JP2010540488A - 糖タンパク質及びグリコシル化細胞及びそれらの調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規な糖タンパク質、及び糖ペプチド（特に糖タンパク質及びグリコシル化細胞）の調製に適切な関連するグリコシルカルバモイル化法だけでなく、その糖タンパク質の、例えば薬剤及び診断用剤として、又は診断用キットにおける、医薬品における使用を提供する。糖−ペプチド複合体の調製方法は、環状カルバメート（１）（ここで、Ｒ^３及びＲ^４は、ヒドロキシル、アセトアミド、又は糖質部分であり；及び、Ｒ^５は水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、又はＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−であり、ここでＸは糖質部分であり、ｒは０、１、２及び３から選択される整数である。）を、少なくとも１つの１級アミノ基を含むペプチドと反応させることを含む。

Description

本発明は、新規な糖タンパク質及び糖ペプチド（特に糖タンパク質及びグリコシル化細胞）の調製に適切な関連するグリコシルカルバモイル化法だけでなく、例えば薬剤及び診断用剤として又は診断用キットにおける、かかる糖タンパク質の医薬品における使用を提供する。

例えば糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコシル化細胞表面、グリコシル化細胞膜、及び他のグリコシル化された非生物学的表面のような複合糖質の調製に適切な技術は、薬物開発及び糖生物学に非常に重要である。かかることを可能にする技術は、免疫原性及び非免疫原性の糖質部分を化学的及び／又は生物学的物質と接合することにより、糖医薬品の開発に必須の役割を果たす。最も進んだ技術は、通常ライゲーション化学の使用に基づくものであり、ここでライゲーション化学においては、ライゲーションプローブを標的の化学的及び生物学的物質と接合する際には保護基による補助は、用いられない。

いくつかのライゲーション方法論が、科学論文において、所望の糖質部分を導入するために、ペプチド及びタンパク質のＮ端及びリジン側鎖の置換に焦点を置いて記載されている。１級アミノ官能基は、すべての臓器、皮膚、毛皮、絹、細胞表面のようなあらゆる生物学的サンプルにおいて豊富であり、また、簡単に合成ポリマーに発現させることができることは、よく知られている。それゆえ、１級アミン選択的ライゲーション方法論は、多数の産業において多くの種類の製品を提供する最も大きな可能性を持つ。

１級アミンライゲーション化学は、主要な副生成物の生成を抑えつつ、適切な反応性、化学選択性、しばしば満足な位置選択性を、水又は他の水性溶液中で提供しなければならない。１級アミン特異的ライゲーションにおける副生成物の形成は、ライゲーションプローブ及び標的の多機能分子／生物学的物質の両方に存在する、アミノ基、アルコール及びフェノール性水酸基、カルボキシル基等のような多数の求核官能基における望まない反応のために起こる。

いくつかの１級アミン特異的ライゲーション方法論が、過去に紹介されてきた。これらのライゲーションプロセスは、なされた置換の程度及び選択性において重大な欠点を有した。

上述の１級アミンライゲーション技術は、非常に反応性の高いライゲーションプローブ、例えば、混合酸無水物の使用のために、しばしば、低い程度の置換又は低い程度の化学選択性を生じることになる。また、いくつかの場合には活性化剤の使用により、複雑な精製プロセスを要し、生成物の純度を落とす（混合酸無水物法、還元的アミノ化）。さらに、いくつかのライゲーション方法論においては、毒性を有する、又は除去することが困難な濃縮副生成物が、反応性の高い生物学的物質の誘導体化に深刻な問題を生じる（２−イミノメトキシメチルチオライゲーション、アシルアジドライゲーション、スクアレン酸ライゲーション）。ほとんどの場合には、開発された方法論では、不必要な結合部分の導入によるライゲーションの範囲を限定する人工的及び／又は毒性のある残基を含むリンカーシステムを用いている（アリール−イソチオシアナートとのカップリング、スクアレン酸ライゲーション）。

それゆえ、限定的な現在の方法論を考慮し、糖質をタンパク質に接合する新たな適切なライゲーション方法論の開発が必要である。新しい方法論は、以下の基準を満たさなければならない：

−ライゲーション反応は、好ましくは水性の溶液中で起こり、好ましくは水中である。

−人工的なリンカーを用いずに、好ましくは接合部分の直接の結合を形成する。

−天然の無毒性リンカー部分が許容される。
−カップリング試薬は、ライゲーション反応中には、用いてはならない。
−濃縮副生成物の形成は、避けられなければならない。
−ライゲーション化学は、広いｐＨの幅において働かなければならない。
−ライゲーションプローブの反応性は、速い接合を達成しながら、化学選択性及び位置選択性の両方をサポートするものでなければならない。

欧州特許出願公開第４４１１９２Ａ２号明細書は、レトロイソスタージペプチド及びそれらのレニン阻害剤としての使用を開示する。

国際公開第８８／０２７５６Ａ２号パンフレットは、作用持続性の拡張された生物学的に活性なペプチドの糖誘導体を開示する。

本発明は、水中で、広いｐＨの範囲中で、及びいかなるカップリング試薬も用いることなく、無保護の糖質を直接ペプチド／タンパク質／生物学的物質に結合する所望の理想的なライゲーション方法を提供する。さらに、新たに開発された方法は、良好な化学、及び位置選択性を有する。

このように、本発明の１つの態様は、請求項１に参照される糖質−ペプチド複合体の調製方法に関する。

本発明の他の態様は、請求項７、８、及び１０に参照される、糖質−ペプチド複合体に関する。

本発明の３つ目の態様は、請求項１５に参照される、そのような糖質−ペプチド複合体の医薬品としての使用に関する。

本発明の４つ目の態様は、請求項１７に参照される、薬剤、診断用剤として、又は診断用キットにおける糖質−ペプチド複合体の使用に関する。

本発明の５つ目の態様は、オリゴ糖の新規な環状カルバメートに関する。

二糖ライゲーションプローブを用いた糖質環状カルバメートのライゲーションの特異的反応のスキーム。 ヒトインスリンのグリコシル化のための二糖ライゲーションプローブを用いた糖質環状カルバメートのライゲーションの特異的反応のスキーム。 二糖ライゲーションプローブを用いた糖質環状カルバメートの腫瘍細胞へのライゲーションの特異的反応のスキーム。 三糖の腫瘍細胞への一般的な接合。 乳糖の糖質環状カルバメートの調製。 ホスフィンイミン中間体を用いた糖質Ｎ、Ｏ−環状カルバメートの調製。 免疫原性糖質の糖質Ｎ、Ｏ−環状カルバメートの調製。 非環状カルバメートの分子内環化反応を介した糖質Ｎ、Ｏ−環状カルバメートの調製。 誘導糖質Ｎ、Ｏ−環状カルバメートの調製。 糖質Ｎ、Ｏ−環状カルバメートを用いた放射能標識化三糖の調製。 図１１及び図１２ ＦＩＴＣ標識されたＧＳ１Ｂ４による細胞塗抹標本の染色。 図１１及び図１２ ＦＩＴＣ標識されたＧＳ１Ｂ４による細胞塗抹標本の染色。

上述したように、本発明は、該方法が、環状カルバメート（４）

（ここで、Ｒ^３及びＲ^４は、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；及びＲ^５は、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここでＸは糖質部分であり、ｒが０、１、２、及び３から選択される整数である；）
と、少なくとも１つの１級アミノ基を含むペプチドとを反応させるステップを含む、とりわけ糖質−ペプチド複合体の調製方法に関する。

