FI93227B - Hiilihydraattiyhdisteen käyttö in vitro viruspartikkelien tai viruksen pintakomponenttien valmistukseen tai eristämiseen - Google Patents

Description

93227

Hiilihydraattiyhdisteen käyttö in vitro viruspartikkelien tai viruksen pintakomponenttien valmistukseen tai eristämiseen 5 Tämä keksintö koskee hiilihydraattiyhdisteen käyt töä in vitro viruspartikkelien tai viruksen pintakomponenttien valmistukseen tai eristämiseen.

Huolimatta virusten eläimille, ihminen mukaan luettuna, ja kasveille aiheuttamista laajoista vaurioista 10 ei virusinfektioita vastaan ole vielä kehitetty rationaalista yleishoitoa, jokä olisi vertailukelpoinen esimerkiksi bakteeri-infektioiden yhteydessä käytettävän antibioottihoidon kanssa. Vaikka tietyissä tapauksissa on menestyksellisesti käytetty profylaktista lähestymistapaa 15 rokotteen, joka saa aikaan immunisoitumisen ja useimmissa tapauksissa elinikäisen resistenssin uudelleeninfektoitu-mista vastaan, muodossa, ei aina ole ollut mahdollista kehittää rokotetta, jolla olisi niin laaja käyttöalue, että se olisi tehokas saman viruslajin monia erilaisia 20 kantoja vastaan; tämä on ollut ongelmana esimerkiksi tähän mennessä kehitetyissä influenssarokotteissa; immunisoi tuminen on tapahtunut sitä tiettyä kantaa vastaan, johon rokote on perustuhut, mutta ei muita läheistä sukua olevia kantoja vastaan, joilla on hiemat erilaiset anti-25 geeniset ominaisuudet.

Viime vuosina on kiinnitetty lisääntyvää huomiota niin kutsuttujen reseptorien merkitykseen erilaisille biologisille vuorovaikutuksille. Reseptorit, jotka usein ovat glykolipidejä tai glykoproteiineja, ts. koostuvat 30 lipidiin tai proteiiniin liittyneestä hiilihydraattiosas- ta, ovat eläin- ja kasvisolujen plasmakalvoon kiinteästi kuuluvia osia ja niitä on monien erilaisten solujen solukalvon pinnalla. Niiden toiminta monien erilaisten biologisten ryhmien spesifisinä reseptoreina on äärimmäisen 35 monitahoista. Solukalvon pinnalla esillä olevan hiilihyd-raattiosansa ansiosta niillä voi olla antigeenisiä ominai- 2 93227 suuksia, tai ne voivat toimia solun pintamarkkereina; ne saattavat antaa rakenteellista jäykkyyttä kalvon lipidi-kaksoiskerroksen ulommalle kerrokselle; ne voivat muodostaa osan solujen välisestä vuorovaikutus- ja tunnistus-5 järjestelmästä; tai ne voivat osallistua solun vuorovaikutukseen biologisesti aktiivisten tekijöiden, kuten bakteeritoksiinien, glykoproteiinihormonien tai mikro-organismien, kanssa ja sitoa nämä solun pintaan. Tiedetään esimerkiksi, että tällaisten reseptorien ja bakteeri-10 infektioiden välillä on yhteyttä siinä mielessä, että reseptorien kanssa analogisia yhdisteitä voidaan käyttää estämään infektion aikaansaannille välttämätön bakteerien adheesio.

Jotta virusinfektio tapahtuisi, virusgenomin on 15 tunkeuduttava isäntäsoluun. Joidenkin kalvovaipallisten virusten (joilla on kalvo nukleokapsidin ympärillä) ollessa kyseessä tiedetään, että tähän prosessiin liittyy kaksivaiheinen mekanismi, nimittäin perättäinen liittyminen ja tunkeutuminen isäntäsoluun (katso viite 1; luet-20 telo liitteistä annetaan jäljempänä osassa "Kirjallisuus") . Tiedetään, että kiinnittymisen saa aikaan virusinfektion kohdesolujen pinnalla sijaitseva reseptori (katso viite 3). Yleisesti on otaksuttu, että tunkeutu-misvaihe on looginen seuraus kiinnittymisestä, joka saa 25 aikaan spontaanin fuusioitumisen pintakalvoon tai resep-torivälitteisen endosytoosin jälkeen tapahtuvan penetraa-tion. Joissakin tapauksissa on pidetty mahdollisena toista vuorovaikutusta, joka on kuitenkin vähemmän spesifinen kuin kiinnittyminen, pääasiassa hydrofobinen vuorovaiku-30 tus kalvon sisäosan kanssa (katso viite 2). Tähän keksintöön johtaneen tutkimustyön edetessä on kuitenkin havaittu yllättävästi, että tiettyjen virusten ollessa kyseessä toinen sitoutuminen onkin päinvastoin spesifinen ja tietyn aineen, jolla on määritettävissä olevat kemialliset 35 ominaisuudet, aikaansaama. Tämä sitova aine on siten verrattavissa tunnettuihin ensimmäisen vaiheen resepto- 93227 3 reihin (katso viite 3), jotka välittävät viruksen kiinnittymisen isäntäsoluun, ja se on analogisesti nimetty toisen vaiheen reseptoriksi. Näyttää todennäköiseltä, että infektoitumisen tapahtuminen vaatii sekä ensimmäisen että toi-5 sen vaiheen reseptorien läsnäoloa solun pinnalla. Pääasiallinen ero näiden kahden reseptorin välillä on se, että ensimmäisen vaiheen reseptoria esiintyy tietyn solu-tyypin pinnalla, joka on altis tietyn viruslajin aiheuttamalle infektiolle, kun taas toisen vaiheen reseptoria 10 esiintyy kaikilla soluilla, jotka ovat virusinfektioiden sisäänpääsyteitä yleensä (ts. tämä reseptori ei ole spesifinen tietylle viruslajille). Niinpä virus valitsee isäntäsolunsa tai -kudoksensa ensimmäisen vaiheen reseptorin avulla, mutta käyttää tunkeutumiseen yleisesti saa-15 tavilla olevaa reseptoria.

Lisäksi otaksutaan, että toisen vaiheen reseptoria tarvitaan viruksen hengissä pysymiseen. Ilman tunkeutumista kalvon läpi sytoplasmaan kiinnittynyt viruspartik-keli hajosi lopulta lysosomeissa solun tehokkaan puhdis-20 tuskoneiston vaikutuksesta. Kyvyn sitoutua toisen vaiheen reseptoreihin otaksutaan siksi olevan hyvin säilynyt (geneettisesti stabiili, niin ettei se muutu toisin kuin viruksen antigeeniset ominaisuudet) viruksen ominaisuus, joka ei ole riippuvainen ensimmäisen vaiheen reseptorin 25 luonteesta.

Toisen vaiheen reseptorin läsnäoloa tukee se tosiseikka, ettei viruksen hydrofobinen osa, esimerkiksi hydrofobinen peptidisekvenssi, kuten viruksen sitoutumiskohdan muodostava peptidisekvenssi, pysty spontaanisti tunkeu-30 tumaan isäntäsolun kalvoon tämän kalvon luonnollisen vastuksen takia. Luonnollinen pintakalvo on rakenteeltaan sellainen, että vältetään hydrofobisten ja muiden aineiden säätelemätön vastaanotto. Tämä vaikuttaisi muuten vakavasti haitallisesti kalvon toimintoihin. Mcmet eliön sää-35 televät aineet, kuten hormonit, ovat hydrofobisia, ja niiden vastaanottoa välittävät spesifiset reseptorit eikä 4 93227 pelkästään liukoisuus solukalvon lipidikaksoiskerrokseen. Hydrofobista tunkeutumista tarvitsevan viruspartikkelin täytyy siten vastaavasti käyttää hyväkseen kaksoiskerrok-sen lähellä olevaa reseptoria, mikä tarkoittaa sitä, ettei 5 pelkkä kiinnittyminen ensimmäisen vaiheen reseptoriin ole riittävä.

Se näennäisesti paradoksaalinen ilmiö, että monille soluille yhteinen virusreseptori mahdollistaa vain tiettyjen solujen infektoitumisen, voidaan selittää isäntä-10 solun pinnan, jossa on lipidikaksoiskerroksesta 100 A:n päähän tai kauemmaksi ulottuva glykokonjugaattikerros, monimutkaisella luonteella. Toisen vaiheen reseptori sijaitsee kaksoiskerroksen välittömässä läheisyydessä, ja sen otaksutaan siksi olevan suojattuna ulkoapäin tule-15 valta suoralta kosketukselta. Ensimmäisen vaiheen reseptorit puolestaan sijaitsevat kauempana kaksoiskerroksesta ja ovat siten välittömästi käytettävissä sitoutumiseen. Otaksutaan, että tämä ensimmäisen vaiheen sitoutuminen mahdollistaa viruspartikkelin pääsyn lähemmäksi kaksois-20 kerroksen läheisyydessä olevaa toisen vaiheen reseptoria, jonka paljastaa hyvin tunnettu ilmiö, pintakomponenttien sivusuuntäinen liikkuvuus, jonka osittain saa aikaan repulsio viruksen pinnasta, joka johtuu esimerkiksi negatiivisesta sähkövarauksesta (katso viite 4). Viruksen si-25 toutuminen toisen vaiheen reseptoriin vaatii siten ensimmäisen vaiheen kiinnittymisen, joka määrää infektion solu-spesifisyyden.

Tämän keksinnön tarkoituksena on käyttää hyväksi tätä ensimmäisen ja toisen vaiheen sitoutumista koskevaa 30 perustutkimusta luonnollisten toisen vaiheen reseptorien käyttämiseksi sellaisinaan kilpailemaan potentiaalisten isäntä- tai kohdesolujen pinnalla olevien toisen vaiheen reseptorien kanssa viruksen sitoutumiskohdista ja estää viruksen tunkeutuminen soluun salpaamalla nämä kohdat, 35 niin että virusinfektio voidaan estää tai torjua, samoin kuin kehittää yhdisteitä, jotka sen ansiosta, että ne il 93227 5 matkivat luonnollisen reseptorin sitomisominaisuuksia, täyttävät saman tehtävän, sitoutumisen viruksen sitoutumiskohtiin ja niiden salpaamisen. Tähän tarkoitukseen on edullista käyttää toisen vaiheen reseptoreita tai niiden 5 kaltaisia yhdisteitä ensimmäisen vaiheen reseptoreiden sijasta, koska ensin mainitut ovat vähemmän spesifisiä ja niillä on siksi laajempi (yleisempi) käyttökelpoisuus.

Esillä oleva keksintö koskee hiilihydraattiyhdis-teen käyttö in vitro viruspartikkelien tai viruksen pin-10 takomponenttien valmistukseen tai eristämiseen, joka hii-lihydraattiyhdiste on valittu ryhmästä sfingosiini-2-D-hydroksirasvahapot, joiden kaava on

O OH

15 | | HN-C-CH-R--R, I 3 1

ROCH-CH I

2i 20 ho-ch-ch=ch-r3-r2 fytosfingosiini-2-D-hydroksirasvahapot, joiden kaava on

0 OH

25 I | HN-C-CH-R0-R..

ROCH-CH OH II

2I I

30 ho-ch-ch-ch2-r3-r2 dihydrosfingosiini-2-D-hydroksirasvahapot, joiden kaava on

0 OH

35 K | HN-C-CH-R0-R1 I 3 1

ROCH-CH III

40 HO-CH-CH2-CH2-R3-R2 joissa kaavoissa I, II ja III R on monosakkaridiryhmä, joka voi olla substituoitu 4-asemassa mono-, di-, tri- 6 93227 tai tetrasakkaridiryhmällä tai sen johdannaisella, R3 ja R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta metyyliä tai ryhmää CHO, N02, NH2, OH, SH, CONHNH2, CON3 tai COOH ja R3 on hiilivetyosa, joka käsittää suoraketjuisen tai haarautu-5 neen, tyydyttyneen tai tyydyttymättömän hiilivedyn, jonka ketjunpituus on 5 - 30 hiiliatomia; D-galaktopyrano-syyli-B-diglyseridi; D-galaktopyranosyyli-a-l-+6-D-galak-topyranosyyli-B-diglyseridi; ja hiilihydraattiyhdisteet, joiden kaavat ovat 10 /ch2-so2-r6-r4

roch2ch IV

Nch2-so2-r6-r5 15 ja

roch2ch2so2r6r4 VII

jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä, R4 ja R5 tarkoitta-20 vat toisistaan riippumatta metyyliä tai ryhmää CHO, N02, NH2, OH, SH, C0NHNH2, C0N3 tai COOH ja R6 on hiilivetyosa, joka käsittää suoraketjuisen tai haarautuneen, tyydyttyneen tai tyydyttymättömän hiilivedyn, jonka ketjunpituus on 5 - 30 hiiliatomia; ja joka hiilihydraattiyhdiste pys-25 tyy sitoutumaan viruksella olevaan kohtaan, joka tunnis taa toisen vaiheen viruksia sitovan reseptorin sitovan epitoopin.

Tässä yhteydessä termillä "sitova epitooppi" tarkoitetaan pienintä mahdollista reseptorin osaa, joka on 30 vuorovaikutuksessa viruksen kanssa. Luonnossa tämä sitova epitooppi sijaitsee virusinfektion kohdesolujen pinnalla olevilla toisen vaiheen reseptoreilla, jotka ovat yleensä glykolipidejä. Tämän keksinnön tekijät ovat osoittaneet toisen vaiheen reseptorien, jotka sisältävät tällaisen 35 sitovan epitoopin, läsnäolon käyttämällä koetta, jossa infektion kohdesoluista eristetyt glykolipidimuodossa 93227 7 olevat mahdolliset reseptorit erotetaan pinnalla (kroma-togrammi), joka on sopivalla käsittelyllä tehty biologista solukalvoa muistuttavaksi. Tämä tarkoittaa sitä, että mahdolliset reseptoriaineet ovat kokeessa todennäköisesti 5 esillä samalla tavalla kuin elävän solun pinnalla. Tämän kokeen tulokset ovat siten hyvin vertailukelpoisia alkuperäisillä soluilla tai kudoksilla saatujen sitoutumistu-losten kanssa. Tämä koe on osoittanut ensimmäisen ja toisen vaiheen reseptoreiden läsnäolon ja lisäksi resepto-10 riehdokkaita, jotka todella saavat aikaan sitoutumisen.

Tämän kokeen tulokset ovat ristiriidassa aiemmin julkaistujen tulosten kanssa, jotka perustuvat kokeisiin, joissa käytetään liukoiseksi saatetussa misellimuodossa olevia eristettyjä aineita estämään viruksen kiinnitty-15 minen isäntäsoluihin aktiivisuutta koskevien tietojen saamiseksi. Näillä kokeilla saadaan usein aikaan epäspesifinen sitoutuminen, eivätkä ne siksi riittävästi heijasta solun pinnalla esiintyviä todellisia sitoutumisme-kanismeja.

20 Viitteessä 6 esimerkiksi kuvataan Sendai-viruksen indusoiman hemolyysin (punaisten verisolujen vuodon) estämistä muutamien pitkäketjuisten rasvahappojen avulla, ts. ilmeistä vaikutusta virusten tunkeutumiseen. Vapaat rasvahapot eivät kuitenkaan ole pintakalvon komponentte-25 ja. Näyttää siltä, että tässä tapauksessa hydrofobiset parafiiniketjut ovat epäspesifisessä vuorovaikutuksessa F-glykoproteiinin (määritellään jäljempänä) hydrofobisen, peptidisekvenssin kanssa. Kahdessa julkaisussa (katso viite 7) raportoidaan rhabdoviruksen estämisestä fosfa-30 tidyyliseriinillä ja muilla fosfolipideillä. Lopuksi mainittakoon että kahdessa Huangin julkaisussa (katso viite 8) kuvataan Sendai-viruksen ja Fowl-pesäkeviruksen aiheuttaman hemolyysin estämistä käyttämällä misellimuodossa olevia rasvahappoja, fosfolipidejä tai glykolipi-35 dejä. Kuten mainittiin, Huangin käyttämien vapaiden rasvahappojen, fosfolipidien tai luonnon tai synteettis- 8 93227 ten glykolipidien aikaansaamaa Sendai-viruksen sitoutumista ei havaittu käytettäessä tämän keksinnön tekijöiden kehittämää, edellä kuvattua koetta. Nämä kolme aineryhmää ovat vertailukelpoisesti aktiivisia, mutta kahden 5 jälkimmäisen aineryhmän polaariset pääteryhmät ovat rakenteellisesti liian erilaisia selittääkseen viruksen spesifisen vuorovaikutuksen tämän osan kanssa. Todennäköisin selitys on siksi se, että näille aineille yhteinen osa, lipidiketjut, ovat epäspesifisestä vuorovaiku-10 tuksessa viruksen hydrofobisten osien, todennäköisimmin F-glykoproteiinin N-terminaalisen peptidin, kanssa. Tämä tarkoittaa sitä, etteivät aiempien tutkijoiden käyttämät aineet voi olla todellisia isäntäsolujen reseptoreita. Fosfolipidien ollessa kyseessä tätä johtopäätöstä tukee 15 kohdesoluilla esiintyvien reseptorikohtien lukumäärä, 106, joka on useita kertalukuja liian pieni vastatakseen fosfolipidiä, hyvin yleistä solun pintakomponenttia.

Lyhyesti sanottuna tähän mennessä julkaistussa kirjallisuudessa esitetyt tulokset voidaan selittää tut-20 kittujen aineiden epäspesifisellä vuorovaikutuksella ra joitetun lukumäärän kanssa viruksia. Vaikka tämä vuorovaikutus voi teoreettisesti tapahtua osan kanssa siitä peptidistä, jonka jäljempänä osoitetaan sitoutuvan spesifisesti toisen vaiheen reseptoriin, jossa on rakenteel-25 lisesti määritelty sitova epitooppi, ei näissä viitteissä esitetä mitään todisteita todellisesta reseptorispesifi-syydestä. Havaittu hydrofobinen vuorovaikutus on lisäksi samanlainen monissa järjestelmissä. Eräs esimerkki ovat rakenteeltaan erilaiset rasvahapot, jotka liittyvät albu-30 miiniin, nisäkkäiden veriplasman tärkeimpään proteiiniin. Viitteissä esitettyjä tuloksia ei siksi voida käyttää tämän keksinnön tarkoituksiin yksinkertaisten hydrofobisten vuorovaikutusten yleisyyden vuoksi.

Tämän keksinnön tekijöiden kehittämän kokeen avul-35 la on siten tullut ensimmäistä kertaa mahdolliseksi määrittää spesifisiä aineita, jotka ovat käyttökelpoisia li 93227 9 toisen vaiheen reseptoreina. Kuten edellä mainittiin, kokeessa ei siten tapahdu sitoutumista toisiin kalvokompo-nentteihin, joiden muut tutkijat (katso edellä mainitut viitteet) ovat väittäneet sitovan analysoituja viruksia.

5 Ei esimerkiksi tapahdu sitoutumista vapaisiin rasvahappo-ihin/hiilihydraattien lipideihin, jotka molemmat ovat luonnon toisen vaiheen reseptorien komponentteja, eikä fosfolipideihin, kuten fosfatidyylikoliiniin, sfingomye-liiniin, fosfatidyylietanoliamiiniin tai fosfatidyylise-10 riiniin, käytettäessä relevantteja reseptorimateriaali- tasoja. Tämän keksinnön tekijöiden käyttämän kokeen spesifisyys on siten mahdollistanut toisen vaiheen reseptorin rakenteen määrittämisen välttämättä muilla koemenetelmillä saadut harhaanjohtavat tulokset, pääasiassa pe-15 rinteisissä kokeissa käytettävien komponenttien epäspesifinen vuorovaikutus.

Edellä kuvatussa kokeessa reseptorina aktiivisiksi todettujen aineiden perusteella on saatu selville sitovan epitoopin tiettyjä yleispiirteitä. Niinpä tämän keksinnön 20 tarkoituksiin käytettävien yhdisteiden tulisi koostua hydrofobisesta osasta, hydrofobisen osan vieressä olevasta polaarisesta osasta ja polaarisen osan vieressä olevasta osasta, joka on sekä polaarinen että hydrofobinen. Lisäksi on todettu, että näiden osien tulisi muodostaa 25 jatkuva pinta, jonka kokonaispituus on noin 15-20 A ja leveys noin 8-10 A.

Tämän keksinnön mukaisesti hydrofobinen osa voi koostua hiilivetyryhmästä, jolla on hydrofobinen pinta, jonka ala on vähintään noin 50-80 A2. Tämä pinta-ala on 30 havaittu riittäväksi saamaan aikaan hydrofobisen vuorovaikutuksen viruksen sitoutumiskohdan ja sitovan epitoopin hydrofobisen osan välille, mutta hiilivetyosa voi luonnollisesti kattaa suuremmankin alan, mikä saattaa olla käytännöllistä joissakin sovellutuksissa, joissa re-35 septori on määrä kytkeä kantajaan (katso jäljempänä). On kuitenkin tärkeää ottaa huomioon, ettei hiilivetyryhmän 93227 10 suurempi pinta-ala vaikuta itse sitovaan epitooppiin. Po-laarisen/hydrofobisen osan tulisi edullisesti sisältää rakenne, joka vastaa luonnollisessa sitovassa epitoopissa esiintyvän heksoosin α-puolta. Tämä α-puoli muodostaa 5 sakkaridin "hydrofobisen" puolen. Polaarisen puolen, joka muodostaa välivyöhykkeen hydrofobisen ja polaarisen/hyd-rofobisen osan välille, tulisi sisältää vähintään kaksi vetysidoksen muodostumiskohtaa. Välivyöhyke voi sisältää sekä vetysidosdonoreita että vetysidosakseptoreita.

