CN86100608A - 制备抗病毒剂的方法 - Google Patents

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Abstract

在动物细胞表面上发现了第二步病毒结合受体。其被认为是病毒穿透靶细胞所需要的。第二步受体已被发现可与属于许多不同科的病毒相结合。第二步受体和与第二步受体的结合表位相应或相类似的天然或合成性物质，并从而能与病毒上的识别天然第二步受体结合表位的位点相结合，被指明可以用于病毒感染的诊断，预防和治疗。

Description

本发明述及将某些对病毒具有结合特性的化合物用于病毒感染的诊断、预防、治疗，和抗病毒剂、以及包含这些化合物的药物组成。
虽然病毒严重损害植物、动物及人类，对病毒感染亦然没有适当的疗法，比如象抗生素治疗细菌感染那样有效。在某些情况下，人们成功地使用了接种疫苗，这种预防措施能产生免疫，预防再感染，但是，要让一种疫苗广泛有效地适用于同一种病毒的大量的不同品系，就不那么可行了。比如，迄今发现的热血病疫苗能够对特定的品系产生作用，而对其它品系则无效，这些品系非常相似，仅仅是抗原性稍有差异。这就是一个问题。
近年来，人们对受体与生物联系的重要性给予了越来越多的注意。所谓受体，通常是一些糖脂或糖蛋白，即其组成的糖的部分与脂或蛋白质相连，构成了动植物细胞膜的完整部分，存在于多种细胞的细胞膜表面，它们作为特定的接受者对大量生物实体的作用是完全不同的，这取决于组成它们的那些暴露在细胞膜表面的糖部分。它们作为细胞表面的标示物具有抗原特性或抗原功能，能够保持脂双分子层膜外侧单层的稳定性，并形成一个细胞的胞间联系与胞间识别系统，或者在细胞对生物活性因子的作用中起作用。比如对细菌毒素、糖蛋白激素或微生物起作用，把它们固定在细胞表面。例如，我们知道，在细菌感染与受体的联系中，受体类似物可用来阻止细菌的附着（这对感染是必要的）。
病毒感染，已知病毒基因组必须进入宿主细胞内。对于一些被膜病毒（病毒粒子周围有一层膜），这个过程包括两个步骤，即持续附着和渗入宿主细胞（见参考文献1;参考文献见本申请的参考书目部分）。已知附着有赖于病毒感染的靶细胞表面上的受体（见参考文献3）;普遍认为，渗入过程是附着的逻辑发展，因这可以造成细胞膜表面的持续溶解，或认为渗入是以受体引导的细胞内吞作用的结果。
在有些情况下，考虑第二步的影响，它比附着具有较小的特异性，而主要是与细胞内部的疏水作用（见参考文献2）有关。然而相反，在促成本发明的研究过程中，惊奇地发现，对我们所研究的病毒，第二步结合却是特异的。这是由于一种具有某些化学特性的特殊物质作用的结果。因而跟第一步受体（见参考文献3，它帮助病毒吸附在宿主细胞上）相比，这种物质相应地被称为第二步受体。细胞感染的发生，看来第一步受体和第二步受体都是必须的。而这两类受体的主要区别在于，第一步受体（存在于特殊类型的细胞上）易于感染特殊种类的病毒，第二步受体（存在于各种细胞上）一般说来则是病毒感染的输入港（即这种受体对病毒一般不具有特异性）。因此，一种病毒利用第一步受体选择其宿主细胞或组织，而用普遍通用的受体作渗入。
又进一步，我们认为第二步受体对于病毒的存活是必须的。不通过膜进入细胞质，附着的病毒粒子在细胞清理机制的有效作用下最终将被其溶酶体所分解。因而认为第二步受体结合对于病毒具有良好的保护性（遗传上稳定，不易变化，与病毒抗原性相反），且与第一步受体的性质无关。
支持第二步受体存在的一个证据是，病毒的一个疏水部分，例如一个疏水多肽链（如组成病毒结合部位的多肽链），由于膜本身的排斥特性而不能自动地进入细胞膜。膜表面的这种物质可以阻止对疏水基团及其它物质的失控吸收，否则将严重影响膜的功能。生物体内许多规则物质如激素是疏水的，而它们的吸收则是靠特定受体的媒介作用而不只是靠细胞膜双分子层的流动性。所以类似地，病毒粒子的疏水渗入也必须利用一种双层一闭锁受体，这就意味着仅仅附着在第一步受体上是不够的。
那种似乎是自相矛盾的现象，即许多细胞所通用的一种病毒受体仅能使一定的细胞发生感染只能归结为宿主细胞表面的复杂特性（离脂层100
Figure 86100608_IMG26
或更远分布着的一层糖原结合物）;第二步受体紧接脂双层分布，并认为它隐藏在与外部的直接接触下面。另外，第一步受体远离脂双层，因而非常易于结合。我们假定，第一步结合使病毒粒子接近于双层-闭锁受体，该受体由公认的现象即细胞表面组成的侧向流动性能暴露。细胞表面组成又由于比如病毒表面的电负性而部分地降低其排斥性（见参考文献4）。因而病毒与第二步受体的结合需要第一步的附着来限定感染的特异性。
本项发明的目的即是利用这种两步结合的基本原理，使自然的第二步受体与比如那些潜在的宿主或靶细胞上的第二步受体竞争病毒上的结合部位，并且通过闭锁这些部位来阻止病毒渗入细胞内，从而防止或控制病毒感染，并且，产生一些化合物，由于这些化合物具有自然受体的结合特性，因而能够完成对病毒同样的结合功能或闭锁病毒的结合位点。就此目的，我们提出利用第二步受体或其相似化合物而不用第一步受体，原因在于前者特异性小故而具有更广泛的实用性（更一般地）。
相应地，本项发明述及某种化合物的使用，这种化合物至少具有一种成分，该成分，考虑其组成、特性、与动植物细胞上的第二步病毒结合受体结合表位的一致性与相似性（而且这部分能够结合到病毒的某个位点上，并使病毒能够识别第二步受体的结合表位）;以及制造某种组合物使之能够对病毒感染进行诊断、预防和治疗。
上文中述语“结合表位”意指与病毒联系的受体上可能的最小部位。在自然界，这种结合部位由病毒感染的靶细胞的第二受体（一般是糖脂）携带。包含这种结合表位的第二受体的存在由本发明者利用一种分析方法所证实。在这个方法当中，潜在的受体以糖脂的形式从感染的靶细胞面取出，分离在某个面上（色层分离谱），该面经过适当处理能够表征细胞膜。这就意味着，活细胞当中潜在的受体物质大概也会以相似的方式通过同样的方法暴露出来。因此，这种方法的结果也能与完整细胞或组织进行很好的比较，这种方法揭示了第一和第二步受体的存在，而且更进一步地表明那些待定受体实际上影响结合。
这种方法所产生的发现与原来发现的结果相矛盾。原来的方法能提取的胶状物用来阻止病毒在宿主细胞上的吸附，限制其活动。用这些方法常常能产生一些无差异结合因而不能恰当反映细胞表面上的实际结合机制。
例如参考文献6描述的溶血抑制是由仙台病毒通过几个长的脂肪酸链产生的，这是一个对病毒渗入的明显效应。然而，游离的脂肪酸并不参与膜表面的组成。在这种情况下，好象是疏水链烃非特异性地影响了F糖蛋白（定义见下文）的疏水多肽链。有两篇文章（见参考文献7）报道，杆状病毒的抑制由磷脂酰丝氨酸及其它磷脂造成。另外，由黄写的两篇文章（见参考文献8）表明，仙台病毒或禽鼠疫病毒产生的溶血抑制需要磷脂及某些天然的或人工合成的糖脂的作用。这样，用胶状的脂肪酸、磷脂或糖脂就可以抑制仙台病毒产生的流血。如上所述，通过本发明者前面所讲的方法，当使用黄所用的游离脂肪酸、磷脂、天然或人工合成的糖脂时，并没发现与仙台病毒结合。这三类物质具有相似的活性，第二三类物质的极性在结构上与后两者相比差异很大，很难解释病毒与这一部分的特异影响，因此，比较合理的解释就是这些物质的公共部分（脂链），能够非特异性地影响病毒的疏水部分，这很类似于F糖蛋白的N端肽链。这就是说，前人研究所用的物质并不真正是宿主细胞的受体。如磷脂，它是靶细胞表面的基本组成部分，发现靶细胞上的结合位点为106个，这样的数量级对相应的磷脂来讲还是太低了，这显然是支持上述结论的。
简单说来，迄今出版的文献或许只能解释有限的几种病毒与被试验物质的非特异性疏水联系。尽管这种联系能够合理发生（考虑到同一肽链与第二受体在结合表位的特异结合），仍不能凭这些文献说这就是真正的受体专一性。一个例子就是不同结构的脂肪酸与清蛋白的联系（清蛋白是哺乳动物血浆的主要蛋白质）。因而，由于简单疏水联系的一般性，前述的结果不适合本发明。
通过本发明者使用的方法，首次有可能确定那些被称为第二受体的特定物质。因如前所述，用这个方法并没有那种结合，即象其它研究者所说的那种膜上其它部分与被研究病毒的结合（见前述参考文献）。例如，并没有与游离脂肪酸/脂或游离糖的结合，它们都是第二受体的组成部分;也没有与磷脂类如磷脂酰胆碱、神经磷脂、磷脂酰乙醇胺或磷酯酰丝氨酸的结合（用相应的受体物质）。所以，本发明者所用的方法使得确定第二受体的结构成为可能，就是要避免用其它方法得到错误结果（主要是传统方法中试验物质的非特异影响）。在上述方法的基础上，可以确定那些具有受体活性物质在结合表位的基本特点，也就是本发明者所确定的这些化合物、它具有一个疏水部分，一个紧接着疏水部分的极性部分以及一个紧接着极性部分的即极性又疏水性的部分，并且，这三部分应该在一个连续面上，其长约为15-20
Figure 86100608_IMG27
，宽8-10 。
根据本发明，这个疏水部分应当带一个烃基（表示一个疏水面，其面积最小为50-80
Figure 86100608_IMG29
）。这个表面区域能够有效地建立病毒结合位点与结合表位疏水部分的疏水联系，当然这个烃基应该延伸相当大的区域，这在受体与携带者的结合部位具有实际应用意义（如下）：然而应该注意的是，这个大的烃区域并不组成结合表位本身。极性/疏水部分更应当包含这样一种结构，就象自然结合表位中己糖的α-侧端那样。这个α侧端组成糖的“疏水”段。极性部分（组成疏水部分与极性/疏水部分的中间层）应该至少包括两处氢键部位。中间层则能够携带氢键的供体和受体。
极性疏水部分应当包括一个同环或杂环结构，单糖更合适，以便能够自由地取代;但这种取代不至于影响空间结构（象自然结合表位的己糖α侧端）。试验表明，闭锁结合的取代能够延伸其侧端（象己糖α侧端），而允许结合的取代则能使其向另一个方向延伸。这表明病毒结合方式的空间特异性。比如取代物可能是糖，而以具有β-吡喃半乳糖或β-吡喃葡萄糖的构型的单糖为好，至少存在于受体活性部分当中，以己糖为好，但戊糖或庚糖也可用于上述目的。己糖可以是半乳糖或葡萄糖，这是自然受体的最好形式。
包含烃的疏水部分不必具有结构特异性，因为它对初级表位识别和膜上的氢键断裂并不重要;这分别由极性/疏水部分和极性部分所影响。然而，疏水部分对病毒结合部位与细胞膜广泛的疏水联系是重要的;因而需要有恰当模仿自然受体结合的物质。否则病毒结合部位的闭锁就不那么有效。这个烃部分应当包括饱和的或非饱和的、分支或线性的、开链或环状烃或是它们的结合。如果烃基部分包括一到两个饱和或不饱和、线状或分支状的烃基则更好。最好是，烃为神经酰胺的一部分。因神经酰胺在单层表面平衡时具有自我缩合作用（见参考文献33），这可能归结为其内部分子的氢键。这就表示，致密表面上的结合部位对于一个配体-比如病毒的有效结合是重要的。神经酰胺要包括一个2-羟基脂肪酸，因为这能使病毒更容易接近结合表位（在这些受体物质当中，它对高度自聚单层上的结合表位与内部分子氢键产生的致密分子群提供合适的构象及表征）。这个烃基部分至少应具有14个碳原子，而从实用的观点看[当给疏水联系的携带者与烃基分子提供充分的疏水性时（见下）]，含有20-30个碳原子更好。
以上表明，作为受体物质或受体替代物，对这种化合物结构或构象的有效性要求较严格。已经发现，该化合物应有一个弯曲或弧形的构象，其极性疏水头部与疏水部分（如烃）所形成的单层平面保持弯曲。相应地，该化合物应与1-O-β-D-吡喃半乳糖基-N-（2-D-羟基烷酰基）-1，3-D-二羟基-2-D-氨基碱所带有的自然结合表位相一致，
Figure 86100608_IMG30
其空间原子关系的大致构象通过结晶分析如下：a＝11.2
Figure 86100608_IMG31
，b＝9.3
Figure 86100608_IMG32
，c＝46.5
Figure 86100608_IMG33
，β＝99°;相应地，以X、Y、Z表示其分级选择原子配价物，则己糖Cl″0.82，0.99，0.42，C3″0.91，1.25，0.44，C5″0.72，1.15，0.46，对于长链碱基，O1 0.80，0.90，0.41，Cl 0.76，0.76，0.42，C2 0.78，0.66，0.39，C5 0.61，0.62，0.31，N1 0.90.0.69，0.38，O2 0.57，0.69，0.37对脂肪酸，Cl′ 0.98，0.58.0.37，C2′1.08，0.64，0.36，C5′.95，0.45，0.38，O2′1.12，0.79，0.37。
