FI98704C - Menetelmä valmistaa reseptoreita, joilla on sitomisaktiivisuus pienen reseptoriryhmän nuhaviruksiin ja niiden käyttö - Google Patents

Description

98704

Menetelmä valmistaa reseptoreita, joilla on sitomisaktiivisuus pienen reseptoriryhmän nuhaviruksiin ja niiden käyttö - Förfarande för att framställa receptorer med bindningsaktivitet för den lilla receptorgruppens rhinovira och deras användning

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa reseptoreita, joilla on sitomisaktiivisuus pienen reseptoriryhmän nuhaviruksiin, sen puhdistaminen sekä sen käyttö.

Ihmisen nuhavirukset muodostavat Picoma-virusten heimon sisällä suuren suvun ja ne sisältävät erilaista serotyyppiä (6, 11). Nämä RNA-virukset hyökkäävät ihmisen hengitystiehyeeseen ja aiheuttavat akuutteja infektioita, jotka johtavat nuhaan, yskään, käheyteen jne., ja joita yleisesti kutsutaan kylmettymiseksi (15). Nuhavirusten aiheuttamat infektiot ovat kaikkein yleisimpiä ihmisten sairauksista. Vaikkakin sairauksien kulku on useimmiten harmiton, kylmettymisen heikentävät kuitenkin organismia yleisesti. Muut patogeenit voivat tällä tavoin aiheuttaa sekundäärisiä infektioita.

Ihmisen nuhavirusten suuri ryhmä voidaan jakaa kahteen alaryhmään, kun luokittelun kriteerinä käytetään kilpailua humaanien soluviljel-mäsolujen (yleensä HeLa-solut) pinnoilla olevista sitoutumiskohdista. Tämä alkuperäinen luokittelu (10), jossa nuhaviruksia oli vain muutama, voitiin laajentaa 88:aan laajemmaksi suunniteltujen kokeiden avulla (4, 1). Näiden kokeiden tulosten perusteella on pääteltävissä, että suuresta lukumäärästä huolimatta solujen pinnoilla on vain kaksi keskenään erilaista reseptoria, jotka voivat sitoutua jomman kumman nuhavirusryhmän edustajaan. Tähän mennessä on voitu luokitella 78 serotyyppiä "nuhavirus-reseptoreiden suureen ryhmään" ja 8 "nuhavirusreseptoreiden pieneen ryhmään" (RVRG, Rhinovirus-Rezeptor-Gruppe). Kaksi muuta nuhavirusten edustajaa ei käyttäytynyt yksiselitteisesti, eikä niiden jakaminen ollut siten lopullisesti mahdollista (1).

Nuhavirusinfektioiden on viime vuosina todettu huomattavasti lisääntyneen asutuskeskuksissa. Useimmissa muissa infektiosairauksissa esiintyy pitkäaikaista tai pysyvää immuniteettia kyseistä sairauden aiheuttajaa vastaan, mutta sen sijaan nuhavirusten aiheuttamat infektiot esiintyvät yhä uudelleen. Pysyvän immuniteetinpuuttumisen 2 98704 syynä on nuhaviruskantojen, joilla keskenään ei esiinny lainkaan immunologista ristireaktiota tai sitä esiintyy vain vähän, suuri määrä (6, 11). Infektoitumisen jälkeen voidaan tosin osoittaa vasta-aineita kyseistä viruskantaa vastaan, mutta nämä eivät anna mitään suojaa muita nuhaviruskantoja vastaan. Nuhavirusten aiheuttamat toistuvat infektiot ovat mahdollisia väestössä kiertävien kantojen suuren lukumäärän vuoksi.

Vain kahden reseptorin olemassaolo tarjoaa siten lupaavia aloitus-mahdollisuuksia nuhavirusinfektioiden onnistuneelle torjumiselle.

Koska reseptorit ovat yleensä erittäin spesifisiä, on olemassa mahdollisuus vaikuttaa kohdistetusti reseptoreihin sopivien aineiden avulla, esimerkiksi salpaamalla reseptorit. Jos käytetään reseptoreita salpaavia aineita, voidaan estää reseptorispesifisten virusten tunkeutuminen soluihin. Nämä samat aineet, joita tällä tavoin voidaan käyttää infektion estämiseen, ovat käytettävissä myös todetun nuhavirusinfektion hoitoon. Tällaisten aineiden saaminen helpottuu oleellisesti, useissa tapauksissa on jopa vasta tällöin mahdollista, kun vastaava reseptori on karakterisoitu.

Esillä olevan keksinnön tavoitteena oli siten eristää pienen RVRG-ryhmän reseptori ja puhdistaa se.

Tähän mennessä ainoat käytettävissä olevat, nuhavirusten reseptoreita koskevat tiedot koskevat suuren RVRG-ryhmän reseptoria.

Suuren RVRG-ryhmän reseptorin puhdistaminen ja karakterisointi suoritettiin monoklonaalisen vasta-aineen avulla, joka oli saatu immunisoimalla hiiret HeLa-soluilla. Tämä reseptori on glykolysoitu-nut, ja natiivissa tilassa sen molekyylipaino on 440 kD. Denaturoin-ti natriumlauryylisulfaatilla on 440 kD alayksikön irtoamisen, jolloin oli lähellä johtopäätös, että funktionaalinen reseptori on pen-tameerinä (17). Pienen RVRG-ryhmän reseptoria ei ole tähän mennessä karakterisoitu eikä puhdistettu. Ainoat tiedot tästä reseptorista viittaavat sen muodostumiseen proteiinista ja osoittavat lisäksi, että näitä - tai samankaltaisia - proteiineja on mukana myös monien * muiden lajien soluissa. Tämä erottaa pienen RVRG-ryhmän reseptorin oleellisesti suuren ryhmän reseptorista, jota on löydetty vain ih- li 3 98704 missoluilla ja muutamissa tapaukissa apinasoluilla. Vaikuttaminen reseptoriin, esimerkiksi salpaamalla reseptori aineilla, jotka estävät viruksen tunkeutumisen soluun, näyttää mahdolliselta torjuntakeinolta tai myös sopivalta jo olemassa olevan infektion hoitokeinolta .

Esillä olevan keksinnön tavoitteena oli siten luoda edellytykset valmistaa aineita, jotka mahdollistavat suojautumisen pienen resep-toriryhmän nuhavirusten aiheuttamia infektioita vastaan.

Esillä olevassa keksinnössä tämä tavoite saavutettiin siten, että a. soluista, parhaiten HeLa-soluista eristetään ja puhdistetaan mem-braaneja, b. membraanien reseptorit liuennetaan detergenteillä, parhaiten Triton-XIOO:11a, CHAPS :11a, Zwittergent:11a, oktyyliglukosidilla tai DOC:11a, erityisen mielellään oktyyliglykosidilla, c. liukenemattomat ainesosat poistetaan ja d. reseptorit puhdistetaan kromatograafisesti parhaiten konka-navaliini-A-, risiini-sefaroosi- tai Lens culinaris- lektiinipyl-väässä ja käsiteltiin neuramidaasilla, jonka jälkeen reseptorit kromatografoidaan anioninvaihtopylväässä, parhaiten Mono Q-pylväässä ja/tai Superose-pylväässä, jotka reseptorit ovat nuhavirukseen sitoutuva glykoproteiini, jolla on seuraavat ominaisuudet: (i) molekyylipaino on 120 kD polyakryyliamidigeelillä SDS:n läsnäollessa; (ii) sedimentointivakio määritettynä sakkaroosigradienttisent- rifugoinnilla detergentin läsnäollessa, vastaa arvoa noin 28,4S; (iii) sitoutuu Lens culinaris-lektiiniin; (iv) ei sitoudu hepariini-sefaroosiin; (v) sitoutuu irreversiibelisti anioninvaihtajaan; (vi) sen sitoutumisaktiivisuus neuramidaasin on voimakas ,- (vii) se muodostuu ala-yksiköistä, jotka molekyylin sisäisesti on liitetty disulfidi-silloilla; (viii) sillä ei ole sitoutumisaktiivisuutta nuhavirukseen nähden EDTA:n läsnäollessa.