10 Polaarinen/hydrofobinen osa voi sisältää homo- tai heterosyklisen rakenteen, ja se on edullisesti monosakka-ridi, joka on mahdollisesti substituoitu sillä tavalla, ettei substituentti häiritse steerisesti luonnollisessa sitovassa epitoopissa esiintyvän heksoosin α-puolta vas-15 taavaa rakennetta. Kokeet ovat osoittaneet, että sitoutumisen estävät substituentit työntyvät ulospäin tämän heksoosin α-puolta vastaavalta puolelta, kun taas sitoutumisen sallivat substituentit suuntautuvat eri suuntiin, mikä osoittaa viruksen lähestymisen eteeristä spesifi-20 syyttä. Substituentti voi olla esimerkiksi sakkaridi.

Monosakkaridilla on edullisesti β-galaktopyranoosin tai β-glukopyranoosin konformaatio, ainakin reseptorina aktiivisessa osassaan, ja se on edullisesti heksoosi, vaikkakin pentoosia tai heptoosia voidaan myös käyttää tähän 25 tarkoitukseen. Heksoosi voi olla galaktoosi tai glukoosi, jotka ovat optimaalisimmassa luonnollisessa toisen vaiheen reseptorissa esiintyviä heksooseja.

Hiilivetyryhmän muodostamalla hydrofobisella osalla ei tarvitse olla rakenteellista spesifisyyttä, koska 30 se ei näytä olevan oleellinen primaariselle epitoopin tunnistukselle eikä kalvon vastuksen murtamiselle vetysi-doksin, jotka ilmiöt saavat aikaan polaarinen/hydrofobinen osa ja vastaavasti polaarinen osa. Hydrofobinen osa on kuitenkin tärkeä viruksen sitoutumiskohdan ja solukal-35 von väliselle laajalle hydrofobiselle vuorovaikutukselle, ja siitä syystä sitä tarvitaan edelleen aineissa, joita 93227 11 käytetään luonnollisen reseptorin jäljittelyyn, koska asianmukainen sitoutuminen ja siten viruksella olevan kohdan salpaaminen eivät muuten olisi tehokkaita. Hiili-vetyryhmä voi olla tyydyttynyt tai tyydyttymätön, haa-5 roittunut tai suoraketjuinen, avoketjuinen tai syklinen hiilivety tai niiden yhdistelmä. Hiilivety on edullisimmin osa keramidia, koska keramidirakenteilla on itsetii-vistymisvaikutus pintatasapainon yksinkertaisessa kerroksessa (katso viite 33), todennäköisesti molekyylien väli-10 sen vetysidosten muodostumisen ansiosta. Tämä saattaa saada aikaan sitovan epitoopin esiintymisen tiivistyneessä pinnassa, mikä on tärkeää ligandin, ts. viruksen, tehokkaalle sitoutumiselle. Keramidin tulisi edullisesti sisältää 2-hydroksirasvahappoa, koska tämä näyttää edis-15 tävän viruksen pääsyä sitovaan epitooppiin sitä kautta, että se tietyissä reseptoriaineissa saa aikaan sopivan konformaation ja sitovan epitoopin esiintymisen voimakkaasti itsetiivistyvässä yksinkertaisessa kerroksessa, jossa vallitsee molekyylien tiivis pakkautuminen intermo-20 lekulaaristen vetysidosten ansiosta. Hiilivetyryhmässä tulisi olla vähintään noin 14 hiiliatomia, mutta käytännön kannalta (tarvittaessa riittävä hydrofobisuus hiili-vetyryhmän sitomiseksi kantajaan hydrofobisen vuorovaikutuksen kautta (katso jäljempänä)) edullisesti noin 20-30 25 hiiliatomia.

Kuten edellä mainittiin, on havaittu reseptori-aineena tai reseptorin korvikkeena käytettävän yhdisteen rakenteen tai konformaation olevan ratkaiseva sen tehon kannalta tässä suhteessa. On havaittu, että yhdisteellä 30 tulisi olla taipunut tai kaareva konformaatio, jossa po- laarinen/hydrofobinen pääteryhmä taipuu kohden hydrofobisen osan, kuten hiilivetyryhmän, muodostaman yksinkertaisen kerroksen tasoa. Yhdisteellä on siten edullisesti yleinen konformaatio, joka vastaa luonnollisen sitovan 35 epitoopin konformaatiota l-0-p-D-galaktopyranosyyli-N-(2- D-hydroksialkanoyyli)-l,3-D-dihydroksi-2-D-aminoalkaanis- 93227 12 sa, jolla on kristallografisten sopimusten mukaisesti kuvattu atomien approksimatiivisten eteeristen suhteiden konformaatio, jossa kideyksikkökopin mitat ovat a = 11,2 A, b = 9,3 A, c = 46,5 A ja β= 99° ja valitut atomiosakoordinaatit x, y 20 ja vastaavasti z heksoosin Cl":lie 0,82, 0,99 ja 0,42, C3":lie 0,91, 1,25 ja 0,44, C5":lle 0,72, 1,15 ja 0,46, pitkäketjuisen emäksen Olille 0,80, 0,90 ja 0,41, Cl:lie 0,76, 0,76 ja 0,42, C2:lle 0,78, 0,66 ja 0,39, C5:lle 0,61, 0,62 ja 0,31, Niille 0,90, 0,69 ja 0,38, 02:lle 25 0,57, 0,69 ja 0,37, rasvahapon Cl':lle 0,98, 0,58 ja 0,37, C2':lie 1,08, 0,64 ja 0,36, C5’:lle 1,17, 0,71 ja 0,29, 01':lie 0,95, 0,45 ja 0,38 ja 02':lle 1,12, 0,79 ja 0,37, jolloin yhdisteessä esiintyvät nämä atomisuhteet ja 30 -koordinaatit tai niiden variantit, jotka eivät häiritse sitomisaktiivisuutta siitä syystä, että yhdiste sisältää polaarisen/hydrofobisen osan (rakenteeltaan samankaltainen kuin luonnollisen sitovan epitoopin konformaatio-kaavassa esitetty osa A), joka sisältää luonnollisessa 35 sitovassa epitoopissa esiintyvän heksoosin α-puolta vastaavan rakenteen/konformaation ja edullisesti monosakka- 93227 13 ridin D- tai L-muodon, jolla on ainakin reseptorin aktiivisessa osassa β-galaktopyranoosin konformaatio ja joka monosakkaridi sisältää mahdollisesti sopivan substi-tuen-tin asemassa, jossa substituentti ei steerisesti häiritse 5 luonnollisessa sitovassa epitoopissa esiintyvän heksoosin α-puolta vastaavaa rakennetta, polaarisen osan (rakenteeltaan samankaltainen kuin luonnollisen sitovan epitoo-pin konformaatiokaavassa esitetty osa B), joka sisältää vähintään kaksi vetysidoksen muodostumiskohtaa, joka voi 10 olla amino-, karbonyyli-, hydroksyyli-, sulfhydryyli-, sulfoksi- tai sulfoniryhmä, ja hydrofobisen osan (rakenteeltaan samankaltainen kuin luonnollisen sitovan epitoo-pin konformaatiokaavassa esitetty osa C), joka sisältää tyydyttyneen tai tyydyttymättömän, haaroittuneen tai suo-15 raketjuisen, avoketjuisen tai syklisen hiilivedyn tai tällaisten yhdistelmän, jonka pinta-ala on vähintään noin 50-80 A2.

Edellä yleisesti esitetystä käy ilmi, että tämän keksinnön tarkoituksiin käytettävän yhdisteen sitovan 20 epitoopin rakenteen tulisi edullisesti olla sellainen, joka läheisesti jäljittelee optimaalisimman luonnollisen reseptorin konformaatiota röntgenkristallografisesti määritettynä (katso viite 31). Tällä luonnollisella reseptorilla on lusikkamainen tai lapiomainen konformaatio (nä-25 kyy edellä esitetystä konformaatiokaavasta), jossa hek-soosi (A) taipuu kohti parafiiniketjujen (C) muodostaman yksinkertaisen kerroksen tasoa. Tämä tarkoittaa sitä, että heksoosin α-puoli, mutta ei β-puoli, suuntautuu ulospäin yksinkertaisesta kerroksesta, kuten kiteen pak-30 kautumisesta ilmenee. Vastaavaa sitomatonta glykolipidiä, joka on erilainen vain siinä suhteessa, että siinä on ei-hydroksirasvahappo hydrofobisena osana 2-hydroksirasvaha-pon sijasta, on tutkittu NMR-spektroskopialla (katso viite 32), joka osoittaa, että heksoosi on kohtisuorassa yk-35 sinkertaisen kerroksen tasoa vastaan ja siten kääntyneenä pitkäketjuisen emäksen sidoksen Cj-C^ ympäri. Vaikka tutkimukset tehtiin eri menetelmillä eri molekyyleille, ne 93227 14 osoittavat edulliset konformaatiot, jotka eroavat toisistaan tässä yhteydessä relevantilla tavalla. Kiteessä esiintyvää tiivistä intermolekulaarista pakkautumista vastaavalla tavalla keramidirakenteiden yksinkertaisessa 5 kerroksessa tapahtuu itsetiivistymisilmiö veden pinnalla (ja todennäköisesti myös biologisella kalvolla), joka aiheutuu molekyylien välisten vetysidosten muodostumisesta (katso viite 33). Vertailukohtana olevien tiiviisti pakkautuneiden glykolipidien suhteen tämä tarkoittaa sitä, 10 että ei-hydroksirasvahappospesies ei tarjoa heksoosin a-eikä β-puolta sitomiseen käytettäväksi toisin kuin 2-hyd-roksirasvahappoa sisältävä spesies. Tästä voidaan päätellä, että heksoosin α-puoli osallistuu viruksen sitomiseen ja että 2-hydroksiryhmä on ratkaiseva tämän puolen saat-15 tamiseksi saavutettavissa olevaksi sitoutumista varten.

Toinen reseptoriepitoopin suunnittelulle tärkeä tekijä on tähän reseptoriin todennäköisimmin sitoutuvan viruksen pinnalla olevan proteiinin luonne. Esimerkiksi Sendai-viruksen (joka kuuluu paramyksovirusryhmään ja jo-20 ta käytetään laajasti kokeissa) pinnalla on kahta proteiinia (katso viitteet 2 ja 3). HN-proteiini (hemaggluti-niinineuramidaasiproteiini) sisältää sitoutumiskohdan neuramiinihappoa sisältävää ensimmäisen vaiheen reseptoria varten. Toisen proteiinin, F-proteiinin (fuusiopro-25 teiinin) on osoitettu olevan välttämätön viruksen kalvon fuusioitumiselle isäntäsolun plasmakalvon kanssa (penet-raatio), joka fuusioituminen on välttämätön viruksen nuk-leokapsidin viemiseksi sytoplasmaan (katso viitteet 2 ja 3). F-proteiinin hyvin säilyneen N-terminaalisen hydrofo-30 bisen peptidisekvenssin osallistuminen tähän prosessiin on todistettu vähän aikaa sitten inhibitions, joka aiheutettiin sarjalla luonnollisen sekvenssin kaltaisia synteettisiä peptidejä (katso viite 35). Muiden virusten pinnalla esiintyy analogisia N-terminaalisia peptidejä 35 (katso viite 2, White et ai.). Viitteessä 35 esitetyt tiedot osoittavat, että näiden synteettisten peptidien vaikutuskohta on kohdesolun pinnalla ja että vaikutus on 15 93227 kyllästettävissä, mikä osoittaa reseptorikohtien määräksi noin 10^/solu. Tässä määritellyn toisen vaiheen reseptorin pitäisi olla identtinen näiden kohtien kanssa, sillä Sendai-viruksen pinnalla on vain kaksi proteiinia ja on 5 olemassa kaksi sitoutumisominaisuutta. Voimakkaimmin inhiboiva synteettinen peptidi on N-karbobentsoksipeptidi Z-D-Phe-L-Phe-Gly (Z tarkoittaa karbobentsoksia). Viruksen pintaproteiinin N-terminaalinen sekvenssi on L-Phe-L-Phe-Gly. Luonnossa esiintymätön karbobentsoksiryhmä lisää 3 10 tehoa noin 10 -kertaiseksi verrattuna peptidiin, jossa ei ole tätä ryhmää. Luonnossa esiintymätön D-isomeeri on 500 kertaa tehokkaampi kuin vastaava L-isomeeri.

Näitä kahta tietoa, reseptoriglykolipidin kide-konformaatiota ja tämän reseptorin kanssa todennäköisimmin 15 vuorovaikutuksessa olevien inhiboivien peptidien rakennetta, on käytetty peptidin ja reseptorin todennäköisten yhteenliittymien molekyylimallien muodostamiseen. Sen loogisen oletuksen perusteella, että peptidin N-terminaa-lisen osan tulisi olla lähinnä kaksoiskerrosta, voidaan 20 edellä mainitun synteettisen peptidin ja reseptorin kon-formaation optimaalinen yhteensopivuus määritellä seuraavasti. Tulisi ottaa huomioon, että nomenklaturia, jota käytetään osoittamaan atomien tai funktionaalisten ryhmien asemaa molekyylissä, on viitteen 38 mukainen.

25 1. Hydrofobinen vuorovaikutus peptidin bentsoksi- ryhmän ja reseptorin rasvahapon ja pitkäketjuisen emäksen parafiiniketjujen välillä.

2. Vetysidokset D-Phe:n N:n ja rasvahapon C=0:n ja emäksen OH3:n ja D-Phe:n C=0:n välillä.

30 3. Hydrofobinen vuorovaikutus D-Phe:n bentseeni- renkaan ja heksoosin 0(.-puolen ja emäksen C^l :n välillä mukaan luettuina heksoosirenkaan CH1, CH3 ja CH5. On ilmeistä, ettei D-Phe:n korvaaminen luonnon L-Phe:llä salli tällaista läheistä yhteenliittymistä.

35 4. Synteettisen peptidin L-Phe:n bentseenirengas saattaa olla hydrofobisessa vuorovaikutuksessa tämän ja 16 93227 siihen liittyvien reseptorimolekyylien kanssa. Hydrofobinen vuorovaikutus toteutuu siten kaikilla kolmella bent-seenirenkaalla.

Kvantitatiivisista sitoutumiskokeista saadut käyrät 5 (katso jäljempänä) osoittavat luonnollisen reseptorin sitoutuvan alhaisella affiniteetilla viruksella oleviin yksittäisiin kohtiin ja tarvitsevan monivalenttisuutta sitoutuakseen tehokkaasti. Tämä selittää sen, miksi synteettisellä liukoisella yksivalenssisella peptidillä, jolla 10 on luonnollinen sekvenssi, on alhainen inhibitioteho. Luonnossa esiintymättömän N-karbobentsoksiryhmän tehtävänä on parantaa sitoutumista lisäämällä hydrofobista vuorovaikutusta reseptorin kanssa luonnolliseen rakenteeseen verrattuna. Tätä ryhmää ja sen parempaa steeristä yhteensopi-15 vuutta luonnossa esiintymättömän D-Phe:n kanssa verrattuna L-Phe:iin ei tarvita, kun kyseessä on alkuperäisen viruspartikkelin luonnollisen peptidin kautta tapahtuva multivalenttinen sitoutuminen, joka saa aikaan riittävän voimakkaan kokonaisvuorovaikutuksen. Tämä voi viitata sii-20 hen, että karbobentsoksiryhmän kanssa vuorovaikutuksessa oleva hydrofobinen reseptoriosa ei ole funktionaalinen viruksen kannalta. Otaksutaan kuitenkin, että viruksen ja isäntäsolun kalvon väliseen todettuun vuorovaikutukseen voi sisältyä edellä esitetyn epitoopin määrittelemän 25 alueen lisäksi toinen hydrofobinen alue, sen jälkeen kun primaarinen vuorovaikutus ja kalvon vastuksen murtuminen on saatu aikaan.

Viruksissa, joiden tiedetään sisältävän hydrofobisia N-terminaalisia peptidejä, esiintyy lievää sekvenssin 30 vaihtelua, vaikkakin hydrofobisuus on vaatimuksena. Erilaisten synteettisten N-karbobentsoksipeptidien käytöllä on myös erilainen inhibitiovaikutus eri viruksiin, ja joissakin tapauksissa tapahtuu tehon suhteellinen muuttuminen päinvastaiseen suuntaan (katso viite 35). Laajen-35 nettu molekyylimallien muodostus osoittaa, että tämä peptidirakenteen "huojunta" on siedettyä ja saadaan aikaan il 17 93227 hyvä vuorovaikutus reseptorin kanssa. Tulisi ymmärtää, että sitoutumisen reseptoriin välittää tämän mallin mukaisesti lineaarinen peptidi eikä useista peptidisilmukoista muodostunut tasku, joka usein saa aikaan suuremman spesi-5 fisyyden ja heikomman aminohappokorvautumisten siedon.

Luonnollisen toisen vaiheen reseptorin konformaa-tion perusteella voidaan hahmotella keksinnön mukaisesti käytettäväksi aiotun yhdisteen sisältämän sitovan epitoo-pin yksityiskohdat vertaamalla niitä luonnollisen epi-10 toopin samankaltaisiin osiin.

A. Heksoosin (Gal^ tai Glc^) pC-puoli ja pitkä-ketjuisen emäksen Cl Tämä on sokerin "hydrofobinen" puoli, jossa hydrofobiset kohdat ovat Gal:n asemassa CH1, CH3, CH4 ja CH5 15 ja Glc:n asemissa CH1, CH3 ja C5. Myös pitkäketjuisen emäksen CI^I on hydrofobinen. Gal ja Glc sitovat jokseenkin yhtä hyvin, mikä osoittaa, että aseman C4 stereo-kemia ei ole oleellinen. Asemassa C4 oleva substituentti ei lisäksi estä sitoutumista, mutta tekee sen heikommaksi.

20 Nämä ovat nisäkässolun monoglykosyylikeramidien ainoat tunnetut heksoosit. Synteettisen epitooppianalogin vastaava osa voi koostua C^-C^-monosakkaridista, jolla on samanlaiset ominaisuudet heksoosirenkaan od.-puolella.

Tämä voi olla substituoitu asemassa 4 olevalla sakkaridilla 25 tai muulla substituentilla, joka ei häiritse steerisesti pääsyä sitovaan epitooppiin. Kaikkien tällaisten sakka-ridilaajennusten mahdollisten konformaatioiden molekyyli-mallien muodostus (katso viite 38) osoittaa, että sitoutumisen estävät substituentit suuntautuvat ulospäin 30 Glc:n ot-puolta vastaavalta puolelta, kun taas sitoutumisen sallivat substituentit suuntautuvat eri suuntiin.

Tämä osoittaa viruksen lähestymisen steerisen spesifisyyden ja tukee sitä väitettä, että ot-puoli osallistuu sitomiseen. Periaatteessa polaarinen/hydrofobinen osa voi 35 itse asiassa olla mikä tahansa rengasrakenne, jolla on Gal:n tai Glc:n oC-puolen piirteet, ts. pääasiassa 18 93227 hydrofobinen rengasosa, josta suuntautuu ulospäin polaarisia substituentteja esimerkiksi OH:n, SH:n tai =0:n muodossa. Jotkut näistä substituenteista voivat olla po-laarittomia, esimerkiksi halogeeni, CH^ tai lyhyehkö 5 aikaani tai aikeeni, hydrofobisten ja polaaristen ryhmien välisen tasapainon optimoimiseksi.

B. Rasvahapon (sidosakseptori) C=0:ssa ja emäksen (sidosdonori ja -akseptori) 0H3:ssa olevat vety-sidoksen muodostumiskohdat 10 Fytosfingosiinin 0H4 ei ole oleellinen. Rasvahapon 0H2 näyttää olevan oleellinen reseptorin konformaatiolle muttei suoralle vuorovaikutukselle viruksen kanssa. Kuten edellä mainittiin, primaarisen, spesifisen epitoopin tunnistuksen jälkeen tapahtuva todettu vuorovaikutus voi 15 kuitenkin hyödyntää myös tätä OH:ta vetysidoksen muodostukseen. Nämä kaksi sitoutumiskohtaa voivat sijaita noin 5-6 A:n etäisyydellä toisistaan, ja niitä voivat olla pääasiassa C=0, 0=S=0, OH ja NH.

C. Hydrofobinen osa 20 Molekyylimallin perusteella tämän tulisi sisältää happoa C6:een asti ja emästä C8:aan asti. Kuten edellä mainittiin, on luonnollisella peptidillä kuitenkin vain yksi vuorovaikutuskohta, kun taas luonnossa esiintymätön peptidi sitoutuu hydrofobisesti myös N-karbobentsoksi-25 ryhmän kanssa, mikä tekee tarkan määrittelemisen vaikeaksi. Viruksen ja solukalvon väliseen osoitettuun vuorovaikutukseen voi tässäkin tapauksessa sisältyä primaarisen epitoopin tunnistuksen ja vetysidosten muodostuksen kautta tapahtuneen kalvon vastuksen murtamisen jälkeen laajempi 30 peptidin ja kalvon välinen hydrofobinen vuorovaikutus.

Tämä oleellinen hydrofobinen osa voi siksi vaihdella, eikä sillä ole rakenteellista spesifisyyttä. Synteettisessä epitooppianalogiassa hydrofobinen osa voi koostua tyydyttyneestä tai tyydyttymättömästä, haaroittuneesta 35 tai lineaarisesta, avoketjuisesta tai syklisestä hiilivedystä tai niiden yhdistelmästä, jonka pinta-ala on il 2 19 93227 vähintään noin 50-80 A . Riittävän hydrofobisuuden voi kuitenkin muodostaa myös jäykän oligomeerin, kuten lyhyen polystyreeni-, polyeteeni-, polyvinyyli- jne. ketjun hydrofobinen puoli.

5 Luonnollisen epitoopin dimensiot, jotka voidaan päätellä kiteen konformaatiosta (katso viite 31), ovat seuraavat: osan B vetysidoksen muodostuskohdat ovat noin 6-8 A:n etäisyydellä osan A heksoosirenkaan keskipisteestä. Osa C on noin 6-8 A pitkä ja noin 8-10 A leveä. Sito-10 van epitoopin kokonaispituus on siten suuruusluokkaa noin 16-20 A. Synteettisen epitooppianalogin mittojen tulisi siten olla samat tai suurin piirtein samat.

