CN1835962A - 利用乙酰化二糖治疗疾病的组合物与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用乙酰化二糖及其类似物来治疗疾病的组合物与方法。

Description

利用乙酰化二糖治疗疾病的组合物与方法
本研究是由国立健康研究所(NIH)基金CA46462资助的。因此政府对本发明拥有权利。
发明领域
本发明通常涉及利用乙酰化二糖及其类似物治疗疾病的组合物与方法。
发明背景
肿瘤转移被认为是依赖于血液运载的肿瘤细胞、循环血小板(促进血小板-肿瘤栓形成)与内皮间的细胞粘附，以促进在脉管系统的停留、生长和外渗。参见唐等人(Tang et al.)，《入侵转移》(InvasionMetastasis)，14卷：109-122页，1994年；迈克埃弗尔等人(McEver etal.)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，14卷：585-591页，1997年；克劳斯等人(Krause et al.)，《临床试验转移》(Clin.Exp.Metastasis)，17卷：183-192页，1999年。已有报道揭示了此过程中作为重要元件的一些类型的粘附受体和配体，包括选择素(selectin)、趋化因子和整合素(integrin)。参见唐等人(Tang et al.)，《入侵转移》(InvasionMetastasis)，14卷：109-122页，1994年；康奈基(Kannagi)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，14卷：577-584页，1997年；伯恩斯(Behrens)，《乳腺癌研究与治疗》(Breast Cancer Res.Treat.)，24卷：175-184页，1993年。总之，这些肿瘤细胞的粘附特征类似于在炎症过程中的白细胞渗出特性。在两种情况下，在细胞表面糖轭合物上，寡糖、唾液酸Lewis X[sLeXSiaα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAc]与唾液酸Lewis a[sLeaSiaα2，3Galβ1，3(Fucal，4)GlcNAc]的表达，使得细胞具有粘附内皮细胞、血小板或白细胞上的E-选择素、P-选择素和L-选择素的能力。对一种或多种选择素遗传改变的人肿瘤与小鼠的研究强调了这些相互作用在癌细胞血源性转移中的重要性。参见拜安科恩等人(Biancone et al.)，《试验医学杂志》(J.Exp.Med.)，183卷：581-587页，1996年；菜克宁等人(Renkonen et al.)，《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)，74卷：296-300页，1997年；弗伦特等人(Frenette et al.)，(Thromb Haemost)，78卷：60-64页，1997年；金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年；伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年。
对所述选择素的糖类配体以O-连接的糖蛋白粘蛋白和糖酯为主，其在簇排列(clustered arrangement)中表现为sLeX或sLea。参见福田(Fukuda)，《癌症研究》(Cancer Res.)，56卷：2237-2244页，1996年；堪萨斯(Kansas)，《血液》(Blood)，88卷：3259-3287页，1996年；金等人(Kim et al.)，《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)，155卷：461-472页，1999年。一些侵袭性的实体肿瘤表现出对抗sLeX单克隆抗体、E选择素和P选择素有显著的反应性。这些肿瘤包括来自肺、结肠与乳腺的较大部分的肿瘤。参见康奈基(Kannagi)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，14卷：577-584页，1997年；莱克宁等人(Renkonenet al.)，《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)，74卷：296-300页，1997年；金等人(Kim et al.)，《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)，155卷：461-472页，1999年；福岛等人(Fukushima et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，44卷：5279-5285页，1984年；康奈基等人(Kannagi et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，46卷：2619-2626页，1986年；曼诺里等人(Mannoriet al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，55卷：4425-4431页，1995年；中森等人(Nakamori et al.)，(J.Clin.Oyacol.)，15卷：816-825页，1997年。有sLeX参与的粘附作用可能通过血小板上的P选择素或白细胞上的L-选择素来稳定“肿瘤栓(neoplastic emboli)”、或通过促进粘附于并有可能渗出内皮，从而在转移的病理生理的早期步骤中发挥重要作用。参见金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年；伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年；莱斯等人(Rice et al.)，《科学》(Science)，246卷：1303-1306页，1989年；斯通等人(Stone et al.)，《临床调查杂志》(J.Clin.Invest.)，92卷：804-813页，1993年；洪等人(Honn et al.)，《癌症转移评论》(Cancer Metastasis Rev.)，11卷：325-351页，1992年；弗伦特等人(Frenette et al.)，《试验医学杂志》(J.Exp.Med.)，191卷：1413-1422页，2000年。这些相互作用的重要性来自结肠、肺、胃以及其它癌症切除后的患者的研究，此研究表明活存与sLeX的肿瘤表达呈逆相关。参见小川等人(Ogawa et al.)，(J.Thorac.Cardiovasc.Surg.)，108卷：329-336页，1994年；等人(Nakamori et al.)，(Dis.Colon Rectum)，40卷：420-431页，1997年；巴尔杜斯等人(Baldus et al.)，《肿瘤生物学》(Tumour Biol.)，19卷：445-453页，1998年。
