CN101821281A - 糖蛋白和糖基化的细胞以及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了新的糖蛋白和相关的适合于制备糖肽(特别是糖蛋白和糖基化的细胞)的糖基甲氨酰化方法，以及此类糖蛋白在医学中，例如作为药物和诊断剂或在诊断试剂盒中的用途。所述用于制备糖-肽缀合物的方法包括使环状氨基甲酸酯(1)：(其中R3和R4为羟基、乙酰氨基或糖部分；并且R5为氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基或X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数)与包含至少一个伯氨基基团的肽反应。

Description

糖蛋白和糖基化的细胞以及其制备方法
发明领域
本申请公开了新的糖蛋白和相关的适合于制备糖肽(特别是糖蛋白和糖基化的细胞)的糖基甲氨酰化方法，以及此类糖蛋白在医学中，例如作为药物和诊断剂或在诊断试剂盒中的用途。
发明背景
适合于制备糖缀合物例如糖肽、糖蛋白、糖脂、糖基化的细胞表面、糖基化的细胞膜和其他糖基化的非生物学表面的技术在药物发现和糖生物学中具有巨大的重要性。通过将免疫原性的和非免疫原性的糖部分缀合至化学和/或生物学实体，此类使之能能够实现的技术在糖药物(glycopharmaceuticals)的开发中发挥着至关重要的作用。通常，最先进的技术基于连接化学的使用，其中在将连接探针(ligatingprobes)缀合至靶化学和生物学实体的过程中免除了保护基团的辅助。
在科学文献中已描述了几种连接方法，其集中于肽和蛋白质的N-末端和赖氨酸侧链的取代，以便递送所希望的糖部分。众所周知，伯氨基官能团在所有种类的生物学样品例如器官、皮肤、毛皮、蚕丝、细胞表面中都是丰富的，并且还可以容易地展示在合成聚合物上。因此，伯胺选择性连接方法具有为众多工业提供许多种类的产品的最大潜力。
伯胺连接化学必须在水或其他水性溶液中提供适当的反应性、化学选择性、常令人满意的位点选择性，而同时消除严重的副产物形成的发生。伯胺特异性连接的副产物形成是由于在连接探针和所靶向的多功能分子/生物学实体中存在的众多亲核官能团例如仲氨基、醇和酚羟基、羧基等处的不希望的反应所致。
过去已介绍了几种伯胺特异性连接方法。就所达到的取代度和选择性而言，这些连接方法具有严重的缺点。
由于使用非常具有反应性的连接探针例如混合酐，上面所提及的伯胺连接技术经常遭受低取代度和低程度的化学选择性的问题。在几种情况下，活化试剂的使用也是必需的，从而使操作程序复杂化并且降低了产物纯度(混合酐方法，还原性胺化)。此外，在一些连接方法中，可以形成有毒的或难以除去的缩合副产物，从而在敏感的生物学实体的衍生化中造成严重的问题(2-亚氨基甲氧基甲硫基连接，酰基叠氮化物连接，方形酸连接)。在大多数情况下，所开发出的方法使用包含人工和/或毒性残基的接头系统(用芳基异硫氰酸酯进行偶联，方形酸连接)，从而通过引入非必需的连接部分而限制了连接的范围。
因此，鉴于目前技术的限制，存在有开发新的适合于将糖类缀合至蛋白质的连接方法的需要。新的方法必须满足下列标准：
-连接反应应当优选地在水性溶液中，优选地在水中进行；
-应当优选地建立在所缀合的部分之间的直接键合，由此消除人工接头的使用；
-可以接受天然和非毒性的接头部分；
-在连接反应过程中应当避免偶联试剂；
-应当消除缩合副产物形成；
-连接化学应当能够在宽的pH范围内工作；
-连接探针的反应性应当支持化学选择性和位点选择性，而同时可以达到迅速的缀合。
EP 441192 A2公开了反电子等排的(retroisosteric)二肽和其作为凝乳酶抑制剂的用途。
WO 88/02756 A2公开了具有延长的作用持续时间的生物活性肽的糖衍生物。
发明简述
本发明提供了所希望的理想连接程序，其通过在宽的pH范围内并且不使用任何偶联试剂，在水中将未经保护的糖类直接连接至肽/蛋白质/生物学实体。此外，该新开发出的方法提供了优异的化学选择性和位点选择性。
因此，本发明的一个方面涉及用于制备糖-肽缀合物的方法，参见权利要求1。
本发明的另一个方面涉及糖-肽缀合物，参见权利要求7、8和10。
本发明的第三个方面涉及用于在医学中使用的此类糖-肽缀合物，参见权利要求15。
本发明的第四个方面涉及糖-肽缀合物作为药物、诊断剂或在诊断试剂盒中的用途，参见权利要求17。
本发明的第五个方面涉及新的寡糖的环状氨基甲酸酯。
附图简述
图1：使用二糖连接探针来进行的糖环状氨基甲酸酯连接的具体反应流程。
图2：对于人胰岛素的糖基化，使用二糖连接探针来进行的糖环状氨基甲酸酯连接的具体反应流程。
图3：对于肿瘤细胞，使用二糖连接探针来进行的糖环状氨基甲酸酯连接的具体反应流程。
图4：三糖与癌细胞的一般性缀合。
图5：乳糖的糖环状氨基甲酸酯的制备。
图6：经由膦亚胺中间体来制备糖N，O-环状氨基甲酸酯。
图7：免疫原性的糖的糖N，O-环状氨基甲酸酯的制备。
图8：经由无环氨基甲酸酯的分子内环的形成来制备糖N，O-环状氨基甲酸酯。
图9：衍生化的糖N，O-环状氨基甲酸酯的制备。
图10：经放射性标记的具有N，O-环状氨基甲酸酯的三糖的制备。
图11和12：用经FITC标记的GS1B4对细胞涂片进行的染色。
发明详述
如上面所提及的，本发明尤其涉及用于制备糖-肽缀合物的方法，所述方法包括使环状氨基甲酸酯(4)
Figure GPA00001088319900041
其中R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；并且R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数；
与肽反应的步骤，所述肽包含至少一个伯氨基基团。
生物学和化学实体的化学修饰是最重要的反应之一，其可以提供以新的物理、化学、生物学和生理学特性为特征的产物。生物聚合物和生物学实体的最所希望的结构修饰之一是糖基化。糖缀合物是给肽/蛋白质和生物学细胞表面提供新特性的天然结构。例如，糖-肽缀合物可以稳定所考虑的肽(例如，蛋白质)的最佳构象，从而保持所希望的功能。糖-肽缀合物还可以表现出蛋白质的增加的半寿期、水溶性和提高的稳定性。共价连接的糖还可以作为病毒、原核细胞和真核细胞表面上的免疫决定簇。已知几种糖部分抑制微生物的粘附，而其他的担当用于结合微生物的受体。因此，糖缀合物在病毒和细菌感染中发挥着重要的作用，并且某些衍生物可以用作抗感染剂。
因此，在本文中，术语“糖-肽缀合物”意指糖和肽的缀合物，例如在下文中通过通式1和2的缀合物所概括的(参见进一步的下文)。应当理解，缀合物包含一个或多个糖部分以及肽部分。此类糖部分本身可以是单糖、二糖或寡糖。
实际上，术语“糖部分”(也称为糖基部分)，当在本文中使用时，意在包括(但不限于)衍生化的和未衍生化的单糖、二糖、寡糖、N-糖苷、S-糖苷和C-糖苷。糖部分可以具有由单糖单元组成的线性或支化的(通常高度支化的)结构。一些较大量使用的单糖单元包括葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰-神经氨酸等。
术语“肽”，当在本文中使用时，意在包括较小的肽，例如具有最少5个氨基酸单元的寡肽，和直到具有最少30个氨基酸单元的多肽和蛋白质。通常，肽/肽部分包含总共至少30个氨基酸单元，通常是通过酰胺键(肽键)连接在一起的α-氨基酸。在更令人感兴趣的实施方案中，氨基酸单元的总数目通常为至少60，例如至少100，或者至少150。较大的肽/肽部分甚至可以由两个或更多个对于生物学上有活性的肽/蛋白质例如酶、治疗上相关的蛋白质等的形成来说相关的结构域组成。
环状氨基甲酸酯(4)代表了用于形成糖-肽缀合物的关键试剂。
在该环状氨基甲酸酯中，R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；此外，R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数。
应当理解，在最引人兴趣的实施方案中，环状氨基甲酸酯代表二糖、三糖或寡糖，即R3、R4和X中的至少一个表示糖部分。
作为环状氨基甲酸酯化合物的令人感兴趣的变体的例子，可以提及在二糖和寡糖的还原端的1，2-N，O-位置处具有环状氨基甲酸酯部分的化合物(4a)、(4b)和(4c)：
Figure GPA00001088319900061