Kuten edellä mainittiin, epitoopin polaarisen/hydro-fobisen osan muodostava monosakkaridi voi olla pentoosi, 15 heksoosi tai heptoosi, kuten luonnossa esiintyvä monosakkaridi, esimerkiksi ksyloosi, arabinoosi, glukoosi, galaktoosi, fukoosi, riboosi, talloosi tai mannoosi, tai niiden johdos, kuten deoksisokeri, asetyloitu tai alkyloitu sokeri, haaroittunut sokeri, aminosokeri tai 20 uronihappo. Jotta monosakkaridilla olisi halutut ominaisuudet erityisesti konformaation suhteen, sen tulisi edullisesti olla rengasmuodossa (kuten furanoosi- tai pyranoosimuodossa). Soveltuvia esimerkkejä tällaisista monosakkarideista ovat ksylopyranoosi, arabinopyranoosi, 25 glukopyranoosi, galaktopyranoosi, mannopyranoosi jne.

Kuten edellä lisäksi mainittiin, tämä monosakkaridi voi olla substituoitu asemasta, jossa substituentti ei häiritse steerisesti sitoutumista. Useimpien monosakkaridien kohdalla tämä tarkoittaa sitä, että substituentti voi 30 olla asemassa 4 (heterosyklisen renkaan hiiliatomi 4).

Periaatteessa substituentti voi olla mikä tahansa substituentti, joka täyttää edellä mainitun vaatimuksen eikä lisäksi häiritse polaarisuuden ja hydrofobisuuden välistä tasapainoa tässä epitoopin osassa. Edullisia substituent-35 teja ovat mono-, di-, tri- ja tetrasakkaridit, kuten Gal, Glc, Xyl, Ara, Fuc, Rib, Man, Man p<,1->3Man, 20 93227

Man <*· 1 ->2Man, Man 1->6Man , Gal/31->2Man, Fuc ¢(. 1->2Gal,

Fuc c£1->3Gal, Fuc oC1 ->6Gal, Galyftl->2Gal, Gal/*1 ->6Gal, Gal/3l->3Gal, GaloCl->3Gal/%, Galot1->4Gal^, GlceU->4Glc, Glc/»>1->4Glc, Glcrt1->4Glc/&1->4Glc, GlcoC1->4Glcetf->4Glc, 5 Gal//31->3Gal|^1->4Glc , Gal^1->3Galy6l->3Galy%1->4Glc ,

Glcol1->6Glcoi1->4Glc <*1->4Glc, Galo41 ->3 (Fuc oCI->2) Gal^, niiden mikä tahansa soveltuva yhdistelmä tai johdos, kuten sopivalla tavalla asetyloitu, alkyloitu, haaroittunut tai aminoitu johdos (käytetyt lyhenteet ovat hyväksytyn hiili-10 hydraattinomenklaturian mukaisia).

Luonnolliselle sitovalle epitoopille analogisen synteettisen sitovan epitoopin muodostavat kolme osaa tulisi liittää sillä tavalla, että muodostuu sitova koko-naisepitooppi, jolla on annetut mitat ja edellä kuvatut 15 piirteet muodostetun pinnan samalla puolella. Tämä voidaan saavuttaa syntetisoimalla luonnollisen epitoopin kaltainen melko jäykkä epitooppi. Polaarisen/hydrofobisen osan ja polaarisen osan välinen liittävä osa voi siten sisältää kaksi sopivalla tavalla substituoitua hiiliatomia, 20 joilla on luonnollisen sitovan epitoopin konformaatio. Polaarinen/hydrofobinen osa ja polaarinen osa voidaan lisäksi liittää toisiinsa muodostamalla sidos polaarisen/ hydrofobisen osan glykosidisen hapen tai glykosidisen rikin tai eetterin tai tioeetterin ja polaarisessa osassa 25 olevan Cl^-ryhmän tai sen kaltaisen ryhmän välille. Jos polaarisen/hydrofobisen ja polaarisen osan välisen liitoksen on määrä olla lyhyt ja melko jäykkä, on glykosidi-sidos ^-anomeerinen. Nämä kolme osaa voidaan kuitenkin liittää toisiinsa joustavamminkin sillä edellytyksellä, 30 ettei sidoksen luonne ja pituus häiritse mitoiltaan edellä hahmotellun kaltaisen sitovan pinnan muodostumista näistä kolmesta osasta. Sillä edellytyksellä, että tämä vaatimus täytetään, voidaan määritelmiä vaihdella enemmän, erityisesti A:n suhteen; jos näin tehdään, anomeerinen sidos voi 35 esimerkiksi olla o<-tyyppiä.

il 93227 21

Kuten edellä mainittiin, kohdesoluilla olevat reseptorit ovat useimmiten joko glykoproteiineja tai glyko-lipidejä. Kuten luonnollisen reseptorin konformaatiota koskevista erittelyistä käy ilmi, on kuitenkin havaittu, 5 että vain glykolipidit voivat luonnossa toimia toisen vaiheen reseptoreina virusten sitomiseksi. Tämä keksintö koskee siten pääasiassa lipideihin liitettyjen hiilihydraattien, glykolipidit, glykosfingolipidit ja glyko-glyserolipidit mukaan luettuina, tai niiden reseptoreina 10 aktiivisten analogien käyttöä antiviraalisina aineina. Esimerkkejä tähän tarkoitukseen käyttökelpoisista glyko-lipideistä ovat D-galaktopyranosyyli-/^ -diglyseridi ja D-galaktopyranosyy 1 i-ot| ->6 -D-galaktopyranosyy 1 i- /¾ -diglyseridi, joita on luonnossa löydettävissä kasvisolukalvo-15 jen pinnalta ja joilla on havaittu olevan toisen vaiheen sitovan reseptorin ominaisuudet, jotka viittaavat niiden käyttökelpoisuuteen virusperäisten kasvitautien torjunnassa.

Glykoglyserolipidien välivyöhykkeellä on vain vety-20 sidosakseptoreita, eikä se siksi aiheuta tiukkaa molekyy-lipakkautumista eikä voimakkaasti itsetiivistyvää yksinkertaista kerrosta, joiden on osoitettu olevan tärkeitä oikean konformaation ja sitovan epitoopin esilletuonnin aiheuttajia glykosfingolipidien ollessa kyseessä. Kokeet 25 ovat osoittaneet, ettei sitoutuminen glykoglyserolipidei-hin vaadi 2-hydroksirasvahappoa, koska sitova epitooppi on viruksen saavutettavissa jopa 2-hydroksirasvahapon poissa ollessa glykoglyserolipidimolekyylien kauemmas ulottuvan esillä olon ansiosta. Glykosfingolipidien olles-30 sa kyseessä on edullista, että hydrofobinen osa sisältää 2-hydroksirasvahappoa, koska tämän on havaittu saavan aikaan tehokkaamman sitoutumisen. Antiviraalisena aineena käytettävä yhdiste voi niin ollen olla yleiskaavan I mukainen sfingosidi-2-D-hydroksirasvahappo, yleiskaavan 35 II mukainen fytosfingosidi-2-D-hydroksirasvahappo tai yleiskaavan III mukainen dihydrosfingosidi-2-D-hydroksi-rasvahappo, 93227 22

O OH

» I

H N - C - CH - R3 - R1

5 ROCH2CH I

HO-CH-CH=CH-R3-R2 tai

10 O OH

I! I

H N - C - CH - R3 - R1

ROCH2CH OH II

15 I I

HO-CH-CH-CH2- R3-R2 tai

20 O OH

H N - C - CH - R3 - R1

ROCH2CH III

25 I

HO-CH-CH2-CH2-R3-R2 joissa kaavoissa R on sakkaridi, jolla on /6-galaktopyra-30 noosin konformaatio ainakin reseptorina aktiivisessa osassa ja R.j ja R2 ovat riippumattomasti metyyli-, CHO-, NC^-, ΝΗ2-( OJ-, SH-, CONHNH2-, CON3~ tai COOH-ryhmä. Kun reseptoria tai reseptorianalogia on määrä käyttää sellaisenaan, ts. kun se on riittävän tehokas saamaan aikaan sitoutumi-35 sen sellaisenaan, ovat R^ ja R2 edullisesti metyylejä, mutta kun luonnollisen epitoopin tai synteettisen epitoop- 93227 23 pianalogin on määrä esiintyä monivalenssisessa muodossa (katso jäljempänä), on edullista, että ja/tai R2 on reaktiivinen ryhmä, jolla on kyky reagoida joko itse reseptoreilla tai kantajalla olevien samankaltaisten ryhmien 5 kanssa. R^ on hiilivetyryhmä, joka voi sisältää suoraket-juisen tai haaroittuneen, tyydyttyneen tai tyydyttymättö-män hiilivedyn, jonka ketjun pituus on vähintään 5 hiili-atomia. Hiilivetyketjut ovat kuitenkin useimmiten lineaarisia ja tyydyttyneitä tai monotyydyttymättömiä. R voi 10 olla edellä määritelty monosakkaridi, joka on mahdollisesti substituoitu asemassa neljä olevalla yhdellä tai useammalla muulla sakkaridilla, kuten edellä mainittiin; polaa-risen/hydrofobisen osan muodostama kokonaissakkaridi voi siten olla esimerkiksi 15 Gale,

GlcB,

GalBWGIcB,

Gala1-*4GalB,

Galal-'GGalBl-^GIcB, 20 Gala1-*4Galf51-*4GlcfJ,

Fucal-^GalBI-^GIcB,

GlcNAcB1-3GalBWGIcB,

GalNAcBWGalBl^lGIcB,

GaIa1-"3( Fuca1-*2)GalBl-*4GlcB, 25 GalB1-3GlcNAcBl^3GalB1-4GlcB,

GalBl-4GlcNAcBl-3GalB1-4GlcB,

GalBI-^BiFucal-MJGIcNAcBI^GalBI-^GIcS, tai GalB1M(Fucal-3)GlcNAcB1-3GalB1-4GlcB, 30 jossa termi "NAc" tarkoittaa sakkaridin N-asetylaatiota.

Kokeellisesti on osoitettu, että glykolipideillä, joissa on korkeintaan viisi sakkaridia, on kyky sitoa viruksia; suurempi oligosakkaridi muodostaa todennäköisesti steerisen esteen viruksen pääsylle epitooppiin. Parhaiksi 35 luonnossa esiintyviksi sitojiksi on kvantitatiivisin sitou-tumistutkimuksin (katso jäljempänä) osoitettu Glcy3Cer ja 93227 24

GalfiCer. Tämä osoittaa, että useamman kuin yhden sakkari-din käyttö sitomistärkoituksiin on tarpeetonta, vaikkakin se saattaa olla välttämätöntä lähtöaineiden saatavuuden kannalta valmistettaessa reseptoreja tai reseptorianalo-5 geja jne.

Kuten edellä on useaan kertaan mainittu, tämän keksinnön mukainen käyttö ulottuu myös luonnollisen sitovan epitoopin reseptorina aktiivisiin analogeihin. Tällaiset analogit voivat tietenkin olla missä tahansa muodossa 10 sillä edellytyksellä, että ne täyttävät edellä kuvatut vaatimukset konformaation suhteen, ja tällaiset analogit voidaan siten valita monien erilaisten yhdisteiden joukosta. On kuitenkin havaittu, että yhdisteet, joilla on yleinen kaava IV, 15 CH2-so2-R3-Rl

ROCH-CH

2 s IV

CH2-S02-R3-R2 20 jossa R, , R2 ja R^ ovat edellä määriteltyjä, muodostavat erityisen kiintoisan ryhmän reseptorianalogeja näihin tarkoituksiin käytettäväksi. Synteettisten reseptoriana-logien ollessa kyseessä voidaan käyttää samoja sakkarideja, 25 kuin mitä edellä lueteltiin luonnollisten reseptoriainei-den yhteydessä. Erityisen kiintoisia tämän yleiskaavan mukaisia yhdisteitä ovat /ch2so9-(ch2)15ch3

30 GlcB^OCH2CH

nch2so2-(ch2)15ch3 ja 35 /CH2S02"^CH2^15CH3

Gal&WGIcfl-OCHjCH

ch2so2-(ch2)15ch3 93227 25 joilla on havaittu olevan sitomisteho, joka on samaa suuruusluokkaa kuin'luonnollisilla reseptoriaineilla (katso esimerkki 5).

Koska näiden reseptorianalogien on havaittu olevan 5 vertailukelpoisia luonnonaineiden kanssa ominaisuuksiensa ja konformaationsa (mittojen) suhteen, ne ovat täysin päteviä luonnollisen reseptorin korvikkeita. Näiden tai näiden kaltaisten synteettisten reseptorianalogien käytön etuna on niiden valmistusmenetelmä, joka voidaan toteut-10 taa yksinkertaisemmin kuin luonnollisen reseptorin tuottaminen synteettisesti tai hankalimmalla menetelmällä, keräämällä niitä solujen pintakalvoista.

Yleiskaavan IV mukaisia synteettisiä reseptori-analogeja voidaan valmistaa menetelmällä, jossa saatetaan 15 reagoimaan glykosidi, jolla on yleinen kaava V, CH_X / 2

ROCH2CH V

'ch2x 20 jossa X on poistuva ryhmä ja R edellä määritelty, tiolin kanssa, jolla on yleinen kaava VI,

25 HS-R3~R1 VI

jossa R^ ja R1 ovat edellä määriteltyjä, ja saattamalla tuote reagoimaan hapettimen kanssa. Reaktio voidaan toteuttaa vedessä tai soveltuvassa orgaanisessa liuotti-30 messa, kuten etyyliasetaatissa, metyleenikloridissa, eetterissä tai dimetyylisulfoksidissa. Reaktio voidaan hyvin toteuttaa huoneen lämpötilassa. Reaktioaika voi olla 24-48 tuntia. Reaktio toteutetaan yleensä käyttämällä vähän yli 2 ekvivalenttia yleiskaavan VI mukaista tiolia 35 yhtä ekvivalenttia kohden yleiskaavan V mukaista glyko-sidia. Reaktio voidaan toteuttaa lievästi emäksisissä 26 93227 olosuhteissa, ja sakkaridi voidaan suojata sopivalla tavalla.

Saatavien tioyhdisteiden hapetus vastaaviksi kaavan IV mukaisiksi silfoneiksi voidaan tehdä käyttämällä 5 neljä ekvivalenttia tai enemmän hapettavaa ainetta. Esimerkkejä käyttökelpoisista hapettimista ovat perhapot, kuten m-klooriperbentsoehappo, peroksidit, kuten tert-butyylihydroperoksidi, amiinioksidit, kaasumainen happi ja epäorgaaniset hapettimet, kuten kaliumpermanganaatti, 10 kromitrioksidi, jne. Reaktio tehdään tavallisesti huoneen lämpötilassa.

Toinen kiintoisa yhdisteryhmä ovat yhdisteet, joilla on yleinen kaava VII,

15 roch2ch2so2-r3-r1 VII

jossa R, R^ ja R^ ovat edellä määriteltyjä. Nämä yhdisteet voidaan valmistaa vastaavista sulfideista hapettamalla edellä kuvatulla tavalla.

20 Jotta yhdiste olisi käyttökelpoinen diagnostisena, profylaktisena tai terapeuttisena aineena virusinfektioiden yhteydessä, on tärkeää, että näihin tarkoituksiin käytettävä yhdiste on sellaisessa muodossa tai sitä käytetään sellaisella tavalla, että saavutetaan riittävä affiniteet-25 ti viruksen suhteen. Jos yhdiste on riittävän aktiivinen, sitä voidaan näin ollen käyttää sellaisenaan vesiliukoisessa muodossa, ts. monovalenttisessa muodossa (so. erillisinä yhdisteyksikköinä, joista kukin sisältää suurin piirtein vain yhden sitovan epitoopin). Tämän muodon odote-30 taan olevan erityisen merkityksellinen synteettisten reseptorien ollessa kyseessä, koska näillä saattaa olla paljon suurempi affiniteetti virusten suhteen kuin luonnon reseptoreilla, joiden sitoutumisaffiniteetin on havaittu olevan alhainen. Luonnollisten ja otaksuttavasti muuta-35 mien synteettisten reseptorien ollessa kyseessä, voi siksi olla yleensä edullista saattaa yhdiste sellaiseen.

il 93227 27 muotoon, että siinä on useita viruksen sitovia kohtia (jatkossa käytetään termiä "monivalenssinen sitoutuminen"), tehokkaan sitoutumisen aikaansaamiseksi. Luonnossa moni-valenssisen sitoutumisen saa aikaan suuri proteiinimole-5 kyylien lukumäärä viruksen pinnalla ja vastaava määrä glykolipidireseptoreita isäntäsolun pinnalla. Käytettäessä yhdistettä keksinnön mukaiseen tarkoitukseen se tulisi siksi saattaa muotoon, joka jäljittelee monivalenssista sitoutumista. Tämä voidaan saavuttaa käyttämällä luonnon 10 glykolipidireseptoreita tai saman kokoisia synteettisiä reseptorianalogeja, jotka voivat esiintyä miselleinä tai hydrofobisille pinnoille sidottuina (kohdesolun pinnan jäljittelemiseksi). Vähemmän stabiilit misellit voivat kuitenkin aiheuttaa epäspesifisen sitoutumisen mihin tahan-15 sa pintaan, ja siksi reseptorin tai reseptorianalogin sitominen kiinteälle faasille on edullista.

Yhdiste voidaan vaihtoehtoisesti liittää moni-valenssisesti makromolekyylikantajaan, joka voi olla jompaa kumpaa kahdesta tyypistä: tyyppiä, jossa kantajalla on 20 hydrofobinen pinta, johon yhdisteen hydrofobinen osa liittyy hydrofobisen ei-kovalenttisen vuorovaikutuksen kautta, jolloin hydrofobinen pinta on esimerkiksi polymeeri, kuten muovi tai mikä tahansa muu polymeeri, johon on liitetty hydrofobisia ryhmiä, polystyreeni, polyeteeni, 25 polyvinyyli jne., tai se voi olla makromolekyylinen kantaja, johon yhdiste sidotaan kovalenttisesti. Tässä jälkimmäisessä tapauksessa soveltuva kantaja voi olla luonnon tai synteettinen polymeeri. Kantaja voi siten olla oligo-tai polysakkaridi, esimerkiksi selluloosa, tärkkelys, 30 glykogeeni, kitosaani tai aminoitu sefaroosi, johon reseptori tai reseptorianalogi voidaan liittää hydrofobisessa osassa olevan reaktiivisen ryhmän, kuten reseptorina aktiivisessa aineessa esiintyvän hydroksyyli- tai amino-ryhmän, kautta, oligo- tai polypeptidi, kuten globuliini, 35 albumiini, fibriini jne., jolloin sitoutuminen saadaan aikaan esimerkiksi reseptorin tai reseptorianalogin 28 hydrofobisen osan hydroksyyli- tai aminoryhmän kautta, näiden yhdistelmä tai vastaava soveltuvalla tavalla substi-tuoitu konjugaatti. Kantaja voi olla myös epäorgaaninen kantaja, kuten piioksidimateriaali, esimerkiksi silika-5 geeli, zeoliitti, piimää tai erilaisten lasityyppien, kuten aminoidun lasin, pinta, johon reseptori tai resep-torianalogi voidaan liittää reseptorina aktiivisen aineen hiilivetyryhmässä olevan hydroksyyli-, karboksyyli- tai aminoryhmän kautta. Kun yhdistettä on määrä käyttää ennal-10 taehkäisyyn tai hoitoon, on välttämätöntä, että kantaja on fysiologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja, kuten myrkytön ja/tai allergisoimaton kantaja. Tämän tyyppisiä kantajia, joiden tällä hetkellä ajatellaan olevan käyttökelpoisia tähän tarkoitukseen, ovat esimer-15 kiksi poly-L-lysiini ja poly-D,L-alaniini.

Tämä keksintö perustuu siihen havaintoon, että virukset näyttävät yleensä vaativan toisen vaiheen reseptoria tunkeutuakseen oleellisesti isäntäsolun sytoplasmaan, niin että yksi- tai monivalenssisessa muodossa ole-20 via luonnon sitovaa epitooppia tai synteettistä epitooppi-analogia voidaan käyttää estämään virusinfektio salpaa-malla viruksen pohjalla käytettävissä olevat sitoutumiskohdat, niin että estetään viruksen pääsy epiteelisoluihin virusinfektioiden elimistööntulokohdassa. Esimerkkejä 25 tällaisista elimistööntulokohdista ovat silmän, nenän, suuontelon, kurkun, hengitysteiden, ruoansulatuskanavan, virtsateiden tai sukuelinten limakalvot. Tämän keksinnön yleinen käyttökelpoisuus perustuu siihen tosiasiaan, että kohdesoluilla esiintyvää toisen vaiheen sitovaa reseptoria 30 vastaavien tai niiden kanssa analogisten yhdisteiden on osoitettu sitovan monia erilaisia viruksia, jotka kuuluvat heimoihin Adenoviridae, Herpetoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae ja Reoviridae. Muita tässä yhteydessä kiintoisia virusheimoja ovat Picornaviridae ja 35 Retroviridae. Mielenkiinnon kohteina oleviin viruksiin kuuluu siten sekä DNA- että RNA-viruksia ja kaksinkertai- il 93227 29 sella kalvovaipalla varustettuja ja varustamattomia partikkeleja, jotka virukset aiheuttavat monia erilaisia sairauksia, jotka vahingoittavat monia erilaisia elinjärjestelmiä ja joista ovat esimerkkeinä erilaiset influens-5 sat ja tavalliset vilustumistaudit, ripulit, herpes I ja II, sikotauti, tuhkarokko, vesikauhu, AIDS, leukemia, jne.

Keksinnön mukainen käyttö voi lisäksi olla diagnostinen käyttö, jossa käytetään hyväksi tietoa toisen vaiheen reseptorin toiminnasta virusten sitomisen yhteydessä.

