JPH01503436A - 少数ライノウイルスレセプターグループのレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 少数ライノウィルスレセプターグループのレセプター本発明は、ヒトライノウィ ルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）の少数レセプターグループのレセプター、その精 製法及びその使用法に関するものである。

ヒトライノウィルスは、ビニルナウィルス族で大きい属を構成しており、９０以 上の血清型を含んでいる（６．１１）。これらのＲＮＡウィルスは、ヒトの呼吸 器系に影警を与え、風邪、咳、かれ声その他を引きおこし、一般的には風邪とし て知られている急性感染症の原因となっている（１５）。ライノウィルスによる 感染は、ヒトの最も一般的な病気の１つである。この病気の結末は一般的に害の 少ないものであるが、風邪はその生体を一般に衰弱させる。それから、他の病因 により引き起こされる第２次感染をおこすことがある。

多くのライノウィルスは、ヒト細胞培養物（一般的には、ｔｌｅＬａＨｅＬａ細 胞る細胞表面上の結合部位に対する競争を分類基準に用いると、２つのサブグル ープに分類することができる。このわずかなライノウィルスの代表的の最初の分 類（１０）は、広範囲の実験の結果、８８個の代表物にまで拡張されてきた（４ ．１）。

これらの実験の結果は、その多さにもかかわらず、おどろくべきことに、１つ、 又は別のグループのライノウィルスの代表物が結合できる、細胞表面上の２つの みの異なるし七ブタ−が存在することを示した。現在まで、７８個の血清型の多 数の“ライノウィルスレセプターグループ”及び８個の少数“ライノウィルスレ セプターグループ″が分類されている（ＲＶＲＧ）。他の２個の代表物は明確な 挙動を示さず、明確に分類することができなかった。

近年、かなりのライノウィルス感染の増加が過密地域で発見されている。他の感 染症の大多数は、問題とされる病原から、長期又は永久的象疫が生ずるが、ライ ノウィルスによる感染は、何度も（り返して起こる。この持続的免疫の欠除の理 由は、互いに免疫学的に相互反応をほとんどもしくは全く起こさない、ラインウ ィルス株の多様性にある（６．１１）、感染後、問題となるウィルス株に対する 抗体が検出されるが、それらは、他のラインウィルス株に対する予防とはならな い、集団中、多数の株が循環することから、ライノウィルスによる反復感染が可 能となる。

それゆえ、わずか２つのレセプターの存在は、ライノウィルス感染をうまくやっ つける可能性を示している。

一般に、レセプターは非常に特異性が高いので、適当な物質により、例えば、レ セプターをブロックすることにより、このレセプターを制御することも可能であ る。レセプターをブロックする物質を用いると、レセプター特異的ウィルスの細 胞への侵入を防ぐことができる。このように、感染を防ぐことができる同物質は 、明白なライノウィルス感染の治療にも使用できる。もし、問題としているレセ プターの特徴がわかっていれば、このような物質の生産を実質的により容易に、 かつ、ある場合にはなによりも始めに行うことができる。

本発明の１つの目的は、少数ＲＶＲＧのレセプターを車離し、かつ精製すること である。これまで入手できたライノウィルスレセプターに関する情報は、多数Ｒ ＶＲＧのレセプターに関するものであった。

多数ＲＶ　ＲＧのレセプターの精製及び特徴づけは、ＨｅＬａ細胞でマウスを免 疫化することにより得られるモノクローナル抗体を用いて行なわれた。このレセ プターをグリコジル化されており、本来の状態では、約４４０ｋＤの分子量を有 していた；ラウリル硫酸ナトリウムによる変性により９０ｋＤのサブユニットに 解離し、このことは、機能性レセプターは、ペンタマーとして存在しているとい う結論へと導＜（１７）。これまで、少数ＲＶＲＧに対するレセプターは、特徴 づけも、精製もされてきていなかった。このレセプターに関するデータは、唯こ のタンパク質構造を示し、また、これら又は同様のタンパク質も、多くの他の種 の細胞上に存在することも示した。これは、ヒトの細胞、及びまれには、サルの 細胞にのみ見られる。多数グループのレセプターと、少数ＲＶＲＧのレセプター を基本的に区別している。例えば、細胞へのウィルスの侵入を防ぐ物質でレセプ ターをブロックするというような、このレセプターへの影響は、存在する感染の 予防又は治療にさえも有効であるように思われる。

それゆえ、本発明の目的は、少数レセプターグループのライノウィルスによる感 染に対する予防を行う物質を調製するための必要条件を促供することである。

このことは、本発明において、例えばｌ１ｅＬａ細胞膜などの細胞膜からレセプ ターを単離することにより成し遂げられている。これらの細胞を、従来法により 、懸濁液中で培養し、この細胞を破壊し、核を除いて、膜を精製する。ついで膜 中に見い出されるレセプターを可溶化する。精製した１ＩｅＬａ細胞由来の活性 レセプターの可溶化を最適化するため、様々な濃度の種々の界面活性剤をテスト した。界面活性剤を選ぶ重要な因子は、もっとも高いウィルス結合活性をもつで きる限り多くの膜物質を可溶化する能力である。

−１％１−０−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドがもっとも適している ことがわかった（第０図）。

不溶性成分を除き、ついで、溶液中のレセプターを精製した。

ウィルス結合活性をモニターできるように、ニトロセルロースベーパーに固定し たレセプターへの、ｓｓ３ラベルしたウィルスの結合を可能にした、高感度フィ ルター結合テストが開発された。

テストに必要なウィルスを培養し、従来法で精製した（１３）。

本発明に従かうレセプターをクロマトグラフ法で精製した。

大部分の膜タンパク質はグリコジル化されていることが知られているので、レセ プターをレンスクリナリス（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチン・カラム で精製した。このレクチンは、α−Ｄ−グルコース及びα−Ｄ−マンノースユニ ットに対する特異性を有している（１６）。結合した物質を、１％オクチルグル コシドを含むリン酸バフファ食塩水中の】Ｍのα−Ｄ−メチルグルコシド溶液で ）容出した。

その部分標本を２つのニトロセルロースに吸着し、それぞれ本来のウィルス及び 加熱したウィルスと共にインキュベートした。

溶出物質の場合の、本来のウィルスへの強い結合を示すフラクションのオートラ ジオグラフィーを、素抜は物質由来のフラクシヨンと比較した。加熱したウィル スは、素抜は物質に弱い結合を示した。このことは、高い比率の疎水性タンパク 質による非特異的相互作用を示している；加熱したライノウィルスはより高い疎 水性を有している（９）、４℃での長期間の保存で、精製したウィルスは、加熱 したウィルスと同じ抗原性を有する粒子に徐々に変化していくことが明らかにな っているので、結合テストを行う直前に、これら汚染物を、例えばｍＡＫ　２Ｇ Ｚのような、Ｃ決定因子特異的モノクローナル抗体による免疫沈殿化により分離 した。

これらモノクローナル抗体は、Ｃ決定因子でマウス又はウサギを免疫化し、つづ いて、ケラ−（Ｋ　６　ｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の方 法に従かうクローニングによる、従来法で得た（１８）　。

Ｌ、クリナリス（ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチンカラムに加え、レセプターの精 製には、コンカナバリンＡ１リシン及びΔバリンーセファロースカラムも使用し た。上述のように、素抜は及び溶出物質をテストした。Ｃａｎ、　Ａセファロー スカラムを、ＩＭα−Ｄ−メチル−マンノシドで溶出すると、あよそ２０％の結 合活性が回収され、リシンカラムを１Ｍガラクトースで溶出すると、およそ１０ ０％の結合活性が回収された。コックスサツキーＢウィルスグループに対するレ セプターとは対照的に（７）、ヘパリン−セファロースは、結合活性を遅延しな かった。

Ｌ、クリナリｘ　（ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）カラム由来の溶出物を、ＦＰＬＣによ り、スーパーロース、カラム（ファルマシア）で分離した（ゲルー過クロマトグ ラフィー）。マーカータンパク質と比較して、活性レセプターの分子量は、４５ ０ｋＤと測定された。同時に、混入タンパク質の実質的比率を取除くことができ たく第１図）。

