ES2253457T3

ES2253457T3 - Pestivirus atenuados.

Info

Publication number: ES2253457T3
Application number: ES02003407T
Authority: ES
Inventors: Gregor Meyers
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-05-26
Also published as: TR200003622T2; TR200103666T2; PT1084251E; JP2010259445A; ES2257476T3; DE69928700T2; PL202509B1; HU228468B1; CN1304452A; BR9911619B1; SK287626B6; EP1203813A2; SK18232000A3; CA2330241A1; DE69929544D1; EP1614423A2; WO1999064604A2; ATE286131T1; JP2013099357A; AR020084A1

Abstract

Pestivirus atenuado, en el que la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína ERNS está inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o mutaciones situadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de dicha glicoproteína no sean lisina.

Description

Pestivirus atenuados.

Campo de la invención

La invención también se refiere a pestivirus atenuados al inactivar la actividad de ribonucleasa (actividad de RNasa) que reside en la glicoproteína E^{RNS}, a ácidos nucleicos para preparar pestivirus de este tipo, a vacunas y a composiciones farmacéuticas que comprenden los pestivirus atenuados de la invención. Además, se describen métodos para distinguir entre los virus atenuados de la invención y virus patógenos.

Antecedentes de la invención

Los pestivirus son los agentes causantes de enfermedades de animales económicamente importantes en muchos países de todo el mundo. Materiales aislados de virus actualmente conocidos han sido agrupados en tres diferentes especies que, juntas, forman un género dentro de la familia Flaviviridae.

I: Virus de la diarrea viral bovina (VDVB) causa la diarrea viral bovina (DVB) y la enfermedad de la mucosa (EM) en ganado (Baker, 1987; Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

II: Virus de la fiebre porcina clásica (VFPC), llamado anteriormente virus del cólera porcino, es el responsable de la fiebre porcina clásica (FPC) o cólera porcina (CP) (Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

III: El virus de la enfermedad de la frontera (VEF) se encuentra típicamente en ovejas y provoca la enfermedad de la frontera (EF). Se ha descrito también que síntomas similares a EF en ganado se producen después de la infección intrauterina de corderos con VEF (Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

Una clasificación alternativa de pestivirus se proporciona por Becher et al. (1995) u otros.

Los pestivirus son pequeños virus provistos de una cubierta con un genoma de ARN de cadena sencilla de polaridad positiva que carece tanto de las secuencias 5' cap como 3' poli(A). El genoma vírico codifica una poliproteína de aproximadamente 4000 aminoácidos dando lugar a productos de escisión finales mediante tratamiento de co-traducción y post-traducción que implican proteasas celulares y víricas. Las proteínas víricas están dispuestas en la poliproteína en el orden NH_{2}-N^{pro}-C-E^{RNS}-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Rice, 1996). La proteína C y las glicoproteínas E^{RNS}, E1 y E2 representan componentes estructurales del virión del pestivirus (Thiel et al., 1991). Se encontró que E2 y, en menor medida, E^{RNS}, eran dianas para la neutralización de anticuerpos (Donis et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijn et al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). E^{RNS} carece de un anclaje de la membrana y se secreta en cantidades considerables a partir de las células infestadas; se ha informado que esta proteína exhibe una actividad de RNasa (Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). La función de esta actividad enzimática para el ciclo vital del virus es actualmente desconocida. En el caso de una cepa de vacuna contra VFPC se ha informado que una destrucción experimental de la RNasa mediante mutagénesis dirigida al sitio da como resultado un virus citopatógeno que tiene características de crecimiento en el cultivo de células equivalentes al virus de tipo salvaje (Hulst et al., 1998). La actividad enzimática depende de la presencia de dos extensiones de aminoácidos conservadas entre la E^{RNS} del pestivirus y diferentes RNasas conocidas de origen vegetal y fúngico. Estas dos secuencias conservadas contienen un residuo histidina (Schneider et al., 1993). El intercambio de cada uno de estos residuos por lisina en la proteína E^{RNS} de una cepa de vacuna de VFPC dio como resultado la destrucción de la actividad de RNasa (Hulst et al., 1998). La introducción de estas mutaciones en el genoma de la cepa de vacuna de VFPC no influía sobre la viabilidad viral o las propiedades de crecimiento, sino que conducía a un virus que exhibía un fenotipo ligeramente citopatogénico (Hulst et al., 1998).

Han sido producidas para VFPC y VDVB, y actualmente se utilizan, vacunas que comprenden virus atenuados o exterminados o proteínas víricas expresadas en sistemas de expresión heterólogos. La base estructural de la atenuación de estos virus utilizados como vacunas vivas es desconocida. Esto conduce al riesgo de revertantes impredecibles mediante retromutación o recombinación después de la vacunación. Por otra parte, la eficacia de vacunas inactivadas o proteínas víricas heterólogamente expresadas (vacunas subunidad) en la inducción de la inmunidad es más bien baja.

En general, las vacunas vivas con mutaciones definidas como base de la atenuación permitiría evitar las desventajas de la presente generación de vacunas. Actualmente, no están disponibles dianas potenciales para atenuar mutaciones en pestivirus.

Una ventaja adicional de dichas mutaciones atenuantes estriba en su singularidad molecular que permite utilizarlas como marcadores distintivos para un pestivirus atenuado y para distinguirlas de pestivirus procedentes del campo.

Debido a la importancia de una profilaxis eficaz y segura, así como detectable, y del tratamiento de infecciones por pestivirus, existe una fuerte necesidad de vacunas vivas y específicamente atenuadas con un elevado potencial para la inducción de la inmunidad, así como una base definida de atenuación que también se puede distinguir de pestivirus patógenos.

Por lo tanto, el problema técnico en el que se basa la presente invención consiste en proporcionar pestivirus específicamente atenuados y marcados de forma detectable para uso como vacunas atenuadas vivas con una elevada eficacia para la inducción de inmunidad que, como resultado de este método, también se pueden distinguir de pestivirus patógenos procedentes del campo.

Descripción de la invención

La solución al problema técnico anterior se consigue mediante la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Se ha encontrado, sorprendentemente, que los pestivirus se pueden atenuar específicamente mediante la inactivación de la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}.

Los pestivirus atenuados proporcionan ahora vacunas vivas de elevada inmunogenicidad. Por lo tanto, en un aspecto adicional, se describe una vacuna viva que comprende un pestivirus, en la que está inactivada la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}. El término "vacuna", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un componente inmunológicamente activo que induce una respuesta inmunológica en un animal y, posiblemente pero no necesariamente, uno o más componentes adicionales que refuerzan la actividad inmunológica de dicho componente activo. Una vacuna puede comprender, adicionalmente, componentes adicionales típicos de composiciones farmacéuticas. El componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender organismos vivos completos en su forma original o en forma de organismos atenuados en una denominada vacuna viva modificada (VVM) u organismos inactivados por métodos apropiados en una denominada vacuna exterminada (VE). En otra forma, el componente inmunológicamente activo de la vacuna puede comprender elementos apropiados de dichos organismos (vacunas subunidad), siendo estos elementos generados al destruir el organismo completo o el crecimiento de cultivos de organismos de este tipo y proporcionando las subsiguientes etapas de purificación la o las estructuras deseadas, o por procesos de síntesis inducidos por una manipulación apropiada de un sistema adecuado tal como, pero no limitado a bacterias, insectos, mamíferos u otras especies, más subsiguientes procesos de aislamiento y purificación, o por inducción de dichos procesos de síntesis en el animal que necesita una vacuna por incorporación directa de material genético utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas (vacunación de polinucleótidos). Una vacuna puede comprender uno, o simultáneamente más de uno de los elementos antes descritos.

Componentes adicionales para reforzar la respuesta inmune son constituyentes a los que habitualmente se les alude como adyuvantes tales como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, aceite minerales u otros aceites o moléculas auxiliares añadidas a la vacuna o generadas por el cuerpo después de la respectiva inducción por parte de componentes adicionales de este tipo, tales como, pero no limitados a interferones, interleuquinas o factores de crecimiento.

Una "composición farmacéutica" consiste esencialmente en uno o más ingredientes capaces de modificar las funciones fisiológicas, por ejemplo inmunológicas, del organismo al que se administra a, o de organismos que viven en o sobre su superficie tales como, pero no limitados a antibióticos o antiparasitarios, así como otros constituyentes añadidos a la misma con el fin de lograr otros determinados objetivos tales como, pero no limitados a cualidades de tratamiento, esterilidad, estabilidad, capacidad de administrar la composición por vías enteral o parenteral tales como la vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradermal u otra vía adecuada, tolerancia después de la administración, propiedades de liberación controlada.

Una vacuna descrita con ello se refiere a una vacuna según se define anteriormente, en donde un componente inmunológicamente activo es un pestivirus o un componente de origen pestivírico.

La expresión "vacuna viva" se refiere a una vacuna que comprende un componente vivo, en particular un componente activo vírico vivo.

El término "pestivirus", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a todos los pestivirus caracterizados por pertenecer al mismo género, tales como VDVB, VFPC y VEF dentro de la familia Flaviviridae y por su expresión de la glicoproteína E^{RNS}. Naturalmente, dicho término también se refiere a todos los pestivirus según se caracterizan por Becher et al. (1995) u otros que expresan la glicoproteína E^{RNS}. "Actividad de RNasa", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la capacidad de la glicoproteína E^{RNS} de hidrolizar ARN.

Ha de hacerse observar que en las publicaciones el término glicoproteína E0 se utiliza a menudo como sinónimo a la glicoproteína E^{RNS}.