其中，R6和R7如上面对于R3和R4所定义的，R9如上面对于R5所定义的，并且R8和R10独立地选自羟基、C1-6-烷氧基、C2-20-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。
术语“C1-6-烷氧基”表示“C1-6-烷基-氧基”，其中“C1-6-烷基”意指具有1至6个碳原子的线性或支化的烃基团，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基。
术语“C2-20-酰氧基”表示“C1-19-烷基-C(＝O)-O-”，其中“C1-19-烷基”意指具有1至19个碳原子的线性或支化的烃基团，例如乙酰氧基、乙基羰基氧基、丙基羰基氧基、异丙基羰基氧基、丁基羰基氧基、戊基羰基氧基、辛基羰基氧基等，以及其不饱和的变体，例如其中“C2-20-酰氧基”具有含义“C1-19-烯基-C(＝O)-O-”、“C1-19-二烯基-C(＝O)-O-”、“C1-19-三烯基-C(＝O)-O-”、“C1-19-四烯基-C(＝O)-O-”、“C1-19-炔基-C(＝O)-O-”等的那些，等等。
环状氨基甲酸酯与肽之间的反应
在本文中相关的肽是具有至少一个可以与环状氨基甲酸酯进行反应的伯氨基基团的那些肽。将会意识到，有些肽包含几个伯胺，例如源自赖氨酸单元的侧链伯胺和源自各种氨基酸(但将脯氨酸排除在外)的N-末端伯胺。
使环状氨基甲酸酯(4)与肽反应的步骤牵涉在促进一个或多个伯氨基基团和相应数目的环状氨基甲酸酯分子之间的反应的条件下使所述种类相接触。
连接反应可以通过下面的反应流程来举例说明，其中(4)表示1，2-N，O-环状氨基甲酸酯(R3、R4和R5如上所定义)和(2)表示肽(E1)的一个伯氨基基团(H2N)，和所得的糖-肽缀合物由(3)表示：
糖环状氨基甲酸酯(4)与在肽/蛋白质、生物学实体等(2)中存在的伯胺的N-亲核体的开环反应是该新型连接方法的关键化学。在环状氨基甲酸酯(4)以反式-反式稠合的二环体系为特征的情况下，连接变得非常强有力。这样的极具张力的环体系倾向于通过开环过程来稳定化。诸如(4)的环状氨基甲酸酯的制备将在后面进行讨论。
通常，糖类的相应的环状氨基甲酸酯与表现出伯氨基基团的化学和生物学实体的化学选择性和位点选择性新型连接反应在酸性、中性或碱性反应条件中，在0-40℃的温度范围内，在有机或水性溶液中进行。包括但不限于下列的溶剂可以用于此类化学转化：甲醇、水、乙醇、丙酮、甲苯、苯、1，4-二噁烷、DMF、吡啶等及其混合物。为了控制pH、催化过程和位点选择性，碱性物质例如无机/有机碱(尤其是N，N-二异丙基乙胺、三乙胺等)及其盐在取代过程中可以是优选的。可以使用酸性物质，例如无机/有机酸，优选地，HCl、乙酸、甲酸等，及其盐例如NaH2PO4。通常，取决于底物的结构、所设置的温度和糖的环状氨基甲酸酯，取代的反应时间在3至24小时之间变化。通常，以80至95％的产率获得经缀合的糖缀合物产物。
重要的是强调，N-末端和赖氨酸侧链取代之间的位点选择性可以通过pH调整和设定适当的反应条件而容易地保持。因此，在pH 4-7下进行的连接反应通常展示出优异的N-末端选择性。在较高pH 8-10下的缀合主要提供赖氨酸侧链经修饰的产物。所述新型连接在pH 7下在水中进行，而不需添加任何碱/酸或任何其他活化试剂。此外，所得的产物具有天然的糖基脲键，其不能被认为对生命体系是毒性的或有害的。
因此，在根据本发明的方法的一个实施方案中，反应在极性溶剂例如水中进行。
在根据本发明的方法的某些实施方案中，所述反应在6.5-10.5的范围内的pH下进行。备选地，所述反应在4.7-7.0的范围内的pH下进行以促进在N-末端处的选择性连接，或者在8.0-10.0的范围内的pH下进行以促进在赖氨酸侧链处的选择性连接。
所述方法可应用于任何类型的肽，例如单链肽、多链肽、折叠的肽、聚集的肽、细胞表面结合蛋白、细胞膜结合蛋白等。
在一个特别令人感兴趣的实施方案中，所述肽是细胞表面或细胞膜结合蛋白。
该方法产生了大量的新的糖-肽缀合物，优选地包括下面进一步定义和描述的那些(参见“新的糖-肽缀合物”)。
新的糖-肽缀合物
一类新的糖-肽缀合物是由通式1所定义的那些，其中一个或多个糖部分通过其糖苷位置经由羰基接头而连接至肽/蛋白质的赖氨酸残基的ε-氨基官能团。
因此，本发明还涉及糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式1的部分，和其药学上可接受的盐：
Figure GPA00001088319900091
其中
R1和R2连同间插性赖氨酸部分一起表示肽部分；
R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；
R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数。
关于此的例子是这样的糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式1a、1b和1c中任一个的部分，
Figure GPA00001088319900092
Figure GPA00001088319900101
其中，R6和R7如上面对于R3和R4所定义的，且R9如上面对于R5所定义的，并且R8选自羟基、C1-6-烷氧基、C2-20-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。
另一类新的糖-肽缀合物是由通式2所定义的那些，其中糖部分通过其糖苷位置经由羰基接头而连接至肽/蛋白质的N-末端氨基官能团。
因此，本发明还涉及糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式2的部分，和其药学上可接受的盐：
Figure GPA00001088319900102
其中
R11是氨基酸侧链；
R2连同-NH-CHR11-C(＝O)-一起表示氨基酸单元总数目为至少30的肽部分；
R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；
R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数。
关于此的例子是这样的糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式2a、2b和2c中任一个的部分，
Figure GPA00001088319900111
其中，R6和R7如上面对于R3和R4所定义的，R9如上面对于R5所定义的，并且R8选自羟基、C1-6-烷氧基、C2-20-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。
应当理解，上述类别的由通式1和通式2所表示的糖-肽缀合物是部分重叠的，因为可以容易地想象：一个或多个糖部分通过其糖苷位置经由羰基接头而连接至肽的赖氨酸残基的ε-氨基官能团；以及在同一肽内，糖部分通过其糖苷位置经由羰基接头而连接至肽的N-末端氨基官能团。所述肽可以，如果其由两条或更多条链组成，甚至具有两个或更多个N-末端连接的糖部分。
在一些最引人兴趣的实施方案中，所述肽是细胞表面或细胞膜结合蛋白。
术语“氨基酸侧链”意指通常包含在肽(包括合成肽)中的氨基酸的侧链基团，并且不限于大约20种必需氨基酸。氨基酸侧链的例子为氢(表示甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、2-丙基(缬氨酸)、2-甲基-1-丙基(亮氨酸)、2-丁基(异亮氨酸)、甲硫基乙基(甲硫氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、3-吲哚基甲基(色氨酸)、羟甲基(丝氨酸)、1-羟基乙基(苏氨酸)、巯基甲基(半胱氨酸)、4-羟基苄基(酪氨酸)、氨基羰基甲基(天冬酰胺)、2-氨基羰基乙基(谷氨酰胺)、羧甲基(天冬氨酸)、2-羧基乙基(谷氨酸)、4-氨基-1-丁基(赖氨酸)、3-胍基-1-丙基(精氨酸)和4-咪唑基甲基(组氨酸)。
