PT87244B - Processo para a preparacao de receptores do grupo de receptores pequenos com actividade de ligacao a rhinovirus - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se ao receptor do grupo de receptores pequenos de Rhinovirus humanos, a sua purificação, assim como a sua utilização·

Os Rhinovirus humanos representam uma grande estirpe dentro da família dos vírus Picorna e contem mais de noventa tipos de soro diferentes (6,11)· Estes RNA-vírus atacam o canal respiratório do homem e originam infecçães agudas que provocam oonstipaçães, tosse, rouquidão, etc· e que, geralmente, são designadas como resfriados (15)· As infecçSos por Rhinovirus contam-se entre as doenças mais frequentes do homem· Não obstante o decurso das doenças na maior parte das vezes ser de natureza benévola, os resfriados originam, no entanto, um enfraquecimento geral do organismo· Por esse motivo, podem originar infecçães secundárias por outros agentes patogenicos·

grande grupo dos Rhinovirus humanos pode dlvidir-se em dois subgrupos, se, como critério de classificação, se considera a competição para os locais de ligação nas superfícies de células de culturas de células humanas (em geral, célu- . las HeLa). Esta classificação original de alguns tipos dos Rhino virus (10) pode alargar-se a oitenta e oito representantes medi-: ante experiências largamente aplicadas (4,1).

I 0 resultado destas experiências leva à conclusão de que, apesar do grande número, surpreendentemente, existem; apenas dois receptores diferentes na superfície das células a i que os representantes de um ou do outro dos grupos de Rhlnovirus se podem ligar. Até agora, foi possível classificar-se setenta e oito tipos de soro no grande grupo dos receptores de Rhinovirus e oito do pequeno grupo de receptores de Rhinovirus (RVRG). Dois outros representantes não se comportavam nitidamente, de modo que não era possível uma classificação distlntiva(l)

Nos últimos anos, verificou-se um aumento con-, siderável de infecções provocadas por Rhinovirus em centros de ' diversões. Enquanto, na maior parte das outras doenças infecciosas, se consegue uma imunidade de longa duração ou permanente contra o agente que provoca a doença, as infecções provocadas p£ lo Rhinovirus podem verificar-se sempre. A razão das falhas de uma imunidade permanente reside no grande número de estirpes de Rhinovirus que não apresentam nenhuma ou apenas uma pequena reac ção cruzada imunelógica umas em relação às outras (6,11). Depois de realizada a infecção, podem detectar-se, na verdade, anticorpos contra a respectiva estirpe de vírus, mas, no entanto, estes não garantem qualquer protecção contra as outras estirpes de Rhi novirus·

Por causa do grande número de estirpes que cirI culam na população, são possíveis infecções repetidas provocadas por Rhinovirus.

Por consequência, a existência de apenas dois receptores das múltiplas possibilidades de inserção proporciona l um combate com êxito das infecções provocadas pelo Rhinovirus.

Como em geral os receptores são altamente espe

cíficos, existe a possibilidade de, com substâncias apropriadas,; se provocar uma influência dos receptores, por exemplo, por blo-; queio dos receptores. Se se utilizam substâncias que bloqueiam o í receptor pode evitar-se a penetração de vírus específicos dos rjs ceptores para as células. As mesmas substâncias que podem evitar¹ uma infecção são desta maneira utilizadas também para a terapia | de uma infecção por Rhlnovirus que já se tenha manifestada. A j procura de tais substâncias é essencialmente facilitada em mui- | tos casos se for possível caracterizar o correspondente recep- | tor.

Um objectivo da presente invenção foi, portan-; to, isolar o receptor para os pequenos RVRG e purificá-lo. !

i

As indlcaçães unicamente disponíveis até agora| relativamente aos receptores de Rhlnovirus referem-se ao receptor dos RVRG grandes.

A purificação e caracterização do receptor dos RVRG grandes foi realizada com o auxílio de um anticorpo monocl<>

, i nal que foi obtido por imunização de ratos com células HeLa. Este I receptor é glicosilado e tem um peso molecular à volta de 440 kD no estado natural. A desnaturação com lauril-sulfato de sódio origina uma dissociação em sub-unidades com 90 kD que sugere a conclusão de que o receptor funcional se encontra presente como um pentâmero (17).

receptor para os RVRG pequenos até agora não foi caracterizado nem purificado. Os dados individuais sobre estes receptores apontam para a sua constituição a partir de proteína e mostram que esta proteína ou proteínas semelhantes também são existentes nas células de uma série de outras espécies. ; Isso diferencia o receptor dos RVRG pequenos essencialmente do receptor do grupo grande que apenas foi possível encontrar em cé lulas humanas e, em poucos casos, em células de macaco. A existên cia de uma influencia, por exemplo, de um bloqueio de um receptor por substâncias que evitam a penetração do vírus nas células j mostra-se apropriada como possível prevenção ou também como tera' pia de uma infecção já existente.

!

objectivo da presente invenção fci, portanto,

proporcionar as bases para a preparação de substâncias que possi bilitam uma protecção contra infecções provocadas por Rhinovirus do grupo dos pequenos receptores.

Este objectivo é atingido de acordo com a presente invenção isolando o receptor de membranas de células, por exemplo, de membranas de células HeLa. Estas células foram culti vadas em suspensão por processos em si conhecidos, as células fo] ram desfeitas, os núclecs das células eliminados e as membranas ί j purificadas. Os receptores que se encontram nas membranas foram ’ em seguida solubilizados.

Para a optimização da solubilização de receptoj res activos a partir de células HeLa purificadas foram ensaiados^ diversos detergentes com várias concentrações. Como competente i para a escolha de determinado detergente, considerou-se a possibilidade de solubilizar o mais possível o material da membrana ] com a activldade menor possível de ligação de vírus. Como o mais apropriado, verificou-se ser a solução a 1$ de 1-O-n-octil-p-D-glucopiranósido (Figura O). i

Os componentes insolúveis foram eliminados e os receptores que se encontram em solução foram purificados. Para se poder seguir a actividade de ligação de vírus, desenvolveu] -se um ensaio de ligação de filtração sensível que possibilita a

Q K ligação de vírus marcados com ^S a receptores, que foram imobilizados em papel de nitrocelulose.

Os vírus necessários para o ensaio foram culti vados o purificados de acordo com uma maneira em si conhecida (13).

A purificação dos receptores de acordo com a J I presente invenção realizou-se por meio de métodos cromatográficos.

Como se sabe que a maior parte das proteínas das membranas é glicosilada, purificou-se o receptor numa coluna] d· lectina de Lens culinaris. Esta lectina possui especificidade; para as unidades de of-D-manose e de o(~D-glucose (16).