生物学的及び化学的物質の化学修飾は、新たな物理学的、化学的、生物学的、及び生理学的性質により特徴づけられる製品を提供できる最も重要な反応である。生体ポリマー及び生物学的物質の最も望ましい構造的修飾の１つは、グリコシル化である。
複合糖質は、ペプチド／タンパク質、及び生体細胞表面の新たな性質を提供する天然の構造である。例えば、糖質−ペプチド複合体は、検討中のペプチド（例えばタンパク質）を最適なコンホメーションで安定化し、そのことにより所望の機能を維持することができる。糖質−ペプチド複合体は、また、半減期を増加、水溶性、及びタンパク質の安定性を促進することができる。共有結合した糖質はまた、ウイルス表面、原核細胞及び真核細胞において免疫決定基となりうる。いくつかの糖質部分は、微生物の接着を阻害することが知られており、一方その他は、それらの結合のための受容体として作用する。それゆえ、複合糖質は、ウイルス及びバクテリア感染における重要な役割を果たし、特定の誘導体は抗感染薬として用いられうるであろう。

このように、本文脈においては、用語「糖質−ペプチド複合体（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、糖質及びペプチド、例えば、以下に概略する一般式１及び２の複合体を意味することを意図する（以下を参照）。複合体は、１つ以上の糖質部分及びペプチド部分を含むと理解されるはずである。そのような糖質部分は、それ自体でモノ−、ジ−、又はオリゴ糖が含まれうる。

実際、用語「糖質部分」（また、グリコシル部分とも呼ばれる）は、−本明細書において用いられる場合には−（しかし、それに限定されないが）誘導体及び非誘導体のモノ−、ジ−、オリゴ−糖、Ｎ−、Ｓ−、及びＣ−グリコシドを包括することを意図する。糖質部分は、単糖ユニットからなる直線又は分岐した（しばしば高度に分岐した）構造を表しうる。いくつかのより多く用いられる単糖ユニットには、グルコース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マンノース、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸等が含まれる。

用語「ペプチド」は−本明細書において用いられる場合には−、例えば５以上のアミノ酸ユニットを有するオリゴペプチドのような小さいペプチドから、３０以上のアミノ酸ユニットを有するポリペプチド及びタンパク質まで包括することを意図する。典型的には、ペプチド／ペプチド部分は、合計少なくとも３０アミノ酸ユニットを含み、典型的には、αアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）により結合している。より興味深いことに、例えば、合計のアミノ酸ユニットは、より興味深い態様としては、典型的には少なくとも６０、例えば少なくとも１００、又はさらには少なくとも１５０からなる。より大きいペプチド／ペプチド部分は、例えば酵素、治療的に関連するタンパク質等、生物学的ペプチド／タンパク質の形成に関連する２つ以上のドメインからなるものでありうる。

環状カルバメート（４）は、糖質−ペプチド複合体形成における鍵反応剤である。

環状カルバメートにおいては、Ｒ^３及びＲ^４は、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。さらに、Ｒ^５は、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここで、Ｘは糖質部分であり、ｒは、０、１、２、及び３から選択される整数である。

環状カルバメートが、ジ−、トリ−又はオリゴ糖、すなわち少なくとも１つのＲ^３、Ｒ^４、及びＸが糖質部分であることは理解されるはずである。

環状カルバメートの興味深い変化体の例としては、ジ−及びオリゴ糖（４ａ）、（４ｂ）、及び（４ｃ）：

（ここで、Ｒ^６及びＲ^７は、上述のＲ^３及びＲ^４において定義された通りであり、Ｒ^９は、上述のＲ^５において定義された通りであり、及びＲ^８及びＲ^１０は独立して、ヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−２０−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。）
において、１、２−Ｎ、Ｏ−位の還元末端に環状カルバメート部分を有する化合物である。

用語「Ｃ_１−６−アルコキシ」は、「Ｃ_１−６−アルキル−オキシ」、ここで「Ｃ_１−６−アルキル」は、１ないし６炭素原子の、例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソ−プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシである、直鎖の又は分岐した炭化水素基を意味することを意図する。

用語「Ｃ_２−２０−アシルオキシ」は、「Ｃ_１−１９−アルキル−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−」、ここで「Ｃ_１−１９−アルキル」は、１ないし１９炭素原子の、例えばアセチルオキシ、エチルカルボニルオキシ、プロピルカルボニルオキシ、イソ−プロピルカルボニルオキシ、ブチルカルボニルオキシ、ペンチルカルボニルオキシ、オクチルカルボニルオキシ等だけでなく、それらの不飽和種、例えば「Ｃ_２−２０−アシルオキシ」は、「Ｃ_１−１９−アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−」、「Ｃ_１−１９−アルキル−ジ−エン−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−」、「Ｃ_１−１９−アルキル−トリ−エン−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−」、「Ｃ_１−１９−アルキル−テトラ−エン−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−」、「Ｃ_１−１９−アルキニル−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−」等である、直鎖の又は分岐した炭化水素基を意味する。

環状カルバメートとペプチドの反応
本文脈におけるペプチド関連体は、環状カルバメートとの反応を受ける少なくとも１つの１級アミン基を有する。あるペプチドは、例えばリジンアミノ酸ユニットを起源とする側鎖１級アミン及び種々のアミノ酸（ただし、プロリンを除く）を起源とするＮ端１級アミンのようないくつかの１級アミンを含むことが理解されるであろう。

環状カルバメート（４）とペプチドとの反応のステップは、１つ以上の１級アミノ基及び対応する数の環状カルバメート分子との反応を促進する条件下、化学種を作用させることを伴う。

ライゲーション反応は、以下の反応スキーム（ここで、（４）は１、２−Ｎ、Ｏ−環状カルバメート（Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５は上述において定義された通りである。）であり、（２）はペプチド（Ｅ^１）の１つの１級アミノ基（Ｈ_２Ｎ）であり、生成した糖質−ペプチド複合体は（３）で示される）：

により説明される。

ペプチド／タンパク質、生物学的物質等において見られる、糖質環状カルバメート（４）の１級アミンのＮ−求核種による開環反応において、（２）は新規なライゲーションプロセスの鍵化学物質である。環状カルバメート（４）が、トランス−トランス縮合した２環系であることにより特徴づけられる場合には、ライゲーションは、強力な手法となる。そのような極端にひずんだ環系は、開環プロセスを経て安定化されることを好む。環状カルバメート、例えば（４）の調製は後述する。

対応する糖質環状カルバメートと、１級アミノ基を有する、化学的及び生物学的物質との化学選択的及び部位選択的新規ライゲーション反応は、典型的には、０−４０℃、酸性、中性、又は塩基性反応条件下、有機又は水溶性溶液中のいずれでも行われる。溶媒は、メタノール、水、エタノール、アセトン、トルエン、ベンゼン、１、４−ジオキサン、ＤＭＦ、ピリジン等及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されないものが化学変換に用いられる。塩基性物質、例えば無機／有機塩基−特にＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン等−及びそれらの塩が、置換反応中、ｐＨ、触媒反応、及び位置選択性を制御するためには好ましいであろう。酸性物質、例えば無機／有機酸−好ましくは、塩酸、酢酸、ギ酸等−及びそれらの塩、例えば、ＮａＨ_２ＰＯ_４が用いられうる。置換反応の反応時間は、典型的には、３−２４時間であるが、基質の構造、設定温度及び糖質である環状カルバメートに依存する。複合糖質の接合生成物は、典型的には、８０ないし９５％の範囲の収率で得られる。

ｐＨ適合化及び適切な反応条件を設定することにより、Ｎ端及びリジン側鎖の間の置換における位置選択性が、容易に維持されることを強調することは重要である。それゆえ、ライゲーション反応は、ｐＨ４−７で通常良好なＮ端選択性を示す。高いｐＨ８−１０での接合では、ほとんどのリジン側鎖修飾体が得られる。新規ライゲーションは、追加のいかなる塩基／酸又はあらゆる他の活性化剤なしで、水中、ｐＨ７で有効である。さらに、生成物はグリコシルウレア結合を有し、これは生体にとって有毒又は有害とはなり得ないと考えられている。