La expresión "inactivación de la actividad de RNasa que reside en dicha glicoproteína" se refiere a la incapacidad o a la capacidad reducida de una glicoproteína E^{RNS} modificada de hidrolizar ARN en comparación con el tipo salvaje no modificado de dicha glicoproteína E^{RNS}.

La inactivación de la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} se puede conseguir por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, según se demuestra en esta memoria y por parte de Hulst et al. (1998). Por lo tanto, en una realización preferida, se describen con ello vacunas, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína.

Se ha demostrado que la glicoproteína E^{RNS} forma un homodímero unido por disulfuro de aproximadamente 97 kD, en donde cada monómero consiste en 227 aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 268 a 494 de la poliproteína de VFPC según se describe por Rümenapf et al. (1993). Los primeros 495 aminoácidos, según se expresan por parte de la cepa Alfort de VFPC, se muestran en la figura 1 solamente con fines de referencia. La secuencia del genoma de la cepa Alfort de VFPC está disponible en la genoteca GenBank/EMBL bajo el número de acceso J04358; alternativamente, la secuencia de aminoácidos para la cepa CP7 de VDVB es accesible en la genoteca GenBank/EMBL (número de acceso U63479). Dos regiones de aminoácidos están muy conservadas en la glicoproteína E^{RNS}, así como en algunas proteínas de plantas y hongos con actividad RNasa (Schneider et al., 1993). Estas dos regiones son de particular importancia para la actividad enzimática de RNasa. La primera región consiste en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307, y la segunda región consiste en los aminoácidos en las posiciones 338 a 357 de dicha poliproteína vírica, según se ejemplifica por la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC (numeración de acuerdo con la secuencia de aminoácidos deducida publicada la cepa Alfort de VFPC (Meyers et al., 1989)). Los aminoácidos de particular importancia para la actividad de RNasa según se ha mencionado anteriormente no están limitados de modo alguno por la posición exacta según se define para la cepa Alfort de VFPC, sino que simplemente se utilizan de una manera ejemplar para indicar los aminoácidos preferidos que se encuentran en esa posición o que corresponden a esa posición en otras cepas tales como se encuentran en VDVB, VEF y pestivirus en general, ya que están muy conservadas. Para pestivirus distintos de la cepa Alfort de VFPC, la numeración de las posiciones de los aminoácidos preferidos es a menudo diferente, pero un experto en el campo de la biología molecular de pestivirus identificará fácilmente estos aminoácidos preferidos por su posición con relación a los aminoácidos muy conservados de dicha glicoproteína. En un ejemplo particular, no limitante, la posición de Alfort 346 de VFPC es idéntica a la posición 349 de la cepa CP7 de VDVB.

Como consecuencia, en una realización más preferida, se describe con ello una vacuna, en donde dichas deleciones y/o mutaciones inactivantes están situadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1, para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar, correspondiente a las mismas en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización muy preferida, se describe con ello que la inactivación de dicha actividad de RNasa por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346 de dicha glicoproteína conduce a vacunas vivas particularmente útiles. Por lo tanto, la presente invención se refiere a vacunas de acuerdo con la invención, en donde dicha actividad de RNasa es inactivada por la deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

La presente invención demuestra que los pestivirus son viables y codifican una proteína E^{RNS} sin actividad de RNasa cuando está suprimido el residuo histidina en la posición 346 de la poliproteína vírica (numeración de acuerdo con la secuencia publicada de Alforte de VFPC/Tübingen (Meyers et al., 1989)), que representa uno de los residuos del sitio activo putativo conservados de la RNasa de E^{RNS}. Se ha demostrado también para esta invención que la deleción de la respectiva histidina en la E^{RNS} de un pestivirus VEB (posición 349, numerado de acuerdo con la secuencia de CP7 de VDVB de la genoteca GenBank/EMBL (número de acceso U63479)) da como resultado un virus viable en el que la glicoproteína E^{RNS} ha perdido la actividad de RNasa. En contraposición con las mutaciones puntuales cambiando un aminoácido por otro, un mutante por deleción es generalmente mucho más estable con respecto a los revertantes. La infestación de cerdos con un mutante de Alfort de VFPC/Tübingen patogénica que expresa E^{RNS} con esta deleción no condujo a fiebre ni a otros síntomas clínicos típicos de infecciones por VFPC, mientras que la infestación con el virus de tipo salvaje dio como resultado fiebre, diarrea, anorexia, apatía, agotamiento de células B y trastornos nerviosos centrales. Estos cerdos fueron exterminados en una fase moribunda mostrando graves hemorragias en la piel y órganos internos 14 días después de la inoculación. Los cerdos infestados con el mutante no mostraban ni viremia ni agotamiento de células B según se ensayó en los días 3, 5, 7, 10, 14 después de la infección, mientras que el VFPC se aisló fácilmente de muestras de sangre derivadas de los cerdos inoculados con el virus de tipo salvaje. El mutante por deleción se replicaba aparentemente en los animales según se indicaba por la inducción de anticuerpos neutralizantes (véase el Ejemplo 3, Tabla 3c). La respuesta inmune al virus mutante era suficiente para permitir que sobreviviera un enfrentamiento letal con 2x10^{5} TCID_{50} de la infección muy patógena con la cepa Eystrup de VFPC (König, 1994) que es heteróloga a la cepa Alfort. Además, los animales sometidos a ensayo no mostraron síntomas clínicos típicos de la infección por VFPC tales como fiebre, diarrea, hemorragias, agotamiento de células B o anorexia después de la infección por enfrentamiento. Estos datos demuestran que la infección de cerdos con el mutante por deleción induce una respuesta inmune suficiente para la protección frente a un enfrentamiento estricto.

Por lo tanto, en una realización más preferida, se describen con ello vacunas, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida adicional, se describen con ello vacunas de VDVB, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346 según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas de VDVB, de dicha glicoproteína.

La presente invención se refiere a pestivirus atenuados, en los que la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} está inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de dicha glicoproteína, según se describe en la figura 1 para VFPC, no sean lisina. Un pestivirus recombinante, en el que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de dicha glicoproteína son lisina ha sido descrito por Hulst et al. en 1998. Estos pestivirus particulares demostraron efectos citopáticos en células del riñón de cerdo. Hasta ahora, ha habido un total desconocimiento del rasgo atenuante, sorprendente e innovativo, debido a la inactivación de la actividad enzimática de E^{RNS}.

En una realización preferida por las razones anteriormente establecidas para vacunas, la presente invención también se refiere a pestivirus de acuerdo con la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o mutaciones localizadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida por las razones establecidas anteriormente para vacunas, la presente invención también se refiere a pestivirus de la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida por las razones establecidas anteriormente para vacunas, la presente invención también se refiere a pestivirus, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida adicional, la presente invención se refiere a pestivirus VDVB, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas de VDVB, de dicha glicoproteína.

Los pestivirus atenuados y los componentes activos de las vacunas de la presente invención se pueden preparar fácilmente mediante técnicas recombinantes modificadoras de los ácidos nucleicos que dan como resultado la expresión de una secuencia de aminoácidos mutante en la glicoproteína E^{RNS}. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican una glicoproteína E^{RNS}, en donde la actividad de RNasa que reside en dicha glicoproteína es inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de la glicoproteína según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC no sean lisina.

En una realización preferida, la presente invención se refiere, por las razones mencionadas anteriormente, a ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o mutaciones que están localizadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida, la presente invención se refiere, por las razones mencionadas para vacunas, a ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

En una realización más preferida adicional, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos de VDVB de acuerdo con la invención, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas VDVB, de dicha glicoproteína.

Nucleótidos, por ejemplo ADN o ARN, son también útiles para preparar vacunas de ADN, ARN y/o vector. En estas vacunas, los nucleótidos se aplican directamente al animal, o indirectamente a través de vectores distintos del virus original. Las vacunas de nucleótidos y vacunas de vector son bien conocidas por el estado actual de la técnica y no necesitan ser elaboradas adicionalmente.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de ácidos nucleicos de la presente invención para preparar vacunas de nucleótidos y/o vectores.

Las vacunas, los pestivirus atenuados y/o los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención son particularmente útiles para la preparación de una composición farmacéutica.

En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una vacuna de acuerdo con la invención, y/o un pestivirus de acuerdo con la invención, y/o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. Un ejemplo no limitante de una composición farmacéutica de este tipo, únicamente dado con fines de demostración, se podría preparar como sigue: el material sobrenadante de un cultivo de células infestado se mezcla con un estabilizador (por ejemplo espermidina y/o BSA (albúmina de suero bovino)), y la mezcla se liofiliza o deshidrata subsiguientemente por otros métodos. Antes de la vacunación, dicha mezcla se rehidrata entonces en soluciones acuosas (por ejemplo solución salina, PBS (solución salina tamponada con fosfato)) o no acuosas (por ejemplo emulsión en aceite, adyuvante basado en aluminio).

Un aspecto adicional de la presente descripción se refiere a un método para la atenuación de pestivirus. La invención proporciona un método único e inesperado para atenuar pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}.

Los pestivirus específicamente atenuados son especialmente útiles para la preparación de vacunas. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención describe métodos para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuados, caracterizados porque se inactiva la actividad de RNasa en la glicoproteína E^{RNS}.

