CN102012429B - 嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法 - Google Patents
嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法，属于生物技术领域。以硝酸纤维素（NC）膜为固相载体，以嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清为一抗，HRP-羊抗兔IgG为二抗。本发明一次可进行多个样本的测定，可显著缩短检测样本所需要的时间，且操作简便快速，同时可满足在非实验室条件下进行的要求，能够快速、方便地用于致病性嗜水气单胞菌的检测。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体地说，是一种致病性嗜水气单胞菌Dot-ELISA检测的方法。
背景技术
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于弧菌科气单胞菌属，为嗜温、有动力的气单胞菌群，该菌普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中。致病性嗜水气单胞菌对水产动物、畜禽和人类均有致病性，不仅可引起水产动物的烂鳃病、赤皮病、穿孔病等疾病，而且可以通过水产动物和水产品感染人畜，引发人畜腹泻和食物饲料中毒，是一种典型的人-兽-鱼共患病病原。鉴于嗜水气单胞菌的广泛致病性，因而对其进行快速有效的诊断、流行病调查及公共卫生检疫等具有重要价值。
嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒力因子密切相关。越来越多的研究表明，该菌产生的胞外毒素是其重要的致病因子。目前针对嗜水气单胞菌的检测技术主要为常规细菌学检测、PCR检测等。由于常规细菌学检测技术耗时费力，不具备快速检测的优点；PCR检测方法虽灵敏度高、特异性好，且不受病原微生物可培养与否的限制，但该技术要求实验仪器精密，且操作技术有一定的难度，因此不适于在基层推广。斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)与ELISA相似，其特征在于将ELISA中的固相载体变成硝酸纤维素(NC)膜。采用Dot-ELISA检测嗜水气单胞菌具有快速、特异性较强、重复性好、可同时检测大量样品等优点，既保留了常规ELISA的优点，又克服了其繁琐的程序，且结果直观，可用肉眼直接观察。
针对嗜水气单胞菌胞外产物建立的Dot-ELISA已纳入致病性嗜水气单胞菌检验方法国家标准(GB/T 186522-2002)，但由于嗜水气单胞菌胞外产物成分较为复杂，包括胞外毒素如气溶素、溶血素和细胞毒性肠毒素，以及胞外蛋白酶、核酶和淀粉酶等，因此以总胞外产物建立的Dot-ELISA检测方法不易标准化。研究表明，嗜水气单胞菌所产生的气溶素(Aerolysin)是其重要的致病因子，且气溶素基因在致病性嗜水气单胞菌不同分离株中高度保守。因此，通过克隆表达嗜水气单胞菌气溶素，以嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清为一抗，HRP-羊抗兔IgG为二抗，从而建立嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法。这种检测方法不仅简便、快速、准确，可以满足非实验室条件下的检测要求，而且易于标准化，具有广泛的应用前景。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于通过克隆表达嗜水气单胞菌的气溶素，以嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清为一抗，建立一种更为标准化的致病性嗜水气单胞菌Dot-ELISA检测方法。
技术方案
用于检测建立嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法，其特征在于：对嗜水气单胞菌毒力因子气溶素进行原核表达，然后以表达的嗜水气单胞菌重组气溶素为免疫原制备兔抗血清，以嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清为一抗，HRP-羊抗兔IgG为二抗，建立Dot-ELISA检测方法。具体包括：
1)标准株的选择
本发明中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-1株，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.3220；
2)嗜水气单胞菌气溶素的原核表达
(1)设计气溶素基因引物：