このようにして、本発明の１つの態様は、反応は、例えば水のような極性溶媒中で行われうる。

ある態様では、本発明の方法では、反応のｐＨが６．５−１０．５の範囲で行われる。あるいは、反応はＮ末端での選択的ライゲーションを促進するためｐＨが４．０−７．０の範囲で、又はリジン側鎖での選択的ライゲーションを促進するためｐＨが８．０−１０．０の範囲で行われる。

この方法はあらゆる型のペプチドに適用でき、例えば、一本鎖ペプチド、複数鎖ペプチド、折りたたまれたペプチド、凝集したペプチド、細胞表面結合タンパク質、細胞膜結合タンパク質等である。

１つの特に興味深い態様としては、ペプチドは、細胞表面又は細胞膜結合タンパク質である。

この方法は、多量の新規糖質−ペプチド複合体、好ましくは、以下に定義され、記述されているものを含む（「新規糖質−ペプチド複合体」参照）。

新規糖質−ペプチド複合体
新規糖質−ペプチド複合体の１つのクラスは、一般式１に定義され、ここで、１つ以上の糖質部分が、そのグリコシド部位において、ペプチド／タンパク質のリジン残基のε−アミノ官能基の、カルボニルリンカーを介して結合している。

このように、本発明はまた、一般式１：

（ここで、
Ｒ^１及びＲ^２は、間に存在するリジン部分と一緒になって、ペプチド部分を表し；
Ｒ^３及びＲ^４は、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；
Ｒ^５は、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここで、Ｘは糖質部分であり、ｒは０、１、２、及び３から選択される整数である；）
の１つ以上の部分を含む糖質−ペプチド複合体、及び、それらの薬学的に許容される塩に関する。

ここに示す例は、一般式１ａ、１ｂ、及び１ｃ

（ここで、Ｒ^６及びＲ^７は、上述のＲ^３及びＲ^４において定義された通りであり、及びＲ^９は上述のＲ^５において定義された通りであり、及びＲ^８は、ヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−２０−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。）
のいずれか１つ以上の部分を含む糖質−ペプチド複合体である。

新規糖質−ペプチド複合体の異なるクラスは、一般式２により定義され、ここで、糖質部分は、ペプチド／タンパク質のＮ末端アミノ官能基とグリコシド部位において、カルボニルリンカーを介して結合している。

このように本発明は、また一般式２：

（ここで、
Ｒ^１１はアミノ酸側鎖；
Ｒ^２は−ＮＨ−ＣＨＲ^１１−Ｃ（＝Ｏ）−と一緒になって、合計のアミノ酸が少なくとも３０のペプチド部分を表し；
Ｒ^３及びＲ^４は、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；
Ｒ^５は、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここでＸは糖質部分であり、ｒは０、１、２及び３から選択される整数である；）
の１つ以上の部分を含む糖質−ペプチド複合体、及び、それらの薬学的に許容される塩に関する。

ここに示す例は、一般式２ａ、２ｂ、及び２ｃ

（ここで、Ｒ^６及びＲ^７は、上述のＲ^３及びＲ^４において定義された通りであり、Ｒ^９は上述のＲ^５において定義された通りであり、及びＲ^８は、ヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−２０−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。）
のいずれか１つ以上の部分を含む糖質−ペプチド複合体である。

上述の一般式１及び一般式２で示される糖質−ペプチド複合体のクラスは、部分的に重複しており、１つ以上の糖質部分が、グリコシド部位においてペプチドのリジン残基のε−アミノ官能基と、カルボニルリンカーを介して結合しており、及び、−同一ペプチド内において−糖質部分は、グリコシド部位においてＮ末端アミノ官能基と、カルボニルリンカーを介して結合していると容易に予想されることが理解されるであろう。ペプチドは、−２本鎖以上からなる場合には−２つ以上のＮ末端結合した糖質部分を含みうる。

ある興味深い態様としては、ペプチドは、細胞表面又は細胞膜結合タンパク質である。

用語「アミノ酸側鎖」は、典型的にはペプチド（合成ペプチドを含む）における、アミノ酸の側鎖の基を言い、２０の必須アミノ酸に制限されないことを意図する。アミノ酸側鎖の例は、水素（グリシンを表す）、メチル（アラニン）、２−プロピル（バリン）、２−メチル−１−プロピル（ロイシン）、２−ブチル（イソロイシン）、メチルチオエチル（メチオニン）、ベンジル（フェニルアラニン）、３−インドリルメチル（トリプトファン）、ヒドロキシメチル（セリン）、１−ヒドロキシエチル（スレオニン）、メルカプトメチル（システイン）、４−ヒドロキシベンジル（チロシン）、アミノカルボニルメチル（アスパラギン）、２−アミノカルボニルエチル（グルタミン）、カルボキシメチル（アスパラギン酸）、２−カルボキシエチル（グルタミン酸）、４−アミノ−１−ブチル（リジン）、３−グルタチオン−１−プロピル（アルギニン）、及び４−イミダゾリルメチル（ヒスチジン）がある。

用語「薬学的に許容される塩」は、酸付加塩及び塩基性塩を含むことを意図する。実例としては、酸付加塩は、無毒性の酸により形成される薬学的に許容される塩である。そのような有機塩の例は、それらのマレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、シュウ酸、ビス−メチレンサリチル酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、桂皮酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、イタコン酸、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、及びテオフィリン酢酸だけでなく、８−ハロテオフィリン酢酸、例えば、８−ブロモテオフィリン酢酸の塩がある。そのような無機酸塩の例は、それらの塩酸、臭化水素、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸の塩がある。塩基性塩は、（残留している）カウンターイオンが、アルカリ金属、例えば、ナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属、例えば、カルシウム及びアンモニウムイオン（^＋Ｎ（Ｒ）_３Ｒ’、ここでＲ及びＲ’は、独立して、任意に置換されたＣ_１−６−アルキル、任意に置換されたＣ_２−２０−アルケニル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたヘテロアリール）から選択される塩である。薬学的に許容される塩は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７. Ｅｄ. Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ. Ｇｅｎｎａｒｏ （Ｅｄ.）， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， Ｕ.Ｓ.Ａ.， １９８５、及び、よりその最新の版、及び、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されたものが挙げられる。それゆえ、用語「それらの酸付加塩及び塩基性塩」は、本明細書中、そのような塩を含むことを意図する。さらに、化合物だけでなく、あらゆる中間体、又は出発物質は、水和物の形態で存在しうる。

さらに、化合物は、ラセミ混合物又は個々の立体異性体、例えばエナンチオマー又はジアステレオマーの形態で存在しうることが理解できるであろう。本発明は、可能な立体異性体（例えば、エナンチオマー及びジアスレテレオマー）だけでなく、ラセミ体及び可能な立体異性体の１つを増加させた混合物を包括する。

環状カルバメートの調製
環状カルバメート誘導体（４）（及び（４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ））の調製は、グリコシルアジド又は対応する他のアジド−デオキシ−オリゴ糖誘導体を、トリアルキル／アリールホスフィン存在下、二酸化炭素により処置することに基づいて行われる。典型的には、反応は中性の反応条件下、０−４０℃の範囲で、無水の有機溶液中で行われる。溶媒は、アセトン、トルエン、ベンゼン、１、４−ジオキサン、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン等及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されないものが化学変換に用いられる。環状カルバメート形成のための反応時間は、基質の構造、設定温度、及び用いるトリアルキル／アリールホスフィンの性質により、典型的には３−２４時間である。環状カルバメート生成物は、典型的には８０ないし９５％の高収率で得られる。