La inactivación de la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} proporciona un método sorprendente y nuevo para marcar de forma detectable pestivirus. En un aspecto adicional, se describe con ello un método para marcar de forma detectable pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}. La característica de la ausencia de actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} de pestivirus según se proporciona con ello permite ahora marcar de forma detectable estos pestivirus. Pestivirus marcados y no marcados o la E^{RNS} secretada de células infestadas con pestivirus en fluidos corporales pueden distinguirse claramente por la ausencia o presencia de actividad de RNasa de las glicoproteínas E^{RNS} tras el aislamiento y el ensayo de tal actividad enzimática.

Para pestivirus inactivados en su actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} por deleción y/o mutación se puede utilizar un cierto número de otras técnicas. Pestivirus de este tipo se pueden fácilmente detectar debido a las consecuencias estructurales que resultan de deleciones y/o mutaciones de este tipo. Por ejemplo, la diferencia de secuencia de la secuencia de ácidos nucleicos de la glicoproteína E^{RNS} alterada es detectable por técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos o técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), según se demuestra en el Ejemplo 8; la secuencia de proteínas alterada se puede detectar por anticuerpos monoclonales específicos que no reconocen proteínas inalteradas. A la inversa, también es posible detectar las proteínas alteradas y, con ello, estructuralmente marcadas mediante la ausencia de la unión a anticuerpos monoclonales específicos que reconocen glicoproteínas de E^{RNS} inalteradas, bajo la condición de que se pueda establecer de otro modo la presencia de pestivirus. Y, naturalmente, las deleciones y/o mutaciones que avalan la actividad de RNasa en los virus marcados darán como resultado diferentes respuestas inmunes en animales cuando se comparan con las respuestas que resultan de infecciones por pestivirus no marcados.

Una realización preferida para todos los aspectos referentes a métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se proporcionan con ello son los métodos que se refieren a la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa es inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína.

Una realización más preferida para todos los aspectos referidos a los métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se proporcionan con ello son los métodos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dichas deleciones y/o mutaciones están situadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

Una realización muy preferida para todos los aspectos referidos a los métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se proporcionan con ello son los métodos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa es inactivada por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

Una realización más preferida para todos los aspectos referidos a los métodos para atenuar pestivirus, métodos para producir una vacuna de pestivirus específicamente atenuado y métodos para marcar de forma detectable pestivirus según se proporcionan con ello son los métodos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa es inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o de manera correspondiente a la misma en otras cepas de dicha glicoproteína.

La presente invención describe vacunas y/u otras composiciones farmacéuticas que son particularmente útiles para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales. Por lo tanto, se describe con ello un aspecto adicional de la presente invención referido a métodos para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales, caracterizados porque una vacuna de acuerdo con la invención u otra composición farmacéutica de acuerdo con la invención se aplica a un animal que necesita de una profilaxis o un tratamiento de este tipo.

En un aspecto adicional descrito en esta memoria, se describe un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente atenuados, en el que dicho procedimiento se caracteriza porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}.

En un aspecto descrito en esta memoria, se describe un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente marcados, caracterizado porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}.

Una realización preferida para todos los aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente marcados según se proporciona con ello son los procedimientos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa se inactiva por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína.

Una realización más preferida para todos los aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente marcados según se proporciona con ello son los procedimientos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dichas deleciones y/o mutaciones están localizadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

Una realización muy preferida para todos los aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente marcados según se proporciona con ello son los procedimientos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa es inactivada por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

Una realización más preferida para todos los aspectos referentes a un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente atenuados, un procedimiento para la preparación de pestivirus específicamente marcados según se proporciona con ello son los procedimientos relacionados con la inactivación de la glicoproteína E^{RNS}, en los que dicha actividad de RNasa es inactivada por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

Las vacunas u otras composiciones farmacéuticas de la presente invención son útiles para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere al uso de una vacuna según se proporciona con ello para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un pestivirus de acuerdo con la invención para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales.

Pestivirus y/o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención son útiles componentes activos de una composición farmacéutica o una vacuna. Por lo tanto, la presente invención se refiere, en un aspecto adicional, al uso de un pestivirus de la invención y/o un ácido nucleico de la invención para la preparación de una vacuna o una composición farmacéutica. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales.

Tal como se ha mencionado antes, la inactivación de la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} proporciona un método sorprendente y nuevo para marcar pestivirus.

Como consecuencia, un aspecto descrito con ello se refiere a métodos para distinguir los pestivirus marcados de forma detectable de acuerdo con la invención de pestivirus no marcados y, posiblemente, patógenos. Métodos de este tipo son especialmente útiles para investigar la eficacia de pestivirus marcados en animales. Un animal tratado con una vacuna demostrará ser marcador-positivo después de obtener una muestra de dicho animal y someter a ensayo dicho marcador. Los animales no marcados y los animales especialmente no marcados que demuestran ser pestivirus-positivos, pueden ser inmediatamente separados, aislados o sacrificados para eliminar el inminente riesgo de propagar la infección patógena a otros animales.

La presente invención proporciona un método para marcar de forma detectable pestivirus, caracterizado porque se inactiva la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS}. Esta característica de la ausencia de actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} de pestivirus según se proporciona con ello permite ahora marcar de forma detectable estos pestivirus. Como resultado, los pestivirus marcados y no marcados se pueden claramente distinguir por la ausencia o presencia de la actividad de RNasa de la glicoproteína E^{RNS} tras el aislamiento y el ensayo de una actividad enzimática de este tipo. La determinación de la presencia o ausencia de esta actividad enzimática tras obtener una muestra que contiene un pestivirus de interés o un material del mismo se puede efectuar de acuerdo con métodos estándares tales como, por ejemplo, se describe en el Ejemplo 2 o en Hulst et al. (1994).

Por lo tanto, una realización preferida descrita con ello, se refiere a un método para distinguir animales infestados con pestivirus de animales vacunados con un pestivirus específicamente atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas:

(1): obtener una muestra de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o de un animal vacunado;

(2): determinar la ausencia o presencia de actividad de RNasa de una glicoproteína E^{RNS} dentro de dicha muestra;

(3): correlacionar la ausencia de actividad de Rnasa de la glicoproteína E^{RNS} con un animal vacunado y correlacionar la presencia de dicha actividad con una infección por pestivirus de dicho animal.

Se describen con ello pestivirus que están inactivados en su actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} por deleción y/o mutación. Pestivirus de este tipo se detectan fácilmente debido a las consecuencias estructurales que resultan de deleciones y/o mutaciones de este tipo. La diferencia en la secuencia del gen E^{RNS} que codifica la glicoproteína E^{RNS} alterada se puede detectar mediante técnicas de secuenciación o técnicas de PCR. Como resultado, en una realización preferida descrita en esta memoria se describe un método para distinguir animales infestados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus específicamente atenuado, que comprende las siguientes eta-
pas:

(1): obtener una muestra de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o un animal vacunado;

(2): identificar la secuencia de nucleótidos de un ge- noma de pestivirus o proteína dentro de dicha muestra;

(3): correlacionar las deleciones y/o mutaciones de la secuencia de nucleótidos de E^{RNS} tal como se presenta en la vacuna con un animal vacunado y correlacionar la ausencia de dichas deleciones y/o mutaciones con una infección por pestivirus de dicho animal.

Además, los cambios estructurales que resultan de la secuencia de proteínas alterada de la glicoproteína E^{RNS} de pestivirus de la invención se puede detectar mediante anticuerpos monoclonales o policlonales específicos, que no reconocen proteínas inalteradas. Por lo tanto, una realización adicional descrita con ello se refiere a un método para distinguir animales infestados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas:

(2): identificar una glicoproteína E^{RNS} modificada de un pestivirus atenuado mediante la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas E^{RNS} presentes en dicha muestra, siendo modificadas dichas glicoproteínas por un método de acuerdo con la invención, con lo que dichos anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteínas E^{RNS} no modificadas;

(3): correlacionar la unión específica de dichos anti-cuerpos monoclonales o policlonales con un animal vacunado, y correlacionar la ausencia de anticuerpos que se unen a una infección por pestivirus de dicho animal, bajo la condición de que la presencia de material pestivírico en dicho animal y/o dicha muestra se establezca de otro modo.

A la inversa, también es posible detectar las proteínas alteradas y, con ello, estructuralmente marcadas, mediante la ausencia de la unión a anticuerpos monoclonales o policlonales específicos que reconocen solamente glicoproteínas E^{RNS} inalteradas, si la presencia de pestivirus se puede establecer de otro modo. Una realización preferida descrita con ello se refiere a un método para distinguir animales infestados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas:

(2): identificar una glicoproteína E^{RNS} no modificada de un pestivirus mediante la unión específica de anticuerpos monoclonales o policlonales a glicoproteínas E^{RNS} presentes en dicha muestra, no siendo modificadas dichas glicoproteínas por un método según se proporciona con ello, con lo que dichos anticuerpos monoclonales o policlonales no se unen a glicoproteínas E^{RNS} modificadas;

(3): correlacionar la unión específica de dichos anticuerpos monoclonales o policlonales con una infección por pestivirus en dicho animal, y correlacionar la ausencia de anticuerpos que se unen a un animal vacunado, bajo la condición de que la presencia de material pestivírico en dicho animal y/o dicha muestra se establezca de otro modo.