10 Diagnostisiin tarkoituksiin voidaan infektoituneiden potilaiden eritteissä tai muissa tutkittavissa näytteissä esiintyvät virushiukkaset käsitellä reseptoriaineella, joka voi olla esimerkiksi kastotikkujen, immunologisten testiliuskojen, polymeerihelmien tms. muodossa olevan 15 sopivan kantaja-aineen pinnalla. Sitoutumisen jälkeen pinta pestään huolellisesti, ja viruksen läsnäolo voidaan osoittaa monin kliinisen virologian alalla vakiintunein tavoin. Virus voidaan esimerkiksi absorboida ensin mikro-titraussyvennyksiin, minkä jälkeen tehdään detektointi 20 ELISA-menetelmin (katso viite 1, kohta "Materiaalit ja menetelmät" ja esimerkki 6). Myös muita tämän keksinnön tekijöiden kehittämiä tutkimuksia voidaan soveltaa yksinkertaistettuun diagnostiseen käyttöön.

Ajatellaan myös, että edellä kuvattuja yhdisteitä 25 voidaan käyttää erilaisiin bioteknisiin tarkoituksiin, kuten viruspartikkelien tai viruksen pintakomponenttien valmistukseen ja eristykseen käyttämällä vakiintuneita affiniteettikromatografiamenetelmiä. Tätä varten resepto-riaine voidaan kytkeä kiinteään kantajaan, kuten liittää 30 edellä kuvatulla tavalla monivalenssisesti makromolekyyli-kantajaan, ligandin sitomiseksi kromatografiakolonneihin, elektroforeesia, suodatusta, sedimentointia tai sentri-fugointia varten. Reseptorin ominaisuudet (sitoutumis-vakio, jne.) voidaan optimoida eluution jne. kannalta 93227 30 suunnittelemalla yhdisteen synteesi siten, että vältetään viruksen irreversiibeli sitoutuminen reseptoriin. Tällä tavalla voi olla mahdollista eristää tai puhdistaa virus-partikkeleita tai virusaineita ja/tai detektoida viruksia 5 erilaisista näytteistä käyttämällä hyväksi niiden sitoutumista näihin kiinteisiin kantajiin kytkettyihin reseptoreihin tai reseptorianalogeihin.

Eräs reseptorien ja reseptorianalogien ehdotettu käyttö saattaa olla viruksen kalvolla olevan viruksen 10 sitoutumisen aikaansaavan aineen eristäminen. Ajatellaan, että tätä ainetta voidaan käyttää rokotustarkoituksiin, ts. kyseessä olevan ihmisen tai eläimen immunisointiin viruslajin, jonka pinnalta aine on saatu, aiheuttaman virussairauden lisäksi myös muita virussairauksia vastaan, 15 joita aiheuttavat virukset, joilla on pinnallaan sama aine. Tällä hetkellä otaksutaan näin ollen, että tällä tavalla voidaan tuottaa laajaspektrinen rokote erilaisia virus-sairauksia vastaan. Verrattuna tavanomaisiin rokotusmene-telmiin, joissa käytetään heikennettyjä virusvalmisteita, 20 tällaisella rokotteella olisi se ilmeinen etu, että infek-toimattomat viruksen komponentit voivat stimuloida vasta-aineiden tuotannon, joilla vasta-aineilla on kyky tehdä kyseessä oleva virus vaarattomaksi salpaamalla se molekyyli, joka on välttämätön viruksen infektion aiheutta-25 valle pääsylle isäntäsoluun.

Lopuksi ajatellaan, että saattaa olla mahdollista valikoida edellä kuvatulla tavalla viruksista sitoutuvia proteiineja tai glykoproteiineja, joita voidaan käyttää lääkkeiden ohjaamiseen elimistön tiettyihin soluihin.

30 Esimerkiksi liposomi (lipidirakkula) voidaan varustaa esimerkiksi monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen tietyn kohdesolun (esimerkiksi kasvainsolun tai solunsisäisiä loisia sisältävän solun) suhteen. Jotta vältettäisiin liposomin mahdollinen inaktivoituminen, 35 jonka aiheuttaa endosytoottinen otto lysosomeihin, se voidaan varustaa myös viruskomponentilla, joka tunnistaa 93227 31 toisen vaiheen reseptorin. Tällä tavalla voidaan viruksen osoitettua penetraatiomekanismia käyttää osana toksisen lääkkeen kuljetusvälinettä. Liposomi voidaan vaihtaa vasta-aineen (ensimmäinen vaihe) ja viruskomponentin suoran 5 kemiallisen liittymisen avulla bakteeritoksiinin aktiiviseen alayksikköön, joka vaikuttaa vain solun sisällä (katso viite 12).

Piirroksen kuvaus

Keksintöä kuvataan edelleen viitaten piirrokseen, 10 jossa kuvio 1 esittää koetta, jossa tutkittiin Sendai-viruksen (S-variantti) sitoutumista ensimmäisen vaiheen reseptoriin analysoituna kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Kaksi vasemmanpuoleista kaistaa on detektoitu kemiallisesti ja ne ovat ihmisen eryt-15 rosyyttien (kaista 1) ja ihmisen aivojen (kaista 2) koko-naisgangliosideja (neuramiinihappoa sisältäviä glykolipi-dejä). Oikealla puolella esitetään samat kaksi kaistaa Sendai-viruksen sitomisen ja autoradiografian jälkeen.

Kuten kuviosta ilmenee, virus ei sitoutu kaistan 1 pää-20 asiallisiin aivovyöhykkeisiin. Sitä vastoin tapahtuu ilmeisen voimakasta sitoutumista useisiin kaistan 1 erytro-syyttivyöhykkeisiin, erityisesti hitaasti liikkuviin.

Kuvio 2 esittää koetta, jossa tutkittiin Sendai-viruksen (S-variantti) sitoutumista toisen vaiheen resep-25 toriin analysoituna kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Tämä valaisee tämän kokeen mahdollistamaa suuren reseptoriehdokasmäärän analysoimista eri lähteistä saatujen glykolipidien seoksina (reseptorien seulonta). Vasemmalla on kromatogrammi anisaldehydillä 30 tehdyn kemiallisen detektoinnin jälkeen ja oikealla auto-radiogrammi, joka saatiin kun samat kaistat oli peitetty viruksella. Esitetyt ei-happamat kokonaisglykolipidit ovat seuraavat: ihmisen erytrosyytit (kaista 1), ihmisen lapsenpihka (kaista 2), Macaca cynomolgusin suoli (kaista 93227 32 3), koiran ohutsuoli (kaista 4), kaniinin ohutsuoli (kaista 5), marsun ohutsuoli (kaista 6) ja hiiren paksusuoli (kaista 7). Valkoiset numerot viittaavat taulukossa 3 lueteltuihin aineisiin. Kuvasta käy ilmi, että suuri 5 joukko kemiallisesti detektoituja voimakkaita glykolipi-divyöhykkeitä (vasemmalla) ei sido virusta (oikealla), mikä osoittaa kokeen suuren selektiivisyyden ja spesifisyyden .

Kuvio 3 esittää koetta, jossa tutkittiin Sendai-10 viruksen (S-variantti) sitoutumista toisen vaiheen resep-toriaineisiin analysoituna kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Tämä valaisee sitoutumista synteettisiin tai luonnon lähteistä eristettyihin ja kemiallisesti identifioituihin aineisiin. Tilan säästämi-15 seksi samaan kaistaan lisättiin useita puhtaita aineita aloittaen nopeimmin liikkuvasta aineesta, kuten ilmenee vasemmalla olevasta, anisaldehydillä detektoidusta kroma-togrammista. Oikealla puolella on autoradiogrammi. Numerot viittaavat taulukkoon 3. Kaista 1: synteettinen, fy-20 tosfingosiinia ja 2D-hydroksisteariinihappoa sisältävä 2, eihydroksirasvahappoa sisältävä 3, 15 ja GalNAcal-> 3(Fucal-> 2)Galp1-> 4(Fucal-> 3)GlcNAcpl-> 3Galpl->4GlcpCer; kaista 2: fytosfingosiiniä ja steariinihappoa sisältävä synteettinen 2, 3 (kolme 2-hydroksirasvahappoa 25 sisältävää lähekkäin liikkuvaa vyöhykettä) ja ei-hydrok-sirasvahappoa sisältävä 15; kaista 3: sfingosiiniä ja steariinihappoa sisältävä synteettinen 2, 3, ei-hydroksi-rasvahappoa sisältävä 6 (kontaminoitunut), 16 ja 22 (kolme 2-hydroksirasvanappoa sisältävää lähekkäin liikkuvaa 30 vyöhykettä); kaista 4: fytosfingosiiniä ja 2-hydroksi- steariinihappoa sisältävä synteettinen 1, fytosfingosiiniä ja ei-hydroksirasvahappoa sisältävä 3, 6 ja GalNAcal->3GalNAcpi->3Galal->4Gaipi->4GlcpCer, joka sisältää ei-hydroksirasvahappoa; kaista 5 sfingosiiniä : 93227 33 ja steariinihappoa sisältävä synteettinen 1, taulukon 1 aine 13, 6 (lyhytketjuinen 2-hydroksirasvahappo), 16 (kaksi 2-hydroksirasvahappoa sisältävää lähekkäin liikkuvaa vyöhykettä) ja 17 (oikealla olevassa autoradiogram-5 missä esiintyvät kolme lähekkäin liikkuvaa vyöhykettä voivat olla 17:n kontaminaatioita); kaista 6: 8 (kaksi lähekkäin liikkuvaa vyöhykettä), 20 ja GalNacal->3(Fucal->2)Gaipi->4GlcNAcpi->3Gaipi->4GlcpCer.

Kuvio 4 esittää käyriä, joita saatiin tutkimalla 10 kvantitatiivisesti Sendai-viruksen sitoutumista (katso "Materiaalit ja menetelmät") erilaisiin synteettisiin ja luonnollisiin glykolipideihin, jotka saatiin kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Glyko-lipidilaimennoksia absorboitiin mikrotitraussyvennyksiin 15 (x-akseli) ja viruksen sitoutuminen arvioitiin inkuboin-nin jälkeen mittaamalla radioaktiivisuus (y-akseli). Kirjaimet viittaavat seuraaviin tutkittuihin näytteisiin: A on taulukon 3 aine 1 tai 2. B on ensimmäisen vaiheen reseptori, jolla on seuraava sekvenssi: 20 NeuAca2->3Galöl->4GlcNAcpi-*3 (NeuAca2-»3GalBl->4GlcNAcB-*6 ) -GalBl-*4GlcNAcpi-»3Galöl->4GlcpCer. C on taulukon 3 aine 3 (sisältää 2-hydroksirasvahappoa) tai taulukon 1 aine 18.

D on taulukon 3 aine 5. E voi olla taulukon aineet 21 ja 22 (jotka sitovat heikosti kromatogrammissa, katso aine 25 22, kuvan 3 kaista 3) tai taulukossa 3 negatiivisia ai neita.

Kuviossa 5 esitetään esimerkkejä luonnossa esiin tyvistä keramidimolekyylispesieksistä (rasvahapon ja pitkäketjuisen emäksen yhdistelmiä). Näistä on tehty yh-30 teenveto muualla (Karlsson teoksessa Chapman (toim.), Biological Membranes, voi. 4. Academic Press, Lontoo, 1982, s. 1-74). R sisältää emäksen Cl:n hapen, ja se voi olla fosforyylikoliini, kuten sfingomyeliinissä, tai sak-karidi, kuten glykosfingolipideissä. Rasvahappojen pää- 34 93227 tyypit ovat ei-hydroksi-, 2-D-hydroksi- ja 2-D,3-D-dihyd-roksirasvahapot, joissa on noin 12-26 hiiliatomia ketjussaan, joka voi olla tyydyttynyt, tyydyttymätön, lineaarinen tai haaroittunut. Emästen päätyypit ovat dihydroksi-5 emäkset (sfingosiini-, dihydroksisfingosiini- ja niiden sukulaisemäkset) ja trihydroksiemäkset (fytosfingosiini-ja sen sukulaisemäkset). Niissä on noin 14-22 hiiliatomia, ja ketju voi olla tyydyttynyt, tyydyttymätön, lineaarinen tai haaroittunut. Kolmen klassisen emäksen abso-10 luuttiset rakenteet ovat: sfingosiini; 1,3-D-dihydroksi-2-D-amino-4-trans-oktadekeeni (spesiekset B ja D), dihyd-rosfingosiini: 1,3-D-dihydroksi-2-D-amino-oktadekaani (spesies A) ja fytosfingosiini: 1,3-D,4-D-trihydroksi-2-D-amino-oktadekaani (spesiekset C, E ja F). Nisäkässolu-15 jen yleisimmät spesiekset ovat A-E, joissa usein on rasvahapossa 15-cis-kaksoissidos. Epiteelisolujen yleisimmät spesiekset ovat D ja E, jotka ovat parhaita virusten si-tojia (taulukko 4). Siksi virukset ovat valinneet toisen vaiheen reseptoreiksi glykolipidejä, joilla on keramidi-20 koostumus, joka vallitsee epiteelisoluissa, virusinfektioiden elimistöön tulokohdissa.

Kuvio 6 esittää toisen vaiheen reseptorin konfor-maatiota, joka saatiin tekemällä yksikideröntgenkristal-lografinen mittaus taulukon 3 mukaiselle synteettiselle 25 aineelle 1, joka sisältää dihydrosfingosiiniä ja 2D-hyd-roksisteariinihappoa [katso Pascher et ai., Chem. Phys. Lipids, 20 (1977) 175-191]. Typpiatomi on täplikäs ja karbonyylihappi ja hapon C20 varjostettuja. Aine valmistettiin Pascherin kuvaamalla tavalla [Chem. Phys. Lipids, 30 12 (1974) 303-315] ja kiteytettiin 95-%:isesta etanolista.

Röntgentiedot kerättiin Picker FACF I -diffraktometrillä,

II

35 93227 ja mitattiin yli 5000 riippumatonta heijastusta. Kaikki laskut tehtiin DEC-10 -tietokonejärjestelmällä käyttämällä pääasiassa X-RAY 72 -ohjelmistoa.

Kuvio 7 esittää ohutkerroskromatogrammia, joka on 5 detektoitu anisaldehydillä ja joka valaisee toisen vaiheen reseptoriglykolipidien läsnäoloa ihmisen ohutsuolen epiteelisoluissa. Epiteelisolut ja ei-happamat kokonais-glykolipidit preparoitiin ja identifioitiin kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Kaksois-10 vyöhykkeet, jotka ovat yhteisiä kaikille neljälle kaistalle, on identifioitu taulukon 3 aineiden 1 ja 2, jotka ovat kaksi optimaalista luonnollista virusten sitojaa (esimerkki 2 ja kuva 4), seokseksi. Hitaammin liikkuvat glykolipidit ovat veriryhmätukolipidejä, ja ne vaihtelevat 15 analysoitujen neljän yksilön mukaan, jotka olivat seuraa-via veriryhmätenotyyppejä: Kaista 1: A^Le (a+b ), erittä-jä; kaista 2: OLe (ab), erittäjä; kaista 3: OLe (a+b ), erittämätön; kaista 4: OLe (ab), erittäjä. Näiden näytteiden koostumusta ovat kuvanneet Björk et ai. teoksessa 20 Cartron et ai. (toim.), Red Cell Membrane Glycoconjugates and Related Genetic Markers, Libraire Arnette, Pariisi 1983, s. 125-137.

Kuvio 8 esittää muualla yksityiskohtaisesti kuvatun (Karlsson teoksessa Chapman (toim.), Biological Membranes, 25 voi. 4, Academic Press, Lontoo 1982, s. 1-74) eläinsolun pintakalvon ulomman yksinkertaisen kerroksen rakennekaaviota. Kolme pääasiallista lipidikomponenttia ovat sfingo-lipidi, glyserolipidi ja kolesteroli, ja niissä on väli-vyöhykkeellä joukko vetysidosakseptoreita ja -donoreita, 30 jotka muodostavat molekyylien välisten sivusuuntaisten vetysidosten järjestelmän, joka on tärkeä kalvon stabii-lisuudelle. Sitomiskohtia on erityisen tiheässä limakalvojen epiteelisoluissa, virusinfektioiden elimistööntulo-kohdassa. Kuten esimerkissä 4 osoitetaan, epiteelisoluissa 35 on runsaasti toisen vaiheen reseptoria (taulukon 3 aine 1 ja 2), joka on sekä vetysidosakseptoreita että -donoreita 36 sisältävä sfingolipidi. Myös kasvisolut sisältävät taulukon 3 ainetta 2 taulukon 3 aineiden 26 ja 27 lisäksi, jotka ovat glyserolipidejä. Nämä sitovat viruksia (taulukko 3). Virukset ovat siten kehittäneet (pintapeptidin 5 kautta) kyvyn käyttää hyväksi selektiivistä sitoutumista varten kaikkia kolmea pintakalvon osaa, jotka ovat oleellisia kalvon tekemiseksi stabiiliksi suluksi. Tällä tavalla penetraation ja infektoitumisen mahdollistava toisen vaiheen reseptori on kaikkien solupintojen normaali kompo-10 nentti.

Materiaalit ja menetelmät

Luonnon reseptorin ja sen sukulaisaineiden valmistus ja rakenteellinen karakterisointi Sitoutumistutkimuksiin käytetyt ihmis- ja eläin-15 glykolipidinäytteet, joko puhtaat glykolipidispesiekset tai glykolipidikokonais- tai -osaseokset, valmistettiin suurin piirtein viitteessä 14 kuvatulla tavalla kylmäkuivatusta kudoksesta uuttamalla useaan kertaan kloroformilla ja metanolilla, tekemällä lievä emäskäsittely ei-20 sfingolipidien hajottamiseksi ja dialysoimalla 4 vrk vettä vastaan vesiliukoisten tuotteiden poistamiseksi. Jäljelle jäävä lipidimateriaali erotetaan ensin silika-geelipylväällä hallitsevien rasvahappoestereiden erottamiseksi ennen emäksiä täysin kestäviä sfingolipidejä.

25 Nämä erotetaan sitten DEAE-selluloosa tai DEAE Sepharos^^ kolonnilla ei-happamaan ja happamaan glykolipidifraktioon. Hapan fraktio erotetaan sitten tavallisesti tekemällä gradienttieluointi DEAE Sepharosesta®. Ei-hapan fraktio asetyloidaan etikkahappoanhydridissä ja pyridiinissä ja 30 fraktioidaan uudelleen silikageelillä tekemällä portaittainen tai jatkuva gradienttieluointi metanolilla kloroformissa tai muissa liuottimissa. Fraktiot deasetyloidaan miedossa emäksessä ja fraktioidaan edelleen tarvittaessa, kunnes ne ovat puhtaita. Puhtaus testataan ohutkerros-35 kromatografiällä ja tarkistetaan vielä massaspektrometrialla ja NMR-spektroskopiällä jäljempänä kuvattavalla tavalla.

il 93227 37

Ei-glykolipidikontaminaatioista täysin vapaiden glykolipidien valmistamiseksi lisätään 250 ml metanolia noin 250 ml:aan yhden verensiirtoyksikön ihmisveriplas-maa, ja seosta pidetään 30 min 70°C:ssa jatkuvasti sekoit-5 taen 1 l:n haihdutuspullossa. Uuteliuos suodatetaan, ja jäännös siirretään takaisin uuttopulloon. Tämä menettely toistetaan kahdesti käyttäen 250 ml kloroformin ja metano-lin seosta tilavuussuhteessa 2:1 ja kerran 250 ml:11a metanolia. Yhdistetyt uuteliuokset haihdutetaan kuiviin 10 lisäten pieniä tilavuuksia tolueenia.

Pieniä määriä märkiä soluja voidaan uuttaa samalla tavalla. Toimittaessa suuremmassa mitassa kudos kylmäkui-vataan ensin palasina ja tehdään kaksivaiheinen uutto Soxhlet-laitteessa. Ihmisen ohutsuolen ollessa kyseessä 15 (kuivapaino esimerkiksi 130 g) uutetaan ensin kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 2:1 24 tuntia (1000 ml liuotinta 2000 ml:n pyöröpullossa, joka on sijoitettu asbestieristeiseen sähköhauteeseen). Toinen uutto tehdään käsittelemällä 24 tuntia 1500 ml:11a kloroformin 20 ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 1:9. Yhdistetyt uuteliuokset haihdutetaan kuiviin suodattamatta.

Kuivattua plasmauutejäännöstä käsitellään 3 tuntia liuoksella, joka sisältää 0,2 mol/1 KOH:ia metanolissa, pullossa, joka sisältää viisi lasihelmeä hienojakoisen 25 dispersion muodostamiseksi ajoittaisen ravistelun aikana. KOH neutraloidaan 1 ml:11a etikkahappoa. Seos dialysoidaan vettä vastaan dialyysipussissa, kun on lisätty 100 ml kloroformia ja 40 ml vettä kaksifaasisysteemin aikaansaamiseksi. Kun on dialysoitu 4 vrk juoksevaa vesijohtovettä 30 vastaan, pussin sisältö haihdutetaan 70°C:ssa lisäten useaan kertaan tolueenia. Lopuksi näyte suodatetaan ja eluoidaan kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 2:1. Kokonaissuoliuutteen ollessa kyseessä käytetään 500 ml KOH:n metanoliliuosta.

35 Plasmanäyte (noin 1,4 g) laitetaan pylvääseen, joka sisältää 10 g silikageeliä kloroformissa. Käytetty 93227 38 silikageeli on pääasiassa Mallinckrodt Chem. Worksin,

St. Louis, USA, valmistamaa, ja se seulotaan hiukkas-kokoon yli 45^um ja kuivataan. LiChroprep Si 60:llä (E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta), joka 5 täyttää vertailukelpoiset määritelmät, on kuitenkin samankaltaiset ominaisuudet, vaikkakin jonkin verran silika-geeliä saattaa eluoitua. Eluoidaan kolme fraktiota: 100 ml kloroformia eluoi pääosan massasta (noin 1 g uutetta, kolesterolia ja rasvahappojen metyyliestereitä); 100 ml 10 kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 98:2 saattaa sisältää vapaata keramidia; 100 ml kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 1:3 ja 100 ml meta-nolia eluoivat kaikki glykolipidit ja emäksiä kestävät fosfolipidit (noin 60 mg). Dialysoidun ohutsuolinäytteen 15 (noin 40 g) ollessa kyseessä käytetään 50 g silikageeliä ja 500 ml liuotinta kussakin vaiheessa.

