HU228469B1 - Attenuated pestiviruses, their use, and nuclein acids for their production - Google Patents

Attenuated pestiviruses, their use, and nuclein acids for their production Download PDF

Info

Publication number
HU228469B1
HU228469B1 HU1200536A HUP1200536A HU228469B1 HU 228469 B1 HU228469 B1 HU 228469B1 HU 1200536 A HU1200536 A HU 1200536A HU P1200536 A HUP1200536 A HU P1200536A HU 228469 B1 HU228469 B1 HU 228469B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lys
thr
glycoprotein
arg
csfv
Prior art date
Application number
HU1200536A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregor Meyers
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmed filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmed
Publication of HU228469B1 publication Critical patent/HU228469B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Legyengített pesövírusek, nuklemsavak előállításukhoz és alkalmazásuk
A találmány torüfefo
A találmány tárgyát. a glikoprotein-ERNS-ben lévő ribonukleáz-aktivitás (R.^.áz-aktivitás). inaktiválásával legyengített pestivírusok, ilyen pestivírusok előállítására szolgáló nu kiéin savak, a találmány szerinti legyengített pestivírusokat tartalmazó vakcinák és gyógyszerkészítmények képezik. Továbbá a találmány szerinti legyengített vírusok és patogén vírusok megkülönböztetésére szolgáló eljárásokat közlünk.
Á találmány háttere
A pestivírusok gazdaságilag jelentős, állatokban világszerte sok országban előforduló betegségek kórokozó ágensei, Jelenleg ismert vírusízolátumokat· három különböző fajba csoportosítjuk, amelyek együtt egy nemzetséget alkotnak, a Flaviviríd&e-c saladban.
I. Marhában előforduló hasmenés (diarrhoea) vírusa (BVDV) marhában vírusos hasmenést (BVD) és nyálkabetegséget (MD| okoz (Baker, d. Ara. Vet. Med. Assoc, 190, 1449-1458 (1.987); Moennig és Plagemann, Adv. Vírus Rés. 41, 53-91 (19921; Thiel et al, The Pestiviruses”, “Fíelds Virology” e. könyvben, szerk. Fíelds, Β. N. et at, Líppincott-Raven, Philadelphia,
1059-1073, old. (1996)).
II. Klasszikus sertésláz vírusa (CSFVf, melyet korábban sertéskolera-vírusnak Is neveztek, felelős a klasszikus sertéslázért (CSF) vagy sertéskoleráért (HC) {Moennig és Plagemann, Adv. Vírus Rés. 41, 53-91 (1992); Thiel et al., The Pestiviruses”, “Fíelds Virology” c. könyvben, szerk. Fíelds, Β. M. el at, Lippineott-Raven, Philadelphia, 1059-1073. old. (1996)1, ílk Border-betegség vírusa (8DV}? amely tipikusan sertésben fordul elő, és border-betegséget (BD) okoz. A szímptómák hasonlóak a marhában előforduló MD-hez. és leírták annak előfordulását bárányok méhében fellépő BDV-fertőzés után (Moennig és Plagemann, Adv. Vírus· Rés. 41, 53-91 (1992); Thiel et al, “The Pestiviruses”, “Fields Virology* c. könyvben, szerk, Fields, Β. N. et ah, Uppincott-Raven, Philadelphia, 1059-1073. old. (1996)).
Becher és munkatársai (Virology 209, :200-206 (1995)): vagy .mások létrehozták a pestivírusok egy alternatív osztályozását.
A pestivirusok kisméretű, becsomagolt vírusok, amelyek egyszálú. pozitív polaritást! RNS-genomot tartalmaznak, amelyből hiányzik az 55~végí cap-szekvencia és 3’-végi poli(A)-szekvencia. A vírusgénem körülbelül 4000 amínosavből álló polifehérjét kódol, a végső hasítási termékek ko- és poszttranszlációs processzálás útján, jönnek, létre cellulárís és vírusproteázok közreműködésével. A vírusfehérjék. políféhégébe rendeződnek az alábbi sorrendben: NH2-NPro-C-E^s-BÍ -E2-p7~-NS2-bS3-NS4A-HS4B-KS5-NS5B-COOH (Bice, “The Pestiviruses*, “Fields Virology” e. könyvben, szerk. Fields, Β. N. et -al., Lippincoít~Raver.i, Philadelphia, 931-959. old. (1996)), Protein-Ü és az ERNS-, Elés E2-glikoproteínek alkotják a pestivírus-virion strukturális komponenseit. fThiei et al., J, Virol. 65, 4705-4712 (1991)). Azt találták, hogy E2 és kisebb mértékben ERNS képezi az antitest-semlegesítés célpontjait (Donis et. at, J, Gén. Virol. 69, 77-86 (1998); Faion et ah, Virology 190, 763-772 (1992): van Rijn et al, d. Gén. Virol. 74, 2053-2060 (1993); Welland et al, J. Virology 64, 3563-3569 (1990); Weiland et al, >J. Virology 66, 3677-3682 (.1992)1. Az BRNSbői hiányzik a membrán-horgony, és jelentős mennyiségben szekretálódík a fertőzött sejtekből; leírták, hogy ez a fehérje RNáz-aktivitással rendelkezik [Huist et al, Virology 200, 558-565 (1994); Schneider et al, Science 261, 1169-1171 (1993); Windisch et al, J. Virol. 70, 352-358 (1996)). Ezen enzimaktivitás funkciója a vírálís életciklusban jelenleg ismeretlen. CSFV-vakcínatörzs esetén leírták az RNáz-aknvítás kísérleti megszüntetéséi, helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával, amely citopatogén vírust eredményezett, amelynek növekedési tulajdonságai sejttenyészetben, megegyeztek a vad típusú vírussal (Hulst et al. J, Virol. 72, 151-157 (1998)). Az enzimaktivitás két aminosav-szakasz jelenlététől függ, amelyek konzervatívak pesiívírus-ER^~-ben és különböző ismert növényi és gombaeredetű ENázokban, Az említett mindkét
i.
konzervatív szekvencia, egy hisztidint tartalmaz fSchneíder et at, Science 26 L 1169-071 (1993Π. A CSFV-vakcinaíörzsböl származó ERNS~fehéijében ezen aminosav cseréje lizinre az RNáz-aktivitás megszűnését eredményezi (Hulst eí al, 3. Virol, 72, 151-157 (19981). Ilyen mutációk bevitele a CSFV-vakcinatörzs genonfiáha nem. befolyásolta a vírus életképességét vagy növekedési tulajdonságait, viszont olyan vírushoz vezetett, amely enyhén citopatogén fenotípust mutatott [Hulst et al., d, Virol. 72, 151-157 (1998)1,
Előállítottak legyengített vagy elpusztított vírusokat, vagy heterológ: expressziös rendszerben expresszált vírusfehérjéket tartalmazó vakcinákat CSFV-re és BVDV-re, és jelenleg ezeket alkalmazzák. Elő vakcinaként alkalmazott, említett vírusok legyengítésének strukturális alapja nem ismert. Ez előre nem látható visszafejlődések kockázatához vezet a vakdnálást kővető reverz mutáció vagy rekombináció által. Másrészt ínaktivált vakcinák vagy heterológ expresszált vírusfehérjék iaiegységvakeínákj hatékonysága immunitás índukálására inkább alacsony.
Legyengítés alapjaként definiált mutációkat tartalmazó, élő vakcinák általában lehetővé tennék a jelenleg alkalmazott vakcina-generáció hátrányainak kiküszöbölését. Pestívírusokban jelenleg nem állnak rendelkezésre potenciális célpontok gyengítő mutációkra.
Az említett gyengítő mutációk további előnye molekuláris egyediségükben van, amely lehetővé teszi azok alkalmazását megkülönböztethető jelölőként gyengített pestívírusokban, valamint lehetővé teszi azok. megkülönböztetését a természetes körülmények, között, található pestivírusoktóL
Pestivírus-fertözések hatékony és biztonságos valamint detektálható profilaxisának és kezelésének jelentősége miatt határozott igény van élő és specifikusan legyengített vakcinákra, amelyek nagy hatékonysággal képesek immunitást indukálni, valamint igény van definiált alapon létrehozott gyengítésre, amelyet továbbá meg lehet különböztetni patogén pestiviru soktól.
Tehát a találmány szerinti megoldás alapját képező technikai problémát specifikusan legyengített és detektálhatőan jelölt pestivirusok előállítása jelen
X- 4 'i ti immunitást nagy hatékonysággal indukálni képes, élő, legyengített vakcinaként való alkalmazásra, amelyeket, ezen. eljárás eredményeként továbbá meg lehet különböztetni természetes körülmények között előforduló, paíogén pestivírusoktól.
Λ fofo/mány /e/rása
A fenti technikai problémát a leírás és a találmány szabadalmi igénypontokban körülírt, előnyös megvalósítási módjai szerint oldjuk meg.
Meglepd módon azt találtuk, hogy pestivirusokat specifikusan le lehet gyengíteni glikoproteín~BRNS~ben lévő ribonukleáz-aktivitás inaktiválásával..
A legyengített pestivírusok most már nagy hatékonyságú immunogenítást biztosító, élő vakcinaként alkalmazhatók.
Ezért, további vonatkozásban közlünk itt egy pestivírust tartalmazó olyan élő vakcinát, amelyben a gIíkoprotein-E'RNS-ben lévő RNáz-aktivitás inaktiválva van.
A „vakcina* kifejezés a leírásban olyan gyógyszerkészítményre utal, amely legalább egy, immunolögiailag aktív komponenst tartalmaz, amely immunválaszt képes indukálni, és lehetőség szerint, de nem szükségszerűen tartalmaz egy vagy több további komponenst, amely az aktív komponens immunológiai aktivitását képes fokozni. A vakcina tartalmazhat gyógyszerkészítményekben tipikusan alkalmazható, további komponenseket. Egy vakcina immunológiaílag aktív komponense tartalmazhat élő szervezeteket eredeti formájukban vagy gyengített szervezet formájában, úgynevezett módosított élő vakcinaként (MbV), vagy olyan szervezetek formájában, melyek megfelelő módszerekkel ináktiválva vannak, úgynevezett elölt vakcinaként (KV), Egy vakcina immunolögiailag aktív komponensének másik formája tartalmazhat a szervezetből származó megfelelő elemeket -{alegységvakcinák), amely -elemekhez egyrészt a teljes szervezet elpusztításával juthatunk, vagy ilyen szervezetek tenyészetben való növesztésével és azt követő tisztításával, amely a kívánt struktúra(ka)t eredményezi, vagy szintetikus eljárással, alkalmas rendszer, például baktériumok, rovarok, emlősök vagy más fajok megfelelő manipulálásával,
♦ ♦ ezt követően izolálást és tisztítási eljárásokkal, vagy ilyen szintetikus eljárások indukáiásával az Ilyen vakcinára szoruló állatban ügy, hogy alkalmas gyógyszerkészítményeket alkalmazunk genetikai anyag közvetlen bevitelére {polínukleotid-vakeínáció}. Egy vakcina tartalmazhat egy vagy egyidejűleg egynél több, fentebb leirt elemet..
További, immunválaszt fokozni képes komponenseket együttesen adjuvánsoknak hívjuk, például alumíníum-hidroxid., ásványi és egyéb olajok, vagy a vakcinához adagolt járulékos molekulák, vagy ilyen további komponensekkel előidézett, megfelelő indukálás után a test által termelt járulékos molekulák, például interferonok, interleukinek vagy növekedési faktorok.
A „gyógyszerkészítmény” lényegében egy vagy több olyan alkotórészből áll, amelyek képesek annak a szervezetnek a fiziológiai, -például immunológiai funkcióit módosítani, amelynek beadjuk, vagy amely szervezetben él vagy felszínén van, például antibiotikumok vagy antiparazitíkumok, valamint más hozzáadott alkotórészből áll abból a célból, hogy bizonyos más célokat elérjünk, például egyedi jellegzetességek kezelése, sterilitás, stabilitás, a készítmény beadhatósága enteráiis vagy parenteráüs utakon, például orálisan, intranazálisan, intravénásán, intramuszkulárisan, szubkur.án, intradermálisan vágj’ más alkalmas úton, tolerancia a beadás után, szabályozott felszabadulást biztosító- tulajdonságok.
Áz itt közölt vakcina olyan fentebb definiált vakcina, amelyben egy vagy több, immunologiailag: aktív komponens pestivírus vagy pestivirus·-eredetű.
Az „élő vakcina” kifejezés olyan vakcinára utal, amely élő, különösen vírálís élő aktív komponenst tartalmaz.
A .„pestivírus’’ kifejezés a leírásban valamennyi pestivírusra utal, melyeket az jellemez, hogy ugyanahhoz a nemzetséghez tartoznak, mint BVDV, CSFV és BDV a Flaviviridae-családban, és glíkoprotein-ERNS-t expresszálnak. Természetesen a kifejezésen értünk minden olyan pestivírust, melyet Becher és munkatársai {Virology 209, 200-206 (1995)j vagy mások jellemeztek, és amelyek glikoprotein-ERNS~t expresszálnak. Az „RNáz-aktivitás” kifejezés a le6
írásban azt jelenti, hogy a glíkoprotein~ERN's RNS-t képes hidrolizálni.
Meg kell jegyeznünk, hogy a glikoprotein-EO gyakran szerepel közleményekben glikoprotein-ERNS szmorúmájakén t.
A „glíkoproteínben lévő RNáz-aktivitás inaktiválása” kifejezés arra utal, hogy módosított glikoprotem-ERNS nem képes, vagy a módosítatlan glikoproíein-ERNS vad típusához viszonyítva csökkent mértékben képes RNS-t hidrolízálni.
Glikoprotein~E'RNS~ben. lévő RNáz-aktivitás inaktiválása elérhető a glikoproteinben lévő legalább égy aminosav deléciójával és/vagy mutációjával, amint azt a leírásban bemutatjuk, valamint Hulst és munkatársai kJ. Virok 72, 151-157 (1998)] leírták. Ennélfogva egy előnyös megvalósítási módként olyan élő vakcinákat közlünk, amelyekben, a ghkoproteín-ERRS-ben lévő RNáz-aktívítás a giíkoproieinhen lévő legalább egy aminosav deléciójával és/vagy mutációjával inaktiválva van.
Kimutattuk,, hogy a gIikoprotein-ERNö körülbelül 97 kD méretű, díszülfid-kötéssel kapcsolódó homodimer, amelyben az egyes monomerek 227 aminosavból állnak, ami megfelel a CSFV-polifehérje 268-494. aminosavainak a Rümenapf és munkatársai által leírtak szerint ÍJ. Vírol. 67. 3288-3294 (1993)], Az l. ábrán csak hivatkozás céljából, bemutatjuk az első 495 aminosavat, ahogyan a CSFV-Alfort-törzs expresszálja. A CSFV Alfort-törzsének .genomi szekvenciája rendelkezésre áll a GenB&nk/EMBL-könyvtárban, JÖ4358. nyilvántartási számon; ezzel párhuzamosan a CP7 -BVDV- törzs aminosav-szekvenciája elérhető a GenBank/EMBL-konyvtárban (U63479, nyilvántartási számon). A glíköprotein~ERNS~hen két amino sav-régió nagymértékben konzervatív, valamint néhány növényi és gomhaeredetü. RNáz-aktivitást mutató fehérjében is [Schneider et al., Science 261, 1169-1171 (1993)1, Ez a két régió különösen jelentős az RNáz enzimaktivitáshoz, Az első régió a. vírus-polifehérjéhen lévő, 295-307. helyzetben lévő aminosavakból áll, a második régió pedig a 338-357, aminosavakból áll, ahogyan az 1, ábrán CSFV-Aiforttörzsre bemutatjuk (számozás a CSFV-Alfort-törzs közölt, levezetett aminosav-szekvenciája szerint történt; Meyers et al., Virology 17 L 555-567 (1989)1, Az
Φ* φ ♦ *
RNáz-aktivitáshoz különösen jelentős, fentebb említett aminosavak semmiképpen nem korlátozódnak a CSFV-Aifort-torzs esetén definiált pontos helyzetre, egyszerűen szemléltetés céljából mutattuk be ebben a helyzetben vágymás törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő, előnyös aminosavakat, ahogyan BVDV-ben, BDV-ben is és általában pestivirusokban megtalálhatók, mivel általában ezek nagymértékben konzervatívak. CSFV-Alfort-törzstőI különböző pestívírusokra az előnyös aminosavak számozása gyakran eltér, de a pestivírusok molekuláris biológiája területen jártas szakember könnyen képes azonosítani ezeket az előnyös aminosavakat a giikoprotein nagymértékben konzervatív aminosavaihoz viszonyított helyzetük alapján. Ez adott példában, a CSFV-Alfort 346. helyzete megegyezik a BVDV-pp7-törzs 349; helyzetével.
Következésképpen egy előnyben részesített megvalósítási módként itt egy olyan vakcinát köziünk, amelyben az ínaktlválö deléeiók és/vagy mutációk a giikoprotein például az !. ábrán CSPV-AIfort-torzsre leírt 295-3Ö7. helyzetében és/vagy 338-357. helyzetében lévő amino savaknál, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosavaknál vannak.
Egy nagyon előnyös megvalósításként közöljük itt, hogy az RNáz-aktívításnak a giikoprotein 346, aminosav-helyzetében delécióval vagy mutációval előidézett inaktiválása különösen hasznos élő vakcinákhoz vezet. Ezért a. találmány tárgyát képezik a. találmány szerinti olyan vakcinák, amelyekben az RNáz-aktivítás a giikoprotein például az 1. ábrán CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciójával vagy mutációjával van inaktiváiva.
A találmány szerinti megoldásban bemutatjuk., hogy pestivírusok életképesek és RNáz-aktívitással nem rendelkező E^Meheijét kódolnak, ha a vitális noüfehérje 346. helyzetében lévő hisztidint deletáljuk [számozás a CSFV-Alfort/Tübingen-törzs közölt, levezetett aminosav-szekvsnciája szerint történt: Meyers et al,, Viroiogy 171, 555-567 (.1989)1, amely hísztidin megfelel az BRNS-RNáz egyik konzervatív, feltételezett aktív helyének, A találmány sze rinti megoldásban bemutatjuk, hogy BVD-pestivírus-ban lévő ERNS-ben a meg··
felelő hisztídin (349. helyzet, a számozás a G-enBank/EMBL-könyvtárban lévő BVBV-CP7 szekvenciája szerint történt, nyilvántartási száma: U634791 déléciöja olyan életképes vírust eredményez, amelyben az ERNS-gíikoprotein elvesztette az RNáz-áktivitását. Egyik aminosavat másikra változtató pontmutációkkal szemben egy deiéciős mutáns általában sokkal stabilabb visszaaiakulás tekintetében. Sertések fertőzése patogén, ezen deléciőt tartalmazó ERN:S-t expresszáló CSEV-Alfort/Túbíngen-mutánssal nem vezet lázhoz vagy más, CSFV-fertőzésekre tipikus- klinikai jelekhez, .míg vad típusú vírusfertőzés lázat, hasmenést, anorexiát., apátiát, B-sejtek kimerülését -és a központi idegrendszer rendellenességeit eredményezi. Ezeket a sertéseket haldokló állapotban elpusztítottuk, amikor súlyos vérzések voltak a bőrben és belső szervekben a fertőzés utáni 14. napon, A mutánssal fertőzött sertések nem mutattak sem virémiát, sem B-sejt-kimerülésí, a fertőzés utáni 3., 5., 7., 10. és 1.4. napon, míg CSFV~t könnyen lehetett izolálni a vad típusú vírussal oltott sertésekből származó vérmintákból. A delécíós mutáns látszólag replíkálődott az állatokban, melyet semlegesítő antitestek indukálődása jelzett (lásd 3. példát, 3<e táblázatot). A mutáns vírusra adott immunválasz kielégítő volt. ahhoz, hogy lehetővé tegyen túlélést nagymértékben patogén CSFV-Eystrup-törzs ikonig, “Vírus dér klassisehen Sehweinepest; üntersuchungen zűr Pathogenese und zűr Induktion eíner protektiven ImmunarÁwort. Díssertation, Tíerárztliehe Hochschul-e Hannover, Németország (19941] 2 x lö's TClDso letális fertőzése esetén, amely törzs heterolog az Alfort-törzsre nézve. Továbbá a tesztelt állatok nem mutattak tipikus CSFV-fertőzésre utaló jeleket, például lázat, hasmenést, vérzéseket, B-sejt-kímerúlést vagy anorexiát a fertőzés után. Ezek az adatok alátámasztják azt, hogy sertések fertőzése a delécíós mutánssal olyan immunválaszt indukál, amely elegendő súlyos fertőzéssel szembeni védelemre.
Ennélfogva legelőnyösebb megvalósítási módként itt olyan vakcinákat közlünk, amelyekben az RN az-aktivitás a glíkoproteinnek például az 1, ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hísztidin deléciójával van ínskdváiva.
Egy további legelőnyösebb megvalósítási módként közlünk itt olyan BVDV-vakeinákat, amelyekben az RNáa:-aktivitás a glikoproteín például az 1, ábrán CSFV-vMfort--törzsre leírt 346, helyzetében, vagy más BVDV- törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin. deléclőjával van inaktiválva.
A találmány tárgyát, olyan legyengített pestivírusok képezik, amelyekben a gbkoprotein~ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás a glíkoproteí nben léve legalább egy ammosav delécíójával és/vagy mutációjával inaktiválva van azzal a kikötéssel, hogy a. glikoproteín például az 1. ábrán CSFV-Ákőrt-törzsre leírt 297. és/vagy 346, helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosav nem lizim Hulst és munkatársai 1998-ban leírtak olyan rekomblnáns pesuvirust, amelyben a glikoproteín 297, és/vagy 346, antinosav-heiyzetében lizin van. Ezek a konkrét pestivírusok eítopatikus hatást mutattak sertésből származó ve se sejtekben. Egészen mostanáig teljesen ismeretlen volt az ER?íS enzimaktivitás inaktiválására következtében létrejövő, meglepő és innovatív gyen gi the tőség! tulaj dón ság.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint, szintén a találmány tárgyát képezik a vakcinákra fentebb említett okok miatt a találmány szerinti olyan pestivirusok, amelyekben az RNáz-aktivitás & glikoproteín például az 1, ábrán CSFV-Alfort-tönssre leírt 295-307, helyzetében, és/vagy 338-357, helyzetében lévő aminosavak, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosavak delécíójával és/vagy mutációjával van inaktiválva.
Egy előnyösebb megvalósítási mód szerint szinten a találmány tárgyát képezik a vakcinákra fentebb említett okok miatt a találmány szerinti olyan pestivirusok, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoproteín például az 1, ábrán CSEV-vtlfort-törzsrc leírt 346. helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav delécíójával vagy mutációjával van inaktiválva.
A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint, szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb vakcinákra említett okok miatt a találmány szerinti pestivírusok, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoproteín például az
1.. ábrán CSFV-Alforí-törzsre lein 346. helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin deléciőjávai inaktiválva van,
A találmány további legelőnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik a. találmány szerinti BVDV-nukleinsavak, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoprotein például az 1. ábrán CSFV-AIfort-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más BVDV-törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin deléciőjávai inaktiválva van.
A találmány szerinti gyengített pestivirusnkat és a vakcinák hatóanyagait könnyen elő lehet állítani nukleinsav-módositá.sra szolgáló rekombináns technikák alkalmazásával, amelyek glikoprotein-ERKS~ben mutáns aminosav-szekveneia expresszióját eredményezik. Ezért a találmány tárgyát képezik további vonatkozásában gliköprötein~E'RNM. kódoló nnkleínsavak, amelyekben a glikoproteinben lévő RNáz-aktivitás a gllkoproteínben lévő legalább egy aminosav deléciőjávai és/vagy mutációjával inaktiválva van azzal a kikötéssel, hogy a glikoprotein például az 1., ábrán CSFV~Alfort~tőrzsre leírt. 297, és/vagy 346, helyzetében, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben lévő aminosav nem Hzln.
A találmány előnyős megvalósitási módja szerint, a találmány tárgyát képezik a fentebb említett okok miatt a találmány szerinti nnkleinsavak, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoprotein például az I. ábrán CSFV-AlforttÖrzsre leírt 295-307. helyzetében és/vagy 338-357, helyzetében lévé amínosavak, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetekben 'lévő aminosavak deléciőjávai és/vagv mutációjával inaktiválva van.
Á találmány előnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik a fentebb vakcinákra említett okok. miatt, a találmány szerinti nuklemsavak, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoprotein például az-1. ábrán CSFV-Alfort-törzsre leirt 346, helyzetében lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciőjávai vagy mutációjával inaktiválva van.
A találmány legelőnyösebb megvalósitási módja szerint, a találmány tár11 ♦ ♦ φ * * φφ* » * gyát képezik & találmány szerinti nukleinsavak, amelyekben az RNáz-aktívítás a glikoprotein például az 1. ábrán CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy· más törzsekben ennek megfelelő helyzetben 'lévő hisztídin deléciójá.val inaktiválva van.
A találmány további legelőnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik, a találmány szerinti BVDV-nukleinsavak, amelyekben az RNáz-aktivitás a glikoprotein például az b ábrán CSFV-Alfort-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más BVDV- törzsekben ennek megíéieíő helyzetben lévő hisztidin deléciőjával inaktiválva van,
Ntikleofídok, például DNS vagy RNS, szintén alkalmasak DNS-, RNSés/vagy vektor-vakcinák előállítására. Ezekben a vakcinákban a nukleotídokat közvetlenül beadjuk az állatnak vagy közvetve, az eredeti vírustól különböző vektorokon keresztül. Nukleotid-vakcinák és vektor-vakcinák szakember számára jól ismertek, és továbbiakban nem tárgyaljuk.
A találmány tárgya egy további vonatkozásában a találmány szerinti nukleinsavak alkalmazása nukleotid- és/vagy vektor-vakcinák előállítására.
A találmány szerinti vakcinák, gyengíteti pestivírusok, és/vagy nukieinsavak különösen alkalmasak gyógyszerkészítmény előállítására.
Következésképpen, a találmány tárgyát képezik további vonatkozásában a találmány szerinti vakcinát és/vagy a találmány szerinti pestívírust és/vagy a találmány szerinti nukleotid-szekvenciát tartalmazó gyógyszerkészítmények. Ilyen gyógyszerkészítményeket például, kizárólag bemutatás céljából, az alábbiak szerint lehet preparálni: fertőzött sejtek tenyészetéből származó sejttenyészet-felülúszót összekeverünk stahílizátorral (például s-permidinnel és/vagy BSA-val, azaz marhaszérumból származó albuminnal), és azután a keveréket liofilizáljuk vagy más módszerrel dehidratáljuk. Vakcináciő előtt a keveréket azután vizes (például sóoldattal, PBS-eh azaz foszfát-pufíeroit sóoldattal) vagy nem-vizes oldatokkal (például olajos emulziókkal, alumínium-alapú adjuvánssal) .rehidratáljuk.
A jelen leírás tárgya egy további vonatkozásban egy eljárás pestivirusok
73S1I3/RCZ »·φ :<· «
legyen gítésére. A találmány egyedülálló és nemvárt. eljárást bocsát rendelkezésre pestivirusok legyengítésére, amelyben a glikoprotem-ERRíM>en lévő RNáz- aktivitást inaktiválj uk.