Naturalmente, la modificación estructural y la ausencia de la actividad de RNasa en los virus marcados de la invención dará como resultado diferentes respuestas inmunes en animales cuando se comparan con las respuestas que resultan de infecciones por pestivirus no marcados. Los pestivirus de la invención producen una respuesta inmune diferente y distinta, celular así como humoral, que difiere de respuestas inmunes no modificadas y, posiblemente, patógenas. Por ejemplo, glicoproteínas E^{RNS} según se proporciona con ello darán como resultado anticuerpos policlonales que son diferentes en su especificidad de unión cuando se comparan con anticuerpos policlonales que resultan de glicoproteínas no modificadas. Esta diferencia en la especificidad de unión proporciona un marcador para distinguir animales vacunados con pestivirus según se proporciona con ello de animales infestados con pestivirus en el campo. Ensayos para el rastreo de sueros en cuanto a anticuerpos policlonales específicos que se unen a un epítopo de tipo salvaje o una mutación por deleción del marcador de ese epítopo para el fin de diferenciar animales infestados y vacunados han sido descritos, por ejemplo, para cerdos infestados con pseudorrabia y vacunados (Kit et al., 1991).

Una realización preferida descrita con ello se refiere a un método para distinguir animales infestados por pestivirus de animales vacunados con un pestivirus atenuado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas:

(1): obtener una muestra de anticuerpos policlonales de un animal de interés del que se sospecha una infección por pestivirus o de un animal vacunado;

(2): identificar cualquier unión específica de dichos anticuerpos policlonales a la glicoproteína E^{RNS} no modificada o a la glicoproteína E^{RNS} según se modifica según se describe en esta memoria;

(3): correlacionar la unión de dichos anticuerpos policlonales a la glicoproteína E^{RNS} no modificada con una infección por pestivirus y correlacionar la unión de dichos anticuerpos policlonales a la glicoproteína E^{RNS} según se modifica como se describe en esta memoria con uno vacunado.

Referencias

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Ejemplos Ejemplo 1 Generación de mutantes de pestivirus RNasa-negativos

Partiendo de los clones pA/VFPC (Meyers et al., 1996a) o pA/VDVB (Meyers et al., 1996b) de ADNc de longitud completa, a partir de los cuales se puede obtener ARNc infeccioso mediante transcripción in vitro, se generaron subclones. Para VFPC, un fragmento XhoI/SspI de pA/VFPC se clonó en pBluescript SK+ y se cortó con XhoI y SmaI. Para VDVB, un fragmento XhoI/BglII de pA/VDVB se clonó en el plásmido pCITE-2C cortado con las mismas enzimas. A partir de estas construcciones se produjo ADN del plásmido de cadena sencilla de acuerdo con el método de Kunkel (Kunkel et al., 1987), utilizando células CJ 236 de E. coli (BioRad) y el fago de cadena sencilla VCMS (Stratagene). El ADN de cadena sencilla se convirtió en cadenas dobles utilizando el ``estuche de mutagénesis in vitro "Phagemid" (BioRad). Alguno de los oligonucleótidos sintéticos que se utilizaron como cebadores para generar los mutantes de pestivirus deseados se enumeran a continuación de una manera ejemplar:

C-297-L:: AGGAGCTTACTTGGGATCTG

C-346-L:: GGAACAAACTTGGATGGTGT

C-297-K:: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC

C-346-K:: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d:: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

B-346-d:: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG

El ADN del plásmido de cadena doble se utilizó para la transformación de células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene). Plásmidos que albergan colonias bacterianas se aislaron a través de la selección por ampicilina. El ADN del plásmido se preparó y se analizó adicionalmente mediante la secuenciación de nucleótidos utilizando el estuche de secuenciación de T7 polimerasa (Pharmacia). Los plásmidos que contenían las mutaciones deseadas y ningún cambio en los segundos sitios se utilizaron para la construcción de clones de ADNc de longitud completa. En el caso de VFPC, un fragmento XhoI/NdeI del plásmido mutagenizado se insertó junto con un fragmento NdeI/BglII derivado del plásmido 578 (pCITE 2A, que contiene el fragmento XhoI/BglII de pA/VFPC) en pA/VFPC cortado con XhoI y BglII. Para obtener el mutante CP7 de VDVB, un fragmento XhoI/BglII que contenía la deleción se insertó en pA/VDVB cortado con XhoI y NcoI junto con un fragmento BglII/NcoI aislado de pA/VDVB/Ins-. A partir de la construcción pA/VDVB/Ins- se transcribió un ARNc que da origen a un VDVB no citopatogénico tras la transfección en células adecuadas (Meyers et al., 1996b). Los diferentes clones de longitud completa se amplificaron y los plásmidos se aislaron. La presencia de las mutaciones deseadas se demostró mediante secuenciación de ADN. Después de la linearización con SrfI (clones de longitud completa de VFPC) o SmaI (clones de longitud completa de VDVB), el ARNc se transcribió según se ha descrito previamente (Meyers et al., 1996ab). El ARN se purificó mediante filtración en gel y extracción con fenol/cloroformo y se utilizó para la transfección de células de riñón porcinas (PK15) o células de riñón bovinas (clon B2 de MDBK) (construcciones de VFPC o VDVB, respectivamente). Las transfecciones se analizaron mediante inmunofluorescencia con antisueros específicos del virus. En los casos en los que los mutantes deseados se podían recuperar (inmunofluorescencia positiva), los virus se amplificaron mediante el paso sobre las mismas líneas de células utilizadas para los experimentos de transfección. El análisis adicional de los mutantes de VFPC incluía la determinación de curvas de crecimiento de una etapa y la caracterización de ARN vírico mediante transferencia de Northern con sondas de ADNc específicas del virus así como la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) y la subsiguiente secuenciación de los fragmentos de PCR para verificar la presencia de las mutaciones deseadas en el genoma vírico. En todos los casos se demostró la presencia de la mutación deseada. La totalidad de los virus recuperados se desarrolló igualmente bien y producían cantidades similares de ARN al igual que los virus que resultan del plásmido que exhibe la secuencia de tipo salvaje.

La viabilidad del mutante de VDVB se demostró mediante transfección del ARNc respectivo y del desdoblamiento de las células 3 días después. Parte de las células se sembró en una placa de 3,5 cm de diámetro, se fijó con acetona/metanol el día siguiente y se analizó mediante inmunofluorescencia con una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos de VDVB (Weiland et al., 1989). Se encontró que todas las células eran positivas, mientras que un control de células transfectadas con ARN no infeccioso no mostró ninguna señal. A partir de una parte de las células transfectadas con el ARNc respectivo, se produjo un extracto mediante un ciclo de congelación y descongelación. Las células de reciente aportación se infestaron con este extracto de células y se demostró que eran VDVB positivas mediante inmunofluorescencia específica de VDVB 3 días después de la infección.

La Tabla 1 resume los diferentes cambios introducidos en las secuencias conservadas de E^{RNS} que representan los sitios activos putativos de la RNasa que son codificados por los mutantes del virus indicados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

2

\begin{minipage}[t]{145mm}Leyendas de la
Tabla 1: el ensayo de la actividad de RNasa se efectuó en un ensayo
transitorio. Las células BHK21 se infestaron con el virus de la
vacuna vTF7-3 (Fuerst  et al ., 1986) y luego
se transfectaron con la  respectiva construcción de ADNc (5  \mu g 
de ADN de plásmido, transfección utilizando Superfect según se
recomienda por el suministrador (Qiagen)). Al cabo de 10 horas de
incubación a  37^{o}C  en una incubadora de CO _{2},  las células
transfectadas se lisaron y trataron para la determinación de RNasa
según se describe a continuación. La viabilidad se determinó según
se describe a continuación.\end{minipage}

Ejemplo 2 Efecto de diferentes mutaciones sobre la actividad de RNasa de E^{RNS}

Para someter a ensayo el efecto de las diferentes mutaciones sobre la actividad de RNasa de E^{RNS}, células apropiadas se infestaron con los virus mutantes. Para VFPC, la infección se llevó a cabo con una multiplicidad de infecciones (m.d.i.) de 0,01. La infección con el virus de tipo salvaje servía como un testigo positivo, mientras que como testigo negativo se utilizaron células no infestadas. Al cabo de 48 h después de la infección, las células se lavaron dos veces son solución salina tamponada con fosfato y se lisaron en 0,4 ml de tampón de lisis (Tris/HCl 20 mM; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 2 mg/ml de albúmina de suero bovino; 1% de Triton X100; 0,1% de ácido desoxicólico; 0,1% de dodecilsulfato de sodio). El material lisado se añadió a tubos de reacción de 1,5 ml, se trató con ultrasonidos (dispositivo de ultrasonidos Branson B12, 120 vatios, 20 s en un baño de agua de cuerno de copa), se aclaró mediante centrifugación (5 min, 14.000 rpm, centrífuga Eppendorf, 4ºC) y el material sobrenadante se sometió a ultracentrifugación (ultracentrífuga superior de mesa Beckmann, 60 min a 4ºC y 45.000 rpm en un rotor TLA 45). La determinación de la actividad de RNasa se efectuó en un volumen total de 200 \mul que contenía 5 ó 50 \mul de material sobrenadante de la segunda etapa de centrifugación y 80 \mug de poli(rU) (Pharmacia) en tampón de ensayo de RNasa (Tris-acetato 40 mM (pH 6,5), EDTA 0,5 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM). Después de la incubación de la mezcla de reacción a 37ºC durante 1 hora, se añadieron 200 \mul de ácido perclórico 1,2 M, LaSO_{4} 20 mM. Después de 15 min de incubación sobre hielo, la mezcla se centrifugó durante 15 min a 4ºC y 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf. Al material sobrenadante se añadieron 3 volúmenes de agua, y una parte alícuota de la mezcla se analizó midiendo la densidad óptica a 260 nm utilizando un espectrofotómetro Ultrospec 3000 (Pharmacia). En todos los casos, las mutaciones introducidas en el gen E^{ms} anularon completamente la actividad de RNasa (Tabla 1).