Eluiu-se o material ligado com solução de ©( -Dί t st 4 «s

-metil-glucósido 1 molar em solução de NaCl tamponizada com fosfatos com 1% de octil-glucósido.

Aplicaram-se partes alíquotas sobre nitrocelu-; lose em duplicado e incubou-se com vírus tanto naturais como I também aquecidos. A auto-radiografia das fracçães demonstrou umaj forte ligação ao vírus natural no material que foi eluído, em comparação com as fracções provenientes da circulação. Os vírus i aquecidos mostraram fraca ligação ao material reciclado. Isto significa interacções não específicas que foram provocadas pela i elevada percentagem de proteínas hidrofóbicas; os Rhinovirus aque eidos apresentam uma elevada hidrofobicidade (9)·

Porque foi verificado que os vírus purificados! se transformam a pouco ou pouco durante a armazenagem durante ; grandes intervalos de tempo a 4* C em partículas que possuem a mesma antigenieidade que os vírus aquecidos (C-determinantes), foram separadas estas contaminações por imunoprecipitação com an ticorpos monoclonais específicos C-determinamèes, por exemplo, mAK 2G2, imediatamente antes da realização de ensaios de ligaçãoj Obtêm-se estes anticorpos monoclonais de acordo com uma maneira de proceder em si conhecida por imunização de ratos ou de coelhos com C-determinantes e subsequente clonação de acordo com Kohler e Milstein (18).

Além da coluna com lectina de Lens culinar1s. foram também utilizadas colunas de Concanavalina A-Sepharose, Rí cino-Sepharose e Heparina-Sepharose, para purificar o receptor. i i I material de passagem e o material eluído foram ensaiados como se referiu acima. As colunas de Concanavalina A-Sepharose foram eluídas com solução de °(-D-metil-manosido 1 M, em que se pôde recuperar aproximadamente 20% de actividade de li gação. A eluição da coluna de rícino com galactose 1 M, originou aproximadamente 100% de actividade de ligação recuperátél. Ao contrário do receptor para o grupo de vírus de Coxsackie B (7), a Heparina-Sepharose não permitiu recuperar a actividade de ligaw ção. | material eluído da coluna de Lens culinário foi separado numa coluna de Superose com o auxílio de FPLC (Phar

macia) (cromatografia de permeação de gel). Por comparação cem proteínas marcadas, foi possível determinar o peso molecular do receptor activo como sendo igual a 4-50 kD. Simultaneamente, foi : possível separar-se a maior parte das proteínas contaminantes (Figura 1). !

receptor do grupo de receptores de Rhinovirus pequenos desloca-se num gel: de poli-acrilamida em presença de SDS com um peso molecular aparente de 120 kD. Em alguns casos, pode também observar-se uma banda dificilmente visível com : um peso molecular ligeiramente mais pequeno que, possivelmente, constitui uma modificação das quantidades principais da proteína do receptor (Figura 5, coluna 1). Os pesos moleculares das duas ^! formas do receptor são consideravelmente mais altos do que os en contrados para o receptor de Rhinovirus grande (90 kD).

Porque as proteínas do receptor dos dois grupos possuem um peso molecular igual a cerca de 450 kD na sua for! ma natural, não é improvável que a sua constituição a partir de sub-unidades seja semelhante. 0 peso molecular efectivo pode, no entanto, ser diferente do determinado por cromatografia de permeabilidade de gel por causa da pequena diferença dos volumes de retenção de proteínas nesta gama de elevado peso molecular.

A estrutura dos Picornavirus apresenta um sul-! co profundo (o Canyon), que se prolonga em torno do eixo quíntuplo 4a simetria icosaédrlca e que contém, possivelmente, os pon-; tos de ligação do receptor (19). Aceita-se que o receptor do gru! po de receptores de Rhinovirus grandes e o receptor para o grupo de vírus Coxsackie B ligam os vírus sobre os eixos quíntuplos (20). A questão de se saber se o receptor dos grupos pequenos é , um pentâmetro fica sem resposta porque o peso molecular das duas sub-unidades é muito grande em comparação com o receptor do gru-i po grande.

i Com o auxílio de uma centrifugação com gradien i te de açúcar, foi possível calcular as constantes de sedimenta- ! ção do receptor. Para esse efeito, aplicou-se receptor de L, cu-; linaris purificado com um gradiente de açúcar e centrifugou-se. 0 máximo de actividade foi determinado na posição do gradiente s 6 w

que corresponde as constantes de sedimentação de 28,4 S (Figura 2).

Em ensaios prévios, verificou-se que o receptor numa coluna de cromatografia de permuta de aniões não podia ser eluído. Porque o receptor é insensível em relação a neuro-aminidase, eliminou-se o ácido sialínico da glicoproteína para i evitar a acção de troea iónica com o material da coluna. A amostra foi então aplicada a uma coluna Mono Q (Pharmacia). 0 receptor foi eluído com gradientes de NaCl* A actividade de ligação pode ser evidenciada como o pico mais largo a cerca de NaCl 250 | mMolar (Figura 3).

A purificação dos receptores de acordo com a presente invenção é também possível por uma combinação das opera: Çães de purificação por cromatografia em diversos materiais de 5 cromatografia.

As propriedades químicas e os requisitos estru turais do receptor de acordo com a presente invenção para a liga ção de vírus foram determinados cop o auxílio de enzimas e de reagentes químicos (Tabela 1), tratamento com tripsina destrói completamente a actividade de ligação. Este facto concorda com os resulta- I dos já conhecidos do tratamento enzimático de superfícies de células (14) e aponta para o carácter de proteína do receptor. 0 tratamento do receptor solubilizado com neuraminidase resultou reprodutível com um ligeiro aumento da actividade de ligação. E£ te tratamento origina, possivelmente, uma melhor acessibilidade da região sob a molécula do receptor que constitui o objecto da interacção com o vírus. Deste facto, conclui-se que o ácido sialínico não é necessário para a ligação do vírus. í ditiotreitol (DTT) destrói a capacidade de ligação, o que permite concluir sobre a participação das pontes i de dissulfureto na manutenção da dobragem correcta da proteína.

peso molecular surpreendentemente elevado determinado por cromatografia de permeabilidade de gel e centrifugação em gradiente j significa uma estrutura oligomérica da molécula do receptor. A sensibilidade em relação a DTT permitiu concluir que as pontes sa 7 se

de dlssulfureto intermoleculares são necessárias para a associa-: çSo das hipotéticas sub-unidades.

tratamento com iodo-acetamida reduziu apenas ligeiramente a actividade de ligação e isso significa que os gru pos de sulfidrilo livres não são necessários para tuna ligação eficiente.