该化合物原子以及其配价物和变形体，并不影响其结合活性，由于化合物含有一个极性/疏水部分（结构上与图示的自然结合表位分子构象的A部相似），包括与自然结合表位己糖的α侧端相似的结构/构象，且优选包括一个D或L构型的单糖（具有β-吡喃葡萄糖的构型），至少在受体活性部分，其中的单糖处在合适的自由取代位置，且替代物并不影响与自然结合表位上己糖的α侧端类似的那个空间结构，该化合物的极性部分（与图示的自然结合表位分子构象中的B部分相似）至少包括两个氢键位置，它们或许是氨基、羰基、羟基、巯基、磺酰基或砜基。该化合物的疏水部分（与图示的自然结合表位分子构象中的C部分相似）包括一个饱和的或不饱和的、分支的或线性的开链的或环状的烃基，或该烃基的自身结合，并且形成一个至少50-80
Figure 86100608_IMG34
的表面区域。
上述表明，适用于本目的化合物结合表位的结构应该很象最佳自然受体的结构模型，这由X-射线晶体分析决定（见参考文献31）。这种自然受体与己糖[A，它弯向烷烃链（C）所形成的单层平面）有一个匙状或铲状的构象（显见于上面图示的分子造型）。这就是说，己糖的α侧端而不是β侧端暴露在单层的表面，这从晶体堆积上可以看到。与此相应，未结合糖脂与此的不同仅在于它具有一个非羟基脂肪酸。NMR波谱分析知，疏水部分由一个双羟基脂肪酸取代（见参考文献32）;且研究表明，己糖垂直于单层平面，这样围绕C1-C2键轴旋转。尽管试验是用不同方法对分散的分子做的，却建立了更合适的构象。并且该构象以本文所表明的方式而不同。与紧密的内部分子晶体堆积类似，神经酰胺的结构表明在水面上（或在生物膜上）的单层具有自凝聚作用，这归结于其内部分子氢键（见参考文献33）。对于密集联接的糖脂而言，这意味着其非羟基脂肪酸类结合时既不代表己糖的α侧端，也不代表其β侧端（与2-羟基脂肪酸相比）。由此可知，己糖的α侧端在与病毒结合时发生作用，2-羟基在此侧端的结合中具有重要作用。
对受体表位示别来说，第二个重要的因素是与此受体相结合的病毒上蛋白质的性质。例如，仙台病毒（属于paramyxo病毒组，常用于试验），其表面具有两个蛋白质（见参考文献2、3）。HN（血细胞凝集素-神经氨酸苷酶）蛋白带有包含神经氨酸的第一受体结合位点。另一蛋白质，F（融合）蛋白，被认为对病毒膜与宿主细胞浆膜的融合起重要作用（渗入），因为融合是把病毒粒子运送到细胞质的必要方式（见参考文献2、3）。在这个过程中，F蛋白质的N端疏水多肽链的卷入近年来已被证实，这是通过用一系列与自然序列相似的合成多肽链进行抑制完成的（见参考文献35）。其它病毒表面也存在有类似的N端肽链（见参考文献2，White等人）。参考文献35所提供的材料说明，这些合成肽链的作用位点是在靶细胞上，并且其作用是可饱和的，表明每个细胞的受体位点约为106个。此处定义的第二受体与这些结合位点是等同的，因为仙台病毒表面仅有两个蛋白质和两种结合性质。最有效的抑制合成肽链是N-苄氧羰基肽链Z-D-phe-L-phe-Gly（Z表示苄氧羰基）。病毒表面蛋白的N-端序列是L-phe-L-phe-Gly。和没有该基团的肽链相比，特异的苄氧羰基使其效应增加约103倍;非自然的D异构体则为L异构体效应的500倍。
这两部分资料，即糖脂受体的晶体构象及与此受体相联系的抑制性肽链的结构，被用来建造肽链和受体大致连结的分子模型。基于这样一个合理的假设，即肽链N端与双层紧连，如前述最佳合成肽链及受体构象可表述如下，应该提及，分子中原子或官能团位置的命名方式与参考文献38一致。
1.在肽链的苯甲酸基团与脂肪酸受体的烷烃链及其长链基团的疏水作用。
2.D-phe的N端与脂肪酸的C＝O之间以及OH与D-phe的C＝O之间的氢键联系。
3.D-phe的苯环与己糖的α侧端及CH21基团间的疏水影响，包括己糖环的CH1，CH3，CH5基团。很明显，D-phe与天然L-phe的置换并不能形成如此密切的联系。
4.合成肽链的L-phe端的苯环影响烷烃链及邻近分子的疏水性。这样，即同一种疏水关系必须适合三个苯环的共同要求。
许多定量分析曲线（见下）表明，病毒的单个位点与自然受体存在低亲合力，有效地结合就需要多价才行。这就解释了人工合成的可溶的单价肽链自然序列的低抑制能力。非自然的N-苄氧羰基的作用就是要增加这种结合力（通过增加与自然结构相似的受体的疏水联系）。该基团及其与非天然的D-phe较好的空间结合（与L-phe相比）在病毒粒子与自然肽链多价结合的情况下就不需要了，因为这时提供了一种充分强的整体性联系。这表明，与苄氧羰基类似的疏水受体部分并不作用于病毒、然而，可以预言，在细胞膜阻碍的破裂及初级联系的影响之后，病毒与宿主细胞膜间的相互联系应有一个比上面叙述的结合表位更好的疏水区域。
已知携带疏水的N-端肽链的病毒在顺序上变异较小，尽管疏水性是必须的。而且，对分散的病毒来说，因各种人工合成的N-苄氧羰基肽链往往表现出不同的抑制效应，在有些情况下甚至出现反作用（见参考文献35）。展开的分子模型表明，这种不断“颤动”的肽链结构具有一定的耐受性并能与受体建立良好的联系。应该看到，按这种观点，与受体的结合常常是由线性肽链而不是几个肽链所成的袋状结构作为媒介，因而经常产生高度专一性以及对氨基酸替代物的不稳定性。另一方面，可能是线性肽链更容易接近这种半裸露的结合表位。
基于第二自然受体的构象，按照本发明，适用的化合物上结合表位的详细构造可通过与自然表位相似性比较如下：
A.己糖（Gal    β或Glc    β）的α侧端和长链基团的C1
这是糖的疏水侧面，它具有疏水联系部位，位于Ga1的CH1，CH3，CH4，CH5，Glc的CH1，CH3和CH5;并且，长链基团的CH21表示疏水性。Gal与Glc的结合性大致相当，这表明C4的主体化学特性并不重要。另外，C4位上的取代并不能闭锁结合，相反倒使之更容易。上述事实仅见于哺乳动物细胞的单糖神经酰胺的己糖中。与合成肽链类似物的相应部分应当包括一个C5-C7单糖，并与己糖环的α侧端有类似的性质。这样能够在4位上被单糖或其它物质取代同时不影响结合表位空间结构的易接近性。具有该结构的单糖的分子模型（见参考文献38）表明这种替代能够阻止Glc的α侧端的伸展连接而能够使之在别的方向连接。这表明病毒结合方式的空间特异性并支持这样一种事实，即α侧端参与了结合。原则上，极性/疏水部分可以是任何环状结构，它具有Gal或Glcα侧端的特点，即一个带有极性伸展取代部分的疏水环，这个极性取代部分可以是OH，SH或＝O，有些取代物也可以是非极性的如囟素、CH3、短的链烃或烯烃，以便较好地协调疏水部分与极性部分之间的联系。
B.脂肪酸中C＝O上的氢键位点（键受体）及该基团中的CH3（键供体和受体）
4-羟双氢鞘氨醇上的OH4并不重要，该脂肪酸上的OH2对受体的结合看来是重要的，但不与病毒直接发生关系。然而，如上所述，特殊结合表位初级结合后联系的建立也要用-OH来形成氢键。这两个键位距离约5-6
Figure 86100608_IMG35
，它们可能主要是C＝O，O＝S＝O，OH或NH。
C.疏水部分
依据上面的分子模型，这部分应该包括最多为C6的酸及C8的碱。然而，如上所述，天然肽链仅具有一种连接而非天然肽链还有与N-苄氧羰基的疏水连接，这就使严格的定义变得不精确了。另外，为初级表位识别及膜阻碍氢键断裂之后，细胞膜与病毒之间应建立某种联系，包括肽链与膜之间的疏水关系。因此，这个重要的疏水部分也许将发生变化，失去了结构特异性。对于人工合成的结合表位类似物，该疏水部分应当包括一个饱和的或不饱和的、分支的或线性的、开链或环状烃，或其自身的结合，并且至少要形成一个50-80
Figure 86100608_IMG36
的表面区域。其充分的疏水性应由一个致密低聚物的疏水侧链形成，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯醇的短链等。
从己糖晶体构象（见参考文献31）可知，结合表位的范围应为、B部分的氢键部位距A部分的己糖环中心6-8
Figure 86100608_IMG37
，C部分长6-8 ，宽8-10
Figure 86100608_IMG39
，因而结合表位的总长度约为16-20 。合成的表位类似物也应该与之相等或大致差不多相等。
如上所述，形成结合表位的极性/疏水部分可以是戊糖、己糖或庚糖，诸如自然形成的单糖：木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、黑角藻糖、核糖、塔罗糖、甘露糖、及糖类的衍生物比如还原糖、乙酰化或烷化糖、分支糖、氨基糖及糖醛酸等。为了得到与特殊构象一致的特点，该单糖最好应具有一个环状结构（象吡喃糖或呋喃糖那样）。这种单糖的合适的例子是：吡喃木糖、吡喃阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、吡喃甘露糖等。上述进一步表明，这个单糖在某个位置被取代时，取代物不会影响结合位点的空间结构。对大多数单糖来说，这意味着替代是发生在4位上的（杂环的第四个碳原子）。原则上，替代物可以是满足上述要求的任何物质，并且不致影响该部分结合表位与疏水性之间的协调。较好的替代物是单、双、三或四聚糖，诸如：Gal，Glc，Xyl，Ara，Fuc，Rib，Man，Man-α1→3    Man，Man    α1→2    Man，Manα1→6    Man，Gal    β1→2    Man，Fucα1→2    Gal，Fucα1→3    Gal，Fucα1→6    Gal，Galβ1→2    Gal，Galβ1→6    Gal，Galβ1→3    Gal，Galα1→3    Galβ，Galα1→4    Galβ，Glcα1→4    Glc，Glcβ1→4    Glc，Glcα1→4Glcβ，Glcα1→4    Glc，Glcα1→4Glcα→4    Glc，Galβ1→3    Galβ1→3    Galβ1→4Glc，Galβ1→3    Galβ1→3    Galβ1→4Glc，Glcα1→6    Glcα1→4    Glcα1→4    Glc，Gaα1→3（Fucα1→2）Galβ，以及它们的适当结合或其衍生物，如适当的乙酰化、烷基化、分支化或氨基化的（上述简写符号与通用的糖类符号一致）。
人工合成的自然结合表位的类似物的三个部分能够结合在一起形成一个完整的部分，并具有上面所述的各种特征和标准，这些特征暴露在所定平面的同一侧端。这可通过合成一个与自然表位很类似的物质来得到;这样，在极性/疏水部分与极性部分的联接上，就应当包括两个能够取代的碳原子，且与自然表位的构象一致。另外，极性/疏水部分与极性部分的连结是由极性/疏水部分的糖苷或硫苷，乙醚或硫醚与极性部分的CH2或其它类似基团所形成的。如果极性/疏水部分与极性部分的连接短而紧密，那么这个糖苷键就是β-异头性的。然而，也许这三个部分的结合相当灵活，并且该结合处的长度及性质并不影响这三个部分按上面所述的大小范围形成的结合面。如果满足这些准则，A部的特定专一性就可以有多种实用性，而异头性连接或许应该是α型的。
如上所述，靶细胞上的受体常常是糖蛋白或糖脂。但是，通过对自然受体构象组成的研究发现，在自然界，仅仅是糖脂才能在病毒结合中起第二受体的作用。本发明主要关心的是脂链糖的抗病毒剂，包括糖脂、糖鞘脂类、糖甘油脂及其受体活性类似物，具有此用途的糖脂的例子是，D-吡喃半乳糖基-β-甘油二酯或D-吡喃半乳糖基-α1→6-D-吡喃半乳糖基-β-甘油二酯;在自然界，发现该化合物存在于细胞膜的表面，并具有第二受体的特性，预示该化合物能够抗植物病毒疾病。
糖甘油脂的中间层仅表示氢键受体因而并不影响致密分子团和高自聚单层（该单层对糖鞘脂类的结合表位的适当构象及表征是重要的）。实践证明，与糖甘油脂的结合并不需要2-羟基脂肪酸，因为即使没有2-羟基脂肪酸存在，结合表位对病毒来说也是可利用的（这归结于糖甘油脂分子的空间构象）。如果考虑糖鞘脂类，那么这个疏水部分最好还是要带有一个2-羟基脂肪酸，因为这能使结合更为有效。从而，这种作为抗病毒剂的化合物可以是：鞘氨醇-2-D羟基脂肪酸，分子式为Ⅰ，或是植物鞘氨醇-2-D羟基脂肪酸，分子式为Ⅱ，或，2氢鞘氨醇-2-D羟基脂肪酸，分子式为Ⅲ。