A specifikusan gyengített pestivirusok különösen alkalmasak vakcinák előállítására. Ezért a találmány további vonatkozásában eljárásokat közöl specifikusan legyengített pestivírus-vakcinák előállítására, amelyeket, az jellemez, hogy a glíkoproteín-E^^-ben. lévő ENáz-aktivltás inaktiválva van.
A ghkoprotein-ER-NS-ben lévő RNáz-aktívitás inaktiválása meglepő és új módszert biztosít pestivirusok detektálható jelölésére. Egy további szempont szerint közlünk itt egy eljárást pestivírusok detektálható jelölésére, amelyet az jellemez, hogy a glíkoprotein-ERNS~ben lévő RNáz-akti vitást inaktiváljuk. Az e szerint rendelkezésre bocsátott pestivírusok azon jellemzője, hogy a glikoproteín-ERNS-ben lévő RNáz-aktívitás hiányzik, lehetővé teszi ezen pestivírusok detektálható jelölését. Jelölt és jelöletlen pestivírusok, vagy pestivírussal fertőzött sejtekből testfolyadékokba szekretált ERNS egyértelműen megkülönböztethető a glíkoproteín-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás hiánya vagy jelenléte alapján, izolálás és ilyen enzimaktivásra. való vizsgálat esetén,
Glikoproteín-ERNÍú-ben lévő RNáz-aktivitásukhon deléciővai és/vagy mutációval inaktivált pestlvirusokra. számos más technikát lehet alkalmazni. Ilyen pestívirusokat könnyen lehet detektálni ilyen deiéciök és/vagy mutációk eredményeként kialakult strukturális következmények miatt. Például a megváltoztatott. glí.koprotei.n-ERNS nukleinsav-szekvenciájának szekvenciakülönhségeí nukleinsav-szekvenáló technikák, vagy PCR-techníkák (polimeráz láncreakció) alkalmazásával detektálhatok, a 8, példában bemutatottak szerint; a megváltoztatott fehéqeszekvenciát olyan specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával lehet detektálni, amelyek nem képesek felismerni az eredeti fehérjéket, Fordítva, a megváltoztatott és ezáltal strukturálisan jelölt fehérjéket ís lehet detektálni olyan specifikus monoklonális antitestek kötődésének hiányával, amelyek az eredeti glikoprotein-ERNS-fe.hérjéket képesek felismerni azzal a. kikötéssel, hogy pestivírusok jelenléte más okra vezethető vissza. És természetesen, a jelölt víru15
Φ* φφφ φφ sokban, lévő RNáz-aktívitást megszüntető· deléciók és/vagy mutációk eltérő immunválaszt váltanak ki állatokban, a jelöletlen pe-stivírus-fertőzés eredményeként létrejött válaszokhoz viszonyítva.
Egy minden szempont -szerinti vonatkozásban. előnyős megvalósítás pestivírusok legyengítésére -szolgáló eljárásokra, specifikusan legyengített pestivírus-vakcina előállítására szolgáló eljárásokra és az így rendelkezésre bocsátott pestivírusok detektálható jelölésére szolgáló eljárásokra vonatkozik, amelyek a gliko-proteín-ERNS inaktiválására vonatkozó eljárások, ahol -az RNáz-aktívitás az említett gllko proteinben lévő legalább egy aminosav deléciojával és/vagy mutációjával van ínaktíválva.
Egy minden. szempont szerinti vonatkozásban előnyösebb megvalósítás pestivírusok, legyengítésére szolgáló eljárásokra, specifikusan legyengített pestivírus-vakcma előállítására szolgáló eljárásokra és az. így rendelkezésre bocsátott pestivírusok detektálható jelölésére szolgáló eljárásokra vonatkozik, amelyek a glikcprotéi.n-ERN’s inaktiválására, vonatkozó eljárások, ahol a. deléciók és/vagv mutációk a glikoproteinnek például az 1. ábrán a CSEV-Alfort-törzsre leírt 295-307. helyzetében és/vagy 3-38-357. helyzetében lévő amino-savaknál, vagy más törzsekben glíkoprötein ennek megfelelő helyzeteiben lévő aminosavaknál találhatók.
Egy minden szempont szerinti vonatkozásban nagyon előnyös megvalósítás pestivírusok legyengítésére szolgáló eljárásokra., specifikusan legyengített pestívírus-vakcina előállítására, szolgáló- eljárásokra és az így rendelkezésre bocsátott pestivírusok detektálható jelölésére szolgáló eljárásokra vonatkozik, amelyek a glikoprotein-E·®^ Inaktiválására vonatkozó eljárások,, ahol az RKáz-aktivitás a glikoproteinnek például az Ί. ábrán a CSFV-Aliért-törzsre leírt 346, helyzetében lévő aminosav vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciojával vagy mutációjával van inaktiválva..
Egy' minden szempont szerinti vonatkozásban legelőnyösebb megvalósítás pestivírusok legyengítésére szolgáló eljárásokra, specifikusan legyengített pestivírus-vakcina előállítására szolgáló eljárásokra és az így rendelkezésre bocsa“í)«í 3/jOG tott pestivlrusok detektálható jelölésére szolgáló eljárásokra vonatkozik, amelyek a gIikoptotein~ERM5 Inaktiválására vonatkozó eljárások, ahol az RNáz-aktlvitás a glikoproteinnek például az 1. ábrán a CSFV·Aliért-törzsre leírt 346. helyzetében, vagy más törz.sekbon ennek megfelelő helyseiben lévő lévő hisztidin-maradék deled ójával van Inaktiváiva .
A jelen találmány olyan vakcinákat és/vagy más gyógyszerkészítményeket közöl, amelyek különösen alkalmasak pestivirus-fertőzések megelőzésére és kezelésére állatokban. Ennélfogva egy további szempont szerint közlünk itt eljárásokat pestivirus-fertőzések megelőzésére és kezelésére állatokban, amelyekre az jellemző, hogy egy itt rendelkezésre bocsátott vakcinát vagy más gyógyszerkészítményt. adunk, be ilyen megelőzésre vagy kezelésre szoruló állatnak.
Egy további vonatkozásban közlünk itt egy eljárást olyan specifikusan legyengített pestivlrusok előállítására, amely eljárásra az jellemző, hogy a glikoprotein-ER^s-ben. lévő RNáz-aktlvítást inaktiváljuk,
Egy szempont szerint, közlünk itt. egy eljárást olyan specifikusan, jelölt pestivírusok előállítására, amely eljárásra az jellemző, hogy a gíÍkoprotein-ERNSben lévő RNáz-aktivítást inaktiváljuk.
Egy előnyös megvalósítási mód valamennyi vonatkozásban egy specifikusan legyengített pestivlrusok előállítására szolgáló eljárás, egy specifikusan jelölt pestivírusok előállítására szolgáló eljárás, ahogy itt rendelkezésre bocsátjuk, a glíkoprotein-ERNS inaktiválására vonatkozó olyan eljárások, amelyekben az RNáz-aktivítást a glikoproteinhen lévő legalább egy aminosav deléciőj ával és/vagy mutációjával inaktiváljuk.
Egy előnyösebb megvalósítási mód. valamennyi vonatkozásban egy specifikusan legyengített pestivírusok előállítására szolgáló eljárás, egy specifikusan jelölt pestlvímsok előállítására szolgáló eljárás, ahogy itt rendelkezésre bocsátjuk, a gÍikoprotein-ERNS inaktiválására vonatkozó olyan eljárások, ahol az említett deiéelök és/vagy mutációk például az I. ábrán, a CSFV-Alfort-tőrzsre leírtaknak megfelelően az említett glikoprotein 295-töl 307,. és/vagy a 338-tól
7.0 c A 1 ..< / x« X * ♦ »* # x ♦
XX XX **
357, aminosav-helyzeteíben, vagy más törzsekben ennek megfelelő aminosav-helyzetekben találhatók.
Egy nagyon előnyős megvalósítási mód valamennyi vonatkozásban egy specifikusan legyengített pestivirusok előállítására szolgáló eljárás, egy spéci(ikusan jelölt pestivirusok előállítására szolgáló eljárás, ahogy itt rendelkezésre bocsátjuk, a giikoprotein-ERN's inaktiválására vonatkozó olyan eljárások,, ahol az RNáz- akti vitást az említett glikoproteinnek például az 1. ábrán a CSFV-Alfort-törzsre leírtak szerint a 346, helyzetben lévő aminosav, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő aminosav deléciójával vagy mutációjával inaktíváljuk..
Egy legelőnyösebb megvalósítási mód valamennyi vonatkozásban egy specifikusan legyengített pestivirusok előállítására szolgáló eljárás, egy specifikusan jelölt pestivírusok előállítására szolgáló eljárás, ahogy itt rendelkezésre bocsátjuk, a. gli.koprotein-ERNS inaktiválására vonatkozó olyan eljárások, ahol az említett. RNáz-aktivitást az említett glikoproteinnek például az 1, ábrán a CSFV-Alfort-tőrzsre leírtak szerint a 346. helyzetben, vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben lévő hisztidin-maradék deléciójával inaktiváljuk.
A találmány szerinti vakcinák vagy más gyógyszerkészítmények alkalmasak pestivírus-fertozések megelőzésére vagy kezelésére állatokban..
Tehát a találmány egyik szempontból egy itt rendelkezésre bocsátott vakcina pestivírus-fertozések állatokban való megelőzésére és kezelésére való al kalmazására vonatkozik. Egy másik szempontból a találmány egy találmány szerinti gyógyszerkészítmény állatokban pestivírus··fertőzés megelőzésére és kezelésére való alkalmazására vonatkozik, Egy további szempont szerint a. találmány egy találmány szerinti pestivírus állatban pestivírus-fertőzés megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására való alkalmazására. vonatkozik.
A találmány szerinti pestivirusok és/vagy nnkleinsavak gyógyszerkészítmény vagy vakcina hasznos hatóanyagai. Ezért a találmány egy további vonatkozásában egy találmány szerinti pestivlrus és/vagy nukleinsav vakcina ?Qnx3/ss.r
Ifo * *·»♦ vagy gyógyszerkészítmény előállítására való- alkalmazására vonatkozik. Egy további szempont szerint a találmány egy találmány szerinti mikleinsav állatban pestivírus-fertőzések megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előáll kására való alkalmazására, vonatkozik.
A fentebb említettek szerint, a glikoproteín-ERNS-ben lévő ribonukleáz-aktivitás inaktiválása egy meglepő és -új módszert biztosít pestivírusok jelölésére.
Az itt közölt egyik szempontból következően a találmány tárgyát képezik eljárások a találmány szerint öetektálhatóan jelölt pestivírusok jelöletlen és valószínűleg patogén pestivírusoktól való megkülönböztetésére. Ilyen eljárások különösen hasznosak jelölt pestivírusok hatékonyságának nyomon követésére állatokban. Egy vakcinával, kezelt állat jelölésre pozitívnak bizonyul, miután mintái vettünk ilyen állatból és vizsgálatot végeztünk az említett jelölőre. Jelöletlen állatok és különösen pestivírusra pozitívnak bizonyuló, jelöletlen állatok azonnal szétválaszthatok, elkülöníthetők vagy levághatok, hogy megszüntessük a patogén fertőzés más állatokra való átterjedésének fenyegető veszélyét.
A találmány eljárást biztosít pestivírusok detektálható jelölésére, amelyre az jellemző, hogy a glikoprotein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitást inaktiváljuk. A glíköprotein~ERNí?~ben lévő RKáz-aküvitás hiányának ez a tulajdonsága lehetőséget biztosit ezen pestivírusok detektálható jelölésére. Ennek eredményeként jelölt és jelöletlen pestivírusokat egy értelműén meg lehet különböztetni a glikoprotem-ERNS-ben lévő RNáz-aktivítás megléte vagy hiánya alapján, izolálás és ilyen enzimáktívításra való vizsgálat után. Ilyen enzimaktivitás meglétének vagy hiányának meghatározását a kérdéses pestivírust vagy abból származó anyagot tartalmazó mintából standard módszerek szerint végezzük, például a 2, példában leírtak szerint vagy a Húst és munkatársai által leírtak szerint [Vlrology 200, SSS-565
Ennélfogva egy itt közölt előnyös megvalósítás vonatkozik egy pestivírussal fertőzött állatok specifikusan legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló eljárásra, amely magában foglalja a következő lépéseket:
« » χ* (!) minta nyerése egy kérdéses állatból, amelyről feltételezzük, hogy pestivirus-fertőzésben szenved vagy vakcináit;
(2j egy glíkoproteín-ERNS RNáz-aktivitása hiányának vagy meglétének meghatározása a mintában;
(3) a glikoprotein-ERN£í' RNáz-aktivitás hiányának, kölcsönös megfeleltetése égy vakcináit állattal, és az említett aktivitás meglétének kölcsönös megfeleltetése az állat pestivirus-fertőzésével.
Köziünk itt olyan pestivírusokat,, amelyek glikopí'otein-ERNS-ben lévő RNáz-aküvitásukban delécióval és/vagy mutációval maktiváltak, Ilyen pestivírusokat könnyen lehet detektálni ilyen deléeiök és/vagy mutációk eredményeként kialakult strukturális következmények alapján. Megváltoztatott gIíköproteIn-ERNS-t kódoló ERN:S-génbeu lévő szekveneiakülönhség szekvenálö technikákkal vagy PCR-technikákkal detektálható. Ennek eredményeként egy előnyös megvalósítás itt leír egy eljárást pestivirussal fertőzött állatok specifikusan legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére, amely magában foglalja a következő lépéseket;
(!) minta nyerése egy kérdéses állatból, amelyről feltételezzük, hogy pesüvirus-feríözéshen szenved vagy egy vakcináit állat;
(2) egy pestivírus genom nukleotíd- szekvenciájának vagy fehérjéjének az azonosítása a mintában;
(3) az ERNS--nukleotid~szekvenciának a vakcinában meglévő deléeíóínak és/vagy mutációinak kölcsönös megfeleltetése egy vakcináit állattal, és az emutett delécióík és/vagy mutációk hiányának kölcsönös megfeleltetése az említett állat pestívirus fertőzésével.
Továbbá, a találmány szerinti pestivíru&okban levő glikoproteih-ERNS megváltoztatott fehérje-szekvenciájának eredményeként létrejött strukturális változásokat olyan specifikus monokionáiis vagy poliklonáüs antitestekkel lehet detektálni, amelyek nem képesek felismerni a nem változtatott fehérjéket.
Ennélfogva egy itt közölt további megvalósítás egy pestivirussal fertőzött állatoknak egy találmány szerinti legyengíteti pestivirussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló eljárásra, vonatkozik, amely magában foglalja a következő lépéseket:
(1) minta nyerése egy kérdéses állatból, amelyről feltételezzük, hogy pestivínts-fertözésben szenved vagy egv vakcináit állat;
(21 egy pestivírus módosítatlan ER^s-glikoproteinjének azonosítása monoklönális vagy poliklonális antitesteknek az említett mintában jelenlévő ERNS~gl.ikoproteínekhez való speciális kötődése által, amely említett glikoproteinek egy itt rendelkezésre bocsátott eljárással módosítottak, miáltal az említett monoklonális vagy poliklonális antitestek nem kötődnek módosítatlan ERNS~glikoproteinekhez;
(3) az említeti monoklonális vagy poliklonális antitestek specifikus kötődésének kölcsönös megfeleltetése egy vakcináit állattal, és az antitest-kötődés hiányának kölcsönös megfeleltetése az említett állat pesti vírus-fertőzésével, azzal a fenntartással, hogy pestivírus anyag jelenléte az említett állatban és/vagy az említett mintában másként megái lapított.
Fordítva, az is lehetséges, hogy a megváltoztatott és ezáltal strukturálisan jelölt fehérjéket olyan specifikus monoklonális vagy poliklonális antitestek kötődésének hiánya, által mutassuk ki, amelyek csak nem változtatott glikoprotein-ERNS-t. Ismernek fel, ha a pestivírusok jelenléte másképp megállapított. Egy itt közölt előnyös megvalósítás pestivirussal fertőzött állatoknak egy találmány szerinti legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló olyan eljárásra vonatkozik, amely magában foglalja a következő lépéseket:
(11 minta nyerése egy kérdéses állatból, amelyről feltételezzük, hogy pesüvírus-fertőzött vagy egy vakcináit állat:
(2} egy pestivírus módosítatlan ERHS~glikoprotemjének azonosítása monoklonális vagy poliklonális antitesteknek az említett mintában jelenlévő EKRS~glikoprofeinekhez való speciális kötődése által, amely említett glikoproteinek nem lettek módosítva egy itt rendelkezésre »·: »* ♦* * ϊ 0:
* ·<** ♦
λ * » >
bocsátott eljárással, miáltal az említett monoklo.nális vagy políkionális antitestek nem kötődnek módosított ERN'á-glikoprote.inekbez;
(3) az· említett monoklonális vagy poliklonális antitestek specifikus kötődésének kölcsönös megfeleltetése egy említett állatban levő pestivírus fertőzéssel, és az antitest-kötődés hiányának kölcsönös megfeleltetése egy vakcináit állattal, azzal a fenntartással, hogy a pesüvírus anyagnak az említett állatban való jelenléte másként megállapított.
Természetesen a találmány szerinti jelölt vírusokban a strukturális módosítás és az RNáz-aktivitás· hiánya eltérő immunválaszokat eredményez állatokban, jelöletlen pestivírus-fertözések eredményeként létrejövő válaszokhoz.
viszonyítva. A találmány szerinti pestivírusok eltérő és megkülönböztethető, celluláris valamint humorális· immunválaszt képesek, kiváltam, amely eltér a módosítatlan és valószínűleg patogén immunválaszoktól. Például az itt rendelkezésre bocsátott glikoprotein-ERNS'-ek olyan poliklonális antitesteket, eredményeznek, amelyek kötési speeifitásukban különböznek olyan poliklonális antitestektől, amelyek módosítatlan glikoproteinek ellen termelődtek. Ez a különbség a kötési specifitásban rendelkezésre bocsát egy jelölést az Itt rendelkezésre bocsátott pestivírusokkal vakcináit állatoknak természetes körülmények között előforduló pestivírussal. fertőzött állatoktól való megkülönböztetésére, beírtak szérumok szűrésére szolgáló teszteket specifikus poliklonális antitestekre, amelyek vagy egy vad típusú epltóphoz vagy ezen epítöp egy markor-deiéciós mutánsához képesek kötődni, fertőzött és vakcináit állatok, például pseudoarabltes-fertőzőtt és vakcináit sertések megkülönböztetése céljából [Kit, M. and S. Kit, Vet.eri.hary Microbiölogy 28, 141-155 (1991)1.
Egy itt közölt előnyös megvalósítás egy pestivírussal fertőzött állatoknak egy találmány szerinti legyengített pestivírussal vakcináit állatoktól való megkülönböztetésére szolgáló olyan eljárásra vonatkozik, amely magában, foglalja a következő lépéseket:
(11 poliklonális antitestek mintájának nyerése egy kérdéses· állatból, amelyről feltételezzük, hogy pestivírus-fertözótt vagy egy vakcináit állat;
* «ί « « ** * 4 ♦ « « » Λ * * * » * .
x« *♦< Λ· *** *a (2) az említett políkionáiis antitestek módosítatlan glikoprotein.-ERNS-hez. vagy itt leírt módosított gükoprotein~E'RNS-hez való bármilyen specifikus kötődésének azonosítása;
(3) az említett políkionáiis antitestek módosítatlan gUkoproteín-ERNS~hez való kötődésének kölcsönös· megfeleltetése egy pestivirus. fertőzéssel, és az említett políkionáiis antitestek, itt leírt módosított glikoprotein-E^hez való kötődésének kölcsönös megfeleltetése egy vakcináival.
Λ teljes hosszúságú pA/C8FV--cDRS-kIónböI [Mcyers et al,., J. Vírol. 67, 7088-7095 (1.996)] vagy pA/BVDV-klŐnböl fMeyers et ah, J, Vírol. 67, 70887095 (1996)( kiindulva, melyekből fertőző c RNS-t lehet előállítani ín vitro transzkripcióval, .előállítottunk szubklonokat. CSFV eseten, a. pA/CSFV-ből származó Xhoi/SspI-fragmentumot Xhol- és Smal-enzimekkel hasított, pBluescript SK+ plazmádba klónoztuk. BVDV esetén, p.A/BVDV-bői származó Xho/BglH-fragmentumot ugyanezen enzimekkel emésztett pCíTB-2C- plazmádba klónoztuk. Ezekből a konstrukciókból egyszálú plazmid-DNS-t állítottunk elő a Kunkei által leírt módszer szerint (Kunkéi et al., Methods Enzymol, 154,
367-392 (1987)}, E. coli CJ'236-sejteket (BioRad) és VCMS egyszálú fagot (Str&tagene) alkalmazva. Az egyszálú DNS-t dupla szálúvá konvertáltuk „Phagemid in vitro. Mutagenesis Kit” (BioRad) alkalmazásával. A kívánt pestivirus-mutánsok előállítására primerként alkalmazott, szintetikus oligonukieotidok közül néhányat példaként az alábbiakban sorolunk fel:
C-346-L
C-297-K:
C-346-K:
C-346-d:
8-346-d:
ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC
ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA
GAATGGAACAAAGGÁTGGTGTAAC
CA
-a a a n AAAGGTTG GTGCAACTGG / RA7.
«*«« « * «♦
A kettős szálú plazmid-DNS-t alkalmaztuk E. coli XLl-Blue-sejtek (Stratagene} transzformálására . A piazmidot tartalmazó baktéríumko léniákat ampieillin-szelekeió alkalmazásával izoláltuk. Píazmíd-DNS-t preparáltunk, és tovább analizáltuk nukfeotídszekvenálással T7~pokmerázt tartalmazó, szekvenálő reagenskészlet (Pharmacia} alkalmazásával. A kívánt mutációkat tartalmazó és második cserét nem tartalmazó plazmidokat alkalmaztuk teljes hosszúságú cDNS-klőnok előállítására. CSPV esetén a mutagenizált plazmádból származó XhoI/Ndel-fragmentumot inszertáltuk. 578-píazmidból (pCITB 2A, pA/CSFV-ből származó Xhoí/BglIl-fragmentumot tartalmaz} származó Ndel/BgHí-fragmentummal együtt Xhol- és Bglll-enzimekkel hasított pA/CSFV-be. BVDV-CP7-mutáns előállítása céljából a deléciót tartalmazó Xhol./Bgill-fragmentumot Xhol- és ^col-enzimekkel hasított pA/RVDV-be inszertáltuk pA/BVDV/Ins~ plazmádból izolált BglH/Ncoí-fragmentummal együtt. A pA/'BVDV/lns- konstrukcióból egy olyan cRNS~t írtunk át, amely egy nem-cítopatogén BVQV-t hozott létre alkalmas sejtekbe való transzfekciő esetén [Meyers et al., J. Virol. 67, 7088-7095 /1996}}. A különböző, teljes hosszúságú klón okát amplifikáltuk, és a plazmidokat izoláltuk. A kívánt mutációk jelenlétét DNS-szekvenálással igazoltuk. S-ffl- (CSFV teljés hosszúságú klóitok esetén) vagy Smal(BVDV teljes hosszúságú kidnek esetén) enzimmel való Imearlzálás- után cRNS-t átírtuk korábban leírtak szerint ÍMeyers et ab. J. Virol. 67, 7088-7095 (1996); Meyers et al.., J. Virol. 7.0, 8606-8613 (1996)j. Az RNS-t gélszúréssel és fenol/kloroformos extrakcíóval tisztítottuk, és sertésveséből származó sejtek ÍPK1S) vagy marhaveséből származó sejtek. (MDBK B2~klőn) transzfekciójára alkalmaztuk azokat (CSFV- vagy BVDV-konstrukciőkat, ebben a sorrendben}. A transzfékciókat immuníluoreszcenciával analizáltuk, vírusspecifikus antiszérum alkalmazásával. Azokban az esetekben, ahol a kívánt mutánsokat ki lehetett nyerni (immunfluoreszcencíásan pozitív), a vírusokat úgy amplifikáltuk, hogyf a tran&zfekcíós kísérletekhez alkalmazott sejtvonalakha passzoltuk. A CSFV-mutánsokat a továbbiakban úgy analizáltuk, hogy meghatároztunk egylépéses növekedési görbéket, és a virális RNS-t Northern-blottal jelleme'?S8U3/KA2 •y.
* * ♦♦ # «« » * * * * *»♦ *♦ « « * ♦ ««« «♦ »Χ zunk vírus-specifikus cDNS-próbák alkalmazásával, valamint reverz transzkripcióval pcKmeráz láncreakcióban (RT-PCR), és azt követően szekvenáltuk a PCR~fragmentumoka.t a. kívánt mutációk vírusgenomban. való jelenlétének igazolása céljából. Valamennyi esetben igazoltuk a kívánt mutáció jelenlétét. Mindegyik kinyert vírus egyformán jói. növekedett, és hasonló mennyiségű. RNSt termelt, mint a vad típusú szekvenciát tartalmazó plazmádból származó vírus.
A BVDV-mutáns életképességét úgy mutattuk ki, hogy a megfelelő cRNS-t transzfektáltuk, és 3 nappal később a sejteket, több részre osztottuk. A sejtek egy részét 3,5 cm átmérőjű edénybe oltottuk, egy nappal később acélon/metanollal fixáltuk, és immunfluoreszcenciával analizáltuk BVDV-specifikus monoklonális antitest-keverék alkalmazásával [Weiland et al., d. Virol. Methods 24, 237-244 (19891], Valamennyi sejtet, pozitívnak találtunk, míg nem-fertőző RNS-el transzfektált, kontroll sejtek nem mutattak jelet. A megfelelő eRNS-el transzfektált sejtek egy részéből előállítottunk extraktumot egy ciklus fagyasztás/felolvasztással. Friss sejteket megfertőztünk ezzel a sejtextraktummal, amelyekről 3 nappal a fertőzés után, BVDV-specifikus immunfluoreszcencia alkalmazásával bebizonyosodott, hogy BVDV-pozitívak.
Az 1. táblázatban összefoglaljuk az ERNS-ben lévő, feltételezett RNáz aktív helynek. megfelelő, konzervatív szekvenciába bevitt, különböző- változtatásokat, melyeket a jelölt vírus-mutánsok kódoltak.
Szekvencia RNáz-motívumban
RNáz Mutáns aktivitás éleképessw pA/CSFV
C-297-L ...SLLGIWPEKlC...
0-346-1 .....SLHGIWPEKIC...
C-297-LAV IS-L ...SLLGIWPEKlC.....
C-297-K ...SLKG1WPEKIC...
C-346-K ...SLHGIWPEKIC...
C~297~c ......SL GSWPEKIC...
.SLHGIWPEKIC........RHEWNKHGWCNW..
...RHEWNKHGWCNW..
...RHEWNKLGWCNW.. - τ
...RHEWNXtGWCNW.. - +
...RHEWNKHGWCNW..- - +
.....RHEWNKKGWCNW..- - +
RHEWNKHGWCNW..