术语“药学上可接受的盐”意在包括酸加成盐和碱式盐。酸加成盐的举例说明性例子为与无毒性的酸形成的药学上可接受的盐。此类有机盐的例子为与下列酸形成的那些盐：马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、草酸、亚甲基双水杨酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、乙酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、肉桂酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、衣康酸、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸和茶碱乙酸，以及8-卤代荼碱，例如8-溴荼碱。此类无机盐的例子为与下列酸形成的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸。碱式盐的例子为这样的盐，其中(其余的)抗衡离子选自：碱金属，例如钠和钾；碱土金属，例如钙；和铵离子(+N(R)3R′，其中R和R′独立地表示任选地经取代的C1-6-烷基、任选地经取代的C2-20-烯基、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基)。药学上可接受的盐为，例如，在Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版.Alfonso R.Gennaro(编辑)，MackPublishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更近版本中以及在Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中所描述的那些。因此，本文中所使用的术语“酸加成盐和其碱式盐”意在包括这样的盐。此外，所述化合物以及任何中间体或起始材料还可以以水合物的形成存在。
此外，应当理解，所述化合物可以作为外消旋混合物或者单独的立体异构体例如对映异构体或非对映异构体而存在。本发明包括每一种此类可能的立体异构体(例如对映异构体和非对映异构体)以及外消旋物和就可能的立体异构体之一而言丰富的混合物。
环状氨基甲酸酯的制备
环状氨基甲酸酯衍生物(4)(以及(4a)、(4b)和(4c))的制备基于在三烷基/芳基膦存在下用二氧化碳处理相应的糖基叠氮化物或相应的其他叠氮基-脱氧-寡糖衍生物。通常，反应在中性反应条件下于0-40℃的温度范围下在无水有机溶液中进行。包括但不限于下列的溶剂可以用于此类化学转化：丙酮、甲苯、苯，1，4-二噁烷、DMF、四氢呋喃等及其混合物。取决于底物的结构、所设置的温度和所使用的三烷基/芳基膦的性质，环状氨基甲酸酯形成的反应时间通常在3至24小时之间变化。通常，以80至95％的高产率获得环状氨基甲酸酯产物。
备选地，环状氨基甲酸酯衍生物(4)(以及(4a)、(4b)和(4c))的制备基于用三烷基/芳基膦处理相应的糖基叠氮化物或相应的其他叠氮基-脱氧-寡糖衍生物，其牵涉膦亚胺衍生物的分离。在第二步中，使膦亚胺衍生物与二氧化碳反应，从而提供所希望的寡糖的环状氨基甲酸酯。通常，反应在中性反应条件下于0-40℃的温度范围下在无水有机溶液中进行。包括但不限于下列的溶剂可以用于此类化学转化：丙酮、甲苯、苯、1，4-二噁烷、DMF、四氢呋喃等及其混合物。取决于所使用的三烷基/芳基膦的性质，膦亚胺形成的反应时间为3-10小时。取决于底物的结构、所设置的温度，环状氨基甲酸酯的形成通常在3至24小时之间变化。通常，以80至95％的高产率获得环状氨基甲酸酯产物。
备选地，环状氨基甲酸酯衍生物(4)(以及(4a)、(4b)和(4c))的制备牵涉用光气或其他合适的光气衍生物(例如双光气或三光气)处理相应的糖基胺或其他氨基-脱氧-寡糖。通常，反应在中性或碱性反应条件下于0-40℃的温度范围下在有机或水性溶液中进行。包括但不限于下列的溶剂可以用于此类化学转化：水、丙酮、甲苯、苯、1，4-二噁烷、DMF、四氢呋喃、吡啶等及其混合物。取决于底物的结构和所设置的温度，环状氨基甲酸酯的形成通常在3至24小时之间变化。通常，以80至95％的高产率获得环状氨基甲酸酯产物。
备选地，环状氨基甲酸酯衍生物(4)(以及(4a)、(4b)和(4c))的制备基于用碱例如氢化钠或DBU处理相应的无环氨基甲酸酯衍生物，从而引发分子内环闭合程序。通常，反应在碱性反应条件下于0-40℃的温度范围下在无水有机溶液中进行。包括但不限于下列的溶剂可以用于此类化学转化：甲苯、苯、1，4-二噁烷、DMF、四氢呋喃等及其混合物。取决于底物的结构和所设置的温度，环状氨基甲酸酯的形成通常在3至24小时之间变化。通常，以80至95％的高产率获得环状氨基甲酸酯产物。
重要的是强调，环状氨基甲酸酯衍生物(4)(以及(4a)、(4b)和(4c))在几种反应条件下显示出优异的稳定性，从而允许广泛的化学衍生化，例如O-酰化、O-烷基化、环状缩醛形成、环状缩酮形成、未经保护的衍生物的氢解。这样的独特选择扩展了环状氨基甲酸酯连接探针的用处，并且可以用于将众多的衍生化实体连接至肽/蛋白质、生物学实体和复杂的化学实体。
相信，寡糖的环状氨基甲酸酯(4a)、(4b)和(4c)，即
Figure GPA00001088319900141
Figure GPA00001088319900151
其中R6和R7如上面对于R3和R4所定义的，并且R9如上面对于R5所定义的；R8和R10独立地选自羟基、C1-6-烷氧基、C1-6-酰氧基、乙酰氨基和糖部分，是如此地新，并因此本发明还涉及这样的实体，其在通式2a、2b、2c、3a、3b和3c的化合物的制备中是有用的，尤其是作为中间体。
糖-肽缀合物的用途
一般地，本文所定义的糖-肽缀合物的用途为用作药物、诊断试剂或在诊断试剂盒中使用。
特别地，相信本文所定义和描述的糖-肽缀合物(包括根据本文所定义和描述的方法而制备的那些)在医学领域内提供了大量的可能性。
在一种变化形式中，糖-肽缀合物的糖基部分(糖部分)表示非免疫原性的糖。
在一个优选的实施方案中，可以将几种非免疫原性的糖例如葡聚糖、麦芽糖糊精、麦芽糖、纤维二糖、全-O-甲基化的寡糖、硫-联寡糖缀合至治疗性肽/蛋白质，以增加后者的半寿期并提供有益的物理、生物学和生理学特性，例如增加的溶解度、热稳定性和酶学稳定性等。
在另一种变化形式中，糖-肽缀合物的糖基部分(糖部分)表示免疫原性的糖。
在该变化形式中，可以将几种免疫原性的糖，例如ABO血型抗原、Lewis型抗原、肿瘤特异性抗原、α-Gal-表位、α-甘露糖基-表位、多聚唾液酸，缀合至：
-肽/蛋白质，以便通过主动疫苗接种来下调特定的肽/蛋白质。
-病毒(活的、灭活的或病毒颗粒)，例如HIV、乙型肝炎病毒、疱疹病毒、流感病毒、禽流感病毒等，以便制备针对感染的疫苗。
-细菌，例如分枝杆菌(Mycobacterium)、螺杆菌(Heliobacter)等，以便制备抗细菌的疫苗。
-肿瘤细胞，以便改变免疫学特性并通过自身癌症疫苗接种来产生强的免疫应答。
-癌细胞膜，以便制备自身肿瘤疫苗。
在进一步的实施方案中，可以将亲脂性寡糖用于通过附着至白蛋白来增加肽/蛋白质的稳定性。
实施例
部分1：连接
实施例1：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(参见图1)。通过添加三乙胺和乙酸将pH调整至
Figure GPA00001088319900161
将混合物在室温下保持4小时，并且随后将反应混合物转移至透析膜中并逆蒸馏水透析2天，然后进行冻干，从而获得作为白色粉末的3。
质谱法：MALDI-TOF：糖基化的BSA 68333，BSA参照：66134。
实施例2：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(参见图1)。通过添加三乙胺和乙酸将pH调整至
Figure GPA00001088319900171
将混合物在室温下保持4小时，并且随后将反应混合物转移至透析膜中并逆蒸馏水透析2天，然后进行冻干，从而获得作为白色粉末的3。
质谱法：MALDI-TOF：糖基化的BSA 69099，BSA参照：66134。
实施例3：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(参见图1)。通过添加三乙胺和乙酸将pH调整至
Figure GPA00001088319900172
将混合物在室温下保持4小时。将反应混合物转移至透析膜中并逆蒸馏水透析2天，然后进行冻干，从而获得作为白色粉末的3。