Figure 86100608_IMG41
其中，R代表单糖（至少在其受体活性部分具有β-吡喃半乳糖的构象），R1，R2分别代表一个甲基，或CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH基团。当受体或受体类似物能够用来充分影响其结合时，R1与R2最好是甲基类;但当自然表位或自然表位类似物具有多价形式时（见下），R1与（或）R2最好是一个活性基团，以能够影响受体上的类似基团或携带者的类似基团起作用。R3表示一个烃分支，该分子应包括一个线性或分支的，饱和或未饱和的烃，并至少带有5个碳原子。但是，通常情况下，该烃链是线性、饱和或单一未饱和的。R即是上面所述的单糖，并能够在4位上被上面所述的其它单糖自由取代。这样，包括极性/疏水部分的单糖可以是：
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，or
Galβl→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
此处，“NAC”表示N-乙酰化糖。
实践表明，有五个单糖的糖脂能够与病毒结合。而较大的低聚糖使病毒与表位的结合产生空间阻碍。通过大量研究（见下）确定，最好的天然结合剂是：GlcβCer及GalβCer;这表明，能满足结合目的的单糖是很多的，尽管有必要考虑制备受体及受体类似物起始物质的可利用性。
像上面多次重述的那样，本发明的利用也涉及到自然结合表位的受体活性类似物。当然，这些类似物的结构能满足上述要求的构象，我们能够从大量化合物中来挑选这种类似物。然而我们发现，具有分子或Ⅳ的化合物
Figure 86100608_IMG42
（此处R，R1，R2及R3的定义如上）形成一个适合本目的受体类似物的活性基团。对于人工合成的受体类似物，上面列举的各类单糖可以作为自然受体物质。特别地，具有这类特性化合物的分子结构为：
Figure 86100608_IMG43
Figure 86100608_IMG44
并发现它们的结合亲合性与自然受体物质差不多（见例5）。
从特点与构象（范围）来说，因为发现这些受体类似物与天然物质是一致的，作为自然受体的替代者也是完全有效的。用这些天然类似物的好处在于制备它们的方法比制造天然受体或用烦索的方法从细胞膜上提取这些东西更容易些。
具有分子式Ⅳ的合成受体类似物可通过下列过程制备：具有分子式Ⅴ的糖苷
Figure 86100608_IMG45
（此处Ⅹ代表一个离去基团，R定义如上），与具有分子式Ⅵ的硫羟
（此处R3及R1定义如上）在氧化剂存在下发生作用。该反应可在水溶液或有机溶剂如乙酸、二氯甲烷、醚或二甲亚砜中进行，合适的反应温度是室温，反应时间需24～28小时，反应比例为稍多于两个当量的硫羟（具有分子式Ⅵ）与一个当量的糖苷（具有分子式Ⅴ）;反应在弱碱条件下进行，并且该单糖可适当保护。
结果得到的硫代化合物，可在四当量或更多的氧化剂存在的条件下氧化成为通式Ⅳ的砜类。合适的氧化剂的例子是，过酸类，如间-氯过苯甲酸，过氧化物如叔-丁基氢过氧化物，氨基氧化物、气态或无机氧化剂如高锰酸钾、三氧化铬等，反应温度一般是室温。
另外一些活性基团化合物是具有分子式Ⅶ的化合物。
此处，R，R1，R3的定义如上。这些化合物可以通过上述的硫化物经氧化来制备。
要使该化合物对病毒感染的诊断、预防、治疗有效，用于此目的的化合物应当以这样一种形式或方式提供，那就是对病毒有充分的亲合性，这是很重要的。这样，如果该化合物具有充分的活性，它的供给方式就可是水溶状态，即单价状态（意指该化合物以单个形式分散出现，每个实际上仅仅带有一个结合表位）。这种形式被认为特别适合，当考虑到合成受体比天然受体对病毒有更高的亲合力时。因而考虑到天然的及几种合成受体时，这种化合物最好能够提供这样一种形式，即它代表病毒结合的一个复合位点（下述的“多价键”）以便提供有效的结合。在自然界，共价键被病毒表面的许多蛋白质分子及宿主细胞上相当数量的糖脂所影响。当该化合物被用于此目的时，它就应当以模仿这种共价键的形式出现。这可以用天然糖脂受体或人工合成的同大小的受体类似物来得到，并认为它们是胶态分子团或在疏水表面上（靶细胞表面）。但是，这些不稳定的胶态分子团能够增加同各种表面的非特异性结合，因而受体及受体类似物的固相表征更为重要。
这种化合物应于某个大分子携带者具有复杂的连接，而这个大分子携带者可以是下列两种形式之一：其一，该部分具有一疏水面，并通过疏水非共价联系与上述化合物的疏水部分相连，该疏水面可以是塑料或其它多聚物（其疏水基团已被连接），如聚苯乙烯、聚乙烯及其它聚乙烯化合物。其二，该大分子携带者是一个共价键化合物。对后者来说，合适的携带者可以是天然或合成多聚体，比如，携带者可以是单糖或多糖，象植物纤维物质、淀粉、糖原脱乙酰壳多糖、胺基琼脂。它们通过疏水部分的一个活性基团与受体或受体类似物相结合。比如，存在于受体活性物质上的羟基或氨基，多或寡肽，象球蛋白、清蛋白、纤维蛋白等，与受体或受体类似物疏水部分的羟基或氨基结合，或其自然合适替代物的结合。这个大分子携带者也可以是无机物，象硅氧化物，如硅胶、沸石、硅藻土、或各种玻璃状的表面如胺化玻璃，受体或受体类似物可通过受体活性物质上的羟基、羧基或氨基与其相连结。当该化合物用于预防和治疗时，最重要的就是，携带者必须符合生理及药理要求。比如一个非毒性和/或非变应原的携带者即可。用于此目的的携带者可以是比如聚-L-赖氨酸及聚-D，L-丙氨酸。
本发明建立在这样一个基础上，即病毒要渗入宿主细胞质中，必须存在第二步受体。因而，单价或多价形式的自然结合表位或合成表位类似物能够阻止病毒感染;因为这能够闭锁病毒上的结合位点以便在病毒感染的输出港处阻止病毒侵入上皮细胞。这种输入港的例子有：：眼睛、鼻子、口腔、喉、呼吸道、食道、尿道、生殖器官中的粘膜等。本发明的实用性在于这样的事实，即靶细胞上与第二受体相当或类似的那些化合物能够结合大量品系的病毒，包括Adenoviridae，Herpetoviridae，Orthomyxoviridae，Paramyxoviridae，Rhabdoviridae，Reoviridae，另外，与此相关的病毒有Picornaviridae和Retroviridae，这样，有意义的病毒包括DNA、RNA病毒和没有双层膜的粒子。这些病毒能引起各种器官系统的大量疾病，如病毒性流感、伤风、腹泻、Ⅰ号、Ⅱ号疱疹、流行性腮腺炎、麻疹、狂犬病，AIDS和白血病等。
在动物及人的预防方面，可以在粘液膜上以适当的方式直接涂上病毒抑制化合物，诸如悬液、气溶胶，软膏、栓剂、喷雾剂，洗剂以及包含上面所述的单价或多价受体和受体类似物的溶液。这样，这些活性物质与病毒结合，闭琐第二步受体结合位点。感染的病人或动物分泌的病毒粒子所接触过的物品或表面，在将本发明所述的化合物用于该物体或某一表面时，能引起预防作用。病毒与多价受体的结合不仅阻止病毒渗入靶细胞内，而且能使病毒凝集在这个多价接触点上。这意味着，许多病毒粒子与第一步受体的结合也能被阻止。也可进行植物类的预防，如喷洒于种子、秧苗或成体植物，通过施用有效剂量的受体或受体类似物，如上所述，它们以单价或多价方式存在并且制成便于使用的形式，如溶液、乳剂、悬浊液。
本发明所述的使用也包括已经发生感染的情形。如当病毒已经在输入港穿过粘液膜并且在生物体内固定下来。运用所谓受体的治疗方法是，通过注射、肠道吸收或其它粘液膜吸收那些可溶的小分子量的单价受体类似物来实现（如前所述，它们与病毒的结合有加强的趋势）。这样，已感染细胞多价结合所（排斥）暴露的病毒粒子就能与注射或吸收的物质相结合，从而阻止它们进入新的细胞（扩散感染）。多价携带者经过口腔造成的小肠病毒感染可以服用防酸被膜或防酸胶囊药品来阻止其扩散。作为一个应用实例，咬伤后造成的狂犬病，病毒沿着神经通道到达神经中枢（经过几个月甚至几年），最后造成死亡。使用上面所述的化合物，让它渗入到血脑屏障或直接注射到脑脊髓液中从而阻止病毒侵入脑细胞，损伤脑组织。
这种受体或受体类似物药剂具有广泛的适用范围，既包括消毒、预防、也包括治疗等，各种感染类型、病人的年龄、身体状况等;且应该是用毫克水平的量即可满足。对循环感染（腹泻），每人日剂量1μg即可凝集一天产生的病毒。这时所提供的受体药物是二价的，而且一个病毒粒子仅与一个二价受体结合。当然，在实际应用当中，大剂量药剂对彻底消除病毒也是需要的。与目前所用的大多数药物恰恰相反，药剂量并不显得那么重要，因为作为药剂的受体或受体类似物，其毒性效应可以忽略不计。事实上，自然受体在人们及动物界是大量存在的。
更进一步，本发明也可用于诊断。考虑病毒与第二步受体的结合，诊断时，检验存在于感染病人分泌物或其它样品中的病毒粒子暴露于受体物质，它存在于一个适当携带物表面，其形式为：量尺、免疫检验卡、聚合颗粒等。结合后，细心清洗表面，病毒存在与否即可用临床病毒学上的各种方法来显示。例如首先将病毒吸收在微滴孔上，然后用ELISA方法检测（见参考文献1）。另外，本发明者所建立的其它分析方法也可简化诊断步骤。
还可以看到，上述化合物也能用于有关病毒的生物工艺。病毒粒子或病毒表面物质的制备与分离可以用亲合层析方法。为此，受体物质应与固体支持物（如多价连接的大分子携带者与层析柱中的配体）结合。受体的特性（结合常数等）能够适合洗涤等;通过化合物的合成设计以阻止病毒与受体的不可逆结合。这样，就有可能分离与纯化病毒粒子或病毒物质。通过受体或受体类似物与这些固体物质的结合来检测各种样品中的病毒。
这些受体或受体类似物的另一用途是，分离病毒膜上与结合有关的物质。可以认为，这种物质能够用作接种疫苗，即不仅能够使人或动物对某类病毒传入的疾病产生免疫，而且能够免疫病毒表面带有同样物质时所能产生的疾病。这样，我们就假设，可以对大量以这种方式产生的病毒疾病形成免疫，与通常使用的减弱病毒产生的免疫方法相比，这种方法具有一定的优越性，即对未感染病毒成份能够刺激抗体产生，这样就闭琐了病毒感染宿主细胞所经过的主要分子。
最后，可以认为，按照上面所讲的方式从病毒中挑选结合蛋白或糖蛋白，能将药物带到生物体内的特异性细胞上。例如，脂质体（脂质小泡）能够结合上对特定靶细胞具有专一性的单克隆抗体（如肿瘤细胞或带胞内寄生物的细胞）。为了最终阻止钝化（通过溶酶体的内吞作用），脂肪体应用病毒组成物加以标记以示别第二步受体。按照这种方式，已经建立的病毒机制可以带有毒剂媒介物的一部分。脂肪体能够与抗体的直接化学对应物相交换（第一步）和病毒成份（第二步）交换细菌毒素的活性亚单位，但仅在细胞起作用，（见参考文献12）。
本发明也涉及到一种抗病毒剂，它是具有上面描述的性质和特点的化合物：需要明确的是，这里涉及的是呈现一种分离形式的化合物，即不包括在自然界由细胞携带的化合物。
本发明还进一步涉及到具有上述特征和性质的化合物组成的药物组合物，它们被合适的药学媒介物或赋形剂结合在一起。
组合物可以是通过各种适当途径的方式结合，如口腔吸收，注射或局部应用。这样，其组成可以是下列形式，如悬浊液、溶液、烟雾剂、软膏、洗剂、乳剂、喷雾剂、栓剂、嵌入剂、药片、胶囊或锭剂等。它们包含上面说到的单价或多价状态的受体或受体类似物。可以认为，当用于预防时，该组合物应当在下列器官的粘液膜上有适当的存在形式，如眼、鼻、口腔、喉，可用烟剂、喷雾剂、锭剂、洗剂或乳剂。当用于消毒时，提到的受体或受体类似物应以纸状或液态提供，以适合清洗设备，物体或表面，这些地方已经或曾经接触到感染病人的分泌物。
用于治疗时，可认为适用于注射的组合物象受体或受体类似物的溶液或悬浊液（以水或以等渗盐水作媒介），也应当适合口腔吸收（或肠粘膜吸收），象药片或胶囊就可满足要求。为了避免受体或受体类似物受到胃液的损伤或降解，药片或胶囊应当有一个防酸外罩。受体物质通过粘液膜的吸收应当以栓剂的形式出现，如鞘状或直肠状栓剂。
媒介物及赋形剂的药物学适应性，以及自由选择其它药物学适应物质（存在于稀释、结合剂、颜料、调味品、防腐剂及分散剂中），并且与药物合成人员理解的传统的药物使用方式保持一致。
绘图说明
下面通过参考图进一步解释本发明