4 98704

Erityisen sopivaksi detergentiksi osoittautui 1-prosenttinen 1-O-n-oktyyli-ft-D-glukopyranosidi (kuvio 0).

Liukenemattomat komponentit erotettiin ja liuoksessa olevat reseptorit puhdistettiin edelleen. Jotta viruksia sitovaa aktiivisuutta voitaisiin seurata, kehitettiin herkkä suodatinsi-tomistesti, joka mahdollistaa 35S-leimatun viruksen sitomisen reseptoreihin, jotka oli immobilisoitu nitroselluloosapaperil-le.

Testissä tarvittavat virukset viljeltiin ja puhdistettiin sinänsä tunnetuilla tavoilla (13).

Keksinnön mukaiset reseptorit puhdistettiin kromatograa fisten menetelmien avulla.

Koska on tunnettua, että useimmat membraaniproteiinit ovat glykolysoituneita, reseptori puhdistettiin Lens culinaris lektiini-pylväässä. Tämä lektiini on spesifinen a-D-glukoosi-ja a-D-mannoosykysiköille (16). Sitoutunut aines eluoitiin IM a—D-metyyliglykosidilla fosfaattipuskuroidussa NaCl-liuokses-sa, joka sisälsi 1 % oktyyliglukosidia.

Eluaattierät levitettiin nitroselluloosalle kaksinkertaisina ja inkuboitiin sekä natiivin että kuumennetun viruksen kanssa. Jakeiden autoradiograafi osoitti voimakasta sitoutumista natii-viin virukseen eluoidussa aineksessa verrattuna läpivirrannei-siin jakeisiin. Kuumennetulla viruksella esiintyi heikkoa sitoutumista läpivirranneeseen materiaaliin. Tämä merkitsee epäspesifisiä vuorovaikutuksia, joita aiheutti hydrofobisten proteiinien suuri määrä; kuumennetulla nuhaviruksella esiintyy kasvanutta hydrofobisuutta (9). Koska oli todettu, että puhdistettu virus 4°C:ssa pidempään säilytettynä muuntuu vähitellen partikkeleiksi, joilla on sama antigeenisyys kuin kuumennetulla 5 98704 viruksella (C-determinantit), nämä kontaminantit erotettiin välittömästi ennen sitomistestin suorittamista immunosaostama-malla C-determinanteille spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla. Tämä monoklonaalinen vasta-aine saadaan sinänsä tunnetulla tavalla immunisoimalla hiiret tai kaniinit C-determinanteilla ja sen jälkeen kloonaamalla Köhler'in ja Milstein'in menetelmällä (18).

L. culinaris lektiini-pylvään lisäksi käytettiin konkavalii-ni A-, risiini- ja hepariini-sefaroosi-pylväitä reseptorin puhdistamiseen. Läpivirtaama ja eluoitu aines testattiin samalla tavoin kuin edellä. Con.A-Sepharose-pylväät eluoitiin 1 M α-D-metyylimannosidilla, jolloin sitomisaktiivisuudesta voitiin saada takaisin lähes 20 %; risiini-pylvään eluointi 1 M galaktoosilla johti lähes 100-prosenttisesti talteen saatavissa olevaan sitomisaktiivisuuteen. Päinvastoin kuin Coxsackie B-virus-ryhmällä (7) hepariini-sefaroosi ei pidättänyt sitomisaktiivisuutta.

L. culinaris-pyivään eluaatti erotettiin Superose-pylväässä FPLC:n (Pharmacia) avulla (geelipermeaatiokromatografia). Markkeriproteiineihin vertaamalla voitiin aktiivisen reseptorin molekyylipainoksi määrittää 450 kD. Samanaikaisesti voitiin erottaa suuri osa kontaminoivista proteiineista (kuvio 1).

Nuhavirusreseptoreiden pienen ryhmän reseptori liikkuu polyakryyliamidissa SDS:n läsnäollessa 120 kD näennäisellä molekyylipainolla. Joissakin tapauksisa voidaan myös havaita juuri ja juuri nähtävissä oleva vyöhyke, jolla on hieman alhaisempi molekyylipaino ja joka mahdollisesti on resepto-riproteiinin päämäärän modifikaatio (kuvio 5, kaista 1). Reseptorin kummankin muodon molekyylipainot ovat huomattavasti korkeampia kuin mitä on saatu nuhavirus-reseptoreiden suurelle ryhmälle (90 kD).

Koska kummankin ryhmän reseptoriproteiineilla on natiivissa 6 98704 muodossaan noin 450 kD molekyylipaino, ei ole epätodennäköistä, että niiden alayksiköistä muodostuva rakenne on samankaltainen. Tosiasiallinen molekyylipaino voi kuitenkin poiketa geelipermeaatiokromatografiällä määritetystä johtuen proteiinien retentiotilavuuksien vähäisestä erosta tässä suuren molekyvlipainon alueessa. Picorna-virusten rakenteessa esiintyy syvä vako (kanjoni), joka kulkee viisinkeinaisen ikosaedri-symmetria-akselin ympäri ja joka mahdollisesti sisältää reseptorin sitoutumiskohdan (19). Oletettavasti kysymys on nuhavirus-reseptoreiden suuren ryhmän reseptorista ja Coxsackie B-virusryhmän reseptorista, joka sitoo virukset viisinkertaisen akselin kautta (20). Kysymys, onko pienen ryhmän reseptori pentameeri, jää vastaamatta, koska sen alayksiköiden molekyylipaino on erittäin korkea verrattuna suuren ryhmän reseptoriin.

Sokerigradientti-sentrifugoinnin avulla oli mahdollista määrittää reseptorin sedimentaatiovakio. Tätä varten laitettiin culinaris-puhdistettua reseptoria sokerigra-dientin päälle ja sentrifugoitiin. Suurin aktiivisuus havaittiin gradientin kohdassa, joka vastaa 28,4 S sedimen-taatiovakiota (kuvio 2).

Esikokeissa oli todettu, että reseptoria ei enää voitu eluoida anioninvaihtokromatografia-pylväästä. Koska reseptori ei ole herkkä neuraminidaasille, glykoproteiinista poistettiin sialiinihappo pylväsmateriaalin kanssa tapahtuvan ionien vuorovaikutuksen pienentämiseksi. Tämän jälkeen näyte vietiin mono Q-pylvääseen (Pharmacia) ja reseptori eluoitiin NaCl-gradientilla. Sitomisaktiivisuus voitiin osoittaa leveänä piikkinä kohdalla noin 250 mM NaCl (kuvio 3) .

Keksinnön mukainen reseptori voidaan puhdistaa myös erilaisilla kromatografiamateriaaleilla suoritettujen kromatograa-fisten puhdistusvaiheiden yhdistelmän avulla.

7 98704

Kemialliset ominaisuudet ja keksinnön mukaisen reseptorin rakenteelliset edellytykset virusten sitomiselle selvitettiin entsyymien ja kemiallisten reagenssien avulla (taulukko 1) .

Trypsiinikäsittely tuhoaa sitomisaktiivisuuden täydellisesti. Tämä sopii yhteen jo tunnettujen tulosten kanssa, jotka on saatu solun pintojen entsymaattisesta käsittelystä (14), ja viittaa reseptorin proteiiniluonteeseen.

Liuennetun reseptorin käsittely neuramidinaasilla nosti toistuvasti hieman sitomisaktiivisuutta. Tämä käsittely parantaa mahdollisesti reseptorimolekyylin sen alueen luoksepäästävyyttä, joka on viruksen vuorovaikutuksen kohteena. Tästä käy ilmi, että sialiinihappo ei ole välttämätön viruksen sitomiselle.

Ditiotreitoli (DTT) tuhoaa sitomisaktiivisuuden, mistä voidaan päätellä, että disulfidisillat osallistuvat proteiinin oikean poimutuksen säilyttämiseen. Geelipermeaatiokromato-grafian ja gradienttisentrifugoinnin avulla saatu, yllättävän korkea molekyylipaino viittaa reseptorimolekyylin oligomeeriseen rakenteeseen. Herkkyydestä ditiotreitolille voitiin päätellä, että hypoteettisten alayksiköiden liittyminen edellyttää molekyylin välisiä disulfidisiltoja.