质谱法：MALDI-TOF：糖基化的BSA 68329，BSA参照：66134。
实施例4：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(参见图1)。通过添加三乙胺和乙酸将pH调整至
Figure GPA00001088319900173
将混合物在室温下保持4小时。将反应混合物转移至透析膜中并逆蒸馏水透析2天，然后进行冻干，从而获得作为白色粉末的3。
质谱法：MALDI-TOF：糖基化的BSA 67679，BSA参照：66134。
实施例5：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(10mg)和人胰岛素4(50mg)溶解在水(13mL)中(参见图2)。通过添加二异丙基-乙胺和水性NaH2PO4将pH调整至
Figure GPA00001088319900174
将混合物在室温下保持2.5小时，然后将反应混合物冻干，从而以大于90％的位点选择性获得B29糖基化的胰岛素5。
质谱法：MALDI-TOF：B-29-糖基化的人胰岛素：6171，人胰岛素：5805。
实施例6：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(10mg)和人胰岛素4(50mg)溶解在水(13mL)中(参见图2)。通过添加二异丙基-乙胺和水性NaH2PO4将pH调整至
Figure GPA00001088319900181
将混合物在室温下保持2.5小时，然后将反应混合物冻干，从而提供经修饰的胰岛素(5)。
质谱法：MALDI-TOF：糖基化的人胰岛素：6171，人胰岛素：5804。
实施例7：
将麦芽糖基环状氨基甲酸酯1(10mg)和人胰岛素4(50mg)溶解在水(13mL)中(参见图2)。通过添加二异丙基-乙胺和水性NaH2PO4将pH调整至
Figure GPA00001088319900182
将混合物在室温下保持2.5小时，然后将反应混合物冻干，从而以大于90％的位点选择性获得B-1糖基化的人胰岛素5。
质谱法：MALDI-TOF：B-1-糖基化的人胰岛素6171，人胰岛素：5804。
实施例8：
在PBS缓冲液(5ml)中混合α-Gal表位-环状氨基甲酸酯6(二糖)(25mg)和人乳腺癌细胞系7(2×106的细胞数目)(参见图3)。将混合物在37℃下保持3小时，然后对混合物进行离心以将细胞与介质分开。
用经荧光标记的凝集素处理所述经修饰的细胞，并通过流式细胞术来证实所述修饰。
实施例9：
在PBS缓冲液(5ml)中混合α-Gal表位-氨基甲酸酯6(二糖)(25mg)和人乳腺癌细胞系7(1×106的细胞数目)(参见图3)。将混合物在37℃下保持3小时，然后对混合物进行离心以将细胞与介质分开。
用经荧光标记的凝集素处理所述经修饰的细胞，并通过流式细胞术来证实所述修饰。
实施例10：
在PBS缓冲液(5ml)中混合α-Gal表位-氨基甲酸酯6(二糖)(25mg)和人乳腺癌细胞系7(5×105的细胞数目)(参见图3)。将混合物在37℃下保持3小时，然后对混合物进行离心以将细胞与介质分开。
用经荧光标记的凝集素处理所述经修饰的细胞，并通过流式细胞术来证实所述修饰。
从实施例11至实施例15，化合物9称为“三糖探针(trisaccharideprobe)”。参见图4。在实施例14和15中，带有记号的碳原子用C13同位素进行标记。
实施例11：
将三糖探针缀合至B16BL6细胞系
细胞的准备
对于该实验，使用两瓶(300cm2)(TPP，Trasadingen Switzerland)汇合的B16.BL6黑素瘤细胞，所述B16.BL6黑素瘤细胞于37.5℃在5％CO2中在含有10％胎牛血清(无P/S)的DMEM中生长。从细胞中除去生长培养基，并且向细胞中添加25mL PBS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)并立即再次除去。添加另外10mL PBS并除去，然后用Cell Dissociation Solution C5914(Sigma-aldrich，Saint Louis，Missouri)(3mL/瓶)收获细胞并转移到10mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。细胞于20℃以300G离心5分钟，并弃去上清液。随后，在PBS(无Mg2+和Ca2+)中洗涤细胞，如上述那样进行离心，并重悬浮在PBS(无Mg2+和Ca2+)中。测定细胞悬浮液的浓度。
将α-gal表位缀合至B16.BL6黑素瘤细胞
将500mg α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)溶解在PBS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并通过无菌滤器(Sartorius
Figure GPA00001088319900201
0.20my)(Sartorius，Goettingen，Germany)。制备8种不同浓度的缀合物。将2mL的每种缀合物稀释物添加到具有2mL PBS(无Mg2+和Ca2+)和600μl含106个B16.BL6细胞的细胞悬浮液的瓶中。瓶中的终体积为4.6mL。将瓶编号为1至10。瓶1和10不含缀合物并用作对照。将细胞与缀合物在37℃和5％CO2下温育3小时25分钟。
在缀合后，用10mL的Cell Dissociation Solution C5914(Sigma-Aldrich，Saint Louis，Missouri)收获来自缀合反应1(未缀合的细胞)、2、4、6和8的细胞并转移到10mL管(TPP，TrasadingenSwitzerland)中。细胞于20℃以300G离心5分钟，并重悬浮在PBS(无Mg2+和Ca2+)中。最后，如前述那样离心细胞，并重悬浮在含1％BSA的100μl TBS中。通过经锥虫蓝染色的细胞样品的显微术评价来测定细胞的浓度和生存力。次日，如上面所描述的那样收获来自缀合反应3、5、7、9和10(未缀合的细胞)的细胞。细胞于20℃以300G离心一次5分钟，并重悬浮在含1％BSA的100μl TBS中。通过经锥虫蓝染色的细胞样品的显微术评价来测定细胞的浓度和生存力。
用经FITC标记的GS1B4对细胞涂片进行染色
将来自缀合反应1(未缀合的对照细胞)、2、4、6和8的细胞的涂片与在TBS中以1∶200稀释的经FITC标记的GS1B4一起在室温下温育1小时。在TBS中进行漂洗之后，将一滴Fluorescent MountingMedium(DAKO)放置在每一个细胞样品上并在上面放上盖玻片。通过荧光显微术来评估经FITC标记的GS1B4与在经缀合的细胞上的Galα1，3Gal的结合。
流式细胞术分析
通过流式细胞术来分析来自缀合反应1(未缀合的细胞)、2、4、6和8的B16.BL6细胞。将100μL包含1×105个细胞的细胞悬浮液与10μg/mL(1∶100稀释度)的在含1％BSA的TBS中的经FITC标记的GS1B4一起于4℃温育15分钟。通过流式细胞术来测定经染色的细胞的比例、平均的细胞荧光强度和中值的细胞荧光强度。然后，将细胞在PBS中洗涤一次，并重复进行测量。使用已知表达～2×106Galα1，3Gal表位/细胞的兔红细胞(RRBC)用于进行比较。经缀合的B16.BL6细胞和RRBC的分析在不同日进行。
在缀合后的细胞的浓度和生存力
在缀合程序结束时，对于所有缀合反应，通过锥虫蓝染色所评估的细胞的数目和生存力均显著地降低。然而，观察到在不同缀合反应之间的相当大的变化。从每个缀合反应获取100μl至130μl的体积的细胞悬浮液。
表1.在缀合后的细胞的浓度和生存力
  反应   缀合物   细胞浓度   细胞生存力
  1   无   2.50×106个细胞/mL   24.8％
  2   200mg   3.50×106个细胞/mL   58.9％
  3＊   100mg   3.08×106个细胞/mL   65.6％
  4   50mg   3.16×106个细胞/mL   1.9％
  5＊   20mg   1.90×106个细胞/mL   0.0％
  6   10mg   2.26×106个细胞/mL   16.8％
