/EMBLデータライブラリー（受理番号U63479）中でアクセスし得
る。アミノ酸の二つの領域は糖タンパク質ERNS中だけでなく、或る種の植物及び
菌類のRNase活性タンパク質中で高度に保存される（Schneiderら, 1993）。これ
らの二つの領域がRNase酵素活性に特に重要である。第一領域はCSFVのアルフォ
ート株について図１により例示されるように位置295-307のアミノ酸の領域から
なり、また第二領域は前記ウイルスポリタンパク質の位置338-357のアミノ酸か
らなる（CSFV株アルフォートの公表された演繹アミノ酸配列(Meyersら, 1989)に
従うナンバリング）。上記RNase活性に特に重要なアミノ酸はCSFVのアルフォー
ト株について特定された正確な位置に何ら限定されないが、その位置又はBVDV、
BDV及び一般のペスチウイルスに見られるその他の株中のその位置に相当する位
置にある好ましいアミノ酸を指摘するために単に例示様式で使用される。何とな
らば、それらが高度に保存されるからである。CSFVアルフォート株以外のペスチ
ウイルスについて、好ましいアミノ酸の位置のナンバリングはしばしば異なるが
、ペスチウイルスの分子生物学の分野の専門家は前記糖タンパク質の高度に保存
されたアミノ酸に対するそれらの位置によりこれらの好ましいアミノ酸を容易に
同定するであろう。一つの特別な非限定例において、CSFVアルフォートの位置34
6はBVDV株cp7の位置349と同じである。
【０００９】 結果として、本発明は更に好ましい実施態様において本発明のワクチンに関す
るものであり、前記不活性化欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置
295-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に
記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置され
る。 非常に好ましい実施態様において、本発明は前記糖タンパク質の位置346のア
ミノ酸の欠失又は突然変異による前記RNaseの不活性化が特に有益な生ワクチン
をもたらすことを開示する。それ故、本発明は前記RNase活性が前記糖タンパク
質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又
はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不
活性化されている本発明のワクチンに関する。
るものであり、前記不活性化欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置
295-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に
記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置され
る。 非常に好ましい実施態様において、本発明は前記糖タンパク質の位置346のア
ミノ酸の欠失又は突然変異による前記RNaseの不活性化が特に有益な生ワクチン
をもたらすことを開示する。それ故、本発明は前記RNase活性が前記糖タンパク
質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又
はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不
活性化されている本発明のワクチンに関する。
【００１０】 本発明はウイルスポリタンパク質の位置346のヒスチジン（CSFVアルフォート
／ツビンゲン(Tubingen)の公表された配列（Meyersら, 1989）に従うナンバリン
グ）（これはERNS RNaseの保存された推定活性部位残基の一つに相当する）が欠
失される場合にペスチウイルスが生存可能であり、RNase活性のないERNSタンパ
ク質をコードすることを実証する。また、BVDペスチウイルスのERNS中の夫々の
ヒスチジン（位置349、BVDV CP7 GenBank/EMBLデータライブラリーの配列（受理
番号U63479）に従ってナンバリングされた）の欠失はERNS糖タンパク質がRNase
活性を失った生存可能なウイルスをもたらすことが本発明について実証された。
一つのアミノ酸を別のものに変える点突然変異とは対照的に、欠失突然変異体は
一般に復帰突然変異体よりも極めて安定である。この欠失を含むERNSを発現する
病因CSFVアルフォート／ツビンゲンの突然変異体によるブタの感染はCSFV感染症
の発熱又はその他の典型的な臨床症候をもたらさなかったが、一方、野生型ウイ
ルスによる感染は発熱、下痢、拒食症、アパシー、Ｂ細胞の枯渇及び中枢神経障
害を生じた。これらのブタが瀕死段階で殺され、接種14日後に皮膚及び内臓中に
ひどい出血を示した。その突然変異体で感染されたブタは感染３日、５日、７日
、10日、14日後に試験してウイルス血症を示さなかったし、またＢ細胞枯渇を示
さなかったが、一方、CSFVが野生型ウイルスを接種されたブタ由来の血液サンプ
ルから容易に分離された。欠失突然変異体は中和抗体の誘導により示されるよう
に動物中で明らかに複製した（実施例３、表3cを参照のこと）。突然変異体ウイ
ルスに対する免疫応答はアルフォート株に異種であるCSFV株エイストラップ(Eys
trup)（Konig, 1994）による高度に病原性の感染の2x105 TCID50による致死抗原
投与を克服させるのに十分であった。更に、試験動物は抗原投与感染後に発熱、
下痢、出血、Ｂ細胞枯渇又は拒食症のようなCSFV感染に典型的な臨床症候を示さ
なかった。このデータは欠失突然変異体によるブタの感染が厳しい抗原投与に対
する保護に十分の免疫応答を誘導することを実証する。
／ツビンゲン(Tubingen)の公表された配列（Meyersら, 1989）に従うナンバリン
グ）（これはERNS RNaseの保存された推定活性部位残基の一つに相当する）が欠
失される場合にペスチウイルスが生存可能であり、RNase活性のないERNSタンパ
ク質をコードすることを実証する。また、BVDペスチウイルスのERNS中の夫々の
ヒスチジン（位置349、BVDV CP7 GenBank/EMBLデータライブラリーの配列（受理
番号U63479）に従ってナンバリングされた）の欠失はERNS糖タンパク質がRNase
活性を失った生存可能なウイルスをもたらすことが本発明について実証された。
一つのアミノ酸を別のものに変える点突然変異とは対照的に、欠失突然変異体は
一般に復帰突然変異体よりも極めて安定である。この欠失を含むERNSを発現する
病因CSFVアルフォート／ツビンゲンの突然変異体によるブタの感染はCSFV感染症
の発熱又はその他の典型的な臨床症候をもたらさなかったが、一方、野生型ウイ
ルスによる感染は発熱、下痢、拒食症、アパシー、Ｂ細胞の枯渇及び中枢神経障
害を生じた。これらのブタが瀕死段階で殺され、接種14日後に皮膚及び内臓中に
ひどい出血を示した。その突然変異体で感染されたブタは感染３日、５日、７日
、10日、14日後に試験してウイルス血症を示さなかったし、またＢ細胞枯渇を示
さなかったが、一方、CSFVが野生型ウイルスを接種されたブタ由来の血液サンプ
ルから容易に分離された。欠失突然変異体は中和抗体の誘導により示されるよう
に動物中で明らかに複製した（実施例３、表3cを参照のこと）。突然変異体ウイ
ルスに対する免疫応答はアルフォート株に異種であるCSFV株エイストラップ(Eys
trup)（Konig, 1994）による高度に病原性の感染の2x105 TCID50による致死抗原
投与を克服させるのに十分であった。更に、試験動物は抗原投与感染後に発熱、
下痢、出血、Ｂ細胞枯渇又は拒食症のようなCSFV感染に典型的な臨床症候を示さ
なかった。このデータは欠失突然変異体によるブタの感染が厳しい抗原投与に対
する保護に十分の免疫応答を誘導することを実証する。
【００１１】 それ故、最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不
活性化されている本発明のワクチンに関する。 更に別の最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失によ
り不活性化されている本発明のBVDVワクチンに関する。 別の局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性が前記糖タン
パク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化さ
れており、但し、前記糖タンパク質の位置297及び／又は346（CSFVについて図１
に記載された）のアミノ酸がリシンではないことを条件とする、弱毒化ペスチウ
イルスに関する。前記糖タンパク質の位置297及び／又は346のアミノ酸がリシン
である組換えペスチウイルスがHulstらにより1998年に記載されていた。これら
の特別なペスチウイルスはブタ腎臓細胞中で細胞変性効果を示した。今まで、ER NS 酵素活性の不活性化による驚くべき、かつ革新的な弱毒化の特徴が全く知られ
ていなかった。
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不
活性化されている本発明のワクチンに関する。 更に別の最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失によ
り不活性化されている本発明のBVDVワクチンに関する。 別の局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性が前記糖タン
パク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化さ
れており、但し、前記糖タンパク質の位置297及び／又は346（CSFVについて図１
に記載された）のアミノ酸がリシンではないことを条件とする、弱毒化ペスチウ
イルスに関する。前記糖タンパク質の位置297及び／又は346のアミノ酸がリシン
である組換えペスチウイルスがHulstらにより1998年に記載されていた。これら
の特別なペスチウイルスはブタ腎臓細胞中で細胞変性効果を示した。今まで、ER NS 酵素活性の不活性化による驚くべき、かつ革新的な弱毒化の特徴が全く知られ
ていなかった。
【００１２】 ワクチンについて上記された理由のために好ましい実施態様において、本発明
はまた前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は位置338-357
（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株
中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される欠失及び／又は突然変異によ
り不活性化されているペスチウイルスに関する。 ワクチンについて上記された理由のために更に好ましい実施態様において、本
発明はまた前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフ
ォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置
）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている本発明のペスチウイ
ルスに関する。 ワクチンについて上記された理由のために最も好ましい実施態様において、本
発明はまた前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフ
ォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置
）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されているペスチウイルスに関する。 更に別の最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失によ
り不活性化されているBVDVペスチウイルスに関する。
はまた前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は位置338-357
（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株
中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される欠失及び／又は突然変異によ
り不活性化されているペスチウイルスに関する。 ワクチンについて上記された理由のために更に好ましい実施態様において、本
発明はまた前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフ
ォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置
）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている本発明のペスチウイ
ルスに関する。 ワクチンについて上記された理由のために最も好ましい実施態様において、本
発明はまた前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフ
ォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置
）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されているペスチウイルスに関する。 更に別の最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失によ
り不活性化されているBVDVペスチウイルスに関する。
【００１３】 本発明の弱毒化ペスチウイルス及びワクチンの活性成分は糖タンパク質ERNS中
の突然変異体アミノ酸配列の発現をもたらす核酸修飾組換え技術により容易に調
製し得る。それ故、本発明の更なる局面は前記糖タンパク質にあるRNase活性が
前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により
不活性化されており、但し、前記糖タンパク質の位置297及び／又は346（例示様
式でCSFVアルフォート株について図１に記載された）のアミノ酸がリシンではな
いことを条件とする、糖タンパク質ERNSをコードする核酸に関する。 好ましい実施態様において、本発明は、上記された理由のために、前記RNase
活性が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFV
アルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当す
る位置）のアミノ酸に位置される欠失及び／又は突然変異により不活性化されて
いる、本発明の核酸に関する。 更に好ましい実施態様において、本発明は、ワクチンについて上記された理由
のために、前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフ
ォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置
）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている、本発明の核酸に関
する。 最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タンパク質
の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又は
その他の株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化さ
れている、本発明の核酸に関する。 更に別の最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失によ
り不活性化されている、本発明のBVDV核酸に関する。
の突然変異体アミノ酸配列の発現をもたらす核酸修飾組換え技術により容易に調
製し得る。それ故、本発明の更なる局面は前記糖タンパク質にあるRNase活性が
前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により
不活性化されており、但し、前記糖タンパク質の位置297及び／又は346（例示様
式でCSFVアルフォート株について図１に記載された）のアミノ酸がリシンではな
いことを条件とする、糖タンパク質ERNSをコードする核酸に関する。 好ましい実施態様において、本発明は、上記された理由のために、前記RNase
活性が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFV
アルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当す
る位置）のアミノ酸に位置される欠失及び／又は突然変異により不活性化されて