少数グループレセプターは、ＳＤＳの存在するポリアクリルアミドゲル中、見か けの分子量１２０ｋＤの位置まで泳動した。時々、レセプタータンパク質の修正 を示している（第５図、レーン１）。

両型のレセプターの分子量は多数グループレセプター（９０ｋＤ）よりかなり大 きい。両タンパク質とも、本来の状態では、約４５０ｋＤの分子量をもつので、 それらのサブユニット構造は同じようである。しかし、この高分子量範囲で、タ ンパク質の保持容積にわフィーで測定されたものと異なるかもしれない。ピコル ナウィルスの構造は、レセプター結合部位が含まれると考えられている、正十六 面体対称の５回回転軸のまわりに走る深い亀裂（カンヨン）を示す（１９）。ラ イノウィルス主要グループレセプター及びコンクスサッキーＢウィルスグループ に対するレセプターは（２０）、この５回回転軸のところでウィルスに結合する と提唱されている。

主要グループレセプターがペンタマーであるかどうかという問題は、そのサブユ ニットの分子量が、主要グループレセプターと比較したときかなり大きいことか ら、まだ残されたままである。

シー！　ｉｉ　ｅ度勾配により、このレセプターの沈降係数を測定することがで きる。この目的のため、Ｌ、クリナリス（ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）精製したレセプ ターをシテ―勾配に通用し、遠心した。活性ピークは、沈降係数２８．４３に対 応する勾配の位置に存在することが分かった（第２図）。

予備テストで、このレセプターは、アニオン交換クロマトグラフィーからは、全 く溶出されないことが分った。このレセプターはノイラミニダーゼには感受性が ないことから、カラム物質とのイオン性相互作用を減少させるため、シアル酸を 糟タンパク質から除いた。その後、このサンプルを、モノＱカラムに通用しくフ ァルマシア）、このレセプターをＮａＣｆ勾配で溶出した。結合活性は、約２５ ０ｍＭ　ＮａＣ１の位置にブロードなピークで検出された（第３図）、′ また、種々のクロマトグラフィー物質でのクロマトグラフ精製ステップを組合せ で、本発明のレセプタを精製できる。

ウィルス結合に対する、本発明のレセプターの化学的性質及び構造上の必要条件 を、酵素及び化学試薬を用いて測定した（第１表）。

トリプシン処理は、結合活性を全て破壊した。このことは、細胞表面の酵素処理 で得られた従来の結果（１４）と一致しており、かつ、このレセプターのタンパ ク質性を示している。

可溶性レセプターのノイラミニダーゼ処理により、再現性よく、結合活性がわず かに増加した。この処理は、ウィルスとの相互作用の標的となる：レセプター分 子上の領域への接近能を高めるのであろう。

ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、結合活性を破壊し、このことは、このタンパ ク質の正しい折りたたみを維持するのにジスルフィド結合が関係しているという 結論へ導く、ゲル濾過クロマトグラフィー及び勾配遠心により測定された、驚く べき程高い分子量は、このレセプター分子のオリゴメリンク構造を示している。

ＤＴＴに対する感受性は、分子間ジスルフィド結合が、その仮説のサブユニット の会合に必要であるという結論へと導く。

ヨードアセトアミドでの処理は、結合活性をわずかに減少させた。このことは遊 離したスルフィドリル基は、有効な結合に必要ではないことを示している。

３１Ｓラベル化ウイルスとのニトロセルロースフィルターのインキュベージラン において、エチレンジアミン四酢ａ　（ＥＤＴＡ）の存在下、結合は検出されな かった。このことは、ライノウィルスと細胞表面との相互作用に二価カチオンの 存在を必要としていることを示す、以前の研究と一致している（１２）。

一対の血清型間の競合結合検定法を、ヒトのライノウィルスの２つのレセプター クラスへの分類に使用してきた（１０．１）。

それ故、本発明において；本発明のレセプターの特異性を明らかにするため、少 数レセプターグループの代表としてＨＲＶ２及びＨＲＶ４９を用い、また、多数 レセプターグループの代表としてＨＲＶ８９を用いて、競合実験を行った。固定 化したレセプターを含むニトロセルロースフィルターを、およそ２０倍過剰のＨ ＲＶ２又はＨＲＶ８９の存在下、ラベル化したＨＲＶ２とともにインキュベージ ランした。第２表に示すように、この結合は、非ラベル化ＨＲＶ２の存在下では 、非常に抑圧されるが、ＨＲＶ８９によっては影響をうけなかった。これらの結 果をチェックするため、４９で再テストした。再び、ＨＲＶ２が大きく結合を減 少させたが、ＨＲＶ８９は影響を与えないことは、明らかであった。

ＨＲＶ２及びＨＲＶ８９が種々のレセプターに結合するにもがかわらず、それら のキャプシドタンパク質は驚くべきことに同じものである（５）、最近、ＨＲＶ １４のＸ線構造解析に基づき、ＨＲＶ２及びＨＲＶ１４の間の構造の詳細な比較 が行なわれた（２）０両ＨＲＶ１４及びＨＲＶ８９とも、多数ＲＶＲＧ（ＤＬｚ セプターに結合する。それゆえ、一群の保存されるアミノ酸が、仮説上のレセプ ター結合部位に存在するのであろうと予想することができる。しかし現在まで、 カンランｗ４域内の保存的なアミノ酸の単純なパターンは、いまだ発見されてい ない。

本発明は、はじめて、少数ＲＶＲＧに対するレセプターを作成を可能にした。

本発明のレセプターを使用して、はじめて、ウィルス／レセプター相互作用の制 御された研究が可能となった。最終的にウィルス活性をになっている、レセプタ ー上の領域を位置づけることが特に重要である。一度、これらの領域が知れれば 、これらの領域を特異的に指向する物質を作成することが可能となり、またそう することにより、種々のライノウィルスに対するレセプターをブロックすること ができる。

本発明は、先に報じられているプロセスにより調製すること可能であり、かつ、 少数ＲＶＲＧの代表物を結合できる、レセプターに関するものである。

また本発明は、当業者にはよく知られている方法により、天然のレセプターから 作ることができるレセプターに関するものである０例により、還元剤による処理 により得られ、また、例えば電気泳動法により精製することができる、天然のレ セプターのサブユニットが述べられている。これらのサブユニットは、例えば、 天然のレセプターに対する、相当する抗体に対してと同様に、分取的に、診断的 に、そして、または、治療的に用いられる、ポリクローナル、そして、またはモ ノクローナル抗体を作るのに用いられる。また、このレセプター・サブユニット は、天然のレセプターに対してと同様に角いられる。

また本発明は、天然のレセプター、そして、または、制御された酵素処理によっ て得られる、そのサブユニットの修正に関係している０本発明で示されているよ うに、トリプシンでの処理は、本発明のレセプターの結合活性を破壊するが、一 方、ノイラミニダーゼは、活性をわずかに増加させた。それゆえ、特異的な酵素 、そして、または、化学試薬が、活性を改良され、そして、または、使いやすい 、そして、または、天然のレセプターと比べて安定性のよい、レセプターを作る ことは考えやすく、当業者なら誰でもこのことを非独創的方法でチェックできる 。これらの修正は、例えば切断されたタンパク′Ｊｔ鎖の一部、そして、または 、天然のレセプターの全ての、またはいくつかのサブユニット中に切断されたタ ンパク質鎖を生ずる。

また、これらの修正に加えて、天然のレセプターを全体的に、又は部分的に、例 えば、制御された還元により、サブユニットへと転換することができる。また、 これら大又は小サブユニットは、例えば制御された酸化で結合し、天然のレセプ ターと比べて再配列した大または小ユニットを作りうる。