Plasmanäytteen silikageelikromatografiän kolmas fraktio laitetaan kolonniin, joka sisältää 5 g asetaatti-muodossa olevaa DEAE-selluloosaa (DE-23, Whatman) kloro-20 formin ja metanolin seoksessa tilavuussuhteessa 2:1.

Näytteen annetaan tasapainottua kolonnilla 1 tai 2 vrk. Eluoidaan kaksi fraktiota, toinen 100 ml:11a kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 2:1 ja 100 ml:11a metanolia, jolloin eluoituu ei-happamia glykolipidejä ja 25 emäksiä kestäviä fosfoiipidejä, pääasiassa sfingomyelii-niä, ja toinen 50 ml:11a liuosta, joka sisältää 5 % (massa/tilavuus) LiCl:a metanolissa, jolla eluoituu happamia glykolipidejä (sulfatideja ja gangliosideja) ja emäksiä kestäviä fosfolipidejä. Viimeksi mainittu fraktio 30 dialysoidaan yhdessä kloroformin (30 ml) ja veden (20 ml) kanssa juoksevaa vesijohtovettä vastaan 4 vrk. Se voidaan joko käyttää happamia glykolipidejä sisältävänä kokonais-fraktiona tai käsitellä edelleen kuvatulla tavalla sulfa-tidien ja gangliosidien erottamiseksi /Breimer et ai., 35 J. Biochem. 93 (1983) 1473-14857. Ensimmäinen fraktio haihdutetaan kuiviin ja asetyloidaan. Suolinäytteen 93227 39 (noin 2 g) ollessa kyseessä käytetään 20 g DEAE-sellu-loosaa.

Kuiva ei-hapan plasmanäyte asetyloidaan pitämällä sitä yön yli pimeässä kloroformin (2 ml), pyridiinin 5 (2 ml) ja etikkahappoanhydridin (2 ml) seoksessa. Kloro formia lisätään liukoisuuden parantamiseksi ja täydellisen reagoinnin varmistamiseksi. Lisätään 5 ml metanolia ja 5 ml tolueenia, ja näyte haihdutetaan typpivirrassa kuumennetulla vesihauteella ja imetään lopuksi astiaan 10 alipaine.

Asetyloitu plasmanäyte laitetaan kolonnille, joka sisältää 10 g silikageeliä kloroformin ja metanolin seoksessa tilavuussuhteessa 98:2. Tähän tarkoitukseen käytetään hiukkasia, joiden koko on alle 45^um ja jotka on 15 käsitelty metanolilla ja kuivattu. Eluoidaan kolme fraktiota: 100 ml kloroformin ja metanolin seosta tilavuus-suhteessa 95:5, 100 ml kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 90:10 ja 100 ml kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 1:3 sekä 100 ml metanolia.

20 Kolmas fraktio sisältää pääasiassa asetyloitua sfingo-myeliiniä. Ensimmäiset kaksi fraktiota, jotka sisältävät asetyloituja glykolipidejä ja jonkin verran epäpuhtauksia, haihdutetaan yhdessä ja deasetyloidaan. Suolifrak-tiolle käytetään 50 g silikageeliä.

25 Asetyloitujen glykolipidien deasetylointi voidaan tehdä kahdella tavalla, joista toiseen sisältyy dialyysi-vaihe ja toiseen ei.

Menetelmä A: Plasmanäytteelle käytetään 2 ml tolueenia, 2 ml metanolia ja 4 ml liuosta, joka sisältää 0,2 30 mol/1 KOH:a metanolissa, 30 min:n ajan ravistellen ajoittain (suolinäytteelle käytetään 5, 5 ja vastaavasti 10 ml). Kun on lisätty 0,5 ml etikkahappoa, näyte siirretään yhdessä kloroformin (10 ml) ja veden (10 ml) kanssa dia-lyysipussiin (kaksifaasisysteemi), ja dialysoidaan 4 vrk 35 juoksevaa vesijohtovettä vastaan. Pussin sisältö haihdutetaan 70°C:ssa lisäten useaan kertaan tolueenia.

40 93227

Menetelmä B: Tässä tapauksessa ei tarvita dialyysiä, koska neutraloitumisen jälkeen muodostuvan kalium-asetaatin määrä on hyvin pieni verrattuna glykolipidin määrään. Reagenssi koostuu 1 ml:sta liuosta, joka sisäl-5 tää 0,2 mol/1 KOH:a metanolissa, 14 ml:sta metanolia ja 5 ml:sta tolueenia. Tätä seosta käytetään 0,1 ml asety-loidun lipidin määrän ollessa korkeintaan 2 mg, 0,2 ml korkeintaan 4 mg:lie, 0,5 ml korkeintaan 15 mg:lie, 1 ml korkeintaan 40 mg:lie jne. Deasetyloitava näyte haihdu-10 tetaan kuiviin, lisätään asianmukainen määrä reagenssia ja seosta sekoitetaan ajoittain 2 tunnin ajan, minkä jälkeen KOH neutraloidaan etikkahapolla ja liuottimet haihdutetaan. Esimerkkinä mainittakoon, että deasetyloitaessa 40 mg asetyloitua glykolipidiä 1 ml:11a reagenssia jää 15 glykolipidinäytteeseen noin 1 mg kaliumasetaattia. Mikäli välttämätöntä, kaliumionit voidaan poistaa suodattamalla esimerkiksi kloroformin ja metanolin seoksella pestyn, H+-muodossa olevan AmberlitJ^CG-50, tyyppi I:n läpi (Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania, USA), ja 20 deasetylaatioseos voidaan suodattaa suoraan lisäämättä etikkahappoa. Voi kuitenkin esiintyä jonkin verran irreversiibeliä adsorboitumista, ja eluoitu hartsi voi aiheuttaa myös kontaminaatiota. Siksi on edullista, että tietty määrä kaliumasetaattia jää näytteeseen.

25 Deasetyloitu plasmanäyte suodatetaan pylvään läpi, joka sisältää 2 g DEAE-selluloosaa kloroformin ja metanolin seoksessa tilavuussuhteessa 2:1. Kolonnille laitetun näytteen annetaan tasapainottua 1-2 vrk ennen eluointia 50 ml:11a kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhtees-30 sa 2:1 ja 50 ml:11a metanolia. Tämän vaiheen tarkoituksena on poistaa emäksiä kestävät aminoryhmän sisältävät fosfo-lipidit, jotka ovat muuttuneet N-asetyloiduiksi johdoksiksi asetyloinnin aikana. Tämä tekee niistä happamia.

Lopullinen silikageelikromatografiavaihe poistaa 35 polaarittomat epäpuhtaudet, jotka eluoituvat kahdessa ensimmäisessä fraktiossa. Plasmanäyte pakataan kolonnille, n 93227 41 joka sisältää 5 g silikageeliä (hiukkaskoko alle 45^,um) kloroformin ja metanolin seoksessa tilavuussuhteessa 98:2. Kun on eluoitu kaksi fraktiota, molemmat 50 ml:11a kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 98:2, puhtaat 5 glykolipidit eluoidaan 50 ml :11a kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 1:3 ja 50 ml:11a metanolia. Ei-happamien glykolipidien lopullinen kokonaissaanto yhden verensiirtoyksikön ihmisveriplasmasta on 6-8 mg.

Preparatiivisia vaiheita seurataan ohutkerroskroma-10 tografialla (Silica gel 60 nanoplates, E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) käyttämällä edullisesti kloroformi-metanoli-vesiseosta tilavuussuhteessa 65:25:4 derivatisoi-mattomille ja kloroformin ja metanolin seosta tilavuus-suhteessa 95:4 asetyloiduille näytteille. Anisaldehydi on 15 edullinen detektointireagenssina, koska se muodostaa luonteenomaisia värejä: glykolipidit värjäytyvät tavallisesti vihreiksi tai sinivihreiksi, glyserofosfolipidit harmaiksi tai violeteiksi ja sfingomyeliini ja keramidi sinisiksi (katso viite 21).

20 Edellä kuvattu menettely johtaa ei-happamien glyko lipidien kokonaisseokseen (1 - noin 20 sokeria), joka on täysin vapaa ei-glykolipidiepäpuhtauksista. Tämä fraktio on tärkeä testattaessa toisen vaiheen reseptorin läsnäolo erilaisissa solutähteissä (katso kuvat 2 ja 7). Toisen 25 vaiheen reseptorin eristämiseksi puhtaassa muodossa tällaisista glykolipidiseoksista voidaan edellä kuvattua viimeistä silikageelikromatografiavaihetta muuttaa hieman seuraavasti. Kun on eluoitu kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 98:2, on yksisokerinen toisen 30 vaiheen reseptori helppo eluoida kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 95:5 - 90:10. Tehtäessä suurimittainen valmistus valituista lähteistä voidaan edellä kuvattua menettelyä kuitenkin yksinkertaistaa suuresti seuraavasti. Saatavissa olevia toisen vaiheen reseptorin 35 lähteitä voivat olla nisäkkään suoli (katso kuvio 7), hiivat tai sienet ja jotkut selkärangattomat. On esimerkiksi 42 93227 osoitettu, että meritähti, Asterias Rubens, jota on helppo pyydystää merestä, on hyvä toisen vaiheen reseptorin lähde /aine 2 taulukossa 3, katso Björkman et ai., Biochim. Biophys. Acta, 270 (1972) 260-265]. Nisäkkäiden aivot 5 sisältävät myös hyvin paljon toisen asteen reseptoria, joka on taulukon 3 aineen 1 muodossa. Tätä varten kylmäkuivattua aivoa (esimerkiksi naudan tai sian aivoa) uutetaan kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 2:1 (jota käytetään kymmenkertainen määrä kudokseen näh-10 den). Suodatettu uuteliuos haihdutetaan kuiviin, uutetaan uudelleen samalla liuottimena ja suodatetaan. Haihdutetulle uutteelle tehdään emäksinen metanolyysi yön yli (rajoitettu tilavuus, esimerkiksi 500 ml yksiä aivoja kohden, liuosta, jossa on 0,2 mol/1 KOH:a metanolissa).

15 Sitten seoksen pH säädetään etikkahapolla arvoon noin 3,5, ja liuotin jaetaan kerroksiin säätämällä kloroformin, metanolin ja veden välinen tilavuussuhde arvoon 8:4:3.

Kun seos on seissyt yön yli, alempi kerros haihdutetaan kuiviin ja sille tehdään silikageelikromatografia. Tämä 20 vaihe toteutetaan eräänlaisena suodatuksena käyttämällä lyhyttä, leveää kolonnia, joka on pakattu pelkkään kloroformiin ja johon lisätään korkeintaan 1 g uutetta/1 g adsorbenttia. Pääosa uutteesta eluoituu pelkällä kloroformilla (kolesterolia ja rasvahappojen metyyliestereitä).

25 Toisen vaiheen reseptori, Gal^Cer, eluoituu kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 95:5 - 90:10. Eluoinnin loppuvaiheessa voi epäpuhtautena tulla joukkoon sulfatoitua Gal^Cer:a. Gal^Cer-saannon parantamiseksi seos voidaan suodattaa DEAE-selluloosan läpi, joka sitoo sulfa-30 toituneen aineen. Viimeiset jäännökset pigmentoituneita aineita voidaan tarvittaessa poistaa kiteyttämällä etanolista. Kylmäkuivatulle meritähdelle voidaan käyttää täsmälleen samaa menettelyä. Tässä tapauksessa DEAE-sellu-loosalla poistetaan kolesterolisulfaatti sulfatoituneen 35 GaIyiCer:n sijasta.

Il 93227 43

Eristettyjen fraktioiden rakenneanalyysi tehdään hajottamattomille näytteille massaspektrometrisesta (katso viite 14) ja NMR-spektroskooppisesti (katso viite 15) ja käyttämällä yhdistetysti permetyloituja, permetyloitu-5 ja LiAlH^-pelkistettyjä ja (glykolipidien ollessa kyseessä) permetyloituja, LiAlH4~pelkistettyjä, trimetyylisily-loituja johdoksia. Tällä tavalla saadaan selville oligosakkaridien sekvenssi ja anomeria ja keramidin koostumus. Tehdään myös hajotus, jotta saataisiin tietoa sokerien 10 tyypistä ja sidosten asemista kaasukromatografian ja massaspektrometrian yhdistelmällä viitteessä 16 kuvatulla tavalla.

Käytettiin muutamia synteettisiä keramideja mukaan luettuina yhdistelmät sfingosiini-(ei-hydroksirasvahappo), 15 sfingosiini-hydroksirasvahappo, fytosfingosiini-(ei- hydroksirasvahappo) ja fytosfingosiini-hydroksirasvahappo (katso viite 17). Valmistettiin myös samankaltaisia pitkä-ketjuisen emäksen ja rasvahapon luonnollisia yhdistelmiä käyttämällä menetelmää, johon edellä viitattiin.

20 Sfingomyeliini saatiin edellä kuvatulla menette lyllä. Erilaisia fosfoglyseridejä valmistettiin tekemättä emäshajotusta ja ne erotettiin DEAE-selluloosalla happa-miksi (fosfatidyyliseriini ja fosfatidyyli-inositoli) ja ei-happamiksi fosfoiipideiksi. Ei-happamet fosfolipidit 25 erotettiin sitten silikageelipylväillä fosfatidyylietanoli-amiiniksi ja fosfatidyylikoliiniksi. Aineiden puhtaus testattiin ohutkerroskromatografiällä, ja ne identifioitiin analysoimalla komponentit (katso viite 18). Fosfatidyyli-koliinia, fosfatidyylietanoliamiinia ja fosfatidyyli-30 seriiniä ostettiin myös Sigma Chemical Co:sta.

Kahta kasviperäistä glykoglyserolipidiä, galakto-syylidiglyseridiä ja digalaktosyylidiglyseridiä ostettiin Sigma Chemical Co.:sta.

Tri Irmin Pascher luovutti muutamia synteettisiä 35 monoglykosyylikeramideja, ja niiden valmistusta kuvataan julkaisussa Pascher, Chem. Phys. Lipids, 12 (1974) 303-315.

44 93227 Nämä olivat galaktopyranosyy li/$- ja glukopyranosyyli^-keramideja, jotka sisälsivät erilaisina yhdistelminä pitkäketjuista emästä ja rasvahappoa, kuten sfingosiiniä, dihydrosfingosiiniä, fytosfingosiiniä ja 2-hydroksi- ja 5 ei-hydroksirasvahappoja. Eräästä tällaisesta spesieksestä, dihydrosfingosiiniä ja 2-D-hydroksioktadekaanihappoa sisältävästä galaktopyranosyyli/Jkeramidista, määritettiin kidekonformaatio /Pascher et ai., Chem. Phys. Lipids, 20 (1977) 175-191/, ja sitä käytettiin reseptorin sitovan 10 epitoopin osoittamiseen.

Toisen vaiheen reseptorin (GaljbCer tai Glc^Cer) kemiallinen synteesi voidaan toteuttaa erilaisin tavoin, joihin on viitattu edellä ja joista on yksityiskohtainen katsaus viitteessä 13. Dihydrosfingosiini (kaavan A mukai-15 nen emäs kuviossa 5) voidaan esimerkiksi valmistaa Carterin et ai. tai Jennyn ja Grobin (katso viite 13) mukaan. Hydroksirasvahappo voidaan liittää tähän käyttämällä 2-D-asetoksioktadekaanihapon /Karlsson et ai., Chem. Phys. Lipids 12 ( 1974), 65-74_/ p-nitrof enyyliesteriä /Pascher, 20 Chem. Phys. Lipids, 12 (1974) 303-3157· 3-O-bentsoyyli-johdoksen valmistuksen jälkeen voidaan Gal:n tai Glc:n asetobromijohdoksia käyttää Gal^Cerin tai Glc/iCer:n (aineet 1 ja vastaavasti 2 taulukossa 3) valmistukseen.

Synteettiset reseptorianalogit ja niiden sukulais-25 aineet

Mono- tai oligosakkaridit, jotka oli liitetty lipi-diosaan tai monivalenssisesti naudan seerumialbumiiniin (aineet 1-5 ja 0-14 taulukossa 1), ostettiin The Sugar Companystä, Arlöv, Ruotsi. Uudet tämän keksinnön kannalta 30 merkitsevät reseptorianalogit (aineet 6-9 ja 15-18 taulukossa 1) valmisti ja luovutti tri Göran Magnusson, Department of Organic Chemistry 2, University of Lund, Ruotsi /bahm§n et ai., Carbohydr. Res., 118 (1983) 292-301; Dahmön et ai., 127 (1984) 27-33/. Käytetyt reseptori-35 analogit esitetään taulukossa 1.

ti 93227 45

Taulukko 1

Sitoutumisen estämiseen käytettyjä synteettisiä reseptorianalogeja (Sokerit ovat D-konfiguraatiossa ja pyranoosi-5 muodossa)

1 Gal taiGalBCETE

2 Glc taiGclBCETE

3 Gal&WGIc taiQalBl-4Glc&CETE

4 GaIBCETE-BSA

10

5 GlcBCETE-BSA

6 GaipWGIcBOEt ch7sOt(ch2)10cooh

7 GalBl-4Glc5-OCH2CH

CH-SO-(CH-)7CH-15 222/3 ch2so7(ch7)10cooh

8 GalB1-4Glc5-"OCH2CH

ch2so2(ch2)10cooh 20 ch2so,(ch,)10conh-bsa

9 GalB1-+4GlcB-OCH2CH

ch2so2(ch2)7ch3 10 GalBWGIcBCETE-BSA 25

11 GalBOTE

12 GlcBOTE

13 GaIBWCIcBOTE

14 Gala1-4GalBOTE

CH_S-(CH-)ie.CH0 30 2 2 15 3

15 GalBl->4GlcB-OCH2CH

ch2s-(ch2)15ch3 16 gicboch2ch2so2-(ch2)17ch3 46 93227

Taulukko 1 (j a tkoa) CH2S02-(CH0)15CH3

17 GlcS-OCH2CH

5 CH9S02-(CH0)15CH3 CH2SO0-(CHo)15CH3

18 Gal61-4Glc^OCHnCH

ch2so2-(ch7)15ch3 10 - CETE: (OCH0CH0SCH^CH2CO^CH3) OTE: (OCH7CH7S(CH2)17CH3) BSA: naudan seerumialbumiini 15 Epiteelisolujen preparointi

Tuoreista kudoksista peräisin olevat epiteelisolut preparoitiin kahdella tavalla: huuhtomalla ja raaputtamalla. Pesu tehtiin EDTA:a sisältävällä fosfaattipuskurilla suolisilmukoissa viitteessä 19 kuvatulla tavalla.

20 Silmukka täytettiin puskurilla ja sitä inkuboitiin vesi-hauteessa 37°C:ssa muutamia minuutteja varovasti liikutellen/ sekoittaen , minkä jälkeen suolen sisältö dekantoi-tiin. Tämä toistettiin 5-10 kertaa, ja kukin fraktio sentri-fugoitiin ja sen sisältämät solut tutkittiin mikroskoop-25 pi- ja markkerientsyymianalyysillä (alkalinen fosfataasi, tymidiinikinaasi). Pelkkiä epiteelisoluja sisältävät fraktiot yhdistettiin ja käytettiin glykolipidien valmistukseen edellä kuvatulla tavalla. Tällä tavalla analysoitiin muutamien ihmisyksilöiden ja rottakantojen ohut- ja paksu-30 suolista saatuja epiteelisoluja. Ihmisen ohutsuolta raaputettiin myös varovasti lusikalla, jolloin saatiin epiteelisoluja, jotka sisälsivät jonkin verran ei-epiteelijäännöstä epäpuhtautena. Samalla tavalla saatiin epiteelisoluja ihmisen virtsateistä (virtsaputkesta) samoin kuin koiran 35 ja hiiren suolista. Analysoitiin myös muutamien muiden eläimien, kissa, turska, marsu, hamsteri, kana ja kaniini

If 93227 47 mukaan luettuina, ohutsuoli (katso viite 20). Keramidi-komponenttien massaspektrometria- jne. tietojen hankkimisen lisäksi näytteet ajettiin boraatilla kyllästetyllä silikageelilevyllä, jolla monoglykosyylikeramidit erottu-5 vat sekä Gal:n ja Glc:n että sfingosiinin, fytosfingosii-nin, ei-hydroksi- ja 2-hydroksirasvahapon pääasiallisten keramidiyhdistelmien mukaan (katso viite 21).

Viruspreparaatit ja vasta-aineet Käytetyissä reseptorianalyyseissä sitoutunut virus 10 detektoitiin anti-virusvasta-aineen avulla. Polyklonaali-set ja monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin tavanomaisin menetelmin /Rose et ai. (toim.), Manual of Clinical Immunology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 19807· Testatut virukset olivat tunnettuja viruksia, 15 jotka kasvatettiin ja määritettiin ammattimaisissa virus-laboratorioissa käyttämällä vakiintuneita menetelmiä /Lennette (toim.), Manual of Clinical Microbiology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980/. Käytetyt virukset esitetään taulukossa 2.