いる、本発明の核酸に関する。 更に好ましい実施態様において、本発明は、ワクチンについて上記された理由
のために、前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフ
ォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置
）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている、本発明の核酸に関
する。 最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タンパク質
の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又は
その他の株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化さ
れている、本発明の核酸に関する。 更に別の最も好ましい実施態様において、本発明は前記RNase活性が前記糖タ
ンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された
位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失によ
り不活性化されている、本発明のBVDV核酸に関する。
【００１４】 ヌクレオチド、例えば、DNA又はRNAはまたDNAワクチン、RNAワクチン及び／又
はベクターワクチンを調製するのに有益である。これらのワクチンでは、ヌクレ
オチドが動物に直接適用され、又は初期のウイルス以外のベクターにより間接的
に適用される。ヌクレオチドワクチン及びベクターワクチンは現在の技術水準か
ら公知であり、更に詳述するまでもないであろう。 更なる局面において、本発明はヌクレオチドワクチン及び／又はベクターワク
チンを調製するための本発明の核酸の使用に関する。 本発明のワクチン、弱毒化ペスチウイルス、及び／又は核酸は医薬組成物の調
製に特に有益である。 従って、本発明の更なる局面は本発明のワクチン、及び／又は本発明のペスチ
ウイルス、及び／又は本発明のヌクレオチド配列を含む医薬組成物に関する。例
示目的のためにのみ示される、このような医薬組成物の一つの非限定例は以下の
ようにして調製し得る。感染細胞培養物の細胞培養上澄みが安定剤（例えば、ス
ペルミジン及び／又はBSA（ウシ血清アルブミン））と混合され、続いて混合物
が凍結乾燥され、又はその他の方法により脱水される。ワクチン注射の前に、前
記混合物がその後に水溶液（例えば、食塩水、PBS（食塩加リン酸緩衝液））又
は非水性溶液（例えば、油エマルション、アルミニウムをベースとするアジュバ
ント）中で再度水和される。
はベクターワクチンを調製するのに有益である。これらのワクチンでは、ヌクレ
オチドが動物に直接適用され、又は初期のウイルス以外のベクターにより間接的
に適用される。ヌクレオチドワクチン及びベクターワクチンは現在の技術水準か
ら公知であり、更に詳述するまでもないであろう。 更なる局面において、本発明はヌクレオチドワクチン及び／又はベクターワク
チンを調製するための本発明の核酸の使用に関する。 本発明のワクチン、弱毒化ペスチウイルス、及び／又は核酸は医薬組成物の調
製に特に有益である。 従って、本発明の更なる局面は本発明のワクチン、及び／又は本発明のペスチ
ウイルス、及び／又は本発明のヌクレオチド配列を含む医薬組成物に関する。例
示目的のためにのみ示される、このような医薬組成物の一つの非限定例は以下の
ようにして調製し得る。感染細胞培養物の細胞培養上澄みが安定剤（例えば、ス
ペルミジン及び／又はBSA（ウシ血清アルブミン））と混合され、続いて混合物
が凍結乾燥され、又はその他の方法により脱水される。ワクチン注射の前に、前
記混合物がその後に水溶液（例えば、食塩水、PBS（食塩加リン酸緩衝液））又
は非水性溶液（例えば、油エマルション、アルミニウムをベースとするアジュバ
ント）中で再度水和される。
【００１５】 本発明の付加的な局面はペスチウイルスの弱毒化方法に関する。本発明は糖タ
ンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを特徴とするペスチウイルス
の特異かつ予期しない弱毒化方法を提供する。 特異的に弱毒化されたペスチウイルスはワクチンの調製に特に有益である。そ
れ故、更なる付加的な局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活
性を不活性化することを特徴とする特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチ
ンの生産方法に関する。 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化はペスチウイルスを検出可能に
標識するための驚くべき、かつ新規な方法を提供する。更なる局面において、本
発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを特徴とするペス
チウイルスを検出可能に標識する方法を提供する。本発明のペスチウイルスの糖
タンパク質ERNSにあるRNase活性の不在の特徴はこれらのペスチウイルスを検出
可能に標識することを可能にする。体液中のペスチウイルス感染細胞から分泌さ
れた標識され、又は標識されていないペスチウイルス又はERNSは分離及びこのよ
うな酵素活性のアッセイ後に糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在によ
り明らかに区別し得る。
ンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを特徴とするペスチウイルス
の特異かつ予期しない弱毒化方法を提供する。 特異的に弱毒化されたペスチウイルスはワクチンの調製に特に有益である。そ
れ故、更なる付加的な局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活
性を不活性化することを特徴とする特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチ
ンの生産方法に関する。 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化はペスチウイルスを検出可能に
標識するための驚くべき、かつ新規な方法を提供する。更なる局面において、本
発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを特徴とするペス
チウイルスを検出可能に標識する方法を提供する。本発明のペスチウイルスの糖
タンパク質ERNSにあるRNase活性の不在の特徴はこれらのペスチウイルスを検出
可能に標識することを可能にする。体液中のペスチウイルス感染細胞から分泌さ
れた標識され、又は標識されていないペスチウイルス又はERNSは分離及びこのよ
うな酵素活性のアッセイ後に糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在によ
り明らかに区別し得る。
【００１６】 欠失及び／又は突然変異により糖タンパク質ERNSにあるそれらのRNase活性を
不活性化されたペスチウイルスについて、幾つかのその他の技術が使用し得る。
このようなペスチウイルスはこのような欠失及び／又は突然変異から生じる構造
上の結果のために容易に検出し得る。例えば、変化された糖タンパク質ERNSの核
酸配列の配列の相違が実施例８に示されるように核酸配列決定技術又はPCR技術
（ポリメラーゼ連鎖反応）により検出できる。変化されたタンパク質配列は変化
しなかったタンパク質を認識しない特異性モノクローナル抗体により検出し得る
。その逆に、変化され、それにより構造標識されたタンパク質を変化しなかった
糖タンパク質ERNSを認識する特異性モノクローナル抗体への結合の不在により検
出することがまた可能であるが、但し、ペスチウイルスの存在がそれ以外に証明
し得ることを条件とする。また、勿論、標識ウイルス中のRNase活性を終わらせ
る欠失及び／又は突然変異は未標識ペスチウイルス感染症から生じる応答と較べ
た場合に動物で異なる免疫応答を生じるであろう。
不活性化されたペスチウイルスについて、幾つかのその他の技術が使用し得る。
このようなペスチウイルスはこのような欠失及び／又は突然変異から生じる構造
上の結果のために容易に検出し得る。例えば、変化された糖タンパク質ERNSの核
酸配列の配列の相違が実施例８に示されるように核酸配列決定技術又はPCR技術
（ポリメラーゼ連鎖反応）により検出できる。変化されたタンパク質配列は変化
しなかったタンパク質を認識しない特異性モノクローナル抗体により検出し得る
。その逆に、変化され、それにより構造標識されたタンパク質を変化しなかった
糖タンパク質ERNSを認識する特異性モノクローナル抗体への結合の不在により検
出することがまた可能であるが、但し、ペスチウイルスの存在がそれ以外に証明
し得ることを条件とする。また、勿論、標識ウイルス中のRNase活性を終わらせ
る欠失及び／又は突然変異は未標識ペスチウイルス感染症から生じる応答と較べ
た場合に動物で異なる免疫応答を生じるであろう。
【００１７】 ペスチウイルスの弱毒化方法、特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチン
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に好ましい実施態様は前記RNase活性を前記糖タンパク質の少な
くとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する糖タンパク
質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。 ペスチウイルスの弱毒化方法、特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチン
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に更に好ましい実施態様は前記欠失及び／又は突然変異が前記糖
タンパク質の位置295-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート
株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のア
ミノ酸に位置される糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。 ペスチウイルスの弱毒化方法、特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチン
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に非常に好ましい実施態様は前記RNase活性が前記糖タンパク質
の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又は
その他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活
性化される糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に好ましい実施態様は前記RNase活性を前記糖タンパク質の少な
くとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する糖タンパク
質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。 ペスチウイルスの弱毒化方法、特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチン
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に更に好ましい実施態様は前記欠失及び／又は突然変異が前記糖
タンパク質の位置295-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート
株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のア
ミノ酸に位置される糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。 ペスチウイルスの弱毒化方法、特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチン
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に非常に好ましい実施態様は前記RNase活性が前記糖タンパク質
の位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又は
その他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活
性化される糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。
【００１８】 ペスチウイルスの弱毒化方法、特異的に弱毒化されたペスチウイルスワクチン
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に最も好ましい実施態様は前記RNase活性が前記糖タンパク質の
位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はそ
の他の株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化され
る糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。 本発明は動物のペスチウイルス感染症の予防及び治療に特に有益であるワクチ
ン及び／又はその他の医薬組成物を提供する。それ故、本発明の更なる局面は本
発明のワクチン又は本発明の別の医薬組成物をこのような予防又は治療を要する
動物に適用することを特徴とする動物のペスチウイルス感染症の予防方法及び治
療方法に関する。 更なる局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化
することを特徴とする特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法を提供す
る。 一つの局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化
することを特徴とする特異的に標識されたペスチウイルスの調製方法を提供する
。
の生産方法及び本発明のペスチウイルスを検出可能に標識する方法について言及
する全ての局面に最も好ましい実施態様は前記RNase活性が前記糖タンパク質の
位置346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はそ
の他の株中のそれに相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化され
る糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方法である。 本発明は動物のペスチウイルス感染症の予防及び治療に特に有益であるワクチ
ン及び／又はその他の医薬組成物を提供する。それ故、本発明の更なる局面は本
発明のワクチン又は本発明の別の医薬組成物をこのような予防又は治療を要する
動物に適用することを特徴とする動物のペスチウイルス感染症の予防方法及び治
療方法に関する。 更なる局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化
することを特徴とする特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法を提供す
る。 一つの局面において、本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化
することを特徴とする特異的に標識されたペスチウイルスの調製方法を提供する
。
【００１９】 特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法、本発明の特異的に標識され
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に好ましい実施態様は
前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又
は突然変異により不活性化する糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方
法である。 特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法、本発明の特異的に標識され