Käsittely jodiasetamidilla alentaa sitomisaktiivisuutta vain vähän ja viittaa siihen, että vapaat sulfhydryyliryh-mät eivät ole välttämättömiä tehokkaalle sitomiselle.

: Mitään sitomista ei voitu todeta etyleenidiaminotetra- etikkahapon (EDTA) läsnäollessa inkuboitaessa nitrosellu-loosasuodatinta ^S-leimatun viruksen kanssa. Tämä sopii yhteen aikaisempien tutkimusten kanssa, jotka osoittivat kahdenarvoisten kationien läsnäolon välttämättömyyden nuhavirusten ja solun pintojen väliselle vuorovaikutukselle (12) .

8 98704

Ihmisen nuhavirusten jakamiseen kahteen .käsittelyluokkaan on käytetty serotyyppiparien välisiä kilpailevia sitoutumis-menetelmiä (10,1). Esillä olevassa keksinnössä käytettiin sen vuoksi keksinnön mukaisten reseptoreiden spesifisyyden selvittämiseksi kilpailukokeissa viruksia HRV2 ja KRV49 pienen reseptoriryhmän edustajina ja virusta HRV89 suuren reseptoriryhmän edustajana. Nitroselluloosasuodattimia, joissa oli immobilisoituja reseptoreita, inkuboitiin, kun mukana oli noin 20-kertainen ylimäärä joko HRV2- tai HRV89-virusta yhdessä leimatun HRV2:n kanssa. Kuten taulukko II osoittaa, sitoutuminen aleni voimakkaasti leimaamattoman HRV2:n läsnäollessa, mutta HRV89 ei siihen vaikuttanut.

Näiden tulosten varmistamiseksi toistettiin nämä kokeet leimatulla HRV49:lla käyttämällä kilpailijoina HRV2- ja HRV89-viruksia. Jälleen on ilmeistä, että HRV2 pienentää sitomista voimakkaasti ja että HRV89:lla ei sen sijaan ole mitään vaikutusta.

Vaikka HRV2 ja HRV89 sitoutuvat eri reseptoreihin, niiden kapsidiproteiinit ovat yllättävässä määrin samankaltaisia (5). HRV2:n ja HRV14:n välillä suoritettiin äskettäin yksityiskohtainen rakenteiden vertailu HRV14:n röntgen-rakenneanalyysin perusteella (2). Kummatkin virukset, HRV14 ja HRV89, sitoutuvat suuren RVRG-ryhmän reseptoriin.

Sen vuoksi voidaan olettaa, että hypoteettisesta resepto-: rin sitomiskohdasta löydetään ryhmä konservoituneita amino happoja. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole ollut mahdollista löytää kanjoni-alueen sisällä konservoituneiden aminohappojen yksinkertaista ryhmää.

Esillä olevan keksinnön avulla on ensimmäisen kerran mahdollista valmistaa pienen RVRG-ryhmän reseptoreita oleellisesti puhtaassa muodossa.

Keksinnön mukaisten reseptoreiden avulla on ensimmäisen kerran mahdollista tutkia kohdistetusti viruksen ja reseptorin vuorovaikutuksia. Tällöin on erityisen merkityksel- 9 98704 lista niiden reseptoreiden alueen, jotka viime kädessä vastaavat viruksen vaikutuksesta, sijoittuminen. Tuntemalla nämä alueet voi olla mahdollista valmistaa aineita, jotka ovat suuntautuneet spesifisesti näitä alueita vastaan, jolloin näin mahdollisesti voidaan salvata lukuisten erilaisten nuhavirusten reseptorit.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat reseptorit, jotka voidaan valmistaa kuvatulla menetelmällä ja jotka sitovat pienen RVRG-ryhmän edustajia.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat myös reseptorit, jotka voidaan valmistaa ammattimiehen tuntemilla menetelmillä luonnonmukaisista reseptoreista. Tässä yhteydessä mainittakoon esimerkkimäisesti pelkistimillä käsittelemällä saatavissa olevat luonnonmukaisen reseptorin alayksiköt, jotka voidaan puhdistaa esimerkiksi elektroforeettisilla menetelmillä. Näitä alayksiköitä voidaan käyttää esimerkiksi polyklonaalisten ja/tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen, joita vasta-aineita voidaan käyttää prepa-ratiivisesti, diagnostisesti ja/tai terapeuttisesti samalla tavoin kuin vastaavia, luonnonmukaisten reseptoreiden vastaisia vasta-aineita. Myös reseptoreiden alayksiköitä voidaan käyttää samalla tavoin kuin luonnonmukaisia reseptoreita .

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat myös luonnonmukaisten reseptoreiden ja/tai niiden alayksiköiden modifikaatiot, jotka voidaan saada kohdistetun entsymaattisen käsittelyn avulla. Esillä olevassa keksinnössä on jo osoitettu, että käsittely trypsiinillä tuhosi keksinnön mukaisten reseptoreiden sitomisaktiivisuuden, kun taas neuramidinaasi-käsittely hieman nosti aktiivisuutta. Sen vuoksi on ajateltavissa ja ammattimiehen osoitettavissa ei-keksinnöllisellä tavalla, että määrätyillä entsyymeillä ja/tai kemiallisilla reagensseilla päästään reseptoreihin, jotka joko ovat vaikutukseltaan parempia ja/tai paremmin applikoitavissa 10 98704 ja käytettävissä ja/tai joilla on parempi stabiilisuus kuin luonnonmukaisilla reseptoreilla. Nämä modifikaatiot voivat, esimerkiksi johtaa siihen, että luonnonmukaisten reseptoreiden kaikista tai yksittäisistä alayksiköistä erotetaan tai katkaistaan irti proteiiniketjuja ja. tai että.proteiiniketjut pilkotaan.

Näiden modifikaatioiden lisäksi on edelleen mahdollista muuntaa luonnonmukaiset reseptorit esimerkiksi ohjatun pelkistämisen kautta joko täydellisesti tai osittain alayksiköiksi. Nämä enemmäp tai vähemmän suuret alayksiköt voidaan myös liittää esimerkiksi kohdistetun hapettamisen avulla enemmän tai vähemmän suuriksi yksiköiksi, jotka on sijoitettu uudelleen luonnonmukaisiin reseptoreihin verrattuna.

Disulfidisiltojen lohkaisemiseen sopivia pelkistimiä ovat esimerkiksi tioliyhdisteet, kuten tiofenoli, 4-nitrotio-fenoli, 1,-4-butaaniditioli ja erityisesti 1,4-ditiotreitoli. Pelkistäminen suoritetaan edullisesti vesi-alkalipitoi-sessa mediumissa, esimerkiksi alkalimetallihydroksidin, esimerkiksi natriumhydroksidin, alkalimetallikarbonaatin, esimerkiksi natriumkarbonaatin tai orgaanisen emäksen, erityisesti trialempialkyyliamiinin, esimerkiksi trietyyli-amiinin laimeassa vesiliuoksessa huoneen lämpötilassa.

Hapettimia, jotka sopivat disulfidisidosten uudelleen-liittämiseen pelkistetyissä polypeptideissä, ovat esimerkiksi ilman happi, jota johdetaan polypeptidin vesiliuoksen läpi, johon mahdollisesti on lisätty katalyyttinen määrä siirtymäryhmän metallisuolaa, esimerkiksi rauta-(III)-sulfaattia, rauta-(III)-kloridia tai kupari-(II)-sulfaattia; jodi, myös kaliumjodi-adduktina KJ^, jota käytetään mieluummin alkoholipitoisessa, esimerkiksi metanolipitoi-sessa, tai vesi-alkoholipitoisessa, esimerkiksi vesi-metanolipitoisessa liuoksessa? kaliumheksasyanoferraatti- (III) vesiliuoksessa; 1,2-dijodietaani tai atsodikarbonk-syylihappodimetyyliesteri tai -dietyyliesteri, jotka saate 98704 11 taan reagoimaan vedessä tai vedestä ja veden kanssa sekoittuvasta alkoholista, esimerkiksi metanolista muodostuvassa seoksessa. Hapettaminen suoritetaan erityisesti huoneen lämpötilassa.