图一表明，仙台病毒（S变种）与第一受体的结合及按材料和方法部分描述的研究。左边两部分经化学检测表明它们是神经节苷脂（含神经氨酸的糖脂），Lane    1是人血红细胞的，Lane    2是人脑中的。这两部分的左边通过与病毒结合后的放射自显影表现出来。如图，病毒并没有与（Lane    2的）大脑相连;相反，倒与Lane    1的红血细胞的几个键位有很强的联结，特别是那些慢速运动的。
图2表明，仙台病毒（S变种）与第二受体的结合，及按材料和方法部分描述的研究。这表明，通过这种方法对不同器官糖脂混合物的大量潜在受体的可能分析（逐个寻找受体）。左边是用茴香醛化学检测后的层析，是在同一部分由病毒遮盖后的放射自显影。后面的是完全非酸性糖脂，且表示，人血红细胞（Lane    1），人胎粪（Lane    2）、弥猴（Macaca    cynomolgus）肠（Lane    3），、狗小肠（Lane    4）、兔小肠（Lane    5）、几内亚猪小肠（Lane    6）、鼠大肠（Lane    7），其可靠数目见表3所列物质。图上化学检测还表明，许多大的糖脂分子键（左）不与病毒结合（右），及这种结合方法的高度选择性和专一性。
图3表明，仙台病毒（S变种）与第二受体物质的结合及按材料和方法部分描述的研究。这表明，结合物是人工合成的，或从自然物中分离出来并经过化学修饰的。为节省空间，在同一部分也加入了几种纯物质，层析谱左边所示的快速运动成分（由茴香醛检测）。放射自显影在左边，数目见表3。Lane    1：植物鞘氨醇与2-羟基硬脂酸的2位合成，与非羟基脂肪酸的3位合成，及15位与GalNAcα1→3（Fuc1→2）-Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→4    GlcβCer;Lane    2：神经鞘氨醇与硬脂酸的2倍合成、3（3个紧密运动连接的2羟基脂肪酸）及15位与非羟基脂肪酸的连接;Lane    3：鞘氨醇与硬脂酸的2位连接，3，6位与非羟基脂肪酸的合成，16，22位（3个紧密运动连接的2羟基脂肪酸）;Lane    4，神经鞘氨醇与2-羟基脂肪酸的1位连接，神经鞘氨醇与非羟基脂肪酸的3位连接，及GalNAcα1→3    GalNAcβ→3    Galα1→4    Galβ1→4    GlcβCer和非羟基脂肪酸的6位连接;Lane    5：鞘氨醇与硬脂酸的1位连接，表1中的第13号物质，6（短链-2羟基脂肪酸）、16（两个密切连接的2羟基脂肪酸），17（3个密切运动带）;在放射性自显影图谱的右边可能有污染物17;Lane6：8（两个密切运动键）、20，GalNAcα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4    Glcβ1→3    Galβ1→4    GlcβCer。
图4表示，仙台病毒与各种合成的或天然糖脂结合所成的曲面（参见材料与方法部分）。它们的结合在材料与方法部分叙述。稀释的糖脂吸收在微滴孔中（X轴），而培养后病毒的结合用放射活性检测（Y轴），字母表示下列测定样品：A为表3中的物质1或2;B具有下面序列的第一受体：NeuAc    α2→3    Galβ→4    GlcNAcβ1→3（NeuAcα2→3    Galβ1→4    GlcAcβ1→6）Galβ1→4    GlcNAcβ1→3    Galβ1→4    GlcαCer;C为表3中的物质3（带有2羟基脂肪酸）或表1中的物质18;D为表3中的物质5;E表3中的2或22（它在色层谱中有轻微的连接，见图3，Lane3中的物质22）或表3中的阴性物质。
图5表示，自然形成的神经酰胺类分子（由脂肪酸和长链基团组成），这在别处已经总结（Karlsson，in    Chapman，ed，Biological    Membranes，Vol.4，Academic    Press，London，1982，PP.1-74）;R包括基团C1上的氧，可能是神经膦脂上的磷酰胆碱或糖鞘氨醇中的原糖。脂肪酸的主要种类是非羟基、2-D羟基及2-D、3-D-双羟基脂肪酸，带有约12-26个碳原子，饱和或未饱和的，线性或分支状的。基团的主要类型是2羟基（鞘氨醇、2氢鞘氨醇或有关碱基）及三羟基团（植物鞘氨醇等），它们大约具有14-22个碳原子，链可以是饱和的、未饱和的、线性或分支状的;三种主要基团的基本结构是：鞘氨醇，1，3-D-2羟-2-D-氨-4-反-十八烯（种类B和D）;2羟鞘氨醇、1-3-D-2羟-2-D-氨基-十八烷（种类A）;植物鞘氨醇：1，3-D，4-D-3羟-2-D-氨基十八烷（种类C、E及F）。哺乳动物细胞最常见的类型是A-E，并带有15-顺双键脂肪酸，上皮细胞最常见的是D和E，它们是最好的病毒结合者（表4）。因此，由于第二步受体，病毒可以被选择，带有神经酰胺的糖脂能够支配上皮细胞，及病毒感染的输出港。
图6表示第二步受体的构成，通过单晶X-射线结晶合成的物质1（表3）得到，它具有2氢鞘氨醇及2-D-羟基硬脂酸（参Paseher et al.，Chem.phys Lipids 20，1977，pp.175-191）。其中的氮是点状的，碳氢和酸中的C2O呈线状;该物质的合成见Passcher，Chem.phys.Lipids 12，1974，pp.303-315，从95%乙醇中结晶得到。X-射线的资料收集在双色层分离仪Picker FACF1，并测定了5000多独立的关系，各种计算是通过DEC-10计算机主要用X-RAY72程序系统完成。
图7表示用茴香醛检测的单色层分离物质，以说明在人大小肠上皮细胞上存在的第二步受体糖脂。上皮细胞和完全非酸糖脂的制备与表述见材料与方法部分。表3中物质1，2表示四行中常见的双键，1，2是最合适的病毒自然结合物（例2及图4）。比较慢速运动的糖脂是血组岩藻糖脂，且在四个当中均有差异，据分析，它们的构象如下：Lane 1 A，Le（a-b+），分泌型，Lane 2 Ole（a-b+）分泌型，Lane 3 Ole（a+b-），非分泌型，Lane 4 Ole（a-b-）分泌型。这些样品的组成已被描述过，见Biork et al.，in Carton et al.，eds.，Red Cell Membrane Glycoconjugates and Related Genetic Maskess，Libraire Arntte，Pasis，1983，pp.125-137。
图8表示动物细胞膜表面外部单层的结构，这在别处已有人作过详细描述（Karlsson，in    Chapman，ed.，Biological    Memfsanes，Vol4，Academioc    Psess，London，1982，pp.1-74）。其中，三个主要的脂类组成物是鞘脂类、甘油脂类、胆固醇类，并在中间层。它们携带很多氢键受体与共体从而能够形成一个内部分子侧向氢键定向系统，这对膜的稳定性具有重要意义，病毒感染的输入港处粘液膜细胞上皮部分的结合位点是相当致密的。如例4所示，上皮细胞上有丰富的第二步受体（表3中的物质1和2），它是包含有氢键受体与共体的鞘脂类。植物细胞也包括表3中的物质2，除表3中的26、27（它们是甘油醇）之外，这些物质都与病毒结合（表3）。因而，病毒通过一个肽链表面形成一个有用的特性（作用于）选择结合，表面膜上的三个部分对膜的稳定屏障都是很重要的。这样，可以说，病毒感染与渗入所需的第二步受体是所有细胞表面的正常组成部分。
材料及方法
天然受体及其有关物质的结构特征化和制备
用于结合研究的人类和动物糖脂样品，可以是纯糖脂和全部或部分的糖脂混合物，基本按参考文献13所述制备，即对冻干组织用氯仿-甲醇反复萃取，用弱碱处理降解非鞘脂类，对水透析4天以除去水溶性产物。剩下的脂材料首先在硅胶柱上，先于完全碱稳定的鞘脂类，对主要的脂肪酸酯洗脱。然后，在DEAE纤维素或DEAE琼脂糖
Figure 86100608_IMG46
柱上分为非酸性糖脂及酸性糖脂部分。酸性部分。接着一般用DEAE琼脂糖
Figure 86100608_IMG47
梯度洗脱而分开。非酸性部分用乙酸酐和吡啶乙酰化，在硅胶柱上用甲醇存在于氯仿的或其它的溶剂分步或连续梯度洗脱，反复分部，如果需要，以弱碱对各组分去乙酰化，并进一步分部直至纯净为止。按以下所述，对纯度用薄层层析测试，再进一步用质谱和NMR波谱检验。
要制备完全不含非糖脂污染物的糖脂，在一份转移的约250毫升人血浆中加入250毫升甲醇，该混合物在1升的蒸发瓶中，连续搅拌并加热至70℃30分钟。过滤萃取物，残留物再移回到萃取瓶中。以250毫升氯仿/甲醇为2∶1（体积比）重复该过程两次，再以250毫升甲醇重复一次。合并的萃取物加入少量的甲苯并蒸发至干。
少量的湿细胞可用相似的方法萃取。就大规模而言，组织碎片先行冻干，然后在索格利特抽提器中分两步萃取。如果是人小肠（例如干重130克），首先用氯仿/甲醇为2∶1（体积比）萃取24小时（在置于石棉绝缘电加热器中的2000毫升圆烧瓶中加入1000毫升溶剂）。第二步用1500毫升氯仿/甲醇为1∶9（体积比）萃取24小时。合并的萃取物不经过滤而蒸发至干。
干燥的血浆萃取残留物用50毫升0.2M    KOH存在于甲醇中的溶液在瓶中处理3小时，该瓶中含有5个玻璃珠用于摇振时使分散更好。对KOH用1毫升乙酸中和。当加入100毫升氯仿和40毫升水产生两相后，混合物在透析袋中对水透析。在对流动的自来水透析4天后，袋中的成份在70℃蒸发，并重复加入甲苯。最后过滤样品，并用氯仿/甲醇为2∶1（体积比）和甲醇洗脱。对于肠的全部萃取物，使用了500毫升KOH存在于甲醇中的溶液。
血浆样品（约1.4克）放到10克包被于氯仿中的硅胶柱内。所用硅胶主要得自Mallinckrodt    Chem.Works，St.Louis，USA，筛选大于45微米的颗粒并干燥。但Li    Chroprep    Si    60（E.Merk，Darm-stadt，West    Germany）具有差不多的规格，也具有类似的性质，虽然有些硅胶可洗提掉。洗脱出三个组分：100毫升氯仿洗脱出萃取物的主要部分（约1克）（胆固醇和脂肪酸甲酯）;100毫升的氯仿/甲醇，（体积比）98∶2可含有游离的神经酰胺;100毫升氯仿/甲醇1∶3（体积比）和100毫升甲醇洗脱所有的糖脂和碱-稳定的磷脂（约60毫克）。如果是透析过的小量的肠样品（约40克），则每一步骤用50克硅胶和500毫升溶剂。
从硅胶层析血浆样品得到的第三组分，装到5克DEAE纤维素（DE-23，whatman）柱内，该纤维素为乙酸盐形式并包被于氯仿/甲醇为2∶1（体积比）中。装入的样品在柱内平衡1或2天。洗脱得到2个组分，一种是用100毫升氯仿/甲醇2∶1（体积比）和100毫升甲醇洗脱的非酸性糖脂和碱-稳定磷脂，主要是鞘磷脂，另一种是用50毫升5%（w/v）Li    C1于甲醇中的溶液洗脱的酸性糖脂（硫脂和神经节苷脂）和碱-稳定的磷脂。后一组分用30毫升氯仿和20毫升水对流动的自来水透析4天。它可用作总的酸性糖脂组分或进一步按所述被分为硫脂和神经节苷脂（见Breimer    et    al.，J.Biochem.93，1983，pp.1473-1485）。第一组分蒸发至干并乙酰化。如果是肠样品（约2克），则使用20克DEAE纤维素。
对干的非酸性血浆样品的乙酰化，是在2毫升氯仿，2毫升吡啶和2毫升乙酸酐中于暗处过夜完成。加入氯仿是要改变可溶性并保证反应完全。加入5毫升甲醇和5毫升甲苯，样品在加热水浴上于氮气流中蒸发，最后抽真空。
乙酰化的血浆样品装到10克硅胶柱上，硅胶置于氯仿/甲醇98∶2（体积比）中。为此目的，使用了小于45微米的，并用甲醇处理和干燥的颗粒。洗脱出三个组分：100毫升氯仿/甲醇95∶5（体积比）;100毫升氯仿/甲醇90∶10（体积比）;100毫升氯仿/甲醇1∶3（体积比）加上100毫升甲醇。第三组分主要含有乙酰化的鞘磷脂。前两种组分含有乙酰化糖脂和一些污染物，被一起蒸发和去乙酰化。对肠的组分，使用50克硅胶。
对乙酰化糖脂的去乙酰化，可用两种方法进行，一种含有透析步骤，而另一种不含。
方法A.
对血浆样品，用2毫升甲苯，2毫升甲醇和4毫升0.2M    KOH于甲醇中的溶液，历时30分钟并不时振荡（对肠样品，分别用5，5和10毫升）。加入0.5毫升乙酸后，样品用10毫升氯仿和10毫升水转移到透析袋中（两相系统），并对流动自来水透析4天。袋内的成分在70℃蒸发并重复加入甲苯。
方法B.
