NO173298B

NO173298B - Anvendelse av karbohydratforbindelse med virusbindende egenskaper for in vitro diagnose av virusinfeksjoner eller for fremstilling eller isolering av viruspartikler eller virusoverflatekomponenter

Info

Publication number: NO173298B
Application number: NO86863646A
Authority: NO
Inventors: Karl-Anders Karlsson; Erling Norrby; Goeran Wadell
Original assignee: Symbicom Ab
Priority date: 1985-01-14
Filing date: 1986-09-12
Publication date: 1993-08-16
Also published as: IE860075L; AU5351386A; DK17885D0; IE59036B1; FI93227B; NO863646L; WO1986003971A1; NO863646D0; EP0207984B1; US4859769A; AU580136B2; NO173298C; JPS62502260A; FI863702A; US4980462A; FI863702A0; EP0207984A1; CN86100608A; IL77603A; FI93227C

Description

Oppfinnelsen angår anvendelse av visse forbindelser med virusbindende egenskaper for in vitro diagnose av virusinfeksjoner eller for fremstilling eller isolering av viruspartikler eller virusoverflatekomponenter.

Til tross for den utstrakte skade på dyr innbefattet

mennesker og planter, som forårsakes av vira, har man hittil ikke funnet noen generell rasjonell terapi mot virusinfeksjoner som kan sammenlignes med f.eks. antibiotisk behandling av bakterieinfeksjoner. Skjønt i visse tilfeller

en profylaktisk metode i form av en vaksine som bevirker immunisering, og i de fleste tilfeller, produserer motstand mot reinfeksjon for resten av livet med hell er blitt benyttet, har det ikke alltid vært mulig å utvikle en vaksine med tilstrekkelig vid anvendelighet til å være virkningsfull mot en rekke forskjellige stammer av den samme virusart, og dette har f.eks. vært et problem med de influensavaksiner som hittil er blitt fremstilt, slik at immunisering har funnet sted mot den spesielle stamme som vaksinen har vært basert på, men ikke mot andre nær beslektede stammer med litt forskjellige antigene egenskaper.

I de senere år har betydningen av en rekke biologiske interaksjoner av såkalte reseptorer vært gjenstand for økende oppmerksomhet. Reseptorer, som ofte er glykolipider eller glykoproteiner, det vil si består av et karbohydratparti koblet til et lipid eller et protein, danner integrerte deler av plasmamembranen av dyre- og planteceller, idet de er anordnet på overflaten av cellemembranen på en rekke forskjellige celler. Deres funksjon som spesifikke reseptorer for et vidt område biologiske enheter er ualminnelig mangeartet. Fordi deres karbohydratparti eksponeres på overflaten av cellemembranen, kan de ha antigene egenskaper eller fungere som celleoverflatemarkører, de kan meddele strukturell stivhet til det ytre monolag av membranens lipid-dobbeltlag (bilayer); de kan danne en del av et system for celle/celle-interaksjon og -gjenkjennelse, eller de kan spille en rolle i interaksjonen av cellen med bioaktive faktorer, såsom bakterielle toksiner, glykoproteinhormoner eller mikroorganismer, idet de forankrer disse til celleoverflaten. F.eks. er det kjent at der er en forbindelse mellom slike reseptorer og bakterieinfeksjoner, idet reseptoranaloger kan benyttes til å inhibere den bakterieved-hefting som er nødvendig for å bevirke en infeksjon.

For at en virusinfeksjon skal bli etablert, må virusgenomet trenge inn i vertscellen. For noen membranomsluttede vira (som har en membran rundt nukleokapsidet), er denne prosess kjent å omfatte en totrinnsmekanisme, nemlig den sekvensielle festing til og penetrasjon inn i vertscellen (se henvisning 1; i listen av henvisninger gitt nedenunder i avsnittet med tittelen "Litteraturfortegnelse"). Det er kjent at festingen skyldes en reseptor anordnet på overflaten av målceller for virusinfeksjon (se henvisning 3). Det har i alminnelighet vært antatt at penetrasjonstrinnet er en logisk følge av festingen, hvilket produserer spontan fusjon på overflatemembranen eller penetrasjon etter reseptorbevirket endocy-tose. I noen tilfeller har en andre interaksjon vært tatt i betraktning, men denne er av en mindre spesifikk type enn festingen, hovedsakelig en hydrofob interaksjon med membranens indre (se henvisning 2). I løpet av det forsknings-arbeide som har ført til den foreliggende oppfinnelse, er det imidlertid overraskende funnet at stikk i mot hva man skulle vente, hva visse vira angår, så er den andre binding spesifikk og kan tilskrives en spesiell substans med definerbare kjemiske karakteristikker. Denne bindende substans kan derfor sammenlignes med de kjente førstetrinns-reseptorer (se henvisning 3) som formidler festing av viruset til vertscellen, og er analogt betegnet som annettrinns-reseptoren. Det virker sannsynlig at både førstetrinns- og annettrinns-reseptorene er nødvendige på en celle for at infeksjon skal finne sted. Den viktigste forskjell mellom de to reseptorer er at førstetrinns-reseptoren foreligger på den spesifikke celletype som er tilbøyelig til å bli infisert med en spesiell art virus, mens annettrinns-reseptoren foreligger på alle celler som er innfallsporter for virusinfeksjoner

generelt (dvs. denne reseptor er ikke spesifikk for en spesiell virusart). Således velger et virus sin vertscelle

eller -vev ved hjelp av førstetrinns-reseptoren, men benytter en generelt tilgjengelig reseptor for penetrasjon.

Det antas videre at annettrinns-reseptoren er nødvendig for virusets overlevelse. Uten membranpenetrasjon inn i cyto-plasmaet ville den festede viruspartikkel før eller senere bli nedbrutt i lysosomene ved cellens effektive rengjørings-maskineri. Annettrinns-reseptorens bindingsegenskap antas derfor å være en høyt bevart (genetisk stabil slik at den ikke forandrer seg, i motsetning til de antigene egenskaper av viruset) egenskap av viruset, uansett beskaffenheten av førstetrinns-reseptoren.

Et argument som understøtter nærværet av annettrinns-reseptoren er det faktum at en hydrofob del av viruset, f.eks. en hydrofob peptidsekvens, såsom den peptidsekvens som utgjør bindingssetet på virusen, ikke spontant kan trenge inn i vertscellemembranen på grunn av membranens naturlige motstand. Den naturlige overflatemembran er konstruert for å unngå ikke-regulert opptak av hydrofobe og andre stoffer. Dette ville ellers i alvorlig grad virke negativt forstyrrende inn på membranfunksjonene. Mange regulatoriske stoffer i organismen, såsom hormoner, er hydrofobe, og deres opptak fremmes ved spesielle reseptorer og ikke ved ren oppløselighet i lipid-dobbeltlaget av cellemembranen. Ved anologi må derfor en viruspartikkel som behøver hydrofob penetrasjon benytte en reseptor som er nær dobbeltlaget, hvilket betyr at en festing til førstetrinns-reseptoren ikke er tilstrekkelig i seg selv.

Dette tilsynelatende paradokse fenomen, at en virusreseptor som er felles for mange celler tillater en infeksjon av kun visse celler, kan forklares ved den kompliserte natur av vertscelle-overflaten som har et lag av glykokonjugater som strekker seg 100 Å eller mer fra lipid-dobbeltlaget. Annettrinns-reseptoren er anordnet i den umiddelbare nærhet av dobbeltlaget og antas derfor å være skjult mot direkte kontakt fra utsiden. Førstetrinns-reseptorene, derimot, er anordnet på en større avstand fra dobbeltlaget og er derfor øyeblikkelig tilgjengelige for binding. Det antas at denne førstetrinns-binding tillater en tilnærmelse av viruspartikkelen til den dobbeltlag-nære annettrinns-reseptor som er eksponert ved det velkjente fenomen av sidelengs mobilitet av overflatekomponenter som er delvis indusert ved fra-støtning fra virusoverflaten, hvilket skyldes f.eks. negativ elektrisk ladning (se henvisning 4). Bindingen av viruset til annettrinns-reseptoren krever derfor en førstetrinns-festing som definerer cellens infeksjonsspesifisitet.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er å benytte denne grunnleggende forskning angående førstetrinns- og annettrinns-binding for å anvende de naturlige annettrinns-reseptor er som sådanne for å konkurrere med annettrinns-reseptorer som foreligger på potensielle verts- eller målceller for bindingssetene på viruset, og ved å blokkere disse seter hindre viruspenetrasjon inn i cellene, slik at virusinfeksjon kan hindres eller reguleres, samt utvikle forbindelser som, fordi de etterligner bindingsegenskapene av den naturlige reseptor, oppfyller den samme funksjon av binding til og blokkering av bindingssetene på viruset. Det foretrekkes for det foreliggende formål å anvende annettrinns-reseptorene eller lignende forbindelser snarere enn førstetrinns-reseptorene, da de førstnevnte er mindre spesifikke og derfor har en videre (mer generell) anvendelighet.

Følgelig angår oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse som omfatter minst ett parti, som hva dets konformasjon og egenskaper angår, svarer til eller er analogt med bindingsepitopen av en annettrinns-virusbindende reseptor på en dyre-eller plantecelle, idet dette parti kan binde seg til et sete på et virus som gjenkjenner bindingsepitopen av annettrinns-bindingsreseptoren, for fremstillingen av en blanding for in vitro diagnose av virusinfeksjoner, eller for fremstilling eller isolering av viruspartikler eller virusoverflatekomponenter.

I den foreliggende sammenheng er uttrykket "bindingsepitop" ment å bety den minste mulige del av reseptoren som kan reagere med viruset. I naturen bæres dette bindingsepitop på annettrinns-reseptoren av celler som er mål for virusinfeksjoner, hvilke reseptorer generelt er glykolipider. Tilstedeværelsen av annettrinns-reseptoren omfattende en slik bindingsepitop er blitt vist av oppfinnerne ved hjelp av en analyse hvor potensielle reseptorer i glykolipidform ekstrahert fra målceller for infeksjon, separeres på en overflate (kromatogram) hvorved en egnet behandling utføres for at det skal ligne på den biologiske cellemembran. Dette betyr at de potensielle reseptorsubstanser er tilbøyelige til å bli eksponert i analysen på samme måte som ved presentasjonen på den levende celle. Resultatene fra denne analyse stemmer derfor godt overens med bindingsresultatene fra intakte celler eller vev. Analysen har avslørt nærværet av førstetrinns- og annettrinnsreseptorer, og har videre avslørt de reseptorkandidater som i realiteten bevirker binding.

Det som er funnet fra denne analyse strider mot tidligere publiserte resultater, som var basert på analyser hvor ekstraherte stoffer i oppløseliggjort micellar form brukes til å hindre virusfesting til vertsceller for å skaffe informasjon om aktivitet. Disse analyser produserer ofte uspesifikk binding, og reflekterer derfor ikke på tilstrekkelig måte de aktuelle bindingsmekanismer som foreligger på celleoverflaten.

F.eks. beskriver henvisning 6 inhibisjonen av hemolyse (lekkasje av røde blodceller) indusert ved Sendaivirus ved hjelp av en rekke langkjedede fettsyrer, dvs. en tilsynelatende virkning på viruspenetrasjon. Frie fettsyrer er imidlertid ikke komponenter av overflatemembranen. Det virker som om, i dette tilfelle, de hydrofobe parafinkjeder reagerer uspesifikt med den hydrofobe peptidsekvens av F-glykoproteinet (definert nedenunder). To avhandlinger (se henvisning 7) rapporterer inhibisjonen av rhabdovirus ved fosfatidylserin og andre fosfolipider. Og sluttelig, to avhandlinger av Huang (se henvisning 8) viser inhibisjon av hemolyse forårsaket av Sendaivirus og hønsepestvirus ved bruk av fosfolipider og noen naturlige og syntetiske glykolipider. således var det mulig å inhibere Sendaivirus-indusert hemolyse ved bruk av fettsyrer, eller fosfolipider, eller glykolipider, presentert i micellar form. Som angitt ble ingen binding av Sendaivirus ved frie fettsyrer, fosfolipider eller de naturlige eller syntetiske glykolipider som ble benyttet av Huang funnet ved bruk av analysen utviklet av oppfinnerne, som beskrevet ovenfor. De tre grupper stoffer er aktive ved sammenlignbare nivåer, men de polare hodegrupper av de to sistnevnte er strukturelt altfor forskjellige til å forklare en spesifikk interaksjon av viruset med denne del. Den mest sannsynlige forklaring er derfor at den felles del av disse stoffer, lipidkjedene, reagerer hydrofobt på en uspesifikk måte med de hydrofobe deler av viruset, høyst sannsynlig N-terminalpeptidet av F-glykoproteinet. Dette betyr at stoffene benyttet av tidligere forskere ikke kan være genuine reseptorer på vertscellene. Hva fosfolipidene angår, er denne konklusjon understøttet av antallet reseptorseter, 10^, funnet på målceller, som er flere størrelses-ordner for lavt til å svare til fosfolipid, en meget vanlig celleoverflate-komponent.

Kort fortalt kan dataene angitt i litteraturen som er publisert til dags dato forklares ved en uspesifikk hydrofob interaksjon av de utprøvede stoffer med et begrenset antall vira. Skjønt denne interaksjon teoretisk sett kan finne sted med en del av det samme peptid som nedenunder er antatt å binde seg spesifikt til annettrinns-reseptoren med en strukturelt definert bindingsepitop, er der ikke fremlagt noe bevis i disse henvisninger for genuin reseptorspesifisitet. Videre er den hydrofobe interaksjon som ble gjenkjent, vanlig i mange systemer. Et eksempel er fettsyrer med forskjellige strukturer assosiert med albumin, det viktigste protein i blodplasma fra pattedyr. Derfor kan de angitte resultater ikke benyttes for formålene ifølge den foreliggende oppfinnelse på grunn av generaliteten av enkle hydrofobe interaksj oner.

Ved hjelp av analysen utviklet av oppfinnerne, er det derfor blitt mulig for første gang å definere spesielle stoffer som er nyttige som annettrinns-reseptorer. Således, som angitt ovenfor, er der i analysen et fravær av binding til andre membrankomponenter som andre forskere har hevdet binder de analyserte vira (kfr. de ovenfor angitte henvisninger). F.eks. er der ingen binding til frie fettsyrer/lipider eller frie karbohydrater, som begge er komponenter av den naturlige annettrinns-reseptor, heller ikke til fosfolipider, såsom fosfatidylkolin, sfingomyelin, fosfatidyletanolamin eller fosfatidyIserin, ved bruk av relevante nivåer av reseptor-materiale. Derfor har spesifisiteten ved analysen anvendt av oppfinnerne gjort det mulig å definere strukturen av annettrinns-reseptoren ved unngåelse av villedende resultater oppnådd ved andre analyseteknikker, særlig den uspesifikke interaksjon mellom komponentene anvendt i de tradisjonelle analyser.

På bakgrunn av de stoffer som er funnet å være reseptoraktive i den ovenfor beskrevne analyse, er visse generelle karakteristikker av bindingsepitopen blitt etablert. Således bør forbindelsene benyttet for formålene ifølge oppfinnelsen omfatte en hydrofob del, en polar del som støter opp til den hydrofobe del, og en del som er både polar og hydrofob som støter opp til den polare del. Videre er det etablert at disse tre deler bør danne en kontinuerlig overflate med en samlet lengde på ca. 15-20 Å og en bredde på ca. 8-10 Å.

I henhold til oppfinnelsen kan den hydrofobe del omfatte en hydrokarbonmolekyldel som oppviser en hydrofob overflate med et overflateareal på minst ca. 50-80 Å<2>. Dette overflateareal er funnet tilstrekkelig til å etablere en hydrofob interaksjon mellom bindingssetet på viruset og den hydrofobe del av bindingsepitopen, men hydrokarbonmolekyIdelen kan selvsagt strekke seg over et større område, hvilket kan være praktisk for noen anvendelser der hvor reseptoren skal kobles til en bærer (se nedenunder). Det er imidlertid viktig å notere seg at et større overflateareale av hydrokarbonmolekyldelen ikke bidrar til selve bindingsepitopen. Den polare/hydrofobe del bør fortrinnsvis innbefatte en struktur svarende til a-siden av heksosen som forekommer i den naturlige bindingsepitop. Denne a-side utgjør den "hydrofobe" side av sakkaridet. Den polare del, som danner en mellomliggende sone mellom den hydrofobe del og den polare/hydrofobe del, bør omfatte minst to hydrogenbindings-seter. Den mellomliggende sone kan bære både hydrogenbindings-donorer og hydrogenbindings-akseptorer.