目前研究已经集中于可阻断细胞上Lewis糖类抗原表达的小分子抑制剂的开发上。过-O-乙酰化二糖(Galβ1，4GlcNAcβ-O-萘甲醇[AcGGn-NM]或GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇[AcGnG-NM]的乙酰化形式)被细胞摄取，通过高尔基体中相关的糖基转移酶脱乙酰化且被用作底物。当所述二糖发生寡糖聚集时，会导致源自内源性糖轭合物的聚糖生物合成的转移。参见沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92卷：3323-3327页，1995年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，272卷：25608-25616页，1997年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年。此结果伴随细胞表面sLex表达的减少。单糖GalNAca-O-苄基以相似的方式发挥作用，改变离体结肠细胞系和白细胞系的粘蛋白上O-连接的链的表达，并改变细胞对血小板和内皮的粘附。参见尼弗等人(Niv et al.)，《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)，50卷：147-152页，1992年；等人小岛等人(Kojimaet al.)，《生物化学与生物物理研究通报》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，182卷：1288-1295页，1992年；德拉诺伊等人(Delannoy etal.)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，13卷：717-726页，1996年。然而，需要更高浓度的单糖才能实现与二糖相似的抑制程度(分别为1-5mM对10-50μM)。参见弗斯特等人(Fuster et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，63卷：2775-2781页，2003年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92卷：3323-3327页，1995年；辛德斯高尔等人(Hindsgaul et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，266卷：17858-17862页，1991年；汗等人(Khan et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，268卷：2468-2473页，1993年；罗沃维等人(Lowary et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，251卷：33-67页，1994年；林科尔等人(Linker et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，245卷：323-331页，1993年。因此，本领域需要更有效的阻断Lewis糖类抗原表达并能够作为治疗试剂来控制和预防肿瘤转移的抑制剂。
发明概述
本发明通常涉及肿瘤疾病或转移疾病的治疗或预防的化合物和方法。本发明中的用于治疗的所述化合物和方法使用了一类包括乙酰二糖的化疗试剂。本发明的益处包括通过该类二糖，即过-O-乙酰化二糖，例如，GlcNAcβ1，3Gal(3-O-萘甲醇(AcGnG-NM)的乙酰化形式的作用，来抑制腺癌细胞对固定的重组选择素以及对活化的人血小板和内皮细胞上的选择素的粘附。这些结果表明，以此种方式抑制肿瘤细胞的糖基化会在转移的实验模型中引起与选择素的相互作用降低，增加对白细胞介导的溶胞作用的敏感性并且导致器官中的集落形成减少。
在本发明的一个实施方案中，用于治疗的化合物与方法在肿瘤转移的小鼠模型中显示出了在肺组织中降低肿瘤细胞聚合并形成肿瘤的能力。本发明还提供的治疗组合物，用于将治疗剂量的本发明的乙酰化二糖进行给药，来治疗肿瘤性疾病(neoplastic disease)、以及预防或减少肿瘤的转移。
在一个实施方案中，糖基转移酶的二糖抑制剂包括这样的结构：
                  糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基(amid)，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
在更详细的实施方案中，所述疾病为为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。
在更详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R或过-O-乙酰GlcNAc β1，4GlcNAc-Y-R，其中R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；Y为氧原子。