  7＊   5mg   2.02×106个细胞/mL   34.7％
  8   2mg   2.22×106个细胞/mL   8.1％
  9＊   1mg   2.12×106个细胞/mL   16.0％
  10＊   无   2.34×106个细胞/mL   20.5％
＊)在缀合程序后1天测得的细胞的浓度和生存力
表2.在缀合后的细胞生存力
Figure GPA00001088319900221
用经FITC标记的GS1B4对细胞涂片进行染色
在来自所有所测试的缀合反应(缀合反应2、4、6和8)的细胞上发现了Galα1，3Gal表位，其通过经FITC标记的GS1B4的结合来检测。没有任何未缀合的细胞(缀合反应1)被染色。
参见图11和12。
流式细胞术
在来自所有所测试的缀合反应(缀合反应2、6和8)的B16.BL6细胞上发现了Galα1，3Gal表位，其通过经FITC标记的GS1B4的结合来检测。没有任何未缀合的对照细胞(缀合反应1)被染色。对于所述缀合反应中的每一个，测定具有可检测量的Galα1，3Gal-表位的细胞的比例。
表3.具有可检测量的Galα1，3Gal-表位的细胞
 缀合反应   用FITC-GS1B4作上了标记的细胞
 0(RRBC＊)   94.23％
 1(未缀合的细胞)   0.00％
 2   95.82％
 6   62.17％
 缀合反应   用FITC-GS1B4作上了标记的细胞
 8   56.82％
测量了在其表面上具有可检测量的Galα1，3Gal-表位的细胞的荧光强度。结果强烈地表明，在经缀合的细胞上的Galα1，3Gal-表位的数目大大高于已知存在于兔红细胞上的～2×106Galα1，3Gal表位。下面显示了经洗涤的和未经洗涤的细胞的细胞荧光强度的平均值和中值。
表4.荧光强度，未经洗涤的细胞
  缀合反应   平均荧光强度   中值荧光强度
  0(RRBC＊)   38.17   36.52
  1(未缀合的细胞)   8.19   8.43
  2   726.72   523.30
  6   862.24   798.63
  8   594.99   572.55
＊)已知兔红细胞表达～2×106Galα1，3Gal表位/细胞
在来自缀合反应2的经缀合的B16.BL6黑素瘤细胞上的Galα1，3Gal表位的可视化。用与细胞表面上的Galα1，3Gal表位相结合的经FITC标记的GS1B4，细胞膜被深重地染色。
表5.荧光强度，经洗涤的细胞
 缀合反应   平均荧光强度   中值荧光强度
 1(未缀合的细胞)   14.9   3.68
 2   447.48   321.97
 6   439.04   406.79
 8   264.30   259.45
表6.荧光强度，未经洗涤的细胞
实施例12：
将α-Gal三糖-氨基甲酸酯探针缀合至B16BL6细胞系
减少缀合时间：
细胞的准备
参见实施例11。
将α-gal表位缀合至B16.BL6黑素瘤细胞
将α-Gal三糖-氨基甲酸酯探针(9)溶解在PBS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)和HBSS(含D-葡萄糖)(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并通过灭菌滤器(Sartorius
Figure GPA00001088319900242
0.20my)(Sartorius，Goettingen，Germany)。在PBS和HBSS中均制备3种不同浓度的三糖探针。
准备8个小瓶(25cm2)(TPP，Trasadingen Switzerland)，每瓶包含106个B16.BL6细胞，并添加三糖探针。瓶中的总体积为4.6mL。将细胞与缀合物在37℃和5％CO2下温育1小时。
表7.缀合反应
缀合反应  所添加的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9) 温育缓冲液 温育时间
  P0   对照(无缀合物)   PBS   1小时
  PA   16mg   PBS   1小时
缀合反应  所添加的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9) 温育缓冲液 温育时间
  PB   2mg   PBS   1小时
  PC   1mg   PBS   1小时
  H0   对照(无缀合物)   HBSS(含D-葡萄糖)   1小时
  HA   16mg   HBSS(含D-葡萄糖)   1小时
  HB   2mg   HBSS(含D-葡萄糖)   1小时
  HC   1mg   HBSS(含D-葡萄糖)   1小时
在缀合后，将来自每个瓶的上清液转移到分开的10mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。用Cell Dissociation Solution(2mL/瓶)(Sigma-aldrich，Saint Louis，Missouri)收获细胞，并转移到10mL管中。细胞于20℃以300G离心5分钟，并重悬浮在0.5mL PBS或HBSS中。通过经锥虫蓝染色的细胞样品的显微术评价来测定细胞的浓度和生存力。
在与三糖探针温育1小时后，大多数细胞是活的并且贴附至瓶的底表面。但是，非常难以收获这些细胞，并且它们中的大多数在该程序过程中丧失了。
表8.细胞生存力
  缀合反应   所收获的细胞的生存力
  P0   34.6％
  PA   14.3％
  PB   32.0％
  PC   37.5％
  H0   27.8％
  HA   33.3％
  HB   41.7％
  HC   41.6％
表9.细胞生存力
Figure GPA00001088319900261
实施例13：
将α-Gal三糖-氨基甲酸酯探针(9)缀合至B16BL6细胞系减少缀合时间：
细胞的准备
参见实施例11。
将α-gal表位缀合至B16.BL6黑素瘤细胞
将α-Gal三糖探针(9)溶解在HBSS(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并通过无菌滤器(0.2μm
Figure GPA00001088319900262
13，GelmanSciences，Ann Arbor，Michigan)。制备3种不同浓度的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)。准备5个小瓶，其具有606μL的包含总共106个B16.BL6细胞的细胞悬浮液以及4mL的所述缀合物溶液之一。每瓶包含4.6mL的总体积。将细胞与“Glycom缀合物”在37℃下温育3或1.5小时。
表10.缀合反应
  缀合反应   “Glycom缀合物”   温育时间
  1   19.2mg   3小时
  2   19.2mg   1.5小时
  3   1.9mg   1.5小时
  4   58mg   1.5小时
  5   对照(无缀合物)   1.5小时
在缀合后，将来自每个瓶的上清液转移到分开的10mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。通过向瓶中添加PBS并立即再次除去来洗涤细胞。用Cell Dissociation Solution(2mL/瓶)(Sigma-aldrich，Saint Louis，Missouri)来收获细胞。在5分钟后，将细胞转移到10mL试管中。细胞于20℃以300G离心5分钟，并重悬浮在0.5mL PBS中。通过经锥虫蓝染色的细胞样品的显微术评价来测定细胞的浓度和生存力。
流式细胞术分析
来自缀合反应1的细胞：
将100μL包含1×105个细胞的细胞悬浮液与10μg/mL(1∶100稀释度)的在PBS中的经FITC标记的GS1B4一起于4℃温育15分钟。使用兔红细胞(A)用于进行比较。
来自缀合反应2、3、4和5的细胞：
因为可用于流式细胞术分析的细胞非常少，所以没有测定准确的细胞浓度。取而代之，估计所使用的细胞的量为0.4×105。将细胞与4μg/mL的在PBS中的经FITC标记的GS1B4一起于4℃温育15分钟。使用兔红细胞(B)用于进行比较。
通过流式细胞术来测定平均和中值细胞荧光强度。
流式细胞术分析