93227 48

Taulukko 2

Virukset, joiden on osoitettu sitoutuvan toisen vaiheen reseptoriin 5 Kaksois-

Heimo Laji kerros- kalvo- _vaippa_ DNA-virukset Adenoviridae Adenovirus 2 ja 7 ei

Herpetoviridae B95-8 EB-virus kyllä RNA~virukset Orthomyxo- viridae Influenssavirus kyllä

Paramyxo- ^ viridae Sikotautivirus kyllä

Sendai -vi rus, G-variantti kyllä

Sendai-virus, S-varian tti kyllä 20

Rhabdoviridae Vesikauhuvirus, ERA-kanta kyllä

Reoviridae Rotavirus K8 ei

Reovirus 1,2 ja 3 ei 25 Adenoviruksia 2 ja 7 lisättiin A-549-soluissa ja hyperimmuunit seerumit saatiin immunisoimalla kaniinit tunnetulla tavalla /Wadell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 110 (1984) 191-2207· Ihmisen rotavirus K8:aa lisättiin GMK-soluissa, ja käytettiin kaniinin hyperimmuuniseerumit 30 /Urasawa et ai., Microbiol. Immunol., 25 (1981) 1025-1035/. Reoviruksia 1, 2 ja 3 lisättiin GMK-soluissa, ja käytettiin kaniinin hyperimmuuniseerumit /Rose et ai. (toim.), loc. cit.; Lennette (toim.), loc. cit._7. Epstein-Barr-virus oli B95-8 EB -virus, jota lisättiin apinan lymfoidi-35 soluissa ja jonka valmisti tri L. Rymo /Rymo et ai., Nucl. Acid Res., 5 (1978) 1387-1402/, vasta-aine oli hiiren 93227 49 monoklonaalinen vasta-aine MA, jonka toimitti tri G. Pearson, Dep. Microbiology, The Mayo Foundation, Rochester, USA. Vesikauhuviruksen ERA-kantaa lisättiin BHK-21-soluissa, vasta-aineena oli hiiren monoklonaalinen vasta-aine 5 101-1 /Dietzschold et ai., Proc. Nat. Acad. USA, 80 (1983) 70-74/, ja preparaatit toimitti tri H. Koprowski (katso Dietzschold et ai., loc. cit.). Influenssavirus A/PR/8/34:ää lisättiin alkion sisältävissä kananmunissa, vasta-aine oli hiiren monoklonaalinen vasta-aine H2-6A5, ja nämä 10 valmisteet toimitti tri W. Gerhard /Caton et ai., Cell 31 (1982) 417-4277· Influenssaviruskantoja X-31 ja X-31 HS lisättiin alkion sisältävissä kananmunissa, ja ne toimitti tri J.C. Paulson /katso Rogers et ai., Nature 304 (1983) 76-78/. Nämä kannat detektoitiin peittämällä ohutkerros-15 levy tunnin ajaksi ihmisen erytrosyyttien 2-%:isella suspensiolla (aktiiviset vyöhykkeet värjäytyvät punaisiksi) ja huuhtomalla. Influenssaviruskannat A/Chile/1/83, A/Philippines/2/82 ja B/USSR/100/83 saatiin SBL:stä (Swedish State Bacteriological Laboratory), Solna, Ruotsi.

20 Myös nämä virukset detektoitiin peittämällä ihmisen eryt-rosyyteillä. Sendai-viruksen Z-kantaa (variantit "S" ja "G", katso viite 46 ja esimerkki 1) kasvatettiin alkion sisältävissä kananmunissa tai Vero-soluissa, ja vasta-aineina olivat hiiren monoklonaaliset vasta-aineet 817 ja 25 851 /Arveli et ai., J. Immunol., 129 (1982) 2779-2787/ ja kaniinin anti-Sendai-vasta-aine 121, jonka valmisti tri C. örvell. Sikotautiviruksen Kilham-kantaa kasvatettiin Vero-soluissa, ja vasta-aine oli hiiren monoklonaalinen vasta-aine /örvell, J. Immunol., 132 (1984) 2622-2629/.

30 HTLV-I-viruksen valmisti tri J. Blomberg HTLV-I:ä erittävästä leukemia-T-solulinjasta /katso Blomberg et ai., Leukemia Res., 1985, painossa/. HTLV-III:n toimitti tri R.C. Gallo, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA. HTLV-I ja HTLV-III-virukset jodattiin käyttämällä 35 tavanomaista laktoperoksidaasimenetelmää (Rose et ai.,

Manual of Clinical Immunology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980).

50 93227

Vasta-aineista testattiin epäspesifisen sitoutumisen poissaolo sitoutumiskoejärjestelyllä, jossa käytettiin kaikkia muita aineosia paitsi virusta. Tällä tavalla suljettiin pois vasta-aineiden sitoutuminen suoraan kyseessä 5 oleviin glykolipidivyöhykkeisiin, joka ilmiö saattaisi tuottaa vääriä positiivisia tuloksia.

Viruksen sitoutumisspesifisyyden tutkiminen ja suhteellisen sitoutumisvoimakkuuden arviointi Kokeen, jolla detektoidaan viruksen sitoutuminen 10 glykolipideihin ja tutkitaan sitoutumisen yksityiskohtainen spesifisyys, ovat kehittäneet tämän keksinnön tekijät, ja sillä on ratkaiseva merkitys tämän keksinnön kannalta /katso Hansson et ai., FEBS Lett., 170 (1984) 15-18]. Periaatteessa tutkittavalla viruksella peitetään kroma-15 togrammi, jossa on kohdesoluista tai muista lähteistä saatuja erotettuja glykolipidejä, ja sen annetaan olla vuorovaikutuksessa mahdollisten reseptoriaineiden kanssa. Huolellisten pesujen jälkeen sitoutunut virus detektoidaan anti-virusvasta-aineella ja radionuklidileimatulla anti-20 vasta-aineella, minkä jälkeen tehdään autoradiografia.

Joissakin tapauksissa viruspartikkeli leimattiin suoraan ennen sitoutumista. Menettely on yksityskohtaisesti esitettynä seuraava:

Lipidien (korkeintaan 100^,ug kullekin kaistalle) 25 tai glykolipidien (20-40^ug kullekin kaistalle) kokonais-seokset tai puhtaat glykolipidit (0,01-1^,ug) erotettiin alumiinilevyillä, joiden mitat olivat noin 5 x 5 cm ja jotka oli päällystetty silikageeli 60:llä (Merck), käyttämällä tavallisesti kloroformi-metanoli-vesiseosta (tila-30 vuussuhde 60:35:8). liuottimena ei-happamille glykolipi-deille ja kloroformi-metanoli-2,5 M ammoniakki -seosta (tilavuussuhde 60:40:9) liuottimena happamille glyko-lipideille. Vertailua varten rinnakkaislevy detektoidaan kemiallisesti suihkuttamalla anisaldehydiliuoksella ja 35 kuumentamalla. Virusten sitomista varten kuivattu kroma-togrammi, jolla aineet ovat erottuneina, upotetaan minuu-

II

93227 51 tiksi 200 ml:aan dietyylieetteriä, joka sisältää 0,5 % (massa/tilavuus) polyisobutyylimetakrylaattia (Plexigum P28, Rohm GmbH, Darmstadt), ja kuivataan 2 min. Sitten levy ruiskutetaan fosfaattipuskuroidulla fysiologisella 5 suolaliuoksella (PBS) (pH 7,3), joka sisältää 2 % naudan seerumialbumiinia (BSA) ja 0,1 % NaN^:a (liuos A), upotetaan sitten liuokseen A ja sijoitetaan petrimaljaan 2 tunnin ajaksi. Kun liuos A on valutettu pois, lisätään virussuspensio (noin 25^ug/ml ja noin 2 ml levylle, jolla 10 on edellä annetut mitat) kromatogrammille, joka on sijoitettu vaakasuoraan asentoon petrimaljan kostutettuun atmosfääriin. Inkuboidaan 2 tuntia, minkä jälkeen virus-suspensio valutetaan pois ja levy pestään kuudesti PBSillä 1 minuutti kerrallaan. Tyypillisen vasta-aineen ollessa 15 kyseessä Sendai-viruksen vastainen monoklonaalinen vasta-aine 817, jota on tuotettu vesivatsanesteessä, laimennetaan suhteessa 1:100 liuoksella A, ja käytetään noin 2 ml liuosta levyä kohden inkuboiden 2 tuntia. Pestään viidesti PBS:llä ja inkuboidaan noin 2 ml:n kanssa kaniinin 20 anti-hiiri-Fab:tä 2 tuntia (\ x 10^ pulssia minuutissa/ml 1 25 I-leimattua F(ab')2:a» the Radiochemical Centre, Amersham7. Pestään kuudesti PBS:llä, kuivataan levy ja valotetaan XAR-5-röntgenfilmille (Eastman) tavallisesti 2-3 vrk käyttämällä kuvanvahvistuslevyä.

25 Käsittely muovilla saa aikaan hydrofobisen pinnan.

Erotetut glykolipidit tai muut vyöhykkeet ovat siten esillä hydrofobisella kiinteällä pinnalla samaan tapaan kuin lipidit biologisessa kalvossa. Tämä tarkoittaa sitä, että tutkittava aine on lujasti ankkuroituna parafiini-30 ketjuistaan muovipintaan, ja polaariset pääteryhmät ovat esillä ja saavutettavissa ympäristöstä käsin. Tämä jäljittelee elävän solun pinnan yksinkertaista kerrosta. Tämä muovikäsittely on hyvin ratkaiseva spesifisyyden ja toistettavuuden kannalta ja selittää tämän kiinteäfaasi-35 menetelmän edut perinteisiin inhibitiomäärityksiin nähden, jotka perustuvat "liukoisiksi tehtyihin" aggregaatteihin tai miselleihin (katso viite 22) .

52 93227

Havaittavuusraja vaihtelee ligandin tehon mukaan, mutta on alueella 5-50 ng reseptoria tai suunnilleen samalla pikomoolialueella. Jotta reseptoriehdokasta pidettäisiin negatiivisena taulukoiduissa tuloksissa, ei saisi 5 esiintyä tummentumista ainemäärän ollessa mikrogramma tai enemmän. Hyvät sitojat muodostavat täysin mustia vyöhykkeitä ainemäärällä 100 ng. Tämän kokeen ilmeisenä etuna on se, että aineseokset erotetaan ensin ainespesieksiksi, jolloin vältetään pienempien komponenttien peittymisvaara 10 ja kontaminoivien aineiden aiheuttama väärä negatiivinen sitoutuminen. Päällystäminen albumiinilla sulkee myös epäspesifiset hydrofobiset kohdat, jotka muuten voivat aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia. Lopuksi mainittakoon, että perusteelliset pesut poistavat lisää löyhä-15 rakenteisia epäspesifisiä yhteenliittymiä. Vertailun vuoksi mainittakoon, että perinteellisissä inhibitiokokeissa tavallisesti inkuboidaan virusta kohdesolujen kanssa suspensiossa äänikäsiteltyjen misellien poissa tai läsnäollessa. Hemolyysikokeen ollessa kyseessä tehdään seoksel-20 le yksinkertainen fotometria sentrifugoinnin jälkeen /katso Huang, Lipids, 18 (1983) 489-492/. Siten läsnä ei ole albumiinia, eikä toteuteta keksinnön mukaista koetta vastaavia pesuvaiheita.

Virusten sitoutumisen kvantitatiiviseen määrittä-25 miseen sovellettiin samaa menetelmää kuin analogisessa vasta-aineiden kiinteätaasisitomisessa mikrotitraus-syvennyksiin /Brockhaus et ai., J. Biol. Chem., 256 (1981) 13223-13225/. Laimennussarjän, jossa oli glykolipi-diä tai muita aineita 50^ul:ssa metanolia, annetaan haih-30 tua mikrotitraussyvennyksessä yön yli huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen inkuboidaan 100^u^-:aa liuosta, joka sisältää 2 % BSA:a PBSrssa, 2 tuntia, minkä jälkeen syvennys huuhdotaan kerran samalla tilavuudella samaa liuosta. 50^ul:aa suspensiota, joka sisältää 1,5^,ug virusta BSA-35 PBS:ssa, inkuboidaan 4 tuntia, minkä jälkeen syvennys pestään neljästi 100^ul:lla BSA-PBS:aa. Sendai-viruksen 11 93227 53 ollessa kyseessä 50^ul:aan vesivatsassa tuotettua liuoksella A suhteessa 1:100 laimennettua vasta-ainetta 817 inkuboidaan 4 tuntia, minkä jälkeen tehdään neljä pesua.

Lopuksi inkuboidaan 50,ul:aa kaniinin anti-hiiri-Fab:ta 4 '125 5 (2,5 x 10 pulssia/min I-leimattua F(ab')2:a' the

Radiochemical Centre, Amersham) yön yli 4°C:ssa, minkä jälkeen pestään viidesti 100^ul:lla BSA-PBS:a. Syvennykset leikataan irti levystä ja niistä mitataan yksitellen 1 25 I spektrometrillä.

10 Inhibitiotutkimukset

Yritykset estää viruksen sitoutuminen kahden edellä kuvatun kokeen avulla tehtiin esi-inkuboimalla virusta 1 tai 2 tuntia seoksen kanssa, joka sisälsi korkeintaan 2 mg/ml vapaata sakkaridia tai BSA-konjugoitua sakkaridia 15 PBSrssa tai BSA-PBS:ssa. Tämä seos lisätään sitten levylle tai syvennykseen.

Inhibitiotutkimuksia tehtiin myös ELISA-menetel-mällä (enzymelinked immunosorbent assay) seuraavaksi /katso viite 1 ja Rose et ai. (toim.), Manual of Clinical 20 Immunology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C., 1980/. Tässä tapauksessa mikrotitraussyvennykset (tyyppi Cooks M 29) päällystettiin glykolipidin metanoliliuoksella edellä kuvatulla tavalla tai kaniinin anti-Sendai-anti-seerumilla standardisoiduksi vertailunäytteeksi (katso 25 viite 1). Käytetyt glykolipidit olivat Gal^Cer, joka on virusten sitoja, katso taulukon 3 glykolipidi 1 (noin puolet fraktiosta sisälsi ei-hydroksirasvahappoa, ja tämä spesies on inaktiivinen), ja globosidilla, joka ei ole sitoja, katso taulukon 3 glykolipidi 16, joita kumpaakin 30 käytettiin 500 ng/syvennys. Lisättiin seosta, jossa oli 50^ug antiseerumia/ml natriumbikarbonaattipuskuria, pH 9,6, (1OO^ul/syvennys). Sitten syvennyksiä kyllästettiin 2 tuntia 37°C:ssa liuoksella, joka sisälsi 2 % BSA:a, 50 mM Tris-HCl - 0,15 M NaCl -puskurissa, pH 8,5, ja pes-35 tiin sitten kahdesti samalla puskurilla, joka sisälsi 1 % BSA:a. Sendai-virusta (1 , 5^,ug/syvennys 100^ul:ssa 1-%:ista 54 BSA-puskuria) inkuboitiin 2 tuntia, minkä jälkeen syvennykset pestiin neljästi 100^ul:lla 1-%:ista BSA-puskuria. Sitoutunut virus detektoitiin inkuboimalla 1,5 tuntia 37°C:ssa 100^ul:n kanssa vasta-ainetta 851 laimennettuna 5 suhteessa 1:100 puskurilla, minkä jälkeen pestiin neljästi 100^,ul:lla puskuria. lOO^ulraa piparjuuriperoksidaasin kanssa konjugoitua kaniinin anti-hiirivasta-ainetta (Dakopatts, Glostrup, Tanska; P 161, 10 mg/ml laimennettuna suhteessa 1:500) inkuboitiin 1,5 tuntia 37°C:ssa, min-10 kä jälkeen pestiin neljästi puskurilla. 100^ul:aa/syvennys OPD-liuosta (4 mg ortofenyleenidiamiinia, Sigma, liuotettuna 10 ml:aan 0,1 M natriumsitraattipuskuria, pH 5,0, johon oli lisätty 4^,ul 30-%:ista H2O2:a) inkuboitiin 15 min, ja pysäytettiin reaktio sitten lisäämällä 50^,ul 15 0,5 M H2SO^:a/syvennys. Optiset lukemat otettiin aallon pituudella 492 nm. Tyypilliset arvot olivat seuraavia: kaikki vaiheet virusta lukuunottamatta = 0,150? sitoutuminen globosidiin = 0,200; sitoutuminen Gal^Cer:iin = 0,650; sitoutuminen antiseerumiin = 1,7.

20 Viruksen sitoutumisen estäminen taulukon 1 aineel la 9 tehtiin seuraavasti. Noin 2^ug:aa virusta esi-inku-boitiin silikonikäsitellyssä koeputkessa noin 200yUg:n kanssa ainetta 9 lämpötilassa 37°C 2 tuntia ja siirrettiin sitten 50^ul:n annoksina syvennyksiin ja inkuboitiin 25 1 tunti 37°C:ssa, minkä jälkeen syvennykset pestiin nel jästi 1 % BSA:a sisältävällä puskurilla. Seuraavat vaiheet toteutettiin edellä kuvatulla tavalla. Aine 9 laimennettiin suhteessa 1:4 7 erillisessä esi-inkubointivai-heessa.

30 Tehtiin myös esikokeita viruksen sitoutumisen estos ta kahdessa kuvatussa kokeessa esi-inkuboimalla virusta edellä kuvatulla tavalla amfipaattisten glykolipidien ja muiden aineiden äänikäsiteltyjen misellien kanssa. Tämä tehtiin Sendai-virukselle. Pesäkeinhibitiokoe /Lycke et 35 ai. (toim.), Textbook of Medical Virology, Butterworths, Lontoo 19837 ERA-samankaltaisella viruskannalla CVS-3337 seuraavasti: 93227 55

Fosfatidyylikoliinia (200y.ug) , kolesterolia (100^ug) ja 2-hydroksirasvahappoa sisältävää Gal/i1 ->4Glc-fiCer:a (230^,ug) tai kahta ensimmäistä lipidiä ja fosfati-dyyliseriiniä (200^ug) liuotettiin kloroformin ja metano-5 Iin seokseen, ja haihdutettiin liuotin putkessa. Lisättiin 4 ml PBS:a, ja seosta äänikäsiteltiin Vetrasonics model W-370 -laitteessa 1/2 tuntia huoneen lämpötilassa. Virus laimennettiin PBSrllä, niin että tiheydeksi tuli noin 4 x 10 pesäkkeenmuodostusyksikköä/ml. Virusta 10 (0,5 ml) ja äänikäsiteltyjä misellejä (0,5 ml) (tai PBS:a vertailunäytteenä) inkuboitiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Laimennukset ja CER-yksisolukerroksille jäävän infektoivan viruksen määritys tehdään tavanomaisissa olosuhteissa /Lennette (toim.), Manual of Clinical Micro-15 biology, Americ. Soc. Microbiol., Washington D.C. 198 0.7 · Esimerkki 1

Toisen vaiheen reseptorin löytäminen Analyysimalliviruksena käytettiin Sendai-virusta (katso peittämiskoemenetelmä, jota kuvataan kohdassa 20 ’’Materiaalit ja menetelmät"), koska sen sitoutumista neu-ramiinihappoa sisältäviin reseptoreihin (ensimmäisen vaiheen reseptori) on tutkittu suhteellisen paljon (katso viite 26) (kuvat 1 ja 2 valaisevat viruksen sitoutumista ajateltuihin ensimmäisen ja vastaavasti toisen vaiheen 25 reseptoreihin). Kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla valmistetut viruspreparaatit analysoitiin, ja kahdella aiemmin tuntemattomaan reseptoriin sitoutuvalla X-kannan variantilla osoitettiin olevan erilainen spesifisyys sitoutumisen neuramiinihappoa sisältäviin 30 glykolipideihin (gangliosideihin) ollessa kyseessä.

S-variantti sitoutui vain ihmisen erytrosyyttien gangliosideihin mutta ei ihmisen aivojen gangliosideihin (kuva 1). G-variantti sen sijaan sitoutui kummastakin lähteestä peräisin oleviin gangliosideihin (ei kuvassa).

35 Tiedetään, että näistä kahdesta lähteestä peräisin olevat gangliosidit ovat rakenteellisesti sukua toisilleen, mutta 56 93227 eroavat ydinsekvenssiensä suhteen. Neuramidaasientsyymin aikaansaama neuramiinihapon lohkeaminen gangliosideista estää siten täydellisesti näiden kahden viruspreparaatin sitoutumisen. Tämä osoittaa, että sitoutuminen ganglio-5 sideihin on kokonaan riippuvainen neuramiinihapon läsnäolosta, mutta glykolipidien sitova epitooppi sisältää myös ei-neuramiinihappo-osia, jotka ovat erilaisia aivoissa ja erytrosyyteissä. Spesifisyys ensimmäisen vaiheen reseptorin suhteen on siten erilainen näissä kahdessa tapauk-10 sessa, ja sen pitäisi vastata erillisiä, kemiallisesti erilaisia kohtia näillä kahdella, reseptorin tunnistavalla viruksella. Sen, että kokeessa saattaa esiintyä sitoutumista useisiin vyöhykkeisiin, selittää reseptoriepitoopin esiintyminen eri kokoisilla ydinaineilla, joiden kroma-15 tografinen liikkuvuus on erilainen. Se, että viruksen G-variantti sitoutuu kummastakin lähteestä peräisin oleviin gangliosideihin, voidaan selittää vähemmän tiukalla sitoutumisspesifisyydellä S-varianttiin verrattuna.

Vastakohtana erilaiselle sitoutumiselle ganglio-20 sideihin (ensimmäisen vaiheen reseptoreihin) nämä kaksi varianttia sitoutuvat samalla tavalla toisen vaiheen reseptoreihin. Tämä osoitetaan S-variantille kuviossa 2. Kuten esimerkissä 2 tarkemmin selvitetään, tämä sitoutuminen tapahtuu glykolipideihin, joissa ei ole neuramiinihappoa, 25 ja se on siten kemiallisesti erilainen kuin ensimmäisen vaiheen sitoutuminen.