在更详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM、过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM、过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)或过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。在更详细的实施方案中，所述二糖为GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM  ；6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；GlcNAcβ3Galβ-O-R，其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM，2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]n-2-萘酚；GlcN[3H]Acβ3Galβ-O-NM；或GlcNAcβ3Galβ-O-[3H]NM。
在另一个实施方案中，所述药物组合物包括制药可接受的载体和有效剂量的本发明的乙酰二糖。在另一个实施方案中，治疗哺乳动物个体疾病的的方法包括进行治疗有效剂量的本发明所述组合物的给药。在更详细的实施方案中，所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg的剂量给药。
在另一实施方案中，减轻哺乳动物个体癌症的方法包括对所述哺乳动物个体治疗进行治疗有效剂量的组合物给药，所述组合物包括：糖-X-糖-Y-R，或其制药可接受的盐或前药，其中：所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
且其中所述哺乳动物个体中的所述癌症被减轻。
在详细的实施方案中，所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。在更详细的实施方案中，所述癌症为转移性癌症。在更详细的实施方案中所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg剂量给药。
在另一实施方案中，抑制哺乳动物个体肿瘤转移的方法，包括治疗有效剂量的组合物的给药，所述组合物包括：糖-X-糖-Y-R，其中：所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
在详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R或过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯。
在更详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM、过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM、过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)或过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。在进一步详细的实施方案中，所述二糖为GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM  ；6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM  ；GlcNAcβ3Galβ-O-R，其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM、2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]n-2-萘酚；GlcN[3H]Acβ3Galβ-O-NM；或GlcNAcβ3Galβ-O-[3H]NM。
在另一个实施方案中，调节细胞中天然发生多糖的生物合成的方法包括用药物有效剂量的组合物接触细胞的步骤，所述组合物包括糖-X-糖-Y-R，其中所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；所述每一种糖的羟基独立地被O-酰基、S-酰基、N-酰基、C-酰基取代；或所述每一种糖的羟基独立地被O-芳基、S-芳基或N-芳基取代。
在另一实施方案中，鉴别有效癌症治疗的方法包括用有效剂量的二糖或其制药可接受的盐或前药接触肿瘤细胞培养物的步骤，所述二糖具有结构糖-X-糖-Y-R，其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
还包括步骤：检测培养的所述肿瘤细胞的结合；及通过所述培养的肿瘤细胞的结合减少来鉴定对于哺乳动物个体所述有效的癌症治疗。在详细的实施方案中，所述肿瘤细胞为腺癌细胞。
在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述所述肿瘤细胞与选择素包被的培养皿的结合。在另一个实施方案中，所述包括检测所述肿瘤细胞与凝血酶活化的血小板的结合。在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述所述肿瘤细胞与肿瘤坏死因子α(TNFα)-活化的内皮细胞的结合。
在另一个实施方案中，所述方法包括在免疫缺陷小鼠中检测二糖处理的肿瘤细胞的肺集落形成，并通过减少所述免疫缺陷小鼠中的肿瘤转移来鉴定对哺乳动物个体的所述有效的治疗。
在另一实施方案中，减轻哺乳动物疾病状态的方法，所述哺乳动物对用阻断细胞表面糖类抗原表达的化合物的治疗有反应，所述方法包括对所述哺乳动物进行治疗有效剂量的化合物的给药，所述化合物包括，糖-X-糖-Y-R，或其制药可接受的盐或前药；
其中，
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
在详细的实施方案中，所述糖类抗原为细胞表面受体的配体。在更详细的实施方案中，所述糖类抗原抗原为Lewis糖类抗原。在更详细的实施方案中，所述Lewis糖类抗原为唾液酸(sLeX)糖或唾液酸(sLea)糖。在详细的实施方案中，所述糖类抗原为选择素的配体。在更详细的实施方案中，所述的选择素为E-选择素、P-选择素或L-选择素。