上游引物：CATGGATCC ATCCGTGGCAACAATGAC BamH I
下游引物：TGTCTCGAG TCTCGGCACTGAAATCGC Xho I
提取嗜水气单胞菌J-1株基因组，PCR扩增嗜水气单胞菌气溶素基因片段；
(2)将扩增到的基因片段通过酶切、连接插入到pET-32a(+)中，构建出原核表达质粒，将构建好的重组质粒转入大肠杆菌BL21中，1mM IPTG诱导表达，表达产物为分子量49.6kDa的融合蛋白粗提物，进一步用His Trap亲和层析柱进行纯化，获得嗜水气单胞菌重组气溶素；
3)嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清的制备
将纯化蛋白与等体积的ISA佐剂完全乳化后，背部皮下多点注射2.5kg纯种新西兰雄性大白兔，总注射量0.3g/kg体重，首免15d后进行二免，剂量减半；第二次免疫后10d进行三免，剂量同二免，三免后1周内采血三免后3d采血，心脏采血，获得嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清；
4)嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法
用接种环取培养基表面菌落，接种LB培养基，28℃ 160rpm/min摇床培养48h，13000r/min离心1min取上清，用微量加样器取5μL点样于硝酸纤微素膜光面，37℃烘干，置于质量体积比20％脱脂奶中，37℃封闭1h，用PBST 3次，每次5min，置1∶50嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清中，37℃作用1h；用PBST洗3次，每次5min；置1∶10000酶标羊抗兔中，37℃作用1h，用PBST洗3次，每次5min；滴加DAB显色指示剂显色，待斑点明显后，用去离子水终止显色，设无菌肉汤作阴性对照，以出现棕色斑点者判为阳性，表明待检测菌产生嗜水气单胞菌气溶素。
有益效果
在本发明中，术语“融合蛋白”，是指包括pET-32a(+)载体上的His Tag及一系列酶切位点在内的氨基酸加上目的蛋白的氨基酸序列。融合蛋白的最大优点是方便蛋白的纯化及防止蛋白降解。
本发明嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法，能够更加快速、准确、有效地鉴定出致病性嗜水气单胞菌，为该病原菌引起的水产动物细菌性败血症暴发流行的防控工作奠定基础。本发明有以下创新点：1.采用的Dot-ELISA方法具有快速、特异性较强、重复性好、可同时检测大量样品等优点，既保留了常规ELISA的优点，又克服了其繁琐的程序，且结果直观，可用肉眼直接观察，实现待检菌株的快速有效检测；2.气溶素在嗜水气单胞菌发挥致病性上起重要作用，是研究最深入的通道形成毒素之一，且该毒素在致病性嗜水气单胞菌不同分离株中高度保守。本发明以此为待检抗原，用于判定嗜水气单胞菌是否具有致病性，可靠性好。检测结果表明，Dot-ELISA方法检出阳性率为86.8％，PCR检测aer的阳性率为92.1％，二者符合率为92.1％。
附图说明
图1为重组气溶素蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析
M.中分子量蛋白标准品；1.诱导pET-32a/BL21的菌体总蛋白；2.未诱导pET-aer/BL21的菌体总蛋白；3.无IPTG诱导pET-aer/BL21的菌体总蛋白；4-8.IPTG诱导pET-aer/BL21的菌体总蛋白
图2为pET-aer表达产物的纯化(A)及免疫印迹(B)；
M.中分子量蛋白标准品；1-4.纯化的重组气溶素蛋白
图3为嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法特异性试验
1.嗜水气单胞菌J-1；2-6.温和气单胞菌、爱德华菌、大肠杆菌、葡萄球菌、猪链球菌2型；7.阴性对照(PBS)
图4为嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法敏感性试验
1-5.重组气溶素的浓度分别为1.6×100，1.6×10-1，1.6×10-2，1.6×10-3，1.6×10-4mg/ml
具体实施方式
下面结合具体实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，例如《分子克隆实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)(Sambrook等人)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。
(一)嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法的建立