,·ΰ -J
φ *
χ Α Μ «φ Φ Φ Φ »
C-346-ά .SLHGIWPEKIC... , ..RHEWNKHGWCNW . 4-
C-29Ö/7/8-Ő ,S___IWPEKIC,.. ..RHEWNKHGWCNW.. -
C~345Z6Z7~d .SLHGIWPEKiC... RHEWN___WCNW..- - -
C-345/6-d .SLHGIWPEKIC... ..RHEWN GWCNW.. - -
C-346/7-d .SLHGIWPEKiC... ..RHEWNK_WCNW„- - -
C-342-d .SLHGIWPEKIC..... ..RHEWNKHGWCNW,. - -
C-342/6-d .SLHGIWPEKIC... ,.RH„WNK„GWCNW.. -
C-301-d .SLHGIW_EKIC... . ..RHEWNKHGWCNW,. - -
C-295-S/G .GLHGIWPEKIC,.. ...RHEWNKHGWCNW.. - 4
C-300-W/G .SLHGIGPEKIC..... ..RHEWNKHGWCNW. - 4-
C-3G2-EZ.A .SLHGIWPAKIC..... . .RHEWNKHGWCNW.. -
C-30S-C/G .SLHGIWPEKIC... . .. RHEWNKHGWCNW..
C-300-WZG-302-E/A .SLHGÍGPAKÍC,.. . ..RHEWNKHGWCNW.. - -
C-340-R/G SLHGIWPEKIC..... ..GHEWNKHGWCNW... - -
C-343-W/G .SLHGIWPEKIC... . ..RHEGNKHGWCNW.. - -
C-34S-KZ.A .SLHGIWPEKIC...... ..RHEWNAHGWCNW.. - -
C-297-KZ346-K .SLKGIWPEKIC... . .. RHEWNKHGWCNW. 4
C-297-K/346-L ..SLKGIWPEKIC... . ..RHEWNKKGWCNW.. - 4
pAZBVDV SLHGIWPEKiC... ..RHEWNKHGWCNW.. 4
8-346-d „SLHGIWPEKIC... ..RHEWNKHGWCNW.. - 4
Jelmagyarázat az . táblázathoz: Az RNáz-a.ktivitást tranzier: ks vizsg; álati eljá-
rásban határoztuk meg. BHKSI-sejtr két fertőztünk vTF7-3 t« ihénhirs ilő-virus-
sál ÍFuerst et al., F roc. Natl. Ácad.. S< ti. USA 83, 8122-81.26 (. 986H, í Is azután
a megfelelő cDNS-konstnikclőval transzferáltuk azokat (5 gg plazmid-DNS, transzfekciő Superfect alkalmazásával, a gyártó, Qiagen ajánlásai szerint). Miután lö ára hosszáig inkubáltuk 37*C~on, szén-dioxid-inkubátorban, a transzfektéit sejteket lizísnek vetettük alá, és meghatároztuk az RNáz-aktivitást a lentebb leírtak szerinti Az életképességet az alábbiakban leírtak szerint határoztuk meg,
2, példa: Különböző mutációk hatása Ews RNáz-aktivitására
Különböző mutációk ERNS RNáz-aktivítására kifejtett hatásainak tesztelése céljából megfelelő sejteket fertőztünk a mutáns vírusokkal. CSFV esetén a fertőzést 0,0X fertőzési egységgel. (rmod.) végeztük Vad típusú vírussal való fertőzés szolgált pozitív kontrollként, míg nem-fertőzött sejteket alkalmaztunk, negatív kontrollként. 48 órával a fertőzés után a sejteket kétszer mostuk főszfát-pufferolt sőoldattal, és lízisnek vetettük alá 0,4 ml lízis-pufferben (20 mM Tris/HCl; 100 mM NaCl, 1 mM BDTA, 2 mg/ml rnarhaszérum-albumín; 1% Triton XI00; 0,1% dezoxi-kólsav; 0,X% náteium-dodecil-szulfát). A lizátumot
1,5 ml-es reakciócsövekre töltöttük, és ultrahangos kezelésnek vetettük alá. (Branson szonikátor B12, 120 Watt, 20 másodperc, tölcsér alakú, ultrahangos kezeléshez tervezett edényben, vízfürdőben), centrifügáiással (5 perc, 14.000 rpm, Eppendorf centrifugában, 4°C-on) tisztítottuk, és a felülüszót ultracentrifugáltuk (Beckmann asztali ultracentrifuga, 60 percig, 4°C-on és 45,000 rpmnői, TLA45 rotorban). Az RNáz-aktivitást. 200 ui Összíérfegatban határoztuk meg, amely 5 vagy 50 μ! felülúszót tartalmazott a második centrifugálási lépésből, és 80 ug Poly(rU)~t (Pharmacia) RNáz-vizs.-gálati puííerben (40 mM Trís-aeetát, pH 6,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM ditiotreito.l, DTT). A reakciökeveréket 37°C~on inkubáltük 1 óra hosszáig, majd hozzáadtunk 200 μΐ, 1,2 M perklőrsavat és 20 mM LaSÖ4~et. A keveréket jégen inkubáltük 15 percig, azután centrifugáltuk 15 percig, 4°C~on és 14.000 tpm-en Eppendorf-centrííugábán, A felülúszóhoz 3 térfogat vizet adtunk, és a keverék egy alikvotját optikai denzitásra. vizsgáltuk 260 nm-en, Ultrospee 3000 (Pharmacia) spektrofotométerben. Valamennyi esetben mutációk bevitele az Ems-génbe teljesen megszüntette az RNáz-aktívítást (1. táblázat) ,
BVDV-mutáns eseten az RNáz-aktivitást. olyan anyaggal teszteltük, melyhez RNS-transzfekeiő után jutottunk a helyreállított vírusok passzálása nélkül· A megfelelő RNS-el iranszfekíált sejteket 72 órával a transzfckció után megfeleztük, és két edénybe leoltottuk azokat 24 óra ekekével az egyik edényből sejtextraktumokat preparáltunk, és RNáz-aktivitásra teszteltük a fentebb leírtak szerint, A < ag.; U ZR&Z fertőzés megerősítése céljából, a második edényből származó sejteket imm unöuoreszeeneiával analizáltuk, BVDV-m specifikus monokionálís antitestek alkalmazásával (Weiland et al,, J. Virol. Methods 24, 237-244 (1989)], és 100%-ban pozitívnak találtuk azokat. A transzfekeiöt olyan RNS-el végeztük, melyet (pA/BVDV/lns-)bőí és ρΑ/Β-346-d-ből írtunk át, ez utóbbi plazmid ekvivalens a (pÁ/BVDV/Ins-)-plazmiddal, kivéve azt, hogy a CSFV-Alfort-genom 346. kódonjáv&l ekvivalens kódon deletálva. van. Nem-transzfektált MDBK-sejtek szolgáltak negatív kontrollként. 2A. táblázat
Különböző vírusok RNáz-aktivitásának meghatározása
Alfort C-WT C-297-L C-346-L C~346~d Ο-346-d/Rs kontroll
OD.260 2,4 2,3 1,1 .1,1 1,1 2,3 1,1
Alfort C-WT C-297-L C-346-L C-297-K C-346-K C-297-L/346-L
ODeeo 2,09 2,16 0,715 0,77 0,79 0,766 0,77
C-297-K/346-L C-297-K/346-K C-346-ά kontroli
ODzee 0,725 0,835 0,80 0,84
A 2A., táblázat magyarázata:
PK15-sejteket fertőztünk a jelölt vírusokkal 0,01 fertőzési egységgel (m.o.L), 37cC-on inkubáltuk 48 óra hosszáig szén-dioxidos inkubátorban, és azután finisnek és RNáz-tesztnek vetettük alá. azokat. A különböző sejtextraktumok inkubálása eredményeként keletkezett, savban oldható RNS-l az optikai denzítás 260 nm-en való mérésével határoztuk meg. Az ENáz-akiivitásban megfigyelt különbségek oka nem a mintákban lévő eltérő mennyiségű ERNS~ fehérje volt, mível hasonló értékeket kaptunk az ERNS meghatározására úgy, hogy radioaktív jelölés és immunpreeípítácíó után a radioaktivitást meghatároztuk „phospherimager” alkalmazásával Továbbá az Ems-koneentrácíó csökkentése a szokásos mennyiség egy tizedére a vizsgálati eljárásban nem változtatta meg jelentősen az eredményül kapott OD-kei, ami azt mutatja, hogy a vizsgálati eljárás választott körülményeiben az Ems telítésben volt, CSFV-Alfort-törzs; a többi összes vírust plazmídokból in vitro átírt. RNS-ből. állítottuk elő: például C-WT-t pA/CSFV-ből; C-297-L-t pA/C-297-L-bői, stb.;
*
6 €-346~d/Rs--vírust pA/C-346-d/Rs~ból (pA/€-346~d-ben lévő mutáció visszafordításával állítottuk elő úgy, hogy kicseréltük a megfelelő cDNS-fragmentum-ot pA/CSFV-böl származó- ekvivalens fragmentumra) állítottunk elő; kontroll: nem-fertőzött PK.15~sejtek extaktuma.
A 2B. táblázat magyarázata:
M'DBK.-sejteket fertőztünk ín vitro átírt RRS-el, 72 órával a transzfekció után több részre osztottuk, és 24 órával később RNáz-aktivitásra analizáltuk., A sejtek, fertőzését immunfluoreszcens analízissel igazoltuk, a szövegben leírtak szerint.
B-WT: pA/BVDV/íns- -bői előállított vírus; Β-346-d: ρΑ/Β-346-d-ből előállított, vírus; kontroll: nem-fertőzött M'DBK-sejtekből készült extraktum.
Annak vizsgálata céljából, hogy vajon az RNáz-aktivitás megszüntetése befolyásolja-e pestivirusok patogenitását természetes gazdaszervezetükben, állatkísérletet végeztünk a V(pA/C-346-d)-mutánssal (a. táblázatokban C346~d|. A CSFV teljes hosszúságú, mutáció- nélküli ki-ónjából jV(pA/CSFV)j előállított vírus szolgált pozitív kontrollként. Az egyes mutációkhoz három fiatal sertést (fajta: „Germán land race”, körülbelül 25 kg testtömeg) alkalmaztunk.. Az infékcíós dózis 1. x lö5 TCIDso volt állatonként; az oltás kétharmadát intranazálisan adtuk be (egy-egv harmadol orrlyukanként), egy-harmadát intramuszkulárisan. A két csoportot elkülönített izolációs egységben tartottuk. Vérmintát vettünk az állatoktól a fertőzés előtt és a 3, 5., 7., 1.0., 12. és· 14, napon. Továbbá naponta feljegyeztük a testhőmérsékleteket (2. ábra). A vad típusú vírussal fertőzött állatok klasszikus sertéslázra jellemző klinikai szimptómákat mutattak, mint például láz, ataxia., anorexia, hasmenés, központi idegrendszer rendellenességei, vérzések a bőrben (3.a táblázat). Vírust tudtunk a vérből izo7usnr/ss,i· *
lální a 3, napon (#68. állat) és az 5,, 7., K),f 14. napon (#68,, #78,, #121, állat) (3,b táblázat), A haldokló állatokat elpusztítottuk a fertőzés utáni 14. napon.
Ekkor vírust semlegesítő antitesteket nem tudtunk detektálni. Ezzel ellentétben, a mutánssal fertőzött állatokban nem fejlődtek klinikai szimptömák (3.a táblázati. A hőmérséklet normális maradt (2, ábra) a vizsgálat teljes ideje alatt és az állatok nem hagyták, abba a táplálkozást. Egyik időpontban sem tudtunk vírust kinyerni a vérből. Az állatok mégis egyértelműen fertőzöttek voltak, és nagyon valószínű, hogy a vírus replikálódott, mivel v, legesítő antitestek fejlődtek ki (3.e táblázat).
lennvi állatban sem··
3a. táblázat: Tesztfertőzés utáni klinikai jelek
1. állatkísérlet.
Klinikai jelek
Szám Fertőzés láz hasme- nés CNS rendeli. ano- rexia vérzések. bőrben apátia **
#68 C-WT + 4- 4- 4- 4- 4- 4-
#78 C-WT + + + 4- 4- 4- 4- -·-
#121 C-WT rt- + r -l· 4- 4· 4-
#70 C-346-d - - - - - - - n.a,
#72 C-346-ö - - - - - n.a.
#7# C-346-ά - - - - - - n,a.
* Az eutanázia, napján haldoldott az állat.
** Vérzés· szervekben necropsia esetén. A 3.a táblázat .magyarázata;
fiatal sertést („Germán land race”, körülbelül 25 kg testtömeg) kőt csoportra osztva (az egyes csoportokat, elkülönítve, izolált körülmények között tartottunk) alkalmaztunk ebben a kísérletben, Három állatot CSFV-WT-vei 0 x 1Ö5' TCIDso) és 3 állatot C-346-d mutánssal (1 x lö5 TCIDso) fertőztünk, A rekíális hőmérsékletet és a klinikai jeleket rögzítettük és összesítettük a táblázatban' n.a.: nem végeztünk necropsiát.
7aS'il3/EA2
2θ
X X X A-» * ♦ * * * *
3b. táblázat: Vérsejtvirémia tesztfertézés után l, állatkísérlet
Állat Fertő-
száma zés Viremia a fertőzés utam napon
3 5 7 10 14
#68 C-WT 4 4 § 4 e
#78 C-WT - t- > 4- j e -r
#121 C-WT + s- -r 4·
#70 C-346-d - - ...............-.....1 - -
#72 C-346-d - - i -
#74 C-346-d - L - __________J
A 3b. táblázat magyarázata;
Vérsejtvirémiát úgy detektáltunk, hogy a vért PK15-sej lekkel tenyésztettük együtt. A sejteket 37*C-on, 72 óra hosszáig inkubáltuk, PSS-sel mostuk, jéghideg acélon/metanollal fixáltuk és a. fertőzést ímmuníluoreszeenicával analizáltok glikoprotein-E2-re specifikus monoklonálís antitest alkalmazásával fmAb A1S, Weiland et al., J. Vírology 64, 3563-3569 (1990)1.
3c. táblázat:
CSFY-speeifikus szerűm semlegesítő titer kifejlődése
Napok fertőzés után -3 | 0 17 25 69 76 79 87
#70, sertés .. r „ t 1:18 1:162 1:162 1:162 1:486 1:1458
#7 2, sertés 1 - 1:18 1:54 1:486 1:1458 1:1458 1:4374
#74, sertés - i - 1:6 1:54 1:162 1:486 1:486 1:1458
A 3.c táblázat magyarázata;
Meghatároztuk a C-346-d mutáns vírussal fertőzött sertésekben lévő antitest-titereket az állatkísérlet különböző időpontjaiban;
pl hígított szérumot összekevertünk 50 μζ 30 TCTDso vírust (CSFV Alfort/Tübíngen) tartalmazó tápközeggei. 90 percig inkubáltuk 37°C-on, majd hozzáadtunk löö μί sejtet (1,5 x lö4 sejt), és a keveréket 96 tenyésztőhelyet tar talmazó tálcákra oltottuk. 72 óra elteltével a sejteket jéghideg aceton/metanollal fixáltuk és a fertőzést immunfluoreszcencíával analizáltuk, glikoprotein-E2-re specifikus monokionális antitest alkalmazásával [mAb A18, Weirand et al., d. Virology '64, 3563-3569 (.1990}}. A fertőzés utáni 69. napon az állatokat 2 x lö5 TCIDso Eystrup-CSFV-törzzsel fertőztük. A táblázatban megadjuk azt a. legmagasabb szérumhígítást, amely a. bevitt vírus teljes semlegesítését eredményezte.
4. példa: Protektív immunitás mdukálása RMáz~negativ vírus fertőzésével
Annak analizálása céljából, hogy a mutáns vírussal való fertőzés protektív immunitáshoz vezet, nagymértékben patogén, heteroióg CSFY-iörzzsel (Eystrup törzs, Behring cégtől származik) fertőzési kísérletet végeztünk körülbelül 9 héttel a CSFV-mutánssal való vakeináciö után, 2 x lö5 TCIDse vírust alkalmaztunk a. fertőzéshez. Számos korábbi kísérletben azt találták, hogy ez a vírusmennyiség elegendő letális betegség indukálásához [König, Virus dér klassischen Schweinepest: Untersuchungen zűr Pathogenese und zűr Induktíon einer protektiven Immunantwort.” Dissertation, Tierárztlíche Hochschule Hannover, Németország 11994)1. Azonban előzőleg a CSFV-RNáz-mutánssal oltott állatok nem mutattak betegségre utaló -szimptőmákat fertőzés után, Nem lehetett detektálni lázat <3. ábra) vagy virémiát, viszont semlegesítő antitestek megnővekedett mennyisége produktív fertőzésre és a fertőző vírus replikáciőjára utalt.
A legyengítess. elv igazolása .Annak kimutatása céljából, hogy a mutáns vírus megfigyelt gyengítése valóban a polifehérje 346. helyzetében lévő hisztidin deléciőj a következtében jön létre, és nem azonosítatlan, második helyen létrejövő mutáció következtében, helyreállítottuk a vad típusú szekvenciát ügy, hogy a teljes hosszúságú pA/C-346-d-k.Iőn 1,6 kh méretű XhoI/Ndel-fragmentumát kicseréltük a vad típusú szekvenciával rendelkező pA/CSFV megfeleld fragmentumával, A pA/C-346-d-böl kivágott fragmentumot nukleoddszekvenálással azonosítottuk mutációk vonatkozásában. A polifebérje 346. hísztídínjét kódoló triplet deléciója kivételével nem találtunk különbséget a vad típusú szekvenciához viszonyítva.
·>. π
A helyreállított mutánst tartalmazó cDNS-konsU'ukeiöböl 'V(pA/C-346-d/'Rs)-virust lehetett izolálni, amely azonosan jól növekedett és- ekvivalens RNáz-aktívitást mutatott (2,A táblázat).
Egy második állatkísérletben a helyreállított vírust alkalmaztuk sertések fertőzésére. Kontroliként a deléciós mutánst, alkalmaztuk. Mivel ezek az állatok fiatalabbak voltak („Germán land race”. körülbelül 20 kg testtömeg) az első kísérletben alkalmazott állatokhoz képest, 5 x l ö4 TCIDso vírust alkalmaztunk fertőzésre ebben az· esetben, A mutánssal fertőzött állatok ismét nem mutattak klinikai jeleket (5. táblázat, 4. ábra). Csak az egyik állatnak volt láza. az egyik napon. Ennek ellenére ezek az állatok semlegesítő antitesteket termeltek, és védettek voltak letális CSEV-feríözés ellen, A fertőzést megismételtük 2 x löTClD.se fertőző Eystrup törzzsel. Az állatok, fertőzés után nem mutattak klinikai jeleket, és a hőmérséklet normális maradt (5. ábra), A deléciós mutánssal fertőzött sertésekkel ellentétben, a helyreállított vad típusú vírussal oltott állatokban 'kifejlődött fatális, klasszikus sertésláz,. Egy állatot el kellett pusztítani a fertőzés utáni 11, napon, a többit 3 nappal később. Valamennyi állat mutatta a klasszikus sertésláz tipikus szimptómáit, azaz lázat, hasmenést, anorexia, patológiai jeleket, mint például vérzéseket különböző szervekben, például vesében.
5,a táblázat; Tesztfertőzés utáni klinikai jelek
2. állatkísérlet
Klinikai jelek
Állat. sárs. Fertőzés láz hasme- nés CHS rendelt anore- xia vérzés bőrben apátia 44 444
#43 C-346-Ö - - - - - - n.a.
#47 C-346-d - - - - - n.a.
#87 C-346-d - - - - ·· - n.a.
#27 C-346-d/RS + ·+· + 4 - 4 '* 4
#28 C-346-d/RS 4 4· -¼ 4 - 4 4- m
#30 C-348-d/RS 4 vi- 4· 4 - 4 4 4
* láz csak 1 napig
** Az eutanázia napján haldokiott az állat... *** Vérzés szervekben necropsia esetén.
7SS?.U/i'A3 * X
5a, táblázat:
fiatal sertést („Germán fend raee”, körülbelül 20 kg testtömeg) két csoportra osztva (az egyes csoportokat elkülönítve, izolált körülmények között tartottunk) alkalmaztunk ebben a kísérletben. Három állatot C~346~d (5 x 1.0^ TCID'so) mutánssal és 3 állatot €~346-d/RS~el (5 x .UH TCIDsfe fertőztünk, A C-346-d./RS a C-346-d-mut.ánsből származott úgy, hegy helyreállítottuk a vad típusú E^s-gén szekvenciáját, A rektálís hőmérsékletet és a klinikai jeleket rögzítettük és összegeztük; n.a.: nem végeztünk necropsíát.
5to táblázat:
Diagnosztikai RR&z-feszt fertőzött átóoRbót virémia közben kinyert vírusokkal
Alfort #3. állat C-297-K #5. állat C-297-K #27. állat 0-346d/RS #28, állat C-346- d/RS #30. állat C-34Ó- d/RS Kont- roll
ODeoo 1,84 0,60 0,56 1,84 1,93 1,94 0,49
Vírusokat a 3. és 5, számú állat véréből a fertőzés utáni 5. napon, és a.
2. állatkísérletben (az 5. példában leírtak szerint) alkalmazott, .27.., 28. és 30. számú állat véréből nyertünk ki a fertőzés utáni 7. napon, szöveítenyészetben. szaporítottuk azokat, títráltuk és RNáz-akdvításra teszteltük, a fentebb leírtak szerint. Nem-fertőzött PKlS-sejtek és vad típusú CSFV (Alfort)-törzzsel fertőzött sejtek szolgáltak kontrollként. A 3. és 5. számú állatokat C-297-Kmutánssal fertőztük, míg a 27., 28. és 30. számú állatot C-346-d/RS-mu~ tánssal fertőztük, a táblázatban jelöltek szerint.
6. példa: Eos-ben tévő dupla mutáció hatásai
EXNS-ben lévő dupla mutáció hatásait teszteltük az adott vírus természetes gazdaszervezetben való replikációjára. és patogenitására, ebből a célból állatkísérletet végeztünk V(pA./C-297-L/346-b)-mutánssaI. A CSFV teljes hosszúságú, mutáció nélküli klőnjáből p/(pA/CSFY)] előállított vírus szolgált pozitív kontrollként Az egyes mutációkhoz három fiatal sertést (fájta: „Germán land raee”, körülbelül 25 kg testtömeg) alkalmaztunk. Az Infekcíös dózis 1 x 10* TCIDso volt állatonként; az oltás kétharmadát intranazálisan adtuk be (egyroe/si;
»» ♦-» * · β>
-egy harmadol orrlyukanként), egy-harmadát íntramuszkulárísan. Vérmintát vettünk az állatoktól a fertőzés előtt (ö. napon) és az 5« 8., 12. és 20, napom Továbbá naponta feljegyeztük a testhőmérsékleteket (6. ábra). A dupla mutánssal fertőzött állatok nem mutattak semmilyen klinikai szimptőmát, és az állatok nem hagyták abba a táplálkozást Az állatok (45/2. és 45/3.. állat) lázmentesek voltak a kísérlet teljes ideje alatt, kivéve a 45/1. állatot a 8. napon, melyet valószínűleg, bakteriális sérülés okozott a jobb hátsó láb sérülése következtében. Miután ez az állat antibiotikumos kezelést kapott a 10. napon, a hőmérséklet egy napon beiül visszatért, a normál értékekre (6. ábra), Valamennyi állat vérmintáiból vírust izoláltunk az 5. napon, mig későbbi időpontokban nem detektáltunk vírémiát (6.a táblázat), Valamennyi állat semlegesítő antitesteket termelt (6,b táblázat). A 45/1, állat esetén a semlegesítő titert újra meghatároztuk a fertőzés után 4,5 hónappal, és 1:4374-nek találtuk. Tehát a dupla mutánssal való fertőzés hosszan· tartó immunológiai memóriát eredménvezett.
♦ *** *
« * X X ♦ .».♦ >* » ν ♦:*.·* * **
7. példa: „S-346-«f’-jelű BVDV-virus immunogenifása és gyengítésének elve
A kísérletet arra a célra terveztük, hogy vizsgáljuk a gyengítési elvet és a ρΑΖΒ-346-d-ből helyreállított „B-346-d*-jelü BVDV-virus immunogenitását, spA/BVDV/íns-”-ből helyreállított „B-WT-hez viszonyítva.. A „B~34ő-d*~vir«.s az eredeti 349. BVDV-helyzetben. mutáns, de wB-3465,-nak nevezzük, utalva, az
1. ábrán bemutatott CSFV-Alfort 346. helyzethez viszonyított 'helyzetre.
Kiválasztottunk három csoport BVDV-szeronegatív, 3-6 hónapos állatot. Az 1. és 2, csoport 5 állatot tartalmazott, míg a 3. csoport 3 állatot tartalmazott. Az· 1. és 2. csoportban lévő állatokat megfertőztük 2 x 1Ü6 TCIDso Β-346-d (1. csoport) vagy B~WT (2. csoport) beadásával, 5 ml térfogatban, beadási módonként. Az állatokat intramuszkülárisan (farizomba), intranazálisan. és szubkután (lapocka fölött) fertőztük. A fertőzés utáni 14. napig terjedő időperiódusban mindkét csoportban követtük a. virémlát olyan paramétereken keresztül, mint a vérsejtvírémia és víruski áramlás orrkenetben. Továbbá klinikai paramétereket követtünk, úgymint rektális hőmérsékletet, fehérvérsejt-számot és általános egészségre jellemző paramétereket.
Protektlv immunitást vizsgáltunk antigén ikusan heterolög és virulens BVDV-izolátummal (413) szembeni fertőzéssel, 77 nappal azután, hogy az 1. csoporthoz tartozó állatokat Β-346-d-vel fertőztük. A 3. csoporthoz tartozó állatok szolgáltak fertőzési kontrollként, és ugyanolyan eljárás szerint fertőztük azokat, mint az 1. csoporthoz tartozó állatokat a virulens BVDV-izolátummal. A BVDV-virus (413) eltérd antigenikus (11. típus) csoporthoz tartozik, míg a Β-346-vírus Pe Hetin, C, é.s munkatársai (Virology 203, 260-268 (1994)1 által leírt, osztályozás szerinti antigenikus (1. típusú) csoporthoz tartozik.
Az 1. és 3. csoportban, lévő állatokat megfertőztük 2 x Wb TCIDso BVDV-izolátum (413) beadásával, 5 ml térfogatban beadási módonként. Az állatokat intramuszkülárisan (farizomba), intranazálisan és szubkután (lapocka fölött) fertőztük. A fertőzés utáni 14, napig terjedő idöperíódusban mindkét csoportban követtük a virémlát olyan paramétereken keresztül, min t a vérsejtvirémía és víruskiáramlás orrkenetben. Továbbá klinikai paramétereket követtünk, úgymint, rektális hőmérsékletet, fehérvérsejt-számot és általános egész34 ι·**Ό •ϊ *>* X* «' ** ségre jellemző paramétereket.
Β-346-d-vel való fertőzés után az állatok nem mutattak semmilyen BVDV-re jellemző, tipikus klinikai szimptőmát, például megnövekedett rektális hőmérsékletet (7,a. táblázat) vagy légzőrendszert érintő bármilyen klinikai szimptómát (nem mutatjuk bei.