在来自所有缀合反应的B16.BL6细胞上发现了Galα1，3Gal表位，其通过经FITC标记的GS1B4的结合来检测。来自缀合反应2和4的细胞的分析显示出了具有不同细胞荧光强度的两个细胞群。由未缀合的细胞(缀合反应5)的荧光强度值所指明的相对高的背景染色可能是由于因高估了所使用的细胞数目从而造成所添加的经FITC标记的GS1B4大大过量而引起的。
表11.荧光强度，来自缀合反应1的细胞
  缀合反应   平均荧光强度   中值荧光强度
  RRBC(A)＊   30.3   29.1
  1   197.8   155.4
＊)已知兔红细胞表达～2×106Galα1，3Gal表位/细胞    13
表12.荧光强度，来自缀合反应2、3、4和5的细胞
缀合反应   平均荧光强度   中值荧光强度
RRBC(B)＊   25.9   23.7
2(62.7％的细胞)＊＊   161.63   125.2
2(35.3％的细胞)＊＊   2940.2   2196.8
3   167.8   66.4
4(84.26％的细胞)   49.2   44.1
缀合反应   平均荧光强度   中值荧光强度
4(15.65％的细胞)   770.0   504.8
5(未缀合的细胞)   39.56   32.2
＊)已知兔红细胞表达～2×106Galα1，3Gal表位/细胞
＊＊)从缀合反应2和4中均观察到具有不同荧光强度的两组细胞，因此值是对于这两个组而给出的
实施例14：
将放射性探针缀合至B16BL6细胞系
该实验的目的是估计缀合至B16.BL6黑素瘤细胞的Galα1，3Gal表位的数目，以及比较通过闪烁测量术和流式细胞术所获得的结果。
细胞的准备
对于该实验，使用9瓶(300cm2)(TPP，Trasadingen Switzerland)汇合的B16.BL6黑素瘤细胞，所述B16.BL6黑素瘤细胞于37.5℃在5％CO2中在含有10％胎牛血清(无P/S)的DMEM中生长。从细胞中除去生长培养基，并且向细胞中添加20mL含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)并立即再次除去。添加另外10mL含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)并除去，然后用Cell Dissociation Solution C5914(Sigma-aldrich，SaintLouis，Missouri)(10mL/瓶)收获细胞并转移到50mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。细胞于20℃以300G离心3分钟，并弃去上清液。随后，在含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)中洗涤细胞两次，如上述那样进行离心，并重悬浮在含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)中。测定细胞悬浮液的浓度。
将Galα1，3Gal表位缀合至B16.BL6黑素瘤细胞
将经放射性标记的和常规的三糖探针溶解在含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco，Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并通过无菌滤器(0.2μm
Figure GPA00001088319900291
13，Gelman Sciences，Ann Arbor，Michigan)。制备4种不同浓度的每种“Glycom缀合物”(25mg、5mg、1mg和0.1mg)。准备12个瓶(150em2)(TPP，Trasadingen Switzerland)，每个瓶包含总共10×106个B16.BL6细胞。添加三糖探针，并用含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)将总体积调整至20mL。将细胞与“Glycom缀合物”在37℃下温育1.5小时。在缀合后，将来自每个瓶的上清液转移到分开的50mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。用Cell Dissociation SolutionC5914(5mL/瓶)(Sigma-Aldrich，Saint Louis，Missouri)来收获细胞，并转移到含有上清液的50mL管中。细胞于20℃以300G离心3分钟，并重悬浮在5mL PBS(无Mg2+和Ca2+)中。这重复3次，随后通过经锥虫蓝染色的细胞样品的显微术评价来测定细胞的浓度和生存力。
闪烁测量术
用经放射性标记的三糖探针进行缀合的细胞于20℃以1000G离心5分钟。排出上清液，并使剩余的粒状沉淀干燥。随后，将粒状沉淀溶解在400μl Mili-Q H2O中，并添加1.5mL闪烁液。通过向3个对照细胞样品中添加500pCi、0.5pCi和0pCi来制备关于所述闪烁测量术的标准。将样品在室温下贮存3天，随后将细胞悬浮液转移至闪烁管并进行计数。
流式细胞术分析
通过流式细胞术来分析用常规的三糖探针进行缀合的细胞。将400μl包含2×105个细胞的每种细胞悬浮液与10μg/mL的经FITC标记的GS1B4一起于4℃温育15分钟。通过流式细胞术来测量用GS1B4染色的细胞的平均荧光强度。
在缀合后的细胞的浓度和生存力
在收获程序过程中，意外地合并了两个不同级分的具有经放射性标记的三糖探针的细胞，因此不得不排掉。因此，从这些缀合反应获得的结果与其余的是不可比较的。另外，对于包含用0.1mg经放射性标记的三糖探针进行缀合的细胞的悬浮液，获取到了异常的体积。如在先前的初步实验中所观察到的，所收获的细胞的量和细胞生存力在与不同浓度的缀合物进行温育的细胞之间，以及在与常规的缀合物和与经放射性标记的缀合物进行温育的细胞之间都发生变化。
表13.用常规的缀合物进行缀合的细胞
  所添加的缀合物   细胞浓度＊   生存力＊   所收获的细胞＊
  0mg(对照)   5.0×105   76.0％   2.5×106(25％)
  25mg   9.0×105   77.8％   4.5×106(45％)
  5mg   7.0×105   91.4％   3.5×106(35％)
  1mg   13.4×105   79.1％   6.7×106(67％)
  0.1mg   7.4×105   67.6％   3.7×106(37％)
＊)在α-gal缀合后所估计的
表14.用经放射性标记的缀合物进行缀合的细胞
  所添加的缀合物   细胞浓度＊   生存力＊   所收获的细胞＊
  0mg(对照1)   13.8×105   87.0％   6.9×106(69％)
  0mg(对照2)   12.6×105   90.5％   6.3×106(63％)
  0mg(对照3)   11.4×105   87.8％   5.7×106(57％)
  25mg＊＊   2.0×105   90.0％   1.0×106(10％)
  5mg＊＊＊   10.8×105   81.5％   5.4×106(54％)
  所添加的缀合物   细胞浓度＊   生存力＊   所收获的细胞＊
  1mg   14.8×105   93.2％   7.4×106(74％)
  0.1mg   13.8×105   91.3％   6.9×106(69％)
＊)在α-gal缀合后所估计的
＊＊)仅贴附的细胞
＊＊＊)仅来自上清液的细胞
流式细胞术
如在先前的初步实验中所观察到的，仅经缀合的细胞的级分结合了可检测量的经FITC标记的GS1B4。用1mg进行缀合的细胞的平均荧光强度出乎意料地低，而对于其余的缀合反应在缀合物剂量和平均荧光强度之间观察到正相关。
表15.平均荧光强度
Figure GPA00001088319900311
＊)用GS1B4作上了标记的细胞的平均荧光强度
闪烁测量术
在闪烁计数和缀合物剂量之间发现了正相关。但是，由于上面所提及的在收获程序过程中产生的错误，所述结果与从流式细胞术分析获得的结果不可比较，因此不能在这两种定量方法之间建立联系。
表16.“表位/细胞”的估计
  所添加的缀合物   表位/细胞
  25mg＊   364.2×106
  5mg＊＊   152.4×106