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に更に好ましい実施態
様は前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は
位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又
はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される糖タンパク質ER NS の不活性化に関するこれらの方法である。
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に好ましい実施態様は
前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又
は突然変異により不活性化する糖タンパク質ERNSの不活性化に関するこれらの方
法である。 特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法、本発明の特異的に標識され
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に更に好ましい実施態
様は前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は
位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又
はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される糖タンパク質ER NS の不活性化に関するこれらの方法である。
【００２０】 特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法、本発明の特異的に標識され
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に非常に好ましい実施
態様は前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォー
ト株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）の
アミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化される糖タンパク質ERNSの不活性化
に関するこれらの方法である。 特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法、本発明の特異的に標識され
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に最も好ましい実施態
様は前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート
株について図１に記載された位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）
のヒスチジン残基の欠失により不活性化される糖タンパク質ERNSの不活性化に関
するこれらの方法である。
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に非常に好ましい実施
態様は前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォー
ト株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）の
アミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化される糖タンパク質ERNSの不活性化
に関するこれらの方法である。 特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法、本発明の特異的に標識され
たペスチウイルスの調製方法について言及する全ての局面に最も好ましい実施態
様は前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCSFVアルフォート
株について図１に記載された位置又はその他のBVDV株中のそれに相当する位置）
のヒスチジン残基の欠失により不活性化される糖タンパク質ERNSの不活性化に関
するこれらの方法である。
【００２１】 本発明のワクチン又はその他の医薬組成物は動物のペスチウイルス感染症の予
防及び治療に特に有益である。 それ故、一つの局面において、本発明は動物のペスチウイルス感染症の予防及
び治療のための本発明のワクチンの使用に関する。更なる局面において、本発明
は動物のペスチウイルス感染症の予防及び治療のための本発明の医薬組成物の使
用に関する。 本発明のペスチウイルス及び／又は核酸は医薬組成物又はワクチンの有益な活
性成分である。それ故、本発明は更なる局面においてワクチン又は医薬組成物の
調製のための本発明のペスチウイルス及び／又は本発明の核酸の使用に関する。
防及び治療に特に有益である。 それ故、一つの局面において、本発明は動物のペスチウイルス感染症の予防及
び治療のための本発明のワクチンの使用に関する。更なる局面において、本発明
は動物のペスチウイルス感染症の予防及び治療のための本発明の医薬組成物の使
用に関する。 本発明のペスチウイルス及び／又は核酸は医薬組成物又はワクチンの有益な活
性成分である。それ故、本発明は更なる局面においてワクチン又は医薬組成物の
調製のための本発明のペスチウイルス及び／又は本発明の核酸の使用に関する。
【００２２】 上記のように、糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不活性化はペスチウイル
スを標識するための驚くべき、かつ新規な方法を提供する。 従って、本発明の一つの局面は本発明の検出可能に標識されたペスチウイルス
を未標識かつおそらく病因のペスチウイルスから区別する方法に関する。このよ
うな方法は動物中の標識ペスチウイルスの効力を追跡するのに特に有益である。
ワクチン治療された動物はこのような動物のサンプルを得、前記標識についてア
ッセイした後に標識陽性を与えるであろう。未標識動物及び特にペスチウイルス
陽性を与える未標識動物が直ちに分離され、隔離され、又は屠殺されてその他の
動物への病的感染の広がりの切迫した危険性を取り去ることができる。
スを標識するための驚くべき、かつ新規な方法を提供する。 従って、本発明の一つの局面は本発明の検出可能に標識されたペスチウイルス
を未標識かつおそらく病因のペスチウイルスから区別する方法に関する。このよ
うな方法は動物中の標識ペスチウイルスの効力を追跡するのに特に有益である。
ワクチン治療された動物はこのような動物のサンプルを得、前記標識についてア
ッセイした後に標識陽性を与えるであろう。未標識動物及び特にペスチウイルス
陽性を与える未標識動物が直ちに分離され、隔離され、又は屠殺されてその他の
動物への病的感染の広がりの切迫した危険性を取り去ることができる。
【００２３】 本発明は糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを特徴とする
ペスチウイルスを検出可能に標識する方法を提供する。本発明のペスチウイルス
の糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不在のこの特徴はこれらのペスチウイル
スを検出可能に標識することを今可能にする。その結果として、標識ペスチウイ
ルス及び未標識ペスチウイルスが分離及びこのような酵素活性のアッセイ後に糖
タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在により明らかに区別し得る。関係す
るペスチウイルス又はその物質を含むサンプルを得た後のこの酵素活性の存在又
は不在の測定は、例えば、実施例２又はHulstら(1994)に記載されたような通常
の方法に従って行い得る。 それ故、好ましい実施態様において、本発明は (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中の糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在を測定する
工程、 (3) 糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在をワクチン注射された動物と相関関係
付け、前記活性の存在を前記動物のペスチウイルス感染症と相関関係付ける工程
を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明に従って特異的に弱毒
化されたペスチウイルスでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
ペスチウイルスを検出可能に標識する方法を提供する。本発明のペスチウイルス
の糖タンパク質ERNSにあるRNase活性の不在のこの特徴はこれらのペスチウイル
スを検出可能に標識することを今可能にする。その結果として、標識ペスチウイ
ルス及び未標識ペスチウイルスが分離及びこのような酵素活性のアッセイ後に糖
タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在により明らかに区別し得る。関係す
るペスチウイルス又はその物質を含むサンプルを得た後のこの酵素活性の存在又
は不在の測定は、例えば、実施例２又はHulstら(1994)に記載されたような通常
の方法に従って行い得る。 それ故、好ましい実施態様において、本発明は (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中の糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在を測定する
工程、 (3) 糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在をワクチン注射された動物と相関関係
付け、前記活性の存在を前記動物のペスチウイルス感染症と相関関係付ける工程
を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明に従って特異的に弱毒
化されたペスチウイルスでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
【００２４】 本発明は欠失及び／又は突然変異により糖タンパク質ERNSにあるそれらのRNas
e活性を不活性化されたペスチウイルスを提供する。このようなペスチウイルス
はこのような欠失及び／又は突然変異により生じる構造上の結果のために容易に
検出される。変化された糖タンパク質ERNSをコードするERNS遺伝子の配列の相違
が配列決定技術又はPCR技術により検出できる。その結果として、本発明は好ま
しい実施態様において (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中のペスチウイルスゲノム又はタンパク質のヌクレオチド配
列を同定する工程、 (3) ワクチン中に存在するERNSヌクレオチド配列の欠失及び／又は突然変異を
ワクチン注射された動物と相関関係付け、前記欠失及び／又は突然変異の不在を
前記動物のペスチウイルス感染症と相関関係付ける工程 を含むことを特徴とする、本発明の特異的に弱毒化されたペスチウイルスでワク
チン注射された動物からペスチウイルス感染動物を区別する方法を提供する。
e活性を不活性化されたペスチウイルスを提供する。このようなペスチウイルス
はこのような欠失及び／又は突然変異により生じる構造上の結果のために容易に
検出される。変化された糖タンパク質ERNSをコードするERNS遺伝子の配列の相違
が配列決定技術又はPCR技術により検出できる。その結果として、本発明は好ま
しい実施態様において (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中のペスチウイルスゲノム又はタンパク質のヌクレオチド配
列を同定する工程、 (3) ワクチン中に存在するERNSヌクレオチド配列の欠失及び／又は突然変異を
ワクチン注射された動物と相関関係付け、前記欠失及び／又は突然変異の不在を
前記動物のペスチウイルス感染症と相関関係付ける工程 を含むことを特徴とする、本発明の特異的に弱毒化されたペスチウイルスでワク
チン注射された動物からペスチウイルス感染動物を区別する方法を提供する。
【００２５】 更に、本発明のペスチウイルスの糖タンパク質ERNSの変化されたタンパク質配
列から生じる構造変化が未変化タンパク質を認識しない特異性モノクローナル抗
体又はポリクローナル抗体により検出し得る。 それ故、更なる実施態様において、本発明は (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中に存在するERNS糖タンパク質へのモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体の特異的結合により弱毒化ペスチウイルスの修飾ERNS糖タン
パク質を同定する工程（前記糖タンパク質は本発明の方法により修飾され、それ
により前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が未修飾ERNS糖タンパク
質に結合しない）、 (3) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の特異的結合をワクチン
注射された動物と相関関係付け、前記動物及び／又は前記サンプル中のペスチウ
イルス物質の存在がそうしないと証明される条件下で前記動物のペスチウイルス
感染への抗体結合の不在を相関関係付ける工程 を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明の弱毒化ペスチウイル
スでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
列から生じる構造変化が未変化タンパク質を認識しない特異性モノクローナル抗
体又はポリクローナル抗体により検出し得る。 それ故、更なる実施態様において、本発明は (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中に存在するERNS糖タンパク質へのモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体の特異的結合により弱毒化ペスチウイルスの修飾ERNS糖タン
パク質を同定する工程（前記糖タンパク質は本発明の方法により修飾され、それ
により前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が未修飾ERNS糖タンパク
質に結合しない）、 (3) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の特異的結合をワクチン
注射された動物と相関関係付け、前記動物及び／又は前記サンプル中のペスチウ
イルス物質の存在がそうしないと証明される条件下で前記動物のペスチウイルス
感染への抗体結合の不在を相関関係付ける工程 を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明の弱毒化ペスチウイル
スでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
【００２６】 逆に、ペスチウイルスの存在がそうしないと証明される場合に未変化糖タンパ
ク質ERNSのみを認識する特異性モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体への
結合の不在により変化され、それにより構造上標識されたタンパク質を検出する
ことがまた可能である。好ましい実施態様において、本発明は (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中に存在するERNS糖タンパク質へのモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体の特異的結合によりペスチウイルスの未修飾ERNS糖タンパク
質を同定する工程（前記糖タンパク質は本発明の方法により修飾されておらず、
それにより前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が修飾ERNS糖タンパ
ク質に結合しない）、 (3) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の特異的結合を前記動物
のペスチウイルス感染症と相関関係付け、前記動物及び／又は前記サンプル中の
ペスチウイルス物質の存在がそうしないと証明される条件下でワクチン注射され
た動物への抗体結合の不在を相関関係付ける工程 を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明の弱毒化ペスチウイル
スでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