在详细的实施方案中，所述的疾病状态为肿瘤性疾病。在更详细的实施方案中，所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。在更详细的实施方案中，所述的肿瘤性疾病为转移性疾病。在更详细的实施方案中，所述的疾病为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。
附图的简要描述
图1所示为利用二糖引发剂(primer)来抑制肿瘤细胞表面的sLeX。
图2所示为AcGnG-NM改变了LS180细胞中的细胞表面唾液酸Lewis X。
图3所示为AcGnG-NM处理肿瘤细胞对固化的选择素的粘附变化。
图4所示为AcGnG-NM处理的肿瘤细胞对培养的人微血管内皮细胞(HMVEC)粘附变化。
图5所示为用AcGnG-NM处理之后，血小板对肿瘤细胞的粘附减少。
图6所示为小鼠中抑制剂处理的肿瘤细胞的生物分布变化。
图7所示为用AcGnG-NM进行处理后抑制了转移的肺肿瘤的形成。
图8所示为用AcGnG-NM处理肿瘤细胞后，血小板存在时的细胞溶解作用减少。
图9所示为合成的二糖诱饵(decoy)的化学结构。
图10所示为二糖处理后LLC细胞的离体特征。
图11所示为二糖处理的细胞对固化的P-选择素的粘附变化。
图12所示为过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM对实验性转移的抑制。
图13所示为过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM对自发肿瘤转移的抑制。
图14所示为小鼠中AcGnG-NM处理的P-Sel-/-表型模拟。
图15所示为sLeX表达的寡糖引发(primering)与抑制。
图16所示为脱氧AcGnG-NM对Lewis肺肿瘤(LLC)细胞的实验性转移抑制。
发明详述
总体来讲，本发明涉及用于治疗或预防疾病的二糖化合物和方法。本发明中的所述用于治疗的化合物和方法使用了一类治疗剂，该治疗剂包括修饰的多糖，例如乙酰化二糖。所述乙酰化二糖的作用方式是抑制参与糖蛋白的生物合成的糖基转移酶。所述乙酰化二糖作为糖基转移酶的抑制剂在有限种类的细胞中参与糖生成，为治疗或预防疾病的化合物和方法提供了特异性，如本发明的肿瘤性疾病或转移性疾病，并具有最少的副作用。本发明的化合物和方法可治疗或预防疾病包括但不限于肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化和糖尿病。
用于治疗或预防诸如肿瘤性疾病或转移性疾病的疾病的化合物和方法，包括乙酰化二糖，还包括对可提高特异性糖基转移酶的抑制活性的所述糖的修饰。这些修饰包括但不限于脱氧、脱氢、环氧化、烷化、芳基化、氨化或卤化。还可以从医学化学中的现有技术中考虑对制备母化合物乙酰化二糖的类似物进行其他的化学修饰。
如上所述，含有修饰的乙酰化二糖的化合物在进行体内给药时具有改进的溶解性和药理特性。此外，还提供了对所述乙酰化二糖的修饰，其中所述化合物抑制了糖基转移酶的活性(竞争性或非竞争性)而不是作为糖基转移酶的底物。本发明的所述乙酰化二糖包括结构：糖-X-糖-Y-R；其中所述糖选自唾液酸、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖或甘露糖；X和Y为桥联原子，其可为氧、硫、氮、或碳；R为糖苷配基。在一个实施方案中，所述乙酰化二糖可以是过乙酰化-4-脱氧-GlcNAcβ3Gal-NM(4-脱氧AcGnG-NM)。参见，如美国专利第5,639,734号，在此将其全文及所有用途全部引用以作参考。
本发明的本发明的化合物和方法包括具有修饰的可被识别为寡糖代谢中间产物的二糖，如乙酰化二糖，所以当对细胞进行饲喂时，乙酰化二糖被转变为更复杂的寡糖。所产生的新化合物将以特异的方式进行修饰，以使其代谢活性较低但依然保持所述母化合物的充分特征，因而其在所述寡糖生物合成途径中依然与酶结合。使用这些修饰的类似物可以获得更佳的特异性。乙酰化二糖及其类似物旨在抑制糖基转移酶反应，该反应可产生特定的细胞表面糖轭合物，如糖蛋白和糖脂。这些糖轭合物可促进细胞粘附，从而参与多种生物学和生理学过程，其包括但不限于肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化和糖尿病。所以，通过其对糖轭合物产生的抑制，乙酰化二糖可以干扰这些类型的生物学过程，且籍此提供了对如肿瘤性疾病和转移性疾病的癌症的治疗。
本发明的乙酰化二糖包括“糖-X-糖-Y-R”的结构，例如在聚乳糖胺聚糖和唾液酸Lewis X(sLex)集合的起始、延伸和加帽反应中的类似中间体。对过乙酰化Galβ1，4GlcNAc-萘甲醇(AcLacNAc-NM)化合物的研究表明乙酰化二糖化合物可作为引发剂(primer)。作为引发剂，其可与正常的生物合成中间体竞争酶活性，从而抑制正常糖轭合物的形成。此外，研究还表明乙酰化二糖化合物(乙酰化Galβ1，4GlcNAcβ-O-萘甲醇和乙酰化GlcNAcβ1，3Gal-O-萘甲醇)在包括各种肿瘤细胞系的多种人源和鼠源的培养细胞中引发了寡糖。不仅如此，用这些化合物对人肿瘤细胞进行的处理降低了其致肿瘤性，说明所述类似物也具有类似的效果。
本发明的益处在于包括了可抑制腺癌细胞与固化的重组选择素以及对活化的人血小板和内皮上的选择素发生粘附的一类过-O-乙酰化二糖及其类似物的二糖的能力，如乙酰化形式的GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇(AcGnG-NM)和过乙酰化4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM(4-脱氧AcGnG-NM)。其结果说明通过这一方式对肿瘤细胞糖基化的抑制，导致了在转移的实验模型中选择素互作的降低、升高了白细胞介导的溶胞作用的敏感性，同时导致器官中的集落形成减少。
在肿瘤细胞粘蛋白上唾液酸Lewis X(sLeX)的簇提呈被认为可通过与在血小板和内皮细胞表达的选择素粘附受体结合来促进转移作用。所以，对sLeX集合的干扰可以为治疗转移性疾病提供化疗方法。研究表明过乙酰化二糖可在细胞中作为与sLeX合成有关的寡糖的集合的底物，且二糖上的寡糖集合可以转移源自内源细胞表面糖轭合物sLeX集合。