Reagenssien, erityisesti suolojen ja hapetus- tai pelkistys-aineiden ja niiden jälkituotteiden erottaminen halutusta yhdisteestä tapahtuu sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi molekyylipainosuodattamalla, esimerkiksi sefadeksilla tai piogeelillä.

Kaikkia modifikaatioita voidaan käyttää vastaavaan tapaan kuin luonnonmukaisia keksinnön reseptoreita. Näin saatavat tuotteet, kuten esimerkiksi vasta-aineet, kuten myös modifi-. kaatiot, sisältyvät esillä olevan keksinnön piiriin.

Keksinnön mukainen reseptori on liukoinen, joten sitä voidaan helposti käsitellä ja käyttää.

Reseptorit on myös mahdollista sitoa kiinteään kantajaan ja käyttää tässä muodossa diagnostisiin ja preparatiivi-siin tarkoituksiin. Kantajina tulevat kysymykseen kaikki tavanomaiset kiinteät kantajat, kuten polystyreeni, lasi, dekstraani ja myös biologiset membraanit ja lipidi-vesik-kelit.

Reseptoreihin on edelleen mahdollista sitoa tavanomaisia markkereita ja käyttää tässä muodossa diagnostisesti.

Lisäksi on mahdollista käyttää reseptoreita virusinfektioiden terapeuttiseen hoitoon. Mikäli keksinnön mukaiset reseptorit sidotaan kantajaan, voidaan niitä käytää sekä diagnos- . tisesti että preparatiivisesti virusproteiinien sitomiseen, esimerkiksi nk. affiniteettikromatografiän avulla. Diagnostisesti voidaan virusproteiini merkitä tavalliseen tapaan kantajaan sidotulla reseptorilla, esimerkiksi vasta-aineiden tai leimattujen vasta-aineiden avulla. Leimauksena tulee kysymykseen esimerkiksi radioaktiivinen leimaus, entsyymi tai fluoresoiva ryhmä.

12 98704

Keksinnön mukaisten reseptoreiden terapeuttisessa käytössä voidaan näitä injisoida vastaavasti erittäin puhdistetussa muodossa, jolloin nämä inhiboivat kilpailukykyisesti luonnonmukaiseen reseptoriin verrattuna. Tähän tarkoitukseen käytetään mieluummin liukoisia reseptoreita. Tällaisia liuoksia voidaan käyttää myös diagnostiikkaan ja erotusdiagnostiikkaan.

Erittäin tärkeä on keksinnön mukaisten reseptoreiden käyttö polyklonaalisten ja/tai monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseen, jotka vaikuttavat spesifisesti solumembraaneissa olevia reseptoreita vastaan. Tällaisia vasta-aineita voidaan ensiksikin jälleenkäyttää diagnostisesti soluilla tai solubio-logisella materiaalilla olevien reseptoreiden kuvaamiseen ja määrittämiseen. Ne avaavat näin täysin uusia menetelmiä ja mahdollisuuksia.

Kuvioiden selitykset

Kuvio 0 Reseptoreiden liuentaminen erilaisilla detergenteil-lä (A: luon. virus, B: denat. virus).

Kuvio 1 Liuenneen reseptorin geelipermeaatiokromatografia Superose 6 HR 10/30-pylväässä. 108 solua vastaavat membraanit liuennettiin OG-liuokseen (15 mM natrium-fosfaatti pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM MgC12/ 1 mM CaC12 (PBS), jossa 1 % oktyyliglukosidia), laitettiin 1 ml:n Lu_ culinaris-pylvääseen ja adsorboitunut aines eluoitiin 1 M a-D-metyyliglukosidilla OG-liuoksessa. Eluaatti väkevöitiin Centricon-putkessa 0,5 ml:aan ja vietiin Superosepylvääseen. Pylväs purettiin 0,2 ml/min. OG-liuoksella ja kerättiin 0,5 ml:n jakeet. Kuviossa on annettu yksittäisten jakeiden sitomisak-tiivisuudet, markkeriproteiinit paikat (määritettiin 13 98704 erillisessä kokeessa) ja ekstinktio aallonpituudella 280 nm.

Kuvio 2 Liuennetun reseptorin sokerigradienttisentrifugointi.

L. culinaris-pylväästä eluoitu aines väkevöitiin (kts. kuvion 1 selitykset) ja erotettiin 10-40-prosenttisella sokerigradientilla OG-liuoksessa. Kuviossa on annettu jakeiden (0,4 ml) sitomisaktii-visuudet, katalaasi (kat) ja aldolaasi (Ald)-markkeriproteiinien paikat sekä ekstinktio aallonpituudella 280 nm.

Kuvio 3 Mono Q-anionien vaihtokromatografia. Geelipermeaa-tiokromatografiän (kuvio 1) jakeet 14 - 16 käsiteltiin neuraminidaasilla ja materiaali erotettiin mono Q-kolonnissa FPLC:lla. Kuviossa on annettu yksittäisten jakeiden (0,5 ml) sitomisaktiivisuudet, ekstinktio aallonpituudella 280 nm ja gradientin kulku.

Kuvio 4 Reseptorin osoittaminen Western Blots-menetelmällä.

Mono P anionivaihtopylvään virusten sitomisaktiivi- suus vietiin Superose 6 HR 10/30-pylvääseen. 1,2 ml jakeet kerättiin. Proteiineja seurattiin absorp- : tion &280 avu-'-^a· Kuviossa on myös annettu proteiini- markkereiden (tyroglobuliini, 670k; apoferritiini 440 k; 0-amylaasi, 200k) paikat (a). Superose- pylvään jakeiden proteiinit väkevöitiin ja vietiin kolmelle 6-prosenttiselle SDS-plyakryyliamidigeelille.

Yksi geeli värjättiin Coomassie Balu-värillä (b)

Ja toisen ja kolmannen geelin proteiinit siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (c, d). Siirrettä 35 inkuboitiin S-leimatun HRV2:n kanssa ilman lei-mamattoman HRV2:n läsnäoloa (c) tai sen ylimäärän kanssa (d); markkeriproteiinien (2-makroglobuliini, 180k; β-galaktosidaasi, 116k; fruktoosi-6-fosfaatti- 14 98704 kinaasi, 84k) ja reseptorivyöhykkcet on merkitty nuolilla.

Kuvio 5 Western Blot-menetelmän autoradiografia, joka oli saatu virusten sitomisaktiivisuutta omaavista yhdistetyistä Superose-pylvään jakeista (kts. kuvio 4). Siirteitä inkuboitiin "^S-leimatun HRV2:n .-:anssa. Näytteitä inkuboitiin ennen geelille laittamista SDS:n huoneen lämpötilassa, rata 1; näytettä keitettiin SDS:ssa, rata 2, näytettä inkuboitiin 10 mM ditiotreitolin kanssa, rata 3; radan 1 kanssa identtistä siirrettä inkuboitiin ^S-leimatun HRV2:n kanssa 10 mM EDTA:n läsnäollessa, rata 4, tai inkuboitiin ^S-leimatun HRV2:n kanssa, jota oli kuumennettu 10 minuuttia 56°C:ssa, rata 5.

Materiaalit l-O-n-oktyyli-3-D-glukopyranosidi, Tween 40 ja 3-(3-kolamido- propyyli)-dimetyyliammonio-l-propaanisulfonaatti (Sigma'lta, N-tetradekyyli-N,N-dimetyyli-ammonio-3-propaanisulfonaatti (Zwittergent 3-14) Serva'lta. Muut detergentit Merck'Itä, 3 5 trypsiini Miles'lta, S-metioniini (1350 Ci/mmol)

Amersham'lta.

Esimerkki 1:

Virusten valmistaminen

Viruksia HRV2, HRV49 ja HRV89 viljeltiin oleellisesti kuvatulla tavalla HeLa-solu-suspensiossa ja puhdistettiin (13). Tässä on esimerkkinä annettu HRV2:n viljely, eristäminen ja .puhdistaminen.