ク質ERNSのみを認識する特異性モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体への
結合の不在により変化され、それにより構造上標識されたタンパク質を検出する
ことがまた可能である。好ましい実施態様において、本発明は (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中に存在するERNS糖タンパク質へのモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体の特異的結合によりペスチウイルスの未修飾ERNS糖タンパク
質を同定する工程（前記糖タンパク質は本発明の方法により修飾されておらず、
それにより前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が修飾ERNS糖タンパ
ク質に結合しない）、 (3) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の特異的結合を前記動物
のペスチウイルス感染症と相関関係付け、前記動物及び／又は前記サンプル中の
ペスチウイルス物質の存在がそうしないと証明される条件下でワクチン注射され
た動物への抗体結合の不在を相関関係付ける工程 を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明の弱毒化ペスチウイル
スでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
【００２７】 勿論、構造の修飾及び本発明の標識ウイルス中のRNase活性の不在は未標識ペ
スチウイルス感染症から生じる応答と較べた場合に動物の異なる免疫応答を生じ
るであろう。本発明のペスチウイルスは細胞だけでなく体液の異なり、かつ特有
の免疫応答を誘発し、これは未修飾かつおそらく病的の免疫応答とは異なる。例
えば、本発明の糖タンパク質ERNSは未修飾糖タンパク質から生じるポリクローナ
ル抗体と較べた場合にそれらの結合特異性を異にするポリクローナル抗体を生じ
るであろう。結合特異性のこの相違はペスチウイルス現場感染動物から本発明か
らのペスチウイルスでワクチン注射された動物を区別するための標識を与える。
感染動物及びワクチン注射された動物を差別する目的のために野生型エピトープ
又はそのエピトープのマーカー欠失突然変異に結合する特異性ポリクローナル抗
体について血清をスクリーニングするための試験が、例えば、仮性狂犬病感染ブ
タ及びワクチン注射されたブタについて記載されていた（Kitら, 1991）。
スチウイルス感染症から生じる応答と較べた場合に動物の異なる免疫応答を生じ
るであろう。本発明のペスチウイルスは細胞だけでなく体液の異なり、かつ特有
の免疫応答を誘発し、これは未修飾かつおそらく病的の免疫応答とは異なる。例
えば、本発明の糖タンパク質ERNSは未修飾糖タンパク質から生じるポリクローナ
ル抗体と較べた場合にそれらの結合特異性を異にするポリクローナル抗体を生じ
るであろう。結合特異性のこの相違はペスチウイルス現場感染動物から本発明か
らのペスチウイルスでワクチン注射された動物を区別するための標識を与える。
感染動物及びワクチン注射された動物を差別する目的のために野生型エピトープ
又はそのエピトープのマーカー欠失突然変異に結合する特異性ポリクローナル抗
体について血清をスクリーニングするための試験が、例えば、仮性狂犬病感染ブ
タ及びワクチン注射されたブタについて記載されていた（Kitら, 1991）。
【００２８】 好ましい実施態様において、本発明は (1) ポリクローナル抗体のサンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係
する動物又はワクチン注射された動物から得る工程、 (2) 未修飾糖タンパク質ERNS又は本発明に従って修飾された糖タンパク質ERNS
への前記ポリクローナル抗体の特異的結合を同定する工程、 (3) 未修飾糖タンパク質ERNSへの前記ポリクローナル抗体の結合をペスチウイ
ルス感染症と相関関係付け、本発明に従って修飾された糖タンパク質ERNSへの前
記ポリクローナル抗体の結合をワクチン注射された動物と相関関係付ける工程 を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明の弱毒化ペスチウイル
スでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
する動物又はワクチン注射された動物から得る工程、 (2) 未修飾糖タンパク質ERNS又は本発明に従って修飾された糖タンパク質ERNS
への前記ポリクローナル抗体の特異的結合を同定する工程、 (3) 未修飾糖タンパク質ERNSへの前記ポリクローナル抗体の結合をペスチウイ
ルス感染症と相関関係付け、本発明に従って修飾された糖タンパク質ERNSへの前
記ポリクローナル抗体の結合をワクチン注射された動物と相関関係付ける工程 を含むことを特徴とするペスチウイルス感染動物を本発明の弱毒化ペスチウイル
スでワクチン注射された動物から区別する方法に関する。
【００２９】 （実施例） 実施例１ RNase陰性ペスチウイルス突然変異体の生成 完全長cDNAクローンpA/CSFV (Meyersら, 1996a)又はpA/BVDV (Meyersら, 1996
b)（これらから感染性cRNAがin vitro転写により得られる）で開始して、サブク
ローンを生成した。CSFVについて、pA/CSFVのXhoI/SspI断片をpブルースクリプ
トSK+にクローン化し、XhoI及びSmaIで切断した。BVDVについて、pA/BVDVからの
XhoI/BgIII断片をプラスミドpCITE-2Cにクローン化し、同酵素で切断した。E. c
oli CJ 236細胞（バイオラド）及びVCMS一本鎖ファージ（ストラタゲン）を使用
して、一本鎖プラスミドDNAをKunkel（Kunkelら, 1987）の方法に従ってこれら
の構築物から生成した。“ファージミドin vitro突然変異誘発キット”（バイオ
ラド）を使用して、一本鎖DNAを二本鎖に変換した。所望のペスチウイルス突然
変異体を生成するためのプライマーとして使用された合成オリゴヌクレオチドの
幾つかを例示様式で以下にリストする。
b)（これらから感染性cRNAがin vitro転写により得られる）で開始して、サブク
ローンを生成した。CSFVについて、pA/CSFVのXhoI/SspI断片をpブルースクリプ
トSK+にクローン化し、XhoI及びSmaIで切断した。BVDVについて、pA/BVDVからの
XhoI/BgIII断片をプラスミドpCITE-2Cにクローン化し、同酵素で切断した。E. c
oli CJ 236細胞（バイオラド）及びVCMS一本鎖ファージ（ストラタゲン）を使用
して、一本鎖プラスミドDNAをKunkel（Kunkelら, 1987）の方法に従ってこれら
の構築物から生成した。“ファージミドin vitro突然変異誘発キット”（バイオ
ラド）を使用して、一本鎖DNAを二本鎖に変換した。所望のペスチウイルス突然
変異体を生成するためのプライマーとして使用された合成オリゴヌクレオチドの
幾つかを例示様式で以下にリストする。
【００３０】 C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG
【００３１】 二本鎖プラスミドDNAをE.coli XL1-ブルー細胞（ストラタゲン）の形質転換に
使用した。プラスミドを宿している細菌コロニーをアンピシリン選択により分離
した。プラスミドDNAを調製し、T7ポリメラーゼ配列決定キット（ファーマシア
）を使用してヌクレオチド配列決定により更に分析した。所望の突然変異を含み
、第二部位変化を含まないプラスミドを完全長cDNAクローンの構築に使用した。
CSFVの場合、突然変異誘発プラスミドからのXhoI/NdeI断片をプラスミド578（pA
/CSFVからのXhoI/BgIII断片を含むpCITE 2A）から誘導されたNdeI/BgIII断片と
一緒にXhoI及びBgIIIで切断されたpA/CSFVに挿入した。BVDV CP7突然変異体を得
るために、その欠失を含むXhoI/BgIII断片をpA/BVDV/Ins-から分離されたBgIII/
NcoI断片と一緒にXhoI及びNcoIで切断されたpA/BVDVに挿入した。構築物pA/BVDV
/Ins-から、cRNAを転写し、これが好適な細胞中でトランスフェクション後に非
細胞変性BVDVを生じる（Meyersら, 1996b）。異なる完全長クローンを増幅し、
プラスミドを分離した。所望の突然変異の存在がDNA配列決定により判明された
。SrfI (CSFV完全長クローン)又はSmaI (BVDV完全長クローン)で線状にした後、
cRNAを既に記載されたようにして転写した（Meyersら, 1996ab）。RNAをゲル濾
過及びフェノール／クロロホルム抽出により精製し、ブタ腎臓(PK15)細胞又はウ
シ腎臓(MDBKクローンB2)細胞の形質転換に使用した（夫々、CSFV構築物又はBVDV
構築物）。トランスフェクションをウイルス特異性抗血清による免疫蛍光により
分析した。所望の突然変異体が回収できた場合（免疫蛍光陽性）、ウイルスをト
ランスフェクション実験に使用したのと同じ細胞系による継代により増幅した。
CSFV突然変異体の更なる分析は１工程増殖曲線の測定及びウイルス特異性cDNAプ
ローブによるノーザンブロットによるウイルスRNAの特性決定並びに逆転写ポリ
メラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及びウイルスゲノム中の所望の突然変異の存在を確か
めるためのPCR断片のその後の配列決定を含んでいた。全ての場合に、所望の突
然変異の存在が判明された。回収したウイルスの全てが同等に良く増殖し、野生
型配列を示すプラスミドから生じるウイルスと同様の量のRNAを生成した。
使用した。プラスミドを宿している細菌コロニーをアンピシリン選択により分離
した。プラスミドDNAを調製し、T7ポリメラーゼ配列決定キット（ファーマシア
）を使用してヌクレオチド配列決定により更に分析した。所望の突然変異を含み
、第二部位変化を含まないプラスミドを完全長cDNAクローンの構築に使用した。
CSFVの場合、突然変異誘発プラスミドからのXhoI/NdeI断片をプラスミド578（pA
/CSFVからのXhoI/BgIII断片を含むpCITE 2A）から誘導されたNdeI/BgIII断片と
一緒にXhoI及びBgIIIで切断されたpA/CSFVに挿入した。BVDV CP7突然変異体を得
るために、その欠失を含むXhoI/BgIII断片をpA/BVDV/Ins-から分離されたBgIII/
NcoI断片と一緒にXhoI及びNcoIで切断されたpA/BVDVに挿入した。構築物pA/BVDV
/Ins-から、cRNAを転写し、これが好適な細胞中でトランスフェクション後に非
細胞変性BVDVを生じる（Meyersら, 1996b）。異なる完全長クローンを増幅し、
プラスミドを分離した。所望の突然変異の存在がDNA配列決定により判明された
。SrfI (CSFV完全長クローン)又はSmaI (BVDV完全長クローン)で線状にした後、
cRNAを既に記載されたようにして転写した（Meyersら, 1996ab）。RNAをゲル濾
過及びフェノール／クロロホルム抽出により精製し、ブタ腎臓(PK15)細胞又はウ
シ腎臓(MDBKクローンB2)細胞の形質転換に使用した（夫々、CSFV構築物又はBVDV
構築物）。トランスフェクションをウイルス特異性抗血清による免疫蛍光により
分析した。所望の突然変異体が回収できた場合（免疫蛍光陽性）、ウイルスをト
ランスフェクション実験に使用したのと同じ細胞系による継代により増幅した。
CSFV突然変異体の更なる分析は１工程増殖曲線の測定及びウイルス特異性cDNAプ
ローブによるノーザンブロットによるウイルスRNAの特性決定並びに逆転写ポリ
メラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及びウイルスゲノム中の所望の突然変異の存在を確か
めるためのPCR断片のその後の配列決定を含んでいた。全ての場合に、所望の突
然変異の存在が判明された。回収したウイルスの全てが同等に良く増殖し、野生
型配列を示すプラスミドから生じるウイルスと同様の量のRNAを生成した。
【００３２】 BVDV突然変異体の生存度を夫々のcRNAのトランスフェクション及びその３日後
の細胞のスプリッティングにより示した。細胞の一部を直径3.5cmの皿に接種し
、その後にその日にアセトン／メタノールで固定し、BVDV特異性モノクローナル
抗体（Weilandら, 1989）の混合物による免疫蛍光により分析した。全ての細胞
が陽性とわかり、一方、非感染性RNAでトランスフェクトされた細胞の対照はシ
グナルを示さなかった。夫々のcRNAでトランスフェクトされた細胞の一部から、
抽出物を凍結及び解凍の１サイクルにより生成した。新しい細胞をこの細胞抽出
物で感染させ、感染３日後にBVDV特異性免疫蛍光によりBVDV陽性であると判明し
た。 表１は示されたウイルス突然変異体によりコードされるRNaseの推定活性部位
に相当するERNSの保存配列に導入された異なる変化を要約する。
の細胞のスプリッティングにより示した。細胞の一部を直径3.5cmの皿に接種し
、その後にその日にアセトン／メタノールで固定し、BVDV特異性モノクローナル
抗体（Weilandら, 1989）の混合物による免疫蛍光により分析した。全ての細胞
が陽性とわかり、一方、非感染性RNAでトランスフェクトされた細胞の対照はシ
グナルを示さなかった。夫々のcRNAでトランスフェクトされた細胞の一部から、
抽出物を凍結及び解凍の１サイクルにより生成した。新しい細胞をこの細胞抽出
物で感染させ、感染３日後にBVDV特異性免疫蛍光によりBVDV陽性であると判明し
た。 表１は示されたウイルス突然変異体によりコードされるRNaseの推定活性部位
に相当するERNSの保存配列に導入された異なる変化を要約する。
【００３３】
【表１】
【００３４】 表１の脚注：RNase活性に関する試験を一時的アッセイで行った。BHK21細胞をワ
クチンウイルスvTF7-3 (Fuerstら, 1986)で感染し、次いで夫々のcDNA構築物（
プラスミドDNA５μg、供給業者（キアゲン）により推奨されるようにスーパーフ
ェクトを使用するトランスフェクション）でトランスフェクトした。CO2インキ
ュベーター中の37℃で10時間のインキュベーション後に、トランスフェクトされ
た細胞を溶解し、以下に記載されるようなRNase活性の測定のために処理した。
生存度を以下に記載されるようにして測定した。
クチンウイルスvTF7-3 (Fuerstら, 1986)で感染し、次いで夫々のcDNA構築物（
プラスミドDNA５μg、供給業者（キアゲン）により推奨されるようにスーパーフ
ェクトを使用するトランスフェクション）でトランスフェクトした。CO2インキ
ュベーター中の37℃で10時間のインキュベーション後に、トランスフェクトされ
た細胞を溶解し、以下に記載されるようなRNase活性の測定のために処理した。
生存度を以下に記載されるようにして測定した。
【００３５】 実施例２ ERNSのRNase活性に関する異なる突然変異の効果 ERNSのRNase活性に関する異なる突然変異の効果を試験するために、適当な細
胞を突然変異体ウイルスで感染させた。CSFVについて、感染を0.01の感染多重度
(m.o.i.)で行った。野生型ウイルスによる感染が陽性対照として利用でき、一方
、非感染細胞を陰性対照として使用した。感染48時間後に、細胞を食塩加リン酸
緩衝液で２回洗浄し、溶解緩衝液（20 mM トリス/HCl; 100 mM NaCl、1 mM EDTA
、2mg/mlのウシ血清アルブミン；１％トリトンX100；0.1％デオキシコール酸；0
.1％ドデシル硫酸ナトリウム）0.4mll中で溶解した。溶解産物を1.5mlの反応管
に入れ、音波処理し（ブランソンソニファイアーB12、120ワット、カップホルン
水浴中で20秒）、遠心分離（５分間、14,000rpm、エッペンドルフ遠心分離機、
４℃）により透明にし、上澄みを超遠心分離（ベックマン卓上超遠心分離機、TL
A45ローター中で４℃で45,000rpmで60分間）にかけた。RNase活性の測定をRNase
アッセイ緩衝液（40 mM トリス-アセテート(pH 6.5)、0.5 mM EDTA、5 mM ジチ
オスレイトール(DTT)）中に第二遠心分離工程の上澄み５又は50μl及びポリ(rU)
（ファーマシア）80μgを含む合計200μlの容積で行った。37℃で１時間の反応
混合物のインキュベーション後に、200μlの1.2Mの過塩素酸、20 mM LaSO4を添
加した。氷の上の15分のインキュベーション後に、混合物をエッペンドルフ遠心
分離機中で４℃で14,000rpmで15分間遠心分離した。上澄みに、３倍容積の水を
添加し、ウルトラスペック3000スペクトロフォトメーター（ファーマシア）を使
用して光学密度を260nmで測定することにより混合物のアリコートを分析した。
全ての場合に、突然変異が完全に停止されたRNase活性をEms遺伝子に導入した（