ジスルフィド結合を切断するのに通した還元剤には、例えば、チオフェノール、 ４−ニトロチオフェノール、１．４−ブタンジチオール及び特に、１．４−ジチ オスレイトールのようなチオール化合物が含まれる。この還元は、室温で、例え ば、水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウムのような アルカリ金属炭酸塩、又はトリエチルアミンのような有機塩基、特にトリ低級ア ルキルアミンの希薄水溶液中のような水性／アルカリ性媒体中でうまく行うこと ができる。

還元型のポリペプチド中のジスルフィド結合の再結合に通した酸化剤には、例え ば、硫酸鉄（ｍ）、塩化鉄（ＩＩ）又は硫酸銅（Ｉｆ）のような、触媒量の遷移 金属塩を加えた水性ポリペプチド溶液に通気された空気由来の酸素；例えばメタ ノール性溶液のようなアルコール性溶液、又は、水性−メタノール性溶液のよう な水性−アルコール性溶液中で用いられるのが好まじい、カリウム−ヨウ素付加 ’＄！Ｉ　Ｋ　Ｉ　ｚ形のヨウ素を含む、ヨウ素；水性溶液中のへキサシアノ鉄 ＜ｍ＞ｈカリウム；水中、又は、水及びメタノールのような水混和性アルコール からなる混合物中で反応する、１，２、ショートエタンもしくは、ジメチル又は ジエチルアゾジカルボキシレートが含まれている。酸化は、特別な場合室温で行 った。

目的とする化合物から、試薬、特に塩や、酸化還元剤やその副産物の除去は、例 えば、セファデフクス又はバイオゲルでのような分子量濾過によるような、従来 法を用いて行った。

全ての修正は、本発明の天然のレセプターと同様に用いられた。

修飾のような様式で得られる、抗体のような産物も、本発明の範囲内のものであ る。

本発明のレセプターは可溶性なので、取扱いが容易である。

しかし、このレセプターを固体キャリヤーに結合し、診断及び分取的な目的のた め、このような形でこれらを使用することもできる。また、このレセプターを、 ウィルス感染に対する治療としても使用することができる。もし、本発明のレセ プターがキャリヤーに結合しているなら、それらを、例えばいわゆるアフィニテ ィー・クロマトグラフィーによって、診断的にも、また分取的にも、ウィルスタ ンパク質を結合するのに用いることができる。診断的には、ウィルスタンパク質 は、例えば抗体又は、ラベル化した抗体によるように、キャリヤーに結合したレ セプターによる通常の方法で検出することができる。使用したラベル化には、例 えば、放射性ラベル、酵素又は螢光口がある。

本発明のレセプターを治療に用いたとき、それらは、適当に洗練された形で排出 され、その結果、天然のレセプターを競合的に阻害できる。この目的のためには 、可溶性レセプターを用いた方が好ましい。またこのような？８液は診断及び差 分診断に用いることができる。

特に重要な応用例には、細胞膜中に存在するレセプターに特異的に作用するポリ クローナル、そして、またはモノクローナル抗体の生産に、本発明のレセプター を用いることがあげられる。この種の抗体は、なによりもまず、診断的に細胞上 のレセプター又は、生物学的細胞６質の存在を明らかにし、また測定するのに用 いられる。さらに、それらは治療的に、細胞膜中のレセプターをブロックするの にも用いることができる。結果的に、それらは、総じて、新しい方法及び可能性 を切り開いた。

皿ｑ見庄 第０図　種々の界面活性剤によるレセプターの可溶化（Ａ：天然ウィルス、Ｂ： 変性ウィルス） 第１図　スーパーロース６ＨＲ１０／３０カラムを用いた、可溶化レセプターの ゲル濾過クロマトグラフィー。１０＠個の細胞に相当する膜を、ＯＧ（１５ｍＭ リン酸ナトリウム、ＰＥ７．４．１５０ｍ？ｌ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｆｆ ｔ　、１ｍＭ　ＣａＣｆｆｚ　（ＰＢＳ）に１％オク丙シルグルコシド補ったも の）に溶がして、１゛−ｌのし。

クリナリス（ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）カラムにかけ、ついでその吸着物質を、ＩＭ α−Ｄ−メチルグルコシドのＯＤ溶液で溶出した。この溶出物を、セントリコン （Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）チューブ中０．５ｍｆにまで濃縮し、スーパーロースカ ラムにかけた。このカラムを０．２４！／ｓｉｎの流速でＯＧを用いて展開し、 ０．５ｍ！！づつフラクション集めた。各ワラクシシン０結合活性、マーカータ ンパク質の位１１１Ｆ（別の実験からめた）及び２８０ｎｍでの吸光度が示され ラムから溶出した物質を濃縮しく第１同店注参照）、００９１０〜４０％のシ！ ｉｗ＃勾配で分離した。各フラクション（０，４ＩＩＩＡ＋）の結合活性、マー カータンパク質カタラーゼ（Ｃａｔ）及びアルドラーゼ（Ａｎｄ）の位置及び２ Ｂ０ｎｍでの吸光度が示されている。

第３図　モノＱアニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー の第１４から第１６フラクシツン（第１図）をノイラミニダーゼで処理し、その 物質を七ノＱを用いたＦＰＬＣで分離した。各フラクション（０，５ｍｊりの結 合活性、２Ｂ０ｎｍでの吸光度及び勾配の経路を示した。

第４図　ウェスタンプロット上でのライノウィルス少数グループレセプターの検 出。

モノＱアニオン交換カラムから得られたウィルス結合活性成分を、スーパーロー ス６ＨＲ１ｏ／３ｏカラムにかけた。１．２−ｌづつフラクションを分取した。

タンパク質を２８０ｎｓでモニターし、マーカータンパク質の位置も示した（チ ログロブリン、６７０に、アポフェリチン、４４０に；β−アミラーゼ、２００ ｋ）（ａ）、スーパーロースからのフラクションに含まれているタンパク質を濃 縮し、６％ポリアクリルアミドゲルに３回適用した。このゲルを、コマ−ジブル ー（ｂ）で染色するか、または、そのタンパク質を、ニトロセルロースペーパー に移した（ＣＳｄＬこのプロットを、過剰の未ラベルＨＲＶ２の非存在下（Ｃ） 又は存在下（ｄ）　、”Ｓラベル化ＨＲＶ２とインキュベートし、マーカータン パク質（２−マクログロブリン、１８０に；β−ガラクトシダーゼ、１１６に； フラクトース−６−ホスフェートキナーゼ、８４Ｋ）及びレセプターのバンド位 置を矢印で示した。

第５図　第４図で述べた、スーパーロースカラムから分取したウィルス結合活性 を含むフラクションから得た、ウェスタンプロットのオートラジオグラフ、この プロットを、ｓｓ３ラベル化ＨＲＶ２とインキュベートした。ゲルにロードした サンプルは、室温でＳＤＳとインキュベートしたもの、レーン１、ＳＤＳ中で煮 沸したもの、レーン２．１０ｍＭジチオスレイトールとインキュベートしたもの 、レーン３、レーン１と同じプロントを２％ＳラヘルしたＨＲＶ−３と、１０ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ存在下存在下ティンキトベートの、レーン４．５６℃１０分間加熱 した、３ＳＳラベル化ＨＲＶ２とインキュベートしたもの、レーン５である。

■−粁 １−０−ｎ−オクチル−β−グルコピラノシド、トウィーン４０及び３−（３− コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネートはシグマ 社から入手し、Ｎ−テトラテシルーＮ、Ｎ−ジメチル−アンモニオ−３−プロパ ンスルホネー）　［Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４　］はサーバ社から入手 した。他の界面活性剤はメルク社から、トリプシンはマイルス社から、３Ｓ３− メチオニン（１３５０Ｃｉ／＋ｎ＋ｏｌ　）はアマージャム社から入手した。