A csökkent vérsejfcvirémia (7.b táblázat] és orrkenetben való víruski áramlás (7.0 táblázat) egyértelműen jelezte a B~346~d gyengitettségét a B-WT-hez képest.
A virulens #13:~BVDV~izolátum a 3. csoporthoz tartozó állatokban erős virémiát Indukált BVDV-fcrtőzés tipikus jeleivel, úgymint rektális hőmérséklet megemelkedésével néhány napos időtartam alatt (7.d táblázat), erős leukopéníával (7.e táblázati, kiterjedt. vérsejt-virémiávál (7.f táblázat) és víruskiáramlással az orrkenet-folyadékfoan (?.g táblázat). Ezzel ellentétben, az 1. csoporthoz tartozó állatok, amelyek Β-346-d-vei lettek oltva, nem mutatták BVDV-fertőzés tipikus klinikai szimptómáit. virulens £ 13-BVDV-izolátummal való fertőzés után, Nem volt szignifikáns növekedés fertőzés után a rektális. hőmérsékletben (7»d táblázat), A megfigyelt leukopénia nagyon jelentéktelen, volt nagyságában és időtartamában f?.e táblázat). BVDV-t nem tudtunk Izolálni a vérből (7.Í táblázat), és csak egy állatban tudtunk detektálni víruskiáramlást az orrkewt-váladékban (7,g táblázat).
Ennélfogva B-346-d-vei valő fertőzés erős immunitást indukál, amely egyértelműen csökkent klinikai jeleket, víruskiáramlást és vérsejt-virémiát heterolög BVDV-izoláíumma! való fertőzés után.
7. a táblázat:
Átlagos rektális hőmérséklet az 1. (Β-346-d) és 2. (B-WT) csoportban
Napok ö 1 2 3 4 5 6
Les. 38,8 39,1 39,0 38,7 38,8 38,7 38,7
2.CS. 38,8 39,0 38,9 38,6 38,6 38,7 38,6
Napok 7 8 9 10 11 12 13 1.4
Los, 38,5 38,7 38,5 38,5 38,5 38,4 38,9 38,7
2,cs. 38,4 39,1 38,4 38,4 38,6 38,7 38,6 38,6
*♦
Az 1, csoportban, lévő állatokat a 0; napon fertőztük 6 x 10b TCIDso Β-346-dvel, míg a 2, csoportban lévő állatokat ő x 10& TCIDso B-WT-vel fertőztük.
tőzés utáni 1Ö. napig, naponta. 0,2 ml vért adtunk borjúból származó heresejtek (Cte) 3 tenyészetének mindegyikéhez. amelyek heparint (1 egység/ml véralvadás gátlása céljából) tartalmazó tápközegben voltak. Egy éjszakás inkubálás után az ínokulum-tápközeget lecseréltük friss, heparinmentes tápközegre. 4-6 napos inkubálás után a BVDV-fertőzött sejteket immuníluoreszcenciávai detektáltuk, BVDV-re specifikus poliklonális -szérummal.
A negatív tenyészeteket lefogyasztottuk, és azt követően felolvasztottuk. Ezekből 0,2 ml-t második passzálásra vittünk Cte-sejtekre, BVDV hiányának megerősítése céllábói.
7,c táblázat:
Víruskiáramlás orr folyadékban
Csoport Állat Viruskiáramlás orrkenetben Vírusok kimutathatóságának átlaga (napok)
Első napja Utolsó napja Tartama (napok)
1 1 4 8 4 2,6
2 6 6 ΐ
3 4 4 1
4 5 7 3
5 3 6 4
2 6 6 8 3 3,6
7 5 7 3
8 5 3 4
9 5 6 o
10 3 9 6
Orrváladékot lecentrifugáltuk (1-000 g) a durva törmelékek és szennyeződések eltávolítása céljából. A felülúszó-folyadékot kivettük, és 0,2 ml-t ráoltottunk a három sejttenyészet mindegyikén;. Egy éjszakás inkubálás után az ínokulum-tápközeget lecseréltük 2 ml friss tápközegre. 4-6 napos inkuhálás után. a BVDV-fertozött sejteket immunfluoreszcenciával detektáltuk, BVDV-re specifikus poliklonális szérummal.
7«d táblázat:
»·»·»
A rektális hőmérsékleteket a fertőzés utáni 16. napig követtük. Az 1. és csoportban lévő állatokat a 0. napon fertőztük 6 x 10ö TCIDso virulens #13 B VD V - í zo látummal.
7.e táblázat:
val naponta, a. fertőzéshez képest -2-től 14. napig. Az EDTA-vérmintákban lévő fehérvérsejt-számokat Systnex Miero-Celí Counter F800 alkalmazásával határoztuk meg,
70311
7O>2 *··<♦.*
7f. táblázat:
Vérmintákból izolált BVDV
Csoport Állat Vírus detektálása vérben Időtartam átlaga (napok)
Első napja Utolsó napja Tartama (napok)
1 1 - - 0 0
2 - - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 - - 0
3 n 3 10 8 9,7
12 3 14 12
13 3 9 9
Vérmintákat vettünk EDTA alkalmazásával a fertőzés utáni 10. napig, naponta. 0,2 ml vért adtunk borjúból származó heresejtek (Cte) 3 tenyészetének mindegyikéhez, amelyek heparínt (1 egység/ml véralvadás gátlása céljából) tartalmazó tápközegben voltak. Egy éjszakás ínkubálás után az inokulurn-tápközeget lecseréltük friss, heparínmentes tápközegre. 4-6 napos ínkubálás után a BVDV-fertőzött sejteket immunünoreszcenciávai detektáltuk, BVDV-re specifikus poliklonális szérummal.
A negatív tenyészeteket lefagyasztottuk, és azt követően felolvasztottuk. Ezekből 0,2 ml-t második passzálásra vittünk Cte-sejtökre, BVDV hiányának megerősítése eélj á bő 1.
Rfs Z ?g, táblázat:
Virtaskiáramíás orrfolyadékban
Csoport Állat Vírus kiáramlás orrkenetben. Időtartam átlaga (napok)
Első napja Utolsó napja 'Tartama (napok)
1 1 3 4 2 0,8
2 - 0
3 - - 0
4 - - 0
5 4 5 2
3 11 3 14 12 10
12 3 14 12
13 3 8 6
örrváladékot lécéntrifugáltuk (1 Oöö g). a durva törmelékek és szennyeződések eltávolítása céljából. A feíülúszó-folyadékot kivettük, és 0,2 ml-t ráoltottunk a három sejttenyészet mindegyikére, Egy éjszakás inkubálás után az inokulum-tápközeget lecseréltük 2 ml friss tápkélzegre, 4-6 napos inknbálás után a BVDV-fertőzött sejteket immunöuoreszceneiával detektáltuk, BVDV-re specifikus poliklonális szérummal.
8. példa: C-346-d és CSFV megMönfeöztetése a 346. hisztidin-tódon deléeiója nélkül, RT-FCR alkalmazásával
A C-SFV“glIkoprotein-ER^:!5-ben lévő konzervatív RNáz-motívumot kódoló RNS-szekvencia nagymértékben konzervatív. Az összes ismert CSFV-szekvencia közül egyikben sem találtunk nukleotid-cseréket a CSFV-Alfort-törzs közölt (Meyers et al., (1987b szekvenciájában, a 1387-1416. nukieotidoknak megfelelő régióban. Tehát a genom ezen konzervatív régiójából, származó oligonukleotíd-primereket. lehet alkalmazni RT-FC.R vizsgálati eljárásban, valamennyi CSFV-izolátum detektálására (lásd 7, ábrát). Ennek következtében a
73Sli3/Rft2
346. hisztidint kódoló tríplet (1399-1401. nukleotídok) hiányát megfelelően tervezett primer alkalmazásával lehet detektálni. A konzervatív régiót lefedő,, különböző olígonukleotídokat. szintetizáltunk, amelyek a hisztidín-kődont tartalmazták vagy nem. Ezek az oligonukleotidok szolgáltak S'-végí primerként RT-PCR-reakciÓkban. amelyekben S’-végi primerként E'RNS'-Stop~oligonukleo~ tklot. alkalmaztunk. C-346-d-, C-WT-, €-346-2- vagy C-346-K-val fertőzött sejtek szővettenyészeteiből izolált RhS-t alkalmaztunk terápiáiként. 2 ag hódenaturált. RNS (2 percig 92°C-on, 5 percig jégen 11,5 μΐ vízben 30 pmol reverz. primer jelenlétében): reverz transzkripcióját ügy végeztük, hogy hozzáadtunk 8 pl RT-keveréket (125 mM Tris/HCl pH 8,3,. 182,5 mM KC1, 7,5 mM MgCfe, 25 mM diíiotreitol, egyenként 1,25 mM dATF, dTFP, dCTP, dGTP), 15 U RN&guard-oí (Pharmacia Freihurg, Németország) ős 50 ü Superscript-et (bífe Technologies/B'RL, Eggensteín, Németország) 45 percre, 3-7'eC~on. A reverz· transzkripció befejeződése után a csöveket jégre helyeztük, és hozzáadtunk 30 pl PCR-keveréket (8,3 .mM Tris/HCl pH 8,3; 33,3 mM KC1; 2,2 mM MgCIz; egyenként 0,42 mM. dATP, dTTF, dCTP, dGTP; 0,17% Triton X-100; 0,03% marhaszénim-albumra; 5 U Taq-polimeráz, Applígene, Heidelberg, Németország) és 16,7% DMSO-t. Ha „01 H+3!!-primert alkalmaztunk, az amplí&káciős reakciókeverék nem tartalmazott DMSO-t,. Az amplifikácíót 36 ciklusban végeztük (30 másodperc 94°C-on; 30 másodperc 57°C-on.; 45 másodperc 74°C-on). Az amplifskációs reakciókeverékbőí 1 μΐ-t felvittünk T%-os agaróz-gélre, az amplifíkált termékeket elektroforézissel elválasztottuk, és etídium-brom.iddal megfestettük. A 7. ábrán bemutatottak szerint, az „01 H-3*/Oí E-ms'Stop” prirner-pár lehetővé tett egy csík specifikus anipliSkáiását a 346. kódon deléciöját tartalmazó RNS-bol, míg két más· primer kombinációjával olyan termékeket amplifikáltunk, amelyek tartalmazták a 346. kódont, és nem ügyeltünk meg csíkot akkor, ha terápiáiként olyan RNS-t alkalmaztunk, amelyben ez a kódon deietáiva volt.
? f\ft -j
♦ »
Primerek RT-PCR-hez:
(upstream) 5’-végi;
Ol H*2: TGGAACAAACATGGATGG (downsirearn) 3 -végi:
Az ábrák rövid magyarázata:
1» ábra: A CSFV-Alfőrt-törzs által expresszáít első 495 aminosav
A szekvencíalistáhan bemutatjuk az első 495 aminosavat, ahogyan a CSFV-Alfort-tőrzsben expresszálódík (Meyers et. at, Virology 171. 555-567 (1989)]. Az említett törzsből származó glükoprotém-ERNS egy monomerje megfelel a Rümenapf és munkatársai [J, Vírol 67, 3288-3294 (1.993)] által leírt 268-494. aminosavaknak. A 295-307. és 338-357. aminosavak (alá vannak húzva) megfelelnek azoknak a régióknak, amelyek homölógiát mutatnak növényi és gomhaeredetü RNázokkal (Sehneíder et ah, Science 261, 1169-1171 (1993)1,
2, ábra: Állatok rektális hőmérsékletének görbéi tesztfertőzés után
Naponta rögzített rektálís hőmérséklet vírusfertőzés előtti 2. naptól a vírusfertőzés utáni 18. napig. A rektálís hőmérséklet görbéit részletesen felvettük azokban a csoportokban lévő állatokra, amelyeket pÁ/CSFV-plazmidból származó V(pA/CSFVV-virussal (folyamatos vonal), vagy pA/C-346-d-plazmidhől származó V{pA/C-346-d)-vírussal (szaggatott vonal) fertőztünk.
3. ábra: Álatok rektálís hőmérsékletének görbéi fertőzés után
Naponta rögzített rektálís hőmérséklet vírusfertőzés utáni 1-21, napokon, 69 nappal korábban C-Sőő-d-mutánssal (V(pÁ/C-346-d)] oltott állatokat fertőző CSFV-Eysírup-törzs letális dózisával fertőztünk a szövegben részletesen leírtak szerint. A rektálís hőmérséklet görbéit részletesen felvettük abban a csoportban lévő állatokra, amelyeket 2 x lö5 TCIDse, fertőző CSFV-Ey-struptörzzsel fertőztünk.
?0«íi3/&&2 * » *
4, ábra: Állatok rektális hőmérsékletének görbéi tesztfertőzés után
Naponta rögzített rektális hőmérséklet vírusfertőzés utáni 1-18, napokon. Á rektális hőmérséklet görbéit részletesen felvettük azokban a csoportokban lévő állatokra, amelyeket C-346-d-vel [V(pÁ/C-346-d)1 (szaggatott vonal), vagy helyreállított C-346-d/RS-vlrussal (V(pA/C-346-6/ Rs)] (folyamatos vonal) fertőztünk.
5, ábra: Rektális hőmérsékletek fertőzés után a 2« állatkísérletben
Naponta rögzített rektális hőmérséklet vírusfertőzés utáni 1-10. napokon, 37 nappal korábban C-346-d-mutánssal oltott állatokat fertőző CSFVEystrup-törzs letális dózisával (2 x lös TClDufi fertőztünk.
6. ábra: A 6. példában leírtak szerinti kettős mutánssal kezeit állatok rektális hőmérsékletei
Naponta rögzített rektális hőmérséklet V(pA/C-297-L/346-L)-motánssaI való vírusfertőzés előtt és után.
7. ábra: C-346-d és CSFV megkülönböztetése a 346, hisziidm-kódou őeléciója nélkül, RT-PCR alkalmazásával a 8, példában leírtak szerint
a) Az „Öl H-S’V’Oí Ems>Stop* primer-pár lehetővé tett egy esik specifikus amplífikálását a 346. deiéeícs kódon (C-346-d) delécióját tartalmazó RNSbői, részletesen a 8. példában leírtak szerint. Ezzel ellentétben, ezt a délécíót. nem tartalmazó RNS nem lépett reakcióba a prímer-párral (C-WT, C-346-1, C-346-K), bj és e) A két másik primer kombinációjával (ΟΙ Η·τ2 és Ol Hfe3) olyan terméket amplifikáitunk, amely olyan RNS-böl származott, amely nem tartalmazta a 346. deléciős kódont (OI H*'2: és OI H*3). Nem figyeltünk meg csíkot akkor, ha. templátként olyan RNS-t. alkalmaztunk, amely a C-346-d 346-deléciós mutánsból származott.
♦ φφφ ν «φ «« e > 4 « ♦ * * ν « » *
X Φ ♦ >* XX Φ ♦ * * « * » * χ
ΦΦ ΦΦΧ «φ φφ φ« (SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE)
SEQUENCE CSÜNG <110> Boshringer Ingeíheim Vetmedica SmW < 120 Aítenuaíed pestmruses <130 1-1039 A <140> 02003407,0 <141> 2002-02-14 <150> 02003407 Ό <151 > 2002-02-14 <100> 28 <170> Palentin Var, 2.1 <2ÍO> 1 <211 >20 <212> DNA <213> Artifseisi Sequence <220>
<223> Descrípüon of AríifíCai Sequenee: Primer <400> 1 ttg^5«tc«5 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificiai -Sequence «220 <223> Oescription of Artíficíai Seguencs: Primer <400> 2 ν 4 4
4« » « Κ 4 5 * « 444 44 4
X 4 «4»4 X
4« 4*4 Χχ 4« 4 4 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213=* Artifíoial Segítene® <220 <223> Deacription of Artificiaí Sequence: Primer <40Q>3 ecegg&gett aassgg^ate sgge <210 4 <211 >24 <212> DNA <213> Artiíibai Segítene® <220 <223> Deseriptíon of Artsftcsai Sequence: Primer <4004
4.t^»aC<«* .«ag-95»€ig«5fc <3ΐ.·»^ i<
<210> 5 <211 >24 <212> DNA <213> Artüsessl Seq uenee <220 <223> Deecription of Artifidai Seguence: Primer <400> 5 t#*c 44 <210 6 <211 >30 <212> DMA * Φ φ ♦ φ φι > φ
Φ X ♦♦♦ ♦+ *
X Λ X * » t » >
Χ·* «9ν «X X Λ X φ.
<2Ί3> Artsíseiai Sequence <223» Descríptkm of Artsficbl -Sequence: Primer «400» 6 aonasqgirg gtgeaeoógg «210 7 <211 >495 <212» PRT «213» Arbíicis; Seqyence <22ö>
<223» Deseripííon of Artiííeial Sequenee: CSFV metánt <400>?
Hot: Fro Glu Val Lee Gly Asn. Mis éhe <Cu Leó val Le« Tyr 25 Tyr Ϊ0 Asp is V-í* Thr Thr Sor Alá Gly Lys Arg 30 Gin 15 Frö Lys Lee
»s. V.;C Gia 26 Gía Pro
éhe Gly Asn 35 érő Sor Glv Vei His 4 a Pro Cin Ser Thr Lee 45 Lys Len Őre
His Asp 50 Arg Gly Arg Gly Aap 3$ lle Arg Thr Thr Lee Arg 50 kp Leó Pro
Arg 65 Lya Oly Asp Cys Arg lö Sár Gly Asn His Laa 75 Gly Fró VAl Gór Gly 05
Χίε Tyr Ik Lys Pro 05 Gly Pro Val Tyr Tyr 110 Gin Asp Tyr Thr Gly $5 Fso
VS 1 Tyr his Arg Alá 100 Frs L-ÓV Giu éhe 105 The Asp Cin Alá, Gin 110 Phe Cys
Gle Val Thr 11$ Lys Arg Λ Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lys Lóé
Tyr His 130 Xle Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Xlo Lav Leu 140 Lya Lee Ax&
Ays 143 Arg Thr Fro Ar§ 150 Thr Lse Ly< Trp lío 5 £Λ »S. Λ'· \·’ Arg Asn Th r Aa; ífh
»·«* jr ·«·* Λ y* r »·:***< * * * ««* ** * χ * Jt . v X 4 >* 4** ** :*♦ ♦*
Cys rre Leu Trp Val 1L 5 Thr S-ex Cys Oer Asp 270 Asp Gly Ai n $e í <4.y 175 Ser
Ι,'γ.ίί Asp Lys Lys 2 r«s ISO Asp Arg Két. Asa 135 Lys Gly Lys Lee Lys 190 11 e Ál a
rrn Arg Gin 135 his· Ciu Lys Asp Sor Ly» w Thr Lys 2 re ÍLC 205 Asp Ál A Thr
11© vai. 210 Val Glu Oly Val Lys Tyr Glu 21S Ile Lys Lys 220 Lys Oly Lys Val
Lys 22 5 Gly Lys Ár.n Thr Gin Asp Gly Leu 232 *>>xyv» >yr 5' is 253 ASO: Lyn Asn ·*&* Őre 2M
Lm Glu 5 U £ Arg Lys ;'«s. *s n \V Lys L«u Glu Lys Alá 253 Leu Lau AH Trp Alá 255 Val
He Thr I ru Lse Leu 3éO Tyr Glu Pr© Val 203 Aj. a Alá du te© Tíe 2M Thr Gin
Trp Aln I.XS'ii 27S Ser Asp Asn Si.y Thr Asn 20 ö £?,1 y He < Ú t es Arg 205 Alá. Met Tyr
Arg TAS Oly Val As Arg Oly Le. u Uis. US y Trp 300 Fre Glu r.ye XX e
Cys 305 Lys u.i y Val Pro Thr His Lrn Ale 313 Thr Asp 315 Thr Glu Lhe Lys Glu 33 0
Ile Arg w.y Met Hét 325 Asp Alá ser Glu Arg .330 Thr Asn Tyr Thr Cys 333 .,«f. k _ d' S
Arg Leu Gin Arg Kis 340 Őla Trp Asn Lys MS Kis Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
Ms IU Asu JL. íl x* ςχ' >*' ?rc Trp 11« Sin Leu Két 3 30 .Vn Arg Thr Gin 365 Thr Aon Lnu
Thr Cin 370 Gly pro· Psö Asp Lys Glu Cys 3 ? 5· ÁM Vél Thr 330 cys· Arg Tyr AéU
Lys se s Ase Thr Asp Var Asn Val Val Thr 393 Gin Ai* 355 Arg As© Arg prn Thr 4LÖ
Thr Leu Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lyp Asn 213 The Ser Pb© Ál a Gly 415 Thr
Val i:u Gin Gly 2té 420 Cyg Aén The Asu 4 25 Val Ser Val Glu Asy 430 i Λ,.ίΧ' Lé©
Tyr Gly X Asp 435 Kis Gin Cys Gly Óét Lég 440 L«V Gin Asp Thr 445 Álé Lee Tyr
L«u Xí&U; Asp Gly Hot Thr Asn Thr Hu Glu ÁSh Alá Aí? í»X n Gly Als
450 4 5# 4bO:
* φ
V e » φ Φ * ♦ **
V φ φ Φ * * φ « > κ« ♦ * * * * * *' βφ ΦΦΦ φφ ♦♦
Alá Ara 165 Vsi Thr Sí»·** λ» ΛΕ φ. Trp i')0 Lh« Gly Arg *< 1 M urn Leu 435 Ser Thr Alá Gly Lys 19 C
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe G 4S5h 4SÖ <210 8 <211 >492 <212> PRT <213> Artfeisl Ssqucnee <220> <223> Desoopfion of Artiftelal Sequen.ce:. CSFV múlani 7y Alá Tyr ; r^-Xa 4 SS
<4ÖÖ>8
Aer. Cl u 1. Len Ajsn Ki;; S> Phe Glu Lau Leu Tyr 10 Lys Thr ser Lys Gin Lys 15
Pre V4l \? Λ Val ‘>Λ Λλ V νΐ 1 <v L.5 L \<í Glu pro Val Tyr 35 Asp Thr Ax s GI y M 30 P ί o Len
Phe Gly 35 Pro Ser Giu Val Ms 45 Pro Gin Sex: Thx Lee 4 5 Lys Len Pro
His Asp 50 Arii Gly Arg Gly Áhp 11« 55 Arg jp Thr Leu Arq 50 A&jss Leu Pro
Arg Lys es Gly Asp Cys Arg ?Ö Ser íliy Ars His Leu 75 Giy Pro Val Ser Gly 80
η « Tyr Ly$ Pre 55 Gly Pro V,s · Tyr Tyr Sí Λ í? Stf Sir Asp Tyr Thr Giy Pre 75
Vei Tyr Kis ICO Ale S$ \** 4. A. tt- Leu Giu Phe 105 F&a Asp Gin Als Gin 1IC Phe Cys
Glu. Vei Thr 1.15 Lys Arq: lle Giy Arg 120 v«i •Tí:k φ· 4 öl Gly Ser Asp 125 Gly Lys Leu
Tyr Hls 130 11« Tyr Val Cys Vei Asp 135 Gi y Cys lle Len L«u á4L Lys L«u Aia
Lys Ara 145 Oly Thr Pro Arg ISO Thr Leu Lys Trp lle 155 Arg Asn Phe Th r Asn 107
Cys Pto Le a Trp Val 15.5 Thr Ser Cys Ser Asp XTG tep Gly Alá Ser Gly Ser 1'? 5
Lys Asp Lys Lys 150 Pre Asp Arg Hot Aro 185 Lys G.ly Lys Len Ly« 170 tie Aia
* φ
X Φ ♦ *
Oro . Arg ; Glu 155 HiS J Glu Lys .Mp Ser 200
iie Vat 21 δ Vél G lé Oly Val Lys 215 Tyr
Lys 225 Gly Cys Asn Thr G1n 230 Asp Gly
2xo Glu Sár Arg Ly$ 245 Lys Leu Glu
Ile Thr 11 e Léé 250 Léé Tyr Cin 9ro
Trp Aon Lch 215 501 Asp Asn Gl y Thr 230
Lén Arg 290 Gr y Val Asn Arg Ser 245 Π4
Vél 30 5 Tre Thr 1>ΛϊΛ2 Álé 318 Thr Asp
Met Hét Asp ser 325 Gin Arg Thr
Arg Kis Glu Trp 540 Asn Lys Ols Gly
2 te Trp ile 355 Gin Lee Hét Asn Arg 350
Pro Őré 320 Asp Lys Giu Cys Alá 375 Vsl
305 V® 1 Art Vél vai The 330 Gin Ah
Gly Cys Lye Lys Oly <0S Lys Asn «he
Gly 2ro Cys Asn ,< *?'Λ “ ώ ’v* The Asn Vél Ser
iSis Giu Cys 435 Gly Ser Leu Len Gin 440
Gly Hét 452 Thr Aén Thr tlé Glu 455 Asr.
Thr 465 Ser Trp Leu Giy Arg 4 30 Gin Léé
Xrp Arg Ser Lys Thr Trp Ohe Oly
403
Lys Thr Lys y W *. λ < «? £ .ν. ví *< Λ ώ V A.? Asp Alá Thr
Gin 11 a r.y.s χ<^* $ xk'y s 3'20 Gly Lys Val
Oeu Tyr hl» Asn Lys A$n Lys F£é
235 240
Lys Aln Leu 250 Léu Álé Trn Álé 255 val
Val 2.55 Alá A.l s Glu Asn Ik 270 Thr Gin
Aso Gly jle Λ Gin Ara 255 Al 3 Tyr
Trp 2re Clu Lys tle Cys s Gi y
300
Thr Glu Léé Lys Oru 3Ie Arg Oly 320
Asn Tyr Thr 330 Cys Cys A.rg .Leu 33$ Gin
Trp 345 Cys Asn Trp Tyr Asn 350 He Asp
Thr Gin Thr Asn Leu 305 Thr Gl.u Gly
Thr Cys Arg Tyr Asp 3S0 Lys Asn Th r
Arg Aso Aty 305 Pro Thr Thr 6 í<£ Ut Thr 4 00:
Ser Ohe Alá 410 Gly Thr Va 1. Ue 410 Gle
Vei 425 Glu Asp 11e Leu Tyr 430 Gly λ;φ
Asp Thr Alá Léé Tyr 445 Leu Leu Asp
Alá Arg Gin Gly Álé 400 Alá Arg Vul
ser Th r Al a 47 S Oly cya Lys été Glu 480
Ma Tyr. Alá Leu
4§0
Leu * φ ♦ * «210 9 «211 >494 <212> PRT <213> Artifidal Sequence <220
«223> DescFíption of Artifíciai Sequence: CSFV mutant
<4Q0> 9 Phe Ol ö Lep Leu Ty r 1.0 Lys Thr 5er Lys Gin Lys IS
Hefc Glu Leu í 1 His : 5
Pxo Val Gly Vei Glu « 20 01« Lrc Val Tyr Asp 26 Thr Alá Gly Arg Pro Leu 20
Fhe Gly Ásni 35 ’ro Ser < 51« Val His Pro- Glo 10 Ser Thr Leu Lys Leu Pro. n
His &5ψ Arg SJy An? * Sly Asp ile Arg Thr 55 Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arc Lys Vly 65 Aí;p Cys ,Arg Ser Gly Ar·. His TÖ Leu Gly Pro v&i Ser oly 75 §0
Ile Tyr Jlo- Lyy pxu 85 Gly Pro Val Tyr Tyr SÓ Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
vai Tyr Sis Arg -Alá 100 Pro Leu Glu Phe Phe ns Asp Glu Alá Gin Phe 'Cys 11 δ
Glu Val Thr 115 Lys Arg He Oly Arg Val Thr 120 Oly Sec Asp Gly Lys Leu ϊ ·κ. •X >\ >4
Tyr Hí..s ile no >7- Vs.t. Cys· Val Asp Oly Cys BS Ile Leu Leu Lys Lnu Alá 110
Lyrs A;:y Gly lU Thr 2 ró Arg Thr Leó Lys Trp 150 Ile Arg Asn Phe 'Thr Aam 155 ' 160
Cys $x« T««u Trp Vál 165 Thr Ser Cys Per Asp no Asp Gly Alá Sex Gly Sex >75 X· * v.'