本方法中不需透析，因为中和后所生成的乙酸钾量相对糖脂而言为很小。试剂含有1毫升0.2M    KOH于甲醇中的溶液，14毫升甲醇和5毫升甲苯。对其而言，对上至2毫克的乙酰化糖脂用0.1毫升，对上至4毫克用0.2毫升，对上至15毫克用0.5毫升，对上至40毫克用1毫升，等等。使要去乙酰化的样品蒸发至干，加入适量的试剂，混合物间歇搅拌2小时，然后用乙酸中和KOH，蒸发溶剂。例如，对40毫克乙酰化的糖脂用1毫升试剂去乙酰化，产生大约1毫克残留于糖脂样品中的乙酸钾。如果需要，钾离子可用过滤除去，例如，用氯仿/甲醇洗过的H形式的mberlite
Figure 86100608_IMG48
CG-50型（Rohm and Haas，Philadelphia，Pen-sylvania，USA），去乙酰化的混合物不加乙酸就可直接过滤。然而，会发生一些对糖脂的不可逆吸附，并且洗脱的树脂也会被污染。因而，优选的是使残留于样品中的乙酸钾达到某一数量。
用包被于氯仿/甲醇2∶1（体积比）中的2克DEAE纤维素柱，过滤去乙酰化血浆样品。装入的样品在柱内平衡1-2天，再用50毫升氯仿/甲醇2∶1（体积比）和50毫升甲醇洗脱。这一步的目的是要去除碱-稳定的，含氨基的磷脂（它是在乙酰化过程中被转变为N-乙酰化衍生物）。这就使它们酸化。
最后一步硅胶层析，去掉了在前两步洗脱的非极性污染物。血浆样品装入包被于氯仿/甲醇98∶2（体积比）中的5克硅胶柱内（颗粒小于45微米）。当每次用50毫升氯仿/甲醇98∶2（体积比）洗脱两个组分后，用50毫升氯仿/甲醇1∶3（体积比）和50毫升甲醇洗脱出纯糖脂。1人血转移单位的血浆中，总的非酸性糖脂的最后产量为6-8毫克。
制备步骤用薄层层析监测（硅胶60nanoplates;E.Merck，Darm-stadt，West    Germany），对非衍生物优先选用氯仿/甲醇/水65∶25∶4（体积比），对乙酰化样品优选氯仿/甲醇95∶5（体积比）。优选茴香醛作为保护剂，因为它形成特征颜色：糖脂通常变为绿和兰绿，甘油磷脂变灰或紫色，鞘磷脂和神经酰胺为兰色（见参考文献21）。
上述方法所得到的总非酸性糖脂混合物（1至约20个糖）完全不含非糖脂污染物。这一组分对检测各种细胞源中的第二步受体的存在是重要的（见图2和7）。要从这样的糖脂混合物中分离出纯第二步受体，上述最后的硅胶层析步骤可按下述稍微修改。当用氯仿/甲醇98∶2（体积比）洗脱后，则用氯仿/甲醇95∶5-90∶10（体积比）可将1-糖第二步受体容易地洗脱。要从选择的来源中进行大规模制备，则上述的过程可大大减化如下。可用的第二步受体来源是哺乳动物肠（见图7），酵母或真菌，以及某些无脊椎类。例如，海星（Asterias    rubens），可从海里获取，就是第二步受体的丰富来源（表3中的物质2，见Bjorkman    et    al，Biochim    Bio-phys，Acta    270，1972，pp    260-265）。哺乳动物的脑，是形式为表3中1号物质的第二步受体的非常丰富的源泉。为此目的，冻干的脑（例如牛脑或猪脑）以（体积比为）2∶1的氯仿/甲醇（以组织的十倍重的体积）在温和加热的条件下进行萃取。过滤的萃取物蒸发至干，用同样的溶剂再次萃取并过滤。蒸发的萃取物以碱过夜进行甲醇化（限量，例如对一个脑用500毫升0.2M    KOH于甲醇中的溶剂）。然后用乙酸对混合物过夜中和至PH约为3.5，调氯仿/甲醇/水的体积为8∶4∶3（体积比）从而使溶剂分层。放置过夜后，下边的相蒸发至干并进行硅胶层析。这一步作为一种过滤进行，使用一个短粗的柱，其中填充纯氯仿，对每克吸附剂加入上至1克的萃取物。萃取物的主要部分用纯氯仿洗脱（胆固醇和脂肪酸酯）。第二步受体，Gal    β    Cer，用（体积比）95∶5-90∶10的氯仿/甲醇洗脱。在后一洗脱相中，可有带硫酸根的Gal    β    Cer污染。为了改善Gal    β    Cer，的产量，该混合物可用DEAE纤维素过滤，能结合掉硫酸根物质。如果需要，最后微量的着色物质，可用乙醇结晶去除。同样的过程也可用于冻干的海星。这时，DEAE纤维素去除的是硫酸根化的胆固醇，而不是硫酸根化的Gal    β    Cer。
对分离组分的结构分析，是用非降解的样品，以质谱（见参考文献14）和NMR波谱（见参考文献15）并结合使用过甲基化的和过甲基化Li Al H4还原的衍生物，和（在酸性糖脂时）过甲基化的Li Al H4还原的三甲基甲硅烷基化的衍生物而完成。以这种方法，可得知寡糖的序列和异构性以及神经酰胺的组成。还进行了降解分析以获得糖的类型和连接位置的信息，按参考文献16所述将气色谱和质谱结合进行。
使用了几种合成性神经酰胺，包括有鞘氨醇-非-羟基脂肪酸，鞘氨醇-羟基脂肪酸，植物鞘氨醇-非-羟基脂肪酸和植物鞘鞍醇-羟基脂肪酸的结合（见参考文献17）。类似的长链基和脂肪酸的天然结合物，也用上述的方法制备。
鞘磷脂用上述方法获得。不经碱降解，制备各种磷酸甘油酯，并在DEAE纤维素上分成酸性和非酸性磷脂（磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇）。非酸性磷脂然后于硅胶柱上分成磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。以薄层色谱测试物质的纯度，并分析成分证实（见参考文献18）。磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸也从Sigma    Chemical    Co，购得。
植物源的两种糖甘油脂，半乳糖基二甘油酯和二半乳糖基二甘油酲，从Sigma    Chemical    Co，购得。
几种合成性单糖基神经酰胺得自Irmin    Pascher博士，其制备见Pascher，Chem.Phys.Lipids    12，1974，pp.303-315。它们是吡喃半乳糖基-β-神经酰胺和吡喃葡糖基-β-神经酰胺，并且结合有各种长链基和脂肪酸，例如鞘氨醇，二氢鞘氨醇，植物鞘氨醇和2-羟脂肪酸及非羟基脂肪酸。其中的一种，即带有二氢鞘氨醇和2-D-羟基十八烷酸的吡喃半乳糖基-β-神经酰胺，已确定了其晶体构象（Pascher    et    al.Chem.Phys.Lipids    20，1977，pp    175-191）并且用于指定受体结合表位。
第二步受体（Gal    β    Cer或Glc    β    Cer）的化学合成，可参照上述及参考文献13的详述而以各种不同的方法完成。例如，二氢鞘氨醇（图5中通式A的基础）可按照Carter等人或Jenny和Grob（见参考文献13）所述制备，使用2-D-乙酰氧基十八烷酸（Karlsson    et    al，Chem.Phys.Lipids    12，1974，pp.65-74）的对-硝基苯酯（Pascher，Chem.Phys.Lipids    12，1974，pp.303-315）可将羟基脂肪酸联到其上。当制备了3-O-苯衍生物后，则Gal或Glc的乙酰溴代衍生物可以用于制备Gal    β    Cer或Glc    β    Cer（分别是表3中的1号和2号物质）。
合成性受体类似物及其有关的物质
结合有脂部分或多价结合于牛血清白蛋白的单糖或寡糖（表1中第1-5和第10-14物质），是从The    Sugar    Company，Arlov，Sweden处购得。与本发明关联的新受体类似物（表1中第6-9和第15-18号物质）是从瑞典隆德大学有机化学2系Goran    Magnusson博士处获得并由他制备的（Dahmen    et    al，Carbohydr，Res.118，1983，pp292-301;Dahmen    et    al，ibid.127，1984，pp    27-33）。所用的受体类似物示于下表1。
表1
合成的受体类似物用于抑制或合成
（糖类，具有D构型且为吡喃型）
1    Gal    or    GalβCETE
2    Glc    or    GclβCETE
3    Galβ1→4Glc    or    Galβ1→4GlcβCETE
4    GalβCETE-BSA
5    GlcβCETE-BSA
6    Galβ1→4GlcβOEt
Figure 86100608_IMG49
Figure 86100608_IMG50
10    Galβ1→4GlcβCETE-BSA
11    GalβOTE
12    GlcβOTE
13    Galβ1→4GlcβOTE
14    Galα1→4GalβOTE
Figure 86100608_IMG51
其中，CETE：（OCHCHSCHCHCOCH）
OTE：（OCHCHS（CH）CH）
BSA：牛血清白蛋白
上皮细胞的制备
新鲜组织上皮细胞的制备方法有两种：洗涤或刮削。洗涤方法用含磷酸盐缓冲剂的EDTA的肠环（见参考文献19）。该肠环充满缓冲剂并在水盆中37℃条件缓慢运动或静止几分钟，然后倒出内部填充物。照此重复操作5-10次，把碎片部分离心，并用显微镜检查细胞，用标定酸分析（碱性磷酸酶、胸腺激酶）;含有纯上皮细胞的碎片部分集中起来以备按上述方法合成糖脂之用。这样，从几个人或鼠品系中的大、小肠上得到的上皮细胞可获得分析。用匙轻刮人小肠亦可得到上皮细胞及少许杂物，类似地，人尿道上皮细胞也能向狗或鼠肠上皮细胞那样得到。其它几种动物的小肠也被分析了，其中包括猫、鳕鱼、几内亚猪、仓鼠、母鸡及兔子（见参考文献20）。除了神经酰胺组成物构成的质谱资料外，这些试样经过硼酸盐透浸硅胶面上，在这里，单糖神经酰胺分解的Gal，Glc及主要的神经酰胺与鞘氨醇、植物鞘氨醇、非羟及2-羟脂肪酸的结合物（见参考文献21）。
病毒的制备及抗体
利用受体分析，结合病毒可以通过病毒抗体来检测。单克隆或多克隆抗体的制备见标准方法（Rose    et    al，eds.，Manual    of    Clinical    Immunokogy，Amesic.Soc.Microfiol;Washington    D.C.，1980）。被测病毒是用已知技术在专门实验室里培养的（Lennette，ed.，Manual    of    Clinical    Microfoplogy，Amesic.Sec.Micsefiol.，Washington    D.C.1980）;这些特定病毒见表2。
表2    与第二受体结合的病毒
DNA    viruses    Adenoviridae    Adenovirus    2    and    7    No
Herpetoviridae    B95-8    EB    virus    Yes
RNA    viruses    Orthomyxo-
viridae    influenza    virus    Yes
Paramyxo-
viridae    Mumps    virus    Yes
Sendai    virus，
G    variant    Yes
Sendai    virus，
S    variant    Yes
Rhabdoviridae    Rabies    virus，ERA    strain    Yes
Reoviridae    Rotavirus    K8    No
Reovirus    1，2    and    3    No
腺病毒2和7由A-549细胞传播，其免疫血清从免疫兔得到（Wadell，Curr，Top.Microbiol.Immunol，110，1984，PP.191-220）;人rotavirus    k8由GMK细胞传播，并用兔超免疫血清（urasawa    et    al..Microbiol.Immhunol.25，1981，PP.1028-1035）;呼吸道病毒由GMK细胞传播，并用兔超免疫血清（Rose    et    al.，eds，op.cit.;Lennette，ed.，op.cit.）;E-B氏病毒即B95-8EB病毒由猴淋巴腺细胞传播，由Dr.L.，Rymo得到（Rymo    et    al.，Nucl.Acid    Res.5，1978，PP.1387-1402），抗体为鼠单克隆抗体MA，制备见，Dr.G.Pearson，Dep.Microbiolgy，TheMayo    Foundation，Rochester，USA;狂犬病毒ERA品系由BHK-21细胞传播，抗体为鼠单克隆抗体101-1（Dietzschold    et.al.，Proc.Nat.Acad.USA    80，1983，PP70-74），并由Dr.H.Koprowski制备（见：Dieyrschold    et    al.，op.cit.）。流感病毒A/PR/8134由具胚母鸡卵传播，抗体是鼠单克隆抗体H2-6    A5，这由Dr.W.Gerhard制备，（Caton    et    al.，Cell    31，1982，PP.417-427）;流感病毒品系X-31和X-31    HS在鸡胚中繁殖并由J.C.Paulson博士提供（参见Rogers    et    al.，Nature    304，1983，pp.76-78）。对这些品系的检测是用2%人红细胞悬浮液在薄层板上再涂一层的方法（红色为活性谱带），历时1小时并清洗。流感病毒品系A/Chile/1/83，A/Philippines/2/82和B/USSR/100/83是得自SBL（Swedish    State    Bacteriological    Laborotary），Solna，Sweden。这些品系也用人红细胞再涂层的方法检测。仙台病毒（“S”或“G”变种;参见参考文献46及实施例1）的Z品系在鸡胚或Vero细胞中生长，抗体为鼠单克隆抗体817和815（Orvell    et    al，J.Immunol，129，1982，pp2779-2787）以及由C.Orvell博士制备的兔抗仙台抗体121。肿瘤病毒的Kilham品系是在Vero细胞中繁殖，抗体是鼠单克隆抗体（Orvell，J.Immunol，132，1984，pp    2622-2629）。HTLV-1病毒是由J.Blomberg博士从分泌白血病T细胞株的HTLV-1中制备的（参见Blomberg等人，Leukemia    Res.1985发表）。HTLV-Ⅲ则由National    Cancer    Instiute，Bethesda，USA的R.C.Gallo博士提供。HTLV-1和HTLV-Ⅲ病毒用标准乳过氧化物酶进行碘化（Rose    et    al.，Manual    of    Clinical    Immunology，Americ.Soc.Mrcrobiol，Washington.D.C.1980）。
病毒结合特异性方法及相对结合强度的估计
病毒与糖脂结合检测方法及结合特异性测定由本发明者建立且对本发明具有决定性意义（参考，Hansson    et    al.，FEBS    Lett.170，1984，pp.15-18）。原则上讲，被分析的病毒要在色谱上分层，用分离糖脂从靶细胞上或其它地方，并且允许它与潜在的受体物质结合。经过精心冲洗，结合病毒被抗病毒抗体检测，随后是放射自显影的抗体发射标记。在有些情况下，病毒粒子是在结合前直接被标记的，详细过程如下：