Em presença de ácido etileno-diamino-tetracéti i co (EDTA) na incubação do filtro de nitrocelulose com vírus marcadoe com não se pode detectar a ligação. Isto concorda com ensaios anteriormente realizados que mostraram a necessidade da presença de catiães bivalentes para a interacção dos Rhinovirus

I com as superfícies das células (12).

Os ensaios de competição da ligação entre pares de tipos de soro foram utilizados para classificar os Rhinovirus humanos nas duas classes de receptores (10, 1). Na presente invenção, foram, portanto, empregados HRV2 e HR.V49 como repre sentantes do grupo dos pequenos receptores e HRV89 como represen: tante do grupo dos grandes receptores, em ensaios de competição, para determinar a especificidade dos receptores de acordo com a presente invenção.

Os filtros de nitrocelulose com receptores imo¹ bilizados foram incubados em presença de um excesso aproximadamente igual a vinte vezes de ou HRV2 ou de HRV89 com HRV2 marcado. Como se mostra na Tabela II, a ligação foi massissamente diminuída em presença de HRV2 não marcado, muito embora não fosse influenciada por HRV89. Para a garantia desses resultados, repetiram-se estes ensaios com HRV 49 marcado, com utilização de HRV2 e de HRV89, como competidores. É de novo evidenciado que HRV2 r£ duz maesiçamente a ligação e que HRV89 não tem qualquer influência.

Se bem que HRV2 e HRV89 se liguem a receptores: diferentes, as suas proteínas da cápside mostram uma semelhança : surpreendentemente elevada (5). Uma comparação pormenorizada da estrutura entre HRV2 e HRV14, baseada na análise da estrutura por raios X do HRV14 foi realizada recentemente (2). Os dois HRV14 e HRV89 ligam-se ao receptor dos RVRG grandes. Pode espe% 8 «

rar-se portanto que, no hipotético receptor, sejam encontrados locais de ligação com um conjunto de aminoácidos conservados. Noi entanto, até agora, não foi possível descobrir uma matriz simples de aminoácidos conservados no interior da região do Canyon.

Por meio da presente invenção é possível, pela primeira vez, preparar receptores para os RVRG sob uma forma essencialmente pura.

Mediante os receptores de acordo com a presente invenção, é possível, pela primeira vez, ensaiar as actividades de troca vírus/receptor pretendidas, É de especial interesse para esse efeito a localização das regiães sobre os receptores que respondem finalmente pela acção doe vírus. Pelo conhecimento destas zonas, deve ser possível preparar substâncias que sejam dirigidas especificamente contra estas zonas, para se conseguir j o mais possível um bloqueamento dos receptores para um grande nú “ i mero de Rhinovírus diferentes.

objecto da presente invenção é constituído por receptores que se podem preparar de acordo com o processo descrito e ligam representantes dos RVRG pequenos.

São também objecto da presente invenção os receptores que se podem preparar a partir dos receptores naturais por processos conhecidos pelos peritos no assunto. Por exemplo, padtam mencionar-se a este respeito as sub-unidades que se podem j obter por tratamento com agentes redutores do receptor natural que se podem purificar, por exemplo, por processos eleetroforéti cos. Estas sub-unidades são utilizáveis, por exemplo, para a preI paração de anticorpos policlonais e/ou monoclonais que se podem empregar de maneira semelhante preparativamente, como diagnóstico e/ou como terapêuticos como os correspondentes anticorpos con tra os receptores naturais.

Também são utilizáveis as sub-unidades dos receptores de maneira semelhante aos receptores naturais, !

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São também objecto da presente invenção as mo- i dificaçães dos receptores naturais e/ou das suas sub-unidades que se podem obter por tratamento enzimático. Como se verificou na presente invenção, o tratamento com tripsina destrói a capaci s Ç a

dade de ligação dos receptores de acordo com a presente invenção , enquanto a Neuraminidase origina um ligeiro aumento de actividade .

Por consequência, os peritos no assunto podem pensar e ensaiar de uma maneira não de acordo com a presente in venção que determinadas enzimas e/ou reagentes químicos originam receptores que ou são melhores na sua actividade e/ou são melhor aplicáveis e utilizáveis e/ou possuem uma melhor estabilidade, quando comparados com os receptores naturais. Estas modificações podem fazer com que, por exemplo, em todas ou em sub -unidades individuais dos receptores naturais, se separem partes das cadeias de proteínas, se cortem e/ou se recortem as cadeias de proteínas.

Além destas modificações, é ainda possível transformar os receptores naturais nas sub-unidades ou completa mente ou parcialmente, por exemplo, por redução controlada. Estas sub-unidades maiores ou menores podem também acoplar-se, por exemplo, por oxidação, de maneira a obterem-se unidades maiores ou menores que são apropriadas em comparação com os receptores naturais.

Os agentes redutores apropriados para a separação de pontes de dissulfureto são, por exemplo, compostos de tiol como tiofenol, 4-nitro-tiofenol, 1,4-butano-ditiol e, espe cialmente, 1,4-ditiotreitol.

A redução realiza-se vantajosamente no seio de um meio aquoso-alcalino, por exemplo, no seio de uma solução diluída de um hidróxido de metal alcalino, por exemplo, hidróx_i do de sódio, de um carbonato de metal alcalino, por exemplo, carbonato de sódio ou de uma base orgânica, em especial, de uma trialquilamina inferior, por exemplo, trietilamina, à temperatu ra ambiente.

Os agentes oxidantes que são apropriados para um novo acoplamento de ligações de dissulfureto dos polipéptidos reduzidos são, por exemplo, o oxigénio do ar, que é introdu zido através de uma solução aquosa de polipéptido, que contém adicionada, eventualmente, uma quantidade catalítica de um sal = 10 «s

de metal de transição, por exemplo, sulfato de ferro (ill), cio reto de ferro (ill) ou sulfato de cobre (li); iodo, por exemplo, também sob a forma de aducto de iodeto de potássio Kl que, de preferência, é empregado sob a forma de uma solução alcoólica, por exemplo, metanólica, ou aquoso-alcoólica, por exemplo, aquoso-metanólica; hexacianoferrato (ill) de potássio em solu ção aquosa; 1,2-di-iodo-etano ou o éster de dimetilo ou o éster de dietilo do ácido azo-dicarboxílico, que se faz reagir no seio de água ou de uma mistura que consiste em água e um álcool miscível com água, por exemplo, metanol. A oxidação realiza-se, es pecialmente, à temperatura ambiente.