あるいは、環状カルバメート誘導体（４）（及び（４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ））の調製は、ホスフィンイミン誘導体の単離を含む、グリコシルアジド又は対応する他のアジド−デオキシ−オリゴ糖誘導体を、トリアルキル／アリールホスフィンで処置することに基づいて行われる。第２のステップにおいては、ホスフィンイミン誘導体を、二酸化炭素と反応させ、所望のオリゴ糖の環状カルバメートを得る。典型的には、反応は中性条件下、０−４０℃の範囲で行われる。溶媒は、アセトン、トルエン、ベンゼン、１、４−ジオキサン、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン等及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されないものが化学変換に用いられる。ホスフィン形成のための反応時間は、用いるトリアルキル／アリールホスフィンの性質により３−１０時間である。環状カルバメート形成は、基質の構造、設定温度により、典型的には３−２４時間である。環状カルバメート生成物は、典型的には８０ないし９５％の高収率で得られる。

あるいは、環状カルバメート誘導体（４）（及び（４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ））の調製は、グリコシルアミン又は、他のアミノ−デオキシ−オリゴ糖をホスゲン又は他の適切なホスゲン誘導体、例えばジホスゲン又はトリホスゲンで処置することを伴う。典型的には、反応は中性又は塩基性反応条件下０−４０℃の範囲で、有機又は水の溶液中で行われる。溶媒は、アセトン、トルエン、ベンゼン、１、４−ジオキサン、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン、ピリジン等及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されないものが化学変換に用いられる。環状カルバメート形成のための反応時間は、基質の構造及び設定温度の性質により、典型的には３−２４時間である。環状カルバメート生成物は、典型的には８０ないし９５％の高収率で得られる。

あるいは、環状カルバメート誘導体の調製（４）（及び（４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ））は、非環状カルバメート誘導体を塩基、例えば、水素化ナトリウム又はＤＢＵで処置することにより、分子内閉環反応を開始することに基づいて行われる。典型的には、反応は塩基性条件下０−４０℃の範囲で、無水有機溶液中で行われる。溶媒は、アセトン、トルエン、ベンゼン、１、４−ジオキサン、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン等及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されないものが化学変換に用いられる。環状カルバメート形成のための反応時間は、基質の構造及び設定温度により、３−２４時間である。環状カルバメート生成物は、典型的には８０ないし９５％の高収率で得られる。

環状カルバメート誘導体（４）（及び（４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ））は、複数の反応条件下で、例えば、Ｏ−アシル化、Ｏ−アルキル化、環状アセタール、環状ケタール形成、無保護誘導体の加水分解のような広い化学誘導において、良好な安定性を有することを強調することは重要である。そのような固有のオプションは、環状カルバメートライゲーションプローブの使用の幅を広げ、多数の誘導物質をペプチド／タンパク質、生物学的及び複雑な化学物質にライゲーションすることを可能としうる。

オリゴ糖の環状カルバメート（４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ）、すなわち

（ここで、Ｒ^６及びＲ^７は、上述のＲ^３及びＲ^４において定義された通りであり、及びＲ^９は上述のＲ^５において定義された通りである。Ｒ^８及びＲ^１０は、独立して、ヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_１−６−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。）
は、そのような新規なものであり、それゆえ本発明はそのような物質に関わり、ここで、これらは、とりわけ一般式２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、及び３ｃの化合物の調製の中間体として有用であると信じられている。

糖質−ペプチド複合体の用途
一般に、本明細書中に定義される糖質−ペプチド複合体の用途は、薬剤、診断用剤として、又は診断用キットにおいてである。

特に、本明細書中に定義され記述された方法に従い調製されたものを含み、本明細書中に定義され記述されている糖質−ペプチド複合体は、医薬品において多くの可能性を提供すると信じられている。

１つの変化体として、糖質−ペプチド複合体のグリコシル部分（ｍｏｉｅｔｙ／ｍｏｉｅｔｉｅｓ）（糖質部分）は、非免疫原性糖質を表す。

１つの好ましい態様としては、いくつかの非免疫原性糖質、例えばデキストラン、マルトデキストリン、マルトース、Ｏ−メチル化されたオリゴ糖であるセロビオース、チオ結合したオリゴ糖が、半減期を増加させるため、及び有益な物理学、生物学、及び生理学的性質、例えば、溶解性、熱及び酵素安定性等の向上を提供するため、治療用ペプチド／タンパク質に結合しうる。

他の変化体としては、糖質−ペプチド複合体のグリコシル部分（糖質部分）は、免疫原性糖質を表す。

変化体中において、いくつかの免疫原性糖質、例えばＡＢＯ血液抗原、ルイス抗原、腫瘍特異的抗原、α−Ｇａｌ−エピトープ、α−マンノシル−エピトープ、ポリシアル酸は以下に結合しうる：
−活性化ワクチンによる、ペプチド／タンパク質を下方制御するためのペプチド／タンパク質。
−感染に対抗するためのワクチンを製造するためのＨＩＶ、Ｂ型肝炎、ヘルペス、インフルエンザ、鳥インフルエンザ等のウイルス（生ワクチン、不活性化ワクチン、又はウイルス粒子）。
−抗バクテリアワクチンのためのマイコバクテリウム、ヘリコバクター等の調製のためのバクテリア。
−免疫学的性質を修飾し、自家癌ワクチンによる強い免疫反応を生成するための腫瘍細胞。
−自家癌ワクチンを調製するための腫瘍細胞膜。

さらなる態様としては、脂溶性オリゴ糖は、アルブミンに接着することによりペプチド／タンパク質の安定性の向上に用いられうる。
第１部：ライゲーション

マルトシル環状カルバメート１（４０ｍｇ）及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、５０ｍｇ）２を水（５ｍＬ）に溶解した（図１参照）。トリエチルアミン及び酢酸を加えてｐＨを約９．４４に合わせた。混合物は、４時間室温で維持し、その後、反応混合物を透析膜に移し、２日間蒸留水に対して透析し、その後、凍結乾燥した生成物３を白色粉末として得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：グリコシル化ＢＳＡ６８３３３、ＢＳＡ標準物質：６６１３４。

マルトシル環状カルバメート１（４０ｍｇ）及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、５０ｍｇ）２を水（５ｍＬ）に溶解した（図１参照）。トリエチルアミン及び酢酸を加えてｐＨを約８．５７に合わせた。混合物は、４時間室温で維持し、その後、反応混合物を透析膜に移し、２日間蒸留水に対して透析し、その後、凍結乾燥した生成物３を白色粉末として得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：グリコシル化ＢＳＡ６９０９９、ＢＳＡ標準物質：６６１３４。

マルトシル環状カルバメート１（４０ｍｇ）及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、５０ｍｇ）２を水（５ｍＬ）に溶解した（図１参照）。トリエチルアミン及び酢酸を加えてｐＨを約８．１０に合わせた。混合物は、４時間室温で維持した。その後、反応混合物を透析膜に移し、２日間蒸留水に対して透析し、その後、凍結乾燥した生成物３を白色粉末として得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：グリコシル化ＢＳＡ６８３２９、ＢＳＡ標準物質：６６１３４。

マルトシル環状カルバメート１（４０ｍｇ）及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、５０ｍｇ）２を水（５ｍＬ）に溶解した（図１参照）。トリエチルアミン及び酢酸を加えてｐＨを約７．４５に合わせた。混合物は、４時間室温で維持した。その後、反応混合物を透析膜に移し、２日間蒸留水に対して透析し、その後、凍結乾燥した生成物３を白色粉末として得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：グリコシル化ＢＳＡ６７６７９、ＢＳＡ標準物質：６６１３４。