Lys Asp lys Lys 8ru 100 Asp Arg HAL Α»λ Lys 105 Gly Lys Leu Lys ile Alá no
Px-g Arg Glv XSS Kis Glu Lyr Asm Ser Lys Thr 200 Lys Pxe Px» As-p Ma Thr 205
Ily Val Val 2.10 Glu Gly val Lyh Tyr ele ile 2ÍS Lys Lys Lys oly Lys val V?8
Lys Oly Lys 223 Asn Thr Gin Asp Oly Lou Tyr no Ois- Αχ» Lys Asn Lys Pro 235 J 240
50 > *»« * * 9 9 0 0 W * « + ♦ * fit ♦*» * •«, · *; * « ® x «. * :* * ♦ ♦ * * ** ♦♦
F ϊβ Gitt. Sm Arg Lys 245 Lys lm Gin x>ys Arist 2S0 Len L®« M« trp Alá 255 WL
XI® Thr X.Xe Len X.-en. 2 >50 Tyr Ön Val A3a 295 Alá Gin Mn 11« Thr 270 Gin
Trp AsSn Len Ser Asp .275 Asn Öy Thr Asn GXy 200 11« Gin Arg ΑΧ» Vet 233 'Tyr.
X.'SV: Arg 290 GXy VxU Asn Arg Jer 293 Lan COy XX a Tro Pro Gin Lys ile 300 Cys
tys 305 W Val Pr* Thr His Len 310 AU Thr Asp thr Gla Len Lys Gin 3X5 X la 320
Arg Giy Rnh £feL ASp 325 Alá 3er Gitt Arg Thr 330 Asn Tyr Thr cys Cys 335 Arg
Cin Arg Hás 349 trp Asn Lys Hl a GXy trp Cys Aan Trp Tyr 350 Asn
lle Asp Prn Trp lle 335 Gin Len Heh Asö Arg 330 thr Gin Thr Aa« Le a ,3»5 Thr
Gin GXy 330 ?m Psn Asp Lys Ghi 37 S Cys AXn Val thr Cys Arg Tyr Asp 330 i?ys
As» 3115 Thr Asp Val Asn > Val v&l 350 Thr Gin AJή Arg Asn Arg 7m Thr 395 40$
Len Thr Giy Cys Lva as Lys Giy Lys Asm Phe 4X0 Ser Phe Alá S.ly Thr 4iS Val
x- i í£ Gin Giy Fe» Cyr 420 A.SS Phfe hars Val Jer 4 2 5 Val Gitt Actp ll® Len Λ ;X< ’V ·> Λ ki Tyr
Giy Asp His Sin Cys 435 Gry Ser Lan Lan. Cin Ll Asp &hr Aaa Lan 17— 445 Len
Lan Asp 450 Giy Hét Thr Aan Thr 455 lile Gin Asn Ali Arg Gin Giy Alá UÓ AXa
Arg 4 SS Vs.X Thr sex Trp Len. Giy 470 Arg Gin Lm Sex Thr Alá Giy Lys 475 Lys sas
Leu Gitt Arg Arg Ser 405 Lys Thr trp phe GXy 4 90 Alá Tyr Aln Lett
<2W> 10 <211 >495 <212> PRT <213> AdífídaS Seqvenee
0' * * * <220>
<22.3> Description of ArtlOclal Sequence; CSFVmuíant <400> 10
Hefc ?r<- O'Xn VAX X<®V Sly Asm Vai 28 His Fhís s Glu Glu Gl 13: F ΧΌ Lee VxU Leu Tyr 25 Tyr X,ys 10 Asp Thr Thr Alá Ser Gly Lys Arg 20 Cl n 15 Pro Lys Le h
Fh s Gly Asn 35 Fsai get Glu Vei His 10 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Leú Pro
KX $ Asp 58 Arg Gly Arg Oly Arr Φ 55 XX® Arg Thr Thr * vs , „ XrC M 50 Arg Asp L&u Pro
Arq SS Lys >* A ,, , \s * 5 Asp cys Arg OS .3 sir Gly AhO Η X & Xí&á$ 7.$ Gly Fro Val Ser Oly 80
n® Tyr SX® Lys Pro Gly 85 érc Vai Tyr Tyr C-irs ÓÖ Asp Tyr Thr oly 95 Fra
V® X Tyr Hi$ Arg itó Als F.ro Lev. Olu Fh® 105 2h® Asp í* j.. νΐί» Alá. Gin 110 Fh® Cys
Glu Vai Thr X15 Lys Arg lle Gly Arg 120 Vhl Thr Oly Ser Asp X25 Gly Lys Leu
Tyr Kis m 1.1« Tyr V.3.1 Cys Vai 135 Asp Gly Cys lie Leu 143 Leu Lyr Leu Alá
Gys HS Arg in Λ $ Th? Pro A ríj XSO Thr Lou lys Trp XX® 155 Arg Asn Fh® Thr Asn 150
Cys Pro Trp Vari Thr l&b Ser Cys Ssíí Asp Asp 130 Giy Ar s Ser Oly 175 S«r
Lys Asp Lys Lys i fi l·. L‘ V F * Asp Arg Két Asn X85 Lys Oly Lys Lee Lys 170 11« Áh
Pre Ar§ SX'.j 135 H SriS UU Lys ASp Sec 200 Lys Thr Lys Fr® Pro /. O S S. ·ϊ *·*. í'n.vS’.v· hls Thr
Π® Val 210 vai 0.1« Gly va I Lys 515 Tyr Sin He Lys Lys 22 ö Lys oly Lyr Val
Lys 225 Oly Ly& Aon Thr Sin 255 Asp Oly Leu Tyr Mis 235 As n « y s Asn Lys Pro 24 8
Pro Clh Ser Arg Lys 245 Lys Leu Cl® Lys Aló 250 Leu Lee Alá Tip- Al a 255 V<jX
XX e Th-Γ X Is ií«« 2S8 Len T y r vlh Fre Vél 255 Aiá Al a λ ; x 45 i. Arn li® .*>: ”7 Thr Cin
Trp Asn L«« 272 Ser Asp Asn Oly Thr Asn 280 Gly Ha \J .*, A Ary 2 05 Alá Met Tyr
Lav Arg Gly Vei Asn Arg Ser ί SS Lys Gly Hs Trp 300 8 re Glu Lys He
Cys 305 Lys Oly Val Tre Thr 310 Húí tea A.U Thr Asp 315 Thr g.U? Len Lys Glu 32.0
n sí Arg Oly Met Met Asp 325 Alá S«t Glu Ary 330 Thr Asn Tyr Thr Cyt 335 Cys
Ary Leu Gin Arg His Glu 340 Trp Asn Lys 345 5 i s Gly Trp Cys Asn 350 Tm .·»». . . * yx
Asn U.« Asp 355 Fro Trp TU Gin Lap 350 Mer. Asn Arg Thr C 1 « 355 Thr Asn .Leu
Thr Glu 370 Oly áss l'ru Asp Lys 375 fö« Cys Alá Var Thr 352 Cys. Arg Tyr Asp
Lys Asn Tfet Asp Val A4n 330 V4l vei Thr ele AH 323 Arg ASn Arg 8 ro Thr <00
Tfer Lén Thr Oly Cvs Lys 405 Ly® ÍC V Wí Asn <10 The S C £ 2 ha Alá Cly 413 Tfer
Vai He du Oly Fre Cys 420 Asn Asn <25 Val Ser Val Gle &S5? <30 Ha Leu
Tyr Gly Asy •135 KU Glu cys <r> χ ? xuy 4<0 Leu Leu Cin Asp Thr 445 Alá Leu Tyr
L©« Le u 4 50 Asp Cly Met Thr Asn <55 Thr 11 e c.iu Asn AH 450 Arg G X fi rf-VÍ , 'U· á. y’ Ars
Als 4 65 Arg Ve r Thr Ser Trp 47 0 Leu Oly Arg Gin Len 475 V; {-X f Thr Am. Giy Lys 430
Lys Gle Arg Arc Sor 485 Lys Thr Trp Fhe 430 Gly Al & Tyr Als ica 435
<210> 11 <211> 495 <212> PRT <213> Artifíobl Sequence <220>
<223> Oesenption of Artlficlaí Sequence: CSFV mutant <400> 11 * *
M<U r Glu Lnu Aso Mis Thss Gle 5 Lee Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pre Vgl .•f* $ A .. <yi.y Val Glu Glu Prn Wi Tyr. Asp Thr Alá fU >. iSÁ. 2 Arg Prn Lan
ao 25 IÖ
Gl y Aíjíí Pro Se1 Glu Wl his F £ Gin Ser Thr Lau Lys Leu Pre
35 40 ÍL
,«1;í Asp Arg Giy Arg Giy Asp i lé Arg Thr Thr Lse Arg Asp Leu Pro
30 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Sft £ Gly Asn Ki s Leu oly Prn Val S«r Oly
85 70 7 5 80
11 ö Tyr IL Lys Oí'ö Giy 1' Ε Ö Val. Tyr Tyr Cin Asp .yj. Thr Gly Pre
85’ 90 35
Val Tyr Hís Arg Als Tro LfíU Gle Phe Phe Asp Glu Alá cin éhe Cys
100 105 no
Giu Vél Thr Lys Arg H* Gly Arg Val Thr Oly Shr Asp Gly Lys Leu
115 120 12$
Tys Mis SJL& Tyr val Cys v& .1 Ase L.I y Cys 11.® Leu Leu Lys Leu Alá
UO Π5 140
Lys Arg Gly Thr U Arg Thr Leu Lys Trp J.U Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 180
Cys P tö LSL Ttp Wl TAS: 1L5 3éX CyA Ser Asp no Asp Gly Aia Ser Gl y 173 Ser
Lys Asp Lys Lys Pro Asp 150 Arg Hat Asn. ? he A* J> Lys Gly Lys Len LyS Ile 150 Aia
8 r& Arg 01a Mis Glu Lys ASp Ssr LVS w> Thr lys Fcg Pre- As p Al a L
198 200 205
Ile Val V&X Gin Gly V«I ty'S Tyr 1.1 e Lys Lys Lys Oly Lys Val
no 215 -*$?*> -í$ A. JÍ- \í
Lys Cly Lys Asg Thr cla Asp Lly Lee Tvr }í KI a Asn Lys Asn L«ys Pro
225 Ui 235 240
Ffco Glu Ser Arg Lys Lys Lse Giu Lys Aia Leu Leu ,Us T i p Ai a Vél
245 250 g «Α Χ* ·<*> ·«ίί
ilé Thr Ls Los ktt Tyr Gin Pw Vsl Als Aia Giu Asn Uh Thr Gin
200 2G3 270
Tcp Asn Leu sár Asp Aas Oly Thr Asp Giy Πί Gin Arg Alá Hét & y &
215 230 IBS-
Leu Arg Gl y Vei Asn Axg Ser Leu Lys Gly l.le Trp Arc <>j.u Lys Ü«
280 29$ 100
♦ * « ff ff
Cyr 3 05 Lys Gly Vss Orr- Thr 3.10 His Leu &.le Thr Asp Thr 31.5 Gin tea űys Siti 320
Πο Ap g Oly Met Hot 32.5 Asp «8 Ser Glu Arg 33-0 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cys
Mg Len ,**·'? ·<.> li Arg 345 füt •5iU Trp Asn Lys 345 Lyn Gly Trp Cys A»»· 350 Trp Tyr
Asn Ile A ÍS 355 9 ess >*S í rp Xle Gin Len 300 Hét A s n Arg Thr Gin 3öS Thr Asn Leu
Thr <51. <-> 370 GI y Ars Asp Lys 375· Gla Cys Ar á Val Thr 300 Cys Arg Tyr Asp
Lys 335 Asn The Asp Val Aso 330 ül Val Thr Gin Ara 395 Arg Arm Arg Fru 400
Thr Lsr Thr Gly Cys 4 95 Lys Lys Gly Lys Aso 410 Fhe sár Oho Ma Gly 915 Thr
V&1 «Ο Glu Gly 120 Fro Cys Asn Fhe Aso 425 Val Sor W1 Glu Asp 4 30 l.U Un
'Tyr Cly Asp 4 35 His Glu Cys Gly s«r 44 0 Mii Mu Gin Arp Thr 445 AU kií Tyr
Lö:U m n 4 50 Asp Gly Mgt. Thr Asn 455 Thr du Asn Al« 450 Arg Gin wy Alá
Alá 495 Arg Vél Thr Ser Trp 470 l..ou Gly Gin Leu 475 Thr Mi Gly Lys 409
Lys Les Glu Arg Arg ISO Sao Oys Thr Trp The 4 00 G1 y Als Tyr AXs Leu 4 05
<210> 12 <211> 495 <212> PRT <213> Arhficial Saqnente <220>
<2£3> Descripíion of Artifscsaf Sequence: CSFV múlani <400> 12
U-t Glp M •s £ u Asn Kis 9he Gin 5 Len Lati Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
?ro Val Gl y Vsl Gin Glu Me Λ <\ ví Vei Tyr Mp 25 Thr AU Gly Apg Píö 1 30 »<eu
«. 9 9 9 * ♦ ♦ *' * φ * X » * 9 * χ φ Αφφ ** 9
9 * * * * * * ^4 ♦>* »Χ ♦♦ **
éhe w Ahh 35 Pro Sör Glu Val Fia P>o 40 Gin 3er Thr Asm Lys LOV Fr® 45
Η Π Asp SÓ KI’ Gly Arg Gly Asp SS Xle Arg Thr Thr Leu Ary Asp Lea Pro 00
Arg Ó5 Lyp oly A.ep Cys Arg Ser 70 Gly Ar» kis Lw Gly Pro Vhl Aer Gly §B
Ile Ile Lys Pro Gly Val Tyr Tyr cin Asp Tyr Thr Cl· y Fro
SS «0 5 5
Vei 1V- his Arg 100 AH Pro Leu ! Glu yhe ?fe« Asp GU Ma óin ?h« SÓS II0 Cy«
Glu val T0.£ 115 Lvs Arg He Gly . Arg V«l ' 120 thr Oly Ser Asp· Oly Lys 125 Lru
Tyr hl a 130 Ile Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly 1 Cys Xle leu lea Lys Lee 140 Ah
Lys 140 Arg <31 y Tár Pro Arg Thr ISO Leu Lys ; Trp Ile Arg Asn The The 155 Asn Hó
Cy«5 ?» léu Ts/s> V,U löS Thr Ser Cys Ser Asp Asp Oly Alá Ser Gly 170 175 Ser
lys Asp u. Lys HÓ Fra Asp Arg Mát Mii SOS Lya Gly Lys Leu Lys TIn 100 AH
Arg Sl-u l$s Mis Cl *4 Lys Asp Ser Lys100 Thr Lys 8 re Pro Mp Ai* 205 Thr
LH val 210 vu Sh Gly V»}. Lyr 0 15 Tyr Gin Xle lyr Ly» Lys Oly Lys -·> -\ ·Λ •ilíCv Val
lys 235 Gly Lys Áss Thr 01» Asp 230 Oly Leó Tyr MU Asn Lys Asn Lys 233 Pro 240
0£ö Olu Ser Arg Lys 245 Lys Ixfc-.a Glu Lys A,ls Leu Leu Al® Vzp Ale 230 255 Vhl
11« THr He Lew £<SÓ len Tyr Sin Aro val 245 Aie Air Óla Asn He Thr >00 •Λκ Λ \' Gin
Ttp Asy L«u 275 Ssfi Asp Asn Gly Thr Ars 280 Cly IX« Sin Arg &Xa Hét 285 Tyr
l»w Arg 2AÖ w VA.l A *? a Arg Ser 205 Lea Lys Gly He Trp Pro Gin lys 3H IU
C'.y.s /05 Lys W Val Thr ?Lis 3X0 Lea Ma Thr Asp Thr 01a Lea Lys 315 OÍ u 320
« ΦΦ* ¢4 * ΦΦ « XX » φ ♦ χ Φ Φ··»Φ ♦ ♦
Φ * *** ***
Xle Arg .«Λ V · MM sTsm 325 A«p Alá Ses
Arg Leu Gitt Ary 340 Ura Giu Trp Asn
Ακη X.U ÁTp 3 35 Ah» Trp Π®5 Gin Lee 30
Thr Ólé 37 D Oly Pro Pro Asp LyA Gla 315
Lvs 363 Asm T > *- A aw X A.? Vád A»n 399 Val Val
Thr teu TtU Gly Cys Lys LyS Cty
405
Glu Arg 3Ó Thr ás a Tyr Thr Gya 333 cys
Lyr 34 5 Leu W Trp Cys As n 350 Trp Tyr
MM Asm Arg Txhr Cin 305 Thr Áen Lee
Cys AU Val Tter 380 Cys Arg Tyr Aáp
Thr Gin Alá 353 Arg Arg 9 re Thr 4 90
Lys Asn 410 Phe ser Phe Ar a Gly 415 Thr
val ru Gl u Gly 420 ?r>s Cys Asa Ph< g fen Va 425 1 Ser VA t 01« :i Asp II? X ·Υ·Α 3 V ϊ te
Tyr Gly Asp Kis Gin Cys Gly Ser Mű Len L'Sn Gin Asp Thr 44 S Al a Lse Tyr
Léé Leu <50 Asp Gly Met- Thr Asn Th r 455 Xte Glu As» Ala 400 Arg Gin Gly Ma
Alá 95$ Arg Val Thr Ser Trp 40 Len Gly Arg Gin Lé is. Se r 47 S Thr AI a d y Lys 4S0
Lys Lég Giu Ars Arg Se r lys Thr Trp Phe Gly Als Tyr Als Leu
8 5 4 § Ο < § $ <2W> 13 <211 > 49δ <212> PRT <2t3> Artifidsl Seqvence <220>
<223> Descnpiion of Artifictaf Sequence: CSFV metánt <400> 13
Két Gin Lee Ars His Phe $ sin Lee Léé Tyr Lys O Thr Ser Lys Gin Lys 13
pro Val Oly Vei Gin Oly O ?rc Vei Tyr 7 A <3 φ?1 Asp Thr Gly Arg 3Ö Pre Lee
phe Gly Asn 35 ára Ser Si«s Val Hír 40 Pro Glh Ser Thr Léé 4 3 s^y s Léé pre
*♦*·' •φφ
ΦΧΦΦ * *♦ /** » ♦ ΦΧ * * ♦ ♦ * * > Χ»Φ ♦'* * ., » » ♦ » » ♦ <·♦ φφφ *» »·*
his Asp 35 Arg Gly Arg Gly Asp v. X? lle Arg Thr Thr Leu 53 Arg Asp Leu 2ro
Arg 65 Lys· Gly Asp Cys Arg 70 Ser Gly Asn His .Leu Gly 75 Fr* vei Ser Gly 00
iu Tyr lle cys Pro 3S Oly p® tort Tyr 'Tyr Gin Asp 50 Tyr Thr Gly Uo 35
tort Tyr ’SíS << Λ4Α.ΛΡ Arg 10Ó AU Pro i.&V 1 Os- The Asp Giu Alá Gin 110 The Cys
Glu tort. Thr US Lye Arg lle siy Arg 120 tort Thr Gly Ser Asp tort Gly Lys: len.
Tyr Kis 130 lle *? í «· * * .$' * Val Cys Val 135 Asp G1 y Cys lle Len ;s Άi. ü l> Lee Lys leu &U
Cys 143 Arg Gly •κ >Y*. éra Arg 150 Thr Ií*sy Lys Trp Ile Arg 155 Asn Phn Thr Asn ISO
Cys Pro Lhí Trp tort igs Thr Ser cys Ser ASp Aso Gly 170 Alá. Ser Gly Ser 175
Lys **p tys Lys UO 8 re Asp Arg Hét Asp 105 Lys Gly Lys Leu Lys ISO lle Alá
Erő Arg Glu 133 His Gin Lys tep Ser 200 Lys Thr Lys Tre Pro 205 Asp AU Thr
iu Va 1 210 tort. £>a u Gly U1 Lys 21,5 Tyr Sin Xlü Lys. Lys t?ö ív iv rt Lys Gly Lys Val
Lys 285 Gly nys A«0 •rn Sin 230 A a ρ Gly Len Tyr X.i< Asn 835 Lys Asn Lys 8ro 243
Pro Gin Sex Arg Lys 24 3 Lye Lee Lys Alá Ley Len 250 AU ·«*·___ <rp AU Val 7 fc. S< £.- rt 3
11« Thr Ue Lee SOS Leu Tyr Giu pro Val 2G5 Alá Ma Sin. Asn lle 2?Ö Thr Glu
TCp Ásó Leu 275 Ser Asp Asn Gly Thr 200 Asrs Gly He Ch- Arg 8 SS Al á Hét Tyr
Leu Arg 230 Gly Val Asm Arg Ser TAS Len len ert y Lle Trp 300 Fxn Gly Lys lle *·
cya SOS lys Sly Val Ars Thr MG his Leu Alá Thr Asp TLs 315 Grts L«rt LyS Slu Xv
lle Arg Gly Hét Asp Ais Ser Gin A.xg Thr Asn Tyx Thr Cys Cys
323
330
33$
SS
Arg bén Gin Ar«? 340 kis GÍO Trp Asn
Asn II fc 3 2 Frr W 11« a In Lan 340
* ·><.*,· Glu 57 Gly Pro Ír© Asp Lyu Glu 333
φ-í y & 3SS As© Thr Asp V-sl A.S:'S SOS Wl Val
^'í’s 2* Thr Oly Cys 405 lys Lys Gly
Wl ru Glo Gly as Frn cys Asn Aha
* Lly Asp 435 His Glu Cya Gly Ser 440
Len L«U 4 50 Asp Gly Hal Thr Asn 'Th r 4 SS
Alá <S5 Arg Val Thr Sár Trp 470 Len Gly
LSíu aló A£$ Arg Sex Lys Thr
465
X Φ * „ φ χ ί Φ ♦ ♦ φ * * *
ΦΧ ΦΦΦ χ* ♦♦
lys His Gly Trp Cys Asn 350 Trp Tyr
k«G As a Arg Thr Gin 345 Thr Asn Lan
Cys Al a V a X Thr 300 Cys Arg Tyr Asp
Thr Gin Alá 335 Ary Asn Arg Frn Thr 400
Lys Asn 410 Phe && ϊ' Fhüí Aí a cl v 415 Thr
Aon Val 425 5 rr Val Glü Asp 430 Π© Len
Len Len Gin Asp Thr 445 Alá Lau Tyr
Ha Glu Asn AXa 4<0 Ara Gin Gly Al&
Arg Gin Lnu 435 Se r. Thr Ai >á Gly Lys őö
Trp Phe ’C §δ Gly Al 3 Tyr A.x-s Lau 435
<210> 14 <211 >495 <212> PRT <213> Artificiaí Sequenoe «220 <223> Descriptíon of Artífíobí Sequence: CSFV múlani <4ÖG> 14
r. Gin Gén , 1 Asn His 5 Glu Lea l»eu Tyr 5 0 Lys Thr Ger Lys Gin 15 Lys
o Víl G'ly Vsl Glu 20 Gin Fra Vsl w * A **· Φ. 23 A.vp Thr Alá Gly Arg 3Ö Pro Leu
© Gly Α:ΪΓ: v j; Fsa Sár Glu Ρ -S.; His 4 0 Pro Gin Ser Thr Leu 45 Lys Ls u Frn
Χ '<* « « ♦» φ ♦ *·*. * φ « « ι>« 9«
Arg GÍY 30 A.rq Gl y A«« 53 lle Arg Thr Thr L«« y* λ Ό Arg Asp Leu ?ro
&χ§ 55 Lys; Oly Asp Cys Arg ?é Ser Gly Asa Kis Leu 75 Gly Pro Vai Ser Gly 83
Πβ Tyr 11« lys Pro Gly SS Pre Val Tyr Tyr 30 Slh Asp Tyr Thr Gly Őre gx
Vsl Tyr Kis. Arg löö Alá Hrss leu Cl u Phs 105 The Asp Mi· 13 Aa a Gin 1 IS ebe Cys
Us: .;Λ3 Val Thr Lys 113 Atg lle Gly Arg tzO Val Thr £ S-éí £ Asp 125 Gly Lys; i»e«.
Tyr His m Tyr 130 Val Cys Val 135 Asp Gly Cys He Leu H8 Leu Lys Leu Ah.