本发明提供了治疗或预防肿瘤性疾病或转移性疾病的化合物和方法，证明了用微摩尔浓度的如(Ac)6GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇(AcGnG-NM)的过乙酰化二糖处理培养的人腺癌细胞，可以降低sLeX的表达，以及降低体外对选择素包被培养皿的结合、以及降低与凝血酶活化的血小板和TNF-α活化的内皮细胞的结合。以这种方式改变的糖基化降低了在静脉注射3小时后分布到所述野生型小鼠肺中的肿瘤细胞的活性。尽管与野生型小鼠相比，肺种植的程度有所降低，但是在向P-选择素缺乏的小鼠注射了AcGnG-NM处理的肿瘤细胞之后，并未在生物分布中看到显著性差异。在体外已证明，正常的小鼠血小板而不是P-选择素缺乏的血小板，结合于对照肿瘤细胞并保护他们免于白细胞介导的胞质溶解。相反，采用二糖对肿瘤细胞进行处理显著地降低了正常血小板保护他们免于细胞溶解的活性。最终在实验性的转移模型中说明，向严重的组合免疫缺陷小鼠进行注射之后，用所述二糖对肿瘤细胞进行处理明显地降低了他们的肺集落形成潜能。本发明的化合物和方法代表了一类用于预防和治疗转移性疾病的化疗剂。
本发明提供了将乙酰化二糖用作糖基转移酶抑制剂进行疾病治疗的治疗组合物和方法，所述疾病如肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化和糖尿病。本发明的组合物和方法提供了糖基转移酶的二糖抑制剂，其包括结构：糖-X-糖-Y-R，其中所述糖是葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；R为糖苷配基，包括苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；且其中所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；所述每一种糖的羟基独立地被O-酰基、S-酰基、N-酰基或C-酰基取代；或所述每一种糖的羟基独立地被O-芳基、S-芳基或N-芳基取代。本发明的二糖还包括由1-16碳原子的烃基烷基化的所述糖。参见例如美国专利第5,639,734号，在此将其全文及所有用途全部引用以作参考。
本发明的化合物和方法可用于治疗肿瘤性疾病和转移性疾病，如腺癌。腺癌细胞的特征在于带有Lewis X结构的粘蛋白糖蛋白的表达，因此腺癌细胞也就成了本发明的化合物和方法的示例性的主要对象。乳腺、结肠和前列腺的腺癌是癌症的最流行类型。估计在美国2000年新增的癌症中，乳腺癌为184,200例，结肠癌为93,800例，前列腺癌为180,400例。肺癌中的主要部分也是腺癌。黑素瘤也是本发明的化合物和方法的一种实例性的主要对象，因为有证据表明干扰选择素结合的化合物可影响黑素瘤。可应用本发明的化合物和方法的癌症数量和种类包括肿瘤性和转移性疾病，如那些由带有Lewis-型糖结构的粘蛋白糖蛋白表达为特征的和由选择素结合介导的疾病。当对肿瘤性疾病和转移进行治疗时，本发明的化合物可作为手术肿瘤去除或其他形式的癌症化疗的辅助治疗手段。当对肿瘤性疾病和转移进行治疗时，本发明的组合物可与抑制癌细胞内其他生化途径的其他治疗组合物一起给药。
本发明还意图获得在个体中治疗炎症疾病的方法，包括以本发明药物组合物对所述个体进行所述糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物的治疗有效剂量给药的步骤。总的来讲，本发明的组合物可用于治疗多种炎症性疾病。炎症性疾病的代表性例子包括急性炎症疾病和慢性炎症疾病。急性炎症疾病的代表性例子包括阑尾炎、扁桃腺炎、延迟的超敏反应、由于脓血症的炎症、皮肤炎症和局部缺血性再灌注损伤。慢性炎症疾病的代表性例子包括类风湿关节炎。总的来讲，本发明的组合物可以减轻目标个体炎症的任意浓度进行给药。优选地，所述组合物以约0.1mg/kg到约20mg/kg的剂量给药。
本发明的化合物和方法可通过如降低诸如唾液酸Lewis X和唾液酸Lewis A的所述细胞表面的唾液酸糖的存在来起作用。唾液酸糖形成了称为选择素的与细胞粘附受体结合的配体成分。当所述配体在细胞表面糖轭合物上存在时，他们可促进与那些表达细胞表面选择素受体的细胞的粘附。大多数天然产生的选择素配体是粘蛋白-型糖蛋白，所述糖蛋白由通过糖苷键与含有sLex结构的若干糖链(多糖)连接的蛋白核心构成。
糖抗原包括但不限于ABO，Colton(AQP1)，Diego(SLC4A1)，Duffy(FY)，Hh(FUT1，FUT2)，Kell(Kel，XK)，Kidd/JK(SLC14A1)，Lewis(FUT3，FUT2)，Landsteiner-Weiner/LW(ICAM4/LW)，Lutheran(LU)，MNS(GYPA，GYPB，GYPE)，Rh(RHCE，RHD，RHAG)或YT/Cartwright(ACHE)。括号里的内容是所述糖抗原的基因座位。Lewis糖抗原包括但不限于H，Lea，唾液酸Lea，Leb，Lex，唾液酸Lex，Ley或唾液酸Ley。在一个详细实施方案中，所述Lewis糖抗原是唾液酸Lex(sLex)或唾液酸Ley(sLey)。
肿瘤性疾病的明显特征是在肿瘤性细胞内的粘蛋白表达升高和糖基化活性的改变，包括增强肿瘤细胞和含有选择素的细胞之间的粘附的sLex表达，所述含有选择素的细胞如内皮细胞(E-和P-选择素)、血小板(P-选择素)和淋巴细胞(L-选择素)。通过与选择素受体互作的肿瘤细胞的粘附可以多种方式促进癌症进展。首先，E-和P-选择素在活化的血管内皮细胞上与含有粘蛋白的肿瘤细胞的sLex结构的结合，可有助于肿瘤细胞从血液向其他组织的运输(外渗)，在此组织中所述肿瘤细胞可种植继发肿瘤(转移)。其二，在肿瘤细胞、淋巴细胞和血小板之间的类似的细胞表面结合互作可以在循环系统中形成细胞集结，且这些血栓会停留在小血管中。其三，淋巴细胞和血小板的结合可提供刺激肿瘤细胞生长的生长因子或在免疫系统内的规避。其四，有证据表明血管细胞与选择素的互作对肿瘤血管发生至关重要，因此本发明的组合物也可以对此进行抑制。