1.标准株的选择
本发明中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-1株，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.3220。
2.嗜水气单胞菌重组气溶素的原核表达及纯化
1)嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆
采用基因组提取试剂盒(天根公司)抽提嗜水气单胞菌J-1株总DNA。设计气溶素基因上游引物：CATGGATCC(BamH I)ATCCGTGGCAACAATGAC，下游引物：TGTCTCGAG(Xho I)TCTCGGCACTGAAATC GC。PCR扩增了嗜水气单胞菌气溶素基因片段，并连接pMD-18T simple载体(Takara公司)进行测序。
2)表达载体的构建
BamH I(Takara公司)和XhoI(Takara公司)分别酶切PCR产物和pET-32a(+)(Takara公司)，T4 DNA连接酶(Takara公司)16℃过夜连接。连接产物转入大肠杆菌TOP10(天根公司)中，37℃过夜培养，提取质粒，用BamH I和XhoI酶切鉴定。
3)融合蛋白的表达
阳性克隆提质粒，转入大肠杆菌BL21(Takara公司)中。挑取单菌落接种于5mL LB培养基(含5μL，100μg/mL安苄青霉素)37℃过夜培养。取50μL过夜培养菌液接种5mL LB培养基(含5μL，100μg/mL安苄青霉素)，37℃180rpm/min摇菌3h，至OD600为0.4-0.6。加IPTG至终浓度为1mM，25℃摇菌3-5h后，4℃，10000rpm/min离心8min，收集菌体。用高压灭菌的PBS缓冲液洗涤菌体，重复3次。菌体用1/10菌液体积的超声裂解液重悬，进行超声波破碎菌体，功率200W，工作5s，间隔10s，直至悬液较澄清。超声后的悬液，4℃，10000rpm/min离心20min，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测表明，融合蛋白以包涵体形式进行表达。
4)融合蛋白的纯化
将收集的包涵体用包涵体洗涤液(20mM Na3PO4·12H2O，0.5M NaCl，20mM咪唑，2M脲，pH7.4)洗涤一次，4℃，10000rpm/min离心10min。沉淀用平衡缓冲液(20mM Na3PO4·12H2O，0.5M NaCl，20mM咪唑，8M脲，1mMβ-巯基乙醇，pH7.4，0.45μm滤膜过滤)重悬，4℃溶解过夜或者30℃水浴1h，4℃，12000g离心20min，上清用0.45μm的滤膜进行过滤。用His Trap亲和层析柱(1mL，GE公司)进行纯化。纯化方法如下：首先，用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器接上，1mL/min流速洗柱，避免空气进入柱中；其次，以1mL/min流速平衡缓冲液10mL平衡柱床；接着，将处理好的样品上样，上样完毕后以10mL平衡缓冲液淋洗，洗脱未结合蛋白；淋洗完毕后用5-15mL洗脱缓冲液(20mM Na3PO4·12H2O，0.5M NaCl，500mM咪唑，8M脲，1mMβ-巯基乙醇，pH7.4，0.45μm滤膜过滤)洗脱目的蛋白并分管收集，每管1mL；最后，用10mL平衡缓冲液再次平衡柱床，用5mL 20％乙醇再次平衡，4℃保存。纯化得到的融合蛋白即为嗜水气单胞菌重组气溶素。
5)融合蛋白的检测
(1)SDS-PAGE：配制12％的分离胶(20mM Na3PO4·12H2O；0.5M NaCl；20mM咪唑；2M脲，pH7.4)和5％的浓缩胶(1.4mL ddH2O，0.33mL 30％丙烯酰胺溶液，0.25mL 1M Tris pH 6.8，0.02mL 10％SDS，0.02mL 10％过硫酸铵，0.002mLTEMED)。样品添加上样缓冲液沸水煮10min。浓缩胶电压80V，分离胶电压120V。电泳2.5h。考马斯亮兰染色2h，脱色液脱色。观察，在约49.6kDa处有明显的条带出现。