Lys £4 5 Arg: Gly Th£ Pre Arg 130 Thr Leu Lys Trp Xi·^ x$s Arg Asn Fhe Thr Asn 2 CO
Cys Oró Leu Trp Vei ΪΜ US Ser Cys S«r Asp ivó A&p Gly AlA Ser Gly Sex 175
Lys Asp Lys Lys i$G Tru Aap Mg Met Asn 185 Lys Sty Lyjs Leu Lys 130 lle Alá
Fr? Atff Glu His 135 Glu. lys Asp Ser 20L .Lys Thr lys Tro· ?xő 203 Asp· Mis Thr
ri« W1 vvl Giu 2 IS Gly Val Lys 213 Tyr Glu Ii« Lys Lys 220 Lys Gly Lys Val
Cys 225 Gly lys As« Thr Glu 230 Asp Gly leu Tyr His 225 Asn Lys Asn Lys 2r© 24 ö
Fro GXv Ser Arg Lys Lys 24 3 Leu G1 u Lys Ma 259 Let Lee Ma Alá Val 253
11« Thr Ile leu 1$9 Leu Tyr Gin 2£A Vei 255 AJLsS Alá Glu ASft Ile Λ zL f V Thr Gin
Trp Sse Leu -Ser 223 Asp Asn Gly Thr 2M A®n Ciy Ile Gin Arg 283 Alá Mai Tyr
Leu Arg Gly V&l 233 Asn Arg Ser; L-«u Kis ir e Trp 300 M Slu Lys 11«
Cys 305 Lys Gly Val Dw Thr 310 Mis Leó Aiu Thr Asp 313 Thr Glu Leu Lys du 12 C
X r« Axg Gly Hat Tri Asp 325 Ma Ser Gla Arg 31 ö Thr Asa Tyr Thr Cys Cys .335
Mg Leu Sin Giy 3 .4 £j •5 *í 5sÍ í? Ϊ „ jí- X <. < λ λ. κϊ \5’ L. λ» Trp Asn Lys 34 5 His Gly Trp Cys Asn 330 Trp Tyr
Φφ**
ΧΦ φ χ Φ * » ΦΦΦ ** *
Φ > * Φ *
Φ*χ »» ΦΦ * Φ
Asp llé Asp 355 Ajxs Trp lle Sík Lee 343 Rét AS; A,r e Thr Sin 345 Asn Leu
The Gl U 3-2 & Gly Pao Pre Asp Lys 3?L Olu Cys Aia Val Thr 3BG Cys Arg Tyr Asp
tys 3 5 S Asn Thr AS& Val Asn 334 VAI Tel Thr Gin Ale 335 Arg Asn .Arg Pro Thr 40 Ö
Thr Leu Thr Gly Í05 Lys Lys oly Lys Asn 4X0 Phe Sííí' Phe Alá Giv 415 Thr
val no Cl? .< 7 ri Tf.-Á v Pro Oys AS A Phe ASA 4 25 Vei Ser Vei ulu Asp 430 lle Leu
iyr Gi y Asp 433 His Giü Cys Ől y Ser 4.4 Ö Leu Leu Sin Asp Thr 4 «5 Ale Leu Tvr χ j S--
,?x«U Leó «33 Aup Cl? hét The Asn «55 Thr lle Glu Asn Ma h&O Arg Gin GI y A.re
Á.t 3. 465 Arg wx Thr Ser Trp 03 Leu w Arg Öl a Leu OS Ser Thr Aia Gly Lys 403
Lys Leó Glu Arg «sí Ser Lys Thr Trp Phe 430 Oy Ma Tyr Alá Lse «35
<210> 15 <211 >435 <212> PRT <213> Artífselal Sequence <225>
<223> Descríptson of Artificigl Sequen'ce; CSFV mutanf <400> 15
PSAt * * .** < X S VS-Lsi- Leu Asm Hb 5 Phe 0.1 u Lsen Len Tyr 10 Lys Th £ Ser Lys Gin Lys 15
Pro Val Oly Vaύ CIu rt· V Sí L>4.\í Áré Vaj Tyr Asp Thr Al & Gly Arg Pm Leu
20 25 33
Phe Gly Asn 5ro Sct Gin Val i'u Pro Glu Lee Thr Lpv lys Leu Pre
35 «3 4 S
his Asp Arg Oly Mg ciy Asp Lle Arg The Thr Mg Asp Leu Prr?
30 <' ;\ W
Arg Lys Gly Asp Cys Axq Se r Oly A*'· h 1 s Χί·'ζΐ si Gly Pro Val Sár Gly
<5 70 7¾ 8S
X *· * *:
X 4' « * ♦
444 * 4 44 4 4
T le Tyr lle Lys Bru Giy Fre Vei SS Tyr Tyr 3 δ Gin Asp Tyr Thr Giy 35 Tro
wi Tyr his Atg Ms Fro Leu ISO Glv Ohe ?hn Asp Gin AU Gin éhe Cys
töS 110
Glu W.i Thr Lys Mg tle Sly Arg Vei Thr Gly Ser Asp Giy Lys Lee
11 s u 125
Tyr His tle Tyr Vei Cys Val Asp Gly Lys 11 κ- Lén Lee Lys * Vw<\ wi^L. AU.
130 133 140
Ly-s Arg Gly Thr Pw Arg Thr Len <? ys Trp Ι le Asg Asn rhe -r<y> vxin As«
W 130 Uá Uh
Cys len Trp Val Thr ács; Cys Ser Asp Asp Giy Ai a S £* 57 < :· ϊ ·. > \*.4 y Les
1S5 170 175
Lys Ml Lys Lys Fr« Asp Arg két AáP Lys Gly Lys Leu Lys lle Alá
iso 105 U0
be Arg Gin -Ki» Gl« Lys Asp; Sár Lys The Lys Fr« Fen Asp Al s Thr
195 w 205
de Var Var G.tn Gly Val. Lys Tyr Gin lle Lys Lys Lys Gly Lys Vei
2tŐ 213 T30
Lys Gly Lys Asa Thr Glft Asp Gly Len Tyr Hss Asn Lys Asn Lys Frn
->·?< Λλ» ví Í4 ·- V Mi 840
Fro Clu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Ly?s Alá Leu Leu .Al & Trp ΑΔ & Vei
24$ 2.LÖ 2 5 §
1 te Thr ik t«eu L«u Tyr sla Pro Val Alá Alá el u Asn lle Thr Gin
2S& 2§S 270
Tép Tan Les Asp Asn Gly Thr Asn Gly 11« Gin Mg Alá. két. Tyr
275 200 ML
Leu Atg Gly Vsl Aen At§ Ser Leu His Gly lle Gly éré Glu Lys. lle
2§h 233 300
Cys Lys Gly Val Fro Thr His Lsu AM Thr Asp TL -- 4 X^-Xs Glv Leu Lys Gin
TOL 310 3 IS 323
1U Mg Gly két Hát Asp Alá Sut Glv Arg Thí Asn Tyr Thr Cys Gye
325 330 335
Atg Leu Gin Arg »is Glu Trp Asn Lys Hír Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
bí Ml 350
Asm lle Asp bo Trp lle Gin Len két Asn. At £j The Gin Thr Asn Ma
333 360 505
SAS
- *6
Thr Gitt ro dy Pro de Asp Lys 37 5 Glu
Lys· m Os W Asp Val Asn 366 Val Val
Thr Lett Thr Gly Cys 4 65 Lys lys Gly
Vád Ha ulu Gly 426 6 re Cys >dr Phe
Tyr Gly Asp His 435 Glu Cys Gly Sor 446
le« Lúu Kap Gly Met Thr Asn Thr
4 50 A C £
Alá 4 45 Arg Val Thr Ser Trp 476 heu Gly
Lys hsa Glv Arg Arg 465 Sár Tt y>s Thr
«U ί ·> X * * * * « * · * * * « ♦« »* ♦*
í»««· ''-Ό Thr Alá dn Val Alá d Thr 346 Arg Cye Asp Arg Tyr éré Aatt Thr 468
X,ys A.w i'IÖ Phe Ser Phe Ara Gly 415 Thr
ASft 4 26 Vád Ser Ve l C* i ύ ASp 410 Xte Lett
Lsu LttSJ Gin Asp Thr 445 Λ.Ι Λ Lesi Tyr
I le Sir Asn Alá 466 Arg Gin ciy A,l á
Arg Gl n Lett 44 5 Ser Thr Alá Gly Lys 4 80
Trp The Gly Alá Tyr Alá Lett
456 4'05 <210 16 <211> 494 <212> PRT <213> Arüftási Sequence <220>
<223> Descnptcn of Artifsciaí Sequence: CSFV múlani <40S> 16
Hőt 1 ,s\ * tti tt l>&^3 Aso His The <x ti Lőtt
Pro Val í~Í <r \S λ / Val 26 C-ltt de ?E8 ttsi
Phe Gly Asn 35 Fro Ser Glu Val his 4 8
his Asp 5Ö dy Arg: Gly ASp 56 11®
Arg ÖL Lys dy Asp Cys Arg 76 Ser Oly
de Tyr Ile Lys. Pro Gly Pro Val
Lee Tyr Lys lö Thr Ser Lys Cin Lys 15
Tyr 25 Asp Thr Alá dy Arg 10 T £ í> Lee
1'rtt dtt ser Thr Lett 45 Lys Lett Pro
hrg Thr Thr Lett 48 Αε§ Asp Lett Pro
H’í Lee > j dy Pro X <Ü jL Ser Gly 86
W α w * y* Tyr Gd Tyr Thr Gly ?r»
gO í§ 5.
8$ φ* β* *♦ φ φ* * * ♦ * *
Κ. Φ ** * φ * * Φ Φ
val Tyr His Arg Alá FXö le» Glu The 300 10s The Asp Slw Alá Gin Fhs Cys 110
Gin Val Tár Lys Acg lle- Oly A tg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Len
US 120 12 5
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Πκ Leu Leu Lys; Leu Al®
13C 135 140
lys Arp Gly Thr Fx® Arg Thr lati Lys Trp Ile A re Aáh 2h® Thr Asn
HL 150 III 160
Cys Pro Len Trp Val Tht Ser Cys Ser Asp- Asp Gly Ma Ser Gly Se-r
2 Oh no m
Lys Asp lys Lys Lre Asp. Ary Hét Asn Lys Oly Lys Leu Lys Lle Alá
5 Λ.Λ Ϊ. Ü· C t $ Ή
i<?V &w~?
Fzö Ars? Glu m Ms Glu lys Mp Ser Lys 200 The lys pr® Fr® Asp Ma Thr 2OS
Π«· Val Val Glu sly Val lys Tyr Sin lie Lys Lys Lys Gly lys Ver
210 T< 'S =¾. χ. 4' «5· 220
lys Gly lys Asn Thr Gin W Oly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225 230 23$ 240
Pr© Glu Ser Arg lys Lys len Glu lys Als Loh Le?r Ma Trp Ma. val
US- 2 $Q 255
Jle Tár 11» Lén leu Tyr Gin 2r® Val Al® Alii G11> A»n II® Thr Gin
200 255 r?n *. ·} v
Tpp Asn Len Ser Asp Asn Oly Thr As© Oly He sin Arg Alá Met Tyx
275 230 285
Leu A tg Gly Val Asn Axg ser La.» His Oly He Trp ?r© Glu Lys Jle
290 205 300
Cys Lys sly Vei Fr© Thr His Len Alá Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305 320 315 320
11® Arg Gly Met Met. Asp Ma Sex Glu Ax:g Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
12S no •335
Ary len Sin Arg Si® Trp A®n lys Hl® Gly Trp Cys A®» Trp Tyr Asn
M Ő 345 350
11® Asp Ft® Trp lle Gin Lee Me-fc Asn Arg Thr Gin Thr ÁSh Uu Thr
355 360 355
Glu Gly Fsa yro Asp Lys 0.1 u Cys Ma Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys
δ
3~?$
380
Asn Tht Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ma Arg Mu Axg Ft© ?br 11
3SS
300
2AS
* *» <* *· ** ♦ χ « * * ♦ $t φ:φ.φ &Φ ♦ * ν φ *> * * >Χ« XX ** **
Leu Thr Gys Lys 405 Lys Sí y Lys Asn The Ser 410 Fhe Alá «ry Th 11$ Val
XI e Gl p Gly Are 423 Cys Arh éhs Ars Vei 425 Ser Val Gitt Asp 1 le 430 Lep Tyr
CXy Asp His 43S Gitt Cys Gly $«£ Lep 4 40 LPU Sir, Asn Thr A.U 4 4S Leu Tyr Leu
Len Aap 4 50 Gly Met Thr Asn Thr 4 $5 lle 91« Asn Alá Arg 4 69 9í n Gly Alá Al e
Arg 4 65 vC Thr ser f*·*; Lep 4 70 kx y Ars Gin Leu Ser 43$ Thr Al3 Gl y Lys Lyr 480
Len Gin Arg Azg Ser 4 SS Lys Thr Trp Fbh Oly Aie 453 Tyr Al. a Leu
<210» 17
<211» 495
<212» PRT
<213» Arhííoas Sequence <220» <22'3> Oescription of Artificial Sequence: CSFV mutaní <400» 17
Hét: 1 Gitt Lrn Asn His $ éhe Gin Les lep Tyr 10 Lys 2Γ Ser Lys Gin 15 Lys
?r«s Val í~’· <<',ί.ί y Vei 20 Glp LÍ4}> Λχ Tro Val *ϊ\ . < J- i. 25 Asp TH ? AX-ás Oly Arg ÍV Fra Len
éhe Gl y Asn 35 Liö Ser kXU Val RLs 40 Gin Oer L \ Len 4 -3 Lyy Lep éra
Hl a Asn Arg Gly Arg Asp $5 He Arg Thr Thr X^^ 60 A r y Aep Lett Lre
Arg •S$ Lye Oly Asp Cys Arg 79 Ser Oly Asn Hl >5 Lep 75 ;?i > x ) sst sí y éra Va 1 Ser Gl.y 60
lle Tyh lle Lys 2 se B s Gly Fro Val Tyr Tyr 30 L.Ls Asp Tyr Thr Gly §5 Ára
Vei tyr Kis Arg 103 Alá Fro Len GlO: Fhe löS The Asp GXp Als Gin 110 r'He Gye
Pl p Vei Thr i.< V <* Arg lle xiy Arg Wi Thr Gly Ser Asp Gr. y Lys Lett
Tyr Kis BS Ile Tyr val Cys Val 135 Asp Gly Cys 11 a Len 14 3 Lan Lys Lm Alá
Lys 145 Arg Oly Thr %o Arg 1SS Thr Lan Lys Trp íls Arg 155 Asn Fhe. Thr Asn ISO
Cys B £ö Lee Trp v ,% X 15¾ Thr Ser Cys Ser Asp 1.70 Asp Gly Alá Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys 19 δ 2 re Asp Arg Mer Asn 185 Lys Gly cys Len Lya 1.30 I ié Al a
Pro Arg Glu ni5 m Gin Lys Asp sex 200 Lys Thr Lya Pro Pro Asp •snr .V X A.i« Thr
11a Val 210 Var CL y Gly Val Lys 215 Tyr Glrs 11 a Lys Lys 22L Lys Gly Lys Val
Lya 223 Gly Lys Asrs Thr Gta 230 Asp Gly Len Tyr has Asn 335 Lya Asn Lya Fm 240
Pro Gln 5 s* x Ar g Lya 245 Lys Leu Gin Lys Alá 250 Leu h' ü Min Τφ Alh 253 Val
n« Thr n.e Lsa 250 Lan Tyr Glh Fl'ö val 265 Mi e Alá G.j.u Asn Ile 270 Thr Gin
Tsy Asn Lse Ser 275 Asp ASh Gly Thr 230 A$a Gly Xla Sin Arg Alis 285 Hat. Tyr
Leu Arg 200 5iy Vau Asn Arg Ser 273 Lan 21 s Gly Xle Trp 300 2ra Gin Lys 11«
Cys 3&S Lys Síy Val Örs Thr 310 his Len Al A Thr Asp Thr 315 Gin Lnu Lya· GXn T^r·· V IW 'v
Ile Arg Gly bér. MteL 325 Asp Alá Sár GlG A r g 335 Thr Asn Tyr Thr Cys 335 Cya
Arg Lón Gin Arg 317 Ki s Glu Gly Asn Ly® MS h Is Gly Trp Cys Asn 350 Trp syr
As n Ile Asp VxS ?355- Trp 1 u™ Gin Les 360 heh Asn Arg Thr Cin Thr: 355 Asn Len
Tár Gin 370 Gly 1;:P Fro ASp Lys 375 Glu C«s .ς> Alá WX Thr 3§0 Cya Arg Tyr Asp
Lya 385 Asn Thr Asp Val ASü 300 Va 1 Val Thr Gin Alá Arg 335 Asm Arg Fr>« Thr <03
Thr Lee Thr Gly Cyx 403 ays Lys Gly Lys Asn 410 Lha Sár ?he Alá Gl y <15 Thr
Val Ile d a -njty 420 Fsa cys Asn ?he Asn <25 Vhi 5 a r a a i Glu Asp <30 XX a Lan
* * *»· *·*. φ »
Λ Λ ♦ Λ * ♦· '» *
«.·»· **
Tyx' Oly Ahg 438 Kin Gin Cys Oly Ser 44 0 Lee Lee Gin Asp Thr 448 AJLiS Lee Tyr
Len Len 450 Asp Gly Hét Thr Asn 485 Thr He Gin Asn Als Arg 400 <α.ίϊ Gly AU
Ale 405 Arg val Thr Ser Trp 470 Lee Gly Arg Gin Lee 475 Ser Thr A.X.a y Lys 480
Lys Lno Glu Ars Arg Ser Ly& ™hr Trp The \>n y AU Tyr ?\k. Len
08 470 475 <210> 18 <211 > 492 <212> PRT <213> Artificssl Sequence <220>
<223> Öeseópílörí of Artlficial Sequence: CSFV múlani <40Q> 18
Hét 1 Glu Len Asm His Phe 5 Sin Lse Len Tyr 10 Lys i Λλ- Ser Lys Cin 15 Lys
Fro Val Gly Vél 20 Gin Glu ? r o Val Tyr 25 Asp Thr Alá Oly Arg 30 Tr« Lee
Fhe Gly Asn 35 Frn Ser Glu Val hls 40 2rö Gin Ser Thr Lys Cső Pro
cis Asp Arg 80 Gly Arg Gly W 58 Λ Is Arg Thr Thr Lse §0 Arg Asp Lee Pro
Arg 55 Lys Oly Asp cys Arg 70 Ser Oly Asp fii $ T .«! « T$: 7 e k Ser Oly 30
Jl« Tyr LM Lys Pro Gly 75 Val Tyr Tyr §0 Gla A&p Tyr Thr G.i. y 35 ?n>
Vél TW hls Arg 105 Ma te Leu d 0 Phe M5 ni a w GlU ». * ·.nré Gin 110: Fhe Cys
Gin Val Thr 1 IS Lys Arg Xle Gly Arg 120 Val Thr Giy Ssr Asp 128 Gly Lys Lee
Tyr Mis lle 130 Tyr Vél Cys Vél 135 Asp Gly Cys r 1 e Leu 14Ö Len Lys Leó All
Lys Arq 91y Thr Pro Arq Thr Leu IíVíS Trp lle Axg Aro The Thr Asn
148 5 * 5 15 5 180
.ί
0 0X99 * X « * * « \ v ♦ * ♦*-♦ *♦ « * ♦ ♦ «X ♦ * »
X* «»» XX « y vx
Cys ön Lan Trp VáX 19 5 •V λ'· X; A.vX..' X. Gys S á r As p 170 Ara öy Aia Sőt Gry 17$ Gnr
Lys Asp Lyn Lys 180 Fro Asp Arg Kai Asn Lys 13$ oly Lys L-tttt T,ys 130 TU a;u
prn Arg Gin Μ, Λ\ V rGn kis Gin Lys .Asp ser 200 Lys Thr Lys ?w 2r n 205 Asp Ara Thr
71« Val 210 Vaj Gitt Giy Vtt i :..y r 215 Tyr Gitt 2rá Lys *5 > ·. <v 5' A> Λ χ< A V lys Oly Lys Vad.
ly-7 223 öy Lys Asn Thr Gin Asp A '1 P v< .$ VJ <x· >> Gi 3> Ua Tyr H 5 235 &3.?i Lys .Asn Lys 2 r n 240
Lm Gr tt Ser Arg Lys 2 b ry 3 Lm Gitt Lys Aia 2AG Let: ix'fe ki Alá Trp Alá 255 Val
X la Thr IXs Uu 290 Lett Tys Sin Fsö Vú Alá ?ö Aln Gitt Asn iia 27 0 Thr Gitt
trp Asn Len 275 Ser Asp Asn Giy Thr 200 ASh Giy Tla Gin Arg 2s$ Alá >1ttt Tyr
Lan Arg 290 öy Vei Ano Arg S«r 2$S Lan Lie Giy 11« Trp 300 Pro Glu Lys 21 a
Cyn 30 S Lys Öy Val lm Thr his 010 Lan Alá Thr Asp 315 thr Gitt Lőtt Lys Glv 320
Un Arg öy KnL hat 22 5 Asp Alá Ser Gin Arg 230 Thr Asn Tyr Thr cys 315 Cys
Arg Len Gís Arg 340 hív Cin Trp Ann Trp Cys 34 5 Asn Trp Tyr Asn 350 11 r Asp
Frn trp lle 3$$ Gin Len Kai. Asn Arg 350 Thr Ön The Asn Lan 3S5 Thr Gitt G1 y
Prn Lfo 3'1S fep Ly« Gitt C ys Al A 20& %X Thr Cys Arg Tyr 300 Asp Lys Asn The
.Asp 385 Val Asn val Val Thr Gin 3S0 Als Arg Asn Arg 395 Frn Thr Thr Lőtt Thr 400
Giy Cys Lys Lys Giy 4 05 Lys Asn Ffea Ser Aha <10 AU Giy Thr Val lin <15 Gitt
Giy Pro Vya Mn 420 Fhc Asn vsl Ser Val GU 425 Asp n* Lett Tyr 430 Gl y Asp
His Gitt vy i& 435 ϊ** Ϊ > í \?iy Sár ttCtt nett Gin 42 0 Asp Thr AU Ιηη «5 Less Lno Asp
GXy Mer <>0 A·. xx xx. Thr 1x 0 Gr tt 455 Asn Alá Arg Ön öy 490 Al n Alá Arg Val
fc s
X ♦» X X * « « φφ Φ « « «.
X V XX χ * v w Φ * χ φ x «♦ »xx «« «« »χ
Thr Ser Trp Leu Gly Arg Sin Leu Ser TI ír Ara Gly Lys ί iy.
465 470 475 <§s*
Arg Arg Sas Lys Thr • Trp ?Lé Gly ΑΛ& 5. * :?r Alá Leu
4«5 430 <210» 19 <211> 493 <212» PRT <213» Artfftóal Sequence <220» <2'23> Descópibn of Artiftciai Sequence: CSFV múlani <400» IS
Heh ix Pro Giu Val tan Gly Asn Val 20 His 5 Glv Ohé Glv Glu Le -.5 Pro Val Leu Tyr 25 1 y i 13 Asp Lys Thr Thr Alá Ser G! y Lys Arg 30 Gin 15 Prn Lys Leu
Fhe Gly Asn 35 Pro Ser Glu Vél Hr s 40: Ara Gin Ser Thr Leó 45 Lys Lég Pro
His Asp 50 Arg Arg Gly Asp 55 1.1 e .Arg Thr Thr Len 50 Arg Ap Leu « -x é
Arg §5 Lys Gly Asp Arg « ·5>* IQ·» Φ* V? Lv Jv Gry Asn H i s :.s. 75 Gly Lm Vai Lér Gly 3Ő
lis Tyr Lre Lys Pro 85 Gly Pro Val Tyr Tyr 30 Gin Asp Tyr Thr Giy 35 Pw
Val Tyr His Arg 130 Alá Pro L«u Glv Phe 135 Phe Asp Giu Alá Gin no Phe Cys
Gin Val Thr 115 Lys Arg Ils Gly Arg 120 Val Thr Gly Ser Asp 125 Gly Lyg Leu
Tyr Sir 130 2 le Tyr Val Gys Val 135 Asp Gly Gys Lle Leu 140 Len Lys Leu Al»
Lys 145 Arg Gly Thr ptn Arg 150 Thr Len Lys Trp ile 155 Arg As n Ph« Thr Asn 150
Cys Pro Leu Trp Val IS3 Thr s«r Cys Ser Asp $ ιή *· > « Asp Oly Alá Ser VrV 1 íS Ser
Lys Asp Lys Lys pro .Asp Mg Met Asn Lys Gly Lys Lev Lys 1 le AU
103 185 133 ff ff ffff ff ffff * ffff * ffff ff ff ff ff X X ff ff ff ff
A * ff ff ff ff ff ff ffff ff ff ff ffff ffff ffff
Pre Ar g Glu 3 SS Kis V* Λ < χ LUW Lys Asp Ser 20:0 Lys Thr Lys Pro Fen top Ale Thr 203
Us Vsl V&l 210 Glu Gly ’ Val Lys Tyr 2X5 Cm lle &ίί^ΐ&: 220 Lys Gly Lys Val
Lys GXy lys 22S Asn £' Gin .Asp Gly 230 Len Tyr His Asn 7 4 4 .·£» s-'-.’» Lys top. Lys Fre ή 9 0
Fro Gly Sec Arg Lys 29 5 Lys Leu Glu Lys Alá 250 Leu ten Alá Trp Alá Val 2 55
11« Thr 11« L«U 260 Uu : Tyr Gin 2ro Vél 2 SS Al >l Ars Gru Asn Ile Thr Gin 270
Tro Asn Lc-v 275 Fér Asp Asr<, Oly Thr 250 Asn Oly lle Gin Arg Ali» Hét Tyr 285
Leu Ax-9 01 y 2 90 vm Asn Arg Ser Lee 295 Ms Gly 11« Trp 303 Tre Glu Lys lle
Cys Lys Gly 305 Pro Thr his Leu 310 Ale Thr Asp Thr 315 Glu Len Lys Glu 320
lle Arg Gly H«h MsT 325 Asp Alá Ser Glo Arg 33Ő Thr Aso Tyr Thr Cy« Cys 33 5
Arg Leu Gin Arg 390 His Glu Trp Asn Gly 345 Trp GyS Aon Trp Tyr Mr Ile 350
Asp Mo Trp 355 tle Gin Leu Met.. Asm 3S0 Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Gin 3&5
Gly Pro Pro 370 Asp Y ,ka*; J Gi«. Cys; Alá 373 vei Thr Cys Arg .38$ Tyr Asp Lys Asn
Thr Asp Val 305 Asn Vei Vei Thr Gin 350 Alá Arg Asn Arg 37 5 Fro Thr Thr Leu 40 0
Thr Gly Cys Lys Lvs 405 Gly Lys; Asn Fhe Ser 910 F he Al a Gly Thr Val 11« 915
GlL Gly Tr» Cy« 428 Asn The Asn Val Ser 425 Val Glu h.Ap XIé Leu Tyr Gly 930
Asp R.is Gly 435 Cys Gly Ser Lem Leu 440 Gin Asp Thr Alá Len Tyr Len Lap 445
Asp Gly H«t 930 Thr Asm Thr XXe Glu 455 Asm Alá Arg Gin 450 Oly A3e Aln Arg
Val Thr 5»r 965 T rp Len ely Agg Gin 470 Leu Sor Thr Ma 9 75 Gly Lys Lys Len 400
Cin Arg Arg Sor Lys Thr Trp éhe Gly Alá Tyr Ma Leu
18.5 4 3 0
9« ‘7 Ρ
Μ 9 « Λ 9 9 9 9 « 9 » A < X « 4 ♦ 9 9 * * > ♦ y ♦ * ·» * * ♦ ♦ 9 9 9 9 <210> 20 <211 >495 <212> PRT <213> Artificial Ssquenee <220 <223> Description of ArtíficíáJ Sequence: CSFV rautsnt <400 20
Met GlO LOU Asn His S 8he oí u Leu Leu Tyr 18 Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Píö Vsi Gly Val 28 Glu *X . V <3 Λ U Are Vei Tyr Asp 25 Thr Als Gly Arg 38 8ro L;íU
Phe Gly As?f 35 5« Glu Tel. HÍS 48 Fgg Gin Sec Thr Lföo Lys 45 Leu Pro
His Asp 58 Arg Gly Arg Giy Asp SS ’U Arg Thr Thr I<W 98 Arg Asp Lep Pro
A cg Lys 55 Gly Arp Cys Arg 75 3 sí Gly Asn His Leu 75 82 y Tr» Val Ser 01y 88
C« Tyr ry s Pro 8 5 Giy h» val Tyr Tyr $0 Gin Asp Tyr Thr Gly ?re 53
Vas < yt Kis Arg LO ΑΠ Tr® Lei Glu The The 101 Asp Zs ·} MQ AIn 81n 22 0 Áhs Cys
G 2 g 7 a 3 Thr 115 lys Arg He o.i. y Arg 120 Val Thr Gly Ser Aüip Gly 123 $$.