全脂（每部分含100μg）或全糖脂（20-40μg）的混合物或纯糖脂（0.01-1μg）在铝片上分离，铝片约5×5cm，并敷有硅胶60（Merck），通常用氯仿/甲醇/水（60∶35∶8体积比）作为非酸性糖脂的溶剂，用氯仿/甲醇/2.5M氨（体积比∶60∶40∶9）作为酸性糖脂的溶剂。作为比较，平行的铝片通过喷射或加热在茴香醛溶液中进行化学测定。对于病毒结合，分离物干化后的色谱渗入200ml含0.5%（W/V）聚异丁基-异丁烯酸的二乙基乙醚溶液中1分钟（plexigum P28，Rohm GmbH，Darmstadt）再干燥两分钟，然后喷上含2%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Na N3（溶液A）的磷酸盐缓冲盐水液中，再浸入溶液A中，置于Petri盘中2小时。倒出溶液A后，病毒悬浮液（约每毫升25μg，在前面给定的2ml大小的盘中）加到色谱上，垂直竖立在湿润空气的Petri盘上。约培养2小时后，倒出病毒悬浊液，用PBS洗涤培养皿六次，每次一分钟。在抗体的特殊情况下，单克隆抗体817直接与病毒接触产生腹水流体，用溶液A稀释到1∶100，每个培养皿2ml，培养2小时;PBS洗涤5次后，孵化2小时（4×105cpm/ml125I标记的F（ab′）2，the Radiochemical Centre，Amersham）;再用PBS洗涤6次后，干燥培养皿，暴露于XAR-5X光胶膜上（Eastman），一般2～3天，用一个强的荧光屏。用塑料处理后能够产生一个疏水面;然后分离的糖脂或其它部分诱使之暴露于疏水固体表面，这与糖脂暴露于生物膜上很相似。这意味着，实验物质以其烃链密集于塑料面上，极性头部基团暴露且容易进入环境中。这很象活细胞的单层面。这种塑化处理对于其再产生及特异性来说是非常重要的，而且也说明了这种固相方法比传统抑制方法的优越性，后者是基于“溶解的”凝集物或分子团上的（见参考文献22）。
检测极限随配体的不同而变化，受体范围是5～50ng，或在同一微微摩尔级变动。统计结果中被认为是负的受体侯补者，不应有1或更多微克水平的暗点。本方法的一个明显的优点在于混合物首先被分离为不同部分，这就避免了微小成分的掩蔽或污染物质结合造成的错误。另外，非特异疏水部位的白蛋白包装也能够引起误差;最后，强烈洗涤也除去很多松散的非特异性结合物。通过比较可知，传统的抑制分析方法一般是在缺少或存在超声破碎的分子团时用悬浊液中的靶细胞培养病毒。对于溶血检测，是在混合物离心后进行光度学测定（参Huang，Lipids    18，1983，PP.489～492）。这样，就不存在白蛋白，也没有本方法中各部类似物的洗涤。
对病毒结合的定量确定，从类似物的固相结合或微滴孔中的抗体的技术（Brockhaus et al.，J.Biol.Chem.256，1981，PP.13223-13225）。一系列稀释的糖脂或其它物质在50μl甲醇中，在微滴孔中室温条件下过夜蒸发。用100μl的2% BSA在PBS中再培养2小时，在后用同体积的该溶液洗孔一次。50μl 1.5μg病毒于BSA-PBS中的悬浊液培养4小时，然后每次用100μl BSA-PBS，共洗四次。对于仙台病毒，50μl腹水产生的抗体817在溶液A中稀释1∶100，培养四小时后洗涤四次。最后，将50μl兔抗鼠Fab（2.5×104cpm125I-labelled F（ab′）2，The Radio chemical Centre，Amersham）在4℃隔夜培养然后每次用100μl BSA-PBS，其洗五次。然后，从板上切下各孔，对125I在光度计上单个分析1。
抑制研究
通过上述的两种分析方法，即在每毫升PBS或BSA-PBS中的自由糖或联有BSA的糖总含量最多为2毫升时，对病毒进行1～2小时的预温育，可达到抑制病毒结合的目的。然后将混合物全部加入到培养皿或其它器皿中。接着，还可以用ELISA技术的方法（酶连接免疫吸附检测）进行免疫研究（参见参考文献1和Rose    et    al，eds，Manual    ofClinical Immunology，Americ.Soc.Microbiol，Washington D.C，1980）。此时，微滴孔（Cooks M29型）用上述溶于甲醇的糖脂被敷，或用兔抗仙台抗血清作为标准化对照（见参考文献1）。所用的糖脂用GalβCer，它是一种病毒结合物，见表3的糖脂1（约有一半含有非羟基脂肪酸并且该品种是非活性的），而红细胞糖苷脂不是结合物，见表3的糖脂16，每孔各用500毫微克。然后，加入（100毫升/孔）pH9.6，浓度为50微克/毫升的抗血清碳酸钠缓冲液。再用2% BSA溶于50m MTris-HCl和0.15MNa Cl缓冲液，pH8.5，在37℃饱和2小时，接着用含1% BSA的这种溶液洗两次。每孔1.5微克仙台病毒，溶于100微升1% BSA缓冲液温育2小时，然后用1% BSA缓冲液，每次100微升洗四次。用抗体851与缓冲液按1∶100稀释的液体100微升在37℃温育1.5小时，接着用缓冲液，每次100微升洗四次，从而探测结合的病毒。100微升辣根过氧化物酶-共轭的兔抗鼠抗体（Dakopatts，Glostrnp，Denmark;P161，10mg/ml按1∶500小时的）在37℃温育1.5小时。再用缓冲液洗四次。每孔100微升OPO溶液（4毫克邻苯二胺，Sigma，溶于10毫升0.1M柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液，pH5.0，并已向其中加入了4微升30%的H2O2）温育15分钟，然后，每孔中加入50微升0.5MH2SO4终止反应。在492毫微米处读出光密度值。典型数据如下：除了病毒以外的各步＝0.150;与红细胞糖苷脂的结合＝0.2000;与GalβCer的结合＝0.650;与抗血清的结合＝1.7。
用表1的物质9抑制病毒的结合按下述进行。大约2微克病毒用约200微克物质9在37℃，于硅化试管中预培养2小时，然后每孔移入50微升并以37℃温育1小时，接着用含1%    BSA的缓冲液洗四次。以后的各步按上述进行。物质9在7次分离预培养步骤中接1∶4稀释。
在用已描述的两种分析抑制病毒结合的同时进行准备实验，即用经过声处理的亲水脂糖或其它物质的胶粒象前面所述的那样对病毒进行预温预。这是用于仙台病毒的。对于类ERA病毒菌株CVS-3337的噬菌区抑制实验（Lycke    et    al.，eds.，Textbook    of    Medical    Virology，Butterworths，London，1983）做法如下：
将卵磷脂（200μg），胆固醇（100μg）以及含有2-羟基脂肪酸的Galβ→4Glc βCer（230μg）或前两种脂如磷脂酰丝氨酸（200μg）溶解在氯仿与甲醇的混合液里，挥发性溶剂存放于一个试管里。加入4毫升PBS，用Vetrasonics型W-370在室温下对混合物声处理1～2小时。用PBS稀释病毒到大约每毫升含4×103个可成噬菌区的单位。0.5毫升的病毒和0.5毫升的经过声处理的胶粒（或经过处理的PBS）在室温下温育3小时。在标准条件下进行残留的感染性病毒对CER细胞单层的稀释和滴定（Lennett，ed.Manual of Clinical Microbiology，Amenric.Soc Microbiol，Washington D.C，1980）。
例1    第二步受体的发现
因为对有关仙台病毒与含神经氨酸的受体（第一布受体）的结合的研究较多（见参考文献26）（图1和图2分别表示病毒与第一步受体及第二步受体的结合），所以仙台病毒在分析中做为模式病毒（参阅材料与方法中描述的覆盖物分析方法）。按材料与方法中描述方法制备的病毒经过分析，显示出两种预先未知的、与Z菌株的变种结合的受体，在与含神经氨酸的糖脂（神经节苷脂）结合的情况下，具有各自独立的特性。S变种仅与人体红细胞的神经节苷脂结合，而不与人脑的神经节苷脂结合（图1）。另一方面，G变种可与两种来源不同的神经节苷脂结合（未画出）。现在知道，这两种来源不同的神经节苷脂在结构上相关，而仅仅是核心顺序上不同。这样，神经氨酸酶把神经氨酸从神经节苷脂上解离下来就完全抑制了两种病毒制剂的结合。这说明与神经节苷脂的结合完全依赖于神经氨酸的存在，而不是依赖于也包括非神经氨酸部分在内的糖脂的结合表位的存在，后者在脑或红细胞也是不同的。因此，第一步受体的特性在这两种情况下是不同的，而且应与两种病毒上各自的识别受体的，化学性质不同的位点相一致。那几种分析中可结合的带可用不同大小的核心物质上的受体表位的存在来解释，这些核心物质在色层分离谱上的流动性是不同的。病毒的G变种能与两种不同来源的神经节苷脂结合的事实可解释为，与S变种比较，G变种结合的选择性不强。
和与神经节苷脂（第一步受体）不同的结合形成对比，两个变种以同一模式与第二步受体结合。对S变种的说明见图2。在例2中还要进一步详细地说明，这种结合是对于神经氨酸的情况而言的，并以此和与第一步受体的结合在化学特性相区别。
这说明病毒有两个化学特性不同的，各自独立的受体。另外，如同在说明书及材料与方法中说明的那样，从分析中获得结果说明了方法的特点。当比较通过用化学喷涂（使所有物质可见）的放射自显影（病毒结合）而得到的类型时，选择结合是明显的。一些较大的、由于喷涂而出现的，结构上与受体物质密切相关的带被认为完全与病毒结合（参阅例2）。
例2：与几种病毒有关的天然受体侯选者结合特性的分析
按材料与方法中描述的覆盖物分析方法，分析了大量的受体侯选者（表3）的结合活性。
表3
编号    糖脂结构    病毒结合
1    GalβCer    +
2    GlcβCer    +
3    Galβ1→4GlcβCer    +
4    Galα1→4GalβCer    +
5    Galα1→3Galβ1→4GlcβCer    +
6    Galα1→4Galβ1→4GlcβCer    +
7    Fucα1→2Galβ1→4GlcβCer    +
8    GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    +
9    GalNAcβ1→4Galβ1→4GlcβCer    +
10    NeuAcα2→3Galβ1→4GlcβCer    -
11    Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4GlcβCer    +
12    GalNAcα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4GlcβCer    -
13    Galα1→3Galα1→4Galβ1→4GlcβCer    -
14    Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    +
15    Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    +
16    GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4GlcβCer    -
17    Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4GlcβCer    -
18    Fucα1→2Galα1→3Galα1→4Galβ1→4GlcβCer    -
19    Fucα1→2Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    -
20    Fucα1→2Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    -
21    Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    +
22    Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    +
23    NeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    -
24    Fucα1→2Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    -
25    Fucα1→2Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcβCer    -
26    Galβ    甘油二酯
27    Galα1→6Galβ    甘油二酯
1-25：动物器官，26-27植物器官。单糖除Fuc为L型外均为D构型，且所有单糖均为吡喃糖。+表示结合而-表示没结合。
按前面在材料与方法中描述过的器官溶解法从靶细胞组织中提取出用于病毒感染的混合物，这些混合物在色谱表面上被预先分开以便在覆盖上病毒后能保护活性物质。结合物质经离析，结构特化，以更纯净的形式用于更精细的结合研究。仙台病毒是首次用于这些分析的。由于一次覆盖分析可能含有100种以上的具有不同结构的特质，因此得到一种非常有效的实际受体的选择方法。在使用过的人和动物的各种组织中，如神经组织、血液、胃肠道、尿道，包括成人与胎儿的组织，只有表3中标有｜的和在表4中要进一步说明的糖脂才已证明是受体。在同样的水平，别的表面膜或别的物质没有象按同样方法共同抽提出的胆固醇或各种甘油磷脂那样出现结合。另一方面，几种分析过的病毒（参阅表2），包括仙台病毒（参阅例1）在内，显示出糖脂的结合不同于表3和表4中的方法，后者在化学特性上是不同的，与第一步受体一致。
如同表4中的说明和表3某些物质的说明，依赖于糖脂中亲脂性部分的成分，即神经酰胺，而与天然受体的结合是一种重要的结合。只有神经酰胺中具有2-D-羟脂肪酸的物质才具有活性。因此，涉及到糖类部分（表3）变化的重要性，用于进一步精细试验的所有天然糖脂都要含有2-D-羟脂肪酸。表3中被肯定的种类在含有2-羟脂肪酸时是具有活性的，否则不具有活性。
病毒能以五种糖与糖脂结合（表3）。可是，相当多有关结合的研究（参阅材料与方法）说明单糖物质GalβCer和GlcβCer是最好的结合者。图4中，曲线A代表这两种糖脂。曲线C表示表3中的二糖脂3，曲线D代表三糖脂5。重要的是要说明，这种第二步受体的亲合力（强度）具有与第一步受体同样的等级强度（曲线B）。因此可用分子的外部识别来解释与较大的糖脂结合。这种非常规的结合，以发明者从细菌和细菌毒素的糖类受体结合的结果来看（见参考文献23，25和46），并非意料之外的。一些（大部分）被检测的糖脂尽管含有结合表位，例如→4    GlcμCer，而不结合的事实，是由于大病毒粒子接近单糖表位时有空间障碍。如同使用受体特性的概念一样，这也是在分子水平具有立体特性的一个证据，对非特异性相互作用的一个有力的反驳。
对更广范围应用感兴趣的是，已知植物中含有受体鞘类糖脂（见参考文献41），表3中的含有2-羟脂肪酸的物质2在植物叶子里是一种主要的糖脂。能与仙台病毒结合的物质26和27在植物里也相对较多，而且可做为植物病毒的受体。
不与自由神经酰胺（不含糖）结合的发现对受体物质的结合表位的解释很重要。此外，在分析中，当加入与白蛋白（参阅例6）多价结合的自由寡聚糖或寡聚糖，例如Galβ、Glcβ或Galβ1→4    Glcβ时，对病毒与受体的结合没有抑制。由此可以得出结论，仅对糖脂才存在结合;单独的神经酰胺或单独的糖脂（或结合有一个蛋白质）都不能与病毒相互作用。
从结合的定量研究（图4）得到的曲线指出，第一布受体与第二步受体的结合亲合力非常相似（见各自的曲线B和曲线A）。因为第一步受体已被研究为生物学关系（见参考文献B），这便意味着第二步受体的结合亲合力完全在生物学水平上。而最好的结合者是含有单糖的（比较曲线A，C和D），一些有几个糖的结合者却不是这样（曲线E），尽管后者在覆盖分析中的结合是完全可检测的（表3）。
利用分析检验从定量分析中可以得出的第二个结论是，结合是需要有效多价的低亲合力型。这是根据在同一分析的病毒结合和几种细菌病毒与其各自的糖脂受体结合的比较而得的。几种细菌（见参考文献23和46）和Shiga病毒（见参考文献25和46）的结合类似于病毒（曲线在受体浓度类似的水平处升高）。另一方面，对于霍乱毒素（大小似Shiga毒素），曲线的波峰向左移动到受体浓度较大的102-103处。这些曲线的不同位置同使用可溶的，单价寡糖同功受体来抑制与糖脂受体的配位结合的可能性是一致的。霍乱毒素易被抑制，而对Shiga毒素，在双糖受体浓度为每毫升5毫克的水平上检测不出抑制。可是，利用与白蛋白多价结合的双糖容易抑制Shiga毒素。结论是，霍乱毒素是一高亲合力结合，而Shiga毒素是一低亲合力结合，后者需有有效多价的结合。对于别的几种细菌存在着类似于Shiga毒素的情况。因为病毒结合的曲线与Shiga毒素及几种细菌一致，而与霍乱毒素不同，所以病毒结合是低亲合力型。因此，天然结合表位用于病毒结合似乎还需要多价存在。这种情况在结合分析中和生物膜（例4）中是存在的，并与病毒表面上的结合蛋白的多样性是一致的。