A separação dos reagentes, em especial dos eais e dos agentes de oxidação ou de redução e dos seus produtos da reacção, do composto pretendido, realiza-se de acordo com métodos em si conhecidos, por exemplo, por filtração por se paração de peso molecular, por exemplo, em Sephadex ou Biogel.

Podem utilizar-se todas as modificações que actuem de maneira semelhante como os receptores naturais de aoordo com a presente invenção. Os produtos que se podem obter desta forma como, por exemplo, os anticorpos, bem assim como as suas modificações, estão incluídos no âmbito da presente invenção.

receptor de acordo com a presente invenção é solúvel, de maneira que pode ser administrado e utilizado facilmente.

Porém, é também possível ligar os receptores a um suporte sólido e empregá-los sob esta forma para fins de diagnóstico e de preparação. Como suportes, interessam todos os suportes sólidos, como poliestireno, vidro, dextranos, mas também membranas biológicas e vesículas de lípidos.

É ainda possível ligar aos receptores marcado res radioactivos usuais e empregar sob esta forma para fins de diagnóstico. É ainda possível empregar os receptores para o tra tamento terapêutico de infecções provocadas por vírus.

Desde que os receptores de acordo com a pre= 11 =

Como marcação, interessa, por exemplo, marcação radioactiva, uma enzima ou um grupo fluorescente.

Na utilização terapêutica dos receptores de acordo com a presente invenção, estes podem ser injectados numa forma correspondentemente muito purificada, de modo que eles en tão inibam competitivamente com o receptor natural. De preferên cia, para esta finalidade, empregam-se receptores solúveis. As soluções deste tipo podem também ser utilizadas para o diagnóstico e para o diagnóstico diferencial.

É de muito especial interesse a utilização dos receptores de acordo com a presente invenção para a prepara ção de anticorpos policlonais e/ou monoclonais que actuam especificamente contra os receptores que se encontram nas membranas das células. Os anticorpos deste tipo podem, em primeiro lugar, ser também utilizados como agentes de diagnóstico para a preparação e a determinação dos receptores em células ou em material biológico de células. Podem ainda ser empregados terapeuticamen te para o bloqueio dos receptores nas células das membranas.

Eles abrem, portanto, vias e possibilidades completamente novas.

Legendas das Figuras

Figura 0

Solubilização dos receptores com diferentes detergentes (A s vírus nat.; B : vírus desnat.).

Figura 1

Cromatografia por permeametria de gel do res» 12

ceptor solubilizado numa coluna de Superose 6 HR 10/30. Membranas equivalentes a 10 células foram solubilizadas em OG (fosfa to de sódio de pH 7,4 15 mMj NaCl 150 mM; MgCl₂ 1 mM; CaCl₂ 1 mM (PBS) com 1$ de octil-glucósido), aplica-se a uma coluna com ml de Lens culinaris e elui-se o material absorvido com solução de c( -D-metil-glucósido 1 M em 0G. 0 eluído foi concentrado num tubo Centricon a 0,5 ml e aplicado na coluna Superose. A co luna foi desenvolvida com 0,2 ml/minuto de OG e colectaram-se fracções de 0,5 ml. Estão indicadas a actividade de ligação das fracções individuais, as posições das proteínas marcadoras (determinadas numa experiência separada) e a extinção a 280 nm.

) Figura 2

Centrifugação do receptor solubilizado com um gradiente de açúcar. Concentrou-se o material que foi eluído da coluna de L, culinaris (ver legenda da Figura 1) e separou-se com um gradiente de 10 - 40$ de açúcar em OG. Estão indicadas a actividade de ligação das fracções (0,4 ml), a posição da catalase das proteínas marcadoras (Cat) e de aldolase (Ald), assim como a extinção a 280 nm.

Cromatografia de permuta de aniões Mono Q. As fracções 14 a 16 da cromatografia de permeametria de gel (Fi. gura 1) foram tratadas com Neuraminidase e separou-se o material por meio de FPLC sobre Mono Q. A actividade de ligação das fracções individuais (0,5 ml), a extinção a 280 nm e o decurso do gradiente são indicados.

Figura 4

Detecção do receptor em manchas de Western.

A actividade de ligação de vírus da coluna de permutação de aniões Mono Q foi aplicada a uma coluna de Superose 6 HR 10/30. Obtiveram-se fracções com 1,2 ml. As proteínas foram processadas como Α₂θθ; as posições (a) de marcadores de proteínas (Tiroglo, bulina, 670 k; Apoferritina, 440 k; β -amilase, 200 k) são tam= 13 =

ί

bém indicadas. As proteínas nas fracções da coluna de Superose foram concentradas e aplicadas em três geles de poliacrilamida- I -6% de SDS. Um gel foi corado com Azul de Coomassie (b), as pro^ teínas do segundo e do terceiro geles foram aplicadas a membrana de nitrocelulose (c, d). Incubou-se a mancha com HRV2 marca-; do com ⁹S em ausência (c) ou em presença (d) de um excesso de i HRV2 não marcado; as posições das proteínas marcadoras (2-Macroglobulina, 180k; β -galactosidase, 116k; frutose-6-fosfatoquinase, 84k); e as bandas do receptor são marcadas com setas.

Figura 5

Auto-radiografia de manchas de Western, que foram obtidas a partir das fracções com actividade de ligação de vírus da coluna de Superose reunidas (ver Figura 4). Incuba35 ram-se as manchas com HRV2 marcado com S. As amostras antes da aplicação sobre o gel foram incubadas com SDS à temperatura ambiente, vestígio 1; a amostra foi aquecida a ebulição em SDS, vestígio 2; a amostra foi incubada com ditiotreitél 10 mM, vestígio 3; uma mancha idêntica ao vestígio 1 foi incubada com HRV? marcado com ^JS em presença de EDTA 10 mM, vestígio 4; ou foi

E Q incubado com HRV2 marcado com o que foi aquecido a 56 C durante dez minutos, vestígio 5.

Materiais

1-0-n-octil- β-D-glucopiranósido, Tween 40 e 3-(3-cloramidopropil)-dimetilamónio-l-propano-sulfonato (CHAPS) foram adquiridos em Sigma.

N-tetradecil-N,N-dimetilamónio-3-propano-sulfonato (Zwittergent 3 - 14) foi adquirido em Serva. Os outros detergentes foram fornecidos por Merck. A tripsina foi fornecida por Miles e a ³³S-metionina (1350 Ci/mMole) foi fornecida por Amersham.

EXEMPLOS

Exemylo 1

Preparação dos Vírus

Cultivaram-se e purificaram-se HRV2, HRV49 = 14 =

e HRV89 em suspensão de células HeLa essencialmente como se desj creveu (13). A título de exemplo, referem-se, na presente Memó-j ria Descritiva, as operações de cultura, isolamento e purifica-! ção de HRV2.