Para el VDVB, la actividad de RNasa mutante se sometió a ensayo con material obtenido después de la transfección con ARN sin el paso de los virus recuperados. Las células transfectadas con el ARN apropiado se escindieron 72 h después de la transfección y se sembraron en dos placas. 24 h más tarde, de una placa se prepararon extractos de células y se analizaron en cuanto a la actividad de RNasa tal como se ha descrito antes. Para demostrar la infección, las células de la segunda placa se analizaron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos de VDVB (Weiland et al., 1989) y se encontró que eran 100% positivas. La transfección se llevó a cabo con ARN transcrito a partir de pA/VDVB/Ins- y a partir de pA/B-346-d, el plásmido equivalente a pA/VDVB/Ins-, pero que contiene la deleción del codón equivalente al codón 346 en el genoma de Alfort de VFPC. Células MDBK no transfectadas servían como testigo negativo.

TABLA 2A Determinación de la actividad de RNasa de diferentes virus

	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-346-d	C-346-d/RS	testigo
DO_{260}	2,4	2,3	1,1	1,1	1,1	2,3	1,1

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	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-297-K	C-346-K	C-297-L/346-L
DO_{260}	2,09	2,16	0,715	0,77	0,79	0,766	0,77
	C-297-K/346-L	C-297-K/346-K	C-346-d	Testigo
DO_{260}	0,725	0,835	0,8	0,84

Descripción de la Tabla 2A:

Células pK15 se infestaron con los virus indicados a una m.d.i. (multiplicidad de infección) de 0,01, se incubaron a 37ºC durante 48 h en una incubadora de CO_{2} y luego se lisaron y sometieron a ensayo de RNasa. El ARN soluble en ácidos resultante de la incubación con los diferentes extractos de células se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm. Las diferencias observadas en la actividad de RNasa no eran debidas a las diferentes cantidades de proteína E^{RNS} en las muestras, ya que se obtenían valores similares después de la cuantificación de E^{RNS} mediante marcaje radiactivo, inmunoprecipitación y análisis de radiactividad con un fosforimager. Además, la reducción de la concentración de E^{ms} en el ensayo hasta sólo un décimo de la cantidad habitual no cambiaba los valores DO resultantes de forma considerable, indicando que con las condiciones elegidas, el ensayo estaba saturado con E^{ms}.

Cepa Alfort de VFPC; todos los otros virus se recuperaron de ARN transcrito in vitro a partir de plásmidos: por ejemplo, C-WT a partir de pA/VFPC; C-297-L a partir de pA/C-297-L; etc.; el virus C-346-d/Rs se recuperó a partir de pA/C-346-d/Rs (generado por inversión de la mutación en pA/C-346-d por intercambio del respectivo fragmento de ADNc frente al fragmento equivalente derivado de pA/CFVP); testigo: extracto de células PK15 no infestadas.

TABLA 2B

	B-WT	B-346-d	Testigo
DO_{260}	2,5	1,1	1,1

Descripción de la Tabla 2B:

Células MDBK se infestaron con ARN transcrito in vitro, se escindieron 72 h después de la transfección y se analizaron 24 h más tarde en cuanto a la actividad de RNasa. La infección de las células se demostró mediante análisis por inmunofluorescencia según se describe en el texto.

B-WT: virus recuperado a partir de pA/VDVB/Ins-; B-346-d: virus recuperado a partir de pA/B-346-d; testigo: extracto de células MDBK no infestadas.

Ejemplo 3 Patogenicidad de VFPC después de inactivación de RNasa

Para someter a ensayo si la destrucción de la actividad de RNasa influye sobre la patogenicidad de pestivirus en su hospedante natural, se efectuaron experimentos con animales con el mutante V(pA/C-346-d) (C346-d en las tablas). El virus recuperado a partir del clon de longitud completa de VFPC sin mutación (V(pA/VFPC)) servía como testigo positivo (C-WT en las tablas). Para cada mutante se utilizaron tres cochinillos: (cría: raza de cerdo alemana; aproximadamente 25 kg de peso corporal). La dosis de infección era de 1 x 10^{5} TCID_{50} por animal; dos tercios del material inoculado se administraron por vía intranasal (un tercio en cada ventana de la nariz), un tercio por vía intramuscular. Los dos grupos se alojaron en unidades de aislamiento separadas. Se tomó sangre de los animales dos veces antes de la infección y los días 3, 5, 7, 10, 12 y 14. Además, la temperatura se registró diariamente (figura 2). Los animales infestados con el virus de tipo salvaje mostraron síntomas típicos de fiebre similar a la fiebre porcina clásica, ataxia, anorexia, diarrea, trastornos nerviosos centrales, hemorragias en la piel (Tabla 3a). El virus se pudo recuperar a partir de la sangre el día 3 (animal nº 68) y los días 5, 7, 10, 14 (animales nº 68, nº 78, nº 121) (Tabla 3b). Los animales se sacrificaron en una fase moribunda el día 14 después de la infección. En este momento, no se pudo detectar ningún anticuerpo neutralizante del virus. En contraposición, los animales infestados con el mutante no desarrollaron síntomas clínicos (Tabla 3a). La temperatura se mantuvo normal (figura 2) a lo largo de todo el período experimental y los animales nunca pararon de ingerir comida. En ningún instante se pudieron recuperar virus de la sangre. No obstante, los animales estaban claramente infestados y lo más probablemente es que el virus se replicara, ya que la totalidad de los animales desarrolló anticuerpos neutralizantes (Tabla 3c).

TABLA 3a Síntomas clínicos después de la infestación de ensayo

Experimento con animales 1
Anim. nº	infestado	síntomas clínicos
	con
		fiebre	diarrea	trastornos	anorexia	hemorragias	apatía	moribundo	hemorragias
				del SNC		en la piel		el día de la	en los
								eutanasia	órganos en
									la necropsia
nº 68	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
nº 78	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
nº 121	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
nº 70	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
nº 72	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
nº 74	C-346d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.

Descripción de la Tabla 3a:

6 cochinillos (raza de cerdos alemana; aproximadamente 25 kg de peso corporal) en dos grupos (cada grupo estaba alojado por separado) se incluyeron en el estudio. 3 animales se infestaron con VFPC-WT (1\cdot10^{5} TCID_{50}) y 3 animales con C-346-d (1\cdot10^{5} TCID_{50}). La temperatura del recto y los síntomas clínicos se registraron y se resumen según se detalla en la Tabla; n.a.: no se efectuó ninguna necropsia.

TABLA 3b Viremia de las células de la sangre después de la infestación de ensayo

Experimento con animales 1
Número	infestado	viremia en los días después de la infestación
de animal	con
		3	5	7	10	14
nº 68	C-WT	+	+	+	+	+
nº 78	C-WT	-	+	+	+	+
nº 121	C-WT	-	+	+	+	+
nº 70	C-346-d	-	-	-	-	-
nº 72	C-346-d	-	-	-	-	-
nº 74	C-346-d	-	-	-	-	-

Descripción de la Tabla 3b:

La viremia de las células de la sangre se detectó mediante co-cultivo de la sangre con células PK15. Después de la incubación a 37ºC durante 72 h, las células se lavaron con PBS, se fijaron con acetona/metanol enfriado con hielo y se analizaron en cuanto a la infección por inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína E2 (amc A18, Weiland et al. 1990).

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TABLA 3c Desarrollo del título de neutralización del suero específico de VFDP

días p.i.	-3	0	17	25	69	76	79	87
cerdo nº 70	-	-	1:18	1:162	1:162	1:162	1:486	1:1458
cerdo nº 72	-	-	1:18	1:54	1:486	1:1458	1:1458	1:4374
cerdo nº 74	-	-	1:6	1:54	1:162	1:486	1:486	1:1458

Descripción de la Tabla 3c:

Títulos de anticuerpos de cerdos infestados con el mutante C-346-d del virus determinados a diferentes instantes durante el experimento con animales:

50 \mul del suero diluido se mezclaron con 50 \mul de medio que contenía 30 TCID_{50} de virus (Alfort VFPC/Tübingen). Al cabo de 90 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 100 \mul de células (1,5 x 10^{4} células), y la mezcla se sembró en placas de 96 pocillos. Después de 72 h, las células se fijaron con acetona/metanol enfriado con hielo y se analizaron en cuanto a la infección por inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína E2 (amc A18, Weiland et al. 1990). El día 69 después de la infección, los animales se enfrentaron con 2 x 10^{5} TCID_{50} de la cepa Eystrup de VFPC. La tabla da la dilución del suero más elevada que da como resultado una neutralización completa de virus de entrada.

Ejemplo 4 Inducción de la inmunidad protectora por infección con virus RNasa-negativo

Para analizar si la infección con el virus mutante había conducido a una inmunidad protectora, se efectuó un experimento de enfrentamiento aproximadamente 9 semanas después de la infección con el mutante de VFPC utilizando una cepa VFPC heteróloga muy patógena (cepa Eystrup, procedente de Behring). Para la infección se utilizaron 2 x 10^{5} TCID_{50} de virus. Se encontró que esta cantidad de virus es suficiente para inducir una enfermedad letal en varios experimentos precedentes (König, 1994). Sin embargo, los animales previamente infestados con el mutante de RNasa de VFPC no mostraron síntomas de enfermedad después de la infección de enfrentamiento. No se podía detectar ni fiebre (figura 3) ni viremia, pero un aumento en los anticuerpos neutralizantes indicó una infección productora y una replicación del virus de enfrentamiento.