Tämä osoittaa, että viruksella voi olla kaksi kemiallisesti erilaista ja erillistä reseptoria. Lisäksi kokeessa saadut tulokset valaisevat keksinnön määrittely-30 osassa ja kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" selostetun menetelmän spesifisyyttä. Selektiivinen sitoutuminen on ilmeistä, kun verrataan autoradiografiällä saatuja kuvioita (viruksen sitoutuminen) kemikaaliruiskutuksella saatuihin (kaikki aineet visualisoituvat). Jotkut voimakkaat, 35 ruiskutuksella näkyviin tulevat ja rakenteellisesti resep-toriaineisiin läheisesti liittyvät vyöhykkeet ovat täysin ti 93227 57 negatiivisia viruksen sitoutumisen suhteen (katso esimerkki 2) .

Esimerkki 2

Luonnonreseptoriehdokkaiden sitomisspesifisyyden 5 analysoiminen muutamien virusten suhteen

Suuresta joukosta reseptoriehdokkaita (taulukko 3) analysoitiin sitoutumisaktiivisuus käyttämällä kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvattua peittämiskoetta. Taulukko 3 10 Viruksen

Nro Glykolipidin rakenne sitoutuminen 1 Gal&Cer * 2 GlcSCer ♦ 3 Gal(51-*4Glcf5Cer ♦ 4 Galal-^Gal&Cer * 5 Galal-^Gal&lMGIcBCer ♦ 6 Galal-MGalBl-MGIcBCer * 7 Fucal-‘2Gal51->4GlcSCer * 2Q 8 GlcNAcB1-3GalBl-*4GlcB'Cer 9 GalNAcgl-4Gal51-4GlcBCer 10 NeuAce2*3GalBl-4GlcBCer 11 Galal-3(Fuca1->2)GalBWGIcBCer 12 GalNAco1-3(Fucol-2)GalB1-4Glc&Cer 25 13 Galal-*3Gala1-*4GalB1-4Glc3Cer 14 GalBl-3GlcNAcB1-3Galpl-4GlcBCer 15 GalB1-4GlcNAc&1-3Galp1-4Glc&Cer 16 GalN AcBI -»SGalal-^GalfSl-^GIc&Cer 17 GalBl-3CalNAcBWGalBWGIcBCer 3Q 18 Fucol-2Galol^3Galol^4GalBl^4GlcBCer 19 Fucal-^Galei^GlcNAcBl^SGalBl^GlcBCer 20 Fuco1-2GalBl-4GlcNAcBl-3GalBWGIcBCer 21 GalSl'*'3(Fucal->4)GlcNAcBl'>3GalB1->4GlcBCer ♦ 22 GalBW(Fuca1-*3)GlcNAcBl-3GalBWGIcBCer 35 23 NeuAca2-»3GalBWGIcNAcBl-*3GalB1-*4GlcBCer 24 Fucal-*2GalB1-*3(Fuca1-*4)GlcNAcB1-»3GalB1-4GlcBCer 58 93227

Taulukko 3 (jatkoa) 25 Fucal'>2GalSl-*4(Fucal-k3)GlcNAc5l'‘3Gal5l‘>4Glc5Cer 26 Gal6-diglyseridi + 5 27 Galal-^Gal 5-digly seridi + 1-25: eläinperäisiä, 26-27 kasviperäisiä. Monosakkaridit ovat D-konfiguraatiossa paitsi Fuc, joka on L, ja kaikki ovat pyranoosimuodossa.

10 + osoittaa sitoutumisen ja sitoutumattomuuden.

Virusinfektioiden kohdesoluista tai -kudoksista, jotka uutettiin kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla orgaanisilla liuottimilla, saatujen uutteiden seoksia esierotettiin kromatografiapinnalla, joka 15 mahdollistaa aktiivisten aineiden detektoinnin, kun pinta on peitetty kyseessä olevalla viruspreparaatilla. Sitova aine eristettiin ja sen rakenne karakterisoitiin, ja sitä käytettiin puhtaassa muodossa yksityiskohtaisempiin sitoutumistutkimuksiin. Näissä analyyseissä käytettiin 20 ensin Sendai-virusta. Koska yksi peittämiskoe voi sisältää enemmän kuin 100 rakenteeltaan erilaista ainetta, saatiin aikaan todellisten reseptorien hyvin tehokas valikointi. Käytettäessä erilaisia ihmis- ja eläinkudoksia, kuten hermokudosta, verta, ruoansulatuskanavaa, virtsateitä ja 25 sekä täyskasvuisen että sikiön kudoksia, vain ne glyko-lipidit, jotka on merkitty a+:lla taulukossa 3 ja määritelty tarkemmin taulukossa 4, osoitettiin reseptoreiksi. Muun pintakalvon tai muiden aineiden, jotka uuttuivat rinnalla käytetyissä menettelyissä, kuten kolesterolin 30 tai erilaisten glyserofosfolipidien, merkittävää sitoutumista ei tapahtunut. Toisaalta muutamilla analysoiduista viruksista (katso taulukko 2), mukaan luettuna Sendai-virus (katso esimerkki 1) esiintyi taulukoissa 3 ja 4 esitetystä poikkeavaa glykolipidisitoutumista, joka oli 35 kemiallisesti erilaista ja vastasi ensimmäisen vaiheen reseptoria.

Il 93227 59 Tärkeä havainto oli se, että sitoutuminen luonnollisiin reseptoreihin riippuu glykolipidin lipofiilisen osan, keramidin, koostumuksesta, kuten taulukossa 4 esitetään ja valaistaan joidenkin spesieksien suhteen kuvios-5 sa 3. Vain ne spesiekset, joissa on 2-D-hydroksirasva-happoa keramidissa, ovat aktiivisia. Siksi kaikki luonnon glykolipidit, joita käytettiin yksityiskohtaiseen testaamiseen, joka koskee hiilihydraattiosan vaihtelun tärkeyttä (taulukko 3), valittiin 2-hydroksirasvahapon läsnäolon 10 perusteella. Spesiekset, jotka ovat taulukon 3 mukaan positiivisia, ovat aktiivisia vain sisältäessään 2-hydroksi-rasvahappoa mutta inaktiivisia sisältäessään ei-hydroksi-rasvahappoa.

Viruksella on kyky sitoutua korkeintaan viisi soke-15 ria sisältäviin glykolipideihin (taulukko 3). Kvantitatiiviset sitoutumiskokeet (katso "Materiaalit ja menetelmät") osoittavat kuitenkin, että yksisokeriset aineet Gal/iCer ja Glc^Cer ovat parhaita sitojia. Kuviossa 4 käyrä A edustaa näitä kahta glykolipidiä. Käyrä C edustaa 20 taulukon 3 kaksisokerista glykolipidiä 3 ja käyrä D kol-misokerista glykolipidiä 5. On tärkeä huomata, että sitou-tumisvoimakkuus (lujuus) on tällä toisen vaiheen reseptorilla samaa suuruusluokkaa kuin osoitetulla ensimmäisen vaiheen reseptorilla (käyrä B). Sitoutumisen suurempiin 25 glykolipideihin selittää siten molekyylien sisäosan tunnistus. Tällainen epäkonventionaalinen sitoutuminen ei ole odottamatonta sen valossa, millaisia tuloksia tämän keksinnön tekijät ovat saaneet useiden bakteerien ja bakteeritoksiinien sitoutumisesta hiilihydraatteihin 30 (katso viitteet 23, 25 ja 46). Sen tosiasian, että jotkut (suurin osa) testatuista glykolipideistä ei sitoudu, vaikka ne sisältävät sitovan epitoopin, esimerkiksi ->4Glc^Cer:n, tekee ymmärrettäväksi steerinen este suuren viruspartikkelin pääsylle tähän yksisokeriseen epitooppiin.

35 On olemassa myös lisätodisteita molekyylitasolla esiintyvästä stereospesifisyydestä, joka mahdollistaa reseptori- 93227 60 spesifisyysmallin käytön ja on vahvasti epäspesifisen vuorovaikutuksen vastainen.

Kasvien tiedetään sisältävän reseptoriglykosfingo-lipidejä (katso viite 41), mikä on mielenkiintoista laajem-5 pien sovellutusten kannalta. Taulukon 3 aine 2, joka sisältää 2-hydroksirasvahappoa, on vallitseva glykolipidi kasvien lehdissä. Myös aineita 26 ja 27, joiden on osoitettu sitovan Sendai-virusta, esiintyy suhteellisen runsaasti kasveissa, ja ne saattavat toimia kasvivirusten 10 reseptoreina.

Se havainto, että sitoutumista vapaaseen keramidiin (ilman hiilihydraattia) ei tapahdu, on tärkeä reseptori-aineiden sitovan epitoopin selittämiselle. Lisäksi kokeessa ei ilmene viruksen reseptorisitoutumisen estoa lisät-15 täessä erilaisia vapaita oligosakkarideja tai albumiinin monivalenssisesti liitettyjä oligosakkarideja, esimerkiksi Gal^:a, Glc/3:a tai Gal/il->4Glc^:a (katso esimerkki 6).

Tästä voidaan päätellä, että sitoutuminen tapahtuu ainoastaan glykolipidiin; pelkällä keramidilla ja pelkällä 20 sakkaridilla (tai proteiiniin liitetyllä sakkaridilla) ei ole kykyä olla vuorovaikutuksessa viruksen kanssa.

Kvantitatiivisista sitoutumistutkimuksista saadut käyrät (kuvio 4) osoittavat, että sitoutumisvoimakkuus on hyvin samanlainen ensimmäisen ja toisen vaiheen resepto-25 reillä (käyrä B ja vastaavasti A). Koska ensimmäisen vaiheen reseptorin biologista merkitystä on jo tutkittu (katso viite 3), tarkoittaa tämä sitä, että sitoutumisvoimak-suus toisen vaiheen reseptoriin on biologisesti riittävällä tasolla. Paras toisen vaiheen sitoja on yksisokerinen 30 sitoja (vertaa käyriä A, C ja D), ja jotkut monisokeriset sitojat eivät saa aikaan kohoavaa käyrää (käyrä E), vaikka sitoutuminen on selvästi havaittavissa peittämiskokees-sa (taulukko 3).

Toinen päätelmä tällä kokeella tehdyistä kvanti-35 tatiivisista analyyseistä on se, että sitoutuminen on pieniaffiniteettista tyyppiä ja vaatii monivalenssisuutta 61 S3227 ollakseen tehokas. Tähän johtopäätökseen päästiin vertaamalla samassa kokeessa virusten sitoutumista useiden bakteerien ja bakteeritoksiinien sitoutumiseen vastaaviin reseptoriglykolipideihinsä. Muutamat bakteerit (katso vii-5 te 23 ja 46) ja Shiga-toksiini (katso viitteet 25 ja 46) sitoutuvat samalla tavalla kuin virus (käyrät nousevat samoilla reseptorin laimennustasoilla). Sen sijaan kolera- toksiinin (saman kokoinen kuin Shiga-toksiini) ollessa ky- 2 3 seessä käyrän nousu siirtyy vasemmalle reseptorin 10 -10 -10 kertaisen laimennusasteen kohdalle. Nämä käyrien erilaiset sijainnit sopivat yhteen sen kanssa, että on mahdollista estää ligandin sitoutuminen reseptoriglykolipideihin käyttämällä liukoisia, yksivalenssisia reseptorianalogeja. Koleratoksiini on helppo inhiboida, mutta Shiga-toksiinin 15 tapauksessa ei esiinny havaittavissa olevaa inhibitiota reseptorisakkaridin pitoisuudella 5 mg/ml. Shiga-toksiini on kuitenkin helposti inhiboitavissa käyttämällä albumiiniin monivalenssisesti liitettyä disakkaridia. Johtopäätöksenä on suuriaffiniteettinen sitoutuminen koleratoksii-20 nin ollessa kyseessä ja pieniaffiniteettinen sitoutuminen

Shiga-toksiinin tapauksessa, jolloin viimeksi mainittu vaatii monivalenssisuutta ollakseen tehokas. Useissa bakteereissa vallitsee sama tilanne kuin Shiga-toksiinissa. Koska virusten sitoutumista kuvaavat käyrät ovat yhtäpitäviä 25 Shiga-toksiinin ja monien bakteerien, mutta eivät kolera-toksiinin, käyrien kanssa, on viruksen sitoutuminen pieniaf f initeettista tyyppiä. Siksi luonnollisen sitovan epi-toopin käyttö virusten sitomiseen näyttäisi vaativan moni-valenssista esiintymismuotoa. Tilanne on tällainen sitou-30 tumiskokeissa ja biologisessa kalvossa (esimerkki 4) ja vastaa viruksen pinnalla olevien sitoutuvien proteiinien monilukuisuutta.

Edellä Sendai-viruksen yhteydessä kuvatun lähestymistavan käyttö ulotettiin sarjaan muita viruksia, jotka 35 edustavat useimpia tunnetuista virusheimoista (taulukko 2). Kaikkien taulukossa 2 esitettyjen virusten osoitettiin 62 93227 sitoutuvan tavalla, joka oli hyvin samankaltainen kuin Sendai-viruksella, toisen vaiheen reseptorin ollessa kyseessä, vaikkakin monilla niistä oli myös erillinen ensimmäisen vaiheen reseptori, joka oli analoginen Sendai-5 viruksen vastaavan reseptorin kanssa (esimerkki 1). Nämä virukset analysoitiin käyttämällä viruspreparaatteja ja detektointiin vasta-aineita kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Mahdollisimman monen reseptori-ehdokkaan kattamiseksi käytettiin kuviossa 2 esitettyyn 10 kokeeseen glykolipidiseoksia. Lisäksi käytettiin useita taulukon 3 mukaisia eristettyjä aineita laimennettuina ohutkerroslevyllä sitoutumisvoimakkuuden tutkimiseksi Sendai-virukseen verrattuna. Tulokset osoittivat, että kaikkien tutkittujen virusten sitoutumiskuvio oli ident-15 tinen tai hyvin samankaltainen kuvion 2 mukaisen kanssa, ja sitoutumisvoimakkuus oli samanlainen. Tämä tarkoittaa sitä, että tutkituilla viruksilla pitäisi olla yhteinen spesifinen sitoutumispaikka, jonka pitäisi vastata viruksen pinnalla olevaa yhteistä sitoutuvaa proteiinia. Tämä 20 paikka ei riipu virusten erilaisista vaipoista eikä geno-min luonteesta (taulukko 2). Siten morfologisesti ja geneettisesti erilaisilla viruksilla, jotka aiheuttavat monia erilaisia, erilaisiin elinjärjestelmiin vaikuttavia ihmisten ja eläinten sairauksia, on yhteinen sitoutumis-25 paikka, nimittäin toisen vaiheen reseptori, jota todennäköisesti käytetään penetraatioon.

Esimerkki 3

Reseptorien kemiallinen karakterisointi ja sitovan epitoopin ideaalisen konformaation analysointi 30 Kuten kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvat tiin, erillisiä reseptoreina aktiivisia aineita eristettiin puhtaassa muodossa ja karakterisoitiin kemiallisesti. Tämä antoi rakennetietoja sekä polaarisesta/hydrofobisesta osasta (ts. sakkaridirakenteesta, mukaan luettuna soke-35 reiden tyypit, sekvenssi, sidoksen asema, anomeria ja renkaan koko) että ei-polaarisesta osasta (ts. keramidista, il 93227 63 mukaan luettuna rasvahapporakenteen pituus, haaroittunei-suus, tyydyttymättömyysaste ja hydroksyyliryhmien asema ja konfiguraatio ja pitkäketjuisen emäsrakenteen para-fiiniketjun pituus, tyydyttymättömyys ja funktionaalisten 5 ryhmien asema ja konfiguraatio). Käytetyt menetelmät olivat korkean teknisen tason massaspektrometria (katso viite 14) ja NMR-spektroskopia (katso viite 15) tavanomaisten hajotusmenetelmien lisäksi. Jotta testattaviksi saataisiin monia erilaisia rakenteita, käytettiin preparointilähteinä 10 eri eläimien kudoksia (katso viitteet 13a ja 33). Joitakin käytetyistä epiteelikudoksista on kuvattu glykolipidi-rakenteiden yhteydessä, kuten ihmisen suolta (katso viitteet 42 ja 43), rotan suolta (katso viite 13a), hiiren suolta (katso viitteet 20 ja 41), koiran suolta (katso 15 viite 45) ja kissan, turskan, marsun, hamsterin ja kaniinin suolia (katso viite 20). Moniin näistä rakenteista on tehty katsaus vähän aikaa sitten (katso viite 13). Tämä tarkoittaa sitä, että hyvin suuri määrä taulukkoon 3 sisältymättömiä glykolipidejä ja muita aineita analysoitiin, 20 mutta havaittiin negatiivisiksi Sendai-viruksen sitomisen suhteen.

Eräs hyvin tärkeä piirre on sitoutumisen riippuvuus keramidirakenteesta, mistä on yhteenveto taulukossa 4 yhdelle tietylle glykolipidille, taulukon 3 aineelle 3, joka on 25 eristetty ilmoitetuista luonnon lähteistä ja jonka yksityiskohtainen rakenne on huolellisesti analysoitu. Kokeet tehtiin kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla käyttämällä peittämissitoutumiskoetta. Erilaisten keramidimolekyylispesiesten yksityiskohtaisia rakenteita 30 esitetään kuviossa 5. Taulukossa 4 olevat kirjaimet viit-taavat myös tähän kuvaan.

93227 64

Taulukko 4

Glykolipidin keramidirakenteen vaikutus viruksen sitoutumiseen

Viruksen 5 Rasvahapon ja pitkäketjuisen Valmisteen sitou- emäksen yhdistelmä_lähde_tuminen B: Ei-hydroksirasvahappo- Ihmisen sfingosiini erytrosyytit C: Ei-hydroksirasvahappo- Koiran 10 fytosfingosiini ohutsuoli (+) D: 2-hydroksirasvahappo- Koiran sfingosiini ohutsuoli ++ E: 2-hydroksirasvahappo- Rotan fytosfingosiini ohutsuoli ++ 15 _ -: ei sitoutumista (+):heikko sitoutuminen ++: hyvä sitoutuminen 20 Niinpä, vaikka oligosakkaridirakenne on identtinen näissä neljässä variantissa, vain ne, joissa on 2-D-hydrok-sirasvahappoa keramidissa, sitovat virusta. Tämä ilmiö havaittiin toistettavasti myös muilla taulukon 3 glyko-lipideillä. Tämä näyttää ensi silmäyksellä tarkoittavan 25 sitä, että 2-hydroksiryhmä on erityisesti mukana sitoutumisessa. Erilaisilla synteettisillä glykolipideillä tehdyt sitomistutkimukset sulkevat kuitenkin pois tämän (esimerkki 5). Sen sijaan ajatellaan, että 2-hydroksirasvahappoa sisältävillä glykosfingolipideillä on erilainen konfor-30 maatio kuin ei-hydroksirasvahappoa sisältävillä glykosf ingolipideillä. Tämä on osoitettu ensin mainitun rönt-genkristallografisella analyysillä (katso viite 31) ja jälkimmäisen NMR-analyysillä (katso viite 32). Näissä tapauksissa käytettiin synteettisiä yksisokerisia glyko-35 sfingolipidejä. 2-hydroksiglykosfingolipidillä on lusik-kamainen tai lapiomainen konformaatio (katso kuva 6), 93227 65 jossa sakkaridirengas on noin 110°:n kulmassa keramidiin nähden. Ei-hydroksi-isomeerissä tämä kulma on noin 180°.

Kun käydään läpi analysoitujen aineiden kaikki muut raken-neparametrit, tämä on ainoa yhteinen tekijä tarkastelussa.

5 Siksi, kuten edellä käsiteltiin, glvkosfingolipidin 2-hyd-roksiryhmän merkitys on se, että se pitää ensimmäisen sakkaridin oikealla tavalla taipuneessa edullisessa konfor-maatiossa. Tämä tekee tämän sokerin oC-puolen saavutettavissa olevaksi sitoutumista varten, jonka puolen on siksi 10 ajateltu olevan osa sitovasta epitoopista. Siinä sokerin asennossa (enemmän tai vähemmän oikeassa kulmassa kokeessa käytettyyn kalvon kaltaiseen pintaan nähden), joka vallitsee ei-hydroksiglykosfingolipideissä, tämä sitova epi-tooppi ei todennäköisesti ole saavutettavissa viruksen 15 sitoutumista varten.

Esimerkki 4

Virusinfektioiden elimistööntulokohdissa olevilla kohdesoluilla ja tietyillä muilla soluilla esiintyvät reseptorit 20 Kuten esimerkeissä 2 ja 3 kuvattiin, tämän keksinnön tekijät ovat käyttäneet suurta joukkoa eri eläimien epi-teelikudoksia glykolipidien valmistuslähteinä. Jotta saataisiin tutkituksi tarkemmin reseptoriglykolipidien sijoittuminen epiteelisoluihin, jotka ovat virusinfektioiden 25 välittömiä kohteita, eristettiin tällaisia soluja kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatulla tavalla. Tekniikka kehitettiin rotan suolisoluille (katso viite 19) mukaan luettuina sekä ohut- että paksusuoli, ja sitä sovellettiin myös ihmisen ohut- ja paksusuoleen (katso viite 30 42). Myös limakalvon raaputtaminen tehtiin ihmisen suo lelle (katso viite 42) ja ihmisen virtsaputkelle. Kaikkien analysoitujen epiteelinäytteiden (katso "Materiaalit ja menetelmät") yhteisenä tekijänä kudos- tai eläinlähteestä riippumatta oli Glc/JCer:n (taulukon 3 aine 2, joka sisäl-35 tää 2-hydroksirasvahappoa) ja monissa tapauksissa myös 2-hydroksirasvahappoa sisältävän Gal^Cer:n läsnäolo.

66 93227

Optimaalisimpia luonnollisia Sendai-viruksen sitojia (kuvan 4 käyrä A) esiintyy siten yleisesti epiteelisoluissa. Asian valaisemiseksi kuviossa 7 esitetään tulos, joka saatiin analysoimalla neljän, eri veriryhmätenotyyppiä 5 olevan ihmisen ohutsuolen epiteelisoluja. Vaikka hitaasti liikkuvat veriryhmäfukolipidit ovat odotusten mukaisesti erilaiset näytteissä, on näillä yhteiset reseptorityyppiset glykolipidit. Siksi kaikki solut, jotka virus valtaa infektoidessaan elimistön, sisältävät toisen vaiheen resep-10 torin.