上述对仙台病毒描述的结果可推广到一系列别的病毒，代表大部分已知的病毒品系（表2）。表2中所有的病毒都显示出以同一种方式结合，这种方式非常类似于仙台病毒在第二步受体情形时的结合，尽管其中几种病亲被证明有类似于仙台病毒（例1）第一步受体的独立的第一步受体。利用病毒比较及材料与方法中描述的抗体检测对这些病毒进行了分析。对最大限度的受体侯选者来说，可利用图2中分析所用的糖脂混合物。另外，表3中的几种分离的物质用薄层培养皿中的稀释以检测结合的亲合性与仙台病毒比较。结果表明所有被测的病毒都有与图2完全相同的或非常相似的结合型，具有同样的结合亲合性。这意味着被测病毒具有一种共同的特殊结构特性，这种特性与病毒表面上的共同的结合蛋白应是一致的。该特性不依赖于病毒不同的外壳或基因组的特性（表2）。因此，形态及遗传不同的病毒具有一种共同的结合特性，即可用于穿透的第二步受体，这些病毒能独立地影响器官系统从而引起人和动物多种疾病。
例3受体的化学特性以及结合表位的理想构象
如同材料与方法中所描述的，单个的受体活性物质以纯净的形式被分离并被化学特性化。这既提供了有关极性疏水部分的结构方面的信息（即包括糖的类型、顺序、结合位点、异构性及环大小在内的糖类结构），也提供了非极性部分的信息（即神经酰胺，包括脂肪酸链的结构以及长度，分枝，未饱和程度、位置和羟基的构象，以及长链的基本结构如烷烃链长，未饱和程度及功能基团的位置和构象）。所用的方法有高级质谱（见参考文献14）和NMR波谱（见参考文献15）及常规的降解方法。为了测量大范围的结构，取自不同动物的组织用来作为比较源（见参考文献13a和33）。一些使用的上皮组织已描述了其有关的糖脂结构，如人的肠道（参考文献42和43）。大鼠肠（见参考文献13）。小鼠肠（见参考文献20和44）。狗的肠（见参考文献45）以及猫、鳕鱼、几内亚猪、仓鼠和兔的肠（见参考文献20）。象例2中描述的那样，也分析了几种其它组织。这些结构许多在最近已被重新检查（见参考文献13a）。这就是说分析了大量的糖脂及不包括表3中的物质在内的其它物质，发现不与仙台病毒结合。
一个非常重要的特点是结合对于神经酰胺的依赖，如同表4中总结的那样，一种特别的糖脂，即表3中的3号，从所需的天然源中分离并细致地分析了它的细微结构。象材料与方法中描述的那样，进行试验时应用了覆盖物结合分析。也确定了正结合的标准。用材料与方法中描述的方法定义了被测的糖脂。图5显示了神经酰胺的各种分子类型。此后的表4也与该图有关。
表4
糖脂的神经酰胺结构的病毒结合反应
脂肪酸与长链基的结合    制备源    病毒结合
B.非羟脂肪酸-鞘氨醇    人的红细胞    -
C.非羟脂肪酸-植物鞘氨醇    狗小肠    （｜）
D.2-羟脂肪酸-鞘氨醇    狗小肠    ｜｜
E.2-羟脂肪酸-植物鞘氨醇    大鼠小肠    ｜｜
-：没结合    （｜）：弱结合    ｜｜：有效的结合
这样，尽管单糖结构对四个变种是理想的，但仅是神经酰胺中含有2-D-羟脂肪酸的单糖与病毒结合。这也适用于表3中的其它糖脂。首先，这似乎意味着2-羟基是结合中特有的。可是对各种人造糖脂结合的研究排除了这一点（例5）。取而代之的解释是，在构象上含有2-羟脂肪酸的糖鞘脂类不同于含有一个无羟脂肪酸的糖鞘脂类。这已为组成的X-射线晶体衍射分析（见参考文献31）及以后的NMR分析所证实。在这用的是人造单糖鞘脂。2-羟糖鞘脂有一个匙状或铲状构象（参见图6），该构象在与神经酰胺成大约110°角的位置上有一个糖环。在无羟异构体中，该角大约是180°。在所有其它的共同分析的物质的结构参量中，这是解释中仅有的共同原因。因此，如同上面讨论的一样，糖鞘脂的2-羟基的重要性在于提供了第一个糖化物于适当弯曲的、优选的构象。这使得该糖的α-侧可以进入结合，该处因此就是被称为结合表位的那部分。在糖（大约在分析的膜状表面的右侧）的描述中，在无羟糖鞘脂类里，这个结合表位不太可能容易进入而与病毒结合。
例4.鞘细胞上病毒感染入口处的受体和其它细胞上的受体
象例2和例3中描述的那样，大量的不同动物的上皮组织被本发明者用来做为制备糖脂的源泉。为了更精确地检测病毒直接感染的上皮鞘细胞的受体糖脂的位置，这些细胞象材料与方中所描述的那样被分离。对大鼠的肠细胞（见参考文献19），包括小、大肠、采用了这一技术;该技术也用于人的小、大肠。并在人肠（见参考文献42）和人的尿道刮了粘液。不考虑组织或动物源，一个所有上皮分析样品（参阅材料方法）的共同决定者是GlcβCer（表3中含有2-羟脂肪酸的物质2）及多数情况下含有2-羟脂肪酸的GalβCer。因此，最理想的天然仙台病毒结合者（图4的曲线A）一般存在于上皮细胞中。做为说明，图7显示了来自四种不同血型人小肠上皮细胞的分析结果。正如期望的那样，运动较慢的血液基团fucolipids在样品中有变化，它们有共同的受体型糖脂。因此当感染有机体时所有病毒侵袭的细胞都含有第二步受体。
非上皮细胞有少量的或可能实际上没有这几种受体糖脂。与以前对此情形的看法相反，用于容器（穿刺分析）的红细胞含有受体，在人、牛和猪的细胞中发现这些受体中含有少量的含有2-羟脂肪酸的GalβCer和GlcβCer。
受体糖脂是其重要部分的上皮表面膜的一般结构特性在目前的情况是合适的。在神经酰胺中具有不同数量羟基的鞘脂类的一个特性是靠氢键结合的供体及受体负荷能力（图8）补偿了膜三分之一的有限带（见参考文献33）。这时膜的稳定性可能是异常重要的，这种稳定性依赖于横向定向的氢键网。目前可用的有关细胞表面膜的数据使我们有可能认为病毒已产生了一种结合特性，这种特性通过与这种网的所有三个基本成分的特殊的相互作用而干扰了这种稳定性。
例5仙台病毒与类似于天然受体的非生物人造物质结合的研究。
按材料与方法中所述的两种分析方法对表1中所列的许多人造物与病毒的结合进行分析。表5总结了仙台病毒的覆盖物与所谈的物质的稀释物结合的半定量研究结果。｜与表3或表4中的｜无关，而仅仅是表5内部间的相对比较。
象显示的那样，12是弱结合，11，13或14都不是，其中比较偏向于Glcβ。双链化合物是较好的结合者（比较15和13）。可更重要的是Sulphono类似物，即第16-18号与上面提到的双链化合物的结合非常强。通过前述的定量结合分析，更精确的定量研究表明，18号具有同天然受体，即表3中的3同样一致的亲合力，两者在图4中均以曲线C代表。这些物质是在对天然受体已做的研究的基础上设计的，有趣的是受体类似物的自然表位（例3）的特性和大小，以及规格与这些物质完全一致。虽然B部分是非手性的，且载有一个或二个Sulphono基团，取代了具有一个酰胺链和二个羟基的手性部分，但是满足了对A、B和C部分的要求（象前面解释的那样）。明显地，糖的α侧是可用于结合的，这是例3中说过的必要条件。对于那些同构物，这可以解释为通过排斥可能的氢水结合而提供了四个仅有的位点的Sulphono基团，在分析的单层中形成一个较低密度的分子外层。
表5还说明，几种其它的人造物不与病毒结合。这要么是没有完全满足对B的要求（物质11，13和14可以分别与好的结合者，即表3中的物质1，3及4加以比较），要么是因为在缺少象天然受体的2-羟脂肪酸一样的决定因素时，使A的α侧不能呈现，封闭了链的外层。
表5
用于抑制或结合的人造受体同构物
（糖为D构型及吡喃糖型）    抑制
1    Gal    or    GalβCETE    -
2    Glc    or    GclβCETE    -
3    Galβ1→4Glc    or    Galβ1→4GlcβCETE    -
4    GalβCETE-BSA    -
5    GlcβCETE-BSA    -
6    Galβ1→4GlcβOEt    -
Figure 86100608_IMG52
Figure 86100608_IMG53
10    Galβ1→4GlcβCETE-BSA    -
结合
11    GalβOTE    -
12    GlcβOTE    （+）
13    Galβ1→4GlcβOTE    -
14    Galα1→4GalβOTE    -
CETE：（OCH2CH2SCH2CH2CO2CH3）
OTE：（OCH2CH2S（CH2）17CH3）
BSA＝牛血清白蛋白
-：不结合或抑制;（+）：弱结合;+：结合;++：有效的结合;+++：完全结合。
实施例6
抑制实验
游离态或衍化的或结合有BSA的Gal，Glc和Galβ1→4    Glc（表5的物质1-6和10）用来抑制仙台病毒和受体的结合，所用的糖脂混合物见图2，但还用了表3的1，2和3号物质的纯品，将它们置于薄层板上，在将病毒成层于板上之前，用糖对病毒预培养。放射性自显影的痕迹没有消弱的趋势，这就表明这些物质不具备竞争受体结合的能力。结论是，以单价或多价形式存在天然受体糖部分，其自身是不能与病毒相结合。相似的是，使用表3中的3号物质作为受体而进行的微滴测定也没有抑制发生。
用超生处理的各种膜脂的微团对仙台病毒预培养，明确地抑制了病毒与置于薄层板上的表3的几种糖脂的结合。再者，在噬菌体抑制试验中，经小心超声处理的含表3的3号物质的脂质体则完全抑制了狂犬病病毒。在相似的稀释滴定中，含磷脂酰丝氨酸的脂质体则没有减少噬菌体。
在将病毒成层于薄层板上之前，先用可溶性受体类似物（表5的7-9号物质）对仙台病毒预温育，或在小孔中温育，得到以下结果。
仙台病毒（60微克）和9号物质（1毫克）溶于2毫升PBS，在成层于薄层板上之前，于室温预温育1小时，培养及操作按“材料及方法”所述进行，然后用放射性自显影测定病毒的结合。用于板上的糖脂样品是人红细胞总神经节苷脂（第一步受体，见实施例1），以及表3的1，2，3和5号糖脂，只有适宜的阴性对照例外。与对照板相比（不用表5的9号物质预温育，病毒的结合），在用9号物质预温育之后，病毒的结合显著地减少，其根据放射性自显影图上的暗区变浅来估计的。这样，与糖脂1，2和3号的结合减少了几倍，并且与5号糖脂结合的谱带则消失了。相反，对与第一步受体（红细胞神经节苷脂，与图1相比较）的结合则没有影响。用1mg/ml的7号和8号物质进行的相似的预温育，没有给出明显可见的对病毒结合的抑制。从这些实验以及附加的分析所得出的结论是，多价形式的合成受体类似物（表5的9号物质），能对与第二步受体的结合产生选择性的抑制），而同时又毫不影响与第一步受体的结合，但单价形式的（表5中的7号和8号物质）则不能。
用这些可溶性受体类似物对仙台病毒预温育，使用微滴孔和ELISA分析（见材料与方法），得到以下结果。用表5的9号物质预温育降低了病毒与第二步受体GalβCer的结合（A492＝0.350，是经三次1∶4的稀释之后回到最大水平的最高浓度的典型数值，参见材料与方法）。对病毒与被敷的抗血清的结合没有抑制效应，用单价类似物（7号和8号物质）的预温育也不产生抑制）。这些结果与上述附加分析的结果相一致，均对与第二步受体的结合产生选择性抑制，但对抗体则不行，并且要使类似物有效，就需要多价性。
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Claims (92)

1、一种制备化合物的方法，该化合物具有与由1-O-β-D吡喃半乳糖基-N-(2-D-羟基烷酰基)-1，3-二羟-2-D-氨基烷所带的天然结合表位相应的一般构象，其构象是：
Figure 86100608_IMG1
具有按晶体规则描述的近似的空间原子关系，晶胞，a=11.2
Figure 86100608_IMG2
，b=9.3
Figure 86100608_IMG3
，c=46.5
Figure 86100608_IMG4
，β=99°，选择的部分原子座标X，Y和Z分别为，对于已糖，C1″0.82，0.99和0.42，C3″0.91，1.25和0.44，C5″0.72，1.15和0.46，对长链基，O10.80，0.90和0.41，C10.76，0.76和0.42，C20.78，0.66和0.39，C50.61，0.62和0.31，N10.90，0.69和0.38，O20.57，0.69和0.37，对脂肪酸，C1′0.98，0.58和0.37，C2′1.08，0.64和0.36，C5′1.17，0.71和0.29，O1′0.95，0.45和0.38，O2′1.12，0.79和0.37，显示出这些原子关系和座标的化合物及其不干扰结合活性的变型体，因为该化合物含有极性一疏水部分(与天然结合表位构象式中A部分相似的结构)，包括与天然结合表位中已糖x侧相一致的结构，并且包含至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的D型或L型的单糖，该单糖在这样的位置上被适当地取代，即取代物不对与天然结合表位上的已糖x侧相一致的结构发生空间抵触的适宜的取代，极性部分(与天然结合表位构象式所示的B部分相似的结构)含有至少两个氢结合位点，该位点可以是氨基、羰基、羟基、巯基、亚砜基或砜基，以及疏水部分(与天然结合表位构象式所示的C部分相似的结构)，其含有饱和或不饱和的，分支或直链的，开链或环状的烃，或它们的结合体，并且表面面积至少为50-80
Figure 86100608_IMG5
2，用于对病毒感染的诊断，预防和治疗，该方法包括已知的步骤。
2、根据权项1所述的方法，其中的单糖是戊糖，己糖，庚糖，或它们的衍生物。
3、根据权项2所述的方法，其中的单糖为呋喃型或吡喃型。
4、根据权项3所述的方法，其中的单糖在4位上被取代。
5、根据权项1-4中任何一项所述的方法，其中的取代物是单糖，双糖，叁糖或四糖。
6、根据权项1所述的方法，其中极性-疏水部分与极性部分的连接含有至少两个具有天然结合表位构象的被适当取代的碳原子。
7、根据权项1所述的方法，其中极性-疏水部分与极性部分的连接是由极性-疏水部分上的糖苷氧或糖苷硫，醚或硫醚与极性部分上的CH基团或相似的基团之间的连接而建立。
8、根据权项1-7中任何一项所述的方法，它是脂联糖，如糖鞘脂或糖甘油脂，或它们的受体活性类似物。
9、根据权项8所述的方法，其中的糖脂是D-吡喃半乳糖基-β-二甘油酯或D-吡喃半乳糖基-α1→6-D-吡喃半乳糖基-β-二甘油酯。
10、根据权项8所述的方法，其中的疏水部分含有2-羟基脂肪酸。
11、根据权项10所述的方法，它是通式Ⅰ的鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，或通式Ⅱ的植物鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，或通式Ⅲ的二氢鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸
Figure 86100608_IMG6
其中，R代表至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的糖，R1和R2各自分别代表甲基，CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH，R3代表烃部分，该烃含有长度至少为5个碳原子的直链或分支的，饱和或不饱和的烃。
12、根据权项11所述的方法，其中的糖是：
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，or
Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ.
13、根据权项1所述的方法，其中的化合物具通式Ⅳ或Ⅶ，
Figure 86100608_IMG7
ROCH2CH2SO2R3R1Ⅶ
其中R代表至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的糖，R1和R2各自分别代表甲基，CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH，R3代表烃部分，该烃含有长度至少为5个碳原子的直链或分支的，饱和或不饱和的烃。
14、根据权项13所述的方法，其中的糖是：
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，or
Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ.