Den polare/hydrofobe del kan omfatte en homo- eller hetero-cyklisk struktur, og er fortrinnsvis et monosakkarid som er valgfritt passende substituert på en slik måte at substituenten ikke virker sterisk forstyrrende inn på strukturen som svarer til a-siden av heksosen, som forekommer i den naturlige bindingsepitop. Eksperimenter har bragt på det rene at substitusjoner som blokkerer bindingen, rager ut fra den samme side som a-siden av denne heksose, mens substitusjoner som tillater en binding rager ut i andre retninger, hvilket antyder en sterisk spesifisitet i måten viruset nærmer seg på. Substituenten kan f.eks. være et sakkarid. Fortrinnsvis har monosakkaridet konformasjonen av 6-galaktopyranose eller 5-glukopyranose, i det minste i den reseptoraktive del derav og er fortrinnsvis en heksose, skjønt en pentose eller heptose kan også anvendes for dette formål. Heksosen kan være galaktose eller glukose som er de heksoser som forekommer i den mest optimale naturlige annettrinns-reseptor.

Den hydrofobe del, som utgjøres av hydrokarbonmolekyIdelen, behøver ikke ha noen strukturell spesifisitet, da den ikke synes å være påkrevet for primær epitopgjenkjennelse og hydrogenbindings-oppbrytning av membranmotstand, hvilket bevirkes av henholdsvis den polare/hydrofobe del og den polare del. Den hydrofobe del er imidlertid viktig for en forlenget hydrofob interaksjon mellom bindingssetet på viruset og cellemembranen, og er derfor likevel nødvendig i stoffer som anvendes til å etterligne den naturlige reseptor, da riktig binding og derfor blokkering av setet på viruset ellers ikke ville være virksom. HydrokarbonmolekyIdelen kan omfatte et mettet eller umettet, forgrenet eller lineært, åpenkjedet eller cyklisk hydrokarbon, eller en kombinasjon derav. Fortrinnsvis omfatter imidlertid hydrokarbonmolekyldelen ett eller to mettede eller umettede lineære eller forgrenede hydrokarboner. Helst er hydrokarbonet en del av et ceramid, da ceramidstrukturer viser en selvkondensasjons-virkning i et monolag av overflatebalansen (se henvisning 33) sannsynligvis på grunn av intermolekylær hydrogenbinding.

Dette kan gjøre presentasjonen av bindingsepitopen ved en kondensert overflate viktig for effektiv binding av en ligand, dvs. viruset. Ceramidet bør fortrinnsvis omfatte en 2-hydroksy fettsyre, da dette synes å forbedre tilgjengeligheten av viruset til bindingsepitopen, idet det i visse reseptorstoffer skaffer en egnet konformasjon og presentasjon av bindingsepitopen i et meget selvkodenserende monolag med tett molekylær pakking på grunn av intermolekylær hydrogenbinding. HydrokarbonmolekyIdelen bør ha minst ca. 14 karbonatomer, men av praktiske hensyn (når man skaffer tilstrekkelig hydrofobisitet til å binde hydrokarbonmoleky1-delen til den bærer ved hydrofob interaksjon (se nedenfor)), fortrinnsvis ca. 2 0-3 0 karbonatomer.

Som angitt ovenfor er den struktur eller konformasjon av forbindelsen som skal anvendes som reseptorsubstansen eller reseptorerstatningen (substitute) funnet å være kritisk for sin virkningsfullhet i dette henseende. Det er funnet at forbindelsen bør ha en bøyd eller buet konformasjon med en polar/hydrofob hodegruppe som bøyer seg mot planet av det monolag som dannes av den hydrofobe del, såsom hydrokarbon-moleky Idelen . Følgelig har. forbindelsen fortrinnsvis en generell konformasjon som svarer til den for den naturlige bindingsepitop som bæres av 1-0-6-D-galaktopyranosyl-N-(2-D-hydroksyalkanoyl)-1,3-D-dihydroksy-2-D-aminoalkan som har har konformasj onen med de tilnærmede steriske atomforhold beskrevet i henhold til krystallografiske konvensjoner med en krystallenhetcelle med a = 11,2 Å, b = 9,3 Å, c = 46,5 Å, og R = 99°, og med de valgte fraksjonelle atomkoordinater for henholdsvis x, y og z, for heksosen Cl" 0,82, 0,99 og 0,42, C3" 0,91, 1,25 og 0,44, C5" 0,72, 1,15 og 0,46, for den langkjedede base 01 0,80, 0,90 og 0,41, Cl 0,76, 0,76 og 0,42, C2 0,78, 0,66 og 0,39, C5 0,61, 0,62 og 0,31, NI 0,90, 0,69 og 0,38, 02 0,57, 0,69 og 0,37, for fettsyren Cl<*> 0,98, 0,58 og 0,37, C2' 1,08, 0,64 og 0,36, C5' 1,17, 0,71 og 0,29, 01' 0,95, 0,45 og 0,38, 02' 1,12, 0,79 og 0,37,

hvor forbindelsen oppviser disse atomforhold og -koordinater eller varianter derav som ikke virker forstyrrende inn på bindingsaktiviteten, idet forbindelsen omfatter en polar/- hydrofob del (lik i struktur med delen A vist i konfor-mas jonsformelen av den naturlige bindingsepitop)- innbefattet en struktur som svarer til a-siden av heksosen som forekommer i den naturlige bindingsepitop, og fortrinnsvis omfattende D-eller L-formene av et monosakkarid som har konformasjonen av B-galaktopyranose, i det minste i den reseptoraktive del,

hvilket monosakkarid er valgfritt passende substituert i en stilling hvor substituenten ikke virker sterisk forstyrrende inn på strukturen som svarer til a-siden av heksosen som forekommer i den naturlige bindingsepitop, en polar del (lik i struktur med del B vist i konformasjonsformelen av den

naturlige bindingsepitop) omfattende minst to hydrogenbinding-seter som kan være en amino-, karbonyl-, hydroksyl-, sulfhydryl-, sulfoksy- eller sulfon-gruppe, og en hydrofob del (lik i struktur med del C vist i konformasjonsformelen av den naturlige bindingsepitop) omfattende et mettet eller umettet, forgrenet eller lineært, åpenkjedet eller cyklisk hydrokarbon eller en kombinasjon derav med et overflateareal pa minst ca. 50-80 Å2.

Fra det som er angitt ovenfor, virker det som om strukturen av bindingsepitopen av forbindelsen anvendt for de foreliggende formål fortrinnsvis bør være en som nær etterligner konformasjonen av den mest optimale naturlige reseptor, som bestemt ved røntgenkrystallografi (se henvisning 31). Denne naturlige reseptor har en skjelignende eller skovllignende konformasjon (hvilket fremgår fra konformasjonsformelen vist ovenfor) med en heksose (A) som bøyer seg mot planet av det monolag som er dannet av alkankjedene (C). Dette betyr at a-siden av heksosen, men ikke B-siden, er blottlagt på utsiden av monolaget, slik det kan ses fra krystallpakkingen. Det tilsvarende ikke-bindende glykolipid som avviker bare ved det at det har en ikke-hydroksy fettsyre som den hydrofobe del istedenfor en 2-hydroksy fettsyre er blitt undersøkt ved NMR-spektroskopi (se henvisning 32) som viser at heksosen er plassert perpendikulært på planet av monolaget og således rotert rundt C^-C^ av den langkjedede base. Skjønt disse undersøkelser ble utført ved separate metoder anvendt på separate molekyler, bringer de på det rene de foretrukne konformasjoner som avviker på en måte som er relevant i den foreliggende sammenheng. På samme måte som den tette intramolekylære pakking i krystallet, oppviser ceramidstrukturer en selvkondensasjonseffekt i et monolag på vann (og sannsynligvis også den biologiske membran), som skyldes intermolekylær hydrogenbinding (se henvisning 33). For de tettpakkede glykolipider som er brukt som sammenligning, betyr dette at ikke-hydroksy fettsyrematerialene oppviser hverken a- eller B-siden av heksosen for binding, i motsetning til de 2-hydroksy fettsyreholdige materialer. Fra dette kan man trekke den slutning at a-siden av heksosen er involvert i bindingen av viruset, og at 2-hydroksygruppen er kritisk for å gjøre denne side tilgjengelig for binding.

En annen faktor som er viktig for reseptorepitop-designasjon er beskaffenheten av proteinet av det virus som mest sannsynlig binder denne reseptor. F.eks. har Sendaivirus (som tilhører gruppen paramyxo-virus og benyttes i utstrakt grad for eksperimentering), to proteiner på sin overflate (se henvisning 2 og 3). HN-proteinet (hemagglutinin-neuraminidase) bærer bindingssetet for førstetrinns-reseptoren inneholdende neuraminsyre. Det andre protein, F-proteinet (fusjon), er blitt vist å være helt nødvendig for fusjonen av virusmembranen med vertscellens plasmamembran (penetrasjon), hvilken fusjon er nødvendig for levering av virusnukleo-kapsidet til cytoplasmaen (se henvisning 2 og 3). Engasje-mentet av den høyt bevarte N-terminalhydrofobe peptidsekvens av F-proteinet i denne prosess er i den senere tid blitt underbygget ved inhibisjon med en serie syntetiske peptider lignende den naturlige sekvens (se henvisning 35). Analoge N-terminal-peptider eksisterer på overflaten av andre vira (se henvisning 2, White et al.). Det materiale som er presentert i henvisning 3 5 viser at aksjonssetet for disse syntetiske peptider er på målcellen og at virkningen er mettbar, hvilket antyder reseptorseter på ca. IO<6> pr. celle. Annettrinns-reseptoren, slik den her er definert, bør være identisk med disse seter, da der bare er to proteiner på Sendaivirus-overflaten og to bindingsegenskaper. Det kraftigste inhibitoriske syntetiske peptid er N-karbobenzoksypeptidet Z-D-Phe-L-Phe-Gly (Z angir karbobenzoksy). N-terminal-sekvensen av virusoverflateproteinet er L-Phe-L-Phe-Gly. Den ikke-naturlige (unnatural) karbobenzoksygruppe øker virkningen ca. IO<3> ganger sammenlignet med peptidet uten denne gruppe. Den ikke-naturlige D-isomer er 500 ganger kraftigere enn den tilsvarende L-isomer.

Disse to sett informasjoner, krystallkonformasjonen av reseptorglykolipidet og strukturen av de inhibitoriske lipider som har størst sannsynlighet for å reagere med denne reseptor, er blitt brukt til molekylær modellering av sannsynlige sammenstillinger av peptid og reseptor. Basert på den logiske antagelse at N-terminal-delen av peptidet bør være nærmest dobbeltlaget, kan den optimale tilpasning av det syntetiske peptid angitt ovenfor og reseptor-konformasjonen angis som følger. Det skal bemerkes at den nomeklatur som er benyttet til å angi posisjonen av atomer eller funksjonelle grupper i molekylet er i henhold til henvisning 38. 1. Hydrofob interaksjon mellom benzoksygruppen av peptidet og alkankjedene av reseptorens fettsyre og langkjedede base. 2. Hydrogenbindinger mellom N av D-Phe og C=0 av fettsyren og 0H3 av basen og C=0 av D-Phe. 3. Hydrofob interaksjon mellom benzenringen av D-Phe og ås-siden av heksosen og CH21 av basen, innbefattet CH1, CH3 og CH5 av heksoseringen. Det er åpenbart at en utskifting av D-Phe med det naturlige L-Phe ikke tillater en slik intim assosiasjon. 4. Benzenringen av L-Phe av det syntetiske peptid kan reagere hydrofobt med alkankjedene av denne og tilknyttede reseptormolekyler. Således er en hydrofob interaksjon tilfredsstilt for alle tre benzenringer.

Grafene fra kvantitative bindingsanalyser (se nedenunder) angir en lavaffinitets-binding av den naturlige reseptor til enkeltseter på viruset, hvilket krever multivalens for effektiv binding. Dette forklarer hvorfor det syntetiske oppløselige univalente peptid med den naturlige sekvens har lav potens for inhibisjon. Rollen av den ikke-naturlige N-karbobenzoksy-gruppe er å forbedre bindingen ved ytterligere hydrofob interaksjon med reseptoren sammenlignet med den naturlige struktur. Denne gruppe, og den bedre steriske tilpasning med det ikke-naturlige D-Phe enn L-Phe, er ikke nødvendig hva angår en multivalent binding gjennom det naturlige peptid av den intakte viruspartikkel, hvilket skaffer en tilstrekkelig sterk samlet interaksjon. Dette kan. tyde på at den hydrofobe reseptordel, som reagerer med karbobenzoksygruppen, ikke er funksjonell for viruset. Det er imidlertid antatt at en etablert interaksjon mellom virus og en vertscellemembran kan innbefatte et ytterligere hydrofobt område utover det som er definert ved epitopen som angitt ovenfor, etter at en primær interaksjon og nedbrytning av membranens motstand er blitt utført.

Vira som er kjent for å bære hydrofobe N-terminal-peptider viser en svak variasjon i sekvensen, skjønt hydrofobisitet er nødvendig. Videre er der forskjellige inhibisjonsvirkninger for separate vira ved bruk av forskjellige syntetiske N-karbobenzoksy-peptider med en relativ reversering av potensen i visse tilfeller (se henvisning 35). Utstrakt molekylær modellering viser at denne "vakling" i peptidstruktur tolereres og gir en god interaksjon med reseptoren. Det skal forstås at bindingen til reseptoren i henhold til dette begrep formidles ved et lineært peptid og ikke ved en lomme dannet av flere peptidløkker, og ofte gir både en høyere spesifisitet og mindre toleranse for aminosyresubstitusjoner. På den annen side er et lineært peptid sannsynligvis mer virkningsfullt med hensyn til å skaffe adgang til denne delvis begravde epitop.

På grunnlag av konformasjonen av de naturlige annettrinns-reseptor, kan spesifikasjonene for en bindingsepitop båret av forbindelsen som skal anvendes i henhold til oppfinnelsen, utarbeides ved sammenligning av lignende deler på den naturlige epitop.

A. a-siden av heksosen (Gal/3 eller GlcJ3) og Cl av den langkjedede base.

Dette er den "hydrofobe" side av sukkeret med hydrofobe interaksjonsseter ved CH1, CH3, CH4 og CH5 av Gal og CH1, CH3 og CH5 av Gle. Videre representerer CH2I av den langkjedede base hydrofobisitet. Gal og Gle binder mer eller mindre like godt, hvilket viser at stereokjemi ved C4 ikke er essensielt. Substitusjon ved C4 blokkerer ikke bindingen, men det gjør den svakere. Disse er de eneste kjente heksoser av monoglykosylceramider på pattedyrcellen. Den tilsvarende del på et syntetisk epitolanalog kan bestå av et C5-C7-monosakkarid med lignende karakteristikker på a-siden av heksoseringen. Dette kan være substituert i stilling 4 med et sakkarid eller en annen substituent som ikke virker sterisk forstyrrende inn på adgangen til bindingsepitopen. Molekylær modellering (se henvisning 38) av sannsynlige konformasjoner av eventuelle slike sakkarid-forlengelser viser at de substitusjoner som blokkerer bindingen rager ut fra den samme side som a-siden av Gle, mens substitusjonene som tillater en binding rager i andre retninger. Dette antyder en sterisk spesifisitet i virusets måte å nærme seg på (approach), og understøtter den påstand at a-siden er involvert i bindingen. I prinsipp kan den polare/hydrofobe del i realiteten være en hvilken som helst cyklisk struktur som bærer trekkene av a-siden av Gal eller Gle, dvs. stort sett hydrofob ringdel med utragende polare substitusjoner i form av f.eks. OH, SH eller =0. Noen av disse substitusjoner kan være ikke-polare i form av f.eks. halogen, CH3, et kortere alkan eller alken, for å optimal-isere balansen mellom hydrofobe og polare rester.

B. Hydrogenbinding-seter ved C=0 av fettsyre (bindings-akseptor) og 0H3 av basen (bindingsgiver og -akseptor).

0H4 av fytosfingosin er ikke essensielt. 0H2 av fettsyren synes å være essensielt for konformasjonen av reseptoren, men ikke for direkte interaksjon med viruset. Som angitt ovenfor kan imidlertid en etablert interaksjon etter den primære spesifikke epitopgjenkjennelse også gjøre bruk av dette OH for hydrogenbinding. De to binding-seter kan anordnes ca. 5-6 Å fra hverandre, og de kan primært være C=0, 0=S=0, OH eller

NH.