Ejemplo 5 Confirmación del principio de atenuación

Para demostrar que la atenuación observada del virus mutante se debe de hecho a la deleción de la histidina en la posición 346 de la poliproteína y no es una consecuencia de una segunda mutación puntual no identificada, la secuencia de tipo salvaje se reestableció por intercambio de un fragmento XhoI/NdeI de 1,6 kb del clon pA/C-346-d de longitud completa por el correspondiente fragmento de pA/VFPC que exhibe la secuencia de tipo salvaje. El fragmento escindido a partir de pA/C-346-d se analizó mediante secuenciación de los nucleótidos en cuanto a mutaciones. Exceptuando la deleción del triplete que codifica la histidina 346 de la poliproteína, no se encontró ninguna diferencia con respecto a la secuencia de tipo salvaje. A partir de la construcción de ADNc con el mutante recuperado, se pudo recuperar el virus V(pa/C-346-d/Rs) que se desarrollaba igualmente bien que el virus de tipo salvaje y mostraba una actividad de RNasa equivalente (Tabla 2A).

En un segundo experimento con animales, el virus rescatado se utilizó para la infestación de cerdos. Como testigo se utilizó el mutante de deleción. De nuevo se utilizaron dos grupos que consistían en tres animales. Dado que los animales eran más jóvenes (raza de cerdos alemana de aproximadamente 20 kg) que los del primer experimento, esta vez se utilizaron para la infestación 5 x 10^{4} TCID_{50} de virus. De nuevo, los animales infestados con el mutante no mostraron síntomas clínicos (Tabla 5, figura 4). Sólo un animal tuvo fiebre durante un día. No obstante, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y estaban protegidos frente a un enfrentamiento letal con VFPC. El enfrentamiento se efectuó de nuevo por infestación con 2 x 10^{5} TCID_{50} de la cepa Eystrup de enfrentamiento. Los animales no mostraron síntomas clínicos después del enfrentamiento, y la temperatura se mantuvo normal (figura 5). En contraposición con los cerdos infestados con el mutante de deleción, los animales inoculados con el virus de tipo salvaje rescatado desarrollaron una fiebre porcina clásica fatal. Un animal tuvo que ser sacrificado 11 días después de la infección y los otros dos 3 días más tarde. Todos los animales mostraron típicos síntomas de fiebre porcina clásica, es decir fiebre, diarrea, anorexia y síntomas patológicos similares a hemorragias en diferentes órganos, incluido el riñón.

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TABLA 5a Síntomas clínicos después de la infestación de ensayo

Experimento con animales 2
Anim.	infestado	síntomas clínicos
nº	con
		fiebre	diarrea	trastornos	anorexia	hemorragias	apatía	moribundo	hemorragias
				del SNC		en la piel		el día de la	en los
								eutanasia	órganos en
									la necropsia
nº 43	C-346-d	+*	-	-	-	-	-	-	n.a.
nº 47	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
nº 87	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
nº 27	C-346-	+	+	+	+	-	+	+	+
	d/RS
nº 28	C-346-	+	+	+	+	-	+	+	+
	d/RS
nº 30	C-346-	+	+	+	+	-	+	+	+
	d/RS
	*fiebre sólo durante 1 día

\newpage

Tabla 5a:

6 cochinillos (raza de cerdos alemana; aproximadamente 20 kg de peso corporal) en dos grupos (cada grupo se alojó por separado bajo condiciones de aislamiento) se incluyeron en el estudio. 3 animales se infestaron con C-346-d mutante (5·10^{4} TCID_{50}) y 3 animales con C-346-d/Rs (5·10^{4} TCID_{50}). C-346-d/Rs se derivó de C-346-d mutante reestableciendo la secuencia de tipo salvaje del gen E^{RNS}. Se registraron y resumieron la temperatura del recto y los síntomas clínicos; n.a.: no se efectuó ninguna necropsia.

TABLA 5b Ensayo de RNasa diagnóstico con virus recuperados de animales infestados durante la viremia

	Alfort	animal nº 3	animal nº 5	animal nº 27	animal nº 28	animal nº 30	Testigo
		C-297-K	C-297-K	C-346-d/RS	C-346-d/RS	C-346-d/RS
DO_{260}	1,84	0,60	0,56	1,84	1,93	1,94	0,49

Los virus recuperados de la sangre de los animales 3 y 5 en el día 5 después de la infección y los animales 27, 28 y 30 del experimento con animales nº 2 (descrito en el Ejemplo 5) el día 7 después de la infección se propagaron en cultivo tisular, se titularon y se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad de RNasa tal como se ha descrito antes. Como testigos servían células PK15 no infestadas y células (testigo) infestadas con VFPC (Alfort) de tipo salvaje. Los animales 3 y 5 habían sido infestados con C-297-K mutante, mientras que los animales 27, 28 y 30 habían sido infestados con C-346-d/RS mutante, tal como se indica en la tabla.

Ejemplo 6 Efectos de la doble mutación dentro de E^{RNS}

Para someter a ensayo los efectos de una doble mutación dentro de E^{RNS} sobre la capacidad del virus respectivo de replicarse en su hospedante natural y sobre la patogenicidad, se efectuó un experimento con animales con el mutante v(pA/C-297-L/346-L). Los virus recuperados a partir del clon de longitud completa de VFPC sin mutación (V(pA/VFPC)) servían como testigo positivo. Para cada mutante se utilizaron tres cochinillos (cría: raza de cerdo alemana; aproximadamente de 25 kg de peso corporal). La dosis de infección era 1 x 10^{5} TCID_{50} por animal; dos tercios del material inoculado se administraron por vía intranasal (un tercio en cada ventana de la nariz), un tercio por vía intramuscular. La sangre se tomó de los animales antes de la infección (día 0) y los días 5, 8, 12 y 20. Además, la temperatura se registró diariamente (figura 6). Los animales infestados con el doble mutante no desarrollaban ningún síntoma clínico y los animales nunca pararon de ingerir comida. Los animales no mostraron fiebre a lo largo de todo el período del experimento (animales 45/2 y 45/3), excepto el animal 45/1 el día 8, probablemente debido a la infección bacteriana provocada por lesión de la pata trasera derecha. Después del tratamiento de este animal con un antibiótico el día 10, la temperatura volvió a valores normales en el espacio de un día (figura 6). Para todos los animales el virus se recuperó de la sangre del día 5, mientras que no se detectó viremia en momentos posteriores (Tabla 6a). Todos los animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes (Tabla 6b). Para el animal 45/1, el título de neutralización se determinó de nuevo aproximadamente 4,5 meses después de la infección (d.i.) y se encontró que era 1:4374. Así, la infección con el doble mutante dio como resultado una memoria inmunológica de larga duración.

TABLA 6a Ensayo de viremia

Días d.i.	5	8	12
cerdo 45/I	+	-	-
cerdo 45/II	+	-	-
cerdo 45/III	+	-	-

TABLA 6b Títulos de neutralización

Animal	día 0	día 20 p.i.
45/1	-	1:128
45/2	-	1:256
45/3	-	1:256

Ejemplo 7 Inmunogenicidad y principio de atenuación del virus VDVB "B-346-d"

Este experimento se diseñó para investigar el principio de atenuación así como la inmunogenicidad del virus VDVB "B-346-d" recuperado a partir de pA/B-346-d comparándolo con el virus "B-WT" recuperado a partir de pA/VDVB/Ins-. El virus "B-346-d" está, naturalmente, mutado en la posición 349 del VDVB original pero se denomina "B-346" para indicar la posición con relación a la posición 346 de Alfort de VFPC de la figura 1.

Se seleccionaron tres grupos de animales VDVB seronegativos de 3-6 meses de edad. Los grupos 1 y 2 comprendían 5 animales cada uno, mientras que el grupo 3 comprendía 3 animales. Los animales de los grupos 1 y 2 se infestaron por administración de 2 x 10^{6} TCID_{50} de B-346 (grupo 1) o B-WT (grupo 2) en un volumen de 5 ml por vía de administración. Los animales se infestaron por vía intramuscular (músculo glúteo), por vía intranasal y por vía subcutánea (por encima de la escápula). A lo largo de un período de 14 días después de la infestación, la viremia en los dos grupos se vigiló mediante parámetros tales como viremia de las células de la sangre y derramamiento de los virus en bastoncillos para la nariz. Además, se vigilaron parámetros clínicos tales como las temperaturas del recto, los recuentos de leucocitos y parámetros de salud generales.

La inmunidad protectora frente a una infección con un material aislado de VDVB antigenéticamente heterólogo y virulento (nº 13) se investigó mediante infección de enfrentamiento 77 días después de la infección de los animales del grupo 1 con B-346-d. Los animales del grupo 3 servían como testigo de enfrentamiento y se infestaron de acuerdo con el proceso para los animales del grupo 1 con el material aislado de VDVB virulento. El virus VDVB (nº 13) pertenece a un grupo antigenético diferente (tipo II), mientras que el virus B-346-d pertenece al grupo antigenético (tipo I) de acuerdo con la clasificación descrita (por Pellerin, C. et al., 1994). Los animales de los grupos 1 y 3 quedaron infestados mediante la administración de 2 x 10^{6} TCID_{50} de material aislado de VDVB (nº 13) en un volumen de 5 ml por vía de administración. Los animales se infestaron a través de la vía intramuscular (músculo glúteo), intranasal y subcutánea (por encima de la escápula). A lo largo de un período de 14 días después de la infección, se vigiló la viremia en los dos grupos mediante parámetros tales como la viremia de las células de la sangre y el derramamiento de los virus en bastoncillos para la nariz. Además, se vigilaron parámetros clínicos tales como las temperaturas del recto, los recuentos de leucocitos y los parámetros de salud generales.