15、根据权项1所述的方法，其中包括从组织提取该化合物的步骤。
16、根据权项15所述的方法，其中所述的组织包括哺乳动物组织。
17、根据权项15所述的方法，其中所述的方法还进一步包括一步或更多步的提纯。
18、根据权项17所述的方法，其中所述的提纯步骤至少含有一步色谱。
19、根据权项1所述的方法，其中包括将极性-疏水部分与极性部分相结合的步骤。
20、根据权项19所述的方法，其中所述的疏水部分含有天然或合成的脂，极性-疏水部分含有糖。
21、一种将根据权项1-20所制备的化合物生产为多价形式的方法，其包括将该化合物与大分子载体以多价形式结合。
22、根据权项21所述的方法，其中所述的载体有疏水表面，所述化合物以疏水性非共价作用与该疏水表面相结合。
23、根据权项21所述的方法，其中所述的疏水表面是聚合物，如塑料，或任何已联有疏水基团的聚合物。
24、根据权项21所述的方法，其中所述的化合物是以共价键与大分子载体相连。
25、根据权项21所述的方法，其中所述的载体是天然或合成的聚合物。
26、根据权项21所述的方法，其中所述的载体是寡糖或多糖，寡肽或多肽，或它们的组合体或相似的取代的共轭物。
27、根据权项21-26中任何一项所述的方法，其中所述的载体是生理学上和药理学上可接受的载体。
28、根据权项27所述的方法，其中所述的载体是多聚-L-赖氨酸或多聚-D，L-丙氨酸。
29、一种制备药物组合物的方法，该组合物包括这样一种化合物，其具有与由1-O-β吡喃半乳糖基-N-（2-D-羟基烷酰基）-1，3-D-二羟基-2-D-氨基烷所携带的天然结合表位相一致的构象，
Figure 86100608_IMG8
其构象具有按晶体学规则描述的近似的空间原子关系，晶胞a＝11.2
Figure 86100608_IMG9
，b＝9.3
Figure 86100608_IMG10
，c＝46.5
Figure 86100608_IMG11
，并且β＝99°，对X，Y和Z的选择的部分原子坐标分别为，对己糖，Cl″0.82，0.99和0.42，C3″0.91，1.25和0.44，C5″0.72，1.15和0.46，对长链基，O1 0.80，0.90和0.41，Cl 0.76，0.76和0.42，C2 0.78，0.66和0.39，C5 0.61，0.62和0.31，N1 0.90，0.69和0.38，O2 0.57，0.69和0.37，对脂肪酸，Cl′0.98，0.58和0.37，C2′1.08，0.64和0.36，C5′1.17，0.71和0.29，O1′0.95，0.45和0.38，O2′1.12，0.79和0.37，表现出这些原子关系和座标的化合物或其不干扰结合活性的变形体，因为该化合物含有极性-疏水部分（与天然结合表位构象式中A部分的结构相似），包括与天然结合表位中己糖的α侧相一致的结构，并且最好包括至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的D型或L构型的单糖，该单糖可以在这样的位置上被取代，即取代物不对与天然结合表位上的己糖α侧相应的结构发生空间抵触的适宜的取代，极性部分（与天然结合表位构象式所示的B部分相似的结构）包含至少两个氢结合位点，这些位点可以是氨基，羰基，羟基，巯基，亚砜基或砜类，疏水部分（与天然结合表位构象式所示的C部分相似的结构）含有饱和或不饱和，分支或直链的，开链或环状的烃或它们的结合体，并且表面积至少为50-80
Figure 86100608_IMG12
，同时配以药理学上可接受的媒介物或赋形剂。
30、根据权项29所述的方法，其中所述单糖是戊糖，己糖，庚糖或它们的衍生物。
31、根据权项30所述的方法，其中所述单糖是呋喃型或吡喃型。
32、根据权项31所述的方法，其中所述单糖在4位上被取代。
33、根据权项29-32中任何一项所述的方法，其中所述的取代物是单糖，双糖，叁糖或四糖。
34、根据权项29所述的方法，其中极性-疏水部分与极性部分的连接含有两个具天然结合表位构象并被适当取代的碳原子。
35、根据权项29所述的方法，其中极性-疏水部分与极性部分的连接是由极性-疏水部分上的糖苷氧或糖苷硫，醚或硫醚与极性部分的CH2基或类似的基团之间连接而完成的。
36、根据权项29-35中任何一项所述的方法，其中所述的药用组合物是脂联糖，例如糖鞘脂或糖甘油脂，或它们的受体活性类似物。
37、根据权项36所述的方法，其中的糖脂是D-吡喃半乳糖基-β-二甘油酯或D-吡喃半乳糖基-α1→6-D-吡喃半乳糖基-β-二甘油酯。
38、根据权项36所述的方法，其中所述的疏水部分含有2-羟基脂肪酸。
39、根据权项38所述的方法，其中所述的组合物是通式Ⅰ的鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，或通式Ⅱ的植物鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，或通式Ⅲ的二氢鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，
Figure 86100608_IMG13
Figure 86100608_IMG14
其中R代表至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的糖，R1和R2各自分别代表甲基，CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH基，并且R3代表烃部分，该烃含有长度至少为5个碳原子的直链或分支，饱和或不饱和的烃。
40、根据权项39所述的方法，其中的糖是：
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ.
41、根据权项29所述的方法，其中所述的化合物具有通式Ⅳ或Ⅶ。
Figure 86100608_IMG15
其中R代表至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的单糖，R1和R2各自分别代表甲基，CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH，并且R3代表烃部分，该烃包含长度至少为5个碳原子的直链或分支，饱和或不饱和的烃。
42、根据权项41所述的方法，其中的糖是：
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，or，
Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ.
43、根据权项29至42中任何一项所述的方法，其中所述的药用组合物为多价形式。
44、根据权项29至42中任何一项所述的方法，其中所述的药用组合物是存有多个病毒结合位点形式的。
45、根据权项44所述的方法，其中的药用组合物是与大分子载体多价结合的。
46、根据权项45所述的方法，其中所述的载体具有疏水表面，化合物的疏水部分以疏水性非共价作用联到其上。
47、根据权项46所述的方法，其中所述的疏水面为聚合物，例如塑料，或任何已连有疏水基团的聚合物。
48、根据权项45所述的方法，其中所述的化合物以共价键与大分子载体相连。
49、根据权项48所述的方法，其中所述的载体是天然或合成聚合物。
50、根据权项49所述的方法，其中所述的载体是寡糖或多糖，寡肽或多肽，或它们的结合体，或相似的取代的共轭物。
51、根据权项45-50中任何一项所述的方法，其中的载体是生理学和药理学上可接受的载体。
52、根据权项51所述的方法，其中所述的载体是多聚-L-赖氨酸或多聚-D，L-丙氨酸。
53、一种使用化合物的方法，该化合物至少含有一种构象和性质均与动物，植物细胞上的第二步病毒结合受体的结合表位之构象和性质一致或类似的成分，该成分能与病毒上的识别第二步结合受体的结合表位的位点相结合，用于制备对于病毒感染的诊断，预防和治疗的组合物，或用于制备或分离病毒颗粒或表面成分。
54、根据权利要求53所述的方法，其中所述的成分包括一个疏水部分，一个与疏水部分相邻的极性部分，以及一个与极性部分相邻的即为极性又为疏水性的部分。
55、根据权利要求54所述的方法，其中所述的疏水部分，极性部分和极性-疏水部分形成一个总长约为15～20
Figure 86100608_IMG16
，宽约为8～10
Figure 86100608_IMG17
的连续表面。
56、根据权利要求54或55所述的方法，其中所述的疏水部分包括一个提供了疏水面表的烃部分，该疏水表面的面积约为50～80
Figure 86100608_IMG18
，极性-疏水部分包括一个与天然结合表位的己糖的α侧相一致的结构，并且极性部分包括至少两个氢结合位点。
57、根据权利要求56所述的方法，其中所述的极性-疏水部分含有一个同环或杂环结构。
58、根据权利要求57所述的方法，其中的极性-疏水部分含有一个单糖，该单糖可以这样的方式被取代，即取代物在空间上不与存在于天然结合表位的己糖的α侧相一致的结构相冲突。
59、根据权利要求58所述的方法，其中单糖具有β-吡喃半乳糖或β-吡喃葡萄糖的构象，至少在受体活性部分是如此的。
60、根据权利要求59所述的方法，其中的单糖是己糖。
61、根据权利要求60所述的方法，其中的己糖是半乳糖或葡萄糖。
62、根据权利要求56所述的方法，其中的烃部分包括饱和的或不饱和的，支链或直链的，开链或环状的烃，或它们的组合。
63、根据权利要求62所述的方法，其中的烃包括一个或两个饱和或不饱和，直链或支链的烃。
64、根据权利要求63所述的方法，其中的烃是神经酰胺的一部分。
65、根据权利要求64所述的方法，其中的神经酰胺含有2-羟基脂肪酸。
66、根据权利要求62-65中任何一项所述的方法，其中的烃部分至少含有14个碳原子，以20-30个碳原子为好。
67、根据权利要求53所述的方法，该化合物具有与由1-O-β-D-吡喃半乳糖基-N-（2-D-羟基烷酰基），1，3-二羟-2-D-氨基烷所带的天然结合表位相应的一般构象，其构象是，
具有按晶体学规则描述的近似的空间原子关系，晶胞a＝11.2
Figure 86100608_IMG20
，b＝9.3
Figure 86100608_IMG21
，c＝46.5 ，β＝99°，选择的部分原子座标对X，Y和Z分别为，对于己糖，Cl″0.82，0.99和0.42，C3″0.91，1.25和0.44，C5″0.72，1.15和0.46，对长链基，O1 0.80，0.90和0.41，Cl 0.76，0.76和0.42，C2 0.78，0.66和0.39，C5 0.61，0.62和0.31，N1 0.90，0.69和0.38，C2 0.57，0.69和0.37，对脂肪酸，Cl′0.98，0.58和0.37，C2′1.08，0.64和0.36，C5′1.17，0.71和0.29，O1′0.95，0.45和0.38，O2′1.12，0.79和0.37，显示出这些原子关系和座标的化合物及其不干扰结合活性的变形体，因为该化合物含有极性-疏水部分（与天然结合表位构象式所示A部分相似的结构），包括与天然结合表位中己糖α侧相一致的结构，并且包含至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的D型或L型的单糖，该单糖在这样的位置上被适当地取代，即取代物不对与天然结合表位上的己糖β侧相一致的结构发生空间抵触的适宜的取代;极性部分（与天然结合表位构象式所示B部分相似的结构）含有至少两个氢结合位点，该位点可以是氨基，羰基，羟基，巯基，亚砜基或砜基;以及疏水部分（与天然结合表位构象式所示的C部分相似的结构）含有饱和或不饱和，分支或直链的，开链的或环状的烃，或它们结合体，并且表面面积至少为50-80
Figure 86100608_IMG23
。
68、根据权利要求67所述的方法，其中的单糖是戊糖，己糖或庚糖，或它们的衍生物。
69、根据权利要求68所述的方法，其中的单糖是呋喃型或吡喃型。
70、根据权利要求69所述的方法，其中的单糖在4位上被取代。
71、根据权利要求67至70中任何一个所述的方法，其中的取代物是单糖，双糖，三糖或四糖。
72、根据权利要求67所述的方法，其中的极性-疏水部分与极性部分的连接包括两个被适当取代的，具有天然结合表位构象的碳原子。
73、根据权利要求67所述的方法，其中的极性-疏水部分与极性部分的连接是由极性-疏水部分上的糖苷氧或糖苷硫，醚或硫醚与极性部分上的CH基团或类似的基团之间的连接而建立。
74、根据权利要求67-73中任何一个所述的方法，其中的化合物是脂联糖，例如糖脂，糖鞘脂或糖甘油脂，或它们的受体活性类似物。
75、根据权利要求74所述的方法，其中的糖脂是D-吡喃半乳糖基-β-二甘油酯或D-吡喃半乳糖基-α1→6-D吡喃半乳糖基-β-二甘油脂。
76、根据权利要求74所述的方法，其中疏水部分含有2-羟基脂肪酸。
77、根据权利要求76所述的方法，其中的化合物是通式Ⅰ的鞘氨醇-2-D羟基脂肪酸，或通式Ⅱ的植物鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，或通式Ⅲ的二氢鞘氨醇-2-D-羟基脂肪酸，
其中R代表至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的糖，R1和R2各自分别代表甲基，或CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH，R3代表烃部分，其包括有链长至少为5个碳原子的直链或分支，饱和或不饱和的烃。
78、根据权利要求77所述的方法，其中的糖是
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，or
Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ.
79、根据权利要求67所述的方法，其中的化合物具有通式Ⅳ或Ⅶ，
Figure 86100608_IMG25
其中R代表至少在受体活性部分具有β-吡喃半乳糖构象的糖，R1和R2各自分别代表甲基，或CHO，NO2，NH2，OH，SH，CONHNH2，CON3或COOH，R3代表烃部分，其包括有链长至少为5个碳原子的直链或分支，饱和或不饱和的烃。
80、根据权利要求79所述的方法，其中的糖是
Galβ，
Glcβ，
Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ，
Galα1→3Galβ1→4Glcβ，
Galα1→4Galβ1→4Glcβ，
Fucα1→2Galβ1→4Glcβ，
GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ，
Galα1→3（Fucα1→2）Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，
Galβ1→3（Fucα1→4）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ，or
Galβ1→4（Fucα1→3）GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ.
81、根据以上任何一个权项所述的方法，其中所述的化合物以单价形式提供。
82、根据权利要求53-80中任何一项所述的方法，其中的化合物以其为病毒提供多个结合位点的形式被提供。
83、根据权利要求82所述的方法，其中的化合物是与大分子载体多价结合的。
84、根据权利要求83所述的方法，其中的载体有疏水表面，化合物的疏水部分通过疏水性非共价作用与其相联。
85、根据权利要求84所述的方法，其中的疏水表面是聚合物，如塑料或任何已联有疏水基团的聚合物。
86、根据权利要求83所述的方法，其中的化合物是与大分子载体共价连接的。
87、根据权利要求86所述的方法，其中的载体是天然的或合成的聚合物。
88、根据权利要求87所述的方法，其中的载体是寡糖或多糖，寡肽或多肽或它们的结合体，或类似的适当取代的共轭物。
89、根据权利要求83-88中任何一项所述的方法，其中的载体是生理学和药理学可接受的载体。
90、根据权利要求89所述的方法，其中的载体是多聚-L-赖氨酸或多聚-D，L-丙氨酸。
91、根据上面任何一项权项所述的方法，抵抗选自下列各科的病毒，如腺病毒，疱疹病毒，原生粘病毒，寄生病毒，杆状病毒，呼吸道和肠道病毒，细小核糖核酸病毒和Retroviridae。
92、根据权利要求91所述的方法，其中的病毒选自腺病毒，疱疹病毒，流感病毒，流行性腮腺炎病毒，仙台病毒，狂犬病毒，螺旋病毒，呼吸道和肠道病毒，以及HTLV病毒。
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