■−上 皇ヱ上λ企上製 ＨＲＶ２、ＨＲＶ　４９及びＨＲＶ８９は、基本的ニ）ｌｅＬａ細胞懸濁液中、 先に報告されているように培養し、精製した（１３）。

ＨＲＶ２の培養、単離及び精製法を例としてここに示す。

ＨｅＬａ細胞（Ｈｅｒａオハイオ株、英国、フローラボラトリーズ、０３−１４ ７）を、３７℃でミ濁液として培養する。懸濁培地（トーマス（ＴｂｏＩＩａｓ ）Ｄ、　Ｃ，、コンナンド（Ｃｏｎａｎｔ）Ｒ，Ｍ、及びハンパリアン（Ｈａｍ ｐａｒｉａｎ）Ｖ、　Ｌｌ、＋　１９７０年、プロシーディング−イン・ソサイ アティーオブ・エクスペリメンタル・バイオロジーアントメディシン（Ｐｒｏｃ 、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）　、１３３巻、６２〜６５頁 ；スコツト（Ｓｃｏｔｔ）　Ｅ、　Ｊ、及びヒース（Ｈｅａｔｈ）Ｇ、　Ｆ、、 １９７０年、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ピロロジー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ ｏｌ、）６巻、１５〜２４頁）は、懸濁のためのジクリク修正ＭＥＭ　（ギブコ 、０７２−１３００）及び７％ウマ血清（セロメト（Ｓｅｒｏｍｅｄ０１３５） を含んでいる。接種密度は、５〜ｌ０ＸＩＯ’細胞／−Ｅで、容積は５００ｍｌ ！で行った。この懸濁液を、１×１０−細胞／ｙｓ１．（Ｄ濃度で、無菌条件下 、３００Ｘｇ、１０分間遠心した。

この上清を吸引濾過で除き、細胞は、感染培地１００■１（２％ウマ血清及び２ ｍＭ　ｈｇｌＪ、を含む懸濁培養のためのジオクリク修正ＭＥＭ）に再懸濁した 。２０ｍ１ピペツトで数回、注意深く吸い上げることにより、細胞を感染培地中 均−に分散させた。それからこの培地を５００ｓ＃とした。この細胞懸濁液を、 ３４℃とし、細胞当り０．１の多重度でＨＲＶ２　（２度プラーク精製したもの ）を感染させた。ＨＲＶＺ株は、アメリカン・タイプ・カルチ＋−・コレクシａ ７ＣＡＴＣＣＶＲ−４８２及びＶＲ−１１１２）から入手した。用いた株を、Ｈ ＲＶ２に対する抗血清で中和した（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン、Ｃａｔ、　Ｎ。

ＡＴＣＣ−ＶＲ−１１１２ＡＳ／ＣＰ）、使用したコントロール血清は、中和能 を示さないＨＲＶ７に対する抗血清（Ｃａｔ、　ＮａＡＴＣＣＶＲ−１１１７Ａ Ｓ／ＧＰ）　である、３４℃、６０時間後、ライ　ルスを収穫した。ウィルスは 細胞及び細胞断片、さらに培地からも得ることができた。

この目的のため、培地を、１５００Ｘｇで１０分間遠心することにより感染した 細胞及び細胞断片から分離し、さらに吸引濾過を行った。沈殿は一７０℃で保存 した。

１２リツトルの５濁培養からの細胞沈殿物を合わせ、４０ｗｈ１のＴＭバフファ 　（２０ｍＭ　）リス／ＨＣ！、ＰＨ７，５，２ｍＭ　ｈｇｃｒ、　）に再懸濁 し、１５分間氷上で冷却した後、ダウンス・ホモジナイザーで破壊し、その混合 物を６０００Ｘｇで３０分間遠心した。

それから、この沈殿を、もう１度、ＴＭバフファ１０−ｌで洗浄した。２つの上 清を合わせ、１１０．０００ｘｇ、３時間の遠心を行ない、上滑ウィルスをペレ ット化した。このウィルスペレットを１０ｍｊ！ＫＴＭＰバンフｙ　（５０ｍＭ 　ＭＣＩ、　５０ｍＭ）リス／）ＩＣ！、ＰＨ７，５，５ｍＭ　ｌ’１ｇαよ、 ２−ｈメルカプトエタノール、１ｍＭピューロマイシン、０．５　ｉｅＭ　Ｇ　 Ｔ　Ｐ　）に入れ、ＤＮａｓｅ　Ｉ　（シグマ、リボヌクレアーゼフリー）、１ ５０μｇを加えて、１時間、氷上でインキュベートした。

７％濃度ポリエチレングリコール６０００　（ＰＥ０６０００、メルク）及び４ ５０ｍＭＮａＣ！とともに、４℃で攪拌することにより、感染培地からウィルス を沈殿化させた（コラント（Ｋｏｒａｎｔ）　。

Ｂ、　Ｄ、、ロンバーブ・ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−＋１ｏｌｓ）　Ｋ、、ノー プル（Ｎｏｂｌｅ）Ｊ、及びスタスニ−（Ｓｔａｓｎｙ）Ｊ、Ｔ、　１９７２年 、ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）４８巻、７１〜８６頁）、冷却４時間後、そ のウィルスを１５００Ｘｇ、３０分間の遠心で落とし、この沈殿を、７５μｇの ＤＮａｓｅＩを含むＫＴＭＰバフファ１０−ｋに再懸濁した。この混合物を氷上 で１時間インキュベートしたのち、−７０℃で凍結した。

細胞及び培地由来のウィルス懸濁液を合わせ、３７℃で５分間インキュベートし てから、６０簡ｌの冷Ｔ已バフファ　（１０１トリス／ｌｌＣｌ’　ｐＨ７，４ ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加えて冷やしてから、約５分間、水浴中で超音波処理し た。

それから、このｇ５液を６０００Ｘｇで３０分間遠心した。７％ＰＥＧ６０００ 及び４５０ｍＭＮａ（ｊを含む９２０ｍＡのＴＥバンファをその上滑に加え、こ れを、注意深く、４℃で４時間攪拌し、生成した沈殿を、６０００Ｘｇで３０分 間遠心した。再びこの沈殿を１００＋ｍ１のＴＥバフファに移し、ウィルスを、 ＰＥＧ６０００及びＮａＣｆを加えることにより、上述のように沈殿化し、つい でペレット化した。この沈殿を４０　象１２のＴＭバンファに再勉濁し、この懸 濁液を６０００Ｘｇで３０分間遠心して、さらにウィルスを１１０．０００ｘｇ 、３時間でペレット化した。この沈殿物を１　ｗｌＥのＴＭバフファに溶かし、 ５μｇのＤＮａｓｅ　１を加えた後、４℃で１時間インキュベートした後、ｌ　 ｍｆＴＥバンファを加えた。さらに精製するため、このウィルス懸濁液を、４℃ 、１１０．０００ｘｇで４時間、シ！塘勾配（１０〜３０％−／ＷＴＥバフファ 中）で遠心した。２６０ｎｓでの吸光度から、ウィルスを含むフラクシヨンを見 つけ、ＴＭバンファで希釈して、最終シ＝糟濃度を１０％となるようにした。そ れから、８５０００Ｘｇで８時間の遠心を行った。

ウィルスペレットを１ｓｐＴＭバッファ中に移し、−７０℃で保存した。このウ ィルス調製物の純度をチェックするため、０．１％ラウリル硫酸ナトリウムの存 在下、１２．５％のポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行ない（レムリ 　（Ｌａｅｍ＋５ｌｉ））、　Ｕ、　Ｋ、、１９７０年、ネイチ＋　−（Ｎａｔ ｕｒｅ）　（ロンドン）、２７７巻、６８０〜６８５Ｎ）、タンパク質バンドを コマージ・ブリリアント・ブルーで染色した。