マルトシル環状カルバメート１（１０ｍｇ）及びヒトインスリン４（５０ｍｇ）を水（１３ｍＬ）に溶解させた（図２参照）。ジイソプロピルエチルアミン及びＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液を加えて、ｐＨを約１０．００に合わせた。混合物を２．５時間室温で維持し、反応混合物を凍結乾燥し、Ｂ２９グリコシル化インスリン５を、９０％を超える位置選択性で得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｂ−２９−グリコシル化ヒトインスリン：６１７１、ヒトインスリン：５８０５。

マルトシル環状カルバメート１（１０ｍｇ）及びヒトインスリン４（５０ｍｇ）を水（１３ｍＬ）に溶解させた（図２参照）。ジイソプロピルエチルアミン及びＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液を加えて、ｐＨを約８．００に合わせた。混合物を２．５時間室温で維持し、反応混合物を凍結乾燥し、修飾インスリン５を得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：グリコシル化ヒトインスリン：６１７１、ヒトインスリン：５８０４。

マルトシル環状カルバメート１（１０ｍｇ）及びヒトインスリン４（５０ｍｇ）を水（１３ｍＬ）に溶解させた（図２参照）。ジイソプロピルエチルアミン及びＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液を加えて、ｐＨを約７．００に合わせた。混合物を２．５時間室温で維持し、反応混合物を凍結乾燥し、Ｂ−１−グリコシル化インスリン５を、９０％を超える位置選択性で得た。
質量分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｂ−１−グリコシル化ヒトインスリン：６１７１、ヒトインスリン：５８０４。

α−Ｇａｌエピトープ−環状カルバメート６（二糖）（２５ｍｇ）及びヒト乳癌細胞株７（細胞数２×１０^６）をＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ）中で混合した（図３参照）。反応混合物は、３７℃で３時間維持した後、混合物を培地から細胞を分離するために遠心分離した。
修飾細胞を蛍光標識−レクチンで処置し、修飾はフローサイトメトリーによって証明された。

α−Ｇａｌエピトープ−カルバメート６（二糖）（２５ｍｇ）及びヒト乳癌細胞株７（細胞数１×１０^６）をＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ）中で混合した（図３参照）。反応混合物は、３７℃で３時間維持した後、混合物を培地から細胞を分離するために遠心分離した。
修飾細胞を蛍光標識−レクチンで処置し、修飾はフローサイトメトリーによって証明された。

α−Ｇａｌエピトープ−カルバメート６（二糖）（２５ｍｇ）及びヒト乳癌細胞株７（細胞数５×１０^５）をＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ）中で混合した（図３参照）。反応混合物は、３７℃で３時間維持した後、混合物を培地から細胞を分離するために遠心分離した。
修飾細胞を蛍光標識−レクチンで処置し、修飾はフローサイトメトリーによって証明された。
実施例１１ないし１５においては、化合物９は「三糖プローブ」と呼ぶ。図４を参照。実施例１４及び１５において、印をつけた炭素原子はＣ１３で標識した。

三糖プローブのＢ１６ＢＬ１６細胞株への接合
細胞の調製
３７．５℃、５％ＣＯ_２下、１０％仔ウシ胎児血清（Ｐ／Ｓなし）含有ＤＭＥＭ中でコンフルエントとしたＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞の２つのフラスコ（３００ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を本実験で用いた。成長培地を細胞から除き、２５ｍＬのＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）を細胞に加え、即時に再び取り除いた。別のＰＢＳ１０ｍＬを加えて除き、細胞剥離溶液Ｃ５９１４（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）（３ｍＬ／フラスコ）で細胞を収穫し、１０ｍＬチューブに移した（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、上清を捨てた。続いて、細胞をＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）で洗浄し、上述の通り遠心分離し、ＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）中に再懸濁させた。細胞懸濁液の濃度を決定した。

α−ｇａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合
５００ｍｇのα−Ｇａｌ三糖−カルバメート（９）をＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）に溶解し、無菌フィルターで濾過した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ（商標登録）、０．２０ｍｙ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）。８つの異なる濃度の複合体を調製した。２ｍＬのＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）及び１０^６のＢ１６．ＢＬ６細胞を含む細胞懸濁液６００μＬの入ったフラスコに、それぞれの複合体の希釈液２ｍＬを加えた。フラスコの最終容量は、４．６ｍＬであった。フラスコは、１ないし１０とナンバリングした。フラスコ１及び１０は、複合体を含有せず、コントロールとして用いた。細胞は、複合体と３７℃、５％ＣＯ_２下、３時間２５分間培養した。

接合後、細胞剥離溶液Ｃ５９１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）１０ｍＬで、接合反応１、２、４、６、及び８からの細胞（非接合細胞）を収穫し、１０ｍＬチューブ（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移した。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、ＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）中に再懸濁させた。最後に、細胞は前述の通り遠心分離し、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ１００μＬ中に再懸濁させた。細胞濃度及び生存率を、トリパンブルー染色細胞サンプルを用いて顕微鏡検査により決定した。接合反応３、５、７、９、及び１０（非接合細胞）からの細胞は、翌日に、上述の通りに収穫した。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳ１００μＬ中に再懸濁させた。細胞濃度及び生存率を、トリパンブルー染色細胞サンプルを用いて顕微鏡検査により決定した。

ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４による細胞塗抹標本の染色
接合反応１（非接合細胞）、２、４、６、及び８からの細胞塗抹標本を、室温で１時間ＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４のＴＢＳ１:２００希釈体と室温で１時間培養した。ＴＢＳで洗浄後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社）１滴を各細胞標本に加え、カバーガラスを上に乗せた。ＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４のＧａｌα１、３Ｇａｌへの結合は、蛍光顕微鏡によって評価した。

フローサイトメトリー分析
接合反応１（非接合細胞）、２、４、６、及び８からのＢ１６．ＢＬ６細胞をフローサイトメトリーにより分析した。１×１０^５細胞を含有する細胞懸濁液１００μＬを、１％ＢＳＡをＴＢＳ中に含有する１０μｇ／ｍＬ（１:１００希釈）ＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４と、４℃下１５分培養した。細胞染色の割合、平均及びメジアン細胞蛍光強度をフローサイトメトリーにより分析した。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、測定を繰り返した。〜２×１０^６ Ｇａｌα１、３Ｇａｌエピトープ／細胞を発現することが知られているウサギ赤血球（ＲＲＢＣ）を比較のために用いた。Ｂ１６．ＢＬ６細胞の接合及びＲＲＢＣの分析は、異なる日に行った。

接合後の細胞濃度及び生存率
接合プロセスの終わりには、細胞数及び生存率をトリパンブルー染色により評価したが、全ての接合反応において、有意に減少していた。しかし、異なる接合反応間においては、かなりの多様性が見られた。各接合反応からは１００μＬないし１３０μＬの容量の細胞懸濁液を採取した。

表１ 細胞濃度及び接合後の生存率

＊）細胞濃度及び生存率は、接合プロセスを行った１日後に測定した。

表２ 接合後の細胞生存率

ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４による細胞塗抹標本の染色
ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４との結合により検出されるＧａｌα１、３Ｇａｌエピトープは、試験した全ての接合反応の細胞において見られた（接合反応２、４、６、及び８）。非接合細胞（接合反応１）はいずれも染色されなかった。
図１１及び１２を参照。

フローサイトメトリー
ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４との結合により検出されるＧａｌα１、３Ｇａｌエピトープは、試験した全ての接合反応の細胞において見られた（接合反応２、４、６、及び８）。非接合細胞（接合反応１）はいずれも染色されなかった。検出可能な量のＧａｌα１、３Ｇａｌ−エピトープの細胞の割合を、それぞれの接合反応において決定した。