Desenvolveram-se células HeLa (estirpe HeLa-] -Ohio, 03-147, Flow Laboratories, Inglaterra) em suspensão a i 37° θ. 0 meio de suspensão (D. C. Thomas, R. M. Conant e V. U. Haparian, 197θ, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 133. 62 - 65? E. J. Stott e G. F. Heath, 1970, J. Gen. Virol., 6, 15 - 24) consistia numa modificação de Joklik de MEM para suspensão (Gibco O72-I3OO) e 7% soro de cavalo (Seromed 0135)· A densidade de inoculação foi de 5 - 10 x 10^ células/ml, o volume foi de 500 ml.

Centrifugou-se a suspensão com uma concentra ção de células de 1 x 10^ células/ml em condições estéreis a 300 g durante dez minutos. 0 sobrenadante foi filtrado sob sucção e ressuspenderam-se as células em 100 ml de meio de infecção (modificação de Joklik de MEM para a cultura em suspensão com 2% de soro de cavalo e MgClg 2 mM). Por observação cuidadosa repetida várias vezes numa pipeta de 20 ml, as células foram distribuídas homogeneamente no meio de infecção. Em seguida, di_ luíu-se até perfazer 500 ml. Em seguida, aqueceu-se a suspensão de células a 34° C e infectou-se com HRV2 (purificado em placa por duas vezes) com uma multiplicidade de 0,1 vírus/célula. A estirpe de HRV2 foi adquirida na American Type Culture Collection (ATCC VR-482 e VR-1112). A estirpe utilizada foi neutralizada por meio de anti-soro contra HRV2 (American Type Culture Collection, Cat No. ATCC VR-1112 AS/GP).

Como soro de controlo, serviu um anti-soro contra HRV (Cat. No, ATCC VR-1117 AS/GP) que não mostrou nenhuma neutralização. Depois de sessenta horas a 34° C, fez-se a co lheita do vírus. 0 vírus foi recuperado tanto a partir das célu las ou dos fragmentos das células como também a partir do meio.

Para esta finalidade, o meio foi separado das células infectadas e dos fragmentos das células por centrifugação durante dez minutos a 1500 g e o sobrenadante filtrado sob « 15 ⁸⁸

sucção. 0 precipitado foi congelado a -70° C.

Reuniram-se os precipitados de células de 12 /

litros de cultura em suspensão, ressuspendeu-se em 40 ml de tam pão TM (trie/HCl 20 mM; ph 7,5; MgClg 2 mM) , colocou-se durante quinze minutos em gelo, em seguida abriram-se as células com um homogeneizador de Dounce e centrifugou-se a mistura durante trinta minutos a 6 000 g. Em seguida, lavou-se o precipitado mais uma vez com 10 ml de tampão de TM. Reuniram-se os dois sobrenadantes e centrifugaram-se a 110 000 g durante três horas, para peletizar o vírus. Em seguida, tomou-se o pelete de vírus em 10 ml de tampão KTMP (KC1 50 mM, Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, MgClg 5 mM, mercapto-etanol 2 mM, puromicina 1 mM, GTP 0,5 mM) e, depois da adição de 150 jug de DNase I (Sigma) isenta de ribt> nuclease, incubou-se durante uma hora em gelo.

A partir do meio de infecção, precipitou-se o vírus sob agitação a 4° C com polietileno-glicol 6 000 (PEG 6000; Merck) a uma concentração de 7% ® NaCl 450 mM B, D. Korant K. Lonberg-Holm^.Noble e J. T. Stasny, 197², Virology 48. 71 - 86). Depois de quatro horas a frio, centrifugou-se o vírus a 1 500 g durante trinta minutos, ressuspendeu-se o precipitado em 10 ml de tampão KTMP que continha 75 pg de DNase I, incubou-se a mistura durante uma hora sob gelo e, em seguida, congelou -se a -70° C.

Incubou-se durante cinco minutos a 37° C a suspensão dos vírus que foram obtidos a partir das células e do meio, arrefeceu-se por adição de 60 ml de tampão de TE frio (Tris/HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM) e, em seguida, submeteu-se a ultra-sons em banho de gelo durante cinco minutos.

Em seguida, centrifugou-se a 6 000 g durante trinta minutos. Ao sobrenadante adicionaram-se 920 ml de tampão TE que continha 7% de PEG 6 000 e NaCl 450 mM, agitou-se cuidadosamente a 4^o C durante quatro horas e peletizou-se o precipitado assim obtido por centrifugação durante trinta minutos a 6 000 g. Retomou-se o precipitado em 100 ml de tampão TE, preci pitou-se o vírus como se referiu acima por adição de PEG 6 000 e NaCl e peletizou-se, Ressuspendeu-se o precipitado em 40 ml de =

tampão TM, centrifugou-se a suspensão a 6 000 g durante trinta minutos e peletizou-se os vírus durante três horas a 110 000 g. Dissolveu-se o precipitado em 1 ml de tampão de TM, incubou-se a 4 C durante uma hora depois da adição de 5° pg ^d® DNase Te, i em seguida, adicionou-se 1 ml de tampão de TE. Para posterior purificação, centrifugou-se a suspensão de vírus com gradiente de sacarose (10 - 30$ em peso/peso em tampão de TE) durante qua tro horas a 4° C a 110 000 g.

Por meio da extinção a 26o nm, determinaram-se as fracçães que continham o vírus e diluiram-se com tampão de TM, de modo que a concentração final em sacarose fosse igual a 10$. Em seguida, centrifugou-se durante oito horas a 85 000 g. Retomou-se o pelete de vírus em 1 ml de tampão de TM e guardou-se a -70° C. Para ensaiar a pureza da preparação de vírus, rea lizou-se um ensaio de electroforese no gel de poliacrilamida a 12,5$ em presença de 0,1$ de dodecil-sulfato de sódio (Laemmli, U. K., 1970, Nature (Londres) 277. 680 - 685) e coraram-se com Azul Brilhante de Coomassie as bandas da proteína.

Exemplo 2 _s

Prep&ra.ç&o de Tipo de Soro 2 de Rhinovirus Humano Marcado com ³⁵S-Metionina (HRV2)

Em cápsulas de Petri de 165 centímetros quadrados, infectaram-se duas monocamadas de células HeLa com um MOI (multiplicidade de infecção) de 40 com HRV2 durante uma hora a 34° C, em meio de MEM isento de metionina (Gibco), com soro de feto de vitela dialisado a 2$ (Flow).