C. Den hydrofobe del.

Basert på den molekylære modellering, bør denne innbefatte opp til C6 av syren og C8 av basen. Som angitt ovenfor har imidlertid det naturlige peptid kun én interaksjon, mens det ikke-naturlige peptid også binder hydrofobt med N-karbobenzoksy-gruppen, hvilket gjør en presis definisjon usikker. Igjen kan en etablert interaksjon mellom virus og cellemembran etter primær epitopgjenkjennelse og hydrogenbinding-bryting av membranmotstand innbefatte en forlenget hydrofob interaksjon mellom peptid og membran. Denne stort sett hydrofobe del kan derfor variere, og har ingen strukturell spesifisietet. I en syntetisk epitopanalog kan den hydrofobe del bestå av et mettet eller umettet, forgrenet eller lineært, åpenkjedet eller cyklisk hydrokarbon, eller en kombinasjon derav med et overflateareal på minst ca. 50-80

Å<2>. En tilstrekkelig hydrofobisitet kan imidlertid også

dannes ved den hydrofobe side av en stiv oligomer, såsom en kort kjede av polystyren, polyeten, polyvinyl etc.

Dimensjonene av den naturlige epitop, hvilke kan konkluderes fra krystallkonformasjonen (se henvisning 31), er som følger: hydrogenbinding-setene av del B er anordnet ca. 6-8 Å fra sentret av heksoseringen av del A. Del C er ca. 6-8 Å lang og ca. 8-10 Å bred. Den samlede lengde av bindingsepitopen er derfor av størrelsesorden 16-20 Å. En syntetisk epitopanalog bør derfor ha dimensjoner av den samme eller tilnærmet samme størrelse.

Som angitt ovenfor kan det monosakkarid som danner den polare/hydrofobe del av epitopen være en pentose, heksose eller heptose, såsom naturlig forekommende monosakkarider, f.eks. xylose, arabinose, glukose, galaktose, fukose, ribose, tallose og mannose, eller derivater derav, såsom deoksy-sukkere, acetylerte eller alkylerte sukkere, forgrenede sukkere, aminosukkere og uronsyrer. For å ha alle de ønskede egenskaper med hensyn til konformasjon spesielt, bør monosakkarider fortrinnsvis være i ringform (f.eks. som furanose eller pyranose). Egnede eksempler på et slikt monosakkarid er xylopyranose, arabinopyranose, glukopyranose, galaktopyranose, mannopyranose etc. Som videre angitt ovenfor kan dette monosakkarid være substituert i en stilling hvor substituenten ikke virker sterisk forstyrrende inn på bindingen. For de fleste monosakkarider betyr dette at substitusjonen kan finne sted i stilling 4 (karbonatom 4 av den heterocykliske ring). I prinsipp kan substituenten være en hvilken som helst substituent som oppfyller det ovenfor angitte kriterium, og som dessuten ikke forstyrrer balansen mellom polaritet og hydrofobisitet i denne del av epitopen. Foretrukne substituenter er mono-, di-, tri- eller tetra-sakkarider såsom Gal, Gle, Xyl, Ara, Fuc, Rib, Man, Man-al-<-3Man, Manal->2Man, Manal-»-6Man, GalBl-»2Man, Fucal-^Gal, Fucal->3Gal, Fucal->6Gal, GalBl->2Gal, GalBl->6Gal, GalBl->3Gal, Galal-K5a3.fi, Galal-4Galfi, Glcal->4Glc, Glcfll-»4Glc, Glcal->4GlcB1^4Glc, Glcal->4Glcal-*4Glc, Galfil->3GalBl->-4Glc, GalBl-3GalBl-3GalBl-4Glc, Glcal-6Glcal->-4Glcal-4Glc, Galal-+3 (Fucal-*2) GalB, en hvilken som helst egnet kombinasjon derav eller et derivat derav, såsom et passende asetylert, alkylert, forgrenet eller aminert derivat derav (for-kortelsene som anvendes er i henhold til akseptert karbohydrat-nomenklatur).

De tre deler som utgjør en syntetisk bindingsepitop analog med den naturlige bindingsepitop bør festes sammen for å gi en samlet bindingsepitop med de antydede dimensjoner og med de karakteristikker som er beskrevet ovenfor, eksponert på samme side av den konstruerte overflate. Dette kan oppnås ved syntese av en forholdsvis stiv epitop lik den naturlige epitop. Således kan koblingen mellom den polare/hydrofobe del og den polare del omfatte to passende substituerte karbonatomer med konformasjonen av den naturlige bindingsepitop. Videre kan koblingen mellom den polare/hydrofobe del og den polare del etableres ved en kobling mellom glykosidisk oksygen eller glykosidisk svovel eller en eter eller tioeter på den polare/hydrofobe del, og en CH2-gruppe eller en lignende gruppe på den polare del. Dersom koblingen mellom den polare/hydrofobe del og den polare del skal være kort og forholdsvis stiv, er den glykosidiske kobling av B-anomeritet. De tre deler kan imidlertid også føyes sammen på en mer fleksibel måte til hverandre, forutsatt at beskaffenheten og lengden av koblingen ikke virker forstyrrende inn på opptagelsen av bindingsoverflaten av de tre deler med dimensjoner som antydet ovenfor. Forutsatt at dette kriterium er tilfredsstillet, kan spesifikasjonene av særlig A være mer varierte; dersom den brukes, kan den anomere kobling f.eks. være av a-typen.

Som angitt ovenfor er reseptorer på målceller som oftest enten glykoproteiner eller glykolipider. Som det fremgår fra konformasjons-spesifikasjonene for den naturlige reseptor, er det imidlertid funnet at i naturen kan bare glykolipider fungere som annettrinns-reseptorer for virusbinding. Den foreliggende oppfinnelse angår derfor primært bruken som antivirusmidler av lipidkoblede karbohydrater innbefattet glykolipider, glykosfingolipider og glykoglycerolipider eller reseptoraktive analoger derav. Eksempler på glykolipider som er nyttige for dette formål er D-galaktopyranosyl-ft-diglycerid eller D-galaktopyranosyl-al->6-D-galaktopyranosyl-B-diglycerid, som i naturen kan finnes på overflaten av plantecelle-membraner og er funnet å ha egenskapene av annettrinns-bindingsreseptoren, hvilket indikerer deres nyttighet med hensyn til å bekjempe plantesykdommer av virusopprinnelse.

Den mellomliggende sone av glykoglycerolipider viser hydrogenbinding-akseptorer kun, og bevirker derfor ikke den tette molekylære pakking og meget selvkondenserende monolag som er blitt angitt å være viktige grunner til den riktige konformasjon og presentasjon av bindingsepitopen hva angår glykosfingolipider. Eksperimenter har vist at bindingen til glykoglycerolipider ikke krever en 2-hydroksy-fettsyre, da bindingsepitopen er tilgjengelig for viruset, selv i fravær av 2-hydroksy-fettsyre, på grunn av den mer på avstand anordnede presentasjon av glykoglycerolipid-molekylene. Hva glykosfingolipider angår, foretrekkes det at den hydrofobe del omfatter en 2-hydroksy-fettsyre da dette er blitt vist å forårsake en mer effektiv binding. Følgelig kan den forbindelse som skal anvendes som et antivirusmiddel være en sfingosin-2-D-hydroksy-fettsyre med den generelle formel I eller en fytosfingosin-2-D-hydroksy-fettsyre med den generelle formel II, eller en dihydrosfingosin-2-D-hydroksy-fettsyre med den generelle formel III,

eller eller

hvor R representerer et sakkar id med konf ormas j onen av 13-galaktopyranose, i det minste i den reseptoraktive del, og R^ og R2 hver for seg representerer en metylgruppe eller en CHO-, N02-, NH2-, OH-, SH-, CONHNH2-, CON3- eller COOH-gruppe. Når reseptoren eller reseptoranalogen skal anvendes som sådanne, det vil si er effektiv nok til å bevirke binding i seg selv, er R 3^ og R2 fortrinnsvis metyl, men når den naturlige epitop eller den syntetiske epitopanalog skal presenteres i en multivalent form (se nedenunder), foretrekkes det at R-L og/eller R2 representerer en reaktiv gruppe som er i stand til enten å reagere med lignende grupper på reseptorene selv eller reagere med lignende grupper på en bærer. R 3 representerer en hydrokarbonmolekyldel som kan omfatte et lineært eller forgrenet, mettet eller

umettet hydrokarbon med en kjedelengde på minst 5 karbonatomer. Hydrokarbonkjedene er imidlertid som regel lineære og mettet eller monoumettet. R kan være et monosakkarid som angitt ovenfor, valgfritt substituert i stilling 4 ved ett eller flere andre sakkarider som nevnt ovenfor, således kan det samlede sakkarid omfattende den polare/hydrofobe del f.eks. være

eller

hvor uttrykket "NAc" angir en N-acetylering av sakkaridet.

Det er blitt påvist ved forsøk at glykolipider med inntil fem sakkarider kan binde viraene, et større oligosakkarid er tilbøyelig til å utgjøre en sterisk forhindring med hensyn til virusets adgang til epitopen. De beste naturlige bindere som påvist ved kvantitative bindingsundersøkelser (se nedenunder), er funnet å være GlcBCer og GalfiCer. Dette antyder at bruken av mer enn ett sakkarid er overflødig for bindingsformål, skjønt det kan være nødvendig med hensyn til tilgjengeligheten av startmaterialer i fremstillingen av reseptorene eller reseptoranaloger etc.

Som angitt mange ganger ovenfor, strekker bruken seg i henhold til oppfinnelsen også til reseptoraktive analoger av den naturlige bindingsepitop. Slike analoger kan selvsagt ha en hvilken som helst form, forutsatt at de oppfyller kravene med hensyn til konformasjon som beskrevet ovenfor, og slike analoger kan derfor velges fra en rekke forskjellige forbindelser. Det er imidlertid funnet at forbindelser med den generelle formel IV

hvor R, Ri, R2 og R 3 er som angitt ovenfor, danner en særlig interessant gruppe av reseptoranaloger som kan anvendes for det foreliggende formål. Hva angår de syntetiske reseptoranaloger, kan de samme sakkarider som de som er angitt ovenfor for naturlige reseptorsubstanser anvendes. Særlig interessante forbindelser med denne generelle formel er og

som er funnet å oppvise en bindingsiver som er av samme størrelsesorden som for naturlige reseptorsubstanser (kfr. eksempel 5).

Da disse reseptoranaloger er funnet å være sammenlignbare med de naturlige stoffer med hensyn til egenskaper og konformasjon (dimensjoner), er de fullt gyldige som erstatninger for den naturlige reseptor. Fordelen ved å bruke disse eller lignende syntetiske reseptoranaloger ligger i fremgangsmåten for deres fremstilling, som kan utføres ved enklere metoder enn dersom de naturlige reseptorer skulle produseres enten syntetisk eller ved den mer tungvinte metode av å høste dem fra celleoverflate-membraner.

De syntetiske reseptoranaloger med den generelle formel IV kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter å omsette et glykosid med den generelle formel V

hvor X representerer en avgangsgruppe og R er som angitt ovenfor, med en tiol med den generelle formel VI

hvor R3 og R^ er som angitt ovenfor og omsette produktet med et oksidasjonsmiddel. Reaksjonen kan utføres i vann eller et egnet organisk oppløsningsmiddel såsom etylacetat, metylen-klorid, eter og dimetylsulfoksid. Reaksjonen kan passende utføres ved værelsestemperatur. Reaksjonstiden kan være fra 24 til 48 timer. Reaksjonen utføres generelt med litt mer enn to ekvivalenter av tiolen med den generelle formel VI til én ekvivalent av glykosidet med den generelle formel V. Reaksjonen kan utføres under litt alkaliske betingelser, og sakkaridet kan være passende beskyttet.

Oksidasjonen av de resulterende tioforbindelser til de tilsvarende sulfoner med den generelle formel IV, kan finne sted ved bruk av fire ekvivalenter eller mer av oksidasjons-middelet. Eksempler på nyttige oksidasjonsmidler er persyrer, såsom m-klorperbenzosyre, peroksider såsom tert.butyl-hydroperoksid, aminooksider, gassformet oksygen eller uorganiske oksidasjonsmidler såsom kaliumpermanganat, kromtrioksid etc. Reaksjonen utføres vanligvis ved værelsestemperatur .

En annen interessant gruppe forbindelser er forbindelser med den generelle formel VII

hvor R, R-L og R 3 er som angitt ovenfor. Disse forbindelser kan fremstilles fra de tilsvarende sulfider ved oksidasjon som beskrevet ovenfor.

For å være nyttig som et diagnostisk, profylaktisk eller terapeutisk middel i forbindelse med virusinfeksjoner, er det viktig at forbindelsen anvendt for disse formål leveres i en slik form eller på en slik måte at tilstrekkelig affinitet for viruset oppnås. Således kan forbindelsen, dersom den er tilstrekkelig, aktiv, leveres som sådan i vannoppløselig form, det vil si i univalent form (det betyr at den opptrer som adskilte enheter av forbindelsen som hver bærer stort sett bare én bindingsepitop). Denne form ventes å være særlig relevant hva syntetiske reseptorer angår, da disse kan ha en langt større affinitet for viraene enn de naturlige reseptorer som er funnet å oppvise en binding med lav affinitet. Hva de naturlige og formodentlig flere av de syntetiske reseptorer angår, kan forbindelsen derfor fortrinnsvis være skaffet i en slik form at den oppviser flere bindingsseter for virusen (i det følgende kalt "multivalent binding") for å gi en effektiv binding. I naturen blir multivalent binding oppnådd ved et stort antall proteinmolekyler på virusoverflaten og et tilsvarende antall glykolipid-reseptorer på vertscellen. Når den anvendes for det foreliggende formål, bør forbindelsen derfor skaffes i en form som etterligner denne multivalente binding. Dette kan oppnås ved bruk av de naturlige glykolipid-reseptorer eller syntetiske reseptoranaloger av en lignende størrelse som kan presenteres som miceller eller på hydrofobe overflater (for å ligne på målcelle-overflaten). De mindre stabile miceller kan imidlertid gi opphav til uspesifisert binding på en hvilken som helst overflate, og derfor foretrekkes presentasjonen av reseptoren eller reseptoranalogen på en fast fase. Alternativt kan forbindelsen være multivalent koblet til en makromolekylær bærer som kan være en av to typer: en hvor bæreren har en hydrofob overflate, til hvilken en hydrofob del av forbindelsen er assosiert ved hydrofob ikke-kovalent interaksjon, idet den hydrofobe overflate f.eks. er en polymer, såsom en plast eller en hvilken som helst annen polymer til hvilken hydrofobe grupper er blitt koblet, f.eks. polystyren, polyeten, polyvinyl etc, eller den kan være en makromolekylær bærer, til hvilken forbindelsen er kovalent bundet. I dette sistnevnte tilfelle kan en egnet bærer være en naturlig eller syntetisk polymer. Således kan bæreren være et oligo- eller polysakkarid, f.eks. cellulose, stivelse, glykogen, chitosan eller aminert sefarose, til hvilke reseptoren eller reseptoranalogen kan være bundet gjennom en reaktiv gruppe på den hydrofobe del, såsom en hydroksy- eller aminogruppe som foreligger.på den reseptoraktive substans, et oligo- eller polypeptid såsom et globulin, albumin, fibrin etc, idet bindingen er skaffet gjennom f.eks. en hydroksy-eller aminogruppe på den hydrofobe del av reseptoren eller reseptoranalogen, en kombinasjon derav eller et lignende passende substituert konjugat. Bæreren kan også være en uorganisk bærer, såsom et silisiumoksid-materiale, f.eks. silikagel, zeolitt, diatoméjord eller overflaten av forskjellige glasstyper såsom aminert glass, til hvilke reseptoren eller reseptoranalogen kan være bundet gjennom en hydroksy-, karboksy- eller aminogruppe på hydrokarbonmolekyldelen av den reseptoraktive substans. Når forbindelsen skal anvendes for profylakse eller terapi, er det helt nødvendig at bæreren er en fysiologisk og farmasøytisk akseptabel bærer, såsom en ikke-giftig og/eller ikke-allergen bærer. Bærere av denne type, som for tiden anses å være nyttige for disse formål, er f.eks. poly-L-lysin og Poly-D,L-alanin.