Tyr Hv 130 X lé Tyr Vs.i Cys Ή1 1.15 Asp Gly Cys Ils Lé« 140 Leu Lys Leu Aln
Lys Arg 14 5 Gly Thr ?SP Arg 150 Thr Lnu Lys Trp xU 155 Mg Apu 2hs Thr Asn 358
Cys ?rg leu Trp VAl Hl Thr Ser Cys! Ger Asp Asp 179 Giy AÍA Ser Gly Ser 173
Lys Hp Lys Lys ά 8 re Arp Arg Asn Lys H3 Gly Lys Leu Lys 190 31« A.lé
Ο» Arg Glu ! <« L. ν' «» HÍS Glu Lys As p 5er 208: Lys Thr *<y & Fro Pro Asp 205 AU Thr
X.U Val Vvi 1 Glu ury v&i Lys Tyr Gle 11s líV fe Lys Lys Gly Lys Val
í A 'í < -7 -?· Λ
λ. λΛ· JÍAO4!
»«»« X X» «χ Αχνν * ♦·». * « X * »
X ♦ * WX X X χ *- X * X * X * X ** XXX »'Χ χχ » V
Lys 22 & G.ly Lyn As© Thr Gin Asp Gly 230 Lén Tyr His ,Ásp Lyn Asn 235 Lys te 240
tro- Cí x u 5«ε .Ar g Lys 28$ Lys Let Gin Lys Ma Lea Leu Alá Trp 25© Alá 255 vai
lin Th: ile Ou Len Tyr dn fi.» Val Ma Ma Cin. Asn LM Thí' Cl ή
20$ 255 270
W Asn Len Ser 5 ·*? X &. > 1? Asp Asn Oly Thr 280 Asn Gly Ite Cin Arg Alá 205 Hnt Tyr
Len Arg 290 dy Vél Arn Arg Ser Len 2S5 Hig Gly He Trp L'rn Gin 3ÖÜ ix y & Ile
Cys 30$ uys vly Vei te Thr His Lén 318 Ma Thr Asp Thr Glu Len MS Lys cin 320
liu Arg űk Met Két 325 Asp Als te Cin Arg Thr Mn Tyr Thr dö Cys 335 Cys
Arg Leu Gin Arg 3-40 Ml h Cin Trp Asn AXa His Gly Trp Cys As© 345 330 Trp Tyr
ks Ik As p k» 355 dg He Gin Len 30 hét Ma Axg Thr Cin Thr 36p Asn Lee
Thr Gin 3 7$ Gly te te Asp Lys Cin 3 Ή Cys Ma- Vd Thr cys Mg 5¥G Tyr Asp
$ >.í S*· Αχ· x Ív ob Arn Thr .Asp Vpl Ás A 7k Val 398: Thr Gin ÁM Arg Ann Arg 383 Oro Thr 400
Thr Lan Thr Gly Cys 405 Lys Lys Gly Lys Asn F-he Ser Phe Ála £ '· Art rt -.< \x ciy 415 Thr
Val Xla Glu Gly 420 Orr? Cys Asn ter Asn wl Ser Vsi Glu Asp 422 <30 Ue Lnn
Tyr dy Asp Kis 4 35 Gk Cys Oly Ser «0 Len Leu Cin Asp Thr ÁM 445 Lou Tyr
X^X-S Uu 450 Asp Ciy Mht: Thr Aas. Thr 455 Πβ Gin Asn Alá Arg Sin 460 Ll y Alá
AM 4 45 Arg Val Thr lér Trp Leu Gly <70 Arg Gin Lea Ser Thr Alá <7,6 Gly Lys 4 80
Lys Len Glu Arg Arg 4 SS Ser Lys Thr Trp Áhe Gly Ma Tyr Ma 400 Lm 405
<2W> 21 <211 >493 <212> PRT ·♦ <213> Adiíichl Sequence <220 <223> Descíípíion of Artíficíal 'Ssquence: CSFV mvíant <400> 21
Hét
I
Pro
The
Us
Arg
OS lle
Val £lu
Tyz
Lys
145
Cys
Lys
Lys
Gin Leu Asn Kis ff. Phe S X< Leu Luu Tyr 10 Lys Th r Ser Lys 9« ? < .<. .-
val Gly val élű Gin F'íO Val Tyr Asp Thr Alá Gly Arg Pro
20 25 30
Gly Ahn Pro Sor Cin Vei HU Pm Gin Ser Thr LhU Lys Leu
35 40 45
Asp Arg Gl y Ara oly Asp lle Arg Thr Thr Leu Arg Asp Len
50 55 00
Lys Gly Asp Cys Arí? cet Gly Aso Kis Leu Gly pm Va r Ser
70 75
Tyr 7? Λ A » V? Lys Trp Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Tyr Thr Oly
SS 50 05
tyr Hír Arg AU Pro Leu Giu 90« phe Asy Giu Ara Gin Phe
180 IÖ5 110
Val Thr Lys Arg lle Gly Arg Val Thr cly Se r Asp 'jx.y syn
115 120 . m * x. «.>
Kis 1.1a ‘T y x Val Cys. Val ÁSp Gly Cya r $ Λ a.a.£ Leu Leu Lys Leó
no 135 ϊ x rt
Arg y Thr Pro Arg Thr Leu Lya Trp 11a Arg Asn Phe Thr
150 155
Pro Ttp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ara Ser Giy
155 1?G 175
Asp Lys Fm Asp Arg Kefe Ásn Lys Cl y Lys Leu Lys He
160 m 100
Arg Glv Ki s 01 λΐ Lys Asp Ser Lys Thr Lys .Pro Pro Asp Ai a
•ί Λ £ 'ϋΛ f' 9 05
.t. άν U
Val Val Giu Gly Val Lys Tyr G)a Hú Lys Lys Lys Gly Lys
21Ő 2 15 *> A 4L Φΐ.
Gly AV Thr Gla Áap Giy Len Tyr his .Asn Lys Asn Lys
Lys
Leu
Frn
Pre
Giy
Ura
Ál a
Asg 1t0
Ála
Τδϊ
Val erő
240 i '.< K.
S··
225
φφ
Φ Α 9 Φ φ φ ♦ Φ
Φ * X < φ Φ Φ X
Φ » V X Φ * Φ * V *ΦΦ ΦΦ XX X φ
ere Gitt Ser Arg Lys Lys 24 S Len Gitt Lys AXtt 255 Lee Lett A.1 a Trp Ar a 2 53 Val
χ.π Th? He Lap 2SS Lee Tyr Gin L-e Val 205 Alá Alá Gitt Asn Ilr 270 Thr d h
ϊ.£φ Asn Te© *5 ·?£, .&: ;· \> S« £ Asp As js GI y Thr 200 Asn Giv ·< Xle Gj. n Arg 285 A. 1. s£ Met Tyr
>.©ϋ A.eg 299 aiy V.3 1 As» Arg Ser 2KL Lett His Gl y Lle Trp Fíö 309 V- X . „ V* < íj Xle
Cys 395 Lys d y V.s.1 Pro Thr 318 his Lett Alá Thr Asp 315 Thr Glu Lys G Itt 320
He Arg GXy Mefc Met Asp Síi 4 Als 3cr Gitt Arg 330 Thr Asn Tyr w Cys 335 Cys
Arg Lee Cin Asg 343 Kis GIv Trp Ara Lys 345 Trp Cys Asn Trp Tyr 350 Asn Ué
Asp Pro T rp 355 Us Clrs Lee Kefe Asn 330 Arg Thr Gin Thr Asn 305 Lm Thr Gitt
«ly Pro 370 Pro Asp Lys GX« Cys 375 Alá Vei Thr Cys Arg Tyr 338 Asp Lys Asn
Thr 383 Asp Val Asn Val Val 39ö Thr Gin Al a Arg Asn 33S Arg 3ro Thr Thr Lett 4 00
Thr Cys Lys Lys Gly 405 Lyr Aán p ;φν Ser 410 phe Als Gly Thr Val 415 Xle
Glu GXy Ftn Cys 420 Asn The Asn Val Tar 05 Val. Gl© Asp Xle Ixtttt 433 Tyr Gly
Asp Kis Ch; 4 35 Cys Giy Ont Lee Len 440 Sin Asp 3hr Alá Len 445 Tyr Le© Lee
Asp Gly 4$3 Kefe Thr .Asn Thr Xle 4 55 Gin Asn Alá Arg Sin Gly 430 Al& Als Arg
V&l 4G3 Thr Ser Trp Leu Gly 400 Arg Gitt Lőtt Tar Thr 405 Alá Gly Lys Lys Lm 480
Gitt Arg Arg $«£ Lys Thr 4§S Trp The Gly Alá 400 Tyr Alá Lett
«210 22 <211> 494 «212> PRT <213» Adifkáal Seqoence
/4 *»** » * V *»44 « Ο 4 « * * » tf <220>
<223> Dsscfiphon of Artííscíai Sequence: CSFV mufanf <40Ö> 22
Met .1 ><·> t Uj Laii Asn his T} pha H; La« tau T <? r LÖ Lys Thr «*ς·χ y 4> Xs x· Lys (IH. IS Lys
fro Vei dy ú s X Vau 'írt <- V G lu Pro Val Tyr 25 Asp Thr Alá Gly Arg 30 Sitt Leu
éhe Gly Asn 3S Pro Ser Gitt Val FI ís 40 P ro Sin Ser Thr Lett 45 Lys Latt
his Asp SC Atg Gly Arg Gl y Asp 55 He Arg Thr Thr Lett 40 Arg fc.? Lőtt Pro·
Arg 65 Cys Gly Asp Cys Ar g 7 8 Ser dy Asl Let 75 Gly Pro * í · X > * & Xx Gly 40
IX ss Tyr He Lys Ste SS Oly Ho val Túr Tyr 90 Gitt Asp Tyr Thr kí.í. V $5 3 re
Val Tyr His Arg AXa HŐ Prc< Lett Gitt Phe 105 éhe Asp Gitt Al a Sitt 11Ö The Cys
Glu Va 1 Thr ns Lys Arg n« Gly Atg HÓ Va 1 Thr Gly Ser Asp 135 Oly Lys Lett
Tyr Hás 130 Ue Tyr Val Cy s Val 135 Asp Gly Cys He Lett 14 0 Lőtt Lys Lett Alá
Lys 145 Arg Gly Thr Pro Arg 158 Thr Lsu Lys Trp He 153 Arg Asn éhé Thr Asn 150
Cys H'& Le 15 Trp Vei 165 Thr Ser Cyg Ser Asp 17 Ö Asp dy AXe Ser Gly 1.7S Sej
Lys Asp Lyr Lys Pro 180 Asp Arg Mttt Asn 135 Lys Gly Lys L-tttt Lys ISO Ha Al.a
ér® Arg Gitt 1PS Kis Gitt Lys Asp Ser 200 Lyr Thr Lys Pre Pru 305 Ma Thr
He Val 2X0 VaX Gitt Gly Val Lys 215 Tyr Sitt He Lys Lys 220 Lys Gly Lyp Vttl
Lys 228 Gly Lys Asn Thr Sitt 230 Arp Gly Lőtt· Tyr His 238 Astt Lys Asn Lys P ra 240
Pro La Ser Arg ttya 24 S Ly$ Lett Sitt Lys Ale 280 Lőtt Lru Alá Try Aia 255 Vei
Ik Thr He Len Leu 260 Tyr Gin Prn 7:4 265 Alá A1 a Sa tt Asn He 370 Thr n i v*
* 4« # 4 * 4 4
X ν »4> >» » χ # * ♦ · *. »· «ΐ 4 XX * * '<· ♦ « «
Trp Asn Leu 215 Áe-r Asp Asn 5* $ , r Thr ji- ν \z Asn Gly C? Gin Arg 28 5 Aia Hét; Tyr
Leu Arg 25 0 oly Wl Asn Arg Ser 235 Leu his Giy Γ le T rn 308 Pro Gin tw Ile
Cys 3ÖS Lys Gly Vél Fre Thr 313 íiis Lep Álé Thr Asp 3115 Thr Giu Len Ly s \J ,L U «-} i*V X\ Wv
ile Arg U Hét He 325 A$y Álé Sor Glu Arg 330 W Asn Tyr Thr Cvs 335 Cys
Atg Leu Gin Arf 340 HiS Gi u Trp Asn Lyr 345 Giy X ·*,.£< Cys Asn Trp 350 Tyr Asn
Ile Asp Prö 35 S Trp ile Gin Leu Hét 350 Asn Arg Tbr Gi a Thr 3 SS Ann Len Thr
Glu S.ly 370 Brh Ρ«ϊ Asp Lys ·.> .í u 31S Cys Alá Vél Tbr Gyű 35 0 Arg Tyr Asp Lys
Asn 305 Thr Asp Val Asn Vél SAS Vél Thr Gin Alá Arg 355 Asn Arg Prn Thr Tbr 408
Lan Tbs Gly Cys Lys 4 OS Lys Oly Lys Ann Phe >UÖ 5 c E 8 he Aia Gly Thr 415 Val
n« clu Cí 4 V Wö- 92 0· cys Asn Phe Asp VC 425 Ser Val Glu Asp ile 430 Len Tyr
Gly Asp His 435 Cls Cys Gly Ser Leu 44«> Leu Gin Asp Thr Α~λ a 4 4 5 Len Tyr Leu.
Leu Asp 450 Gly Hét Thr Arx. Thr 4 55 η» Glu Asn Ai-a Arg 4 08 Gin 81 y Alá Aia
Arg <85 Wl Thr Sár Trp i>£5 U. 47Ö · a y Arg Gin Lan Ser 475 Thr Aia Gly Lys Lys W
Len Gin Arg Arg 3« 48 5 Lys Thr Trp Thr Gly 198 Alá Tyr Álé La«
<210> 23 <211> 495 <212> PRT <213> Artífídai Ssquence <220>
<223> Description of Adlficial Sequence: CSFV muíant <40ö> 23 ;ΐεΐ5.
Met. .1 Glu Leu Asn his S GS H?*· t* -5 ·λ· \í Íí. \*x Le©
Pro V>3X Gl y Var 20 GJ\+ Glu Pro Vei
2he Gly As?» 35 2r® ί$£.ε Llu Var His 48
K.c s X? w Arg L1 y Arg Gly Asp 55 rí®
« <« 0 * * Φ « » X ** ♦
X * X ·> * * ♦ X
V* ♦** «« WW V»
Leu Tyr Lys Thr Für Lys Gin Lys 18 15
Tyr Asp Thr Alá Oly Arg Fro Leu 25 88
Fr® Gl® Ser Thr Len Lys Leu Fr© 4$
Arg Thr Thr Leu Arg Asp Ls® pro
SO
Arg SS Lys Gly Asp Cys Arg Ser ?Ő Gly Asn > 91 e i 5© 8 Giy Pí.ö ·?5 f&X Ser C iy 80
IU Tyr 11« Lys Ft© 85 Gly Pro Val Tyr ' lyc Gin Asp Tyr Thr G :8D Xy F §5 re
wx Tyr Hí $ Arg A'U 108 0 x es L® u Cl© M 105 Pás Asp CH; Alá Gin 110 8 he Cys
Olu val Thr 115 Lys Acg Tie Oly Arg Val 12 S Thr Gly Lee ASp 125 Gly τ ,.„.· Le®
Tyr Kis 130 lle Tyr Val Cys v&l ’í *· »J XJ- Asp Gly Cys I > <5 1 A., x 140 Leu Lys Le..? A Ja
Lys 14 5 Arg oly Thr Pre Arg Thr 150 X.eu Lys Trp lle Arg 155 ASh Phe Thr Asn ISO
Cys Fr© Leu Trp Val 105 Thr Ser Cys Cet Asp ί 70 Asp Oly Alá Oer Oly 175 S ά x'
Lys Asp Lys Lys Pt© 103 Asp Arg Kei Asn H5 Lys Giy Lys Leu t x · A> aS· > $$ I le Alá
Ft® Arg Glu 105 Kis Glu Lys Asp Sec Lys 200 The Lys Te© Ft© 205 Asp Alá Thr
lle Val 210 Val Glu Oly V»i Lys 215 Tyr 81 h 11® Lys Lys V- *? A & &k «* Lys Gly Lys Vai
Lys 225 Gly T <·*>* > V* Asm Th.r Gin Asp 230 Gly Leu Tyr Kis Asn 230 Lys Asn Lys Ho 340
Pre Cin Ser Arg Lys 245 Lys lm© Cl.® Lys Alá 050 Leu Len Alá Trp Alá 25 5 Vai
I le Th £ il® Leu Le© 2S0 Tyr Gl.® Fr® Val. 205 Alá Ax & G .1 u Así; Üc 230 Thr
Trp Asn Leu 27 5 Ser Asp Asn Oly Th ε As-3~i 2 80 Cl y Ut Gin Arg 2S5 Al λ Mn r Tyr
Leu Atg 200 Oly Val Asn Arg Ont 285 Leu His oiy lle Trp 300 Ft « Glu kys I le
? G-8 i i 3/ΚΑΖ *ψ>» * ♦» φφ ΦΦΧΦ « ί>« » ♦ * Λ * φ * Α * ** V
4Ψ ΦΦ Φφ φφ
Cyn 335 Lys Gly Val ?i.'!5 The 310 His Leu Ai® Thr Asp 31.5 7h~ Glu Leu Lys Giu 32Ö
11« Arg Gly Hét 325 Asp Ma .Sít 01 u Arg 330 Thr Ash Tyr Thr Cys 335 Cys
4c-2 Len Gin Arg 340 Kis Cin Trp Asn Lys 345 Lys Gly Trp Cys As 350 R$s Φ·ν> 4. .tg Tyr
Asn lle Asp Pr-n 335 Trp 11 e Gin Le a 350 Vet Asn Arg The Sin 355 Thr Asn Len
Thr Gin Gly Ft© 370 Pro Asp Lys 37 3 Gin cys Al.U Val Thr 380 cys Arg Tyr Asp
Lys 1S5 Asn Thr Ase Vei Aen 330 Vsi Val Th.e Gin Alá 305 Arg Asn •Arg Prs The 408
Thr Laa Thr ®ly Cys 4SS Lys Lyíí Ciy Lys Asn 410 The Se s Phe Alá Gly 415 Thr
Vei lle Giu Gly 4 20 ?A> Cys Asn hhr Asn 425 Val Ser Val Gin Asp 4 30 11« Leu
Tyr Gly Asp Kis 435 Giu Cys Gly Ser 410 Láív. Le U Sin Asp Thr 445 Alá Leu Tyr
Leu Len Asp Gly 450 Hét. Thr As R 455 Thr IX <& Gin ASn Alá 460 Arg Sin Gly Al a
Alá 4 SS Arg Val Thr Ser Tee 474 Len Gly Gin Len 473 Ser Thr Al s Gly Lys; 440
Lys Leu Gl« Arg Arg •ISO Ser Lys Thr Txp The 490 Gly Alá iyr Al® Lén 4 SS
<210> 24 <211 > 495 <212> PRT «2Τ3» Ártificia^ Sequence <220>
<223» Oeseriplton of Ariiticiai Sequence: CSFV metánt <4Ö0> 24
Két Glu LhV Asn 1 Kis Phe C ♦lu Leu Lp» Tyr 13 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
0r<5 Val Gly Val 20 Giu. Glu ? ^n Val Tyr Asp Thr Alá Gly Arg P ce Len
85 30
7081 lO/rÜYO tó
225
305 /0
115 .30
135
1Λ0
1S5
ÍÓ0 .2: ΙΟ
200
203
230
310
X »φ φφ Φ«*φ * ΦΦ * ♦ Λ -9 φ) χ ♦ ♦ XX φ * * * φ ♦ «τ φ φ
ΦΦ »*» φφ φφ φφ
135
215
His 40 Pro Gin Ser Thr L®ü 45 Lys Leu Pro
11c Arg The Thr I«cu Arg Asp Leu Pro
30
Ή/ Asn ola Leu Λ^ .ΐ, \2 1? v.' íh tói sor Gly
73 80
V»! Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro
80 55
'01. η The The Ásp íSL Al & Gin Fhu Cy.>
105 '110
Arg Vei Thr Gly Otó Assp Gly Lys aX?V
πα 125
Asp Gly Cys Ile Lvu Lám Lys Lrv Alá
140
Lea Lys Trp 11® Arg Asn Ah* Thr Asp
155 ISO
Cys Sut Ásp A&p X y AJl Ts Ser Gly Ser
1 7 O HA
Mtó Ató'i wv\Sí \> X y h^y & *ίΆ? Lys Ue Aj; ·&
168 130
Ser Lys Thr Lys Pro Pro Ásp Ál a Thr
4 tó 4pA
Tyr Gin Xle Lys Lys Lys Gly lys. val
? Λ <*.· *l « ·
Oly Len Tyr Kis tíy $ Ásp Lyp Pro
275 240
Óin Lys Alá Lm Lén Ál-s Trp Ál. a Val
250 255
Pro Val Alá Alá Olu >tón Ile Thr Glp
263 270
Thr Asn Gly Ile Sin Arii Al a Hét Tyr
200 235
Leu ni 4 Gly ile Trp Pro Gin Lys ilt>·
3QU
leu Κ Τ M, ·«. Thr Asp Thr Glu tsu Lys Gin
215 320
Φφφ-φ * φχ * Φ* * Φ X Φ >» •X ife ΦΦΦ Φ·# »
ΦΦΦ X Φ φ Φ » ♦ ·* β Φ-Φ ♦* φφ φφ φφ [le Arg Gly Hét Hét Asp Al·» 'Ser S.1» Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
125
33«
Arg Le» Gin Art His Clu Txp Asn Lys Len Gly Trp Cys As. n Trp Tyr
3-11
150
Asn Xle A&p ?r«> Trp Lle Gin luu Hét Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355
3S«
355
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Al» Vai Thr Cys Arg Tyr Asp
75
385
Lys Asn Thr Asp Val Asn Vai Vai Thr Gin Ale Arg Asn Arg Fro Thr .380
335
00
Thr Le« Thr Gly Cys Lys Lys Giy Lys «05 ' 410
Phe .Ser phe Alá Gi y Thr «15
Vai Xle Glu Giy Prs Cys Asn Fh« As» Val Ser Val Glu Áss? lle Len !2Ö «25
430
Tyr Giy Asp Kis Gla Cys Oly Sár Lsu L«v Gin Asp Thr Alá Len Tyr 05 440 «45
Lan Leu ASö Giy Hefc Thr Asn Thr Xie Glu Asn Alá Arg Gin Gly Aia «55 «SO
Ua Arg Vai Thr Ser Trp leu Gly Arg Gin t*>u ser Thr Aia Giy 1 165 «19 475
Cys «80
Lya Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp rhg Giy Aia Tyr Aia hgu «85
OÖ
OS <210 25 <211 >495 <2.12> PRT <213> ÁriifieiAi Sequence <220>
<223> Descnption of Adrficraf Sequence: CSFV muiant <400 25
Gin sLíÍL V« Mr Kra 01 u '5 leu Leu Tyr 10 Thr Ser tyr '^ΦΜ-χ •’i s 1 Lys
Val Gi y Vál 2>:i Gl« ctg ?ro val Tyr Aar> TM 25 xl s? Gly Arg 33 * -χ· V Leu
Gly AS :> 35* Tro Ser Glu Val Mis Pra Gin Mr «0 Thr 4> Ley Pra
***·♦ φ ** «« χ»Φχ
Φ ΦΦ Φ 9 * » * * χ ΦΦΦ ΦΦ φ * χ X $ * φ ν φ
ΦΦ ΦΧφ Φρ* χχ χ-φ
Mis Asp 50 Arg Gly Arg Lly Asp SS 1 lé
Arg: ű$ Lys gi y Asp Cys Arg Ser Oly
lie w Tl.e T iíA 1-)¾ »v> X- -X- K· 83 •Sly Ft £5 vei
vei Tyr Mi© Atg Al»' 100 F~© Len G.X u
Gin W1 Thr 1 IS- Lys Arg Us ©λ y Arg 1TL
Tyr no II® Tyr Vei Cys Vei 135 Aep
Ly© 145 Arg íM y Thr Fr© Arg 15Ö Thr Leu
c,s Ft© Leu. Trp· Val 165 Thr Ser oys
Lys Aep Lys Lys Sr© ISO Asy Arg
Pro Arg Gl ··! m His Gin Lys ésp r 200
X -« Vei 210 V« I β.1 e Gi y Val Lys 815 Tyr
Lys Oly Lys Asn Thr Gin As;y Sly
225 230
Fre Glu Ser Arg Lys 245 Lys Len Gin
Ile Thr Lle Leu Lee 2 60 Tyr ;S l ö 2Xö
Tép A© n Lee 27 5 S@r Asp Asn T Thr 2.80
Lee Arg 280 Gly vei Asn Arg ser 295 Leu
Cys 3Ő5 Lys Gly vei Fr© Thr 110 His 14*o1 \-í
lie Arg Gly Met Aet 225 W Als Ser
A.ru Thr Thr Leu 50 Lee? As p· Luu 2 r©
Asn His Leu Gly Fre Val Ser Si y 30
Tyr Tyr SG Gin M,sp wvv w Thr Gly 95 2 re
2 he 1Ö.S Fha ing G In ALa Gin no Phe cys
Vei Thr Gly Ser Asp 3 85 Gly Lys Le©
Gly Cyé ~ is L eu 140 Len Lys Leu Alá
ly® Trp Ilé 155 Arg Asn Phe Thr Asn 160
Ser As© no Asp Gly Al» Ser Gly P$ Ser
Aen 103 Ly© Gly Ly® Leu Lys ISO ile Mt é
Ly® i Π Γ Ly » Tr© Fc® 205 Asp ALe Thr
Gin 2 in Ly© Lys 2 20 Lys •ui y Val
Lee Tyr Ms 235 Asn Lys Asn Μ- Ft© 240
Lys Alá 250 Leu Leu Als Trp MU 255 Val
Val 285 AH Alá G íj AsSn n« T?0 The Gih
Asn .·$ , V y lle Gin Arg 285 Aie Hét Tyr
Mis Gly lle T rp 300 F£Ű p in Ly® XI e
Ale Tht AS© Π5 Thr Glu Leu Ly® Glu 320
Glv Arg 'Thr As-h Tyr Thr Gye Cys
33G 335
Arg Asn Leu lle Gin Asp 365 Arg 340 Tro Kis Tép 01 u lle Trp Cin Aan Leu 340 Lys 54 5 két his Asn Gly Atg trp Thr Gye Sin 36 5 Asm 350 Thr Trp Asn Tyr Leu
Thr Glu 570 Gly F £ Ken Asp x»y s 3 '<? S Glu Cys Álé val Thr ISO Gye Arg •Τ-,-r ' r Σ Asp
Lys 535 Ásu Thr Aap Vél Asn 220 Val. Val Thr Gin Alá 395 Asg Asn Arg Pro «S « Sv 9 ρ 0
Thr Leu Thr Gly Gye 405 Lys Lys Oly Lys Asn 410 Phe Ser Phe Alá Gly 415 Thr
Vai lle du Giy 4 20 Fro Cys Aen Pha * >> <?. val Ser v&l \?X Aep 430 He Lap
Tyr Gly Asp 435 Hl s Glu Cys SXy Ser 440 Leu Lep Glu Asp Thr 445 Alá Leu Tyr
Leu LéU 450 Asp Gly két Thr Asn 455 Thr lle Glu Asn Alá 4S0 Arg Gin Gly Alá
Ála 4S5 Árg Val Thr Ser Trp <70 Leu Gly Atg Glu Leu 476 Ser Thr Alá G.;.y Lys 460
Lys Leu Glu Arg Azq 965 Ser Lys Tbc Trp Phe 490 Fx i s .v Alá Tyr Alá Lee 495
<210> 25 <211 >494 <212> ΡΚΤ <213> Ahsfícsel Sequence <220>
<223> Descripison of Artificiai Sequence: 8VDV műteni <40u> 26
két 1 61U Leu lle Thr 5 Ást Glu Leu Tyr 10 Ly s >he Tyr Lys Glu 15 Lys
Fee Álé Gly V«3: *5· *ν λ- !«í Glu Gin Pro V 3 1 Tyr jC. v? Asp Gls Alá Gly Asn .? <3* Pro Leu
The Gl y Gle 25 Árg Gi y Val lle h i s 40 Pro Gin Ser Thr Lep 95 Lys Len Pro
His Lys Arq Gly Glu Arg Glu VM Fru The ÁSh Leu Ma Sex* 1 a -.-. X X. ».·.'