表１）。
胞を突然変異体ウイルスで感染させた。CSFVについて、感染を0.01の感染多重度
(m.o.i.)で行った。野生型ウイルスによる感染が陽性対照として利用でき、一方
、非感染細胞を陰性対照として使用した。感染48時間後に、細胞を食塩加リン酸
緩衝液で２回洗浄し、溶解緩衝液（20 mM トリス/HCl; 100 mM NaCl、1 mM EDTA
、2mg/mlのウシ血清アルブミン；１％トリトンX100；0.1％デオキシコール酸；0
.1％ドデシル硫酸ナトリウム）0.4mll中で溶解した。溶解産物を1.5mlの反応管
に入れ、音波処理し（ブランソンソニファイアーB12、120ワット、カップホルン
水浴中で20秒）、遠心分離（５分間、14,000rpm、エッペンドルフ遠心分離機、
４℃）により透明にし、上澄みを超遠心分離（ベックマン卓上超遠心分離機、TL
A45ローター中で４℃で45,000rpmで60分間）にかけた。RNase活性の測定をRNase
アッセイ緩衝液（40 mM トリス-アセテート(pH 6.5)、0.5 mM EDTA、5 mM ジチ
オスレイトール(DTT)）中に第二遠心分離工程の上澄み５又は50μl及びポリ(rU)
（ファーマシア）80μgを含む合計200μlの容積で行った。37℃で１時間の反応
混合物のインキュベーション後に、200μlの1.2Mの過塩素酸、20 mM LaSO4を添
加した。氷の上の15分のインキュベーション後に、混合物をエッペンドルフ遠心
分離機中で４℃で14,000rpmで15分間遠心分離した。上澄みに、３倍容積の水を
添加し、ウルトラスペック3000スペクトロフォトメーター（ファーマシア）を使
用して光学密度を260nmで測定することにより混合物のアリコートを分析した。
全ての場合に、突然変異が完全に停止されたRNase活性をEms遺伝子に導入した（
表１）。
【００３６】 BVDV突然変異体について、回収ウイルスの継代を使用しないRNAトランスフェ
クション後に得られた物質でRNase活性を試験した。適当なRNAでトランスフェク
トされた細胞をトランスフェクション72時間後にスプリットし、二つの皿に接種
した。24時間後に、一つの皿から、細胞抽出物を調製し、上記のようにRNase活
性について分析した。感染を証明するために、第二の皿の細胞をBVDV特異性モノ
クローナル抗体（Weilandら, 1989）で免疫蛍光により分析し、100％陽性とわか
った。トランスフェクションをpA/BVDV/Ins-またpA/B-346-d、CSFVアルフォート
ゲノム中のコドン346に均等のコドンの欠失を含む以外はpA/BVDV/Ins-に均等の
プラスミドから転写されたRNAを用いて行った。トランスフェクトされなかったM
DBK細胞が陰性対照として利用できた。
クション後に得られた物質でRNase活性を試験した。適当なRNAでトランスフェク
トされた細胞をトランスフェクション72時間後にスプリットし、二つの皿に接種
した。24時間後に、一つの皿から、細胞抽出物を調製し、上記のようにRNase活
性について分析した。感染を証明するために、第二の皿の細胞をBVDV特異性モノ
クローナル抗体（Weilandら, 1989）で免疫蛍光により分析し、100％陽性とわか
った。トランスフェクションをpA/BVDV/Ins-またpA/B-346-d、CSFVアルフォート
ゲノム中のコドン346に均等のコドンの欠失を含む以外はpA/BVDV/Ins-に均等の
プラスミドから転写されたRNAを用いて行った。トランスフェクトされなかったM
DBK細胞が陰性対照として利用できた。
【００３７】
【表２】
【００３８】 表2Aの説明： PK15細胞を0.01のm.o.i.（感染多重度）で示されたウイルスで感染させ、CO2
インキュベーター中で37℃で48時間インキュベートし、次いで溶解し、RNase試
験にかけた。異なる細胞抽出物とのインキュベーションから生じる酸可溶性RNA
を260nmで光学密度を測定することにより定量した。RNase活性の観察された相違
はサンプル中のERNSタンパク質の異なる量のためではなかった。何とならば、同
様の値が放射性標識、免疫沈澱及びホスホルイメージャーによる放射能の分析に
よるERNSの定量後に得られたからである。更に、通常の量のわずかに1/10へのア
ッセイ中のEms濃度の低下は得られるOD値をかなり変化せず、選ばれた条件では
アッセイがEmsで飽和されることを示した。 CSFV株アルフォート；全てのその他のウイルスをプラスミドからinvitro転写
されたRNAから回収した：例えば、C-WTをpA/CSFVから；C-297-LをpA/C-297-Lか
ら回収した；以下、同様。C-346-d/RsウイルスをpA/C-346-d/Rs（pA/CSFVから誘
導された均等断片に対する夫々のcDNA断片の交換によりpA/C-346-d中の突然変異
の反転により生成した）から回収した。対照：感染されなかったPK15細胞の抽出
物。
インキュベーター中で37℃で48時間インキュベートし、次いで溶解し、RNase試
験にかけた。異なる細胞抽出物とのインキュベーションから生じる酸可溶性RNA
を260nmで光学密度を測定することにより定量した。RNase活性の観察された相違
はサンプル中のERNSタンパク質の異なる量のためではなかった。何とならば、同
様の値が放射性標識、免疫沈澱及びホスホルイメージャーによる放射能の分析に
よるERNSの定量後に得られたからである。更に、通常の量のわずかに1/10へのア
ッセイ中のEms濃度の低下は得られるOD値をかなり変化せず、選ばれた条件では
アッセイがEmsで飽和されることを示した。 CSFV株アルフォート；全てのその他のウイルスをプラスミドからinvitro転写
されたRNAから回収した：例えば、C-WTをpA/CSFVから；C-297-LをpA/C-297-Lか
ら回収した；以下、同様。C-346-d/RsウイルスをpA/C-346-d/Rs（pA/CSFVから誘
導された均等断片に対する夫々のcDNA断片の交換によりpA/C-346-d中の突然変異
の反転により生成した）から回収した。対照：感染されなかったPK15細胞の抽出
物。
【００３９】
【表３】
【００４０】 表2Bの説明 MDBK細胞をin vitro転写RNAで感染させ、トランスフェクション72時間後にス
プリットし、24時間後にRNase活性について分析した。細胞の感染が明細書に記
載された免疫蛍光分析により判明された。 B-WT：pA/BVDV/Ins-から回収されたウイルス；B-346-d：pA/B-346-dから回収さ
れたウイルス；対照：感染されなかったMDBK細胞からの抽出物。
プリットし、24時間後にRNase活性について分析した。細胞の感染が明細書に記
載された免疫蛍光分析により判明された。 B-WT：pA/BVDV/Ins-から回収されたウイルス；B-346-d：pA/B-346-dから回収さ
れたウイルス；対照：感染されなかったMDBK細胞からの抽出物。
【００４１】 実施例３ RNase不活性化後のCSFVの細胞変性 RNase活性の分解がそれらの天然宿主中のペスチウイルスの細胞変性に影響す
るか否かを試験するために、動物実験を突然変異体V(pA/C-346-d)（表中のC346-
d）で行った。突然変異を含まないCSFV完全長クローンから回収されたウイルス
（V(pA/CSFV)）が陽性対照として利用できた（表中のC-WT）。夫々の突然変異体
について、３匹の子ブタ（品種：ゲルマン・ランドレース；体重約25kg）を使用
した。感染用量は動物当り1x105 TCID50であった。接種物の2/3を鼻内投与し（1
/3を夫々の鼻孔に）、1/3を筋肉内に投与した。二つのグループを別々の分離ユ
ニット中に収容した。血液を感染前及び３日、５日、７日、10日、12日及び14日
に動物から２回採取した。加えて、体温を毎日記録した（図２）。野生型ウイル
スで感染された動物は発熱、運動失調、拒食症、下痢、中枢神経障害、皮膚中の
出血のような古典的なブタ熱病の典型的な症候を示した（表3a）。ウイルスを３
日目（動物#68）及び５日目、７日目、10日目、14日目（動物#68、#78、#121）
に血液から回収することができた（表3b）。動物を感染後14日目に瀕死段階で殺
した。この時点では、ウイルス中和抗体を検出することができなかった。対照的
に、突然変異体で感染された動物は臨床症候を発生しなかった（表3a）。体温は
全実験期間にわたって正常に留まり（図２）、動物は食事をとることを停止しな
かった。いずれの時点でも、ウイルスを血液から回収することができなかった。
それにもかかわらず、動物は明らかに感染されており、ウイルスがおそらく複製
した。何とならば、全ての動物が中和抗体を発生したからである（表3c）。
るか否かを試験するために、動物実験を突然変異体V(pA/C-346-d)（表中のC346-
d）で行った。突然変異を含まないCSFV完全長クローンから回収されたウイルス
（V(pA/CSFV)）が陽性対照として利用できた（表中のC-WT）。夫々の突然変異体
について、３匹の子ブタ（品種：ゲルマン・ランドレース；体重約25kg）を使用
した。感染用量は動物当り1x105 TCID50であった。接種物の2/3を鼻内投与し（1
/3を夫々の鼻孔に）、1/3を筋肉内に投与した。二つのグループを別々の分離ユ
ニット中に収容した。血液を感染前及び３日、５日、７日、10日、12日及び14日
に動物から２回採取した。加えて、体温を毎日記録した（図２）。野生型ウイル
スで感染された動物は発熱、運動失調、拒食症、下痢、中枢神経障害、皮膚中の
出血のような古典的なブタ熱病の典型的な症候を示した（表3a）。ウイルスを３
日目（動物#68）及び５日目、７日目、10日目、14日目（動物#68、#78、#121）
に血液から回収することができた（表3b）。動物を感染後14日目に瀕死段階で殺
した。この時点では、ウイルス中和抗体を検出することができなかった。対照的
に、突然変異体で感染された動物は臨床症候を発生しなかった（表3a）。体温は
全実験期間にわたって正常に留まり（図２）、動物は食事をとることを停止しな
かった。いずれの時点でも、ウイルスを血液から回収することができなかった。
それにもかかわらず、動物は明らかに感染されており、ウイルスがおそらく複製
した。何とならば、全ての動物が中和抗体を発生したからである（表3c）。
【００４２】
【表４】
【００４３】 表3aの説明 二つのグループ（夫々のグループを別々に収容した）中の６匹の子ブタ（ゲル
マン・ランドレース；体重約25kg）をその研究に入れた。３匹の動物をCSFV-WT
（1-105 TCID50）で感染させ、３匹の動物をC-346-d (1x105 TCID50)で感染させ
た。直腸温度及び臨床症候を記録し、表に詳しく要約した。n.a.：検死を行わな
かった。
マン・ランドレース；体重約25kg）をその研究に入れた。３匹の動物をCSFV-WT
（1-105 TCID50）で感染させ、３匹の動物をC-346-d (1x105 TCID50)で感染させ
た。直腸温度及び臨床症候を記録し、表に詳しく要約した。n.a.：検死を行わな
かった。
【００４４】
【表５】
【００４５】 表3bの説明 血液細胞ウイルス血症をPK15細胞と一緒の血液の同時培養により検出した。37
℃で72時間のインキュベーション後に、細胞をPBSで洗浄し、氷冷アセトン／メ
タノールで固定し、糖タンパク質E2に特異性のモノクローナル抗体(mAb A18、We
ilandら, 1990)による免疫蛍光により感染について分析した。
℃で72時間のインキュベーション後に、細胞をPBSで洗浄し、氷冷アセトン／メ
タノールで固定し、糖タンパク質E2に特異性のモノクローナル抗体(mAb A18、We
ilandら, 1990)による免疫蛍光により感染について分析した。
【００４６】
【表６】
【００４７】 表3cの説明 動物実験中の異なる時点で測定されたウイルス突然変異体C-346-dで感染され
たブタの抗体力価： 希釈した血清50μlを30 TCID50のウイルス（CSFVアルフォート／ツビンゲン）
を含む培地50μlと混合した。37℃で90分間のインキュベーション後に、細胞100
μl（1.5x104細胞）を添加し、混合物を96ウェルプレートに接種した。72時間後
に、細胞を氷冷アセトン／メタノールで固定し、糖タンパク質E2に特異性のモノ
クローナル抗体(mAb A18、Weilandら, 1990)による免疫蛍光により感染について
分析した。感染後の69日目に、動物に2x105 TCID50のCSFV株エイストラップを抗
原投与した。表は投入ウイルスの完全中和をもたらす最高血清希釈を示す。
たブタの抗体力価： 希釈した血清50μlを30 TCID50のウイルス（CSFVアルフォート／ツビンゲン）
を含む培地50μlと混合した。37℃で90分間のインキュベーション後に、細胞100
μl（1.5x104細胞）を添加し、混合物を96ウェルプレートに接種した。72時間後
に、細胞を氷冷アセトン／メタノールで固定し、糖タンパク質E2に特異性のモノ
クローナル抗体(mAb A18、Weilandら, 1990)による免疫蛍光により感染について
分析した。感染後の69日目に、動物に2x105 TCID50のCSFV株エイストラップを抗
原投与した。表は投入ウイルスの完全中和をもたらす最高血清希釈を示す。
【００４８】 実施例４ RNase陰性ウイルスによる感染による保護免疫の誘導 突然変異体ウイルスによる感染が保護免疫をもたらしたか否かを分析するため
に、抗原投与実験をCSFV突然変異体による感染の約９週後に高度に細胞変性の異
種CSFV株（株エイストラップ、ベーリングから得られた）を使用して行った。2x
105 TCID50のウイルスを感染に使用した。この量のウイルスは幾つかの先行実験
（Konig, 1994）で致死性疾患を誘導するのに十分であることがわかった。しか
しながら、CSFV RNase突然変異体で既に感染された動物は抗原投与感染後に症候
を示さなかった。発熱（図３）又はウイルス血症のいずれもが検出できなかった
が、中和抗体の増加が増殖性感染及び抗原投与ウイルスの複製を示した。
に、抗原投与実験をCSFV突然変異体による感染の約９週後に高度に細胞変性の異
種CSFV株（株エイストラップ、ベーリングから得られた）を使用して行った。2x
105 TCID50のウイルスを感染に使用した。この量のウイルスは幾つかの先行実験
（Konig, 1994）で致死性疾患を誘導するのに十分であることがわかった。しか
しながら、CSFV RNase突然変異体で既に感染された動物は抗原投与感染後に症候
を示さなかった。発熱（図３）又はウイルス血症のいずれもが検出できなかった
が、中和抗体の増加が増殖性感染及び抗原投与ウイルスの複製を示した。
【００４９】 実施例５ 弱毒化原理の確認 突然変異体ウイルスの観察された弱毒化が実際にポリタンパク質の位置346の
ヒスチジンの欠失のためであり、同定されなかった第二部位突然変異の結果では
ないことを示すために、野生型配列を野生型配列を示すpA/CSFVの相当する断片
に対する完全長クローンpA/C-346-dの1.6kb XhoI/NdeI断片の交換により回復し
た。pA/C-346-dから切除された断片を突然変異についてヌクレオチド配列決定に
より分析した。ポリタンパク質のヒスチジン346をコードするトリプレットの欠
失を除いて、野生型配列に対する相違が見られなかった。救済された突然変異体
を含むcDNA構築物から、野生型ウイルスと同等に良く増殖し、均等のRNase活性
を示すウイルスV(pA/C-346-d/Rs)を回収することができた（表2A）。
ヒスチジンの欠失のためであり、同定されなかった第二部位突然変異の結果では
ないことを示すために、野生型配列を野生型配列を示すpA/CSFVの相当する断片
に対する完全長クローンpA/C-346-dの1.6kb XhoI/NdeI断片の交換により回復し
た。pA/C-346-dから切除された断片を突然変異についてヌクレオチド配列決定に
より分析した。ポリタンパク質のヒスチジン346をコードするトリプレットの欠
失を除いて、野生型配列に対する相違が見られなかった。救済された突然変異体
を含むcDNA構築物から、野生型ウイルスと同等に良く増殖し、均等のRNase活性
を示すウイルスV(pA/C-346-d/Rs)を回収することができた（表2A）。
【００５０】 第二動物実験では、救済されたウイルスをブタの感染に使用した。対照として
、欠失突然変異体を使用した。再度、３匹の動物からなる二つのグループを使用
した。動物が第一実験の動物よりも若かったので（ゲルマン・ランドレース、約
20kg）、5x104 TCID50のウイルスを今回感染に使用した。再度、突然変異体で感
染された動物は臨床症候を示さなかった（表５、図４）。１匹の動物のみが１日
目に発熱した。それにもかかわらず、これらの動物は中和抗体を発生し、致死性
CSFV抗原投与に対し保護された。再度、抗原投与を2x105 TCID50の抗原投与株エ
イストラップによる感染により行った。動物は抗原投与後に臨床症候を示さず、
体温が正常に留まった（図５）。欠失突然変異体で感染されたブタとは対照的に
、救済された野生型ウイルスで接種された動物は致死性の古典的なブタ熱病を発