Den foreliggende oppfinnelse grunner seg på den oppdagelse at vira generelt synes å behøve annettrinns-reseptoren for den helt nødvendige penetrasjon inn i vertscelle-cytoplasmaen, slik at den naturlige bindingsepitop eller en syntetisk epitopanalog i uni- eller multivalent form kan anvendes for å hindre virusinfeksjon ved blokkering av de tilgjengelige bindingsseter på viruset for å hindre invasjon av viruset i epitelceller ved innfallsportene for virusinfeksjoner. Eksempler på slike innfallsporter er slimhinnene i øyet,

nesen, munnhulen, halsen, luftveiene, tarmsystemet, urin-veiene og forplantningsorganene. Den generelle anvendelighet av den foreliggende oppfinnelse grunner seg på det faktum at forbindelser svarende til eller analoge med annettrinns-bindingsreseptoren som finnes på målceller, er vist å binde en rekke forskjellige vira som hører til familiene Adeno-viridae, Herpetoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae. Andre virusfamilier av interesse i denne forbindelse er Picornaviridae og Retroviridae. Således omfatter de vira som er av interesse både DNA- og RNA-vira og partikler med og uten en dobbeltlagsmembrankappe, hvilke vira er årsaken til et vidt område sykdommer som påvirker mange forskjellige organsystemer, f.eks. forskjellige influensaer og vanlig forkjølelse, diaré, herpes I og II, kusma,

meslinger, rabies, AIDS, leukemi etc.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan være in vitro diagnostisk bruk, idet man benytter kjennskapet til annettrinns-reseptor-funksjonen med hensyn til binding av viraene. For diagnostiske formål kan viruspartikler som foreligger i utsondringer fra infiserte pasienter eller andre prøver som skal undersøkes, utsettes for reseptorstoffet som kan foreligge på overflaten av et passende bærermateriale i form av f.eks. målepinner (dip-sticks), immunologiske prøvekort, polymerkuler eller lignende. Etter binding blir overflaten vasket omhyggelig, og nærværet av viruset kan vise seg på flere måter som allerede er etablert innenfor klinisk virologi. F.eks. kan viruset først absorberes i mikrotiterbrønner, fulgt av deteksjon ved ELISA-metoder (se henvisning 1, Materialer og Metoder og eksempel 6). Videre kan andre prøvemetoder utviklet av oppfinnerne tilpasses til en forenklet diagnostisk bruk.

Det anses også at forbindelsene beskrevet ovenfor kan benyttes til forskjellige biotekniske formål, såsom fremstilling og isolering av viruspartikler eller virus-overflatekomponenter gjennom bruken av etablerte affinitetskromatografiske metoder. For dette formål kan reseptorstoffet kobles til en fast bærer, såsom multivalent-koblet til en makromolekylær bærer som beskrevet ovenfor for å binde liganden i kromatografiske kolonner for elektroforese, filtrering, sedimentering eller sentrifugering. Egenskapene av reseptoren (bindingskonstant etc.) kan bringes på et optimum for eluering etc. ved konstruk-sjon av forbindelsens syntese, slik at man unngår irreversibel binding av viruset til reseptoren. På denne måte kan det være mulig å isolere eller rense viruspartikler eller virussubstanser og/eller påvise vira i forskjellige prøver ved deres binding til reseptor eller reseptoranaloger koblet til disse faste bærere.

En annen foreslått bruk av reseptorene eller reseptoranalogene kan være å isolere det stoff på virusmembranen som er ansvarlig for virusbinding. Det anses at denne substans kan benyttes for vaksinasjonsformål, dvs. å immunisere det aktuelle menneske eller dyr mot den virussykdom som overføres ved virusartene fra hvilken substansen er blitt avledet, men også mot andre virussykdommer overført av vira som har den samme substans på deres overflate. Således antas det for tiden at en vaksine med et vidt spektrum mot en rekke forskjellige virussykdommer kan fremstilles på denne måte. Sammenlignet med de vanlige vaksinasjonsmeto-der som bruker svekkede viruspreparater, vil en slik vaksine ha den avgjorte fordel at ikke-infektøse viruskomponenter kan stimulere produksjonen av antistoffer som kan nøytralisere det aktuelle virus ved blokkering av det essensielle molekyl for virusinnpass til vertscellen for infeksjon.

Beskrivelse av tegningen

Oppfinnelsen er videre beskrevet med henvisning til tegningen, hvor

fig. 1 viser en undersøkelse av Sendaivirus (S-variant) som binder seg til førstetrinns-reseptoren analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. De to felter (lånes) til venstre er blitt påvist kjemisk og er samlede gangliosider (neuraminsyreholdige glykolipider) av menneskelige erytrocytter (felt 1) og menneskelig hjerne (felt 2). De samme to felter er vist til høyre etter binding av Sendaivirus og autoradiografi. Som vist er der ingen

virusbinding til de viktigste hjernebånd i felt 2. I motsetning til dette er der en øyensynlig sterk binding til flere erytro-cyttbånd i felt 1, særlig de langsomtgående.

Fig. 2 viser en undersøkelse av Sendaivirus (S-variant) som binder seg til annettrinns-reseptoren analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Dette viser den mulige analyse av et stort antall reseptorkandidater som blandinger av glykolipider av forskjellig opprinnelse (sortering for reseptorer) som er mulig med denne undersøkelse. Til venstre er kromatogrammet etter kjemisk påvisning med anisaldehyd og til høyre autoradiogrammet etter en overdekning av virus over de samme felter. Det følgende er de samlede ikke-sure glykolipider som er vist: menneskelige erytrocytter (felt 1), menneskelig mekonium (felt 2), tarm fra Macaca cynomolgus (felt 3), tynntarm fra hund (felt

4), tynntarm fra kanin (felt 5), tynntarm fra marsvin (felt 6) og tykktarm fra mus (felt 7). De hvite tall henviser til stoffer angitt i tabell 3. Det virker som om et stort antall større glykolipid-bånd påvist kjemisk (venstre) ikke binder viruset (høyre), hvilket antyder den høye selektivitet og spesifisitet av undersøkelsen. Fig. 3 viser en undersøkelse av Sendaivirus (S-variant) som binder seg til annettrinns-reseptorsubstanser analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Dette viser bindingen til substanser som er syntetiske eller er blitt isolert fra naturlige kilder og identifisert kjemisk. For å spare plass, ble en rekke rene stoffer satt til det samme felt, idet man startet med det stoff som beveget seg hurtigst, som vist i kromatogrammet til venstre, påvist ved anisaldehyd. Autoradiogrammet er vist til høyre. Figurene henviser til tabell 3. Felt 1: syntetisk, 2 med fytosfingosin og 2D-hydroksy-stearinsyre, 3 med ikke-hydroksyf ettsyre, 15, og Ga INAa l->-3 (Fuca l->2) Ga IB l-»-4 (Fuca l-»-3) - GlcNAcBl-"3GalBl-+4GlcBCer, felt 2: syntetisk 2 med fytosf ingosin og stearinsyre, 3 (tre bånd som beveget seg nær hinannen med 2-hydroksy-fettsyre), og 15 med ikke-hydroksy-fettsyre; felt 3: syntetisk 2 med sfingosin og stearinsyre, 3, 6 med ikke-hydroksy-f ettsyre (forurenset), 16, og 22 (tre bånd som beveget seg nær hinannen med 2-hydroksy-fettsyre); felt 4: syntetisk 1 med fytosfingosin og 2-hydroksy-stearinsyre, 3 med fytosfingosin og ikke-hydroksy-fettsyre, 6, og GalNAcal-+3GalNAcBl-^3Galal-»— 4GalBl-»-4GlcBCer med ikke-hydroksy-f ettsyre; felt 5: syntetisk 1 med sfingosin og stearinsyre, stoff 13 i tabell 1, 6 (kortkjedet 2-hydroksy-fettsyre), 16 (to bånd som beveger seg nær hinannen med 2-hydroksy-fettsyre) og 17 (tre bånd som beveger seg nær hinannen i autoradiogrammet til høyre kan være forurensninger i 17); felt 6: 8 (to bånd som beveger seg nær hinannen), 20, og GalNAal--3 (Fucal->2) GalBl-4GlcNAcBl->-3-*GalBl->4GlcBCer. Fig. 4 viser de kurver som fås fra den kvantitative binding (kfr. Materialer og Metoder) av Sendaivirus til forskjellige syntetiske eller naturlige glykolipider oppnådd som beskrevet i Materialer og Metoder. Fortynninger av glykolipider ble adsor-bert i mikrotiterbrønner (x-aksen), og virusbindingen ble, etter inkubering, målt som radioaktivitet (y-aksen). Bokstavene viser til de følgende prøver som ble testet: A er stoff 1 eller 2 i tabell 3. B er førstetrinns-reseptoren med den følgende sekvens: NeuAcal->-3GalBl-4GlcNAcBl--3 (NeuAca2-*3GalBl->4GlcNAcBl-»-6) GalBl-<-4-GlcNAcBl-+3GalBl-4GlcBCer. C er stoff 3 i tabell 3 (med 2-hydroksy-fettsyre) eller stoff 18 i tabell 1. D er stoff 5 i tabell 3. E kan være stoffene 21 og 22 i tabell 3 (som binder seg svakt i kromatogrammet, se fig. 3, felt 3 for stoff 22) eller de stoffer som er negative i tabell 3. Fig. 5a og 5b viser eksempler på naturlig forekommende molekylære materialer av ceramider (kombinasjoner av fettsyre og langkjedet base). Disse er blitt oppsummert på et annet sted (Karlsson, i Chapman, Red., Biological Membranes, Vol. 4, Academic Press, London, 1982, pp. 1-74). R innbefatter oksygenet av Cl av basen og kan være fosforylkolin som i sfingomyelin eller et sakkarid som i glykosfingolipider. Hovedtypene av fettsyrene er ikke-hydroksy, 2-D-hydroksy og 2-D,3-D-dihydroksy-fettsyrer med ca. 12-2 6 karbonatomer i kjeden, som kan være mettet, umettet, lineær eller forgrenet. Hovedtypene av baser ei dihydroksy (sfingosin, dihydrosfingosin og beslektede baser) og trihydroksy-baser (fytosfingosin og beslektede baser). De har ca. 14-22 karbonatomer, og kjeden kan være mettet, umettet, lineær eller forgrenet. De absolutte strukturer av de tre klassiske baser er: Sphingosin: 1,3-D-dihydroksy-2-D-amino-4-trans-oktadecen (av materialer B og D), dihydrosfingosin: 1,3-D-dihydroksy-2-D-aminooktadekan (av materiale A) og fytosfingosin: 1,3-D,4-D-trihydroksy-2-D-aminooktadekan (av materialer C, E og F). De vanligste materialer i pattedyrceller er A-E, ofte med en 15-cis dobbeltbinding i fettsyren. De vanligste materialer av epitelceller er D og E, som er de beste virusbindere (tabell 4). Derfor har viraene valgt, som annettrinns-reseptorer, glykolipider med en ceramidsammensetning som dominerer i epitelcellene, innfallsporten for virusinfeksjoner. Fig. 6 viser konformasjonen av annettrinns-reseptoren som oppnådd ved enkeltkrystall-røntgenkrystallografi av syntetisk stoff 1 i tabell 3 med dihydrosfingosin og 2D-hydroksy-stearinsyre (kfr. Pascher et al., Chem. Phys. Lipids 20, 1977, pp. 175-191). Nitrogenet er forsynt med prikker og karbonyloksygenet og C20 i syren er skravert. Stoffet ble syntetisert som beskrevet i Pascher, Chem. Phys. Lipids 12, 1974, pp. 303-315, og krystal-lisert fra 95 prosent av etanol. Røntgendataene ble samlet opp på et Picker FACF I defraktometer, og mer enn 5000 uavhengige refleksjoner ble målt. Alle beregninger ble utført på et DEC-10 datamaskinsystem ved bruk av hovedsakelig X-RAY-72-programsyste-met . Fig. 7 viser et tynnskikt-kromatogram påvist med anisaldehyd for å illustrere eksistensen av annettrinns-reseptorglykolipider i epitelceller fra tynntarmen hos mennesker. Epitelceller og samlede ikke-sure glykolipider ble fremstilt og identifisert som beskrevet i Materialer og Metoder. Dobbeltbåndene som er felles for de fire felter, er blitt identifisert som en blanding av 1 og 2 i tabell 3, de to mest optimale naturlige virusbindere (eksempel 2 og fig. 4). De mer langsomtgående glykolipider er blodgruppe-fukolipider og varierer blant de fire individer som ble analysert, som hadde følgende blodgruppe-fenotyper. Felt 1: A^Le (a-b+), sekretor; felt 2: OLe (a-b+), sekretor; felt 3: OLe (a+b-), ikke-sekretor; felt 4: OLe (a-b-), sekretor. Sammensetningen av disse prøver er blitt beskrevet av Bjork et al., i Cartron et al., Red., Red Cell Membrane Glycoconjugates and

Related Genetic Markers, Libraire Arnette, Paris, 1983, pp. 125-137.

Fig. 8 viser det strukturelle konsept av det ytre monolag av dyrecelle-overflatemembranen som beskrevet i detalj på et annet sted (Karlsson, i Chapman, Red., Biological Membranes, Vol. 4, Academic Press, London, 1982, pp. 1-74). De tre viktigste lipidkomponenter er sfingolipid, glycerolipid og kolesterol, og i den mellomliggende sone bærer de en rekke hydrogenbinding-akseptorer og -donorer som danner et system av intermolekylært lateralt orienterte hydrogenbindinger, som er viktige for membranstabilitet. Bindingsseter er spesielt tette i epitelceller av slimhinner, som er innfallsporten for virusinfeksjoner. Som vist i eksempel 4 er epitelceller tallrike i annettrinns-reseptoren (stoff 1 og 2 i tabell 3), som er et sfingolipid inneholdende både hydrogenbinding-akseptorer og -donorer. Planteceller inneholder også stoff 2 i tabell 3, foruten stoff 26 og 27 i tabell 3, som er glyserollipider. Disse binder viraene (tabell 3). Vira har derfor utviklet en egenskap (gjennom et overflatepeptid) som er istand til å anvende, for selektiv binding, alle tre deler av overflatemembranen som er nødvendige for å gjøre membranen til en stabil barriere. På denne måte er annettrinns-reseptoren for viruspenetrasjon og infeksjon en normal komponent av alle celleoverflater.

Materialer og Metoder

Fremstilling og strukturell karakterisering av den naturlige reseptor og beslektede stoffer

De humane og animalske glykolipidprøver brukt for bindingsunder-søkelser, enten rene glykolipidmaterialer eller totale eller partielle glykolipidblandinger, ble fremstilt stort sett som beskrevet i henvisning 13 fra lyofilisert vev ved gjentatte kloroform/metanol-ekstraksjoner, mild alkalisk behandling for å bryte ned ikke-sfingolipider, og dialyse i 4 dager mot vann for å fjerne vannoppløselige produkter. Gjenværende lipidmateriale blir først separert på en silikagel-kolonne for å eluere de dominerende fettsyreestere før de samlede alkalistabile sfingolipider. Disse blir deretter separert på DEAE-cellulose eller DEAE-Sepharose-kolonner i en ikke-sur og sur glykolipidfraksjon. Den sure fraksjon blir deretter separert ved gradienteluering fra DEAE-Sepharose . Den ikke-sure fraksjon acetyleres i eddiksyreanhydrid og pyridin og blir fraksjonert gjentatte ganger på silikagel med trinnvis eller kontinuerlig gradienteluering med metanol i kloroform eller andre oppløsningsmidler. Fraksjonene blir deacetylert i mild alkali og ytterligere fraksjonert inntil de er rene om nødvendig. Renhet testes ved tynnskiktkromatografi og undersøkes ytterligere ved massespektrometri og NMR-spektroskopi som beskrevet nedenunder.

For å fremstille glykolipider fullstendig frie for ikke-glykolipid-forurensninger, blir 250 ml metanol satt til ca. 250 ml menneskelig blodplasma i en overføringsenhet, og blandingen varmes opp til 7 0°C i 3 0 minutter med konstant omrøring i en 1 liters fordampningskolbe. Ekstraktet filtreres og residuet overføres tilbake til ekstraksjonskolben. Fremgangsmåten gjentas to ganger med 250 ml kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum) og en gang med 250 ml metanol. De kombinerte ekstrakter fordampes til tørrhet med tilsetning av små volumer toluen.

Små mengder våte celler kan ekstraheres på lignende måte. I større målestokk blir vevet først lyofilisert i biter og deretter underkastet ekstraksjon i to trinn i et Soxhlet-apparat. Når det gjelder tynntarm fra menneske (f.eks. 13 0 g tørr vekt), er den første ekstraksjon med kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum) i 24 timer (1000 ml oppløsningsmiddel i en 2 000 ml rund kolbe plassert i et asbestisolert elektrisk oppvarmingsapparat). Den andre ekstraksjon utføres med 1500 ml kloroform/metanol 1:9 (regnet på volum) i 24 timer. De kombinerte ekstrakter fordampes til tørrhet uten filtrering.