立板製 ２枚の１６５ｃｌＩベトリ皿中の単層ＨｅＬａ！ｉｔ胞を、Ｍｏｚｇ染多重度） ４０で、２％透析済ウつ胎児血清（フロー（Ｆｌｏｗ）を含む無メチオニンＭＥ Ｍ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中、３４℃、１時間にわたって、ＨＲＶ２で感 染させた。この細胞をＰＢＳで２度洗浄し、新鮮な培地中でさらに３４℃のイン キュベージランを続行した。３時間後、各単層に、１ｍＣ１”Ｓ−メチオニン（ １３５０ｃｉ／ｍｍｏｌ　、アマ−ジャム）を加え、計２４時間、インキュベー ジランを続けた。感染細胞及び細胞断片の培地は、１５００ｘｇ、１０分間の遠 心及び吸引濾過により分離した。その沈殿を５−１．１（１＋Ｍ）リス、１０ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５（）リス／ＥＤＴＡ）中、−７０℃で凍結し、再び 融解した。上滑及び凍結／融解沈殿を合せ、４５．ＯＯＯＸｇで３０分間遠心し た。この遠心後の上清を、１４０．ＯＯＯｘｇで２時間遠心した。そのウィルス ペレットを、３００μｌのトリス／ＥＤＴＡに再懸濁し、ウィルスを、先に述べ た、１０〜３０％シ！ｌ塘勾配で精製した。勾配の各フラクシヨンを１２％ポリ アクリルアミドゲルを用いたＳ　Ｄ　Ｓ　”ｌａ電気泳動分析した。純粋なウィ ルスフラフシランを合わせ、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）存在下、４℃で 最高４週間保存した。

例１及び２由来の調製物から、カプシド構造の変化したウィルスを除くため、例 えばａ＋ｌＫ　２ＧＺなどの、Ｃ決定基に対する、モノクローナル抗体を含む、 免疫吸着体２０μ！を、精製ウィルスと３０分間、インキュベートし、ウィルス プローブを除く前にペレット化した。

免疫亘ｌ生葛匡里 スタフ　イＤ　ニア　７カスオーレウス（Ｓｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎ ｒｅｕｓ）（ＢＲＬ）細胞を、１０％に八となるよう水に懸濁したいこの細胞を ＰＢＳで２回洗浄した後、５分の１容のウサギ−抗−マウスＩｇＧ血清（ベージ ング）を加え、この懸濁液を、室温で１時間インキュベートした。その細胞をＰ ＢＳで２回洗浄し、再び、Ｃ決定基に対するモノクローナル抗体（例えば＋ｓＡ ）［２ＧＺ）を含む５分の１容のマウス腹水と１時間、インキュベートした。２ 回の洗浄後、細胞をベリ７）化し、再びＰＢＳに懸濁した後（１０％誓ハ）、放 射性ラベルしたウィルス調製物を加えた。

■−１ ＨｅＬａ　来のレセプターの可こ化 ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−オハイオ株、英国、フローラボラトリーズ、０３−１ ４７）を、３７℃で５濁培養した。懸濁培地（トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）、　Ｄ 、Ｃ，、コナント（Ｃｏｎａｎｔ）、　Ｒ，Ｍ、及びハンパリアン（Ｈａｍｐａ ｒｉａｎ）＋Ｖ、　Ｕ。、１９７０年、プロシーディング・イン・ソサイアティ ーオブ・エクスベリメンタル・バイオロジー・アンド・メディシン（Ｐｒｏｃ、 　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）　、１３３巻、６２〜６５頁； スコツト（Ｓｃｏｔｔ）、　Ｅ、　Ｊ、及びヒース（Ｈｅａｔｈ）、　Ｇ、　Ｆ 、；１９７０年、ジャーナル・オプ・ジェネラル・ピロロジ・−（Ｊ、Ｇｅｎ。

ν１ｒｏ１．）　６巻、１５〜２４頁）は、懸濁用のジフクリク修正ＭＥＭ（ギ プコ、０７２−１３００）及び７％ウマ血清（セロメト（ＳｅｒｏＩＩｅｄ）、 ０１３５）を含んでいる。接種ぎ度は、５〜ｌ０ＸＩＯ’細胞／ｗｂｌで、容積 は５００＋ｅ＃で行った。この懸濁液を、無菌条件下、１×１０ｔｈ細胞／＋ｊ ’０ｔｉＥＡ胞密度で、３００Ｘｇ、１ｃ分間の遠心を行った。この上清を吸引 濾過で除き、細胞を、リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）７２回洗浄した。１０９ 個の細胞を、２０ｍ＋１０）等張バフ７７　（１０ｍＭヘベスーＫＯＨ，ｐＨ７ ，９，１４０ｍｌ’ｌ　ＫｔＪ、１．５＋ｓＭ　？１ｇＣ！、　、０．５ｍＭ　 ＥＤＴＡ、　０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）に胚濁し、水 冷下、５０ｖａｌダウンス・ホモジナイザーの２００パルスで破壊した。細胞の 核を、１１０００Ｘ、３分間の遠心で除去した。さらに、その膜を２層法で精製 した！２Ｘ１０”個の細胞に相当する膜を、ＰＢＳに移し、液体窒素中で保存し た。これらを可溶化するため、２Ｘ１０’個細胞相当物を１　ｗａｌｌの１％オ クチルグルコシド−ＰＢＳｉ液に照濁し、全ての不溶性物を、８０．ＯＯＯＸｇ 、１時間の遠心で除去した。その上滑は、カラムクロマトグラフィーに用いた。

■−土 フィル　−′人テスト 活性をテストする、カラムクロマトグラフィーがらのフラクションを、ドツト・ プロット装置中のニトロセルロースメンブレン（ＢＡ８５、シュレイチ中−・ア ンド・シェル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈ　Ｑ　１りにか檗た。この プローブを、室温で漏らしたままにしておく、それから残留液体をおだやがな水 流アスピレータで吸引濾過したのち、非特異的タンパク質結合部位を、２％ウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳｉ液を用い、４℃、−晩で飽和した。

その後、このフィルターを、１％トウィーン４０．０．５％デオキシコール酸ナ トリウム及びｌｏｍＭ（３−（３−コルアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ −１−プロパンスルホネート）を含むＰＢＳ中、１０　’　ｃｐ＠のｆｆ５３− メチオニンラベルしたＨ　ＲＶ　２’と１時間インキュベートした。このメンブ レンを、２％ＢＳＡ−ＰＢＳ？Ｓ液で２回洗浄してから乾燥し、プローブに相当 する丸い領域を粉砕して、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定し た。

特異性コントロールとして、ニトロセルロースフィルターのインキュベーション 前に、ＨＲＶ２を５６℃、１ｃ分間加熱処理した（８）、この処理後、どのプロ ーブの結合も検出されなかった（第１Ｂ図）。このことから、固定化した物質に 対する本来のＨＲＶ２の結合は、事実上、ウィルスと、レセプターとの特異的相 互作用に基づくものであると結論づけた。

■−立 レンス・りＩナリス・レクチン・カラムによるアフィンティークロマトグラフィ ー １０８個の細胞相当物を、先に述べたように可溶化し、ＯＧで平衡化したし、ク リナリスカラム（１ｍｕ）にかけた、このカラムを、２　ｍ１２のＩＭ−α−Ｄ −メチル−グルコシド・○Ｇ温溶液溶出した。この結合テストは、結合活性のほ ぼ１００％が回収されるが、全タンパク質の約９０％が除去されることを示して いる。

■−工 °ルゞ　゛隔りロマトグーフィー Ｌ、クリナリス・カラムからの溶出物を、０．５ｍＡになるまでセントリコンチ ューブ（３０ｋＤ排除）で’ＩＮＦＭし、ＦＰＬＣ（ファルマシア）により、ス ーパーロース６ＨＲ１０／３０カラムを使って（ＱＧパンツァー平衡化）、分離 した。マーカータンパク質との比較により、活性レセプターの分子量は、４５０ ｋＤであると測定された。同時に、混入タンパク質の大部分を除くことができた （第１図）。

■＝１ 之二腫包【遠心 り、クリナリス・カラムで精製したレセプター（上述）を、シｇ糟勾配（１０− ４０％　ＯＧ中）にかけ、３８Ｘｒｐｍ、８時間、４℃で遠心した。活性ピーク は、沈降係数２８．４Ｓｆ、こ相当する勾配位置にあることが分った。マーカー タンパク質の位置は、別の勾配中で測定した。界面活性剤の存在の結果、マーカ ーは、１５．Ｏ８及び２１．９３と計算された沈降係数の位置に沈降した（界面 活性剤非存在下では、７．３５及び１１．３Ｓ）。