表３ 検出可能なＧａｌα１、３Ｇａｌ−エピトープの細胞

検出可能な量の細胞表面Ｇａｌα１、３Ｇａｌ−エピトープを有する、細胞の蛍光強度を測定した。結果は、接合細胞におけるＧａｌα１、３Ｇａｌ−エピトープの数は、ウサギ赤血球細胞において発現されることで知られる、〜２×１０^６ Ｇａｌα１、３Ｇａｌエピトープよりもかなり多かった。洗浄及び非洗浄細胞の細胞蛍光強度の平均及びメジアン値を、以下に示す。

表４ 蛍光強度、非洗浄細胞

＊）ウサギ赤血球は、〜２×１０^６ Ｇａｌα１、３Ｇａｌエピトープ／細胞を発現することが知られている。

接合反応２からのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞に接合したＧａｌα１、３Ｇａｌエピトープの視覚化。ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４が結合した細胞表面におけるＧａｌα１、３Ｇａｌエピトープの細胞膜をしっかりと染色した。

表５ 蛍光強度、洗浄細胞

表６ 蛍光強度、非洗浄細胞

α−Ｇａｌ三糖−カルバメートプローブのＢ１６．ＢＬ６細胞株への接合。
接合時間の減少：
細胞の調製
実施例１１を参照。

α−ｇａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合
α−Ｇａｌ三糖−カルバメート（９）をＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＨＢＳＳ（Ｄ−グルコース含有）の両方に溶解し、無菌フィルターで濾過した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ（商標登録）、０．２０ｍｙ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）。３つの異なる濃度の三糖プローブをＰＢＳ及びＨＢＳＳの両方の溶液中で調製した。

それぞれに１０^６のＢ１６．ＢＬ６細胞を含む８つの小フラスコ（２５ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を調製し、三糖プローブを加えた。フラスコの合計容量は、４．６ｍＬであった。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２下、複合体と１時間培養した。

表７ 接合反応

接合後、それぞれのフラスコからの上清を別々の１０ｍＬチューブ（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移した。細胞剥離溶液Ｃ５９１４（２ｍＬ／フラスコ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で細胞（非接合細胞）を収穫し、１０ｍＬチューブに移した。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、０．５ｍＬのＰＢＳ又はＨＢＳＳ中に再懸濁させた。細胞濃度及び生存率を、トリパンブルー染色細胞サンプルを用いて顕微鏡検査により決定した。

三糖プローブと１時間培養後、ほとんどの細胞は生存しており、フラスコの底の表面に接着していた。しかし、これらの細胞を収穫することは困難であり、ほとんどは処置中に失われた。

表８ 細胞生存率

表９ 細胞生存率

α−Ｇａｌ三糖−カルバメートプローブ（９）のＢ１６．ＢＬ６細胞株への接合
接合時間の減少:
細胞の調製
実施例１１を参照。

α−ＧａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合
α−Ｇａｌ三糖プローブ（９）をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）に溶解し、無菌フィルターで濾過した（０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ（商標登録） Ａｃｒｏｄｉｓｃ（商標登録）１３、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）。３つの異なる濃度のα−Ｇａｌ三糖−カルバメート（９）を作製した。４ｍＬの接合溶液を、合計１０^６のＢ１６．ＢＬ６細胞を含む細胞懸濁液６０６μＬに加えた、５つの小フラスコを調製した。それぞれのフラスコは、合計容量４．６ｍＬであった。細胞は、「グリコムコンジュゲート」と３７℃において３又は１．５時間培養した。

表１０ 接合反応

接合後、それぞれのフラスコからの上清を別々の１０ｍＬチューブ（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移した。細胞は、フラスコにＰＢＳを加えて２回洗浄し、即時に除いた。細胞は、細胞剥離溶液（２ｍＬ／フラスコ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ ＬｏｕｉｓＭｉｓｓｏｕｒｉ）で、収穫した。５分後、細胞を１０ｍＬの試験チューブに移した。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、０．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞濃度及び生存率を、トリパンブルー染色細胞サンプルを用いて顕微鏡検査により決定した。

フローサイトメトリー分析
接合反応１からの細胞：
１×１０^５細胞を含有する各細胞懸濁液１００μＬを、１０μｇ／ｍＬ（１:１００希釈）のＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４のＰＢＳ溶液において、４℃下１５分間培養した。ウサギ赤血球細胞（Ａ）を比較のために用いた。

接合反応２、３、４、及び５からの細胞：
フローサイトメトリー分析に使用可能な細胞がほとんどなかったために、正確な細胞濃度は決定されなかった。代わりに、細胞の数は０．４×１０^５であると見積もった。細胞は、４μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４のＰＢＳ溶液において、４℃下１５分間培養した。ウサギ赤血球（Ｂ）を比較のために用いた。
平均及びメジアン細胞蛍光強度をフローサイトメトリーにより決定した。

フローサイトメトリー分析
ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４との結合により検出されるＧａｌα１、３Ｇａｌエピトープは、試験した全ての接合反応の細胞において見られた。接合反応２及び４からの細胞の分析は、異なる蛍光強度の細胞の２つの集団があることを示した。非接合細胞（接合反応５）の蛍光強度により示された比較的高いバックグラウンドの染色は、使用細胞数の過大評価によるＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４の大過剰量の使用の結果であると考えられる。

表１１ 蛍光強度、接合反応１からの細胞

＊）ウサギ赤血球は、〜２×１０^６ Ｇａｌα１、３Ｇａｌエピトープ／細胞を発現することが知られている。

表１２ 蛍光強度、接合反応２、３、４、及び５からの細胞

＊）ウサギ赤血球は、〜２×１０^６ Ｇａｌα１、３Ｇａｌエピトープ／細胞を発現することが知られている。
＊＊）接合反応２及び４においては、蛍光強度の異なる２つの細胞群が見られたため、両群について値を出した。

放射性プローブのＢ１６．ＢＬ６細胞株への接合
この試験の目的は、Ｇａｌα１、３ＧａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合の数を見積り、シンチレーション及びフローサイトメトリーにより得られた結果を比較することにある。

細胞の調製
３７．５℃、５％ＣＯ_２下、１０％仔ウシ胎児血清（Ｐ／Ｓなし）含有ＤＭＥＭ中でコンフルエントとしたＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞の９のフラスコ（３００ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を本実験で用いた。成長培地を細胞から除き、２０ｍＬのＤ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）を細胞に加え、即時に再び取り除いた。別の１０ｍＬのＤ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）を加えて除去し、細胞剥離溶液Ｃ５９１４（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）（１０ｍＬ／フラスコ）で細胞を収穫し、５０ｍＬチューブに移した（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、上清を捨てた。続いて、細胞をＤ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）で洗浄し、上述の通り遠心分離し、Ｄ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）中に再懸濁させた。細胞懸濁液の濃度を決定した。

Ｇａｌα１、３ＧａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合
放射能標識体及び通常の三糖プローブをＤ−グルコース含有（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）に溶解し、無菌フィルターで濾過した（０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ（商標登録） Ａｃｒｏｄｉｓｃ（商標登録）１３、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）。４つの異なる濃度の「グリコムコンジュゲート」を作製した（２５ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、及び０．１ｍｇ）。それぞれ合計１０×１０^６のＢ１６．ＢＬ６細胞を含有する１２のフラスコ（１５０ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を調製した。Ｄ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）を、三糖プローブに加え、それぞれのフラスコの合計容量を２０ｍＬとした。細胞は、「グリコムコンジュゲート」と３７℃において１．５時間培養した。接合後、各フラスコからの上清を、異なる５０ｍＬチューブ（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移した。細胞剥離溶液Ｃ５９１４（５ｍＬ／フラスコ）（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で細胞を収穫し、上清ごと５０ｍＬチューブに移した（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。細胞は２０℃において３分間３００Ｇで遠心分離し、５ｍＬのＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）中に再懸濁させた。これを、トリパンブルー染色サンプルの顕微鏡検査による細胞濃度及び生存率決定までに３回行った。