“转移”是指涉及肿瘤细胞从其发源地进行迁移、规避了宿主的防御系统并继而在远端器官进行种植的多步级联。在转移转播的过程中，血中的肿瘤细胞与血小板和淋巴细胞互作，形成了停留(arrest)在所述微血管且粘附于所述内皮细胞的肿瘤性血栓。肿瘤细胞-宿主细胞的粘附可部分地通过称为选择素的细胞表面糖结合蛋白家族进行介导。血小板上的P-选择素可以促进血小板与肿瘤细胞的结合(“覆盖”)，其可以防止通过先天免疫系统的元件对肿瘤细胞的细胞溶解。在内皮细胞上的P-选择素和E-选择素可以在微血管中帮助锚定肿瘤细胞-血小板栓。L-选择素介导的淋巴细胞的粘附可导致协助继发肿瘤生长的细胞因子和生长因子的局部分泌。
“糖苷配基”是指缺乏糖半族且在本发明中有用的底物。
“环氧基”是指与两个连接的碳原子结合的氧原子。通常，任意环醚都具有三元环；特别的，三元环为环氧乙烷(oxirane)，四元环为氧杂环丁烷(oxetane)，五元环为四氢呋喃(oxolane)，六元环为噁烷(oxane)；氧化乙烷通常是由过酸对烯烃的反应生成的。
“烷基”是指通式为CnH2n+1的烃基。
可采用如乙酰基、丁酰基或苯甲酰基来乙酰化所述二糖，从而降低其亲水性并使其易于渗过细胞膜。二中所述二糖，如乙酰Galβ1，4GlcNAcβ-O-萘甲醇和乙酰GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇都可在培养细胞中引发寡糖，并且抑制唾液酸Lewis X在HL-60人早幼粒白血病细胞、LS180人结肠癌、鼠Lewis肺癌、B16鼠黑色素瘤中抑制唾液酸Lewis X的形成。上述的多种二糖及其乙酰化或芳香族衍生物是本发明的逻辑性范围。此外，关键羟基缺乏或乙酰化的上述化合物的类似物将与糖基转移酶结合并抑制其活性。
本发明的糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物还包括了与羟基结合的甲基。例如，可在所述糖的任意羟基上结合上甲基。此外，所述糖还可以用硫取代氧。例如，优选地可用硫原子取代所述糖的5-OH基团。
本发明的糖基转移酶的二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物的示例包括但不限于，过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R，过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R，过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R，过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R或过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，其中Y为选自O、C、S或N的桥联原子；且其中R为糖苷配基，包括但不限于苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯。
本发明还涉及对细胞中天然产生的糖的合成进行调控的方法，包括将所述细胞与药理学有效量的作为本发明药物组合物的糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物接触的步骤。根据本发明的教导，可对乙酰化二糖进行设计，从而使其可破坏众多种类的天然产生物质，尤其是糖类的合成。例如，本发明提供了破坏与选择素结合的糖类合成的组合物。这些二糖的示例包括但不限于过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚，过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM，过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM，过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM，过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)或过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。这些二糖的示例还包括但不限于GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；GlcNAcβ3Galβ-O-R，其中R＝2-萘甲醇(NM)，8-甲氧基-NM，2-苄基，苯基，2-萘酚，2-萘甲醇基，6-羟基喹啉，5-羟基吲哚，顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯]n-2-萘酚；GlcN[3H]Acβ3Galβ-O-NM或GlcNAcβ3Galβ-O-[3H]NM。总地来讲，本发明的组合物可以任意浓度进行给药，所述浓度可对目标个体细胞中天然产生的糖类的合成进行调控。优选地，所述组合物以约0.1mg/kg到约20mg/kg的剂量给药。
治疗方案
本发明提供了包括这样一种药物组合物，该组合物包括具有抗肿瘤或抗转移活性的、与制药可接受载体一同进行组方的糖基转移酶二糖抑制剂的一种或其多种的组合，例如乙酰化二糖及其类似物。一些组合物包括本发明的多种(如两种或更多钟)乙酰化二糖的组合。
在预防性的应用中，以足以消除或降低所述疾病的风险、减轻所述疾病的严重程度或延缓所述疾病发病的剂量，将乙酰化二糖及其类似物的药物组合物或药剂对怀疑或有疾病或状态(如肿瘤性或转移性疾病)的风险的患者进行给药，所述疾病或状态包括该疾病的生化、组织学和/或行为症状，在所述疾病发展过程中该疾病的并发症以及中间病理学表型。
在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分阻止所述疾病症状(生化、组织学和/或行为学)的剂量，将组合物或药剂对怀疑或已经患有这些疾病的患者进行给药，这些疾病症状包括在所述疾病发展过程中的并发症和中间病理表现型。
足以治疗或预防治疗的剂量被定义为治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案中，通常以多种剂量进行药剂的给药，直到得到了充分的预防或治疗反应。通常，监控所述预防或治疗反应，如果所述反应开始衰退，则需要给予重复的剂量。