Ei-epiteelisolut sisältävät paljon vähemmän tai käytännöllisesti katsoen ei ollenkaan näitä reseptori-glykolipidispesieksiä. Päin vastoin kuin mitä aiemmin on ajateltu, hemolyysiin (penetraatiokoe) käytetyt erytro-15 syytit sisältävät reseptoreja, sillä pieniä, mutta selviä määriä 2-hydroksihappoa sisältäviä Gal/iCer:a ja Glcy$Cer:a on löydetty ihmisen, naudan ja sian erytrosyyteistä.

Epiteelipintakalvon, josta reseptoriglykolipidit ovat tärkeä osa, yleiset rakenteelliset ominaispiirteet 20 ovat merkityksellisiä tässä yhteydessä. Sfingolipidin, jossa keramidin hydroksyyliryhmien lukumäärä on vaihteleva, eräänä erityispiirteenä on yhdistetty vetysidosdonori- ja -akseptorikapasiteetti (kuvio 8), joka muodostaa yhden kalvon kolmesta määritellystä vyöhykkeestä (katso viite 25 33). Tällä on todennäköisesti ratkaiseva merkitys kalvon stabiilisuudelle, joka riippuu sivusuuntaisesti orientoituneesta vetysidosverkostosta. Solun pintakalvosta tällä hetkellä saatavissa olevat tiedot saavat näyttämään todennäköiseltä, että virus on kehittänyt sitoutumisominaisuu-30 den, joka heikentää tätä stabiilisuutta olemalla spesifisessä vuorovaikutuksessa tämän verkoston oleellisen komponentin kaikkien kolmen osan kanssa.

il 67 93227

Esimerkki 5

Sendai-viruksen sitoutumista ei-biologisiin synteettisiin aineisiin, jotka ovat analogisia luonnon reseptorille, koskeva tutkimus 5 Joukosta taulukossa 2 esitettyjä synteettisiä ai neita analysoitiin viruksen sitominen kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" kuvatuilla kahdella kokeella. Taulukkoon 5 on koottu puolikvantitatiiviset sitomistulokset, jotka saatiin peittämällä Sendai-viruksella kyseessä ole-10 van aineen laimennoksia. +-merkit eivät vastaa taulukoiden 3 ja 4 vastaavia merkkejä, vaan ne on tarkoitettu vain taulukon 5 sisäisiin vertailuihin.

Kuten taulukosta ilmenee, tapahtuu heikkoa sitoutumista n:oon 12, mutta ei n:oihin 11, 13 eikä 14, mikä 15 viittaa Glc^irn jonkinasteiseen etusijaan. Kaksiketjuiset yhdisteet ovat parempia sitojia (vertaa 15:ä 13:een).

Mitä tärkeintä on kuitenkin se, että sulfonoanalogit, n:ot 16-18, sitovat voimakkaimmin kaksiketjuisten yhdisteiden ollessa edullisempia. Edellä kuvatun kvantitatii-20 visen sitomiskokeen avulla tehty tarkempi kvantitatiivinen määrittäminen osoittaa, että n:olla 18 on sama sitomis-voimakkuus kuin vastaavalla luonnon reseptorilla, taulukon 3 molla 3, joita kumpaakin edustaa käyrä C kuviossa 4. Nämä aineet suunniteltiin luonnon reseptoreja koske-25 van tutkimustyön perusteella, ja on kiintoisaa havaita, että nämä aineet täysin vastaavat luonnon epitoopin ominaisuuksia ja mittoja (esimerkki 3) ja täyttävät resep-torianalogeja koskevat säännöt. Siten täytetään osia A, B ja C (jotka selitettiin edellä) ja niiden mittasuhteita 30 koskevat vaatimukset, vaikka osa B ei ole kiraalinen ja sisältää toisen kahdesta sulfonoryhmästä amidisidoksen ja kaksi hydroksyyliryhmää sisältävän kiraalisen osan sijasta. On ilmeistä, että sokerin Λ-puoli on käytettävissä sitomiseen, mikä on esimerkissä 3 esitetty vaatimus.

35 Näiden analogien kohdalla tämän selittävät sulfonoryhmät, jotka tuovat molekyyliin neljä onyylikohtaa, jotka repulsion 68 93227 ja mahdollisesti veden kanssa muodostamiensa vetysidosten kautta saavat aikaan molekyylien paljon löyhemmän pakkau-tumisen kokeissa käytetyssä yksinkertaisessa kerroksessa. Taulukosta 5 käy lisäksi ilmi, etteivät muutamat 5 muut synteettiset aineet sido virusta. Tämä johtuu joko B:tä koskevien vaatimusten epätäydellisestä täyttämisestä (aineet n:o 11, 13 ja 14, joita voidaan verrata taulukon 3 aineisiin 1, 3 ja vastaavasti 4, jotka ovat hyviä sito-jia), tai ketjujen tiiviistä pakkautumisesta, joka tekee 10 mahdottomaksi A:n ot-puolen esilläolon konformaation määräävän tekijän, kuten luonnon reseptorin 2-hydroksi-rasvahapon, poissa ollessa.

Taulukko 5

Inhibitioon tai sitomiseen käytetyt synteettiset 15 reseptorianalogit {Sokerit ovat D-konfiguraatiossa ja pyranoosi-muodossa)

Inhibitio

20 1 Gal taiGalSCETE

2 Glc taiGclBCETE

3 Gaiel-»4Glc taiGal&1-4GlcSCETE

4 GaleCETE-BSA

5 GIcSCETE-BSA

25 6 Gal&WGIcSOEt /ch2so2(ch?)10cooh

7 GaieWGIc5-OCH.,CH

x ch2so2(ch7)7ch3 30 ^ch2so2(ch0)1qcooh

8 Gal&WGIcB-OCH2CH

v'ch2so2(ch2)10cooh ^ch?so2(ch^)10conh-bsa

35 9 GalBWGIcS-OCH2CH

NCH2S02(CH7)7CH3 ii : 3227 69

Taulukko 5 (jatkoa)

10 GalBWGIcBCETE-BSA

Sitoutuminen

5 11 GalBOTE

12 GlcBOTE (♦)

13 GaIBWCIcBOTE

14 Galal-4Gal0OTE

10 /CH2S-(CH2)15CH3

15 GalBl-4Glce-OCH2CH

NCH25-(CH2>15CH3 16 GIcB-0CH2CH2S02-(CH2)17CH3 15 ^ CH.S02-(CH9)1c.CH7

17 GlcS-OCH2CH

^ CH2S02-(CH?)15CH3

^CH2S02-(CH2)15CH3 20 18 GalBWGIc-OCH2CH

X CH2S02-(CH2)15CH3 CETE: (0CH9CH2SCH2CH0CO2CH3) 25 OTE: (OCH2CH2S(CH2)1?CH3) BSA: Naudan seerumialbumiini ei sitoutumista/inhibitiota; ( + ) : heikko sitoutuminen; +: sitoutuminen; ++: hyvä sitoutuminen; +++: erinomainen sitoutuminen.

30 Esimerkki 6

Inhibitiokokeet

Gal:a, Glc:a ja Gal^1->4Glc:a vapaassa muodossa, derivatisoituna tai liitettynä BSA:iin (taulukon 5 aineet 1-6 ja 10) käytettiin yritettäessä estää Sendai-viruksen 35 sitoutuminen reseptoreihin, joina käytettiin kuvion 2 mukaisia glykolipidiseoksia, mutta myös taulukon 3 70 93227 puhtaita aineita 1, 2 ja 3, ohutkerroslevyille sijoitettuina, esi-inkuboimalla virusta sokereiden kanssa ennen levyn peittämistä. Ei havaittu minkäänlaista taipumusta autoradiografiatäplien heikkenemiseen, mikä osoittaa, 5 että nämä aineet olivat kyvyttömiä kilpailemaan reseptorien kanssa sitoutumisesta. Johtopäätöksenä on se, että luonnon reseptoriaineiden hiilihydraattiosa yksivalenssi-sessa tai monivalenssisessa muodossa ei sinänsä ole kykenevä sitomaan virusta. Mikrotitraussyvennyskokeessa, 10 jossa käytettiin taulukon 3 ainetta 3 reseptorina, ei myöskään esiintynyt inhibitiota.

Sendai-viruksen esi-inkubointi erilaisten kalvo-lipidien äänikäsiteltyjen misellien kanssa aiheutti viruksen ohutkerroslevyille sitoutumisen selvän inhibition 15 muutamien taulukon 3 glykolipidien ollessa kyseessä.

Pesäkeinhibitiokokeessa osoitettiin, että huolellisesti äänikäsitellyt liposomit, jotka sisälsivät taulukon 3 ainetta 3, inhiboivat täydellisesti myös erään vesikauhu-viruskannan. Fosfatidyyliseriiniä sisältävät liposomit 20 eivät samassa suhteessa laimennettuina saaneet aikaan pesäkkeiden vähenemistä.

Esi-inkuboitaessa Sendai-virusta liukoisten resep-torianalogien kanssa (taulukon 5 aineet 7-9) ennen viruksen levittämistä ohutkerroslevylle tai inkubointia syvennyk-25 sissä, saatiin seuraavat tulokset:

Sendai-virusta (60^,ug) ja ainetta 9 (1 mg) esi-inkuboitiin 2 ml:ssa PBS:a 1 tunti huoneen lämpötilassa, ennen levittämistä ohutkerroslevylle, inkubointia ja käsittelyä, jotka tehtiin kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" 30 kuvatulla tavalla ja joiden jälkeen tehtiin autoradiograf ia sitoutuneen viruksen detektoimiseksi. Levylle levitetyt glykolipidinäytteet olivat ihmisen erytrosyyttien kokonaisgangliosidit (ensimmäisen vaiheen reseptori, katso esimerkki 1) ja taulukon 3 glykolipidit 1, 2, 3 ja 5 sekä 35 lisäksi muutamia sopivia negatiivisia vertailunäytteitä. Verrattuna vertailulevyyn (viruksen sitominen esi- il 93227 71 inkuboimatta taulukon 5 aineen 9 kanssa) tapahtui viruksen sitoutumisen merkittävä väheneminen aineen 9 kanssa tehdyn esi-inkuboinnin jälkeen arvioituna autoradiogrammin tummien alueiden vaalenemisen perusteella. Siten sitoutumi-5 nen glykolipideihin 1, 2 ja 3 väheni murto-osaan, ja gly-kolipidiä 5 vastaava vyöhyke hävisi kokonaan. Sitoutumiseen ensimmäisen vaiheen reseptoriin (erytrosyyttiganglio-sideja, vertaa kuvioon 1) ei sitä vastoin ollut minkäänlaista vaikutusta. Samanlaiset esi-inkuboinnit aineiden 10 7 ja 8 (1 mg/ml) kanssa eivät aiheuttaneet havaittavissa olevaa viruksen sitoutumisen inhibitiota. Näistä kokeista, joissa tehtiin peittämismääritys, on johtopäätöksenä se, että synteettisellä reseptorianalogilla monivalenssisessa muodossa (taulukon 5 aine 9), muttei yksivalenssisessa 15 muodossa (taulukon 5 aineet 7 ja 8), on kyky inhiboida selektiivisesti sitoutumista toisen vaiheen reseptoriin vaikuttamatta ollenkaan sitoutumiseen ensimmäisen vaiheen reseptoriin.

Esi-inkuboitaessa Sendai-virusta näiden liukoisten 20 reseptorianalogien kanssa käyttämällä mikrotitraussyven-nyksiä ja ELISA-määritystä (katso "Materiaalit ja menetelmät") saatiin seuraavia tuloksia. Esi-inkubointi taulukon 5 aineen 9 kanssa vähensi viruksen sitoutumista toisen vaiheen reseptoriin Gal^Cer = 0*350 on tyypillinen 25 arvo suurimmalla konsentraatiolla ja paluu maksimitasolle tapahtuu kolmen suhteessa 1:4 tehdyn laimennuksen jälkeen, katso "Materiaalit ja menetelmät"). Inhiboivaa vaikutusta viruksen sitoutumiseen päällystettyyn antiseerumiin ei esiintynyt, eikä esi-inkubointi yksivalenssisen analogin 30 (aineet 7 ja 8) kanssa aiheuttanut inhibitiota. Tulokset sopivat siten yhteen peittämiskokeen tulosten kanssa, joissa havaittiin toisen vaiheen reseptoriin, mutta ei vasta-aineeseen, tapahtuvan sitoutumisen selektiivinen inhibitio ja se, että analogin tulee olla monivalenssinen ollakseen 35 tehokas.

93227 72

Kirjallisuus 1. Lycke et ai. (toim.), Textbook of Medical Virology, Butterworths, Lontoo 1983.

2. Lycke et ai., katso 1.

5 White et ai., Quart. Rev. Biophys., 16 (1983) 151-195.

3. Lonberg-Holm et ai. (toim.), Virus Receptors, osa 2, "Animal Viruses, Receptors and Recognition", sarja B, voi. 8. Chapman and Hall, Lontoo 1981.

Dimmock, J. Gen. Virol., 59 (1982) 1-22.

10 4. Bell, Biophys. J., 45 (1984) 1051-1064.

5. Lycke et ai., katso 1.

6. MacDonald et al., Virology, 134 (1984) 103-117.

7. Schlegel et al., Cell, 32 (1983) 639-646.

Superti et al., Arch. Virol., 81 (1984) 321-328.

15 8. Huang, J. Gen. Virol., 64 (1983) 221-224.

Huang, Lipids, 18 (1983) 489-492.

9. Paulsen, Chem. Soc. Rev., 13 (1984) 15-45.

10. Lee et al. teoksessa Horowitz (toim.), The Glyco-conjugates, Academic Press, New York 1982, s. 57-87.

20 Dahmen et al., Carbohydr. Res., 127 (1984) 27-33.

11. Lycke et al., katso 1.

12. Middlebrook et al., Microbiol. Rev., 48 (1984) 199-221.

13. Kanfer et al. (toim.), Sphingolipid Biochemistry, Handbook of Lipid Research, vol. 3, Plenum Press, 25 New York, 1983.

13a. Breimer et al., J. Biol. Chem., 257 (1982) 557-568.

14. Breimer et al. teoksessa Quayle (toim.), Adv. Mass Spectrom., voi. 8B, Heyden and Sons Ltd., Lontoo 1980, s. 1097-1108.

30 15. Falk et al., Arch. Biochem. Biophys., 192 (1979) 164-202.

16. Katso Kanfer et al., 13.

17. Karlsson et al., J. Lipid Res., 12 (1971) 466-472.

18. Karlsson et al., Eur. J. Biochem., 46 (1974) 243-258.

35 19. Breimer et al., Exp. Cell Res., 135 (1981) 1-13.

20. Breimer et al., J. Biochem., 90 (1981) 589-609.

» 7 ' ' ✓ ΟΖί./ 73 21. Karlsson et ai., Biochim. Biophys. Acta, 306 (1973) 317-328.

22. Katso Huang, Lipids, viite 8.

23. Hansson et ai. teoksessa Chester et ai. (toim.), 5 Glycoconjugates, Proc. 7th Int. Sympos., Rahms, Lund,

Ruotsi 1983, s. 631-632.

24. Magnusson et ai. teoksessa Chester et ai. (toim.), Glycoconjugates, Proc. 7th Int. Sympos., Rahms, Lund, Ruotsi 1983, 643-644.

10 25. Brown et ai. teoksessa Chester et ai. (toim.), Glyco- conjugates, Proc. 7th Int. Sympos., Rahms, Lund,

Ruotsi 1983, s. 678-679.

26. Katso viite 3.

27. Katso viitteet 23 ja 25.

15 28. Katso Dimmock, viite 3.

29. Katso viite 23.

30. Katso viite 25.

31. Pascher et ai., Chem. Phys. Lipids, 20 (1977) 175-191.

32. Skarjune et ai., Biochemistry, 21 (1982) 3154-3160.

20 33. Karlsson teoksessa Chapman (toim.), Biological

Membranes, voi. 4, Academic Press. Lontoo 1982, s. 1-74.

34. Katso White et ai., viite 2.

Katso Dimmock, viite 3.

25 35. Richardson et ai., Virology, 131 (1983) 518-532.

36. Katso White et ai., viite 2.

37. Katso viite 35.

38. Sabesan et ai., Can. J. Chem., 62 (1984) 1034-1045.

39. Katso viite 31.

30 40. Katso viite 33.

41. Hitchcock et ai. (toim.), Plant Lipid Biochemistry, Academic Press, Lontoo 1971.

42. Falk et ai., FEBS Lett, 101 (1979) 273-276.

43. Björk et ai. teoksessa Cartron et ai. (toim.), Red 35 Cell Membrane Glycoconjugates and Related Genetic

Markers, Libraire Arnette, Pariisi 1983, s. 125-137.

93227 74 44. Hansson et ai., FEBS Lett., 139 (1982) 291-294.

45. Hansson et ai., Biochim. Biophys. Acta, 750 (1983) 214-216.

46. Holgersson et ai. teoksessa Koprowski et ai. (toim.), 5 Symposium on World's Debt to Pasteur, Alan R. Liss,

New York 1985, s. 273-301 (painossa).

Claims (13)

93227

1. Hiilihydraattiyhdisteen käyttö in vitro virus-partikkelien tai viruksen pintakomponenttien valmistuk-5 seen tai eristämiseen, joka hiilihydraattiyhdiste on valittu ryhmästä sfingosiini-2-D-hydroksirasvahapot, joiden kaava on

0 OH 10. ii | HN-C-CH-R--R- I 3 1 ROCH-CH I 2| 15 ho-ch-ch=ch-r3-r2 fytosfingosiini-2-D-hydroksirasvahapot, joiden kaava on

0 OH

20 H | HN-C-CH-R_-R1 I 3 1 ROCH.CH OH II 2I I

25 HO-CH-CH-CH2-R3-R2 dihydrosfingosiini-2-D-hydroksirasvahapot, joiden kaava on

0 OH 30. ii | HN-C-CH-R,-R, I 3 1 R0CHoCH III 2I

35 HO-CH-CH2-CH2-R3-R2 joissa kaavoissa I, II ja III R on monosakkaridiryhmä, joka voi olla substituoitu 4-asemassa mono-, di-, tri-tai tetrasakkaridiryhmällä tai sen johdannaisella, R3 ja 40 R2 tarkoittavat toisistaan riippumatta metyyliä tai ryhmää CHO, N02, NH2, OH, SH, C0NHNH2, C0N3 tai COOH ja R3 on hiilivetyosa, joka käsittää suoraketjuisen tai haarautu- 93227 neen, tyydyttyneen tai tyydyttymättömän hiilivedyn, jonka ketjunpituus on 5-30 hiiliatomia; D-galaktopyrano-syyli-B-diglyseridi; D-galaktopyranosyyli-a-l-+6-D-galak-topyranosyyli-B-diglyseridi; ja hiilihydraattiyhdisteet, 5 joiden kaavat ovat ^CH2-S02-R6-R4 roch2ch IV xch2-so2-r6-r5 10 ja roch2ch2so2r6r4 VII 15 jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä, R4 ja R5 tarkoittavat toisistaan riippumatta metyyliä tai ryhmää CHO, N02, NH2, OH, SH, C0NHNH2, C0N3 tai COOH ja R6 on hiilivetyosa, joka käsittää suoraketjuisen tai haarautuneen, tyydyttyneen tai tyydyttymättömän hiilivedyn, jonka ketjunpituus 20 on 5 - 30 hiiliatomia; ja joka hiilihydraattiyhdiste pystyy sitoutumaan viruksella olevaan kohtaan, joka tunnistaa toisen vaiheen viruksia sitovan reseptorin sitovan epitoopin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, t u n -25 n e t t u siitä, että R on GAlö, GlcS, Gal61-»4GlcB, Galal-*4GalB,

30 Galal-*3GalBl-»4Glcö, Galal-+4GalBl-*4Glcö, Fucal-»2Galöl-*4GlcB, GlcNAcöl->3GalBl->4Glcfi, GalNAcBl-*4GalBl-»4GlcB,

35 Galal->3( Fucal->2 )GalBl->4GlcS, II: 93227 Galöl-*3GlcNAcBl-+3GalBl-»4GlcB, GalBl-»4GlcNAcBl->3GalBl-»4GlcB, GalBl-*3 (Fucal-4 )GlcNAcBl-*3GalBl-*4GlcB, tai GalBl-*4( Fucal-*3 )GlcNAcBl-*3GalBl-4GlcB.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yhdiste on yksivalenssisessa muodossa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yhdiste on sellaisessa muo- 10 dossa, että siinä esiintyy useita sitoutumiskohtia virukselle.

5 Retroviridae.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yhdiste on monivalenssisesti liittynyt makromolekyylikantajaan.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että kantajalla on hydrofobinen pinta, johon yhdisteen hydrofobinen osa on liittynyt hydrofobisella, ei-kovalenttisella vuorovaikutuksella.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö, t u n - 20. e t t u siitä, että hydrofobinen pinta on polymeeri, kuten muovi tai mikä tahansa polymeeri, johon on kytketty hydrofobisia ryhmiä.

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yhdiste on kovalenttisesti liitty- 25 nyt makromolekyylikantajaan.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kantaja on luonnon tai synteettinen polymeeri.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, t u n - 30. e t t u siitä, että kantaja on oligo- tai polysakkaridi, oligo- tai polypeptidi, niiden yhdistelmä tai vastaavasti substituoitu konjugaatti.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 5-10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kantaja on poly-L- 35 lysiini tai poly-D,L-alaniini. 93227

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että virus kuuluu heimoon Adenoviridae, Herpetoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxo-viridae, Rhabdoviridae, Reoviridae, Picornaviridae tai

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että virus on adenovirus, herpesvirus, influenssavirus, sikotautivirus, Sendai-virus, vesikauhuvirus, rotavirus, reovirus tai HTLV-virus. 93227