  1mg   28.3×106
  0.1mg   3.6×106
＊)仅贴附的细胞
＊＊)仅来自上清液的细胞
表17.作为缀合物剂量的函数的“表位/细胞”
实施例15：
将放射性探针缀合至B16BL6细胞系
该实验的目的是估计缀合至B16.BL6黑素瘤细胞的Galα1，3Gal表位的数目，以及比较通过闪烁测量术和流式细胞术所获得的结果。
细胞的准备
对于该实验，使用12瓶(300cm2)(TPP，TrasadingenSwitzerland)汇合的B16.BL6黑素瘤细胞，所述B16.BL6黑素瘤细胞于37.5℃在5％CO2中在含有10％胎牛血清(无P/S)的DMEM中生长。从细胞中除去生长培养基，并且向细胞中添加20mL含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco Invitrogen，Taastrup，Denmark)并立即再次除去。添加另外10mL含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)并除去，然后用Cell Dissociation Solution C5914(Sigma-aldrich，Saint Louis，Missouri)(10mL/瓶)收获细胞并转移到50mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。细胞于20℃以300G离心3分钟，并弃去上清液。随后，在含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)中洗涤细胞两次，如上述那样进行离心，并重悬浮在含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)中。测定细胞悬浮液的浓度。
将α-gal表位缀合至B16.BL6黑素瘤细胞
将经放射性标记的和常规的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)探针(在环状氨基甲酸酯碳上进行标记)溶解在含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)(Gibco，Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并通过无菌滤器(0.2μm
Figure GPA00001088319900331
13，Gelman Sciences，Ann Arbor，Michigan)。使用8种不同浓度的经放射性标记的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)(1μg、10μg、100μg、1mg、5mg、10mg、15mg和20mg)和6种不同浓度的常规的“Glycom缀合物”(10μg、100μg、1mg、5mg、10mg、15mg和20mg)。准备12个瓶(300cm2)(TPP，Trasadingen Switzerland)，每瓶包含10×106个B16.BL6细胞，以用于用经放射性标记的三糖探针进行缀合；和8个瓶(150cm2)(TPP，Trasadingen Switzerland)，每瓶包含5×106个B16.BL6细胞，以用于用无放射性的缀合物进行缀合。添加Glycom缀合物，并用含有D-葡萄糖的HBSS(无Mg2+和Ca2+)来调整总体积，从而使得每个大瓶(300cm2)包含20mL的终体积，和每个中瓶(150cm2)包含10mL的终体积。将细胞与“Glycom缀合物”在37℃下温育1.5小时。在缀合后，将来自每个瓶的上清液转移到分开的50mL管(TPP，Trasadingen Switzerland)中。用Cell Dissociation Solution(10mL/大瓶，和5mL/中瓶)(Sigma-aldrich，Saint Louis，Missouri)来收获细胞，并转移到含有上清液的50mL管中。细胞于20℃以300G离心5分钟，并重悬浮在5mL PBS(无Mg2+和Ca2+)中。这重复3次，随后通过经锥虫蓝染色的细胞样品的显微术评价来测定细胞的浓度和生存力。
闪烁测量术
与经放射性标记的三糖探针一起进行温育的细胞于20℃以1000G离心5分钟。排出上清液，并使剩余的粒状沉淀干燥。随后，将粒状沉淀溶解在450μl Mili-Q H2O中，并添加1.5mL闪烁液。通过向3个对照细胞样品中添加500pCi、0.5pCi和0pCi来制备关于所述闪烁测量术的标准。将样品在室温下贮存3天，随后将细胞悬浮液转移至闪烁管并进行计数。
流式细胞术分析
通过流式细胞术来分析用常规的三糖探针进行缀合的细胞。将400μl包含2×105个细胞的每种细胞悬浮液与10μg/mL的经FITC标记的GS1B4一起于4℃温育15分钟。通过流式细胞术来测量用GS1B4染色的细胞的平均荧光强度。
表18.用常规的缀合物进行缀合的细胞
  缀合反应   所添加的缀合物   细胞浓度＊   生存力＊   所收获的细胞＊
  1   对照   3.4×105(细胞/mL)   94.1.0％   0.85×106(17％)
  2   20mg   4.2×105(细胞/mL)   85.7％   1.1×106(21％)
  3   15mg   6.0×105(细胞/mL)   80.0％   1.5×106(30％)
  4   10mg   2.8×105(细胞/mL)   71.4％   0.7×106(14％)
  5   5mg   4.4×105(细胞/mL)   81.8％   1.1×106(22％)
  6   1mg   4.2×105(细胞/mL)   66.7％   1.1×106(21％)
  7   100μg   6.0×105(细胞/mL)   60.1％   1.5×106(30％)
  8   10μg   4.2×105(细胞/mL)   57.1％   1.1×106(21％)
＊)在α-gal缀合后和在洗涤细胞一次后所测定的
表19.用经放射性标记的缀合物进行缀合的细胞
  缀合反应   所添加的缀合物   细胞浓度＊ 生存力＊   所收获的细胞＊
  A   对照1   5.4×106(细胞/mL)   83.3％   2.4×106(24.3％)
  B   对照2   5.7×106(细胞/mL)   86.3％   2.6×106(25.7％)
  C   20mg   6.1×106(细胞/mL)   82.0％   2.7×106(27.5％)
  D   15mg   4.3×106(细胞/mL)   88.9％   1.9×106(19.4％)
  E   10mg   12×106(细胞/mL)   86.7％   5.4×106(54.0％)
  F   5mg   5.2×106(细胞/mL)   82.7％   2.3×106(23.4％)
  G   1mg   5.9×106(细胞/mL)   91.5％   2.7×106(26.6％)
  H   100μg   3.8×106(细胞/mL)   81.6％   1.7×106(17.1％)
  1   10μg   6.2×106(细胞/mL)   82.3％   2.8×106(27.9％)
  J   1μg   5.0×106(细胞/mL)   84.0％   2.3×106(22.5％)
  K   对照3   5.9×106(细胞/mL)   69.5％   2.7×106(26.6％)
  L   对照4   4.6×106(细胞/mL)   56.5％   2.1×106(20.7％)
＊)在α-gal缀合后和在洗涤细胞4次后所测定的
流式细胞术
出乎意料地，没有检测到经FITC标记的GS1B4与来自任一缀合反应的细胞的高于背景水平的结合。向细胞中添加额外量的经FITC标记的GS1B4，并重复进行测量。然而，还是没有发现染色，并因此不能通过流式细胞术分析来确证成功的α-gal缀合。
闪烁测量术
由于对于用1mg经放射性标记的缀合物进行缀合的细胞的计数产生怀疑，因此省略了对于这些细胞所获得的结果。对于其余的缀合反应，在闪烁计数和缀合物剂量之间发现了正相关。由于上面所提及的没有通过流式细胞术来确证成功的α-gal缀合，因而不能在这两种定量方法之间建立联系。
表20.用经放射性标记的缀合物进行缀合的细胞