35 40
Φ' X Φ Φ Φ' Φ·φ φ φ Φ > V-K
V VV » φ < w χ
Φ φ X> .y φ Φ Φ Φ
X φ φ χ φ φ χ φ
XV ΦΦΦ ΦΦ φφ φφ
Lys Arg Gly Asp Cys Arg Sér Gly Asn Ser Lys Gly ft» Val Ser Gl
M
íi« Tyr lé 8 hrn Gly Tre Χί ή Fh-e Tyr Gin Asp Tyr Lys Gly n
SS Ő.ft > v §S
Val Tyr HU Alá Pxw Le u Μχ.η Fhe The w χ. is» \·\λ u Ál a Ser C y &
$ Λ A •λ·\·· yi iás no
Glu Thr Thr Lys Arg Ile Oly Val Thr £.ly Ser Asp Ser Arg Leu
115 120 125
Tyr His Ile Ts/ >- Ld cya Un Asp oly Cys Ur ile Vei Lys Bér Ál £
110 n? X40
Thr Lys Asp Arg ul?·· Lys Vei Lan Lys Trp Vei HU As n Lys Leu Me
US ISO ISO ISO
Cys ? — Leu Trp Vei Ser Ser Cys Ser Mp Thr Lys Asp Clú Ci y vei
X4B X'?0 175
Vei Arg Lys Lys Gin Crlfi Ly?> 2 re Asp Arg Leu Lin My & Uy Arg Met
IBS 185 ISO
Lys Xls Thr ?«.> Lys Glu Ser Glu 1 y s Asp Ser Lys Ths Lys F Μ ?co
IBS 200 >05
Ásp Ma Thr 21« *»* ísx. Vei Asp Gly Vei Lys Tyr Cin * s& X. Ly a Lys Lyo.
218 115 eee
Gly Lys vei Lys s&r Lys Asn Thr Gin Asp Gly lev Tyr Kis ASrs Lys
220 230 225 240
Aas. Lys 2re ,<·-> s „ ΦΧ v s <? X· Ví Bér Asp Lys Lys Lee Glu Lys •Ά&-3& Lee Leu Al u
m XSÖ 255
Trp Alá Ile ík A le Val The The GXe Vei Thr Gíy Cl a Asn
200 2 OS ^'SA· Λ- .· lo
11« Thr Gin Trp Asn Len Cin Asp Asn. Oly Thr Cin Gly 1 Xé Sin Arg
215 240 2SS
Alá Met Ffce >Tle Arg Gly Vei Asn Mg Ser Leu h.ie Gly Ile Trp Bee
230 2T5 38Ő
Glu Lys He Cys Thr Gly vei no Ser «u Leu Ale Thr Asp· Thr Glu
305 3X0 315 380
leu lys Al á, Xlt His CXy Hét Met Asp Ser ΙαχΛ$ Lys Thr Asp Tyr
325 310 335
Thr Cys Gye .Arg Leu Gin Arg Mis tls Trp Ase Lys »**$ < V ^ry * *·£-' Cys Áin
343 345 iSG
Trp Tyr Asn Hí fv't >' Ben Trp Ile Leu Leu Hat Asn Lys Thr Gin Alá
355
340
OS
* Χ'φ φ-φ ♦ ♦ ♦ * 9 « * Φ
Φ X φφφ Φ« φ
Φ » φ Φ φ φ Φ· κφ φΦφ χ·χ »Φ φφ **φφ
Aha Tyr 393 leu 3 70 Asp Thr Arg Gla Aap Gly s« r GLe Asp 300 FrO 375 Leu Léé Arg As r. V & 1 Glu Val Cys Thr 395 Alá 330 Gin Val <3i Thr Arg Cys Asp Arg Ser 405
Pro Thr FM Lee Thr y X y Cys Lys lys Gly X Λ . Λ. .xsyxs Asn Ser Fhe Alá
105 410 415
Gly He Léé Val Gin Oly Pro Cys A»n The Giu 1.1 e AJ. 3: Val S ·« r tep
420 423 4 30
Val Leu Phe Lys Ri. ? Asp Cys Thr Ser V&.1 Ik Gin Asp Thr Alá
435 440 445
His Tyr Leó Val >Mg$ Gly Heh Thr Asn Ser Lee Glu Ser Alá ,Aig k? i í 1
450 <55 460
Gxy Thr Aie Lys Thr Thr Trp Leó Cl y Arg Cin Leu Oly i£8 Leit
465 *RCS 4 15 480
Oly lys iys Leu Asri Lí^-Sí Ser Lys Thr Trp Phe Oly ÁA
485 490
<210» 27 <211 > 495 <212> PRT <213» ArtTídai Sequence <229>
<223> ΟβδοφΟοη of Artificial Sequence: BVDV mutant
<4Ö0> 27
Met Glu Lto 1ÍS Th r Asn G1 u Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Gin Lys
·$ 5 10 15
3? re Alt Gly Vél Glé Síé FM Vei Tyr Asp Gin Alá Gly Am 1 te Leu
20 •Tett Α» vf oc
PhA Gl y Glu Arg Gly Val Xle His Pro Gin Ser Thr Leu Lya Léé Fro
35 40 45
His Lys Arg Gly Glu Arg Giu Vai FPP Thr teh Leu Alá Ser Lee Fí'ö
50 35 60
Lys Mg Gly Asp Cys .Arg Sor Gr y Asn Ser Lys Gly Pro Vai Ser Oly
95 70 75 80
W ΐ _ > f* .λ A- *...» Tyr Léé Lys Pro Gly ?í« La e Phe Tyr Glu A»» Tyr Lys Gly Psw
85 90 35
**
XX
Xsv ♦ ♦
Val Tyr Sb Arg Alá Ára Uö GIu éhe 105 éhe G.la Gitt v-> Al a ♦ * Φ « X * •X X A Ser 110 Φ X * Φ ♦: >*« »« χ Φ * ·» Φ X *··* X* *·*
Hét cya
Glu Thr Thr Lys Arg Xle Gly Arg Va 1 Thr Gl y 6er Ág p Ser Arg Lett
ns 120 125
Tyr His Xle Tyr Vél Cys Xle Asp Oly Cys lle lle Val Lya Al a
riO 135 14 S
'Thr Lys Asp Arg Gin Lya Val Leu Lys Trp Var His Aan Lys Lsu Asn
145 ' .150 155 165
Cys Frs Leu Trp Val Ser Ser Cys Le r Asp Thr Lys Asp Gitt- Gly Val
165 17G PL
Vél Arg Lys Lys Gin Gin Lys Ára Asp Arg Len Gitt Lys el y Arg Hét
ISO 185 250
Lys Álé Thr érn Lys GX« ser Gitt Lys Asp Sár Lys Thr Lya no éoa
155 200 205
Asp Ma Thr Xle Val Val Asp Gay Val Lys Tyr Gitt Val Lys Lys Lys
210 2: IS 220
Gly Lys val Lys Sas Lys Asn ’T'p. b- A VA S, Gin Lap Gly Lexj Tyr Kis ÁSS! cys
a a «. a e s i. V. V 235 240
Asn Lys Pra Gin Glu Ser Arg Lys Lys Lett G) tt Vy s> Áltt Lett Lett Alá
245 250 355
Trp Alá lle lle his Lett Val Fha yhn Gin Val Thr Heh Oly ί···· T . v «Á. L< Asn
260 205 270
Álé Thr Sin Trp Asn Lee Gin Asp •Áss Gly Thr Gitt Gly Álé Gitt Arg
375 2 §0 265
Alá Hét éhe Sin Arg Oly Val Ash Arg Ser Leu Kis Gly lle Tm Β .νΦ
200 295 300
•GXu Lys Xle Cys Thr dy y&i Ara Ser His Lee Als Thr ÁSjp Thr Gitt
305 319 315 320
Lee Lys Alá x|.« Ki a siy heh Hah Asp Alá Sej Gitt Lys Thr Asn Tyr
325 330 535
Tfcr Cys Cys Arg Leu sin ,«ug His Gitt Trp Asn Lys Kis Gly Trp Cys
$ a 345 350
Asn Trp Tyr Asn Xle Sl« Pso Trp X lé Lee Leu Két Asn I> Thr Gin
355 '3 Stl 365
Alá Asn Lee Thr dh Gly Sin Fitt Lee Arg G.l tt. Cys Als val Thr Cys
375 3?S 350
Arg Tyr Asp Arg Asp sex Asp ȟ: Asn Val Val Thr Gin & Arg A#p
205 330 3 35 4 30
W •'“ν
X X « « φ Α χ φ φ φ
X * *ΦΦ XX Φ
X · φ φ φ φ X
ΦΦ XXX «Φ νφ *<
Ser Gro Thr Pro Leu Thr dy Cy.o Lya Lys dy Lys 410 Aön Phe Sas Phe 415
A.la Giy II® Leu «2δ Vél Gly Pro Cys 425 Asn Phe Glu 1: 1 « Álé 4 30 W.1 Se r
Áss > Val Lan 4 35 í>H £ Ls*'& GlA itt.s Asp 440 cys Thr Ser V&l 11·.' 445 Sin Asp Thr
irts Kis 4 50 Tyr VAX Asp Giy 4 53 Met Thr Asn. Ser Leu 4 0Ö Glu 3« r Aia Ars
Gin 405 Sí y Thr. AM Len { V Thr Thr Trp Leu Oly Arg 4 ~5 Gin Leu dy 11 s 480
Lse ** Tf » A ö.iy Lyo Lys 4 SS & Asn Lys Ser Lys; Thr Trp «8 Phe Giy Als 475
<210> 28 <211 >485 <212> PRT <213> Artificsoi Sequence <220 <223> Descríptíon of Artifícíá! Sequence:. Part of CSFV Aifort <40Ö> 28
Heh <Slu '&eu Asn Kis The Gin Leu Leó Tyr Lys Tér Ser Lyr Gin Lys
1 5 ;& Ό is
P £«3 Vs,X GXy Va 1 51 o Glu Pro Val 11 4 Asp Thr Aia Gly Arg Pro Leu
2Ö 'l· < 4, S 30
•Phé Gly A« Pro Ser Giu Val Kis Pre Gin Se r Tér Lee Lys Leu Pro
35 40 <5
his Asp Arg 58 Go. y Arg Giy Asp 35 Íré Arg Thr Thr Leu Arg Ahp hó Léu Pro
Arg Lys Oly Asp Arg Ser Gly Asn His Leu Giy Pro Va.;. Aer .<·* i y
85 TÓ 75 80
11 e Tyr Us _>ys Pro 85 Lly Pro Vél. T y r Tyr 90 Gin Asp Tyr Thr »ry §5 Pro
Val Tyr His Arq Al a Pro Lse Glu Phe Phe Asp Giu Λ1a Gin Phe Cys
I80 105 110
Glu val Thr Lyu A rg lle Oly Arq v,ü Thr Giy Ser Asp Ciy Lys Leu
115 120 i.2 5
70813.3,7 RAK
Ö &
Λ* « λ *χ»
X Φ « «
XX φ ♦ * Φ « ♦ #» .♦ φ »»
Tyr Kis 130 Jle Tyr Val Cys Val 135 Asp Gly Cys Ile Len 148 Leu Lys Len Mis
Lys Arg 146 Gly Thr Orv .Arg 150 Thr Leu Lys Trp XXe 156 Arg MssS The Thr Asn 160
Cys FXö Len Trp Val Thr ISO Orr Cys Ser Asp Asp 170 Gly Alá Ser Gly 175 Ser
Lys Asp Lys Lys Fre Asp 180 Ax<? Hm A.sn 105 Lys Gly Lys Len Lys 190 .Xx«® Alá
Pro Arg Clu Hrs nltt r<ys 19$ Asp s&r 200 Lys Thr Lys P.re Frs 205 Asp Alá Thr
Ile Val 213 Val du Liy Vat w« 215 Tyr 67. n 11« Lys Lys 220 Lys Gly X<y í« Vsi
Lys Gly 225 Lys Asn Thr Cin 230 Asp Gly Leu Tyr Kis 23$ ASA Lys Asn Lys £> *s 243
Frö Glu Ser Arg Lys Lys 245 Len Glu Lys Al n Len 2 53 Leu Mis Trp Ab 2$ 5 Val
Ile Thr Xle Leu Len Tyr 260 Gin F~s Vei 's ·.- «: íbj Mis. Min Glu Asn Ile 270 Thr On
Trp Asn lea Ser Asp Asn 273 Oly Thr 283 Asn Gly Xle Gin Arg 225 Al s Tyr
Lm Ars? 270 Oly Vsi Asn Arg Se r 235 Len His Gly l.le Trp 300 Fre Cin Lya üe
Cys Lys 305 Gly Val Fre Thr 210 Kis Len Alá Thr 515 wv _ .5 Π \ Gin Lőtt Vy ís sin 320
Ik Arg Gly Hét Hah Asp 325 Al a ser Glu Arg Thr 333 Asm Tyr Thr Cy$ 335 Cys
Arg Lm Gin Arg his Cin íV Trp Arc Lys 345 His Gly Trp Cys Asn 350 Tm Tyr
Asn He Asp ?r« Trp Xle 35$ Gin Lsu 300 kefe Asn Arg Thr fcia 365 Thr Asn Lett
Thr Gin O'TA 3 ? y Gly Frs Vrn Asp Lys 375 Cin Cys Ars Vsa Th r 300 Cys A.rg Tyr Asp
Lys Asn 385 Thr Asp Val. Asn .333 Val Vul Thr Gin Alá 335 Arg A-Sn Arq Örs Thr «08
Thr Len Thr Oly Cys Lys 405 Lys dy Lys Asn í’hs 410 6« r Fh» Al Ciy 435 Thr
Vál XX e Glu Gly Fre Cys <20 A.sn The Asn 425 Val. Ser VjS js. Cl tt Asp «h Ile Leu
«> ffff y «> s ff * * «#·* ♦ ffff * «« »ff« ff» ffff· ff.;.».» ‘ X X «ff <
« 9 « ff* »»
Tyr Gly Asp His to \· 5» Gly Ser Len Lee <* Λ χ. ASjí?· Thr Aie Lee Tyr
935 toö 99 5
Leu Len top GXy Hat Thr Asn Thr lle Glu Asn Arg Gin Gly Aie
410 X 53 4 SO
Ma Arg VaX Thr Ser Trp Gly Arg Gin Mu 5 & : Th r Alii Gly Lys
4S5 <78 47 S 430
Lys Len Sin Agy Arg Ser Lys Thr Trp Ffee GXy Aln Tyr A.Xa Len 485 490 ' 495

Claims (16)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Legyengített pestivmus, amelyben a glikoprotein~ERNS»hen lévő RNáz-aktivitás az illető glikoprotein legalább egy amlnosavának deléciójával és/vagy mutációjával gátolt, ahol az RNáz-aktivitás az l. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint a 295 - 307. helyzetekben és./vagy a 338 -- 357. helyzetekben vagy más törzsekben ezeknek megfelelő helyzetekben levő amínosavaknál deléeiökkal és/vagy mutációkkal gátolt, azzal a fenntartással, hogy az illető glikoprotein 297. és/vagy 346. helyzeteiben levő aminosavak lizintől eltérők.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti pestivírus, amelyben az RNáz-aktivitás az 1, ábrában példaképpen a. CSFV-Alfort. törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346. helyzetben vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben tevő amlnosavának deléciójával vagy mutációjával gátolt.
  3. 3. Az 1, vagy 2. igénypont, szerinti pestivlrus, amelyben az RNáz-aktivitás az L ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346. helyzetében vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben tevő hisztidin-maradék deléciójával vagy mutációjával gátolt.
  4. 4. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti pestivlrus, amelyben az RNázaktivitás az 1, ábrában példaképpen a CSFV»Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 297. és 346. helyzeteiben vagy más törzsekben ezeknek megfelelő helyzetekben levő hisztidin-maradék leucinra. való mutációjával gátolt
  5. 5. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti BVDV-pesdvírus, amelyben az RNáz-aktivitás az 1, ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346. helyzetében vagy más BVDV-íörzsekbert érmék megfelelő helyzetben levő hisztidin-maradék deléciójával gátolt.
  6. 6. Az 1-2. vagy 4. igénypontok, bármelyike szerinti BVDV-pestivirus, amelyben az RNáz-aktivitás az l. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 297. és 346. helyzeteiben vagy más iUiU/ííAX ^*4* * φφ «» .♦.,«« ««»«*«* « ·»· * *Λ* *» φ * * ♦ « » V » « ♦·♦·' ΧΦΦ ΦΦ ί» ΦΦ
    BVDV-törzsekben ezeknek megfelelő helyzetekben levő hisztidin-maradék leucinra való mutációjával gátolt.
  7. 7, Nukleinsav, amely egy 1. igénypontban leírt gHkoprotem~ERN's-t kódol, amelyben az illető giikoprotein-ERNS-ben lévő RNáz-aktivitás a glikoprotein legalább egy aminosavának deléciójával és/vagy mutációjával gátolt, ahol az RNáz-aktivitás az 1. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint a 295 - 307. helyzetekben és/vagy a 338 - 357. helyzetekben vagy más törzsekben ezeknek megfelelő helyzetekben levő amínosavaknál delécíókkal és/vagy mutációkkal gátolt, azzal a fenntartással, hogy az illető glikoprotein 297. és/vagy 346, helyzeteiben levő aminosavak lizíntől eltérők,
  8. 8, A. 7. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az illető RNáz-aktivitás az
    1. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346, helyzetében vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben levő aminosav deléciójával vagy mutációjával, gátolt,
  9. 9, A 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az illető RNáz-aktivitás az 1, ábrában példaképpen a CSFV-Alfori törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346. helyzetében vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben levő hisztidin-maradék deléciójával gátolt.
    19. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav, ahol az illető RNáz-aktivitás az 1, ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346. helyzetében vagy más törzsekben ennek megfelelő helyzetben levő hisztidin-maradék leucinra való mutációjával gátolt.
  10. 11. Egy 7-9. igénypontok bármelyike szerinti BVDV-nukieinsav, ahol az illető RNáz-aktivitás az 1. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 346, helyzetében vagy más BVDV törzsekben ennek megfelelő helyzetben levő hisztidin-maradék deléciójával gátolt.
  11. 12. E^ 7-8. vagy .10. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav, ahol az illető RNáz-aktivitás az 1. ábrában példaképpen a CSFV-Alfort törzsre bemutatottak szerint az illető glikoprotein 297, és 346. helyzeteiben vagy más törzsekben ezeknek megfelelő helyzetekben levő hisztidin-maradék. leucinra.
    7íen való mutációjával gátolt.
  12. 13. A 7-12, igénypontok bármelyike szerinti nnkleinsavak alkalmazása nukleotid- és/vagy vektor-vakcinák előállítására.
  13. 14, Gyógyszerészeti kompozíció, amely magában foglal egy 1-6. igénypontok bármelyike szerinti pestivírust és/vagy egy 7-12, igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat.
    .
  14. 15, Egy 1-6, igénypontok bármelyike szerinti pestivírus és/vagy egy 7-12. igénypontok bármelyike szerinti, nukleinsav alkalmazása. állatban pestíviras-fertőzések megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszerészeti kompozíció előállítására.
  15. 16, A 15. igénypont szerint alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az illető a gyógyszerészeti kompozíció beadásra kerül egy ilyen megelőzést vagy kezelést. igénylő állatnak.
  16. 17. Bgy 1-6. igénypontok bármelyike szerinti pestivirns és/vagy egy 7-12. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav alkalmazása vakcina vagy gyógyszerészeti, kompozíció előállítására..
HU1200536A 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses, their use, and nuclein acids for their production HU228469B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98110356A EP0965639A1 (en) 1998-06-05 1998-06-05 Attenuated pestiviruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU228469B1 true HU228469B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=8232074

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1200536A HU228469B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses, their use, and nuclein acids for their production
HU0102707A HU228468B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses
HU1200537A HU228471B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Methods for detectable labeling of pestiviruses

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0102707A HU228468B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Attenuated pestiviruses
HU1200537A HU228471B1 (en) 1998-06-05 1999-05-26 Methods for detectable labeling of pestiviruses

Country Status (23)

Country Link
EP (5) EP0965639A1 (hu)
JP (3) JP4632540B2 (hu)
KR (1) KR100637940B1 (hu)
CN (2) CN101085346A (hu)
AR (3) AR020084A1 (hu)
AT (3) ATE316380T1 (hu)
AU (1) AU769823C (hu)
BR (2) BR9911619B1 (hu)
CA (1) CA2330241C (hu)
CO (1) CO5050392A1 (hu)
CZ (3) CZ301570B6 (hu)
DE (3) DE69928700T2 (hu)
DK (3) DK1084251T3 (hu)
ES (3) ES2253457T3 (hu)
HU (3) HU228469B1 (hu)
NZ (1) NZ509228A (hu)
PE (1) PE20000552A1 (hu)
PL (2) PL202509B1 (hu)
PT (2) PT1203813E (hu)
SI (3) SI1084251T1 (hu)
SK (3) SK287626B6 (hu)
TR (3) TR200003622T2 (hu)
WO (1) WO1999064604A2 (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
EP1104676A1 (en) 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
EP1149901B1 (en) * 2000-04-21 2006-04-05 Akzo Nobel N.V. Pestivirus mutants and vaccines containing the same
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
US20090068223A1 (en) 2005-11-15 2009-03-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
UY31930A (es) 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
JP2012507537A (ja) 2008-10-31 2012-03-29 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド マイコプラズマ・ボビスの抗原を含む種々の抗原の多価ワクチン組成物における使用
US8846054B2 (en) 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
UY32570A (es) 2009-04-24 2010-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna viva modificada de mycoplasma bovis mejorada
CN101915837B (zh) * 2010-07-28 2013-07-03 中国兽医药品监察所 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法
EP2618841B1 (en) 2010-09-21 2016-10-19 Intervet International B.V. Bvdv vaccine
CN103882051B (zh) * 2014-03-20 2016-04-06 北京市农林科学院 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒
WO2020211801A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. Recombinant classical swine fever virus

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122007000004I1 (de) * 1986-01-27 2007-05-24 Schering Plough Ltd Attenuierte Herpesviren, Herpesviren die eine Aminosäuresequenz kodierende fremde DNA enthalten, unddiese enthaltende Impfstoffe

Also Published As

Publication number Publication date
EP1203812B1 (en) 2005-11-30
JP5755265B2 (ja) 2015-07-29
DK1084251T3 (da) 2005-04-11
KR100637940B1 (ko) 2006-10-23
CA2330241A1 (en) 1999-12-16
SI1203813T1 (sl) 2006-06-30
TR200103666T2 (tr) 2002-03-21
JP5247770B2 (ja) 2013-07-24
CZ20004533A3 (cs) 2001-07-11
TR200103664T2 (tr) 2002-06-21
PE20000552A1 (es) 2000-07-14
SI1203812T1 (sl) 2006-04-30
SK287014B6 (sk) 2009-09-07
CZ301570B6 (cs) 2010-04-21
DE69929544T2 (de) 2006-07-20
EP0965639A1 (en) 1999-12-22
ES2235488T3 (es) 2005-07-01
DE69922953D1 (de) 2005-02-03
HUP0102707A2 (hu) 2001-11-28
HU228468B1 (en) 2013-03-28
DK1203812T3 (da) 2006-04-10
CA2330241C (en) 2010-09-21
PT1203813E (pt) 2006-06-30
SK18232000A3 (sk) 2001-05-10
JP2002517250A (ja) 2002-06-18
WO1999064604A2 (en) 1999-12-16
ES2257476T3 (es) 2006-08-01
ATE311193T1 (de) 2005-12-15
JP2010259445A (ja) 2010-11-18
BR9911619A (pt) 2001-10-02
KR20010071406A (ko) 2001-07-28
PL202509B1 (pl) 2009-06-30
DK1203813T3 (da) 2006-05-22
WO1999064604A3 (en) 2000-01-27
TR200003622T2 (tr) 2001-06-21
CN100374563C (zh) 2008-03-12
BRPI9917787B1 (pt) 2016-09-06
HUP0102707A3 (en) 2008-04-28
EP1203813A3 (en) 2004-02-04
CN101085346A (zh) 2007-12-12
CO5050392A1 (es) 2001-06-27
HU228471B1 (en) 2013-03-28
ATE286131T1 (de) 2005-01-15
PL348019A1 (en) 2002-05-06
DE69929544D1 (de) 2006-04-13
CZ301569B6 (cs) 2010-04-21
DE69928700T2 (de) 2006-06-22
JP2013099357A (ja) 2013-05-23
AU769823C (en) 2004-11-25
PL202161B1 (pl) 2009-06-30
AR071880A2 (es) 2010-07-21
EP1084251B1 (en) 2004-12-29
AR020084A1 (es) 2002-04-10
ES2253457T3 (es) 2006-06-01
AR071881A2 (es) 2010-07-21
CZ301494B6 (cs) 2010-03-24
PT1084251E (pt) 2005-03-31
EP1203812A3 (en) 2004-02-04
JP4632540B2 (ja) 2011-02-16
EP1614423A3 (en) 2008-01-30
AU769823B2 (en) 2004-02-05
BR9911619B1 (pt) 2013-11-12
EP1203813A2 (en) 2002-05-08
SK287625B6 (sk) 2011-04-05
DE69922953T2 (de) 2005-05-19
SK287626B6 (sk) 2011-04-05
EP1203812A2 (en) 2002-05-08
SI1084251T1 (hu) 2005-08-31
ATE316380T1 (de) 2006-02-15
EP1614423A2 (en) 2006-01-11
CN1304452A (zh) 2001-07-18
EP1203813B1 (en) 2006-01-25
NZ509228A (en) 2003-12-19
AU4369299A (en) 1999-12-30
EP1084251A2 (en) 2001-03-21
DE69928700D1 (de) 2006-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5755265B2 (ja) 弱毒化ペスチウイルス
US8895286B2 (en) Attenuated pestiviruses
JP2009291203A (ja) 感染性ウシウイルス性下痢ウイルスクローン
AU777991B2 (en) Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows
US20070015203A1 (en) Infectious bovine viral diarrhea virus