Después de la infección con B-346-d, los animales no mostraron ningún síntoma clínico típico de una infección por VDVB tal como un aumento de la temperatura del recto (Tabla 7a) o cualesquiera síntomas clínicos respiratorios (no mostrados).

La viremia reducida de las células de la sangre (Tabla 7b) y el derramamiento de los virus en bastoncillos para la nariz (Tabla 7c) indicaban claramente una atenuación de B-346-d en comparación con B-WT.

El material aislado de VDVB virulento nº 13 inducía en los animales del grupo 3 una fuerte viremia con síntomas típicos de una infección por VDVB, tal como un aumento de la temperatura del recto a lo largo de un período de varios días (Tabla 7d), fuerte leucopenia (Tabla 7e), una viremia de las células de la sangre extendida (Tabla 7f) y un derramamiento de los virus en el fluido de los bastoncillos para la nariz (Tabla 7g). En contraposición, los animales del grupo 1, que habían sido vacunados por infección con B-346-d, no mostraron casi ningún síntoma clínico típico para una infección por VDVB después de la infección de enfrentamiento con el material aislado de VDVB virulento nº 13. No existía ningún aumento significativo en las temperaturas del recto después de la infección (Tabla 7d). La leucopenia observada era muy marginal con respecto a la magnitud y duración (Tabla 7e). No se pudo aislar VDVB a partir de la sangre (Tabla 7f) y sólo para un animal se pudo detectar un derramamiento de los virus en el material exudado del bastoncillo para la nariz (Tabla 7g).

Por lo tanto, la infección con B-346-d induce una fuerte inmunidad que reduce claramente síntomas clínicos, derramamiento de los virus y viremia de las células de la sangre después de la infección por enfrentamiento con un material aislado de VDVB heterólogo.

TABLA 7a Temperaturas medias del recto en los grupos 1 (B-346-d) y 2 (B-WT)

Día de	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
estudio
Grupo 1	38,8	39,1	39,0	38,7	38,8	38,7	38,7	38,5	38,7	38,5	38,5	38,5	38,4	38,9	38,7
Grupo 2	38,8	39,0	38,9	38,6	38,6	38,7	38,6	38,4	39,1	38,4	38,7	38,6	38,7	38,6	38,6

Los animales del grupo 1 se infestaron el día 0 con 6 x 10^{6} TCID_{50} de B-346-d, mientras que los animales del grupo 2 se infestaron con 6x10^{6} TCID_{50} de B-WT.

TABLA 7b Viremia de las células de la sangre de los grupos 1 y 2

Grupo	Animal	Primer día de	Último día de	Duración registrada	Duración media del
		derramamiento	derramamiento	del derramamiento	grupo (días)
		nasal registrado	nasal registrado	nasal (días)
1	1	6	6	1	1,4
	2	4	6	2
	3	5	5	1
	4	-	-	0
	5	6	9	3
2	6	4	8	5	4,4
	7	4	7	4
	8	4	7	4
	9	4	7	4
	10	4	8	5

Se tomaron muestras de sangre EDTA diariamente hasta 10 días después de la infección con B-346-d y B-WT, respectivamente. Se añadieron 0,2 ml de sangre a cada uno de 3 cultivos de células de testículos de ternero (Cte) en medio que contenía heparina (1 unidad/ml para evitar la formación de coágulos). Después de una incubación durante una noche, el inóculo/medio se reemplazó por medio de reciente aportación sin heparina. Después de la incubación durante 4 a 6 días, las células infestadas con VDVB se detectaron por inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para VDVB. Los cultivos negativos se congelaron y subsiguientemente se descongelaron. 0,2 ml de los mismos se hicieron pasar a un segundo paso sobre células Cte para confirmar la ausencia de VDVB.

TABLA 7c Derramamiento del virus en el fluido nasal

Grupo	Animal	Primer día de	Último día de	Número de días de	Número medio de
		derramamiento	derramamiento	virus detectado en	días de virus
		nasal registrado	nasal registrado	el material exudado	detectado por grupo
1	1	4	8	4	2,6
	2	6	6	1
	3	4	4	1
	4	5	7	3
	5	3	6	4
2	6	6	8	3	3,6
	7	5	7	3
	8	5	8	4
	9	5	6	2
	10	3	9	6

El material exudado nasal se centrifugó (1000 g) para separar los desechos toscos y los contaminantes. El fluido sobrenadante se retiró y 0,2 ml se sembraron en cada uno de tres cultivos de células. Después de incubación durante una noche, el inóculo/medio se reemplazó por 2 ml de medio de reciente aportación. Después de incubación durante 4-6 días, las células infestadas con VDVB se detectaron por inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para VDVB.

TABLA 7d Temperaturas medias del recto en los grupos 1 y 3

Día de	-2	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
estudio
Grupo 1	38,4	38,6	38,5	38,5	38,6	38,4	38,4	38,3	38,4	38,4	38,4	38,4	38,4	38,4	38,5
Grupo 3	38,8	39,1	38,8	39,1	39,4	39,7	40,2	40,2	40,4	41,3	40,2	40,1	40,2	40,8	40,4

Las temperaturas del recto se registraron hasta 16 días después de la infección de enfrentamiento. Los animales de los grupos 1 y 3 se infestaron mediante 6 x 10^{6} TCID_{50} del material aislado de VDVB virulento nº 13.

TABLA 7e Recuento medio de leucocitos

Día de	-2	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
estudio
Grupo 1	11,9	11,9	11,3	10,8	9,2	8,2	8,9	9,9	11,2	11,6	11,6	10,6	10,8	10,8	9,4
Grupo 3	11,7	15,8	13,8	11,1	7,7	9,8	7,4	6,8	7,5	8,7	7,0	8,1	6,2	6,4	6,2

Muestras de células de sangre EDTA se tomaron diariamente desde los días -2 a 14 después del enfrentamiento de cada animal en los dos grupos. Los recuentos de leucocitos en muestras de sangre EDTA se determinaron utilizando un contador de microcélulas Sysmex F800.

TABLA 7f VDVB aislado de muestras de sangre

Grupo	Animal	Primer día de virus	Último día de virus	Duración registrada de	Duración
		detectado en la sangre	detectado en la sangre	virus en la sangre (días)	media (días)
1	1	-	-	0	0
	2	-	-	0
	3	-	-	0
	4	-	-	0
	5	-	-	0
3	11	3	10	8	9,7
	12	3	14	12
	13	3	9	9

Se tomaron muestras de sangre EDTA diariamente hasta 10 días después del enfrentamiento. 0,2 ml de sangre se añadieron a cada uno de 3 cultivos de células de testículos de ternero (Cte) con medio que contenía heparina (1 unidad/ml para evitar la formación de coágulos). Después de incubación durante una noche, el inóculo/medio se reemplazó por medio de reciente aportación sin heparina. Después de la incubación durante 4 a 6 días, células infestadas con VDVB se detectaron por inmunofluorescencia con un suero policlonal específico para VDVB.

Los cultivos negativos se congelaron y subsiguientemente se descongelaron. 0,2 ml de los mismos se hicieron pasar a un segundo paso sobre células Cte para confirmar la ausencia de VDVB.

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TABLA 7g Derramamiento de virus en el fluido nasal

Grupo	Animal	Primer día de	Último día de	Duración registrada	Duración media
		derramamiento	derramamiento	de derramamiento	(días, por grupo)
		nasal registrado	nasal registrado	nasal (días)
1	1	3	4	2	0,8
	2	-	-	0
	3	-	-	0
	4	-	-	0
	5	4	5	2
3	11	3	14	12	10
	12	3	14	12
	13	3	8	6

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El material exudado nasal se centrifugó (1000 g) para separar los desechos toscos y los contaminantes. El fluido sobrenadante se separó y 0,2 ml del mismo se sembraron en cada uno de tres cultivos de células. Después de incubación durante una noche, el inóculo/medio se reemplazó por 2 ml de medio de reciente aportación. Después de la incubación durante 4-6 días, células infestadas con VDVB se detectaron mediante inmunofluorescencia con suero policlonal específico para VDVB.