(2)Western Blot鉴定：SDS-PAGE结束后，去除浓缩胶，测量凝胶大小。根据凝胶的大小剪两张商品化转印用滤纸和一张PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(GE公司)。将PVDF膜浸没于甲醇中5s左右，立即取出和滤纸一起浸没于膜转移缓冲液(甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200mL，去离子水定容至1L)中，平衡5min以上。按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，按照0.7mA/cm2通电转印2h。PVDF膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液(含有5％脱脂奶的TBST缓冲液，TBST缓冲液：NaCl 8.8g，1M Tris-HCl(pH8.0)20mL，Tween-20 0.5mL，去离子水定容至1L)，37℃孵育2h。将PVDF膜转移至含有封闭液和1∶5000稀释的嗜水气单胞菌全菌抗血清(常规方法免疫家兔自制，ELISA效价达1∶106)的密封塑料袋中，37℃孵育1.5h。取出PVDF膜用，TBST漂洗3次，每次5min。PVDF膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和1∶200稀释的HRP-羊抗兔IgG(博士德公司)。37℃孵育1h。PVDF膜放TBST中漂洗3次，每次5min，最后一次用TBST漂洗。加入沉淀型单组分TMB底物溶液(天根公司)显色5-30min。观察结果，在49.6kDa处有棕色条带出现。
3.嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清的制备
将融合蛋白与等量的ISA佐剂(法国SEPPIC公司)完全乳化后，取2.5kg纯种新西兰雄性大白兔背部皮下多点注射，总注射量0.3mg/kg体重。首免15d后进行二免，剂量减半。第二次免疫后10d进行三免，剂量同二免，三免后1周内采血。三免后3d采血，心脏采血，获得抗血清，ELISA检测抗体效价达1∶25600。
4.嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法的建立
嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法工作程序：参照GB/T186522-2002致病性嗜水气单胞菌检验方法，用接种环取鉴别培养基表面菌落少许，接种蔗糖胰蛋白胨肉汤培养基，在最佳温度下摇床(160rpm/min)培养合适时间。13000rpm/min离心1min，取上清，用微量加样器取5μL点样于NC膜光面，37℃烘干。在最佳封闭条件下进行封闭，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。置含有最适浓度的嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清封闭液中，37℃作用一定时间。用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。置含有最适浓度的HRP-羊抗兔IgG封闭液中，37℃作用一定时间，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。滴加DAB显色指示剂(天根公司)显色，待斑点明显后，用去离子水终止显色。设无菌肉汤作阴性对照，以出现明显棕色斑点者判为阳性。
1)细菌培养时间和培养温度的优选
嗜水气单胞菌J-1株接种于LB培养液中，选取28℃、30℃、32℃、34℃和37℃等不同温度摇床培养，分别于培养后6h、12h、24h、32h、36h、48h和72h，13000r/m离心1min，收集菌液上清，点样于NC膜，按照上述工作程序进行试验，选择最佳条件为阴性不着色、阳性呈清晰棕色斑点。嗜水气单胞菌最适增菌温度和时间是28℃摇床(160rpm/min)培养48h。
2)封闭液及封闭条件的优选
分别采用封闭液5％脱脂奶、10％脱脂奶、20％脱脂奶、1％BSA和10％小牛血清；封闭时间选择37℃30min，37℃1h，37℃2h和4℃过夜进行选择封闭。按照上述工作程序进行试验，选择的最佳封闭液及封闭时间为阴性不着色、阳性呈清晰棕色斑点。最适封闭液为20％的脱脂奶，最佳封闭条件为37℃1h。
3)抗体工作浓度和作用时间的优选
嗜水气单胞菌重组气溶素抗血清工作浓度(1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)和时间(30、60、120min)选择，按照上述工作程序进行试验，选择最佳的抗体工作浓度和封闭时间为阴性不着色、阳性呈清晰棕色斑点。嗜水气单胞菌重组气溶素抗血清的最佳工作浓度是1∶50，最佳作用条件为37℃ 1h。
4)酶标二抗及其浓度和作用时间的优选
对比选择HRP-羊抗兔IgG和HRP-葡萄球菌A蛋白(HPR-SPA)工作浓度(1∶1000，1∶5000，1∶10000，1∶20000)和时间(30min、60min、120min)，分别作为二抗进行封闭。按照上述工作程序进行试验，选择最佳的酶标二抗及其作用条件为阴性不着色、阳性呈清晰棕色斑点。最佳酶标二抗为HRP-羊抗兔IgG，最佳工作浓度是1∶10000，最佳作用条件为37℃1h。