Den tørkede plasmaekstraktrest behandles med 50 ml 0,2 M KOH i metanol i 3 timer i en kolbe inneholdende fem glassperler for fin dispergering med risting fra tid til annen. KOH nøytralise-res med 1 ml eddiksyre. Blandingen dialyseres mot vann i en dialysepose etter tilsetning av 100 ml kloroform og 40 ml vann for å gi et tofase-system. Etter dialyse i 4 dager mot rennende ledningsvann blir innholdet av posen fordampet ved 70°C ved gjentatte tilsetninger av toluen. Prøven blir tilslutt filtrert og eluert med kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum) og metanol. Når det gjelder det totale tarmekstrakt blir 500 ml KOH 1 metanol benyttet.

Plasmaprøven (ca. 1,4 g) lastes på en 10 g kolonne av silikagel pakket i kloroform. Silikagelen som benyttes fås hovedsakelig fra Mallinckrodt Chem. Works, St. Louis, USA, siktet til en partikkelstørrelse på mer enn 4 5 /im og tørket. LiChroprep Si 60 (E. Merck, Darmstadt, Vest-Tyskland) med sammenlignbare spesifi-kasjoner har imidlertid lignende egenskaper, skjønt noe av silikagelen kan bli eluert. Tre fraksjoner elueres: 100 ml kloroform eluerer hovedmassen (ca. lg) av ekstraktet (kolesterol og metylestere av fettsyre), 100 ml kloroform/metanol 98:2 (regnet på volum) kan inneholde fritt ceramid; 100 ml kloroform-/metanol 1:3 (regnet på volum) og 100 ml metanol eluerer alle glykolipider og alkalistabile fosfolipider (ca. 60 mg). Når det gjelder den dialyserte prøve av tynntarm (ca. 40 g), blir 50 g silikagel og 500 ml oppløsningsmiddel brukt i hvert trinn.

Den tredje fraksjon fra silikagelkromatografi av plasmaprøven lastes på en kolonne av 5 g DEAE-cellulose (DE-23, Whatman) i acetatform pakked i kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum). Den lastede prøve tillates å ekvilibrere på kolonnen i 1 eller 2 dager. To fraksjoner elueres, en med 100 ml kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum) og 100 ml metanol som eluerer ikke-sure glykolipider og alkalistabile fosfolipider, hovedsakelig sfingomyelin, og en med 50 ml av 5 prosent (vekt/volum) LiCl i metanol som eluerer sure glykolipider (sulfatider og gangliosider) og alkalistabile fosfolipider. Den sistnevnte fraksjon dialyseres med 3 0 ml kloroform og 20 ml vann mot rennende ledningsvann i 4 dager. Den kan benyttes som en samlet sur glykolipidfraksjon eller behandles videre som beskrevet for å separere sulfatider og gangliosider (Breimer et al., J. Biochem. 93, 1983, pp. 1473-1485). Den første fraksjon fordampes til tørrhet og acetyleres. Hva angår tynntarmprøven (ca. 2 g), blir 2 0 g DEAE-cellulose benyttet.

Acetylering av den tørre ikke-sure plasmaprøve utføres i mørke over natten i 2 ml kloroform, 2 ml pyridin og 2 ml eddiksyreanhydrid. Kloroformen tilsettes for å forbedre oppløseligheten og sikre fullstendig reaksjon. 5 ml metanol og 5 ml toluen tilsettes, og prøven fordampes i en strøm av nitrogen på et oppvarmet vannbad og underkastes til slutt vakuumsuging.

Den acetylerte plasmaprøve lastes på en 10 g kolonne av silikagel pakket i kloroform/metanol 98:2 (regnet på volum). For dette formål blir der benyttet partikler mindre enn 45 jum, behandlet med metanol og tørket. Tre fraksjoner elueres: 100 ml kloroform/metanol 95:5 (regnet på volum), 100 ml kloroform/metanol 90:10 (regnet på volum), og 100 ml kloroform/metanol 1:3 (regnet på volum) pluss 100 ml metanol. Den tredje fraksjon inneholder hovedsakelig acetylert sfingomyelin. De første to fraksjoner som inneholder acetylerte glykolipider og noen forurensninger, fordampes sammen og deacetyleres. For tynntarmfraksjonen benyttes 50 g silikagel.

Deacetylering av acetylerte glykolipider kan utføres på to måter, en med og en uten et dialysetrinn.

Metode A. For plasmaprøven blir 2 ml toluen, 2 ml metanol og 4 ml 0,2 M KOH i metanol benyttet med omristing fra tid til annen i løpet av 3 0 minutter (for tynntarmprøven blir henholdsvis 5, 5 og 10 ml brukt). Etter tilsetning av 0,5 ml eddiksyre blir prøven overført med 10 ml kloroform og 10 ml vann til en dialysepose (tofase-system) og dialysert i 4 dager mot rennende ledningsvann. Innholdet av posen fordampes ved 70°C med gjentatte tilsetninger av toluen.

Metode B. I dette tilfelle er ingen dialyse nødvendig, da mengden av kaliumacetat som dannes etter nøytralisering er meget lav, sammenlignet med glykolipidet. Reagensen er sammensatt av 1 ml 0,2 M KOH i metanol, 14 ml metanol og 5 ml toluen. Av dette blir 0,1 ml brukt for inntil 2 mg acetylert glykolipid, 0,2 ml for inntil 4 mg, 0,5 ml for inntil 15 mg, 1 ml for inntil 40 mg osv. Prøven som skal deacetyleres fordampes til tørrhet, den riktige mengde reagens tilsettes, og blandingen omrøres fra tid til annen i 2 timer, hvoretter KOH nøytraliseres med eddiksyre og oppløsningsmidlene fordampes. Som et eksempel gir deacetylering av 40 mg acetylert glykolipid med 1 ml reagens ca. 1 mg kaliumacetat som blir tilbake i glykolipidprøven. Om nødvendig kan kaliumioner fjernes ved filtrering gjennom f.eks. kloroform/metanol-vasket Amberlite£ CG-50 type I i H+<->form (Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania, USA), og deacetyleringsblan-dingen uten tilsatt eddiksyre kan filtreres direkte. En viss irreversibel adsorpsjon av glykolipid kan imidlertid finne sted, og eluert harpiks kan også forurense. Det foretrekkes derfor at en viss mengde kaliumacetat blir tilbake i prøven.

Den deacetylerte plasmaprøve filtreres gjennom en kolonne på 2 g DEAE-cellulose pakket i kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum). Den lastede prøve tillates å ekvilibrere i 1-2 dager før eluering med 50 ml kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum) og 50 ml metanol. Hensikten med dette trinn er å fjerne alkalistabile aminogruppeholdige fosfolipider, som er blitt overført inn i N-acetylerte derivater under acetyleringsfremgangsmåten. Dette gjør dem sure.

Et endelig silikagelkromatografi-trinn fjerner ikke-polare forurensninger eluert i de første to fraksjoner. Plasmaprøven lastes på en kolonne på 5 g silikagel (partikler mindre enn 45 fim) pakket i kloroform/metanol 98:2 (regnet på volum). Etter eluering av to fraksjoner med hver 50 ml kloroform/metanol 98:2 (regnet på volum), blir de rene glykolipider eluert med 50 ml kloroform/metanol 1:3 (regnet på volum) og 50 ml metanol. Det endelige utbytte av samlede ikke-sure glykolipider i plasma fra én overføringsenhet humant blod er 6-8 mg.

Fremstillingstrinnene reguleres ved tynnskiktkromatografi (silikagel 60 nanoplater; E. Merck, Darmstadt, Vest-Tyskland), fortrinnsvis ved bruk av kloroform/metanol/vann 65:25:4 (regnet på volum) for ikke-derivatiserte og kloroform/metanol 95:5 (regnet på volum) for acetylerte prøver. Anisaldehyd foretrekkes som en deteksjonsreagens fordi den danner karakteristiske farger: glykolipider blir som regel grønne eller blågrønne, glycerofosfolipider grå eller violette, og sfingomyelin og ceramid blå (se henvisning 21).

Fremgangsmåten angitt ovenfor fører til en samlet ikke-sur glykolipidblanding (en til ca. 20 sukkere) fullstendig fri for ikke-glykolipid-forurensninger. Denne fraksjon er viktig for testing av nærværet av annettrinns-reseptoren i forskjellige cellekilder (se fig. 2 og 7). For å isolere annettrinns-reseptoren i ren form fra slike glykolipidblandinger, kan det endelige silikagelkromatografi-trinn beskrevet ovenfor modifiseres noe som følger. Etter eluering med kloroform/metanol 98:2 (regnet på volum) blir en-sukker annettrinns-reseptoren lett eluert med kloroform/metanol 95:5-90:10 (regnet på volum). For fremstilling i stor målestokk fra utvalgte kilder kan imidlertid fremgangsmåten beskrevet ovenfor forenkles en hel del, som angitt nedenunder. Tilgjengelige annettrinns-reseptorkilder kan være pattedyr-tynntarm (se fig. 7), gjær eller sopper, eller noen hvirvelløse dyr. F.eks. er det vist at sjøstjerne, Asterias rubens, som er lett tilgjengelig fra havet, er en rik kilde til annettrinns-reseptor (stoff 2 i tabell 3, se Bjørkman et al., Biochem. Biophys. Acta 270, 1972, pp. 260-265). Pattedyrhjernen er også en meget rik kilde til annettrinns-reseptoren i form av stoff 1 i tabell 3. For dette formål blir lyofilisert hjerne (f.eks. kveg- eller svinehjerne) ekstrahert med kloroform/metanol 2:1 (regnet på volum) (ved et volum som er 10 ganger større enn vevets volum) under forsiktig oppvarming. Det filtrerte ekstrakt fordampes til tørrhet og reekstraheres med det samme oppløsningsmiddel og filtreres. Det fordampede ekstrakt underkastes alkalisk metanolyse over natten (begrenset volum, f.eks. 500 ml for én hjerne, av 0,2 M KOH i metanol). Blandingen blir deretter overnøytralisert med eddiksyre til en pH-verdi på ca. 3,5 og oppløsningen skilt ved justering av volumene til kloroform/metanol/vann 8:4:3 (regnet på volum). Etter å ha stått over natten, blir den nedre fase fordampet til tørrhet og underkastet silikagelkromatografi. Dette trinn utføres som en slags filtrering ved bruk av en kort, bred kolonne pakket i rent kloroform og lastet med inntil 1 g ekstrakt pr. g adsorbent. Hoveddelen av ekstraktet elueres med rent kloroform (kolesterol og metylestere av fettsyrer). Annettrinns-reseptoren GalBCer, elueres med kloroform/metanol 95:5-90:10 (regnet på volum). I den senere elueringsfase kan sulfatert GalBCer forurense. For å forbedre utbyttet av GalBCer, kan denne blanding filtreres gjennom DEAE-cellulose, som binder den sulfaterte substans. Om nødvendig kan de siste spor av pigmenterte stoffer fjernes ved krystallisering i etanol. Nøyaktig den samme fremgangsmåte kan anvendes på lyofilisert sjøstjerne. I dette tilfelle blir kolesterolsulfat, og ikke sulfatert GalBCer, fjernet ved DEAE-cellulose.

Strukturanalyse av isolerte fraksjoner utføres på ikke-nedbrutte prøver ved massespektrometri (se henvisning 14) og NMR-spektroskopi (se henvisning 15) og en kombinert bruk av permetylert, permetylert LiAlH4-redusert, og (i tilfellet for sure glykolipider) permetylert LiAlH4-redusert trimetylsilulerte derivater. På denne måte oppnås sekvensen og anomeriteten av oligosakkaridet og sammensetningen av ceramidet. Nedbrytning utføres også for å motta informasjon angående typen sukkere og stillinger av kobling gjennom kombinert gasskromatografi og massespektrometri som beskrevet i henvisning 16.

En rekke syntetiske ceramider ble benyttet, innbefattet kombina-sjonene sfingosin/ikke-hydroksy-fettsyre, sfingosin/hydroksy-fettsyre, fytosfingosin/ikke-hydroksy-fettsyre og fytosfingosin-/hydroksy-fettsyre (se henvisning 17). Lignende naturlige kombinasjoner av langkjedet base og fettsyre ble også fremstilt ved bruk av fremgangsmåten som det henvises til ovenfor.

Sfingomyelin ble oppnådd ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Forskjellige fosfoglyserider ble fremstilt uten alkalisk nedbrytning og separert på DEAE-cellulose inn i sure (fosfatidylserin og fosfatidylinositol) og ikke-sure fosfolipider. De ikke-sure fosfolipider ble deretter separert på silikagel-kolonner inn i fosfatidyletanolamin og fosfatidylkolin. Stoffene ble testet for renhet ved tynnskiktkromatografi og identifisert ved analyse av komponentene (se henvisning 18). Fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin og fosfatidylserin ble også innkjøpt fra Sigma Chemical Co.

To glykoglyserolipider av planteopprinnelse, galactosyldiglyse-rid og digalaktosyldiglyserid, ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co.

En rekke syntetiske monoglykosylceramider ble mottatt fra Dr. Irmin Pascher, og deres fremstilling er beskrevet i Pascher, Chem. Phys. Lipids 12, 1974, pp. 303-315. Disse var galaktopyra-nosylB- og glukopyranosylBceramider med forskjellige kombinasjoner av langkjedet base og fettsyre, såsom sfingosin, dihydrosfingosin, fytosfingosin og 2-hydroksy- og ikke-hydroksy-fettsyrer. Et av disse materialer, galaktopyranosylBceramid med dihydrosfingosin og 2-D-hydroksyoktadekansyre, ble bestemt i sin krystallkonformasjon (Pascher et al., Chem. Phys. Lipids 20, 1977, pp. 175-191) og ble brukt til å angi reseptor-bindingsepitop.

Kjemisk syntese av annettrinns-reseptoren (GalSCer eller GlcfiCer), kan utføres på forskjellige måter som henvist til ovenfor og gjennomgått i detalj i henvisning 13. F.eks. kan dihydrosfingosin (base med formelen A på fig. 5) fremstilles i henhold til Carter et al. eller Jenny og Grob (se henvisning 13). Hydroksy-fettsyre kan kobles til dette ved bruk av p-nitrofenylester (Pascher, Chem. Phys. Lipids 12, 1974, pp. 303-315) av 2-D-acetoksyoktadekansyre (Karlsson et al., Chem. Phys. Lipids 12, 1974, pp. 65-74). Etter fremstillingen av 3-0-benzoyl-derivatet kan acetobromderivater av Gal eller Gle anvendes til fremstilling av GalÆCer eller GlcÆCer (henholdsvis stoff 1 og 2 i tabell 3).

Syntetiske reseptoranaloger og beslektede stoffer

Mono- eller oligosakkarider koblet til en lipiddel eller multivalent til bovinserumalbumin (stoffer 1-5 og 10-14 i tabell 1) ble innkjøpt fra Sockerbolaget (The Sugar Company), Arløv, Sverige. Nye reseptoranaloger av relevans for den foreliggende oppfinnelse (stoffer 6-9 og 15-18 i tabell 1) ble fremstilt av og mottatt fra Dr. Gøran Magnusson, Avdeling for Organisk Kjemi 2, Universitet i Lund, Sverige (Dahmén et al., Carbohydr. Res. 118, 1983, pp. 292-301; Dahmén et al., ibid. 127, 1984, pp. 27-33). De reseptoranaloger som ble anvendt er vist i tabell 1.

Preparering av epitelceller

Epitelceller fra friskt vev ble preparert på to måter: ved vasking og ved skraping. Vasking ble utført med EDTA-holdig fosfatbuffer i tarmløkker som beskrevet i henvisning 19. En løkke (loop) ble fylt med buffer og inkubert i et vannbad ved 37°C ved forsiktig bevegelse/omrøring i noen minutter, hvoretter tarminnholdet ble dekantert av. Dette ble gjentatt 5-10 ganger, og hver fraksjon ble sentrifugert og celler undersøkt ved mikroskopi og markørenzym-analyser (alkalisk fosfatase, tymidin-kinase). Fraksjoner inneholdende rene epitelceller ble slått sammen og brukt i fremstillingen av glykolipider som angitt ovenfor. På denne måte ble epitelceller fra tynn- og tykktarmen fra en rekke menneskelige individer og av rottestammer analysert. Tynntarm fra menneske ble også forsiktig skrapet med en skje for oppnåelse av epitelceller som var noe forurenset med ikke-epitelrest. På lignende måte ble epitelceller fra menneskelig urinvei oppnådd, samt epitelceller fra tynntarmen hos hund og mus. Tynntarmen fra flere andre dyr ble analysert, innbefattet katt, torsk, marsvin, hamster, høne og kanin (se henvisning 20). Foruten massespektrometri etc. for informasjon angående ceramidkomponenter, ble prøvene kjørt på en boratimpregnert silikagelplate hvor monoglykosylceramider separerer både i henhold til Gal og Gle og de viktigste ceramidkombinasjoner av sfingosin, fytosfingosin, ikke-hydroksy- og 2-hydroksy-fettsyre (se henvisning 21).