生した。１匹の動物が感染の11日後に殺され、別の２匹がその３日後に殺された
。全ての動物が古典的なブタ熱病の典型的な症候、即ち、発熱、下痢、拒食症、
及び腎臓を含む異なる臓器中の出血のような病的兆候を示した。
、欠失突然変異体を使用した。再度、３匹の動物からなる二つのグループを使用
した。動物が第一実験の動物よりも若かったので（ゲルマン・ランドレース、約
20kg）、5x104 TCID50のウイルスを今回感染に使用した。再度、突然変異体で感
染された動物は臨床症候を示さなかった（表５、図４）。１匹の動物のみが１日
目に発熱した。それにもかかわらず、これらの動物は中和抗体を発生し、致死性
CSFV抗原投与に対し保護された。再度、抗原投与を2x105 TCID50の抗原投与株エ
イストラップによる感染により行った。動物は抗原投与後に臨床症候を示さず、
体温が正常に留まった（図５）。欠失突然変異体で感染されたブタとは対照的に
、救済された野生型ウイルスで接種された動物は致死性の古典的なブタ熱病を発
生した。１匹の動物が感染の11日後に殺され、別の２匹がその３日後に殺された
。全ての動物が古典的なブタ熱病の典型的な症候、即ち、発熱、下痢、拒食症、
及び腎臓を含む異なる臓器中の出血のような病的兆候を示した。
【００５１】
【表７】
【００５２】 表5aの説明 二つのグループ（夫々のグループが分離条件下で別々に収容された）中の６匹
の子ブタ（ゲルマン・ランドレース；体重約20kg）をその研究に入れた。３匹の
動物を突然変異体C-346-d (5-104 TCID50)で感染させ、３匹の動物をC-346-d/Rs
(5-104 TCID50)で感染させた。C-346-d/RSはERNS遺伝子の野生型配列を回復す
ることにより突然変異体C-346-dから誘導された。直腸温度及び症候を記録し、
要約した。n.a.：検死を行わなかった。
の子ブタ（ゲルマン・ランドレース；体重約20kg）をその研究に入れた。３匹の
動物を突然変異体C-346-d (5-104 TCID50)で感染させ、３匹の動物をC-346-d/Rs
(5-104 TCID50)で感染させた。C-346-d/RSはERNS遺伝子の野生型配列を回復す
ることにより突然変異体C-346-dから誘導された。直腸温度及び症候を記録し、
要約した。n.a.：検死を行わなかった。
【００５３】
【表８】
【００５４】 感染の５日後の動物３及び５並びに感染の７日後の動物実験#2（実施例５に記
載された）の動物27、28及び30の血液から回収したウイルスを組織培養で増殖さ
せ、滴定し、上記のようにRNase活性について試験した。感染されなかったPK15
細胞及び野生型CSFV（アルフォート）で感染された細胞（対照）が対照として利
用できた。動物３及び５は突然変異体C-297-Kで感染され、一方、動物27、28及
び30は表に示されたように突然変異体C-346-d/RSで感染された。
載された）の動物27、28及び30の血液から回収したウイルスを組織培養で増殖さ
せ、滴定し、上記のようにRNase活性について試験した。感染されなかったPK15
細胞及び野生型CSFV（アルフォート）で感染された細胞（対照）が対照として利
用できた。動物３及び５は突然変異体C-297-Kで感染され、一方、動物27、28及
び30は表に示されたように突然変異体C-346-d/RSで感染された。
【００５５】 実施例６ ERNS内の二重突然変異の効果 夫々のウイルスがその天然宿主中で複製する能力及び細胞変性に関するERNS内
の二重突然変異の効果を試験するために、動物実験を突然変異体V(pA/C-297-L/3
46-L)で行った。突然変異を含まないCSFV完全長クローンから回収されたウイル
ス（V(pA/CSFV)が陽性対照として利用できた。夫々の突然変異体について、３匹
の子ブタ（品種：ゲルマン・ランドレース；体重約25kg）を使用した。感染用量
は動物当り1x105 TCID50であった。接種物の2/3を鼻内に投与し（1/3を夫々の鼻
孔に）、1/3を筋肉内に投与した。血液を感染前（０日目）及び５日目、８日目
、12日目及び20日目に動物から採取した。加えて、体温を毎日記録した（図６）
。二重突然変異体で感染された動物は臨床症候を発生せず、動物は食事をとるこ
とを停止しなかった。動物はおそらく右後脚の外傷により生じた細菌感染症のた
めに８日目の動物45/1を除いて全実験期間にわたって発熱を示さなかった（動物
45/2及び45/3）。10日目の抗生物質によるこの動物の治療後に、体温が１日以内
に正常値に戻った（図６）。全ての動物について、ウイルスを５日目に血液から
回収し、ウイルス血症がその後の時点で検出されなかった（表6a）。全ての動物
が中和抗体を発生した（表6a）。動物45/1について、中和力価を約4.5ヶ月p.i.
で再度測定し、1:4374であることがわかった。こうして、二重突然変異体による
感染は長く持続している免疫記憶をもたらした。
の二重突然変異の効果を試験するために、動物実験を突然変異体V(pA/C-297-L/3
46-L)で行った。突然変異を含まないCSFV完全長クローンから回収されたウイル
ス（V(pA/CSFV)が陽性対照として利用できた。夫々の突然変異体について、３匹
の子ブタ（品種：ゲルマン・ランドレース；体重約25kg）を使用した。感染用量
は動物当り1x105 TCID50であった。接種物の2/3を鼻内に投与し（1/3を夫々の鼻
孔に）、1/3を筋肉内に投与した。血液を感染前（０日目）及び５日目、８日目
、12日目及び20日目に動物から採取した。加えて、体温を毎日記録した（図６）
。二重突然変異体で感染された動物は臨床症候を発生せず、動物は食事をとるこ
とを停止しなかった。動物はおそらく右後脚の外傷により生じた細菌感染症のた
めに８日目の動物45/1を除いて全実験期間にわたって発熱を示さなかった（動物
45/2及び45/3）。10日目の抗生物質によるこの動物の治療後に、体温が１日以内
に正常値に戻った（図６）。全ての動物について、ウイルスを５日目に血液から
回収し、ウイルス血症がその後の時点で検出されなかった（表6a）。全ての動物
が中和抗体を発生した（表6a）。動物45/1について、中和力価を約4.5ヶ月p.i.
で再度測定し、1:4374であることがわかった。こうして、二重突然変異体による
感染は長く持続している免疫記憶をもたらした。
【００５６】
【表９】
【００５７】
【表１０】
【００５８】 実施例７ BVDVウイルス“B-346-d”の免疫原性及び弱毒化原理 pA/B-346-dから回収されたBVDVウイルス、“B-346-d”の弱毒化原理並びに免
疫原性を調べるためにそれをpA/BVDV/Ins-から回収された“B-WT”ウイルスと比
較することにより調べるようにこの実験を設計した。ウイルス“B-346-d”は勿
論初期のBVDV位置349で突然変異されるが、図１のCSFVアルフォート位置346に対
する位置を示すために“B-346”と称される。 生後3-6ヶ月のBVDV血清反応陰性動物の三つのグループを選んだ。グループ１
及び２は夫々５匹の動物を含み、一方、グループ３は３匹の動物を含んだ。グル
ープ１及び２の動物を経路当り5mlの容積の2x106 TCID50のB-346-d（グループ１
）又はB-WT（グループ２）の投与により感染させた。動物を筋肉内（殿筋）、鼻
内そして皮下（肩甲骨の上）で感染させた。感染後の14日の期間にわたって、両
方のグループのウイルス血症を血液細胞ウイルス血症及び鼻スワブ中のウイルス
放出のようなパラメーターにより監視した。加えて、直腸温度、白血球カウント
及び全般の健康パラメーターのような臨床パラメーターを監視した。
疫原性を調べるためにそれをpA/BVDV/Ins-から回収された“B-WT”ウイルスと比
較することにより調べるようにこの実験を設計した。ウイルス“B-346-d”は勿
論初期のBVDV位置349で突然変異されるが、図１のCSFVアルフォート位置346に対
する位置を示すために“B-346”と称される。 生後3-6ヶ月のBVDV血清反応陰性動物の三つのグループを選んだ。グループ１
及び２は夫々５匹の動物を含み、一方、グループ３は３匹の動物を含んだ。グル
ープ１及び２の動物を経路当り5mlの容積の2x106 TCID50のB-346-d（グループ１
）又はB-WT（グループ２）の投与により感染させた。動物を筋肉内（殿筋）、鼻
内そして皮下（肩甲骨の上）で感染させた。感染後の14日の期間にわたって、両
方のグループのウイルス血症を血液細胞ウイルス血症及び鼻スワブ中のウイルス
放出のようなパラメーターにより監視した。加えて、直腸温度、白血球カウント
及び全般の健康パラメーターのような臨床パラメーターを監視した。
【００５９】 抗原異種かつ毒性のBVDV分離物(#13)による感染に対する保護免疫をB-346-dに
よるグループ１の動物の感染77日後の抗原投与感染により調べた。グループ３の
動物は抗原投与対照として利用でき、毒性BVDV分離物によるグループ１の動物に
ついての操作に従って感染された。BVDVウイルス(#13)は異なる抗原性グループ
（型II）に属し、一方、B-346-dウイルスはPellerin, C.ら, 1994により記載さ
れた分類に従って抗原性グループ（型Ｉ）に属する。グループ１及び３の動物は
経路当り5mlの容積で2x106 TCID50のBVDV分離物(#13)の投与により感染された。
動物を筋肉内（殿筋）、鼻内そして皮下（肩甲骨の上）で感染させた。感染後の
14日の期間にわたって、両方のグループのウイルス血症を血液細胞ウイルス血症
及び鼻スワブ中のウイルス放出のようなパラメーターにより監視した。加えて、
直腸温度、白血球カウント及び全般の健康パラメーターのような臨床パラメータ
ーを監視した。 B-346-dによる感染後に、動物はBVDV感染症の典型的な臨床症候、例えば、直
腸温度上昇（表7a）、又は呼吸器の臨床症候（示されていない）を示さなかった
。
よるグループ１の動物の感染77日後の抗原投与感染により調べた。グループ３の
動物は抗原投与対照として利用でき、毒性BVDV分離物によるグループ１の動物に
ついての操作に従って感染された。BVDVウイルス(#13)は異なる抗原性グループ
（型II）に属し、一方、B-346-dウイルスはPellerin, C.ら, 1994により記載さ
れた分類に従って抗原性グループ（型Ｉ）に属する。グループ１及び３の動物は
経路当り5mlの容積で2x106 TCID50のBVDV分離物(#13)の投与により感染された。
動物を筋肉内（殿筋）、鼻内そして皮下（肩甲骨の上）で感染させた。感染後の
14日の期間にわたって、両方のグループのウイルス血症を血液細胞ウイルス血症
及び鼻スワブ中のウイルス放出のようなパラメーターにより監視した。加えて、
直腸温度、白血球カウント及び全般の健康パラメーターのような臨床パラメータ
ーを監視した。 B-346-dによる感染後に、動物はBVDV感染症の典型的な臨床症候、例えば、直
腸温度上昇（表7a）、又は呼吸器の臨床症候（示されていない）を示さなかった
。
【００６０】 減少した血液細胞ウイルス血症（表7b）及び鼻スワブ中のウイルス放出（表7c
）はB-WTと較べてB-346-dの弱毒化を明らかに示した。 毒性BVDV分離物#13はグループ３の動物で数日の期間にわたる直腸温度上昇（
表7d）、強い白血球減少（表7e）、延長された血液細胞ウイルス血症（表7f）及
び鼻スワブ液中のウイルス放出（表7g）のようなBVDV感染症の典型的な症候で強
いウイルス血症を誘発した。対照的に、B-346-dによる感染によりワクチン注射
されたグループ１の動物は毒性BVDV分離物#13による抗原投与感染後にBVDV感染
症に典型的な臨床症候を殆ど示さなかった。感染後に直腸温度の有意な上昇がな
かった（表7d）。観察された白血球減少は大きさ及び期間に関して非常に限界に
近かった（表7e）。BVDVが血液から分離できず（表7f）、唯一の動物について鼻
スワブ滲出液中のウイルス放出が検出できた（表7g）。 それ故、B-346-dによる感染は異種BVDV分離物による抗原投与感染後に臨床症
候、ウイルス放出及び血液細胞ウイルス血症を明らかに減少する強い免疫を誘発
する。
）はB-WTと較べてB-346-dの弱毒化を明らかに示した。 毒性BVDV分離物#13はグループ３の動物で数日の期間にわたる直腸温度上昇（
表7d）、強い白血球減少（表7e）、延長された血液細胞ウイルス血症（表7f）及
び鼻スワブ液中のウイルス放出（表7g）のようなBVDV感染症の典型的な症候で強
いウイルス血症を誘発した。対照的に、B-346-dによる感染によりワクチン注射
されたグループ１の動物は毒性BVDV分離物#13による抗原投与感染後にBVDV感染
症に典型的な臨床症候を殆ど示さなかった。感染後に直腸温度の有意な上昇がな
かった（表7d）。観察された白血球減少は大きさ及び期間に関して非常に限界に
近かった（表7e）。BVDVが血液から分離できず（表7f）、唯一の動物について鼻
スワブ滲出液中のウイルス放出が検出できた（表7g）。 それ故、B-346-dによる感染は異種BVDV分離物による抗原投与感染後に臨床症
候、ウイルス放出及び血液細胞ウイルス血症を明らかに減少する強い免疫を誘発
する。
【００６１】
【表１１】
【００６２】 グループ１の動物を０日目に6x106 TCID50のB-346-dで感染させ、一方、グル
ープ２の動物を6x106 TCID50のB-WTで感染させた。
ープ２の動物を6x106 TCID50のB-WTで感染させた。
【００６３】
【表１２】
【００６４】 EDTA血液をB-346-d及びB-WTによる夫々の感染10日後まで毎日サンプリングし
た。血液0.2mlをヘパリン（凝固を防止するために１単位/ml）を含む培地ととも
にウシ睾丸(Cte)細胞の３種の培養液の夫々に添加した。一夜のインキュベーシ
ョン後に、接種物／培地をヘパリンを含まない新しい培地と交換した。4-6日の
インキュベーション後に、BVDV細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による
免疫蛍光により検出した。 陰性培養物を凍結し、続いて解凍した。その0.2mlをCte細胞で第二継代で継代
してBVDVの不在を確かめた。
た。血液0.2mlをヘパリン（凝固を防止するために１単位/ml）を含む培地ととも
にウシ睾丸(Cte)細胞の３種の培養液の夫々に添加した。一夜のインキュベーシ
ョン後に、接種物／培地をヘパリンを含まない新しい培地と交換した。4-6日の
インキュベーション後に、BVDV細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による
免疫蛍光により検出した。 陰性培養物を凍結し、続いて解凍した。その0.2mlをCte細胞で第二継代で継代
してBVDVの不在を確かめた。
【００６５】
【表１３】
【００６６】 鼻滲出液を遠心分離(1000g)してグロスデブリ及び汚染物を除去した。上澄み
液を除去し、0.2mlを３種の細胞培養物の夫々に接種した。一夜のインキュベー
ション後に、接種物／培地を新しい培地2mlと交換した。4-6日のインキュベーシ
ョン後に、BVDV感染細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による免疫蛍光に
より検出した。
液を除去し、0.2mlを３種の細胞培養物の夫々に接種した。一夜のインキュベー
ション後に、接種物／培地を新しい培地2mlと交換した。4-6日のインキュベーシ
ョン後に、BVDV感染細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による免疫蛍光に
より検出した。
【００６７】
【表１４】
【００６８】 直腸温度を抗原投与感染の16日後まで記録した。グループ１及び３の動物を6x
106 TCID50の毒性BVDV分離物#13により感染させた。
106 TCID50の毒性BVDV分離物#13により感染させた。
【００６９】
【表１５】
【００７０】 EDTA血液細胞サンプルを両方のグループの夫々の動物から抗原投与後の２日目
から14日目まで毎日採取した。シスメックス・ミクロ−セル・カウンターF800を
使用して、EDTA血液サンプル中の白血球のカウントを測定した。
から14日目まで毎日採取した。シスメックス・ミクロ−セル・カウンターF800を
使用して、EDTA血液サンプル中の白血球のカウントを測定した。
【００７１】
【表１６】
【００７２】 EDTA血液を抗原投与後の10日目まで毎日サンプリングした。血液0.2mlをヘパ
リン（凝固を防止するために１単位/ml）を含む培地とともにウシ睾丸(Cte)細胞
の３種の培養液の夫々に添加した。一夜のインキュベーション後に、接種物／培
地をヘパリンを含まない新しい培地と交換した。4-6日のインキュベーション後
に、BVDV感染細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による免疫蛍光により検
出した。 陰性培養物を凍結し、続いて解凍した。その0.2mlをCte細胞で第二継代で継代
してBVDVの不在を確かめた。
リン（凝固を防止するために１単位/ml）を含む培地とともにウシ睾丸(Cte)細胞