HeLa-soluja (kanta HeLa-Ohio, 03-147, Flow Laboratories, Englanti) kasvatettiin suspensiossa 37°C:ssa. Supensio-medium (Thomas, D.C., Conant, R.M. ja Hamparian, V.U., 1970, 15 98704

Proc. Soc . Exp. Biol. Med. 133, 62 - 65; Stott, E.J. ja Heath, G.F., 1970 J. gen. Virol, 6, 15 - 24) muodostui suspensioon tarkoitetusta MEM'in Joklik-muunnelmasta (Gibco 072-1300) ja 7 %:sta hevosseerumia (Seromed 0135). Siirros- 4 tustiheys oli 5 - 10 x 10 solua/ml ja tilavuus 50C ml. Suspensiota, jonka solutiheys oli 1 x 10^ solua/ml, sentri-fugoitiin 10 minuuttia steriileissä olosuhteissa 3CC g voimalla. Supernatantti erotettiin imun avulla ja solut suspendoitiin uudelleen 100 ml:aan infektointimediumia (suspensioviljelmälle tarkoitettu MEM'in Joklik-modifikaatio, jossa 2 % hevosseerumia ja 2 mM magnesiumkloridia). solut jaettiin infektointimediumiin homogeenisesti imemällä useita kertoja varovasti 20 ml pipettiin. Tämän jälkeen täytettiin 500 ml:ksi. Seuraavaksi solususpensio lämmitettiin 34°C:een ja infektoitiin HRV2:lla (puhdistettu kahdesti plakin kautta) 0,1 virusta/solu kerrannaisella. HRV2-kanta saatiin American Type Culture-kokoelmasta (ATCC VR-482 ja VR-1112). Käytetyt kannat neutraloitiin HRV2:n vastaisella antiseerumilla (American Type Culture Collection, katalogi n:o ATCC VR-1112 AS/GP). Kontrolliseerumina oli HRV7:n vastainen antiseerumi (katalogi n:o ATCC VR - 1117 AS/GP), joka ei osoittanut mitään neutraloimista. 60 tunnin jälkeen 34°C:ssa poistettiin virus. Virus saatiin sekä soluista tai solufragmenteista tai mediumista.

Tätä tarkoitusta varten erotettiin medium infektoiduista soluista ja solufragmenteista sentrifugoimalla 10 minuuttia 1500 g voimalla, minkä jälkeen erotettiin imulla. Sakka pakastettiin -70°C:ssa.

12 litran suspensioviljelmän solusakat yhdistettiin, suspendoitiin uudelleen 40 ml saan TM-puskuria (20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2), laitettiin 15 minuutiksi jäille ja sen jälkeen solut rikottiin Dounce-homogenisaattorissa ja seosta sentrifugoitiin 30 minuuttia 6000 g voimalla.

Tämän jälkeen sakka pestiin vielä kerran 10 ml:11a TM-puskuria. Molemmat supernatantit yhdistettiin ja sentrifugoi- 16 98704 tiin 3 tuntia 110 000 g voimalla viruksen pelletoimiseksi.

Tämän jälkeen viruspelletti otettiin 1C ml:aan KTMP-puskuria (50 mM KC1, 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mH MgC^, 2 mM merkaptoetanoli. 1 mM puromysiini, 0,5 mM GTP) lisättiin 150 fxg DNase I-entsyymiä (Sigma, ribonukleaasiton) ja sen jälkeen inkuboitiin 1 tunti.

Virus saostettiin infektointimediumista samalla sekoittaen 4°C:ssa polyetyleeniglykoli 6000:11a (PEG 6000; Merck) 7 % konsentraatiossa ja 450 mM NaCl-konsentraatiossa.

(Korant, B.D., Lonberg-Holm, K., Noble, J. ja Stasny, J.T., 1972, Virology £8, 71 - 86). Pidettiin 4 tuntia kylmässä, minkä jälkeen virus erotettiin sentrifugoimalla 30 minuuttia 1500 g voimalla, sakka suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan KTMP-puskuria, joka sisälsi 75 ug DNase I-entsyymiä, seosta inkuboitiin 1 tunti jäillä ja sen jälkeen pakastettiin -70°C:ssa.

Soluista ja mediumista saadut virussuspensiot yhdistettiin, inkuboitiin 5 minuuttia 37°C:ssa, jäähdytettiin lisäämällä 60 ml kylmää TE-puskuria (10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) ja tämän jälkeen ultraäänikäsiteltiin 5 minuuttia jäähauteessa.

Tämän jälkeen sentrifugoitiin 30 minuuttia 6000 g voimalla. Supernatanttiin lisättiin 920 ml TE-puskuria, joka sisälsi 7 % PEG 6000:a ja 450 mM natriumkloridia, sekoitettiin 4 tuntia varovasti 4°C:ssa ja muodostunut sakka pelletoitiin sentrifugoimalla 30 minuuttia 6000 g voimalla. Sakka otettiin taas 100 ml:aan TM-puskuria, virus saostettiin edellä kuvatulla tavalla lisäämällä PEG 6000:a ja natriumklaridia. ja pelletoitiin. Sakka suspendoitiin uudelleen 40 ml:aan TM-puskuria, suspensiota sentrifugoitiin 30 minuuttia 6000 g voimalla ja virus pelletoitiin 3 tunnin aikana 110 000 g voimalla. Sakka liuotettiin 1 ml:aan TM-puskuria, lisättiin 50 ug DNase I-entsyymiä, minkä jälkeen inkuboitiin 1 tunti 4°C:ssa 17 98704 ja tämän jälkeen lisättiin 1 ml TE-puskuria. Jatkopuhdistusta varten sentrifugoitiin virussuspensiota sakkaroosigradien-teilla (10 - 30 p-% TE-puskurissa) 4 tuntia 4°C:ssa 110 000 g voimalla. Viruksia sisältävät jakeet saatiin aallonpituuden 260 nm ekstinktion perusteella ja laimennettiin TM-puskurilla niin, että sakkaroosin loppukonsentraa-tioksi saatiin 10 %. Tämän jälkeen sentrifugoitiin 8 tuntia 85 000 g voimalla. Viruspelletti otettiin 1 ml:aan TM-puskuria ja säilytettiin -70°C:ssa. Viruspreparaatin puhtauden tutkimista varten suoritettiin geelielektroforeesi 12,5-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä 0,1 % natnum-dodekyylisulfaatin läsnäollessa (Laemmli, U.K., 1970 Nature (Lontoo) 277, 680-685) ja proteiinivyöhykkeet värjättiin Coomassie-Brillant-Blau-värillä.

Esimerkki 2: ^5S-metioniinilla leimatun ihmisen nuhaviruksen, sero-tyuyppi 2 (HRV2) valmistaminen 2 2 HeLa-solujen monokerrosta 165 cm petrimaljoilla infek-toitiin tunnin ajan 34°C:ssa HRV2:lla (MOI-arvo, Multiplicity fo Infection, oli 40) metioniinia sisältämättömässä MEM-alustassa (Gibco), joka sisälsi 2 % dialysoitua vasikansikiöseerumia (Flow). Solut pestiin kaksi kertaa PBS:lla ja inkubointia jatkettiin 34°C:ssa uudessa mediumissa.

3 tunnin kuluttua lisättiin kumpaankin monokerrokseen 1 mCi ^S-metioniinia (1350 Ci/mmol, Amersham) ja inkuboi-tiin edelleen yhteensä 24 tuntia. Medium erotettiin infektoiduista soluista ja solufragmenteista sentrifugoimalla 10 minuuttia 1500 g voimalla ja erotettiin imun avulla.