五−主 アニオン六　クロマトグーフィー 予備テストで、レセプターは、モノＱＨＲ５１５カラム（ファルマシア）ではも はや溶出してこないことが分っている。それ故、Ｌ、クリナリス及びゲル濾過カ ラムを用いた予備精製にかけたｌ／セブターを、タンパク質１■当り、ｌユニッ ト（Ｕ）のノイラミニダーゼによる３７℃、１時間の処理にかけ、強酸性のノイ ラミ／酸基を除去した。それから、このサンプルを２倍量になるまで、１（１＋ Ｍリン酸バフファ、ｐｌ＋７．１％オクチルグルコシド溶液で希釈し、モノＱカ ラムにかけた。このカラムを、同バンファ中０からＩＭＮａＣｆｆの勾配で展開 した。結合活性は、約２５０＋＋＋ＭＮａσの位置にブロードなピークとして検 出された。（第３図）。

■−エ 上ｊ１１−ゴリ１１ζ曳裂 ２Ｘ１０’個のＢｅＬａ細胞の細胞質膜を、１％にバ１−０−ｎ−オクチルーβ −Ｄ−グルコピラノシド及び８０．０１％Ｗ／ＶのＬ−α−ｐ−）シルーＬ−リ ジ７７００−メチルヶ）７（ＴＬＣＫ）、Ｌ−１−）ジルアミド−２−フェニル エチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）及びフェニルメチル−スルボニルフルオ ライド（ＰＭＳＦ）（全てシグマ社製）を含む５ｍＡ’ＰＢＳ中、室温、１０分 間処理して可溶化した。不溶性物質を、ベックマン６５固定アングルローターを 用い、３　Ｋｒｐｍ、３０分間の遠心で除去した。

その上滑をＯＧ　（ＰＢＳ、１％Ｗ／Ｖオクチルーグルコシド）で平衡化したし 、クリナリス・レクチン・カラムにがけ、結合物質をＩＭα−メチルグルコース を含むＯＧ５　ｍｌで）８出した。この溶出物を、飽和硫酸アンモニウム等容量 を添加して、５０％飽和とした。沈澱物を）”ｙ７ｙＡ　（１０ｍＭ）’Ｊスー ＨＣｆ（ｐＨ７，５）　、５ｍＭＥＤＴＡ、１％ｌ？／ジオクチルグルコシド） 　２　羨Ｊに溶がし、ファルマシアＦＰＬＣシステムに装着したモノＰアニオン 交換カラムに注入した。パンツ７Ｂ（１，５ＭＮａσを含む以外Ａと同じ）の０ から１００％の勾配を用い、タンパク質を分離した。ウィルス結合活性を含むフ ラクシヨンを集め、セントリコンチューブで０．５ｍｊ！ニまでｅ縮し、５ＩＩ ＭＥＤＴＡを含むＯＧで平衡化したスーパーｏ−ス６カラムで分画した。タンパ ク質濃度ヲ、２８０ｎｍの吸光度でモニターした（第４ａ図）。

このカラムからのフラクションを５０ｐｌに濃縮し、０．１％Ｗ／ＶＳＤＳとし たのち、５ｓ＋ＭＥＤＴＡを含む６％ポリアクリルアミドゲルに３回かけた（２ １）、ゲルで分離したタンパク質は、コマージ・ブルー（第４ｂ図）で染色する が、又は、電気泳動的にニトロセルロースシートに移し、ドツト・プロットで述 べた条件下で、４　Ｘ　１０　’　ｃｐｗａ　（７）”ＳラベルしたＨＲＶ２と インキュベートした。それから、ニトロセルロースを乾燥し、オートラジオグラ フをとった（第４ｃ図）、特異的結合のコントロールとして、同一のプロットを 、２０倍過剰の未ラベルＨＲＶ　２存在下でインキュベートした（第４ｄ図）、 スーパーロース・カラム由来のフラクシヨン６及び７は、ニトロセルロースに移 したとき、ＨＲＶ　２を結合できる物質を含んでいたことが分った。オートラジ オグラフは同ゲルで展開したマーカータンパク質との比較により、およそ１２０ ｋＤに相当する位置に存在する１つのバンドに加えて、３００ｋＤ以上の見かけ の分子量を有するいくつかのバンドを示した（第４ｃ図）、この１２０ｋＤのバ ンドだけは過剰の未ラベルウィルスを含むコントロールには存在せず（第４ｄ図 ）、このことは、このタンパク質と）ｌＲＶ２との特異的相互作用を示している 。

同サンプルを含み、コマージ・ブルーで染色したポリアクリルアミドゲルは、ウ ェスタン・プロット上の放射性バンドに相当する位置に淡いバンドを示した。こ のバンドは、ウィルス結合活性を示すフラクシヨン６及び６から得たサンプル中 にのみ見い出されＳＤＳ中での煮沸が、活性を不可逆的に破壊することから、活 性レセプターの保存には、温和な条件を必要とする（第５図レーン１及びレーン ２と比較して）、レセプター調製物を、ポリアクリルアミドヘロードする前に、 １０ａ＋Ｍジチオスレイトールとインキュベーションすると、結合活性はみられ なかった（第５図、レーン３）。それらのレセプターとライノウィルスの特異的 相互作用が、二価カチオンに依存することから（１２）　、レーン１に適用した ものと同じサンプル由来のプロットを、ＥＤＴＡ存在下、ウィルスとインキュベ ーションした。この条件下では、結合は観察されなかった（第５図、レーン４） 、さらに、コントロールとして、５６℃に加熱したウィルスと、そのニトロセル ロースシートとをインキュベーションした。この処理により、ｕｅＬａｉＥ胞表 面でのウィルスの確認を排除するようなウィルス・カプシドの構造変化が起こる （２３）、第５図、レーン５にみられるように、これらの条件では、結合は起こ らない。

！−１−五 少数ライノウィルスグループレセプターの感受性未処理　１００ １０μｇ　トリプシン　６ ５０ｍ１ｉノイラミニダーゼ　１７０ １０ｍ？ｌジチオスレイトール　１５ １０１ヨード７セト了ミド　８０ １０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム　７０ １０ｍＭＥＤＴＡ　５ 全ての前処理は、３７℃、３０分間行った。

注）（ａ）前処理なし：代りに、１０＋ｉ？ＩＥＤＴＡ存在下、ラベル化ＨＲＶ ２とのインキュベーションを行った。

メー」ニー艮 少数レセプターグループに対する、種々の血清型ライノウィルスの競争 ＨＲＶ８９　９５ 放射性ラベルした１（ＲＶ４９の競争相手ＨＲＶ８９　９０ 説明されているように、２０倍過剰の未ラベルウィルスと、フィルターをインキ ュベーションした。

叉藍貝亘 １、　アブラハム（Ａｂｒａｈａａ）　Ｇ、及びコロンノ　（Ｃｏｌｏｎｎｏ） 、　Ｒ，Ｊ。

（１９８４）、多くの血清型のライノウィルスは、同じ細胞レセプターを有して いる。ジャーナル・オフ・ピロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）　５１巻、３４０〜３４５頁。

２、プラース（Ｂｌａａｓ）　、Ｄ、クエチラ−＜Ｋｕｅｃｂｌｅｒ＞、Ｅ　、 ブリエンド（Ｖｒｉｅｎｄ）　、Ｇ、、アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）、Ｅ、、グ リフイス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）。

Ｊ、　Ｐ、、ルオ（Ｌｕｏ）、Ｆｌｏ、ロスマン（ｌｉｏｓｓｍａｎ）、Ｍ、　 Ｇ、（１９８７年）、２種類のヒト・ライノウィルス（ＨＲＶ２及びＨＲＶ　ｌ 　４）の三次元構造の比較、プロティン（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　（投稿中）。