Viruspreparater og antistoffer

I de reseptoranalyser som ble anvendt ble bundet virus påvist av antivirus-antistoff. Polyklonale og monoklonale antistoffer ble fremstilt i henhold til standardmetoder (Rose et al., Red., Manual og Clinical Immunology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980). De vira som ble utprøvet var kjente vira som var dyrket og definert i profesjonelle viruslaboratorier ved bruk av etablerte teknikker (Lennette, Red., Manual of Clinical Microbiology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980). De spesielle vira er vist i tabell 2.

Adenovirus 2 og 7 ble formert i A-549-celler og hyperimmune sera ble oppnådd ved etablert immunisering av kaniner (Wadell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 110, 1984, pp. 191-220). Humant rotavirus K8 ble formert i GMK-celler, og et hyperimmunt serum fra kanin ble brukt (Urasawa et al., Microbiol. Immunol. 25, 1981, pp. 1025-1035). Reovirus 1, 2 og 3 ble formert i GMK-celler, og hyperimmunt sera fra kanin ble brukt (Rose et al., Red., op. eit.; Lennette, Red., op. eit.). Epstein-Barr-virus var det B95-8-EB-virus forplantet i lymfoide apeceller og var fremstilt av dr. L. Rymo (Rymo et al., Nucl. Acid Res. 5, 1978, pp. 1387-1402), og antistoffet var monoklonalt antistoff fra MA fra mus skaffet av dr. G. Pearson, Dep. Microbiology, The Mayo Foundation, Rochester, USA. ERA-stammen av rabiesvirus ble formert i BHK-21-celler, antistoffet var monoklonalt antistoff 101-1 fra mus (Dietzschold et al., Proe. Nat. Acad. USA 80, 1983, pp. 70-74), og fremstillingene var skaffet av dr. H. Koprowski (cf. Dietzschold et al., op. eit.). Influensaviruset A/PR/8/34 ble formert i embryonaterte hønseegg, antistoffet var monoklonalt antistoff H2-6A5 fra mus, og disse fremstillinger ble skaffet av dr. W. Gerhard (Caton et al., Cell 31, 1982, pp. 417-427). Influensavirus-stammer X-31 og X-31 HS ble formert i embryonaterte hønseegg og var skaffet av dr. J.C. Paulson (cf. Rogers et al., Nature 304, 1983, pp. 76-78). Disse stammer ble påvist ved overlegging av tynnplatene med en 2 prosent suspensjon av menneskelige erytrocytter (rød. farge for aktive bånd) i 1 time og vasking. Influensavirus-stammer A/Chile/1/83. A/Filip-pinene/2/82 og B/USSR/100/83 ble oppnådd fra SBL (Statens Bakteriologiska Laboratorium), Solna, Sverige. Disse vira ble også påvist ved overlegging med menneskelige erytrocytter. Z-stammen av Sendaivirus ("S"- og "G"-varianter; se henvisning 46 og eksempel 1) ble dyrket i embryonaterte hønseegg eller i Vero-celler, og antistoffet var monoklonale antistoffer 817 og 851 fra mus (Ørvell et al., J. Immunol, 129, 1982, pp. 2779-2787) og anti-Sendai-antistoff 121 fra kanin fremstilt av dr. C. Ørvell. Kilham-stammen av kusmavirus ble formert i Vero-celler, og antistoffet var monoklonalt antistoff fra mus (Ørvell. J. Immunol. 132, 1984, pp. 2622-2629). HTLV-I-virus ble fremstilt av dr. J. Blomberg fra en HTLV-I utsondrende leukemisk T-celle-linje (cf. Blomberg et al., Leukemia Res., 1985, under trykking). HTLV-III ble skaffet av dr. R.C. Gallo, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA. HTLV-I- og HTLV-III-vira ble jodért ved bruk av standard laktoperoksidase-teknikk (Rose et al., Manual of Clinical Immunology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980).

Antistoffene ble utprøvet for fraværet av uspesifisert binding i bindings-analysesystemet ved bruk av alle ingredienser, unntatt virus. På denne måte ble det utelukket at antistoffene bandt seg direkte til spesielle glykolipidbånd, et fenomen som ellers kan gi falske positive resultater.

Undersøkelse for virusbindende spesifisitet og bedømmelse av relativ bindingsstvrke

Undersøkelsen for påvisning av virusbinding til glykolipider og for utprøving av detaljert spesifisitet av binding er blitt utviklet av oppfinnerne og er av avgjørende betydning for oppfinnelsen (cf. Hansson et al., FEBS Lett. 170, 1984, pp. 15-

18). I prinsipp blir det virus som skal undersøkes lagt som et lag på et kromatogram med separerte glykolipider fra målceller eller andre kilder og tillates å reagere med potensielle reseptorstoffer. Etter omhyggelige vaskinger blir bundet virus påvist av antivirus-antistoff og radiomerket anti-antistoff fulgt av autoradiografi. I noen tilfeller ble viruspartikkelen direkte merket før binding. Den detaljerte fremgangsmåte er som følger: Blandinger av samlede lipider (inntil 100 ug i hvert felt) eller samlede glykolipider (20-40 fig i hvert felt) eller rene glykolipider (0,01-1 fig) ble separert på aluminiumplater, ca. 5x5 cm, belagt med silikagel 60 (Merck), som regel med kloroform/- metanol/vann (60:35:8, regnet på volum) som oppløsningsmiddelet for ikke-sure glykolipider og med kloroform/metanol/2,5 M ammoniakk (60:40:9, regnet på volum) som oppløsningsmiddelet for sure glykolipider. For sammenligningsformål blir en parallell plate påvist kjemisk ved spraying og oppvarming med anisaldehyd-oppløsning. For virusbinding blir det tørkede kromatogram med separerte stoffer dyppet i 1 minutt i 2 00 ml dietyleter inneholdende 0,5 prosent (vekt/vol.) av polyisobutylmetakrylat (Plexi-gum P28, Rohm GmbH, Darmstadt) og tørket i 2 minutter. Platen blir deretter sprayet med fosfat-buffret saline (PBS) med pH 7,3 inneholdende 2 prosent bovinserumalbumin (BSA) og 0,1 prosent NaN3 (oppløsning A) og deretter neddykket i oppløsning A og plassert i en petriskål i 2 timer. Etter at oppløsning A er helt av, blir virussuspensjonen tilsatt (ca. 25 jug pr. ml med ca. 2 ml for en plate med de dimensjoner som er gitt ovenfor) til kromatogrammet plassert horisontalt i den fuktede atmosfære av en petriskål. Etter inkubasjon i 2 timer blir virussuspensjonen helt av og platen vaskes seks ganger med PBS, 1 minutt hver gang. I et typisk tilfelle av. antistoff blir monoklonalt antistoff 816 rettet mot Sendaivirus produsert i ascitisk væske fortynnet 1:100 med oppløsning A ved bruk av ca. 2 ml pr. plate, med inkubasjon i 2 timer. Etter vasking fem ganger med PBS blir ca. 2 ml antimus-Fab fra kanin inkubert i 2 timer (4 x IO<5>

125

cpm/ml av I-merket F(ab')2/ the Radiochemical Centre, Amersham). Etter seks vaskinger i PBS blir platen tørket og

eksponert for XAR-5-røntgenfilm (Eastman), vanligvis i 2-3 dager ved bruk av en forsterkningsskjerm.

Behandlingen med plast gir en hydrofob overflate. Separert glykolipid eller andre bånd blir således indusert for å bli eksponert på den hydrofobe faste overflate på samme måte som lipidene blir eksponert i den biologiske membran. Dette betyr at prøvestoffet er tett forankret med sine alkankjeder i plastfla-ten med de polare hodegrupper eksponert og tilgjengelige for miljøet. Dette etterligner overflatemonolaget av den levende celle. Denne plastbehandling er meget kritisk for spesifisiteten og reproduserbarheten, og forklarer fordelen med denne fastfase-metode over tradisjonelle inhibisjonsmålinger basert på "opp-løseliggjorte" aggregater eller miceller (se henvisning 22).

Deteksjonsgrensen varierer med ligandens aviditet, men ligger i området 5-50 ng reseptor, eller i omtrent det samme picomolom-råde. For at en reseptorkandidat skal anses som negativ i resultatene i tabellen, bør der ikke være noen formørkelse på et nivå av 1 nq eller mer. Gode bindere gir mettende sorte bånd ved 100 ng. En åpenbar fordel med denne testmetode er at blandinger av stoffer først separeres inn i de enkelte substanser, hvorved man unngår risikoen for å skjerme minorkomponenter eller falsk negativ binding på grunn av forurensende substanser. Videre blokkerer belegging med albumin uspesifiserte hydrofobe seter som ellers kan forårsake falske positive resultater. Og endelig fjerner de utstrakte vaskinger mer løse, uspesifiserte assosia-sjoner. Til sammenligning inkuberer tradisjonelle inhibisjons-tester vanligvis virus med målceller i suspensjon i fravær eller nærvær av lydbehandlede miceller. Hva angår hemolyse-undersøkel-sen, blir enkel fotometri utført på blandingen etter sentrifugering (cf. Huang, Lipids 18, 1983, pp. 489-492). Således er der ikke noe albumin tilstede, og der er ingen vasketrinn analogt med den foreliggende undersøkelsesmetode.

For kvantifisering av virusbinding ble der adoptert en teknikk fra den analoge fastfase-binding eller antistoffer til mikroti-terbrønner (Brockhaus et al., J. Biol. Chem. 256, 1981, pp. 13223-13225). En fortynningsserie av glykolipid eller andre stoffer i 50 til metanol tillates å fordampe i mikrotiterbrønnen over natten ved værelsestemperatur. 100 jul av 2 prosent BSA i PBS blir deretter inkubert i 2 timer,' hvoretter brønnen renses 1 gang med dette volum og oppløsning. 50 jxl av en suspensjon av 1,5 ug av virus i BSA-PBS inkuberes i 4 timer, fulgt av fire vaskinger med 100 ^1 hver av BSA-PBS. Når det gjelder Sendaivirus, blir 50 ul antistoff 817 produsert i ascitisk væske, fortynnet 1:100 i oppløsning A, inkubert i 4 timer, fulgt av fire vaskinger. Til slutt blir 50 ul antimus-Fab fra kanin (2,5 x 104 a cpm <125> I-merket F(ab')2, the Radiochemical Centre, Amersham) inkubert over natten ved 4°C, fulgt av fem 100 /xl vaskinger med BSA-PBS. Brønnene skjæres fra platen og analyseres hver for seg for 125i i et spektrometer.

InhibisionsundersøkeIser

Forsøk på å inhibere bindingen av virus ved hjelp av de to undersøkelser beskrevet ovenfor ble utført ved en preinkubasjon av viruset i en eller to timer med inntil 2 mg pr. ml fritt sakkarid eller BSA-konjugert sakkarid i PBS eller BSA-PBS. Denne blanding blir deretter i sin helhet satt til platen eller brønnen.

Inhibisjonsundersøkelser ble også utført ved hjelp av en ELISA-r teknikk (enzym-koblet immunosorbent undersøkelse) som følger (se henvisning 1 og Rose et al., Red., Manual of Clinical Immunology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980). I dette tilfelle ble mikrotiterbrønner (type Cooks M 29) belagt med glykolipid i metanol som beskrevet ovenfor, eller med kanin-anti-Sendai-antiserum som en standardisert sammenligning (se henvisning 1). De glykolipider som ble anvendt var GalBCer, som er en virusbinder, se glykolipid 1 i tabell 3 (ca. halvparten av fraksjonen inneholdt ikke-hydroksy-fettsyre, og dette materiale er inaktivt) og globosid, som er en ikke-binder, se glykolipid 16 i tabell 3, bege ved 500 ng pr. brønn. 50 fxq/ ml antiserum i natriumbikarbonat-buf f er, pH 9,6 (100 jul/brønn) ble tilsatt. Brønnene ble deretter mettet i 2 timer ved 37°C med 2 prosent BSA i 50 mM Tris-HCl og 0,15 M NaCl-buffer, pH 8,5, og deretter vasket to ganger med denne buffer som inneholdt 1 prosent BSA. 1,5 jug pr. brønn Sendaivirus i 100 ixl 1 prosent BSA-buffer ble inkubert i 2 timer, fulgt av fire vaskinger med 100 /il hver av 1 prosent BSA-buffer. Påvisning av bundet virus ble utført ved inkubasjon i 1,5 timer ved 37°C med 100 /il antistoff 851 fortynnet 1:100 med buffer, fulgt av fire vaskinger med 100 /il hver av bufferen. 100 /il pepperrotperoksidase-konjugert antimus-antistoff fra kanin (Dakopatts, Glostrup, Danmark; P 161, 10 mg/ml fortynnet 1:500) ble inkubert i 1,5 timer ved 37°C, fulgt av fire vaskinger med buffer. 100 /il pr. brønn OPD-oppløsning (4 mg ortofenylendiamin, Sigma, oppløst i 10 ml 0,1 M natriumcitrat-fosfat-buffer, pH 5,0, til hvilken var blitt tilsatt 4 /il 30 prosent H202), ble inkubert i 15 minutter, og deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 50 /il 0,5 M H2S04 pr. brønn. Optisk lesing ble utført ved 492 nm. Typiske verdier var som følger: alle trinn unntatt virus = 0,150; binding til globosid = 0,200; binding til GalBCer = 0,650; binding til antiserum = 1,7.

Inhibisjon av virusbinding ved stoff 9 i tabell 1 ble utført som følger. Ca. 2 /ig virus ble preinkubert i et silikonisert reagensrør med ca. 200 /ig stoff 9 i 2 timer ved 37°C og deretter overført i 50 /il porsjoner til brønnene og inkubert i 1 time ved 37°C, fulgt av fire vaskinger med bufferen inneholdende 1 prosent. BSA. De etterfølgende trinn ble utført som beskrevet ovenfor. Stoff 9 ble fortynnet 1:4 i 7 separate preinkubasjons-trinn.

Innledende forsøk ble også utført på inhibisjonen av virusbinding i de to undersøkelser beskrevet ved preinkubering av viruset som ovenfor med lydbehandlede miceller av amfipatiske glykolipider og andre stoffer. Dette ble gjort for Sendaivirus. Plaque-inhibisjonsforsøk (Lycke et al., Red., Textbook of Medical Virology, Butterworths, London, 1983) ble utført med den ERA-lignende virusstamme CVS-3337 som følger: Fosfatidylkolin (200 /ig) , kolesterol (100 /ig) og GalBl-+4GlcJ3Cer med 2-hydroksy-f ettsyre (230 /ig) eller de første to lipider og f osf atidylserin (200 /ig) ble oppløst i kloroform/metanol og oppløsningsmiddelet fordampet i et rør. 4 ml PBS ble tilsatt og blandingen lydbehandlet i en Vetrasonics modell W-370 i 1/2 time ved værelsestemperatur. Viruset ble fortynnet med PBS for å gi tilnærmet 4 x IO<3> plaque-dannende enheter pr. ml. 0,5 ml virus og 0,5 ml lydbehandlede miceller (eller PBS som sammenligning) ble inkubert i 3 timer ved værelsestemperatur. Fortynninger og titrering av gjenværende infektiøs virus på CER-cellemonolag utføres under standardbetingelser (Lennette, Red., Manual of Clinical Microbiology, Americ. Soc. Microbiol., WashingtonD.C., 1980).