Sakka pakastettiin -70°C:ssa 5 ml:ssa (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7,5 (Tris/EDTA)-puskuria ja sulatettiin uudelleen. Supernatantti ja pakastettu/sulatettu sakka yhdistettiin ja sentrifugoitiin 30 minuuttia 45000 x g voimalla. Tämän sentrifugoinnin supernatanttia sentrifugoitiin 2 tuntia 140000 x g voimalla. Viruspelletti suspendoi- 18 98704 tiin uudelleen 300 jul:aan Tris/EDTA-puskuria ja virukset puhdistettiin edellä kuvatulla tavalla 10-30-prosenttiselia sakkaroosigradientilla. Gradientin yksittäiset jakeet analysoitiin SDS-geelielektroforeesin avulla 12-prosentti-sissa polyakryyliamidigeeleissä. Puhtaat virusjakeet yhdistettiin ja näitä säilytettiin enintään 4 viikkoa 4°C:ssa 1 % BSA:n (naudanseerumialbumiini) läsnäollessa.

Kapsidi-rakenteeltaan muuttuneet virukset poistettiin esimerkin 1 ja esimerkin 2 preparaateista inkuboimalla puhdistettuja viruksia 30 minuuttia 20 ul:ssa immunoadsor-benttia, joka sisälsi C-determinanttien vastaista mono-klonaalista vasta-ainetta, esimerkiksi mAK 2G2:a, ja pelletoimalla ennen virusnäytteiden poistamista.

Immunoadsorbentin valmistaminen

Staphylococcus aureus (BRL)-soluja suspendoitiin veteen 10-painoprosenttiseksi suspensioksi. Solut pestiin kaksi kertaa PBS:lla ja lisättiin 1/5 Voi. kaniinin anti-hiiri IgG-seerumia (Behring); suspensiota inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Solut pestiin kaksi kertaa PBSilla ja inkuboitiin uudelleen tunnin ajan 1/5 Voi. hiiren askites-nesteen kanssa, joka sisälsi C-determinanttien vastaista monoklonaalista vasta-ainetta (esimerkiksi mAK 2G2). Kahden pesun jälkeen pelletoitiin, pelletti suspendoitiin uudelleen PBS-liuokseen (10 paino-%) ja lisättiin radioaktiivisten virusten preparaatteihin.

Esimerkki 3:

Reseptoreiden liuentaminen HeLa-soluista

HeLa-soluja (kanta HeLa-Ohio, 03-147, Flow Laboratories, Englanti) kasvatettiin suspensiossa 37°C:ssa. Suspensio-medium (Thomas, D.C., Conant, R.M. ja Hamparian, V.U., 19 98704 1970, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133, 62 - 65; Stott, E.J. ja Heath, G.F., 1970, J. gen. Virol, 6, 15 - 24» muodostui suspensioon tarkoitetusta MEM:in Joklik-modifikaa-. tiosta (Gibco 072-1300) ja 7 %:sta hevosseerumia (Seromed 4 0135). Siirrostetiheys oli 5 - 10 x 10 solua/ml ja tilavuus 500 ml. Suspensiota, jonka solutiheys oli 1 x 106 solua/ml, sentrifugoitiin 10 minuuttia steriileissä olosuhteissa 300 g voimalla. Supernatantti erotettiin imulla ja solut pestiin 2 kertaa fosfaatilla puskuroidulla 9 keittosuolaliuoksella (PBS). 10 solua suspendoitiin 20 ml:aan isotonista puskuria (10 mM HEPES-KOH, pH 7,9, 140 mM KCL, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM fenyylime-tyylisulfonyylifluoridi) ja rikottiin kylmässä 50 ml:n Dounce-homogenisaattorin 200 iskulla. Solutumat erotettiin sentrifugoimalla 3 minuuttia 1000 x g voimalla. Tämän jälkeen membraanit puhdistettiin edelleen kaksifaasime-

Q

netelmän avulla (3). 2 x 10 solua/ml vastaavat membraanit otettiin PBS-puskuriin ja säilytettiin nestemäisessä g typessä. Liuentamista varten suspendoitiin 2 x 10 solu-ekvivalenttia 1 ml:aan OG-liuosta (1 % oktyyliglukosidia PBS:ssa) ja liukenematon aines erotettiin sentrifugoimalla 1 tunti 80 000 x g voimalla. Pylväskromatografiässä käytettiin supernatanttia.

Esimerkki 4:

Suodatinsitornistesti

Pylväskromatografiän testattavien jakeiden aktiivisuuden määrittämiseksi laitettiin jakeet Dot-blot-laitteen (Bio-Rad) nitroselluloosasuodattimelle (BA85, Schleicher und Schiill). Näytteiden annettiin sitoutua huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen loput kosteudesta erotettiin imulla pienessä vesipumpun tyhjössä ja epäspesifiset proteiinien sitomiskohdat kyllästettiin 2-prosenttisella naudanseerumi-albumiinilla (BSA) PBS:ssa 4°C:ssa yön aikana. Sen jälkeen 20 98704 suodattimia inkuboitiin 1 tunti 103.cpm ^3S-metioniinilla leimatun HRV2:n kanssa PBS-puskurissa, joka sisälsi 1 % Tween 40:a, 0,5 % natriumdesoksikolaattia ja 10 mM (3-(3-kolamidopropyyli)-dimetyyliammonio 1-propaani -sulfonaatti) : a. Membraanit pestiin kaksi kertaa 2 '·!> BSA:11a PBSrssa, kuivattiin ja leikattiin irti näytteet, joissa oli vastaavat pyöreät kehät; radioaktiivisuus mitattiin nestetuikelaskimessa.

Spesifisyyskontrollina kuumennettiin HRV2-virusta 10 minuuttia 56°C:ssa ennen nitroselluloosasuodattimen inkubointia (8). Tämän käsittelyn jälkeen ei voitu enää todeta mitään sitoutumista mihinkään näytteeseen (kuvio 1 B). Tästä voitiin päätellä, että natiivin HRV2:n sitoutuminen immobilisoituun materiaaliin on tosiasiallisesti johdettavissa viruksen ja reseptorin väliseen spesifiseen vuorovaikutukseen.

Esimerkki 5:

Affiniteettikromatografia Lens culinaris-lektiinipylväissä g 10 soluekvivalenttia liuennettiin kuvatulla tavalla ja vietiin culinaris-pylvääseen (1 ml), joka oli tasapainoitettu OG:lla. Pylväs pestiin 5 ml:11a G-liuosta ja sitoutunut aines eluoitiin 2 ml:11a 1 M a-D-metyyli-glukosidia OG-liuoksessa. Sitoutumistesti osoitti, että sitomisaktiivisuudesta voitiin saada takaisin .lähes.

100 %, kun sitä vastoin kokonaisproteiinista oli poistettu noin 90 %.

Esimerkki 6:

Geelipermeaatiokromatografia L. culinaris-pylvään eluaatti väkevöitiin Centricon-putkessa (poistoraja 30 kD) 0,5 ml:ksi ja erotettiin 21 98704

Superose 6 HR 10/30-pylväässä (tasapainoitettu OG-pusku-rilla) FPLC:n avulla (Pharmacia). Markkeriproteiineihin vertaamalla voitiin aktiivisen reseptorin molekyylipai-noksi määrittää 450 kD. Samanaikaisesti voitiin poistaa suurin osa kontaminoivista proteiineista (kuvio 1).

Esimerkki 7:

Sokerigradientti-sentrifugointi L. culinaris-pylvääss.ä puhdistettua reseptoria (kuten edellä) laitettiin sokerigradientin päälle (10 - 40 % OG-puskurissa) ja sentrifugoitiin 8 tuntia 4°C:ssa 38000 kierr./min. Aktiivisuuden maksimin havaittiin olevan gradientin siinä kohdassa, joka vastaa 28,4 S sedimentaatio-vakiota. Markkerriproteiinien sijainnit määritettiin muissa gradienteissa (kuvio 2). Detergenttien läsnäolosta johtuen markkerit sedimentoituivat kohdissa, joissa lasketut sedimentaatiovakiot olivat 15,0 S ja 21,9 S (ilman detergenttejä 7,3 S ja 11,3 S).