３、　プルネテ（Ｂｒｕｎｅｔｔｅ）　、Ｄ、Ｍ、及びラベル（Ｔｉｌｌ）、Ｊ 、Ｅ、（１９７１）、離油。ジャーナル・オフ・メンブレンバイオロジー（Ｊ、 Ｍｅｍｂｒ。

Ｂｉｏｌ、）、５巻、２１５〜２２４頁。

４、　コロンノ（Ｃｏｌｏｎｎｏ）、　Ｒ，Ｊ、、カラハン（Ｃａｌ］ａｈａｎ ）、　Ｐ、　Ｌ、、及びロング（Ｌｏｎｇ）、　Ｗ、　Ｊ、　（１９８６）　、 ヒト・ラインウィルスの主要グループの付着を阻害するモノクローナル抗体の単 離。

ジャーナル・オフ゛・ピロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）　５７　巻、７−１２ 頁。

５、デュエチラ−（Ｄｕｅｃｈｌｅｒ）、Ｍ、、スカーノ（Ｓｋｅｒｎ）、　Ｔ 、、ツマ−グルーバー（Ｓｏｍｍｅｒｇｒｕｂｅｒ）、　Ｌ、二二一バウア−（ Ｎｅｕｂａｕｅｒ）　。

ｃｈ、　、グルエントラ−（Ｇｒｕｅｎｄｌｅｒ）、　Ｐ、、ホギー（Ｆｏｇｙ ）、　１．、ブラース（Ｂｌａａｓ）、　Ｄ、及びクエチラ−（Ｋｕｅｃｈｌｅ ｒ）、Ｅ、（１９８７）、ヒト・ライノウィルスの進化；血清型８９．２及び１ ４の比較。

プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）υ、　Ｓ、　Ａ、（投稿中）。

６、　ホックス（Ｆａｘ）、　Ｊ、　Ｐ、（１９７６）ライノウィルスワクチン は可能か？、アメリカン・ジャーナル・オフ・エビテミオロジー（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｊ、　Ｅｐｉ６ｅｏ１．）　１０３巻、３４５〜３５４頁。

７、　クラ−（Ｍｒａｈ）、　Ｄ、　Ｌ、及びクロウエル（Ｃｒｏｗｅｌｌ）、 　Ｒ，Ｌ。

（１９８５）、グループＢコフクサキーウィルスの結合に対する、デソキシコー ル酸塩による可溶化を行ったＨｅＬａ細胞の細胞質膜の性質、ジャーナル・オフ ・ピロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　５３巻、８６７〜８７０゜ ８、ロンバーブ・ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｒｏｌｅ）＋　Ｋ、及びイン（Ｙｉ ｎ）。

Ｆ、Ｈ，（１９７３）、ｇ染性でかつ不活性なヒトライノウィルスタイプ２の抗 原決定基、ジャーナル・オフ・ピロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）　１２巻、１１４〜１２３頁。

９、ロンバーブ・ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏ１ｍ）、　Ｋ、及びホワイトリ ー（Ｗｂｉｔｅｌｅｙ）、　Ｎ、　Ｍ、（１９７６年）、ポリオウィルス及びヒ ト・ライノウィルスの、ＨｅＬａ細胞との初期相互作用のだめの物理的及び代謝 的必要条件、ジャーナル・オフ・ピロロジー（ＪＪｉｒｏｌ、）１９巻、８５７ 〜８７０頁。

１０、ロンバーグ、ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏ１ｍ）　、　Ｋ、クローウェ ル（Ｃｒｏｗｅｌ　ｌ）　＋Ｒ，Ｌ、及びフィリフブソン（Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ ）、　Ｌ、（１９７６年）、非関連動物ウィルスが、レセプターを共有している 。ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５９巻、６７９〜６８１頁。

１１、メルニク（Ｍｅｌｎｉｃｋ）、　Ｊ、　Ｌ、（１９８０年）、ウィルスの 分類学プロシーディング・イン・メディカル・ピロロジー（Ｐｒｏｃ。

Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、）　２６巻、２１４〜２３２頁。

１２、ノープル・／’１−ペイ　（Ｎｏｂｌｅ−Ｈａｒｖｅｙ）＋　Ｊ、及びロ ンバーブ・ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−ＨｏｌＩＩ）、　Ｋ、　（１９７４年）、 ヒト・ライノウィルス２型のＨｅＬａ細胞への付着における一連のステップ。ジ ャーナル・オプ・ジェネラル・ピロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）　 ２５巻、８３〜９１頁。

１３、スカーフ（Ｓｋｅｒｎ）、　Ｔ、、ツマ−グルーバー（Ｓｏｍｍｅｒｇｒ ｕｂｅｒ）。

に６、プラース（Ｂｌａａｓ）、　Ｄ、　、ピーラ−（Ｐｉｅｌｅｒ）、Ｃｈ、 　、及びクエチラー（Ｋｕｅｃｈｌｅｒ）、　Ｅ、（１９８４年）。ヒト・ライ ノウィルス２型のポリメラーゼ遺伝子の配列。ピロロジー（Ｖｉｒｏｌ、）、１ ３６巻、１２５〜１３２頁。

１４、ストソト（Ｓｔ−ｏｔｔ）、　Ｅ、　Ｊ、及びヒース（Ｈｅａｔｈ）、　 Ｇ、　Ｆ、（１９７０）、Ｌ１３２細胞の悲濁培養における、ライノウィルス２ 型の増殖に影響を与える因子、ジャーナル・オフ・ゼネラル・ヴイロロジー（Ｊ 、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）　６巻、１５〜２４頁。

１５、ストント（Ｓｔｏｔｔ）、　Ｅ、　Ｊ、、キリントン（Ｋｉｌｌｉｎｇｔ ｏｎ）、　Ｒ，Ａ。

（１９７２）。ライノウィルス。アニュアル・レヴユー・オフ・マイクロバイオ ロジー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）２６巻、５０３〜５２５頁 。

１６、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、　Ｎ、　Ｍ、　、レオン（Ｌｅａｎ）、　Ｍ、　 Ａ、、タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈ　ｉ）　、　Ｔ、、ハヮード（ｌｌａｗａｒ ｄ）、　１．に、及びセージ（Ｓａ（ｅ）。

１１、Ｊ、（１９７１年）。レンチル由来のフィトヘマグルチニンの研究。■。

多糖類、糖タンパク質及びりンパ細胞との、レンス・クリナリスのへマクルチニ ンの反応。ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅａｐ）、２７１巻、１５９６〜１６０１゜ １７、ドアシーン（Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ）、　Ｊ、Ｅ、及びコロンノ　（Ｃｏｌ ｏｎｎｏ）。

Ｒ，Ｊ、（１９８６）。ヒト・ライノウィルスの付着に関するレセプタータンパ ク質の単離。ジャーナル・オフ・ピロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　５８巻、２ ９０〜２９５゜１８、ケラ−（Ｋ５ｈｌｅｒ）、　Ｇ、及びミルスタイン（Ｍｉ ｌｓｔｅｉｎ）、　Ｃ−（１９７５）限定した特異性をもつ抗体を分泌する融合 細胞の連続培養。ネイチａｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（ｏンドン）、２５６巻、 ４９５〜４９７゜ １９、ロスマン（Ｒｏｓｓｍａｎ）、　Ｍ、　Ｇ、、アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ ）、　Ｅｏ、エリフラン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）、　Ｊ、Ｗ、、フランケンバーガ ー（Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇｅｒ）。

Ｅ、Ａ、、グリフイス（叶汀ｆｉｔｈ）、　Ｊ、Ｐ、、ヘッチ（Ｉｌｅｃｈｔ） 、　ｌトコ０、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、　Ｊ、　Ｅ、　、クレーマー（ Ｋｒａｍｅｒ）、　Ｇ、、ルオ化ｕｏ）、　Ｍ、、モサー（Ｍｏｓｓｅｒ）、　 Ａ、　Ｍ、、ルーカート（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）。