(二)嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法的特异性和敏感性评价
1.特异性试验
取嗜水气单胞菌标准株J-1、6株非嗜水气单胞菌(温和气单胞菌、爱德华菌、大肠杆菌、葡萄球菌、猪链球菌2型)培养液上清和阴性对照(胰蛋白胨肉汤培养基)，分别用嗜水气单胞菌重组气溶素抗血清做Dot-ELISA。嗜水气单胞菌标准株J-1检测结果为阳性，而对大肠杆菌IMT5155(马新蕾，王少辉，刘永杰等，禽致病性大肠杆菌IMT5155株毒力相关基因片段E9的表达及生物学特性分析，《畜牧与兽医》，20-24，295期)、葡萄球菌标准菌株(钟辉，姚火春，奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株生化特性与菌体蛋白免疫原性分析，《农业生物技术学报》，2006年06期)、爱德华菌菌株(欧阳志明，陈怀青，陆承平，迟缓爱德华菌的粘附特性，《南京农业大学学报》，1997年03期)、猪链球菌2型(姚火春；陈国强；陆承平，猪链球菌1998分离株病原特性鉴定，《南京农业大学学报》，1999年02期)检测结果均为阴性。
2.敏感性试验
将纯化的重组气溶素(1.6mg/ml)用50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)作10倍比连续稀释，观察出现明显棕色斑点的最高稀释倍数。1000倍后仍然可见斑点，表明可检测的气溶素最低浓度为1.6μg/mL。
(三)检测效果比较
选取38株公知公用嗜水气单胞菌(见表1)，用建立好的Dot-ELISA方法进行检测，同时采用PCR 38株嗜水气单胞菌的气溶素基因进行检测，对比两种方法检出的符合率。符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/所检菌株×100％。按如下检测方案进行。
1.嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法
用铂金耳取培养基表面待检测菌落少许，接种于LB培养基28℃摇床(160rpm/min)培养48h。13000rpm/min离心1min取上清，用微量加样器取5μL点样于硝酸纤微素膜光面，37℃烘干。置于20％脱脂奶中，37℃封闭1h，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。置1∶50嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清封闭液中，37℃作用1h。用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。置1∶10000 HRP-羊抗兔IgG封闭液中，37℃作用1h，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。滴加DAB显色指示剂显色，用去离子水终止显色。设无菌肉汤作阴性对照，以出现棕色斑点者判为阳性，表明待检测菌产生嗜水气单胞菌气溶素。
2.嗜水气单胞菌气溶素(aer)基因的PCR检测
取PCR Master Mix(Takara公司)16.5μL于PCR薄壁管，加入aer的上下游引物(10pmM)各1μL，然后加入细菌基因组提取试剂盒(天根公司)抽提制备好的基因组DNA模板(40-80ng)2μL，最后加入超纯水补足至25μL，阴性对照为PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。阳性对照为J-1株基因组。反应参数：94℃预变性5min后，进入循环：94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，置4℃保存。取10μL产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝胶成相系统下拍照判定。
aer引物序列如下，特异性扩增的目的片段大小为301bp。
上游引物：5’-AACCGAACTCTCCAT-3’；
下游引物：5’-P2：CGCCTTGTCCTTGTA-3’。
表1：PCR和Dot-ELISA两种方法检测结果的比较
J-1，PBS-10，SPS104，FPK-81，T1，FBS-35，HA15，G3，DF4-3CC，T8，HA50，SPS103，N-1-2，Z4，HA9，DF4-2GC，Y5，TK961010，PEG14，HB03，HB07，SB94-7，SB94-5，SB94-1，L316，CHSOO-3，AH9617，WCOO-2，BSK-10，TPS-49见文献：Ni XD，Wang N，Liu YJ，Lu CP.Immunoproteomics of extracellular proteins of the Aeromonas hydrophila Chinavaccine strain J-1 reveal a highly immunoreactive outer membrane protein.FEMS Immunol MedMicrobiol.2010，8(3)：363-373.(http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/fim.2010.58.issue-3/issuetoc)