Esimerkki 8:

Anioni-ioninvaihtokromatografia

Esikokeissa oli todettu, että reseptoria ei enää voitu eluoida Mono Q HR 5/5-pylväistä (Pharmacia). Reseptori, joka oli esipuhdistettu culijnaris-pylväässä ja geeli-permeaation avulla, käsiteltiin sen vuoksi 1 yksiköllä neuraminidaasia/mg proteiinia 60 minuutin ajan 37°C:ssa voimakkaasti happamien neuramiinihapporyhmien poistamiseksi.

Näitä voitiin sen jälkeen laimentaa kaksinkertaisesti 10 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 7, jossa 1 % oktyyli-glukosidia, ja viedä Mono Q-pylvääseen. Pylväs purettiin 0 - 1 m NaCl-gradientissa samassa puskurissa. Sitomis-aktiivisuus voitiin osoittaa leveänä piikkinä noin kohdassa 250 mM NaCl (kuvio 3).

22 98704

Esimerkki 9

Reseptorin eristäminen ja puhdistaminen 9 2 x 10 HeLa-solujen plasmamembraanit liuotettiin 10 minuutin kuluessa huoneen lämpötilassa 5 ml:aan PBS-liuosta, joka sisälsi 1 % w/v l-0-n-oktyyli-3-glukopyra-nosidia ja 0,01 % w/v L-a-p-tosyyli-L-lysiinikloorimetyyli-ketonia (TLCK) ja samat määrät L-l-tosyyliamidi-2-fenyyli-etyylikloorimetvyliketonia (TPCK) ja fenyylimetyyii-sulfonyylifluoridia (PMSF) (kaikki SIGMA-yhtiöstä).

Liukenematon aines erotettiin sentrifugoimalla 30 minuuttia 30 000 kierr./min. Beckmann 65 Festwinkelrotor-laitteessa. Supernatantti laitettiin 25 ml:n L_;_ culinaris lektiini-pylvääseen, joka oli tasapainoitettu OG-puskurilla (PBS, 1 % w/v oktyyliglukosidi), ja sitoutunut aines eluoitiin 5 ml:11a OG-puskuria, joka sisälsi 1 M a-metyyliglukosidia. eluaatti kyllästettiin 50-prosenttiseksi kyllästetyn ammoniumsulfaattiliuoksen yhtä suurella tilavuudella.

Saostunut aines liuotettiin 2 ml:aan A-puskuria (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 1 % w/v oktyyli-glukosidi) ja ruiskutettiin Mono P-anioninvaihtopylvääseen, joka oli liitetty FPLC-systeemiin (Pharmacia).

Proteiinit erotettiin 0 - 100 % B-puskuri-gradientilla (kuten puskuri A, jossa kuitenkin 1,5 M NaCl). Virusten sitomisaktiivisuutta sisältävät jakeet yhdistettiin, väkevöitiin Centricon-putken avulla 0,5 ml:ksi ja erotettiin Superose 6-pylväässä, joka oli tasapainoitettu 5 mM EDTA-pitoisella OG-puskurilla. Progteiinin konsentraa-tiota seurattiin ekstinktiona aallonpituudella 280 nm (kuvio 4a).

Tämän pylvään jakeet väkevöitiin 50 jal:ksi, vietiin 0,1 % w/v SDS:aan ja erotettiin kolmella 6-prosnttisella polyakryyliamidigeelillä, jotka sisälsivät 5 mM EDTA:a 23 98704 (21). Erotetut proteiinit geelissä voitiin sen jälkeen värjätä joko Coomassie Blau-värillä (kuvio 4b) tai siirtää elektroforeettisesti nitroselluloosamembraanille (22), jota oli inkuboitu 4 x 10^ cpra ^S-leimatun HRV2:n kansas (kts. edellä). Nitroselluloosa kuivattiin ja autoradiogra-foitiin (kuvio 4c). Spesifisen sitoutumisen kontrollina inkuboitiin identtisesti valmistettua nitrselluloosareplikaa 20-kertaisen leimaamattoman HRV2-ylimäärän läsnäollessa (kuvio 4d). Superose-pylvään jakeiden 6 ja 7 todettiin sisältävän materiaalia, joka kykeni sitomaan HRV2:n, kun se oli siirretty nitroselluloosalle.

Paikan, joka vastaa noin 120 kD molekyylipainoa, lisäksi autoradiografissa esiintyi joitakin vyöhykkeitä, joiden näennäinen molekyylipaino oli yli 300 kD, verrattuna markkeriproteiineihin, jotka oli kehitetty samalla geelillä (kuvio 4c). Kontrollissa, joka sisältää ylimäärän leimaamaton-ta virusta, häviää vain tämä 120 kD vyöhyke (kuvio 4d), mikä osoittaa tämän proteiinin ja HRV2:n spesifisen vvorovaikutuksen. Polyakryyliamidigeelissä, joka sisältää identtiset näytteet ja joka oli värjätty Coomassie·Blau-värillä, esiintyi erittäin heikko vyöhyke kohdassa, joka vastaa radioaktiivista vyöhykettä Western-siirteessä.

Tämä vyöhyke on löydettävissä ainoastaan jakeiden 6 ja 7 niissä näytteissä, joissa oli virusten sitomisaktiivi- suutta (kuvio 4d).

Esimerkki 10

Sitomistestit

Aktiivisen reseptorin valmistaminen uudelleen edellyttää lieviä olosuhteita; esimerkiksi keittäminen SDS:ssa tuhoaa aktiivisuuden irreversiibelisti (vrt. kuvio 5, kaistat 1 ja 2). Jos reseptoripreparaattia inkuboitiin ennen geelille viemistä 10 mM ditiotreitolin kanssa, mitään sitoutumista ei voitu havaita (kuvio 5, kaista 3).

24 98704

Koska nuhavirusten spesifiset vuorovaikutukset reseptoreittansa kanssa edellyttävät kahdenarvoisten kationien läsnäoloa (12), EDTA:n läsnäollessa inkuboitiin viruksen kanssa sellaisen näytteen siirrettä, joka oli identtinen täplälle 1 viedyn näytteen kanssa (kuvio 5). Näissä olosuhteissa ei voitu havaita mitään sitoutumista (kuvio 5, kaista 4).

Toisena testinä suoritettiin nitroselluloosamembraanin inkubointi 56°C:een kuumennetun HRV2:n kanssa. Tämä käsittely muuttaa viruksen kapsidin rakennetta, mikä tekee mahdottomaksi virukselle sitoutua HeLa-solujen pintoihin (kuvio 23). Näissä olosuhteissa ei tapahdu mitään sitoutumista, kuten on nähtävissä kuviosta 5, kaista 5.

Taulukko I

Nuhavirusten pienen reseptoriryhmän herkkyys

Liuennetun pienen reseptoriryhmän sitomismääritys esikäsittely (Sit.-akt.-%)

Ei esikäsittelyä 100 10 fig Trypsiini 6 50 mU Neuraminidaasi 170 10 mM Ditiotreitoli 15 10 mM Jodiasetamidi 80 10 mM Natriumperjodaatti 70 10 mM EDTAa 5

Kaikki esi-inkuboinnit suoritettiin 37°C:ssa 30 minuutin ajan.

Huom.: (a) ei mitään esikäsittelyä, sen asemesta inkubointi leimatun HRV2:n kanssa suoritettiin 10 mM EDTA:n läsnäollessa.

25 98704

Taulukko II

Nuhavirusten erilaisten serotyyppien kilpailu pienen ryhmän reseptoreista.

Radioaktiivisesti leimatun HRV2:n Sitomismääritys , .. . . . . (Sit.-akt.-%) kilpailu seuraavien kanssa: ei mitään 100 HRV2 13 HRV89 95

Radioaktiivisesti leimatun HRV49:n kilpailu seuraavien kanssa: ei mitään 100 HRV2 15 HRV89 90

Suodattimia inkuboitiin kuvatulla tavalla leimaamattoman viruksen 20-kertaisen ylimäärän kanssa.

26 98704

Kirjallisuus 1. Abraham, G., and Colonno, R.J. (1984). Many rhinovirus serotypes share the same cellular receptor. J. Virol.

51, 340 - 345.

2. Blaas, D., Kuechler, E., Vriend, G., Arnold, E. .

Griffith, J.P., Luo, M., Rossmann, M.G. (1987).