Eksempel 1

Oppdagelse av annettrinns-reseptoren

Sendaivirus ble brukt som modellviruset for analyse (cf. overlegnings-undersøkelsesmetoden beskrevet i Materialer og Metoder), fordi den er forholdsvis godt undersøkt med hensyn til sin binding til neuraminsyre-holdige reseptorer (førstetrinns-reseptoren) , (se henvisning 26) (fig. 1 og 2 viser bindingen av viruset til de konseptuelle henholdsvis førstetrinns- og annettrinns-reseptorer). Preparater av viruset fremstilt som beskrevet i Materialer og Metoder ble analysert, og to tidligere ukjente reseptorbindings-varianter av Z-stammen ble vist å bære separate spesifisiteter hva angikk bindingen til neuraminsyre-holdige glykolipider (gangliosider). S-varianten bandt seg til gangliosider av menneskelige erytrocytter kun, men ikke til gangliosider av den menneskelige hjerne (fig. 1). G-varianten på den annen side, bandt seg til gangliosider fra begge kilder (ikke vist). Det er kjent at gangliosidene fra de to kilder er strukturelt beslektet, men avviker i sine kjernesekvenser. Kløyving av neuraminsyren av enzymet neuraminidase fra gangliosidene opphever således fullstendig bindingen av de to viruspreparater. Dette viser at bindingen til gangliosider er fullstendig avhengig av nærværet av neuraminsyre, men at bindingsepitopen av glykolipidene også innbefatter ikke-neuraminsyre-delene, som er forskjellige i hjerne og erytrocytt. Førstetrinns-reseptor-spesifisiteten i disse to tilfeller avviker derfor og bør svare til separate kjemisk forskjellige seter på de to vira som gjenkjenner reseptorene. At flere bånd i undersøkelsen kan binde seg, forklares ved nærværet av reseptorepitopen på kjernesubstanser av forskjellige størrelser, som avviker med hensyn til kromatografisk mobilitet. Det faktum at G-varianten av viruset binder seg til gangliosider av begge opprinnelser, kan forklares ut fra en mindre streng spesifisitet i bindingen, sammenlignet med S-varianten.

I motsetning til den forskjellige binding til gangliosider (førstetrinns-reseptorer), binder de to varianter annettrinns-reseptorene på identisk måte. Dette er vist for S-varianten på fig. 2. Som det skal forklares i nærmere detalj i eksempel 2, er denne binding til glykolipider som mangler neuraminsyre, og er således kjemisk forskjellig fra førstetrinns-bindingen.

Dette viser at et virus kan ha to kjemisk forskjellige og separate reseptorer. Videre viser resultatene oppnådd i under-søkelsen spesifisiteten av fremgangsmåten som forklart i beskrivelsen og i Materialer og Metoder. Den selektive binding er åpenbar når man sammenligner de mønstre som ble oppnådd ved autoradiografi (virusbinding) med kjemisk påsprøyting (alle stoffer gjort synlige). Noen større bånd som kom til syne fra påsprøyting og som er strukturelt nær beslektet med reseptorstoffene, er fullstendig negative for virusbinding (cf. eksempel 2) .

Eksempel 2

Analyse av naturlige reseptorkandidater for bindingsspesifisitet med hensyn til forskjellige vira

Et stort antall reseptorkandidater (tabell 3) ble analysert for bindingsaktivitet ved bruk av overdekningsmetoden beskrevet i Materialer og Metoder.

Blandinger av ekstrakter fra målceller eller vev for virusinfeksjoner ekstrahert ved hjelp av organiske oppløsningsmidler, som beskrevet i Materialer og Metoder, ble pre-separert på kromato-gramoverflaten, hvilket tillot påvisning av aktive substanser etter overdekning med det aktuelle viruspreparat. Et bindings-stoff ble isolert og strukturelt karakterisert og brukt i ren form for mer detaljerte bindingsstudier. Sendaivirus ble først brukt i disse analyser. Da en enkelt overdekningsundersøkelse kan inneholde mer enn 100 stoffer av en mangeartet struktur, ble en meget effektiv utvelgelse av faktiske reseptorer oppnådd. Ved bruk av menneske- og dyrevev av forskjellige typer, f.eks. nervevev, blod, fordøyelsessystem, urinvei, og omfattende både voksent vev og fostervev, var det kun glykolipidene merket med en + i tabell 3 og ytterligere definert i tabell 4 som var vist å være reseptorer. Der var ingen binding på relevante nivåer av andre overfaltemembran-stoffer eller andre stoffer, såsom kolesterol eller forskjellige glyserofosfolipider som ble koekstrahert i de anvendte fremgangsmåter. På den annen side viste flere av de vira som ble analysert (cf. tabell 2) innbefattet Sendaivirus (cf. eksempel 1), en glykolipidbinding som var forskjellig fra den i tabell 3 og 4 som var kjemisk forskjellig og svarte til førstetrinns-reseptoren.

En viktig oppdagelse var at bindingen til de naturlige reseptorer avhenger av sammensetningen av den lipofile del av glykolipidet, ceramidet, som definert i tabell 4 og vist for noen materialer i fig. 3. Bare materialer med 2-D-hydroksy-fettsyre i ceramidet er aktive. Derfor ble alle naturlige glykolipider som ble anvendt for detaljert utprøving angående betydningen av variasjoner i karbohydratdelen (tabell 3) valgt for nærværet av 2-hydroksy-fettsyre. Materialer henvist til i tabell 3 som positive er aktive når de inneholder 2-hydroksy-fettsyre, men inaktive når de inneholder ikke-hydroksy-fettsyre.

Viruset kan binde glykolipider med inntil fem sukkere (tabell 3). De kvantitative bindingsstudier (cf. Materialer og Metoder) avslører imidlertid at en-sukker substanser GalftCer og GlcÆCer er de beste bindere. På fig. 4 representerer kurve A disse to glykolipider. Kurve C representerer to-sukker glykolipid 3 i tabell 3, og kurve D representerer tre-sukker glykolipid 5. Det er viktig å merke seg at aviditeten (styrken) av bindingen for denne annettrinns-reseptor er av samme størrelsesorden som den for den etablerte førstetrinns-reseptor (kurve B). Bindingen til større glykolipider er derfor forklart ved en gjenkjennelse av en indre del av molekylene. En slik uvanlig binding er ikke uventet i lys av oppfinnernes resultater fra karbohydrat-reseptorbinding for flere bakterier og bakterielle toksiner (se henvisning 23, 25 og 46). Det faktum at noen (størstedelen) av de glykolipider som ble utprøvet ikke binder, skjønt de inneholder bindingsepitopen, f.eks. -*4GlcBCer, begrunnes ved en sterisk hindring i den store viruspartikkels adgang til denne en-sukker epitop. Videre er der også bevis for en stereospesifisitet på det molekylære nivå, hvilket tillater bruken av begrepet reseptorspesifisitet, og er et sterkt argument mot en uspesifik interaksjon.

Det er av interesse for videre anvendelser at planter er kjent å inneholde reseptor-glykosfingolipider (se henvisning 41). Stoff 2 i tabell 3 med 2-hydroksy-fettsyre er et dominerende glykolipid i planteblader. Videre er stoffer 26 og 27, som er vist å binde Sendaivirus, forholdsvis utbredt i planter og kan tjene som reseptorer for plantevira.

Den oppdagelse at der ikke er noen binding til fritt ceramid (som mangler karbohydrat), er viktig for tolkningen av bindingsepitopen av reseptorstoffene. Videre, i undersøkelsen, er der ingen inhibisjon eller binding av virus til reseptorer når man tilsetter forskjellige frie oligosakkarider eller oligosakkarider, f .eks. GalB, GlcB eller GalBl-»-4GlcB, koblet multivalent til albumin (cf. eksempel 6). Fra dette kan den konklusjon trekkes at der er binding kun til glykolipidet, hverken ceramid alene eller sakkarid alene (eller koblet til et protein) er i stand til å reagere med viruset.

De kurver som fås fra de kvantitative bindingsundersøkelser (fig. 4) antyder at aviditeten av bindingen er meget lik for første- og annettrinns-reseptorene (henholdsvis kurve B og A). Da førstetrinns-reseptoren allerede er blitt undersøkt for biologisk relevans (se henvisning 3), betyr dette at bindings-aviditeten for annettrinns-reseptoren er på et biologisk tilstrekkelig nivå. Videre er den beste annettrinns-binder den som har ett sukker (sammenlign kurveneA, C og D), og noen bindere med flere sukkere kommer ikke opp (kurve E), skjønt bindingen er klart påvisbar i overdekningsundersøkelsen (tabell 3) •

En andre konklusjon fra kvantitative analyser ved hjelp av denne undersøkelsesmetode er at bindingen er av lavaffinitets-typen som trenger multivalens for å være effektiv. Dette er basert på en sammenligning i den samme test av virusbinding med bindingen av flere bakterier og bakterielle toksiner til deres respektive reseptor-glykolipider. Flere bakterier (se henvisning 23 og 46) og Shigatoksinet (se henvisning 25 og 46) binder på lignende måte til viruset (kurvene stiger ved. lignende nivåer av reseptor-fortynning). På den annen side, når det gjelder koleratoksin (lignende størrelse som Shigatoksin), flyttes kurvens stigning til venstre ved en 10<2->10<3> større reseptorfortynning. Disse forskjellige beliggenheter av kurvene faller sammen med mulighe-ten for å hindre ligandbinding til reseptor-glykolipidene ved bruk av oppløselige univalente oligosakkarid-reseptoranaloger. Koleratoksin er lett hindret, men for Shigatoksin er der ingen påviselig inhibisjon på nivået av 5 mg/ml av reseptor-disakkaridet. Shigatoksinet blir imidlertid lett hindret ved bruk av disakkaridet koblet multivalent til albumin. Konklusjonen er en høyaffinitets-binding i tilfellet koleratoksin, og en lavaffinitets-binding i tilfellet Shigatoksin, idet den sistnevnte trenger multivalens for å være virksom. En lignende situasjon som for Shigatoksin eksisterer for en rekke bakterier. Da kurvene for virusbinding faller sammen med den for Shigatoksin og flere bakterier, men ikke med den for koleratoksin, er virusbindingen av lavaffinitets-typen. Derfor vil anvendelse av den naturlige bindingsepitop for virusbinding synes å behøve en multivalent presentasjon. Denne foreligger i bindingstestene og i den biologiske membran (eksempel 4) og svarer til en flerhet av bindingsproteiner på virusoverflaten.

Fremgangsmåten beskrevet ovenfor for Sendaivirus ble utvidet til en rekke andre vira, som representerer de fleste kjente virusfamilier (tabell 2). Alle vira vist i tabell 2 ble vist å binde på en måte som var meget lik måten for Sendaivirus hva angår annettrinns-reseptoren, skjønt flere av dem også oppviste en separat førstetrinns-reseptor analog med den for Sendaiviruset (eksempel 1). Analysene av disse vira ble utført ved bruk av viruspreparater og antistoffer for påvisning, som beskrevet i Materialer og Metoder. For å dekke så mange reseptorkandidater som mulig, ble glykolipidblandinger anvendt for undersøkelsen vist på fig. 2 benyttet. Dessuten ble flere isolerte stoffer ifølge tabell 3 brukt i fortynninger på tynnskiktplaten for å teste aviditeten av binding sammenlignet med Sendaivirus. Resultatene viste at alle vira som ble utprøvet hadde et bindingsmønster som var identisk med, eller meget likt, det på fig. 2 med lignende bindingsaviditet. Dette betyr at de vira som ble utprøvet hadde en spesifikk bindingsegenskap felles, hvilket bør svare til et felles bindingsprotein på virusoverflaten. Denne egenskap avhenger ikke av de forskjellige innhyllingsfla-ter av virusene eller egenskapen av genomet (tabell 2). Derfor har morfologisk og genetisk forskjellige vira, som forårsaker en rekke forskjellige sykdommer på mennesker og dyr, hvilket påvirker forskjellige organsystemer, en felles bindingsegenskap, nemlig en annettrinns-reseptor som sannsynligvis anvendes for penetrasjon.

Eksempel 3

Kjemisk karakterisering av reseptorer og analyse av den ideelle konformasjon av bindingsepitopen

Som beskrevet i Materialer og Metoder, ble individuelle reseptoraktive stoffer isolert i ren form og karakterisert kjemisk. Dette ga informasjon både om strukturen av den polare/hydrofobe del (dvs. sakkaridstrukturen, innbefattet typen sukkere, sekvensen, bindingens stilling, anomeritet og ringstørrelse) og den ikke-polare del (dvs. ceramidet, innbefattet fettsyrekjede-struktur mht. deres lengde, forgrening og graden av umettethet, og stillingen og konfigurasjonen av hydroksylgruppene, og den langkjedede basestruktur mht. lengden av parafinkjeden, umettethet og stillingen og konfigurasjonen av funksjonelle grupper). Fremgangsmåtene som ble benyttet var høyteknologisk massespektrometri (se henvisning 14) og NRM-spektroskopi (se henvisning 15), foruten vanlige nedbrytningsmetoder. For å få et vidt område strukturer for utprøving, ble vev fra forskjellige dyr brukt som preparatkilder (se henvisning 13a og 33). Noen av de epitelvev som ble brukt er blitt beskrevet med hensyn til glykolipidstrukturer, såsom tynntarm fra menneske (se henvisning 42 og 43), tynntarm fra rotte (henvisning 13a), tynntarm fra mus (se henvisning 20 og 44), tynntarm fra hund (se henvisning 45) og tynntarmer fra katt, torsk, marsvin, hamster og kanin (se henvisning 20). Flere andre vev ble også analysert, som beskrevet i eksempel 2. Mange av disse strukturer er i den senere tid blitt gjennomgått (se henvisning 13). Dette betyr at et stort antall glykolipider og andre stoffer ikke inkludert i tabell 3 ble analysert, men funnet negative for binding til Sendaivirus.

Et meget viktig trekk er avhengigheten av binding på ceramid-strukturen som angitt i tabell 4 for et spesielt glykolipid, nr. 3, i tabell 3, isolert fra de angitte naturlige kilder og omhyggelig analysert for sin detaljert struktur. Forsøkene ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder ved bruk av overdeknings-bindingstesten. Kriterier for positiv binding ble også definert. De glykolipider som ble utprøvet ble definert ved de strukturelle metoder som er beskrevet i Materialer og Metoder. De detaljerte strukturer av forskjellige molekylære ceramidmaterialer er vist på fig. 5. Bokstavene i tabell 4 henviser også til denne figur.

Således, skjønt oligosakkaridstrukturen er identisk for de fire varianter, er det bare de som har en 2-D-hydroksy-fettsyre i ceramidet som binder viruset. Dette ble reprodusert gjentatte ganger for andre glykolipider i tabell 3 også. Dette synes, ved første øyekast, å bety at 2-hydroksy-gruppen er spesifikt involvert i bindingen. Bindingsundersøkelser av forskjellige syntetiske glykolipider gjør imidlertid at man må se bort fra denne mulighet (eksempel 5). Istedenfor dette er tolkningen at glykosfingolipider med en 2-hydroksy-fettsyre avviker med hensyn til konformasjon fra glykosfingolipider som har en ikke-hydroksy-f ettsyre. Dette er blitt dokumentert ved røntgenkrystallo-grafianalyse av den førstnevnte (se henvisning 31) og NMR-analyse av den sistnevnte (se henvisning 32). I disse tilfeller ble syntetisk en-sukker glykosfingolipider anvendt. 2-hydroksy-glykosfingolipider har en skjelignende eller skovllignende konformasjon (cf. fig. 6) med sakkaridringen anordnet med en vinkel på ca. 110° i forhold til ceramidet. I ikke-hydroksy-isomeren er denne vinkel ca. 180°. Gjennomgåelse av alle andre strukturelle parametere av de analyserte stoffer viser at dette er den eneste fellesnevner i tolkningen. Derfor, som angitt ovenfor, er betydningen av 2-hydroksy-gruppen av glykosfingoli-pidet å presentere det første sakkarid i den riktige bøyde foretrukne konformasjon. Dette gjør a-siden av sukkeret tilgjengelig for binding, hvilket derfor er blitt tolket som en del av bindingsepitopen. I presentasjonen av sukkeret (mer eller mindre med rett vinkel på den membranlignende overflate i undersøkel-sen) i tilfellet for de ikke-hydroksy-glykosfingolipider, er det ikke sannsynlig at denne bindingsepitop er tilgjengelig for virusbinding.