用于本发明组合物和方法中的乙酰化二糖及其类似物，可以对人类患者进行给药，所述乙酰化二糖及其类似物以其本身、前药、制药可接受的盐、水合物、溶剂化物、酸性盐水合物、N-氧化物或其同形晶体的形式或药物组合物的形式给药，在药物组合物中，所述化合物以治疗有效量与适合的载体或赋型剂相混合。
制药可接受的载体是由所述给药的特定组合物以及用于对所述组合物进行给药的特定方法部分决定的。所以，有众多对乙酰化二糖组合物进行给药的适合的药物组合物配方(参见，如，《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，迈克出版公司(Mack PublishingCo.)，伊斯顿(Easton)，宾西法尼亚州，第18版，1990年，在此将其全部引用作为参考)。所述药物组合物通常包括以适于对患者进行给药形式的乙酰化二糖或其类似物。所述药物组合物通常配制为无菌的，基本等渗的，并且完全符合美国食品与药品管理局(FDA)的《优质生产规范》(GMP)细则。
有效剂量
本发明所述的用于治疗如肿瘤性或转移性疾病的病状或疾病的乙酰化二糖及其类似物的有效剂量会根据诸多的不同因素发生改变，包括给药方式，靶位点，所述患者的生理状态，患者是人抑或是动物，其它给药药剂，以及所述治疗是预防性的或治疗性的。通常，所述患者是人但是包括转基因动物的非人类动物也可接收治疗。治疗剂量需要进行滴定从而优化安全性和有效性。
用包含乙酰化二糖及其类似物的药物组合物进行给药，所述剂量为所述宿主体重的约0.0001mg/kg到约100mg/kg，通常为0.01mg/kg到约40mg/kg，更通常为约0.1mg/kg到约20mg/kg。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或1-10mg/kg。在一些方法中，可将二种或更多种对糖基转移酶具有不同结合特异性的乙酰化二糖或其类似物同时给药，在这种情况下，给药的每种乙酰化二糖或其类似物的剂量处于所给的范围内。通常对乙酰化二糖组合物可进行多次给药。通过测定所述患者体内乙酰化二糖或其类似物的血液水平来指示，给药间隔可以是不规律的。在一些方法中，可将剂量调节至血浆乙酰二糖的浓度为1-100μg/ml。或者，可采用缓释制剂对乙酰化二糖及其类似物进行给药，该方法需要更低频率的给药。剂量与频率的变化都依赖于患者体内乙酰化二糖的半衰期。给药剂量与频率的变化依赖于所述治疗是预防性的或治疗性的。在预防性的应用中，以相对低的剂量进行相对低频率间隔的长时间给药。一些患者在其余生都将持续接受治疗。在治疗性的应用中，以相对高的剂量进行相对短间隔的给药有时候是必需的，直到所述疾病的发展被减弱或终止，优选地直到所述患者表现出该疾病症状的部分或完全好转。此后，所述患者可以用预防方案的有效剂量的包含乙酰化二糖及其类似物的药物组合物对所述患者进行给药。
给药途径
与制药可接受的载体组方的，具有抗肿瘤或抗转移活性的糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物，可采用非肠道、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内、肌肉内或吸入的方式进行给药。尽管其他方式也是等效的，但乙酰化二糖或其类似物最常见的给药方式是皮下或静脉内。其次的最常用方式是非肠道的。在一些方法中，可将制剂直接注射到肿瘤发展的特定组织中去。在一些方法中，可将乙酰化二糖或其类似物作为缓释的组合物或装置，如Medipad装置进行给药。
本发明的药剂可任意地与其他对治疗多种疾病至少部分有效的其他药剂进行合并给药。例如，在肿瘤转移到大脑的情况下，本发明的药剂可以与其他药剂一起给药，以增加本发明的制剂穿过血脑屏障(BBB)。其他的例子还包括采用公知的化疗剂与本发明的药剂(联合治疗)治疗患者。
制剂
具有抗肿瘤或抗转移活性的乙酰化二糖及其类似物，通常被作为包含活性治疗剂和多种其他制药可接受组分的药物组合物进行给药。参见前述的《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，1990年。所述优选形式依赖于给药及治疗应用的预期方式。根据所需要的制剂，所述组合物还包括制药可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配置对人或动物进行给药的药物组合物的赋形剂。对所述稀释剂的选择应不影响所述组合的生物学活性。这种稀释剂的例子是蒸馏水、生理盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液以及汉克氏液(Hank’s solution)。此外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体，佐剂、或非毒性、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等等。
药物组合物可以包括的较大的、代谢较慢的大分子，例如蛋白、诸如壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸以及共聚物(如乳胶官能化的琼脂糖(SepharoseTM)、琼脂糖(agarose)、纤维素等等)的多糖，多聚氨基酸、氨基酸共聚物和酯聚集物(如油滴或脂质体)。此外，这些载体还具有免疫刺激制剂的功能(即佐剂)。
对非肠道给药而言，本发明的组合物可采用所述物质的溶液或悬液的注射剂型给药，所述剂型含有生理可接受稀释剂以及可以是如水油、盐水、甘油或乙醇的无菌液体的药物载体。此外，在所述组合物中也可以有辅助性物质，如湿润或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等等。药物组合物的其他成分有石油、动物、蔬菜或合成来源的成分，例如，花生油、大豆油和矿物油。通常诸如丙二醇或聚乙二醇的二醇是优选的液体载体，尤其是对可注射的溶液而言。本发明的药剂可以储存注射(depot injection)或植入制剂(implant preparation)的方式进行给药，可采用这样方式组方，以使得持续或脉冲式释放所述活性成分。