As células foram lavadas duas vezes com PBS e continuou-se a incubação a 34° C em meio fresco. Depois de três horas, a cada monocamada adicionou-se 1 mCi de S-metionina (135O Ci/mmol, Amersham) e continuou-se a incubar durante o tempo total de vinte e quatro horas. 0 meio das células infectadas e os fragmentos de células foram separados por centrifugação a I5OO g durante dez minutos e filtrou-se por sucção. Congelou• -se o precipitado a -70° C em 5 ml de Tris 10 mM, EDTA 10 mM, = 17 =

ρΗ 7,5 (Tris/EDTA) e descongelou-se de novo. Reuniram-se o sobre nadante e o precipitado congelado/derretido e centrifugou-se duj rante trinta minutos a 45 000 g. 0 sobrenadante desta centrifuga ção foi centrifugado durante duas horas a 140 000 g. Ressuspendeu-se o pelete de vírus em 300 μΐ de Tris/EDTA e purificou-se o vírus por meio de um gradiente de sacarose 10 - 30%. Analisaram-se as fraeções individuais do gradiente por meio de electrofore se com SDS em 12% de gel de poliacrilamida. Reuniram-se as fracções do vírus puro e guardaram-se em presença de 1% de BSA (albumina de soro bovino) a 4° C, durante um máximo de quatro semanas .

Para se eliminar os vírus com estrutura de eápside alterada a partir das preparações do Exemplo 1 e do Exem pio 2, incubaram-se 20 pl de imuno-adsorvente que continha anticorpos monoclonais contra os determinantes C, por exemplo, mAK 2G2, com o vírus purificado durante trinta minutos e peletizou-se antes de se retirarem as amostras dos vírus.

Preparação do Imuno-Adsorvente

Suspenderam-se células de Staphyloeoccus aureus (BRL) em água de modo a obter-se uma suspensão a 10% em peso/peso. Lavaram-se as células por duas vezes com PBS, adicionou -se 1/5 de volume de soro com IgG de coelho anti-rato (Behring); incubou-se a suspensão durante uma hora à temperatura ambiente. Lavaram-se as células duas vezes com PBS e, de novo, incubaram-se durante uma hora com 1/5 de volume de líquido de ascites de rato que continham anticorpos monoclonais contra os determinantes C (por exemplo, mAK 2G2). Depois de se lavar por duas vezes, peletizou-se, ressuspendeu-se o pelete em PBS (10% em peso/peso) e adicionou-se às preparações dos vírus radioactivos.

Exemplo 3

Solubilização do Receptor de Células HeLa

Cultivaram-se células HeLa (estirpe HeLa-Ohio, 03-147, Flow Laboratories, Inglaterra) em suspensão a 37° • C. 0 meio de suspensão (D. C. Thomas, R. M. Conant e V. U. Hampa s: 18 S

rian, 1970» Proc, Soc, Exp. Biol, Med., 133, 62 - 65; E. J. Stott e G.F. Heath, 1970, J. Gen. Virol., 6, 15 - 24) consistia numa modificação de Joklik de MEM para suspensão (Gibco 072-1300) e 7% de soro de cavalo (Seromed 0135). A densidade de ino culação foi igual a 5 - 10 x 10^ células/mililitro e o volume 500 ml.

Centrifugou-se a suspensão com uma densidade de células de 1 x 10^ células/ml, sob condições estéreis, durante dez minutos, a 300 g. Filtrou-se sob sucção o sobrenadante e lavaram-se as células por duas vezes com solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato (PBS). Suspenderam-se 10~ células em 20 ml de tampão isotónico (HEPES-KOH 10 mM, pH 7,9, KC1 140 mM, MgClg 1,5 mM, EDTA 0,5 mM e fluoreto de fenil-metil-sulfonilo 0,2 mM) e abriram-se a frio com duzentos golpes de um homogeneizador de Dounce de 50 ml. Centrifugaram-se os núcleos das células por centrifugação durante três minutos a 1 000 g. Purifica ram-se as membranas com o auxílio de um método em duas fases (3). As membranas que correspondiam a 2 x 10 células por milili tro foram retomadas em PBS e armazenadas em azoto líquido. Para a solubilização, suspenderam-se 2 x 10 equivalentes de células em 1 ml de solução de octil-glucósido a 1% em PBS (OG) e separou-se o material insolúvel por centrifugação a 80 000 g durante uma hora. 0 resíduo foi utilizado para a cromatografia em coluna

Exemplo 4

Ensaio de Ligação do Filtro

As fracções das cromatografias em coluna para ensaiar relativamente à actividade foram aplicadas num aparelho de manchamento (Bio-Rad) sobre uma membrana de nitrocelulose (BA85, Schleicher und Schull). As amostras foram deixadas infiltrar à temperatura ambiente. Em seguida, foram filtradas sob suc ção os restos de líquido sob ligeiro vácuo produzido por tromba de água e saturaram-se os locais de ligação não específicos da proteína com 2% de albumina de soro de vitelo (BSA) em PBS, a o 5

C durante a noite. 0 filtro foi, em seguida, incubado com 10 cpm de HRV2 marcado com ^^S-metionina em 1% de Tween 40, desoxi19 ^e

colato de sódio a 0,5% e 3-(3-colamidopropil)-dimetilamónio-l-propano-sulfonato 10 mM em PBS, durante uma hora. As membranas foram lavadas por duas vezes com BSA a 2% em PBS, secaram-se e cortaram-se áreas redondas das correspondentes amostras; mediu-se a radioactividade com um contador de cintilação de líquidos.

Como controlo

HRV2 antes da incubação do filtro minutos a 5^° C (8). Depois deste tar nenhuma ligação a nenhuma das concluíu-se que a ligação de HRV2 se deve a uma interacção específica do vírus com o receptor.

da especificidade, aqueceu-se de nitrocelulose durante dez tratamento, não se pode detecamostras (Figura 18). Daqui nativo a material imobilizado

Exemplo 5

Cromatografia de Afinidade em Colunas de Lectina de Lens culi naris *

Solubilizaram-se 10 equivalentes de células descreveu e aplicaram-se a uma coluna de L. culinaris que foi equilibrada com OG. Lavou-se a coluna com 5 ml eluíu-se o material ligado com 2 ml de solução de -D0 ensaio de ligação mostrou que quarecuperados, em tro eliminada.

como se (1 ml), de OG e -metil-glucósido 1 M em OG.

se 100% da actividade de ligação puderam ser ca do que cerca de 90% da proteína total foi

Exemplo 6

Cromatografia de Permeametria de Gel

L.

culinaris foi conde kD) até 0,5 ml e sepa(equilibrada com tampão eluído da coluna centrado com tubos Centricon (exclusão rou~se numa coluna Superose 6 HR 10/30 de OG) com o auxílio de FPLC (Pharmacia). Por comparação com as proteínas marcadoras, pode determinar-se o peso molecular do receptor activo como sendo igual a 450 kD. Simultaneamente, foi possível separar a maior parte das proteínas contaminantes (Figura 1).