Eksempel 4

Reseptorer på målceller ved innfallsporten for virusinfeksjoner og på visse andre celler

Som beskrevet i eksempel 2 og 3, er et stort antall epitelvev fra forskjellige dyr blitt brukt av oppfinnerne som kilder for fremstillingen av glykolipider. For å teste mer presist plasse-ringen av reseptorglykolipider på epitelcellene, som er de direkte mål for virusinfelsjoner, ble slike celler isolert som beskrevet i Materialer og Metoder. Teknikken ble utarbeidet for tarmceller fra rotter (se henvisning 19), omfattende både tynntarm og tykktarm, og ble også anvendt på tynntarm og tykktarm fra menneske. Videre ble en slimhinneskraping utført på mennesketarm (se henvisning 42) og menneske-urinrør. En fellesnevner for alle epitelprøver som ble analysert (cf. Materialer og Metoder) uansett vev eller dyrekilde, er tilstedeværelsen av GlcBCer (stoff 2 i tabell 3 med 2-hydroksy-fettsyre) og i mange tilfeller også GalBCer med 2-hydroksy-fettsyre. De mest optimale naturlige Sendaivirus-bindere (kurve A på fig. 4) eksisterer derfor generelt i epitelceller. Som en illustrasjon viser fig. 7 resultatet fra en analyse av epitelceller av tynntarmen hos fire menneskelige individer med forskjellige blodgruppefenotyper. Skjønt, som ventet, de langsomt-bevegende blodgruppefucolipider varierer fra prøve til prøve, har de reseptortype-glykolipidene felles. Alle celler som virus invaderer, når det infiserer en organisme, inneholder derfor annettrinns-reseptoren.

Ikke-epitelceller har meget lavere mengde, eller kan praktisk talt mangle disse reseptorglykolipidmaterialer. I motsetning til hva som tidligere har vært hevdet, inneholder erytrocytter brukt for hemolyse (penetrasjonsundersøkelse) reseptorene, idet små, men bestemte mengder GalBCer og GlcBCer med 2-hydroksy-fettsyre er blitt funnet på erytrocytter av menneske, kveg og svin.

De generelle strukturelle karakteristika av epiteloverflatemem-branen av hvilken reseptorglykolipidene er en viktig del, er relevante i den foreliggende sammenheng. Et spesielt trekk ved sfingolipid med sitt varierende antall hydroksylgrupper på ceramidet, er den kombinerte kapasitet for hydrogenbinding-donor og -akseptor (fig. 8) som utgjør en av de tre definerte soner av membranen (se henvisning 33). Dette er sannsynligvis av avgjø-rende betydning for membranstabilitet, som avhenger av et lateralt orientert nettverk av hydrogenbindinger. Dataene på celleoverflatemembranen som for øyeblikket foreligger, antyder at det er sannsynlig at viruset har utviklet en bindingsegenskap som virker forstyrrende inn på denne stabilitet gjennom spesifikk interaksjon med alle tre deler av en essensiell komponent av dette nettverk.

Eksempel 5

Undersøkelse av bindingen av Sendaivirus til ikke-biologiske syntetiske stoffer, som er analoge med den naturlige reseptor

En rekke syntetiske stoffer vist i tabell 1 ble analysert for virusbinding i de to undersøkelser beskrevet i Materialer og Metoder. Tabell 5 angir de semikvantitative bindingsresultater fra overdekning av Sendaivirus til fortynninger av det aktuelle stoff. +-tegnene svarer ikke til dem i tabell 3 eller 4, men er bare for relativ sammenligning innenfor tabell 5.

Som vist er der svak binding til nr. 12, men ikke til nr. 11, 13 eller 14, hvilket indikerer en viss preferanse for Glcft. Tokjede-forbindelsene er bedre bindere (sammenlign 15 med 13). Det viktigste er imidlertid at sulfonanalogene, nr. 16-18, binder sterkest, idet tokjede-forbindelsene foretrekkes. En mer presis kvantifisering ved hjelp av den kvantitative bindings-undersøkelse beskrevet ovenfor, viser at nr. 18 har samme aviditet som den tilsvarende naturlige reseptor, nr. 3 i tabell 3, begge representert ved kurve C på fig. 4. Disse stoffer ble konstruert på basis av det forskningsarbeid som var utført på naturlige reseptorer, og det er interessant å merke seg at egenskapene og dimensjonene av den naturlige epitop (eksempel 3) og spesifikasjonene av reseptoranaloger er fullstendig tilfredsstilt ved disse stoffer. Således er kravene til deler A, B og C (som forklart ovenfor) og deres relative dimensjoner oppfylt, skjønt del B er ikke-chiral og bærer en eller to sulfongrupper istedenfor en chiraldel med en amidkobling og to hydroksyler. Åpenbart er a-siden av sukkeret tilgjengelig for binding, hvilket er den betingelse som ble angitt i eksempel 3. For disse analoger er dette forklart ved at sulfongruppene gir fire onyl-seter, som ved frastøtning og muligens hydrogenbinding til vann produserer en meget mindre tett pakking av molekylene i monolaget ifølge undersøkelsene.

Det fremgår videre fra tabell 5 at flere andre syntetiske stoffer ikke binder viruset. Dette skyldes enten ufullstendig oppfyllelse av kravene for B (stoffer nr. 11, 13 og 14 som kan sammenlignes med henholdsvis stoffer nr. 1, 3 og 4 i tabell 3, som er gode bindere), eller tett kjedepakking som gjør presentasjonen av a-siden av A umulig i fravær av en konformasjons-bestemmende faktor som 2-hydroksy-fettsyren av den naturlige reseptor.

Eksempel 6 Inhibisjonsforsøk

Gal,Gle og GalBl-»4Glc i fri form eller derivatisert eller koblet til BSA (stoffer 1-6 og 10 i tabell 5) ble brukt i forsøk på å hindre Sendaivirus i å binde seg til reseptorer ved bruk av blandinger av glykolipider som vist på fig. 2, men også rene stoffer nr. 1, 2 og 3 i tabell 3 på tynnskiktplater ved preinkubering av viruset med sukkere før overdekning på platen. Der var ingen tendens til svekking av de autoradiografe flekker, hvilket tydet på at disse stoffer var ute av stand til å konkurrere med reseptorene for binding. Konklusjonen er at karbohydrat-delen av de naturlige reseptorstoffer i univalent eller multivalent form ikke i seg selv er istand til å binde til viruset. På samme måte var der ingen inhibisjon i mikrotiter-undersøkelsen ved bruk av stoff 3 i tabell 3 som reseptoren.

Preinkubering av Sendaivirus med lydbehandlede miceller av forskjellige membranlipider ga en klar inhibisjon av virusbinding på tynnskiktplater for flere glykolipider i tabell 3. Også i plaque-inhibisjonsforsøket ble en rabiesvirusstamme vist å være fullstendig inhibert ved omhyggelig lydbehandlede liposomer inneholdende stoff 3 i tabell 3. Ved lignende fortynning i titrasjonen ga liposomer inneholdende fosfatidylserin ikke noen reduksjon av plaquer.

Preinkubasjon av Sendaivirus med oppløselige reseptoranaloger (stoffer 7-9 i tabell 5) før overdekning av virus på en tynn-skiktplate, eller inkubasjon i brønner, ga de følgende resultater.

Sendaivirus (60 /ig) og stoff 9 (1 mg) i 2 ml PBS ble preinkubert i 1 time ved værelsestemperatur før overdekning på en tynnskikt-plate og inkubasjon og bearbeiding som beskrevet i Materialer og Metoder, fulgt av autoradiografi for å påvise bundet virus. Glykolipidprøvene påført på platen var totale gangliosider av menneskelige erytrocytter (førstetrinns-reseptor, se eksempel 1) og glykolipider 1, 2, 3 og 5 i tabell 3, foruten en rekke forskjellige egnede negative sammenligningsprøver. Sammenlignet med kontrollplaten (binding av virus uten preinkubasjon med stoff 9 i tabell 5) var der en betydelig reduksjon av virusbinding etter preinkubasjon med stoff 9, bedømt på basis av at de mørke områder på autoradiogrammet ble lysere. Således ble binding til glykolipider 1, 2 og 3 redusert flere ganger, og båndet for glykolipid 5 forsvant helt og holdent. I motsetning til dette var der ingen virkning på bindingen til førstetrinns-reseptoren (erytrocyttgangliosider, sammenlign fig. 1). Lignende preinkubasjoner med 1 mg/ml av stoffene 7 og 8 ga ingen synlig inhibisjon av virusbinding. Konklusjonen fra disse eksperimenter med overdekningsforsøket er at den syntetiske reseptoranalog i multivalent form (stoff 9 i tabell 5), men ikke i univalent form (stoffer 7 og 8 i tabell 5), kan gi en selektiv inhibisjon av binding til annettrinns-reseptoren uten at det har noen virkning på bindingen til førstetrinns-reseptoren.

Preinkubasjsoner av Sendaivirus med disse oppløselige reseptoranaloger ved bruk av mikrotiterbrønner og en ELISA-prøve (se Materialer og Metoder), ga de følgende resultater. Preinkubasjon med stoff 9 i tabell 5 ga en reduksjon av virusbinding til annettrinns-reseptoren GalBCer (A492 = 0,350 som en typisk verdi ved den høyeste konsentrasjon med en tilbakevenden til det maksimale nivå etter tre fortynninger på 1:4, se Materialer og Metoder). Der var ingen inhibitorisk virkning på bindingen av virus til belagt antiserum, og der var ingen inhibisjon ved preinkubasjon med univalent analog (stoffer 7 og 8). Resultatene faller derfor sammen med dem fra overdekningsprøven ovenfor, med en selektiv inhibisjon av binding til annettrinns-reseptoren, men ikke til antistoffet, og et behov for multivalens for at analogen skal være virksom.

LITTERATURFORTEGNELSE

1. Lycke et al., Red., Textbook of Medical Virology, Butterworths, London, 1983.

2. Lycke et al., se 1.

White et al., Quart. Rev. Biophys. 16, 1983, pp. 151-195. 3. Lonberg-Holm et al., Red., Virus Receptors, del 2, "Animal Viruses, Receptors and Recognition", ser. B, vol. 8, Chapman og Hall, London 1981.

Dimmock, J. Gen. Virol. 59, 1982, pp. 1-22.

4. Bell, Biophys. J. 45, 1984, pp. 1051-1064.

5. Lycke et al., se 1.

6. MacDonald et al., Virology 134, 1984, pp. 103-117.

7. Schlegel et al., Cell 32, 1983, pp. 639-646.

Superti et al., Arch. Virol. 81, 1984, pp. 321-328.

8. Huang, J. Gen. Virol. 64, 1983, pp. 221-224.

Huang, Lipids 18, 1983, pp. 489-492.

9. Paulsen, Chem. Soc. Rev. 13, 1984, pp. 15-45.

10. Lee et al., i Horowitz, Red., The Glycoconjugates, Vol. 4, Academic Press, New York, 1982, pp. 57-87.

Dahmén et al., Carbohydr. Res. 127, 1984, pp. 27-33.

11. Lycke et al., se 1.

12. Middlebrook et al., Microbiol. Rev. 48, 1984, pp. 199-221. 13. Kanfer et al., Red., Sfingolipid Biochemistry, Handbook of

Lipid Research, Vol. 3, Plenum Press, New York, 1983.

13a. Breimer et al., J. Biol. Chem. 257, 1982, pp. 557-568.

14. Breimer et al., i Quayle, Red., Adv. Mass Spectrom., Heyden and Sons Ltd., London, Vol 8B, 1980, pp. 1097-1108. 15. Falk et al., Arch. Biochem. Biophys. 192, 1979, pp. 164-202.

16. Se Kanfer et al., 13.

17. Karlsson et al., J. Lipid Res. 12, 1971, pp. 466-472.

18. Karlsson et al., Eur. J. Biochem. 46, 1974, pp. 243-258.

19. Breimer et al., Exp. Cell Res. 135, 1981, pp. 1-13.

20. Breimer et al., J. Biochem. 90, 1981, pp. 589-609.

21. Karlsson et al., Biochem. Biophys. Acta 306, 1973, pp. 317-328.

22. Se Huang, Lipids, ref. 8.

23. Hansson et al., i Chester et al., Red., Glycoconjugates, Proe. 7th Int. Sympos., Rahms, Lund, Sverige, 1983, pp. 631-632. 24. Magnusson et al., i Chester et al., Red., Glycoconjugates, Proe. 7th Int. Sympos., Rahms, Lund, Sverige, 1983, pp. 643-644. 25. Brown et al., i Chester et al., Red., Glycoconjugates, Proe. 7th Int. Sympos., Rahms, Lund, Sverige, 1983, pp.

678-679.

26. Se ref. 3.

27. Se 23 og 25.

28. Se Dimmock, ref. 3

29. Se ref. 23.

30. Se ref. 25.

31. Pascher et al., Chem. Phys. Lipids 20, 1977, pp. 175-191.

32. Skarjune et al., Biochemistry 21, 1982, pp. 3154-3160.

33. Karlsson, i Chapman, Red., Biological Membranes, Academic

Press, London, Vol. 4, 1982, pp. 1-74.

34. Se White et al., i ref. 2.

Se Dimmock i ref. 3.

35. Richardson et al., Virology 131, 1983, pp. 518-532.

36. Se White et al., ref. 2.

37. Se ref. 35.

38. Sabesan et al., Can. J. Chem. 62, 1984, pp. 1034-1045.

39. Se ref. 31.

40. Se ref. 33.

41. Hitchcock et al., Red., Plant Lipid Biochemistry, Academic

Press, London, 1971.

42. Falk et al., FEBS Lett. 101, 1979, pp. 273-276.

43. Bjørk et al., i Cartron et al., Red., Red Cell Membrane Glycoconjugates and Related Genetic Markers, Libraire

Arnette, Paris, 1983, pp. 125-137.

44. Hansson et al., FEBS Lett. 139, 1982, pp. 291-294.

45. Hansson et al., Biochem. Biophys. Acta 750, 1983, pp. 214-216. 46. Holgersson et al., i Koprowski et al. (Red.), Symposium on World's Debt to Pasteur, pp. 273-301, Alan R. Liss, New York, 1985, under trykking.

Claims

1. Anvendelse av en karbohydratforbindelse valgt fra sfingosin-2-D-hydroksy-fettsyrer med den generelle formel I fytosfingosin-2-D-hydroksy-fettsyrer med den generelle formel II dihydrosfingosin-2-D-hydroksy-fettsyrer med den generelle formel III hvor, i formlene I, II og III, R representerer en monosakkarid-molekyldel som er valgfritt substituert i 4-stillingen med en mono-, di-, tri- eller tetrasakkaridmolekyldel eller et derivat derav, R^ og R2 hver for seg representerer en metylgruppe, eller en CHO-, N02-, NH2-, OH-, SH-, CONHNH2-, CON3- eller COOH-gruppe, og R 3 representerer en hydrokarbonmolekyIdel omfattende et lineært eller forgrenet, mettet eller umettet hydrokarbon med en kjedelengde på minst 5 karbonatomer og høyst 25 karbonatomer; D-galaktopyranosyl-B-diglycerid; D-galaktopyranosyl-al-6-D-galaktopyranosyl-Æ-diglycerid; og karbohydratforbindelser med de generelle formler IV eller VII hvor R er som angitt ovenfor, R4 og R5 hver for seg representerer en metylgruppe, eller en CHO-, N02-, NH2- OH-, SH-, CONHNH2-, CON3- eller COOH-gruppe, og R6 representerer en hydrokarbonmolekyldel omfattende et lineært eller forgrenet, mettet eller umettet hydrokarbon med en kjedelengde på minst 5 karbonatomer og høyst 25 karbonatomer; hvilken forbindelse kan binde seg til et sete på viruset som gjenkjenner bindingsepitopen av en annettrinns-bindingsresep-tor, for in vitro diagnose av virusinfeksjoner eller for fremstilling eller isolering av viruspartikler eller virusoverflatekomponenter.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor R er

3. Anvendelse som angitt i krav 1 eller 2, hvor forbindelsen foreligger i univalent form.

4. Anvendelse som angitt i krav 1 eller 2, hvor forbindelsen er i en slik form at den oppviser multiple bindingsseter for viruset.

5. Anvendelse som angitt i krav 4, hvor forbindelsen er multivalent koblet til en makromolekylær bærer.

6. Anvendelse som angitt i krav 5, hvor bæreren har en hydrofob overflate til hvilken en hydrofob del av forbindelsen er assosiert ved hydrofob ikke-kovalent interaksjon.

7. Anvendelse som angitt i krav 6, hvor den hydrofobe overflate er en polymer såsom en plast eller en hvilken som helst polymer til hvilken hydrofobe grupper er blitt koblet.

8. Anvendelse som angitt i krav 4, hvor forbindelsen er kovalent bundet til den makromolekylære bærer.

9. Anvendelse som angitt i krav 8, hvor bæreren er en naturlig eller syntetisk polymer.

10. Anvendelse som angitt i krav 9, hvor bæreren er et oligo-eller polysakkarid, et oligo- eller polypeptid, en kombinasjon derav eller et lignende passende substituert konjugat.

11. Anvendelse som angitt i krav 5-10, hvor bæreren er poly-L-lysin eller poly-D,L-alanin.

12. Anvendelse som angitt i et av de foregående krav, hvor viruset er Sendaivirus.