の３種の培養液の夫々に添加した。一夜のインキュベーション後に、接種物／培
地をヘパリンを含まない新しい培地と交換した。4-6日のインキュベーション後
に、BVDV感染細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による免疫蛍光により検
出した。 陰性培養物を凍結し、続いて解凍した。その0.2mlをCte細胞で第二継代で継代
してBVDVの不在を確かめた。
【００７３】
【表１７】
【００７４】 鼻滲出液を遠心分離(1000g)してグロスデブリ及び汚染物を除去した。上澄み
液を除去し、その0.2mlを３種の細胞培養物の夫々に接種した。一夜のインキュ
ベーション後に、接種物／培地を新しい培地2mlと交換した。4-6日のインキュベ
ーション後に、BVDV感染細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による免疫蛍
光により検出した。
液を除去し、その0.2mlを３種の細胞培養物の夫々に接種した。一夜のインキュ
ベーション後に、接種物／培地を新しい培地2mlと交換した。4-6日のインキュベ
ーション後に、BVDV感染細胞をBVDVに特異性のポリクローナル血清による免疫蛍
光により検出した。
【００７５】 実施例８ RT-PCRによるC-346-dとヒスチジンコドン346の欠失を含まないCSFVの
識別 CSFV糖タンパク質ERNS中の保存RNaseモチーフをコードするRNA配列が高度に保
存される。全ての既知のCSFV配列の中で、ヌクレオチド交換がCSFVアルフォート
株の公表された配列（Meyersら, 1987）の残基1387-1416に相当する領域で見ら
れなかった。こうして、ゲノムのこの保存領域から誘導されたオリゴヌクレオチ
ドプライマーを全てのCSFV分離物の検出のためにRT-PCRアッセイに使用すること
ができる（図７を参照のこと）。従って、ヒスチジン346をコードするトリプレ
ット（ヌクレオチド1399-1401）の不在を適当に設計したプライマーによるRT-PC
Rアッセイにより検出することができた。保存領域をカバーする異なるオリゴヌ
クレオチド（ヒスチジンコドンを含み、又は含まない）を合成した。これらのオ
リゴヌクレオチドを下流プライマーとしてのオリゴヌクレオチドENRS-Stopとと
もにRT-PCR反応に上流プライマーとして利用できた。夫々C-346-d、C-WT、C-346
-L又はC-346-Kで感染された組織培養細胞から精製されたRNAを鋳型として使用し
た。熱変性RNA（30pモルの逆プライマーの存在下で水1.5μl中で92℃で２分間、
氷の上で５分間）２μgの逆転写を８μlのRTミックス（125 mM トリス/HCl pH8.
3、182.5 mM KCl、7.5 mM MgCl2、25 mM ジスレイトール、1.25 mMの夫々のdATP
、dTTP、dCTP、dGTP）、15UのRNAガード（ファーマシア、フライブルグ、ドイツ
）及び50Uのスーパースクリプト（ライフ・テクノロジーズ/BRL、エッゲンシュ
タイン、ドイツ）の添加後に45分間にわたって37℃で行った。逆転写を終了した
後、管を氷の上に置き、30μlのPCRミックス（8.3 mM トリス/HCl、pH8.3; 33.3
mM KCl; 2.2 mM MgCl2; 0.42 mMの夫々のdATP、dTTP、dCTP、dGTP；0.17％トリ
トンX100；0.03％ウシ血清アルブミン；5UのTaqポリメラーゼ（アプリゲン、ハ
イデルブルグ、ドイツ）及び16.7％DMSO）を添加した。プライマーOI H+3を使用
した場合、増幅のための反応ミックスはDMSOを含まなかった。増幅を36サイクル
（30秒94℃；30秒57℃；45秒74℃）で行った。増幅反応液１μlを１％アガロー
スゲルに装填し、増幅産物を電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した
。図７に示されるように、プライマー対OI H-3/OI EmsStopはコドン346の欠失を
含むRNAから誘導されたバンドを特異的に増幅することを可能にし、一方、その
他の二つのプライマー組み合わせでは、コドン346を含む産物が増幅され、この
コドンの欠失を含むRNAが鋳型として使用された場合、バンドが観察されなかっ
た。
識別 CSFV糖タンパク質ERNS中の保存RNaseモチーフをコードするRNA配列が高度に保
存される。全ての既知のCSFV配列の中で、ヌクレオチド交換がCSFVアルフォート
株の公表された配列（Meyersら, 1987）の残基1387-1416に相当する領域で見ら
れなかった。こうして、ゲノムのこの保存領域から誘導されたオリゴヌクレオチ
ドプライマーを全てのCSFV分離物の検出のためにRT-PCRアッセイに使用すること
ができる（図７を参照のこと）。従って、ヒスチジン346をコードするトリプレ
ット（ヌクレオチド1399-1401）の不在を適当に設計したプライマーによるRT-PC
Rアッセイにより検出することができた。保存領域をカバーする異なるオリゴヌ
クレオチド（ヒスチジンコドンを含み、又は含まない）を合成した。これらのオ
リゴヌクレオチドを下流プライマーとしてのオリゴヌクレオチドENRS-Stopとと
もにRT-PCR反応に上流プライマーとして利用できた。夫々C-346-d、C-WT、C-346
-L又はC-346-Kで感染された組織培養細胞から精製されたRNAを鋳型として使用し
た。熱変性RNA（30pモルの逆プライマーの存在下で水1.5μl中で92℃で２分間、
氷の上で５分間）２μgの逆転写を８μlのRTミックス（125 mM トリス/HCl pH8.
3、182.5 mM KCl、7.5 mM MgCl2、25 mM ジスレイトール、1.25 mMの夫々のdATP
、dTTP、dCTP、dGTP）、15UのRNAガード（ファーマシア、フライブルグ、ドイツ
）及び50Uのスーパースクリプト（ライフ・テクノロジーズ/BRL、エッゲンシュ
タイン、ドイツ）の添加後に45分間にわたって37℃で行った。逆転写を終了した
後、管を氷の上に置き、30μlのPCRミックス（8.3 mM トリス/HCl、pH8.3; 33.3
mM KCl; 2.2 mM MgCl2; 0.42 mMの夫々のdATP、dTTP、dCTP、dGTP；0.17％トリ
トンX100；0.03％ウシ血清アルブミン；5UのTaqポリメラーゼ（アプリゲン、ハ
イデルブルグ、ドイツ）及び16.7％DMSO）を添加した。プライマーOI H+3を使用
した場合、増幅のための反応ミックスはDMSOを含まなかった。増幅を36サイクル
（30秒94℃；30秒57℃；45秒74℃）で行った。増幅反応液１μlを１％アガロー
スゲルに装填し、増幅産物を電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した
。図７に示されるように、プライマー対OI H-3/OI EmsStopはコドン346の欠失を
含むRNAから誘導されたバンドを特異的に増幅することを可能にし、一方、その
他の二つのプライマー組み合わせでは、コドン346を含む産物が増幅され、この
コドンの欠失を含むRNAが鋳型として使用された場合、バンドが観察されなかっ
た。
【００７６】 RT-PCR用のプライマー 上流： Ol H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT Ol H+2: TGGAACAAACATGGATGG Ol H+3: GAATGGAACAAACATGGA 下流： Ol ErnsStop: GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG
【図１】 CSFVのアルフォート株により発現された最初の495アミノ酸。配列表はCSFVの
アルフォート株により発現された最初の495アミノ酸を示す（Meyersら, 1989）
。前記株の糖タンパク質ERNSの一つのモノマーはRumenapfら(1993)により記載さ
れたアミノ酸268-494に相当する。植物及び菌類のRNase (Schneiderら, 1993)に
相同性を示す領域に相当する残基295-307及び338-357が下線を施されている。
アルフォート株により発現された最初の495アミノ酸を示す（Meyersら, 1989）
。前記株の糖タンパク質ERNSの一つのモノマーはRumenapfら(1993)により記載さ
れたアミノ酸268-494に相当する。植物及び菌類のRNase (Schneiderら, 1993)に
相同性を示す領域に相当する残基295-307及び338-357が下線を施されている。
【図２】 試験感染後の動物の直腸温度曲線。毎日の直腸温度を感染後の２日目から18日
目まで記録した。直腸温度曲線がプラスミドpA/CSFVから誘導されたウイルスV(p
A/CSFV)(連続線)又はプラスミドpA/C-346-dから誘導されたウイルスV(pA/C-346-
d)(点線)で感染されたグループの夫々の動物について詳細に示される。
目まで記録した。直腸温度曲線がプラスミドpA/CSFVから誘導されたウイルスV(p
A/CSFV)(連続線)又はプラスミドpA/C-346-dから誘導されたウイルスV(pA/C-346-
d)(点線)で感染されたグループの夫々の動物について詳細に示される。
【図３】 抗原投与感染後の動物の直腸温度曲線。毎日の直腸温度を抗原投与ウイルス感
染後の1-21日目に記録した。致死用量のCSFV抗原投与株エイストラップで抗原投
与された動物は明細書に詳述されたように69日前に突然変異体C-346-d〔V(pA/C-
346-d)〕で感染されていた。直腸温度曲線がCSFV抗原投与株エイストラップから
2x105 TCID50で抗原投与されたグループの夫々の動物について詳しく示される。
染後の1-21日目に記録した。致死用量のCSFV抗原投与株エイストラップで抗原投
与された動物は明細書に詳述されたように69日前に突然変異体C-346-d〔V(pA/C-
346-d)〕で感染されていた。直腸温度曲線がCSFV抗原投与株エイストラップから
2x105 TCID50で抗原投与されたグループの夫々の動物について詳しく示される。
【図４】 試験感染後の動物の直腸温度曲線。毎日の直腸温度を感染後の0-18日目に記
録した。直腸温度曲線がC-346-d〔V(pA/C-346-d)〕(点線)又は回復されたウイル
スC-346-d/RS〔V(pA/C-346-dRS)〕（連続線）で感染された二つのグループの夫
々の動物について詳細に示される。
録した。直腸温度曲線がC-346-d〔V(pA/C-346-d)〕(点線)又は回復されたウイル
スC-346-d/RS〔V(pA/C-346-dRS)〕（連続線）で感染された二つのグループの夫
々の動物について詳細に示される。
【図５】 抗原投与感染動物実験#2後の直腸温度。毎日の直腸温度を抗原投与ウイルス感
染後の1-10日目に記録した。致死用量(2x105 TCID50)のCSFV抗原投与株エイスト
ラップで抗原投与された動物は37日前に突然変異体C-346-dで感染されていた。
染後の1-10日目に記録した。致死用量(2x105 TCID50)のCSFV抗原投与株エイスト
ラップで抗原投与された動物は37日前に突然変異体C-346-dで感染されていた。
【図６】 実施例６に記載の二重突然変異体で治療された動物の直腸温度。毎日の直腸温
度が突然変異体V(pA/C-297-L/346-L)による抗原投与ウイルス感染の前後に記録
された。
度が突然変異体V(pA/C-297-L/346-L)による抗原投与ウイルス感染の前後に記録
された。
【図７】 実施例８に記載のRT-PCRによるC-346-dとヒスチジンコドン346の欠失を含まな
いCSFVの識別。 a)プライマー対OI H-3/OI EmpStopは実施例８に詳しく記載されたようにコドン3
46の欠失を含むRNA（C-346-d）から誘導されたバンドを特異的に増幅することを
可能にする。対照的に、前記欠失を含まないRNAは前記プライマー対と相互作用
しない（C-WT、C-346-L、C-346-K）。 b)及びc)その他の二つのプライマー組み合わせ（OI H+2及びOI H+3）はコドン34
6の欠失を含まないRNAから誘導されたバンドを増幅する（OI H+2及びOI H+3）。
346欠失突然変異体C-346-dから誘導されたRNAが鋳型として使用される場合、バ
ンドを観察することができない。
いCSFVの識別。 a)プライマー対OI H-3/OI EmpStopは実施例８に詳しく記載されたようにコドン3
46の欠失を含むRNA（C-346-d）から誘導されたバンドを特異的に増幅することを
可能にする。対照的に、前記欠失を含まないRNAは前記プライマー対と相互作用
しない（C-WT、C-346-L、C-346-K）。 b)及びc)その他の二つのプライマー組み合わせ（OI H+2及びOI H+3）はコドン34
6の欠失を含まないRNAから誘導されたバンドを増幅する（OI H+2及びOI H+3）。
346欠失突然変異体C-346-dから誘導されたRNAが鋳型として使用される場合、バ
ンドを観察することができない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｃ０８５ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 BA11 BA80 CA04 CA09 CA11 CA20 DA02 GA11 GA25 HA17 4B050 CC04 DD01 GG01 LL01 4B063 QA13 QA17 QA19 QA20 QQ02 QQ34 QQ43 QQ53 QQ79 QR08 QR32 QR39 QR48 QR56 QR62 QS16 QS25 QS33 QS34 QS39 QX02 QX10 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA01 BA16 CA45 4C084 AA13 NA14 ZB332 ZC612 4C085 AA03 BA61 DD01 DD04 DD06 DD62 EE01
Claims (52)
- 【請求項１】 糖タンパク質ERNSにあるRNaseが不活性化されているペスチ
ウイルスを含むことを特徴とする生ワクチン。 - 【請求項２】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミ
ノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化されている請求の範囲第１項記載
のワクチン。 - 【請求項３】 前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置295-
307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載
された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される請
求の範囲第２項記載のワクチン。 - 【請求項４】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCS
FVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当
する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている請求の範囲
第1項〜第３項のいずれか一項記載のワクチン。 - 【請求項５】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCS
FVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他のBVDV株中のそれに
相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されている請求の範囲第
1項〜第４項のいずれか一項記載のワクチン。 - 【請求項６】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCS
FVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他のBVDV株中のそれに
相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されている請求の範囲第
1項〜第５項のいずれか一項記載のワクチン。 - 【請求項７】 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性が前記糖タンパク質の少
なくとも一つのアミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化されており、
但し、前記糖タンパク質の位置297及び／又は346（例示様式でCSFVアルフォート
株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のア