= 20 =

Exemplo 7

Centrifugação com Gradiente de Açúcar

Receptor purificado em L, culinaris (como se descreveu acima) foi aplicado a um gradiente de açúcar (10 - 40$ em OG) e centrifugou-se durante oito horas a 3θ 000 rpm a 4° C. Determinou-se o máximo de actividade na posição do gradien te que corresponde à constante de sedimentação de 28,4 S. Determinaram-se as posições das proteínas marcadoras no outro gradien te (Figura 2) com base na presença de detergentes que sedimentaram o marcador com coeficientes de sedimentação calculados de 15,0 S e 21,9 S (7,3 S e 11,3 S em ausência de detergentes).

Exemplo 8

Cromatografia com Permuta de Aniões

Em ensaios prévios, verificou-se que o recep tor de colunas Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) não podia ser eluído. Portanto, tratou-se o receptor previamente purificado por L. culinaris e permeametria de gel com 1 U de neuraminidase/mg de pro teína durante sessenta minutos a 37° θ, para eliminar os grupos de ácido neuramínico fortemente ácidos. A amostra foi em seguida diluída duas vezes com tampão de fosfato de sódio 10 mM de pH 7 e octil-glucósido a 1% e aplicado a uma coluna Mono Q. A coluna foi desenvolvida com um gradiente de NaCl 0 a 1 M no mesmo tampão. A actividade de ligação pode ser detectada como o pico mais largo a cerca de 250 mM de NaCl (Figura 3).

Exemplo 9

Isolamento e Purificação do Receptor

Dissolveram-se membranas de plasma de 2 x 10⁹ células HeLa em 5 ml de PBS que continha 1$ em peso/volume de 1-0-n-octil- p-D-glucopiranósido e 0,01$ em peso/volume de ca da um de L- e(-p-tosil-L-lisino-clorometil-cetona (TLCK), L-l-tosilamido-2-fenil-etil-clorometil-cetona (TPCK) e fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) (todos fornecidos por Sigma), durante = 21 =

dez minutos à temperatura ambiente. Centrifugou-se o material insolúvel durante trinta minutos a 30 000 rpm numa centrífuga de Beckmann 65 de rotor de ângulo fixo. 0 resíduo foi colocado numa coluna de 25 ml de lectina de L. culinaris que foi equilibrada com OG (PBS, 1% em peso/volume de octil-glucósido) e eluíu -se o material ligado com 5 ml de OG que continha o(-metil-glucósido 1 molar. 0 eluído foi saturado até 50% com o mesmo volume de solução saturada de sulfato de amónio. Dissolveu-se o material que precipitou em 2 ml de tampão A (Tris/HCl 10 mM de pH 7,5, EDTA 5 mM, octil-glucósido a 1% em peso/volume) e pulverizou-se numa coluna de permuta de aniões Mono P que estava ligada a um sistema de FPLC (Pharmacia).

As proteínas foram separadas com o auxílio de um gradiente de 0 até 100% de tampão B (como o tampão A, mas contendo NaCl 1,5 M). Reuniram-se as fracções que continham actividade de ligação de vírus, concentrou-se até 0,5 ml com um tubo Centricon e separou-se numa coluna Superose 6 que foi equilibrada com OG que continha EDTA 5 mM. A concentração em proteína foi controlada por meio da extinção a 280 nm (Figura 4a).

Concentraram-se as fracçães desta coluna até ao volume de 50 microlitros, misturaram-se com 0,1% em peso/volume de SDS e separaram-se partes alíquotas em três geles de poliacrilamida a 6% que continham EDTA 5 mM (21). As proteínas separadas no gel foram em seguida ou coradas com Azul de Coomassie (Figura 4b) ou passadas electràforeticamente para uma memE brana de nitrocelulose (22) que foi incubada com 4 x 10^ cpm de HRV2 marcado com ³³S (ver acima). Secou-se a nitrocelulose e auto-radiografou-se (Figura 4c).

Como controlo para uma ligação específica, incubou-se uma réplica de nitrocelulose preparada de maneira idêntica, em presença de um excesso de cinco vezes de HRV2 não marcado (Figura 4d). Verificou-se que as fracçôes 6 e 7 da coluna de Superose continha material que podia ligar HRV2 se fosse passado para nitrocelulose.

A auto-radiografia mostra algumas bandas com um peso molecular detectável maior do que 300 kD adicionalmente = 22 =

a uma posição que corresponde a cerca de 120 kD comparado com proteínas marcadoras que foram desenvolvidas sobre o mesmo gel (Figura 4c). Só esta banda de 120 kD desaparece nos controlos que contém o excesso de vírus não marcado (Figura 4d) e mostra acção de troca específica desta proteína com HRV2. 0 gel de po- ! liacrilamida que contem amostras idênticas e foi corado com Azul de Coomassie mostrou uma banda muito fraca numa posição que corresponde às bandas radiactivas da mancha de Western. Esta banda encontra-se exclusivamente nas amostras das fracções 6 e 7 que apresentaram actividade de ligação de vírus (Figura 4b).

Exemplo 10

Ensaios de Ligação

A preparação repetida de um receptor activo depende da existência de condições suaves; por exemplo, o aquecimento à ebulição*-em SDS destrói irreversivelmente a actividade (ver Figura 5, colunas 1 e 2).

Se a preparação do receptor é incubada com ditiotreitol 10 mM antes da aplicação sobre o gel, não se pode observar qualquer ligação (Figura 5, coluna 3).

Como as acções específicas de troca dos Rhinovirus com os seus receptores depende da presença de catiões bivalentes (12), incubou-se a mancha de uma amostra que era idêntica à aplicada ao vestígio 1 (Figura 5) com vírus em presença de EDTA. Nestas condições, não se conseguiu observar nenhuma ligação (Figura 5, coluna 4).

Como outro ensaio, realizou-se a incubação da membrana de nitrocelulose com HRV2 aquecido a 56° C. Este tratamento originou alterações estruturais da cápside do vírus, que impossibilita a ligação do vírus à superfície de células HeLa (23). Como se pode ver na Figura 5, coluna 5, nestas condições não se verifica qualquer ligação.