DF850P见文献：任燕，致病性嗜水气单胞菌的检测与一种温敏胞外蛋白酶基因的克隆、表达及其免疫性研究，2006，硕士论文。
(http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx？filename＝2005087897.nh&dbname＝CMFD2005)
NJ1，NJ2，NJ5，NJ6，NJ7，NJ8，JJ1见文献：罗志飞，江苏地区嗜水气单胞菌分离鉴定、分子分型及弱毒株生物学特性分析，2009，硕士论文。
检测结果表明，Dot-ELISA方法检出阳性率为86.8％，PCR检测气溶素基因的阳性率为92.1％，二者符合率为92.1％。
综上所述，本发明嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法，能够更加快速、准确、有效地鉴定出致病性嗜水气单胞菌，为该病原菌引起的水产动物细菌性败血症暴发流行的防控工作奠定基础。本发明有以下创新点：1.采用的Dot-ELISA方法具有快速、特异性较强、重复性好、可同时检测大量的样品等优点，既保留了常规ELISA的优点，又克服了其繁琐的程序，且结果直观，可用肉眼直接观察，实现待检菌株的快速有效检测。2.气溶素在嗜水气单胞菌发挥致病性上起重要作用，是研究最深入的通道形成毒素之一，且该毒素在致病性嗜水气单胞菌不同分离株中高度保守。本发明以此为待检抗原，用于判定嗜水气单胞菌是否具有致病性，可靠性好。
Claims (1)
1.嗜水气单胞菌重组气溶素的Dot-ELISA检测方法，其特征在于，对嗜水气单胞菌的毒力因子气溶素进行原核表达，获得分子量为49.6kDa的融合蛋白嗜水气单胞菌重组气溶素；以嗜水气单胞菌重组气溶素为抗原制备兔抗血清，并以其为一抗，HRP-羊抗兔IgG为二抗建立嗜水气单胞菌重组气溶素Dot-ELISA检测方法，具体包括：
1）标准株的选择
所述检测方法中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-1株，分类命名：嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO. 3220；
2）嗜水气单胞菌气溶素的原核表达
（1）设计气溶素基因引物：
上游引物：CATGGATCC ATCCGTGGCAACAATGAC BamHⅠ
下游引物：TGTCTCGAG TCTCGGCACTGAAATCGC XhoⅠ
提取嗜水气单胞菌J-1株基因组，PCR扩增嗜水气单胞菌气溶素基因片段；
（2）将扩增到的基因片段通过酶切、连接插入到pET-32a（+）中，构建出原核表达质粒，将构建好的重组质粒转入大肠杆菌BL21中，1mM IPTG诱导表达，表达产物为分子量49.6 kDa的融合蛋白粗提物，进一步用His Trap 亲和层析柱进行纯化，获得嗜水气单胞菌重组气溶素；
3）嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清的制备
将纯化蛋白与等体积的ISA佐剂完全乳化后，背部皮下多点注射2.5kg纯种新西兰雄性大白兔，总注射量0.3g/kg体重，首免15d后进行二免，剂量减半；第二次免疫后10d进行三免，剂量同二免，三免后1周内采血 三免后3d采血，心脏采血，获得嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清；
4）嗜水气单胞菌气溶素Dot-ELISA检测方法
用接种环取培养基表面菌落， 接种LB培养基，28℃160rpm/min摇床培养48h，13000r/min离心1min取上清，用微量加样器取5μL点样于硝酸纤微素膜光面，37℃烘干，置于质量体积比20%脱脂奶中，37℃封闭1h，用PBST 3次，每次5min，置1:50嗜水气单胞菌重组气溶素兔抗血清中，37℃作用1h；用PBST洗3次, 每次5min；置1:10000酶标羊抗兔中，37℃作用1h，用PBST洗3次，每次5 min；滴加DAB显色指示剂显色，待斑点明显后，用去离子水终止显色，设无菌肉汤作阴性对照，以出现棕色斑点者判为阳性，表明待检测菌产生嗜水气单胞菌气溶素。
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