シンチレーション
放射能標識化三糖プローブと結合した細胞を２０℃において１０００Ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、残ったペレットを乾燥させた。続いて、ペレットをミリＱ水４００μＬに溶解し、１．５ｍＬのシンチレーション溶液を加えた。３つのコントロール細胞に関し、シンチレーションのための標準物質を５００ｐＣｉ、０．５ｐＣｉ、及び０ｐＣｉ加えた。サンプルは、細胞懸濁液をシンチレーションバイアルに移し、計測するまで、室温で３日間保存した。

フローサイトメトリー分析
通常の三糖プローブと接合した細胞は、フローサイトメトリーにより分析した。２×１０^５細胞を含有する各細胞懸濁液４００μＬを、１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４と４℃下１５分培養した。ＧＳ１Ｂ４により染色した細胞の平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。

細胞濃度及び接合後の生存率
収穫プロセスにおいて、放射能標識化三糖プローブによる２つの異なるフラクションの細胞を誤って合わせてしまったため、これらを捨てなければならなかった。従って、これらの接合反応から得られた結果は、他と比較することができなかった。加えて、０．１ｍｇ放射能標識化三糖プローブと接合させた細胞を含有する懸濁液は、異常な容量となった。予備試験において見られたように、収穫細胞の量及び細胞生存率は、異なる複合体の濃度間で、及び通常複合体及び放射能標識化複合体の間で異なる。

表１３ 通常の複合体と接合した細胞

＊）α−ｇａｌ接合後の評価

表１４ 放射能標識化複合体と接合させた細胞

＊）α−ｇａｌ接合後の評価
＊＊）付着した細胞のみ
＊＊＊）上清からの細胞のみ

フローサイトメトリー
予備試験において見られたように、ＦＩＴＣ−標識されたＧＳ１Ｂ４の検出可能量の接合細胞は１フラクションのみであった。１ｍｇの接合における、細胞の平均蛍光強度は予想に反して低く、それに対して、残りの接合反応においては複合体の用量及び平均蛍光強度の間には正の相関が見られた。

表１５ 平均蛍光強度

＊）ＧＳ１Ｂ４で標識した細胞の平均蛍光強度

シンチレーション
正の相関が、シンチレーション計数及び接合用量において見られた。しかし、収穫プロセスにおける上述した過誤により、フローサイトメトリー分析から得られた結果は比較できず、それゆえ２つの定量法の間における関係は、決定することができなかった。

表１６ エピトープ／細胞の推定値

＊）付着した細胞のみ
＊＊）上清からの細胞のみ

表１７接合量の関数としてのエピトープ／細胞

放射性プローブとＢ１６．ＢＬ６細胞株の接合
この試験の目的は、Ｇａｌα１、３ＧａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合の数を見積り、シンチレーション及びフローサイトメトリーにより得られた結果を比較することにある。

細胞の調製
３７．５℃、５％ＣＯ_２下、１０％仔ウシ胎児血清（Ｐ／Ｓなし）含有ＤＭＥＭ中で、コンフルエントとしたＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞の１２のフラスコ（３００ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を本実験で用いた。
成長培地を細胞から除き、２０ｍＬのＤ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）を細胞に加え、即時に再び取り除いた。別の１０ｍＬのＤ−グルコース含有（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）ＨＢＳＳを加えて除去し、細胞剥離溶液Ｃ５９１４（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）（１０ｍＬ／フラスコ）で細胞を収穫し、５０ｍＬチューブに移した（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。細胞は２０℃において５分間３００Ｇで遠心分離し、上清を捨てた。続いて、細胞をＤ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）で洗浄し、上述の通り遠心分離し、Ｄ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）中に再懸濁させた。細胞懸濁液の濃度を決定した。

α−ｇａｌエピトープのＢ１６．ＢＬ６メラノーマ細胞への接合
放射能標識体及び通常のα−Ｇａｌ三糖−カルバメート（９）プローブ（環状カルバメート炭素において標識されている）をＤ−グルコース含有（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔａａｓｔｒｕｐ Ｄｅｎｍａｒｋ）に溶解し、無菌フィルターで濾過した（０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ（商標登録） Ａｃｒｏｄｉｓｃ（商標登録）１３、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）。８つの異なる濃度の放射能標識化α−Ｇａｌ三糖−カルバメート（９）（１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、及び２０ｍｇ）、及び６つの異なる濃度の「グリコムコンジュゲート」（１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、及び２０ｍｇ）を用いた。それぞれ合計１０×１０^６のＢ１６．ＢＬ６細胞を含有する１２のフラスコ（３００ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を放射能標識化三糖プローブとの接合のため、及びそれぞれ合計５×１０^６のＢ１６．ＢＬ６細胞を含有する８つのフラスコ（１５０ｃｍ^２）（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を非放射性複合体との接合のため調製した。グリコムコンジュゲートに、Ｄ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）を加え、それぞれの大フラスコ（３００ｃｍ^２）を最終容量２０ｍＬとし、Ｄ−グルコース含有ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）を加え、それぞれの中フラスコ（１５０ｃｍ^２）を最終容量１０ｍＬとした。細胞は、「グリコムコンジュゲート」と３７℃において１．５時間培養した。接合後、各フラスコからの上清を、異なる５０ｍＬチューブ（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移した。細胞剥離溶液（１０ｍＬ／大フラスコ及び５ｍＬ／中フラスコ）（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で細胞を収穫し、上清ごと５０ｍＬチューブに移した（ＴＰＰ社、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。細胞は２０℃において３分間３００Ｇで遠心分離し、ＰＢＳ（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋なし）５ｍＬ中で再懸濁させた。これを、トリパンブルー染色サンプルの顕微鏡検査による細胞濃度及び生存率決定までに３回行った。

シンチレーション
放射能標識化三糖プローブと結合した細胞を２０℃において１０００Ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、残ったペレットを乾燥させた。続いて、ペレットをミリＱ水４５０μＬに溶解し、１．５ｍＬのシンチレーション溶液を加えた。シンチレーションのための標準物質は、３つのコントロール細胞に、５００ｐＣｉ、０．５ｐＣｉ、及び０ｐＣｉ加えて調製した。サンプルは、細胞懸濁液をシンチレーションバイアルに移し、計測するまで、室温で３日間保存した。

フローサイトメトリー分析
通常の三糖プローブと接合した細胞は、フローサイトメトリーにより分析した。２×１０^５細胞を含有する各細胞懸濁液４００μＬを、ＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４と、４℃下１５分培養した。ＧＳ１Ｂ４により染色した細胞の平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。

表１８ 通常の複合体と接合させた細胞

＊）α−ｇａｌ接合し、細胞を１回洗浄した後に決定した。

表１９ 放射能標識化複合体と接合させた細胞

＊）α−ｇａｌ接合し、細胞を４回洗浄した後に決定した。

フローサイトメトリー
予想に反し、いずれの接合反応においても、ＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４と細胞に結合させたものは、上述のバックグラウンドを上回らなかった。追加のＦＩＴＣ−標識ＧＳ１Ｂ４を細胞に加え、測定を繰り返した。しかし、再び染色は見られず、それゆえ、フローサイトメトリー分析によって、α−ｇａｌ接合は成功しなかったことがわかった。