= 23 =

TABELA I

Sensibilidade do Receptor de Grupos de Rhinovirus Pequenos

Tratamento prévio do grupo de	Ensaio	de Ligação
receptores pequenos solubilizado	(percentagem de ac
	tuação	da ligação)
Nenhum tratamento prévio		100
10 pg de tripsina		6
50 mU de Neuraminidase		170
10 mM de ditiotreitol		15
10 mM de iodoacetamida		80
10 mM de periodato de sódio		70
10 mM de EDTAa		5

Todas as pré-incubações se realizaram a 37° C, durante trinta minutos.

Observação : (a) nenhum tratamento prévio; em vez disso, realizou-se a incubação com HRV2 marcado, em presen ça de EDTA 10 mM.

TABELA II

Competição de Vários Serotipos de Rhinovirus para o Receptor de Grupos Pequenos

Competição do HRV2 radiactivo marcado com	Ensaio de Ligação (percentagem de acção de ligação)
nada	100
HRV2	13
HRV89	95

= 24 =

Competição do HRV49 radiactivo marcado com nada

HRV2

HRV89

Incubaram-se os filtros como se descreveu com um excesso de vírus não marcados igual a vinte vezes.

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - IS Processo para a preparação de receptores do grupo dos receptores pequenos com actividade de ligação a Rhino virus, caracterizado pelo facto de

   a) se isolarem membranas de células, de preferência células HeLa e se purificarem,

   b) se solubilizar os receptores existentes nas membranas com detergentes, de preferência Triton X100, CHAPS, Zwittergent, octilglucésido ou DOC, de preferência especial octilglucósido, = 27 =

   c) se eliminar os componentes insolúveis e

   d) se purificar os receptores por cromatografia, de preferência, numa coluna contendo Concanavalina-A/Sepharose, Rícino/Sephadex, Concanavalina-A/lectina de Lens culinaria ou Rícino/lectina de Lens culinaria.

   - 2* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se cromatografar os receptores, depois de tratamento com Neuraminidase, numa coluna contendo resina permutadora de aniões, de preferência, numa coluna Mono Q.

   - 3* -

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de, a seguir à primeira purificação por cromatografia, se realizar uma segunda purificação por cromatografia numa coluna contendo Superose.

   - 4> -

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o receptor obtido ter um peso molecular determinado por cromatografia de permeametria de gel igual a cerca de 450 kD.

   - 5« -

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de a constante de sedimentação do receptor, determinada por centrifugação em gradiente de açúcar em presença de detergentes corresponder a cerca de 28,4 S.

   _ 6? —

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 4 e 5, caracterizado pelo facto de o receptor obtido ser ligado por lectina de Lens culinaria.

   - 7# -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 6, caracterizado pelo facto de o receptor obtido não ser ligado por heparina/Sepharose.

   = 28 * cações 1 β 4 a 7, caracterizado pelo facto de o receptor obtido ί ligar irreversivelmente um permutador de aniões. Ϊ í

   - 9* - !

   Processo de acordo com qualquer das reivindi- | cações 1 e 4 a 8, caracterizado pelo facto de a sua actividade de ligação ser insensível em frente de Neuraminidase.

   - 10* -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 9, caracterizado pelo facto de o receptor obtido consistir em sub-unidades que são associadas por pontes de dissulfureto intermoleculares.

   - 11* Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 10, caracterizado pelo facto de o receptor obtido em presença de EDTA não apresentar ligação a Rhinovirus.

   _ 12* Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 11, caracterizado pelo facto de actividade de ligação a Rhinovirus ser apenas pouco influenciada por iodoacetamida.

   - 13* -

   Processo para a preparação de sub-unidades de receptor das reivindicações 1 e 4 a 12, caracterizado pelo facto de se reduzir completamente o receptor de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 12.

   - 14* -

   Processo para a preparação de receptor, caracterizado pelo facto de este consistir em, pelo menos, duas unidades do receptor de acordo com a reivindicação 13 e não ser o receptor natural.

   « 29 «

   - 15- Processo para a preparação de receptor, caracterlzado pelo facto de este poder ser preparado por redução do receptor de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 12,

   - 16» Processo para a preparação de um receptor de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 12, caracterizado pelo facto de se fazer por tratamento com enzimas e/ou com produtos químicos que não são mencionados em qualquer das reivindicações anteriores.

   - 17» -

   Processo para a preparação do receptor, caracterizado pelo facto de se oxidar pelo menos duas sub-unidades de receptor de acordo com a reivindicação 13.

   - 18» -

   Processo para a preparação das sub-unidades de receptor <e acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se reduzir o receptor de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 12,

   - 19» -

   Processo para a preparação de receptor, caracterizado pelo facto de se oxidar pelo menos duas sub-unidades de receptor de acordo com a reivindicação 16.

   - 20» -

   Processo para a prova qualitativa e/ou quantitativa de Rhinovirus, caracterizado pelo facto de se empregarem receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17.

   - 21» Processo para a caracterização analítica ou purificação de Rhinovirus, caracterizado pelo facto de se empregarem receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17.

   = 30 =

   - 22#

   Processo para o diagnóstico, caracterizado pelo facto de se empregarem receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17.

   - 23# -

   Processo para a preparação de anticorpos policlonais e/ou monoclonais, caracterizado pelo facto de se empregarem receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17.

   _ 24# Processo para o tratamento terapêutico ou profilático do organismo humano ou de animais, caracterizado pelo facto de se utilizar os receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17.

   - 25# -

   Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento terapêutico, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade activa de um receptor quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17 numa substância veicular e/ou auxiliar farmaceuticamente inerte.

   - 26# -

   Processo para a determinação qualitativa e/ou quantitativa de um dos receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17, caracterizado pelo facto de se utili zar os anticorpos monoclonais ou policlonais que neutralizam especificamente os receptores de acordo com qualquer das reivin dicações 1 e 4 a 17 total ou parcialmente ou se ligarem especificamente a um dos referidos receptores.

   - 27# Processo para a purificação dum dos receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17, caracteri zado pelo facto de se utilizar os anticorpos monoclonais e/ou • policlonais que neutralizam especificamente os receptores de

   - 31 24Ί acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17 total ou parcialmente ou se ligarem especificamente a um dos referidos receptores,

   - 28^ Processo para a preparação de anticorpos monoclonais que neutralizam total ou parcialmente especificamente os receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 4 a 17, ou se ligam especificamente a um dos referidos receptores, caracterizado pelo facto de se imunizarem animais hospedeiros com um dos receptores de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 21, se fundirem B-linfécitos destes animais hospedeiros com células de mieloma, se subclonar linhas de células híbridas que segregam os anticorpos monoclonais e se cultivarem in vitro ou in vivo.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 14 de Abril de 1987, sob ο η?. P 37 12 678.4.