Comparison of three-dimensional structure of two human rhinoviruses (HRV2 and HRV14). Proteins (in . press).

3. Brunette, D.M., and Till, J.E. (1971). A rapid method for the isolation of L-cell surface membranes using and aqueous two-phase polymer system. J. Membr. Biol.

5, 215 - 224.

4. Colonno, R.J., Callahan, P.L., and Long, W.J.

(1986), Isolation of a monoclonal antibody that blocks attachment of the major group of human rhinoviruses. J. Virol. 5J7, 7 - 12.

5. Duechler, M., Skern, T., Sommergruber, W.,

Neubauer, Ch., Gruendler, P., Fogy, I., Blaas, D. and Kuechler, E. (1987). Evolutionary relationships within the human rhinovirus genus; comparison of serotypes 89, 2 and 14. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. ( in press).

6. Fox, J.P. (1976). Is a rhinovirus vaccine possible? American J.Epidemiol. 103, 345 - 354.

7. Krah, D.L., and Crowell, R.L. (1985). Properties of the desoxycholate-solubilized HeLa cell plasma membrane receptor for binding group B coxsackieviruses. J.

Virol. 5_3: 867 - 870.

li 27 98704 8. Lonberg-Holm, K., and Yin, F.H. (1973). Antigenic determinants of infective and inactivated hum ·,η rhinovirus type 2. J. Virol. 1_2, 114 - 123.

9. Lonberg-Holm, K., and Whiteley, N.M. (1976).

Physical and metabolic requirements for early interaction of poliovirus and human rhinovirus with HeLa cells. J. Virol. 19, 857 - 870.

10. Lonberg-Holm, K., Crowell, R.L., and Philipson, L.

(1976), Unrelated animal viruses share receptors.

Nature 259, 679 - 681.

11. Melnick, J.L. (1980). Taxonomy of Viruses. Proc.

Med. Virol. 26, 214 - 232.

12. Noble-Harvey, J., and Lonberg-Holm, K. (1974).

Sequential steps in attachment of human rhinovirus type 2 to HeLa cells. J. Gen. Virol. 2J5, 83 - 91.

13. Skern, T., Sommergruber, W., Blaas, D., Pielcr,

Ch., and Kuechler, E. (1984). The sequence of the polymerase gene of human rhinovirus type 2.

Virology 136, 125 - 132.

14. Stott, E.J., and Heath, G.F. (1970). Factors affecting the growth of rhinovirus 2 in suspension cultures of L132 cells. J. gen. Virol. 6, 15 - 24.

15. Stott, E.J., Killington, R.A. (1972) Rhinoviruses.

Ann. Rev. Microbiol. 2j6, 503 - 525.

16. Young, N.M., Leon, M.A., Takahashi, T., Howard, T.K., and Sage, H.J. (1971). Studies on a phytohemagglutinin from the lentil. III. Reaction of Lens culinaris hemagglutinin with polysaccharides, glycoproteins, and lymphocytes. J. Biol. Chem. 271, 1596 - 1601.

28 98704 17. Tomassini, J.E. and Colonno, R.J. (1986). Isolation of a receptor protein involved in attachment of human rhinoviruses. J. Birol. 5jJ, 290 - 295.

18. Köhler, G. and Milstein, C. (1975). Continuous cultures of.fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature (London) 256, 495 -497.

19. Rossmann, M.G. , Arnold, E., Rickson, J.W.,

Frankenberger, E.A., Griffith, J.P., Hecht, H-J.,

Johnson, J.E., Kamer, G., Luo, M., Mosser, A.M.,

Ruckert, R.R., Sherry, B.A. & Vriend, G. (1985).

Structure of a common cold virus, human rhinovirus 14 (HRV14), Nature (London) 317, 145-154.

20. Mapoles, J.E., Krah, D.l. & Crowell, R.L. (1985).

Purification of a HeLa cell receptor protein for group B coxsackieviruses. Journal of Virology 55, 560-566.

21. Laemmli, U.K. (1979). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bscteriophage T4. Nature (London) 277, 680-685.

22. Burnette, W.N. (1981). Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry 112, 195-203.

23. Lomberg-Holm, K. & Yin, F.H. (1973). Antigenic determinants of infective and inactivated human rhinovirus type 2. Journal of Virology 9, 29-40.

Claims (8)

98704

1. Menetelmä valmistaa reseptoreita, joilla on sitomisaktiivi-suus pienen reseptoriryhmän nuhaviruksiin, tunnettu siitä, että a. soluista, parhaiten HeLa-soluista eristetään ja puhdistetaan membraaneja, b. membraanien reseptorit liuennetaan detergenteillä, parhaiten Triton-XIOO:11a, CHAPS :11a, Zwittergent:11a, oktyyliglukosidilla tai DOC:11a, erityisen mielellään oktyyliglykosidilla, c. liukenemattomat ainesosat poistetaan ja d. reseptorit puhdistetaan kromatograafisesti parhaiten konkana-valiini-A-, risiini-sefaroosi- tai Lens culinaris- lektiinipyl-väässä ja käsiteltiin neuramidaasilla, jonka jälkeen reseptorit kromatografoidaan anioninvaihtopylväässä, parhaiten Mono Q-pylväässä ja/tai Superose-pylväässä, jotka reseptorit ovat nuhavirukseen sitoutuva glykoproteiini, jolla on seuraavat ominaisuudet: (i) molekyylipaino on 120 kD polyakryyliamidigeelillä SDS:n läsnäollessa; (ii) sedimentointivakio määritettynä sakkaroosigradientti-sentrifugoinnilla detergentin läsnäollessa, vastaa arvoa noin 28,4S; (iii) sitoutuu Lens culinaris-lektiiniin: (iv) ei sitoudu hepariini-sefaroosiin; (v) sitoutuu irreversiibelisti anioninvaihtajaan; (vi) sen sitoutumisaktiivisuus neuramidaasin on voimakas; (vii) se muodostuu ala-yksiköistä, jotka molekyylin sisäi sesti on liitetty disulfidi-silloilla; (viii) sillä ei ole sitoutumisaktiivisuutta nuhavirukseen nähden EDTA:n läsnäollessa.

2. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 1 mukaisesti reseptorin alayksiköitä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaan valmistettu reseptori pelkistetään kohdistetusta . 98704

3. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 2 mukaisesti reseptoreita, tunnettu siitä, että vähintään kaksi patenttivaatimuksen 1 mukaan valmistettua reseptorin alayksikköä hapetetaan kohdistetusti.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaan valmistettujen resep-toreiden käyttö - nuhavirusten kvalitatiiviseen ja/tai kvantitatiiviseen osoittamiseen, jolloin reseptorit voivat olla sidottuja mieluummin kiinteään kantajaan; - nuhavirusten analyyttiseen karakterisointiin tai puhdistamiseen; - polyklonaalisten ja/tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen.

5. Polyklonaalisten ja/tai monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka neutraloivat spesifisesti jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaan valmistetut reseptorit kokonaan tai osittain tai sitoutuvat spesifisesti johonkin mainittuun reseptoriin, käyttö jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaan valmistetun reseptorin kvalitatiiviseen ja/tai kvantitatiiviseen määrittämiseen tai puhdistamiseen.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen reseptorin käyttö polyklonaalisten tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka spesifisesti sitoutuvat solumembraanissa oleviin reseptoreihin.

7. Testikitti nuhavirusten määrittämistä varten, tunnet -t u siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaan valmistettuja reseptoreita sidottuna kiinteään kantajaan, jossa virusproteiinin tai rhinoviruksen sitoutuminen voidaan havaita vasta-aineen tai merkityn vasta-aineen avulla.

8. Menetelmä valmistaa monoklonaalisia vasta-aineita, tunnettu siitä, että isäntäeläin immunisoidaan jonkin pa 98704 tenttivaatimuksen 1-3 mukaan valmistetulla reseptorilla, tämän isäntäeläimen B-lymfosyytit fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, monoklonaalista vasta-ainetta erittävät hybridisolulinjat alikloonataan ja näitä viljellään in vitro. 98704