シンチレーション
１ｍｇの放射能標識化複合体と接合した細胞の数に疑いがあったため、これらの細胞によって得られた結果は含めなかった。残りの接合反応においては、シンチレーション計数及び複合体の用量の間に正の相関が見られた。上述の通り、フローサイトメトリーによるα−ｇａｌ接合の確認ができなかったため、２つの定量法の関係は、見いだせなかった。

表２０ 放射能標識化複合体と接合した細胞

＊）α−ｇａｌ接合し、細胞を４回洗浄した後に決定した。

表２１ 接合用量の関数としてのエピトープ／細胞

第２部：糖質含有環状カルバメートの調製

ラクトシルアジド１２（１．５ｇ）をＣＯ_２で飽和させた無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶かし、続いてトリフェニルホスフィン（１．１当量）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を２０分以上かけて混合物に加えた（図５参照）。ＣＯ_２を混合物に５時間吹き込み、混合物は８時間攪拌した。生成した白色沈殿を濾過し、冷アセトンで洗浄し、目的物１３（１ｇ）を得た。

ラクトシルアジド１２（１．８ｇ）を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、続いてトリフェニルホスフィン（１．１当量）を混合物に加え、３時間攪拌した（図６参照）。ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、生成した白色沈殿を濾過し、冷ジエチルエーテルで洗浄し、ホスフィンイミン１６（１．９ｇ）を得た。

ホスフィンイミン誘導体（１．９ｇ）の無水アセトン（４０ｍＬ）溶液にＣＯ_２を吹き込み、室温で６時間攪拌した。続いて、生成した白色結晶を収集し目的物１３を得た。

０℃において、トリホスゲン（１．１当量）をα−ｇａｌ三糖エピトープ１８（１ｇ）のＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ_３溶液に加え、混合物を３０分間激しく攪拌した（図７参照）。続いて、層を分離し、有機層を集めて濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにかけて生成物１９を得た。

ＤＩＰＥＡ（１．３当量）存在下、Ｚ−ＣＬ（１．２当量）をラクトシルアミン２０（１ｇ）のＤＭＦ溶液に加え、混合物を、ＴＬＣで化合物２１への変換が終了するまで攪拌した（図８参照）。続いてＮａＯＭｅ（１．３当量）を加え、室温で攪拌した。反応混合物は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（Ｈ^＋）で中和し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにかけて目的物１３を得た。

塩化アシル（４当量）を、グルコシルカルバメート２２（１００ｍｇ）のＤＣＭ（３ｍＬ）及びピリジン（４ｍＬ）溶液に加え、混合物を終夜攪拌し、続いて混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフィーにかけ、生成物２３を得た（図９参照）。

ＰＰｈ_３（３１．４ｍｇ）のアブソリュートＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、三糖−アジド２４（５０ｍｇ）のアブソリュートＤＭＦ（０．３ｍＬ）溶液を加えた。混合物は、不活性雰囲気下で２時間攪拌した（図１０参照）。続いて、濃Ｈ_２ＳＯ_４５ｍＬを（Ｃ１３標識された）ＢａＣＯ_３（３９．４ｍｇ）に加え、発生させたＣＯ_２を糖質混合物に通した。混合物を８時間、室温で攪拌した。続いて混合物を攪拌し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）でトリチュレートし、生成物２５を白色固形物として単離した。

Claims (18)

1. 糖質−ペプチド複合体の調製方法であって、該方法が、環状カルバメート（１）
   

   

   （ここで、Ｒ^３及びＲ^４が、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；及び、Ｒ^５が、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され_、ここで、Ｘは糖質部分であり、ｒは０、１、２及び３から選択される整数である；）
   を、少なくとも１つの１級アミノ基を含むペプチドと、反応させるステップを含む方法。
2. 反応が、例えば水のような極性溶媒中において行われる請求項１記載の方法。
3. 反応が、ｐＨ６．５−１０．５の範囲において行われる、前述の請求項いずれか記載の方法。
4. ペプチドが、少なくとも３０のアミノ酸ユニットを含む、前述の請求項いずれか記載の方法。
5. ペプチドが、細胞表面又は細胞膜結合タンパク質である、前述の請求項いずれか記載の方法。
6. 糖質−ペプチド複合体が、請求項７−１４のいずれかにおいて定義される化合物である、前述の請求項いずれか記載の方法。
7. 請求項１−６のいずれか記載の方法により得られる糖質−ペプチド複合体。
8. 一般式１：
   

   

   （ここで、
   Ｒ^１及びＲ^２は、間に存在するリジン部分と一緒になって、ペプチド部分を表し；
   Ｒ^３及びＲ^４は、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；
   Ｒ^５は、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここで、Ｘは糖質部分であり、ｒは０及び１から選択される整数である；）
   の１つ以上の部分を含む糖質−ペプチド複合体、及びそれらの薬学的に許容される塩。
9. 一般式１ａ、１ｂ、及び１ｃ
   

   

   （ここで、Ｒ^６及びＲ^７は請求項１のＲ^３及びＲ^４において定義された通りであり、Ｒ^９は請求項１のＲ^５において定義された通りであり、Ｒ^８はヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−２０−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。）
   のいずれか１つ以上の部分を含む、請求項８記載の糖質−ペプチド複合体。
10. 一般式２：
    

    

    （ここで、
    Ｒ^１１はアミノ酸側鎖；
    Ｒ^２は−ＮＨ−ＣＨＲ^１１−Ｃ（＝Ｏ）−と一緒になって、合計のアミノ酸が少なくとも３０のペプチド部分を表し；
    Ｒ^３及びＲ^４は、独立して、ヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；
    Ｒ^５は、水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここでＸは糖質部分であり、ｒは０、１、２及び３から選択される整数である；）
    の１つ以上の部分を含む糖質−ペプチド複合体、及びそれらの薬学的に許容される塩。
11. 一般式２ａ、２ｂ、及び２ｃ
    

    

    （ここで、Ｒ^６及びＲ^７は、請求項３のＲ^３及びＲ^４において定義された通りであり、Ｒ^９は請求項１１のＲ^５において定義された通りであり、及びＲ^８は、ヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−２０−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される。）
    の１つ以上の部分を含む請求項１０記載の糖質−ペプチド複合体。
12. グリコシル部分（糖質部分）が、非免疫原性糖質を表す請求項７−１１のいずれか記載の糖質−ペプチド複合体。
13. グリコシル部分（糖質部分）が、免疫原性糖質を表す請求項７−１１のいずれか記載の糖質−ペプチド複合体。
14. 糖質−ペプチド複合体が、細胞表面又は細胞膜結合タンパク質である請求項７−１３のいずれか記載の糖質−ペプチド複合体。
15. ペプチド部分のアミノ酸ユニットの合計数が少なくとも３０、特に少なくとも１００である請求項７−１４のいずれかにおいて定義される糖質−ペプチド複合体。
16. 医薬品において使用するための請求項７−１５のいずれかにおいて定義される糖質−ペプチド複合体。
17. 薬剤、診断用剤として、又は診断用キットにおける請求項７−１５のいずれか記載の糖質−ペプチド複合体の使用。
18. （４ａ）、（４ｂ）及び（４ｃ）
    

    

    （ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７は、独立してヒドロキシル、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択され；
    Ｒ^５及びＲ^９は、独立して水素、メチル、ヒドロキシメチル、アセトアミドメチル、カルボキシル、及びＸ−（ＣＨ_２）_ｒ−からなる群から選択され、ここでＸは糖質部分であり、ｒは０、１、２及び３から選択される整数であり；及び
    Ｒ^８及びＲ^１０は、独立してヒドロキシル、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_１−６−アシルオキシ、アセトアミド、及び糖質部分からなる群から選択される；）
    から選択されるオリゴ糖の環状カルバメート、及びそれらの薬学的に許容される塩。

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