  所添加的缀合物   用于闪烁测量术的细胞   表位/细胞
  20mg   2.4×106   515.2×106
  15mg   1.7×106   501.2×106
  所添加的缀合物   用于闪烁测量术的细胞   表位/细胞
  5mg   2.3×106   175.3×106
  1mg   2.6×106   33.9×106
  100μg   1.7×106   6.8×106
  10μg   2.7×106   0.6×106
  1μg   2.2×106   1.0×106
＊)在α-gal缀合后和在洗涤细胞4次后所测定的
表21.作为缀合物剂量的函数的“表位/细胞”
Figure GPA00001088319900361
部分2：包含糖类的环状氨基甲酸酯的制备
实施例16：
将乳糖基-叠氮化物12(1.5g)溶解在用CO2饱和的无水DMF(40mL)中，然后向该混合物中添加在无水DMF(5mL)中的三苯基膦(1.1当量)，经过20分钟的时间段(参见图5)。将CO2鼓泡通过该混合物5小时，并搅拌混合物8小时。过滤所形成的白色沉淀，并用冷的丙酮进行洗涤，从而得到所希望的产物13(1g)。
实施例17：
将乳糖基-叠氮化物12(1.8g)溶解在无水DCM(15mL)中，然后向该混合物中添加三苯基膦(1.1当量)，并搅拌3小时(参见图6)。添加乙醚(50mL)，并且过滤所形成的白色沉淀，并用冷的乙醚进行洗涤，从而得到膦亚胺16(1.9g)。
在室温下，将CO2鼓泡通过膦亚胺衍生物(1.9g)在无水丙酮(40mL)中的溶液6小时。然后，收集所形成的白色沉淀，从而得到所希望的产物13。
实施例18：
在0℃下，向α-gal三糖表位18(1g)在EtOAc和饱和NaHCO3中的溶液之中添加三光气(1.1当量)，并剧烈搅拌该混合物30分钟(参见图7)。然后，使相分离，并收集和浓缩有机相。残留物的柱色谱法提供出了产物19。
实施例19：
在DIPEA(1.3当量)存在下，向乳糖基胺20(1g)在DMF中的溶液之中添加Z-Cl(1.2当量)，并搅拌该混合物直至TLC显示完全转化为化合物21(参见图8)。然后，添加NaOMe(1.3当量)，并在室温下搅拌该混合物。用Amberlite IR 120(H+)中和反应混合物，并进行浓缩。残留物的柱色谱法提供出了产物13。
实施例20：
向葡糖基氨基甲酸酯22(100mg)在DCM(3mL)和吡啶(4mL)中的溶液之中添加酰氯(4当量)，然后搅拌该混合物过夜，随后进行浓缩，从而经过色谱法的残留物提供出了产物23(参见图9)。
实施例21：
向三糖-叠氮化物24(50mg)在无水DMF(0.3mL)中的溶液之中添加在无水DMF(0.2mL)中的PPh3(31.4mg)。在惰性气氛下搅拌该混合物2小时(参见图10)。然后，向BaCO3(用C13进行标记)(39.4mg)中添加5mL cc H2SO4，并将释出的CO2转移至所述糖混合物。并且，在室温下搅拌该混合物8小时。然后，浓缩该混合物并用DCM(50mL)进行研磨，从而分离出作为白色固体的产物25。

Claims (18)

1.制备糖-肽缀合物的方法，所述方法包括使环状氨基甲酸酯(1)
Figure FPA00001088319800011
其中R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；并且R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数；
与肽反应的步骤，所述肽包含至少一个伯氨基基团。
2.根据权利要求1的方法，其中所述反应在极性溶剂例如水中进行。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述反应在6.5-10.5的范围内的pH下进行。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽包含至少30个氨基酸单元。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽是细胞表面或细胞膜结合蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述糖-肽缀合物是如权利要求7-14中任一项之中所定义的化合物。
7.通过根据权利要求1-6中任一项的方法可获得的糖-肽缀合物。
8.糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式1的部分，和其药学上可接受的盐：
Figure FPA00001088319800021
通式1
其中
R1和R2连同间插性赖氨酸部分一起表示肽部分；
R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；
R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0和1的整数。
9.根据权利要求8的糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式1a、1b和1c中任一个的部分，
Figure FPA00001088319800022
Figure FPA00001088319800023
Figure FPA00001088319800031
其中，R6和R7如权利要求1中对于R3和R4所定义的，R9如权利要求1中对于R5所定义的，R8选自羟基、C1-6-烷氧基、C2-20-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。
10.糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式2的部分，和其药学上可接受的盐：
Figure FPA00001088319800032
其中
R11是氨基酸侧链；
R2连同-NH-CHR11-C(＝O)-一起表示氨基酸单元总数目为至少30的肽部分；
R3和R4独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；
R5选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数。
11.根据权利要求10的糖-肽缀合物，其包含一个或多个具有通式2a、2b和2c中任一个的部分，
Figure FPA00001088319800041
Figure FPA00001088319800043
其中，R6和R7如权利要求3中对于R3和R4所定义的，R9如权利要求11中对于R5所定义的，并且R8选自羟基、C1-6-烷氧基、C2-20-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。
12.根据权利要求7-11中任一项的糖-肽缀合物，其中所述糖基部分(糖部分)表示非免疫原性的糖。
13.根据权利要求7-11中任一项的糖-肽缀合物，其中所述糖基部分(糖部分)表示免疫原性的糖。
14.根据权利要求7-13中任一项的糖-肽缀合物，其中所述肽是细胞表面或细胞膜结合蛋白。
15.权利要求7-14中任一项之中所定义的糖-肽缀合物，其中所述肽部分的氨基酸单元总数目为至少30，特别是至少100。
16.权利要求7-15中任一项之中所定义的糖-肽缀合物，其用于在医学中使用。
17.根据权利要求7-15中任一项的糖-肽缀合物作为药物、诊断剂或在诊断试剂盒中的用途。
18.选自(4a)、(4b)和(4c)的寡糖的环状氨基甲酸酯，和其药学上可接受的盐：
Figure FPA00001088319800052
Figure FPA00001088319800053
其中
R3、R4、R6和R7独立地选自羟基、乙酰氨基和糖部分；
R5和R9独立地选自氢、甲基、羟甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是选自0、1、2和3的整数；并且R8和R10独立地选自羟基、C1-6-烷氧基、C1-6-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。
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