ミノ酸がリシンではないことを条件とすることを特徴とするペスチウイルス。 - 【請求項８】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又は
位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置又
はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される欠失及び／又は
突然変異により不活性化されている請求の範囲第７項記載のペスチウイルス。 - 【請求項９】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式でCS
FVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相当
する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている請求の範囲
第７項又は第８項記載のペスチウイルス。 - 【請求項１０】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されている請求の範囲第７
項〜第９項のいずれか一項記載のペスチウイルス。 - 【請求項１１】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他のBVDV株中のそれ
に相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されている請求の範囲
第７項〜第１０項のいずれか一項記載のBVDVペスチウイルス。 - 【請求項１２】 糖タンパク質ERNSをコードする核酸であって、前記糖タン
パク質にあるRNase活性が前記糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ酸の欠失
及び／又は突然変異により不活性化されており、但し、前記糖タンパク質の位置
297及び／又は346（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位
置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸がリシンではないことを
条件とすることを特徴とする核酸。 - 【請求項１３】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置295-307及び／又
は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記載された位置
又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される欠失及び／又
は突然変異により不活性化されている請求の範囲第１２項記載の核酸。 - 【請求項１４】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化されている請求の範
囲第１２項又は第１３項記載の核酸。 - 【請求項１５】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式で CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相 当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されている請求の範囲第１ ２項〜第１４項のいずれか一項記載の核酸。
- 【請求項１６】 前記RNase活性が前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他のBVDV株中のそれ
に相当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化されている請求の範囲
第１２項〜第１５項のいずれか一項記載のBVDV核酸。 - 【請求項１７】 ヌクレオチドワクチン及び／又はベクターワクチンを調製
するための請求の範囲第１２項〜第１６項のいずれか一項記載の核酸の使用。 - 【請求項１８】 請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項記載のワクチン
、及び／又は請求の範囲第７項〜第１１項のいずれか一項記載のペスチウイルス
、及び／又は請求の範囲第１２項〜第１６項のいずれか一項記載のヌクレオチド
配列を含むことを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項１９】 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを
特徴とするペスチウイルスの弱毒化方法。 - 【請求項２０】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのア
ミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する請求の範囲第１９項記載の
方法。 - 【請求項２１】 前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置29
5-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記
載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される
請求の範囲第１９項又は第２０項記載の方法。 - 【請求項２２】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化する請求の範囲第１
９項〜第２１項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２３】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化する請求の範囲第１９項〜
第２２項のいずれか一項記載の核酸。 - 【請求項２４】 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを 特徴とする特異的に弱毒化されたワクチンの生産方法。
- 【請求項２５】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのア
ミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する請求の範囲第２４項記載の
方法。 - 【請求項２６】 前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置29
5-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記
載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される
請求の範囲第２４項又は第２５項記載の方法。 - 【請求項２７】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化する請求の範囲第２
４項〜第２６項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２８】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化する請求の範囲第２４項〜
第２７項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２９】 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを 特徴とするペスチウイルスを検出可能に標識する方法。
- 【請求項３０】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのア
ミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する請求の範囲第２９項記載の
方法。 - 【請求項３１】 前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置29
5-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記
載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される
請求の範囲第２９項又は第３０項記載の方法。 - 【請求項３２】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化する請求の範囲第２
９項〜第３１項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項３３】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化する請求の範囲第２９項〜
第３２項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項３４】 請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項記載のワクチン 又は請求の範囲第１８項記載の医薬組成物をペスチウイルス感染症の予防又は治 療を要する動物に適用することを特徴とする動物のペスチウイルス感染症の予防 方法及び治療方法。
- 【請求項３５】 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを
特徴とする特異的に弱毒化されたペスチウイルスの調製方法。 - 【請求項３６】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのア
ミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する請求の範囲第３５項記載の
方法。 - 【請求項３７】 前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置29
5-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記
載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される
請求の範囲第３５項又は第３６項記載の方法。 - 【請求項３８】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化する請求の範囲第３
５項〜第３７項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項３９】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化する請求の範囲第３６項〜
第３８項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項４０】 糖タンパク質ERNSにあるRNase活性を不活性化することを 特徴とする特異的に標識されたペスチウイルスの調製方法。
- 【請求項４１】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の少なくとも一つのア
ミノ酸の欠失及び／又は突然変異により不活性化する請求の範囲第４０項記載の
方法。 - 【請求項４２】 前記欠失及び／又は突然変異が前記糖タンパク質の位置29
5-307及び／又は位置338-357（例示様式でCSFVアルフォート株について図１に記
載された位置又はその他の株中のそれに相当する位置）のアミノ酸に位置される
請求の範囲第４０項又は第４１項記載の方法。 - 【請求項４３】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のアミノ酸の欠失又は突然変異により不活性化する請求の範囲第４
０項〜第４２項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項４４】 前記RNase活性を前記糖タンパク質の位置346（例示様式で
CSFVアルフォート株について図１に記載された位置又はその他の株中のそれに相
当する位置）のヒスチジン残基の欠失により不活性化する請求の範囲第４０項〜
第４３項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項４５】 動物のペスチウイルス感染症の予防及び治療のための請求 の範囲第１項〜第６項のいずれか一項記載のワクチンの使用。
- 【請求項４６】 動物のペスチウイルス感染症の予防及び治療のための請求 の範囲第１８項記載の医薬組成物の使用。
- 【請求項４７】 ワクチン又は医薬組成物の調製のための請求の範囲第７項
〜第１１項のいずれか一項記載のペスチウイルス及び／又は請求の範囲第１２項
〜第１６項のいずれか一項記載のヌクレオチド配列の使用。 - 【請求項４８】 (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中のペスチウイルスのヌクレオチド配列を同定する工程、 (3) ワクチン中に存在するERNSヌクレオチド配列の欠失及び／又は突然変異を
ワクチン注射された動物と相関関係付け、前記欠失及び／又は突然変異の不在を
前記動物のペスチウイルス感染症と相関関係付ける工程 を含むことを特徴とする、特異的に弱毒化されたペスチウイルス（前記の特異的
に弱毒化されたペスチウイルスは請求の範囲第1９項〜第２３項のいずれか一項
記載の方法により弱毒化されている）でワクチン注射された動物からペスチウイ
ルス感染動物を区別する方法。 - 【請求項４９】 (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中に存在するERNS糖タンパク質へのモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体の特異的結合により弱毒化ペスチウイルスの修飾ERNS糖タン
パク質を同定する工程（前記糖タンパク質は請求の範囲第1９項〜第２３項のい
ずれか一項記載の方法により修飾され、それにより前記モノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体が未修飾ERNS糖タンパク質に結合しない）、 (4) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の特異的結合をワクチン
注射された動物と相関関係付け、前記動物及び／又は前記サンプル中のペスチウ
イルス物質の存在がそうしないと証明される条件下で前記動物のペスチウイルス
感染への抗体結合の不在を相関関係付ける工程 を含む請求の範囲第４８項記載の方法。 - 【請求項５０】 (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中に存在するERNS糖タンパク質へのモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体の特異的結合によりペスチウイルスの未修飾ERNS糖タンパク
質を同定する工程（前記糖タンパク質は請求の範囲第1９項〜第２３項のいずれ
か一項記載の方法により修飾されておらず、それにより前記モノクローナル抗体
又はポリクローナル抗体が修飾ERNS糖タンパク質に結合しない）、 (3) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の特異的結合を前記動物
のペスチウイルス感染症と相関関係付け、前記動物及び／又は前記サンプル中の
ペスチウイルス物質の存在がそうしないと証明される条件下でワクチン注射され
た動物への抗体結合の不在を相関関係付ける工程 を含む請求の範囲第４９項記載の方法。 - 【請求項５１】 (1) サンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係する動物又はワクチン
注射された動物から得る工程、 (2) 前記サンプル中の糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在又は存在を測定する
工程、 (3) 糖タンパク質ERNSのRNase活性の不在をワクチン注射された動物と相関関係
付け、前記活性の存在を前記動物のペスチウイルス感染症と相関関係付ける工程
を含む請求の範囲第４８項記載の方法。 - 【請求項５２】 (1) ポリクローナル抗体のサンプルをペスチウイルス感染症の疑いのある関係
する動物又はワクチン注射された動物から得る工程、 (2) 未修飾糖タンパク質ERNS又は本発明に従って修飾された糖タンパク質ERNS
への前記ポリクローナル抗体の特異的結合を同定する工程、 (3) 未修飾糖タンパク質ERNSへの前記ポリクローナル抗体の結合をペスチウイ
ルス感染症と相関関係付け、本発明に従って修飾された糖タンパク質ERNSへの前
記ポリクローナル抗体の結合をワクチン注射された動物と相関関係付ける工程 を含む請求の範囲第４８項記載の方法。
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