Ｒ，Ｒ，、シェリー（Ｓｈｅｒｒｙ）、　Ｂ、　Ａ、、及びブリエンド（νｒｉ ｅｎｄ）、Ｇ、（１９８５）。一般的風邪ウィルス、ヒト・ライノウィルス１４ 型（ＨＲＶ１４）の構造。ネイチａｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（ｏンドン）３１ ７巻、１４５−１５４゜ ２０、マポルス（Ｍａｐｏｌｅｓ）、　Ｊ、　Ｅ、　、クロー（Ｋｒｏｈ）、　 Ｄ、　Ｌ、及びクローウェル（Ｃｒｏｗｅｌｌ）、　Ｒ，Ｌ、　（１９８５）　 、グループＢ：ｌ　ンクサキーウィルスに対する、ＨｅＬａ細胞レセプタータン パク質の精２１、レムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）、　１１．　Ｌ（１９７０）　、 バクテリオファージＴ４の頭部アッセンブリーにおける、構造タンパク質の切断 。

ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（ｔ）ンドン）２７７巻、６８０〜６８５頁。

２２、バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）、　Ｗ、　Ｎ、　（１９８１）　。

ウェスタン・プロッティング；ラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ ルから、未修飾ニトロセルロースへのタンパク質の電気泳動による転移及び、抗 体及び放射性ヨウ素化プロティンＡによる、ラジオグラフィーによる検出。アナ リティヵル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１１２巻 、１９５〜２０３゜ ２３、ロンバーブ・ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−ＨｏｌｌＩ）＋　Ｋ、及びイン（ Ｙｊｎ）−。

Ｆ、［１，（１９７３）感染性でかつ不活性なヒト・ライノウィルス２型の抗原 決定基、ジャーナル・オフ・ピロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ）、９巻、２９〜４０頁。

浄書（内容に変更なし） く　の 溶出体積（而） ｍｍｏｌ　ＮｃＣｌ 平成　年　月　日 特許庁長官　吉　日　文　毅　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００３１２３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　平成１年８月２２日６、補正の対象　図面の翻訳文 （第０．１．２．３図） ７、補正の内容　別紙のとおり 図面の翻訳文（第０．１．２．３図）の浄書国際調査報告 ｍＡｍ＝’−ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００３１２国際調査報告 εＰεε００３１２ ＳＡ２１６１４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）実質的に純粋な、少数レセプターグループのライノウイルスに対する結合 活性を有するレセプター。 （２）ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した分子量が約４５０ｋＤである、請 求項（１）記載のレセプター。 （３）界面活性剤の存在下でのショ糖勾配遠心で測定した沈降係数が約２８．４ Ｓに相当する、請求項（１）又は（２）記載のレセプター。 （４）レンズ・クリナリスのレクチンと結合する、請求項（１）乃至（３）のい ずれか１項に記載のレセプター。 （５）ヘパリン−セファロースと結合しない、請求項（１）乃至（４）のいずれ か１項に記載のレセプター。 （６）アニオン交換体と不可逆的に結合する、請求項（１）乃至（５）のいずれ か１項に記載のレセプター。 （７）ノイラミニダーゼに対して不感受性の結合活性を有する、請求項（１）乃 至（６）のいずれか１項に記載のレセプター。 （８）分子間シスルフィド結合により会合しているサブユニットからなる、請求 項（１）乃至（７）のいずれか１項に記載のレセプター。 （９）ＥＤＴＡの存在下、ライノウイルスに対ずる結合性を示さない、請求項（ １）乃至（８）のいずれか１項に記載のレセプター。 （１０）ヨードアセトアミドによって、わずかに影響を受ける、ライノウイルス に対する結合活性を有する、請求項（１）乃至（９）のいずれか１項に記載のレ セプター。 （１１）請求項（１）乃至（１０）のいずれか１項に記載のレセプターの完全な 還元により生ずるレセプターサブユニット。 （１２）請求項（１１）記載のレセプターサブユニットを少なくとも２個含有し 、かつ、天然のレセプターそのものではないレセプター。 （１３）請求項（１）乃至（１０）のいずれか１項に記載のレセプターの制御さ れた還元により生ずるレセプター。 （１４）前述の請求項では述べられていない、１つ以上の酵素及び／または化学 試薬を用いた、制御された処理によって、請求項（１）乃至（１０）のいずれか １項に記載のレセプターから調製されるレセプター。 （１５）請求項（１１）記載のレセプターサブユニットの少なくとも２個の、制 御された酸化により生するレセプター。 （１６）ａ）細胞、好ましくはＨｅＬａ細胞由来の膜を単離し、これらを精製し 、 ｂ）腹中に存在するレセプターを、界面活性剤、好ましくは、トリトン−Ｘ１０ ０、ＣＨＡＰＳ、ジタージニント（Ｚｗｉｔｔｃｒｇｅｎｔ）、オクチルグルコ シド又はＤｏＣ、最も好ましくはオクチルグルコシドで可溶化し、 ｃ）不溶性成分を除去し、及び ｄ）そのレセプターを、クロマトグラフィー、好ましくは、コンカナバリンＡ、 リシン−セファロース又はレンズ・クリナリス・カラムにより精製する、 以上、ａ）〜ｄ）のステップを含む、少数レセプターグループのライノウイルス に対する結合活性を有するレセプターの調製法。 （１７）レセプターを、ノイラミニダーゼ処理後、アニオン交換カラム、好まし くは、モノＱカラムによるクロマトグラフィーにかける、請求項（１７）乃至（ ２１）のいずれか１項に記載の方法。 （１８）第１のクロマトグラフィーによる精製後、第２のクロマトグラフィーに よる精製をスーパーロースカラムで行う、請求項（１６）又は（１７）記載の方 法。 （１９）請求項（１）乃至（１０）のいずれか１項に記載のレセプターを制御し ながら還元する、請求項（１１）記載のレセプターユニットを調製する方法。 （２０）請求項（１１）記載のレセプターサブユニットの少なくとも２個を、制 御しながら酸化する、請求項（１２）記載のレセプターを調製する方法。 （２１）ａ）好ましくは、レセプターが固体キャリヤーに結合した形で、ライノ ウイルスの定性的そして、または定量的検出を目的として、 ｂ）ラィノウイルスの分析的特性化又は精製を目的として、ｃ）診断そして、ま たは治療を目的として、ｄ）ポリクローナル、そして、またはモノクローナル抗 体の調製を目的として、 ｅ）ヒト又は動物の治療そして、または予防を目的として、または、 ｆ）医薬用組成物の製造を目的として、以上、ａ）〜ｆ）の理由による、請求項 （１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のレセプターの使用。 （２２）請求項（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載の、効果的量のレセプ ターに加えて、医療的に不活性なキャリヤーそして、または賦形剤を含む、医薬 組成物。 （２３）請求項（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のレセプターに対する モノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系列。 （２４）全体的に、もしくは部分的に、請求項（１）乃至（１５）のいずれか１ 項に記載のレセプターを特異的に中和するか、もしくは、該レセプターの１つと 、特異的に結合するモノクローナル抗体。 （２５）全体的に、もしくは部分的に、請求項（１）乃至（１５）のいずれか１ 項に記載のレセプターを中和するか、もしくは、該レセプターの１つと特異的に 結合するポリクローナル抗体。 （２６）請求項（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のレセプターの定性的 、そして、または定量的測定のためのまたは、請求項（１）乃至（１５）のいず れか１項に記載のレセプターの精製のための、請求項（２４）又は（２５）記載 のポリクローナル抗体そして、またはモノクローナル抗体の使用。 （２７）請求項（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のレセプターを含む、 ライノウイルス測定用のテストキット。 （２８）宿主動物を請求項（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のレセプタ ーで免疫化し、該宿主動物由来のＢ−リンパ細胞をミエローマ細胞と融合し、請 求項（２４）記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系列をサブ クローンし、ついで、試験管内又は生体内で培養する、該モノクローナル抗体の 調製法。