Ejemplo 8 Discriminación entre C-346-d y VFPC sin deleción del codón 346 de histidina por RT-PCR

La secuencia de ARN que codifica el motivo de RNasa conservado en la glicoproteína E^{RNS} de VFPC está muy conservada. Entre todas las secuencias de VFPC conocidas, no se encontraron intercambios de nucleótidos en la región correspondiente a los residuos 1387 a 1416 de la secuencia publicada de la cepa Alfort de VFPC (Meyers et al., 1987). Así, los cebadores de oligonucleótidos derivados de esta región conservada del genoma se pueden utilizar en un ensayo de RT-PCR para la detección de todos los materiales aislados de VFPC (véase la figura 7). En consecuencia, se pudo detectar la ausencia del triplete que codifica la histidina 346 (nucleótidos 1399-1401) mediante un ensayo de RT-PCR con un cebador apropiadamente diseñado. Se sintetizaron diferentes oligonucleótidos que cubrían la región conservada que contenían el codón histidina o no lo contenían. Estos oligonucleótidos servían como cebadores dispuestos más arriba en reacciones de RT-PCR con el oligonucleótido E^{RNS}-Stop como cebador situado más abajo. El ARN purificado a partir de células del cultivo tisular infestadas con C-346-d, C-WT, C-346-L o C-346-K, respectivamente, se utilizaron como moldes. La transcripción inversa de 2 \mug de ARN desnaturalizado por calor (2 min 92ºC, 5 min en hielo en 11,5 \mul de agua en presencia de 30 pmol de cebador inverso) se efectuó después de la adición de 8 \mul de mezcla de RT (Tris/HCl 125 mM pH 8,3, KCl 182,5 mM, MgCl_{2} 7,5 mM, ditiotreitol 25 mM, 1,25 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U de RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Alemania) y 50 U de Super-script (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Alemania) durante 45 min a 37ºC. Después de finalizar la transcripción inversa, los tubos se colocaron sobre hielo y se añadieron 30 \mul de mezcla de PCR (Tris/HCl 8,3 mM pH 8,3; KCl 33,3 mM, MgCl_{2} 2,2 mM; 0,42 mM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0,17% de TritonX100; 0,03% de albúmina de suero bovino; 5 U de Taq polimerasa (Appligene, Heidelberg, Alemania) y 16,7% de DMSO). Cuando se utilizó el cebador OI H+3, la mezcla de reacción para la amplificación no contenía DMSO. La amplificación se llevó a cabo en 36 ciclos (30 s 94ºC; 30 s 57ºC; 45 s 74ºC). 1 \mul de la reacción de amplificación se cargó sobre un gel de agarosa al 1%, los productos amplificados se separaron por electroforesis y se tiñeron con bromuro de etidio. Tal como se demuestra en la figura 7, el par de cebadores OI H-3/OI E^{ms}Stop permitía amplificar específicamente una banda derivada de ARN que contenía la deleción del codón 346, mientras que los otros dos productos de combinaciones de cebadores que contenían el codón 346 se amplificaron y no se observó ninguna banda cuando el ARN con la deleción de este codón se utilizó como molde.

Cebadores para RT-PCR

Situados más arriba:

OI H-3:: TGGAACAAAGGATGGTGT

OI H+2:: TGGAACAAACATGGATGG

OI H+3:: GAATGGAACAACAAACATGGA

Situados más abajo:

OI E^{ms}Stop:: GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG

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Leyendas de las figuras

Figura 1

Los primeros 495 aminoácidos, según son expresados por la cepa Alfort de VFPC

El listado de la secuencia muestra los primeros 495 aminoácidos, según son expresados por la cepa Alfort de VFPC (Meyers et al., 1989). Un monómero de la glicoproteína E^{RNS} de dicha cepa corresponde a los aminoácidos 268 a 494, según se describe por Rümenapf et al. (1993). Los residuos 295 a 307 y 338 a 357 que representan las regiones que muestran homología con RNasas de plantas y hongos (Schneider et al., 1993) están subrayados.

Figura 2

Curva de la temperatura del recto de animales después de la infección de ensayo

La temperatura del recto se registró diariamente a partir del día 2 antes hasta el día 18 después de la infección. La curva de la temperatura del recto está detallada para cada animal del grupo infestado con el virus V(pA/VFPC) (línea continua) derivado a partir del plásmido pA/VFPC o con el virus V(pA/C-346-d) derivado a partir del plásmido pA/C-346-d (línea discontinua).

Figura 3

Curva de temperatura del recto de animales después de la infección por enfrentamiento

La temperatura del recto se registró diariamente los días 1-21 después de la infección con virus de enfrentamiento. Los animales a los que se había enfrentado con una dosis letal de cepa de enfrentamiento Eystrup de VFPC habían sido infestados con el mutante C-346-d[V(pA/C-346-d)] 69 días antes, según se detalla en el texto. La curva de la temperatura del recto se detalla para cada animal del grupo enfrentado con 2 x 10^{5} TCID_{50} procedentes de la cepa de enfrentamiento Eystrup de VFPC.

Figura 4

La temperatura del recto se registró diariamente los días 0-18 después de la infección. La curva de la temperatura del recto se detalla para cada animal de los dos grupos infestados con C-346-d[V(pA/C-346-d)] (línea discontinua) o con el virus reestablecido C-346-d/RS[V(pA/C-346-d/RS)] (línea continua).

Figura 5

Temperatura del recto después de la infección de enfrentamiento en el experimento con animales nº 2

La temperatura del recto se registró diariamente los días 1-10 después de la infección con virus de enfrentamiento. Los animales enfrentados con una dosis letal (2 x 10^{5} TCID_{50}) de la cepa de enfrentamiento Eystrup de VFPC habían sido infestados con el mutante C-346-d 37 días antes.

Figura 6

Temperatura del recto de animales tratados con un doble mutante de acuerdo con el Ejemplo 6

La temperatura del recto se registró diariamente antes y después de la infección con virus de enfrentamiento con el mutante V(pA/C-297-L/346-L).

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Figura 7

Discriminación entre C-346-d y VFPC sin deleción del codón 346 de la histidina mediante RT-PCR de acuerdo con el Ejemplo 8

a): El par de cebadores OI H-3/OI E^{MS}Stop permite amplificar específicamente una banda derivada de ARN que contiene la deleción del codón 346 (C-346-d) según se describe en detalle en el Ejemplo 8. En contraposición, el ARN que no contiene dicha deleción no interactúa con dicho par de cebadores (C-WT, C-346-L, C-346-K).

b): y c) Las otras dos combinaciones de cebadores (OI H+2 y OI H+3) amplifican bandas derivadas de ARN que no contiene la deleción del codón 346 (OI H+2 y OI H+3). No se pudo observar ninguna banda cuando como molde se utiliza ARN procedente del mutante de deleción de 346 C-346-d.

<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

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<120> Pestivirus atenuados

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<130> 1-1039 A

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<140> 02003407.0

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<141> 14-02-2002

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<150> 02003407.0

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<151> 14-02-2002

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<160> 28

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggagcttac ttgggatctg

\hfill

20

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaacaaact tggatggtgt

\hfill

20

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<210> 3

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 3

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acaggagctt aaaagggatc tggc

\hfill

24

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<210> 4

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 4

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atggaacaaa aagggatggt gtaa

\hfill

24

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<210> 5

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 5

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gaatggaaca aaggatggtg taac

\hfill

24

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<210> 6

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 6

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catgaatgga acaaaggttg gtgcaactgg

\hfill

30

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<210> 7

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 7

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5

6

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<210> 8

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<211> 492

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 8

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7

8

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<210> 9

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<211> 494

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 9

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9

10

11

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<210> 10

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 10

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12

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<210> 11

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<211> 495

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 11

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14

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<210> 12

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 12

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16

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<210> 13

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 13

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19

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 14

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21

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<400> 15

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23

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25

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<212> PRT

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36

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 23

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40

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<210> 24

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 24

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43

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<210> 25

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 25

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<210> 26

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VDVB

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<400> 26

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<210> 27

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VDVB

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<400> 27

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<210> 28

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial : mutante de VFPC

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<400> 28

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51

52

Claims

1. Pestivirus atenuado, en el que la actividad de RNasa que reside en la glicoproteína E^{RNS} está inactivada por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, en donde dicha actividad de RNasa está inactivada por deleciones y/o mutaciones situadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de dicha glicoproteína no sean lisina.

2. El pestivirus de la reivindicación 1, en el que dicha actividad de RNasa está inactivada por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

3. El pestivirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha actividad de RNasa está inactivada por deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

4. El pestivirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha actividad de RNasa está inactivada por mutación del residuo histidina en las posiciones 297 y 346 con respecto a leucina, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

5. Un pestivirus de VDVB de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha actividad de RNasa está inactivada por deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas de VDVB, de dicha glicoproteína.

6. Un pestivirus de VDVB de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 ó 4, en el que dicha actividad de RNasa está inactivada por la mutación del residuo histidina en las posiciones 297 y 346 con respecto a leucina, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas de VDVB, de dicha glicoproteína.

7. Un ácido nucleico que codifica una glicoproteína E^{RNS} según se describe en la reivindicación 1, en el que la actividad de RNasa en dicha glicoproteína se inactiva por deleciones y/o mutaciones de al menos un aminoácido de dicha glicoproteína, en donde dicha actividad de RNasa se inactiva por deleciones y/o mutaciones que están situadas en los aminoácidos en las posiciones 295 a 307 y/o en las posiciones 338 a 357, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 297 y/ó 346 de dicha glicoproteína no sean lisina.

8. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha actividad de RNasa se inactiva por deleción o mutación del aminoácido en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

9. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha actividad de RNasa se inactiva por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

10. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha actividad de RNasa se inactiva por la mutación del residuo histidina en las posiciones 297 y 346 con respecto a leucina, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

11. Un ácido nucleico de VDVB de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha actividad de RNasa se inactiva por la deleción del residuo histidina en la posición 346, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas de VDVB, de dicha glicoproteína.

12. Un ácido nucleico de VDVB de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8 ó 10, en el que dicha actividad de RNasa se inactiva por la mutación del residuo histidina en las posiciones 297 y 346 con respecto a leucina, según se describe en la figura 1 para la cepa Alfort de VFPC de una manera ejemplar o correspondiente a la misma en otras cepas, de dicha glicoproteína.

13. Uso de ácidos nucleicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 para preparar vacunas de nucleótidos y/o vectores.

14. Una composición farmacéutica que comprende un pestivirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y/o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7a 12.

15. Uso de un pestivirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7a 12. para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por pestivirus en animales.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque a un animal que necesita dicha profilaxis o tratamiento se le administra dicha composición farmacéutica.

17. Uso de un pestivirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7a 12. para la preparación de una vacuna o una composición farmacéutica.