通常，组合物被制备成液体溶液或悬液的可注射形式；也可以制备在注射前适于溶解于或悬浮于液体赋形剂的固体形式。如上所述，为了获得增强的佐剂效果，也可将所述制剂乳化或者包被入诸如多乳酸化合物、聚乙醇酸交酯或共聚物的脂质体或微粒中。参见，朗格(Langer)，《科学》(Science)，249卷：1527页，1990年；以及翰纳斯(Hanes)，《高级药物递送综述》(Advanced Drug Delivery Reviews)，28卷：97-119页，1997年。
适于其他给药途径的其他制剂包括口服、鼻内和肺制剂，栓剂、以及透皮应用。
对栓剂而言，粘合剂和载体包括，例如聚(亚烷基)二醇或甘油三酸酯；这样的栓剂可由含有活性成分为0.5％到10％，优选为1％-2％的混合物形成。口服制剂包括赋形剂，如药物纯的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、含糖钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂，并含有10％-95％的活性成分，优选为25％-70％。
局部应用可导致透皮或皮肤内的传输。局部给药可以通过与霍乱毒素或其脱毒衍生物或其亚基或其他类似细菌毒素试剂的共给药得以增强。参见格莱恩等人(Glenn et al.)，《自然》(Nature)，391卷：851页，1998年。可将所述成分作为混合物使用实现共给药。
或者，透皮的传输可通过使用皮肤贴片(skin patch)或使用转递体(transferosomes)实现。参见保罗等人(Paul et al.)，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)，25卷：3521-24页，1995年；塞瓦克等人(Cevc et al.)《生物化学与生物物理学学报》(Biochem.Biophys.Acta)，1368卷：201-15页，1998年。
所述药物组合物通常配制为无菌的，基本等渗的，并且完全符合美国食品与药品管理局(FDA)的《优质生产规范》(GMP)细则。
毒性
在不引起基本中毒的情况下，本发明所述的乙酰二糖或其类似物的治疗有效剂量可提供治疗性的有益作用。
本发明所述的蛋白的毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序进行测定，例如，测定LD50(50％所述动物的致死剂量)或LD100(100％所述动物的致死剂量)。介于毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养分析和动物实验获得的数据可以被用在配制用于人类的无毒的剂量范围。
本发明所述的乙酰化二糖或其类似物的剂量优选处于包括具有极低或无毒有效剂量的循环浓度范围。根据使用的剂型和给药方式，所述剂量可在以上浓度内有所变动。根据所述患者的情况，医生可选择确切的制剂、给药途径以及剂量。(参见芬格尔等人(Fingl et al.)，1975年，《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)的第1章)。
试剂盒
同样，在本发明的范围之内，也包括有含有本发明组合物(如乙酰化二糖及其类似物)和使用指导的试剂盒。该试剂盒可进一步包括至少一种其他的试剂，或一或多种本发明的其他乙酰化二糖。试剂盒通常包括说明该试剂盒预期用途的内容的标签。所述术语标签包括任意所述试剂盒提供和附带文字、记录材料，或与所述试剂盒一同的其他材料。
示例性的实施方案
实施例1
过乙酰化GlcNacβ3Gal-NM的酶化学合成
已开发了为了动物实验和生产具有不同糖苷配基衍生物的合成克质量的GlcNacβ3Gal-NM的合成方法(方案1)。这是通过使用源自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的细菌β3GlcNac转移酶(LgtA)在大肠杆菌(E.Coli)中过量表达实现的(颜等人(Yan et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，328卷：3-16页，2000年)。这种酶催化从UDP-GlcNAc到Gal的GlcNAc转移，在无需保护所述糖的所述官能团的情况下，产生了具有高立体和区位选择性的β1，3-连接的二糖(方案1)。因为所述合成可以用粗细菌裂解物和便宜的底物(UDP糖；达沃斯化工集团(DavosChemical Corp.)，德国)完成，所以，可以有效并且合理的以低成本实现所述二糖的制备级的合成。所述终二糖是化学过乙酰化的，其异头碳被转化为溴化物或三氯亚氨逐乙酸酯(trichloroacetimidate)，且所述化合物与萘甲醇轭合，使得在离子交换和分子排阻色谱测得的过乙酰GlcNAcβGal-NM的产率为90％。就如我们过去对待其他糖一样，也使用了1H，13C和2-D NMR、元素分析和质谱来对所述化合物的结构进行确定(沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，279卷：161-171页，1995年)。所述方法提供了大量的与不同的糖苷配基轭合的二糖，其将进行深入实验以测定所述糖苷配基对sLeX形成的抑制的影响。
实施例2
过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM和过乙酰4-脱氧-GlcNAcβGal-NM的化学合成
方案2描述了过乙酰4-脱氧-GlcNAcβGal-NM的完整的化学合成，并描述了用可进行β1，3糖基化的3-羟基和在其4’位置适合被氢取代的glucosaminyl供体制备半乳糖的合成途径。所述半乳糖基受体4的合成涉及用吡啶和乙酸酐对化合物1的乙酰化，以97％的产率得到了所述二乙酸盐衍生物2。在酸性条件下去除所述异丙叉保护基团以及通过柱层析纯化所述产物，以96％的产率得到了化合物3。在p-甲苯磺酸存在的条件下将化合物3与triethylorthoacetate反应生成了原酸酯(orthoester)中间体，其随后在酸性条件下以86％的产率转化为化合物4。1H和13C NMR也与4的预期结构一致。
根据文献报道(隆(Lonn)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，139卷：105-113页，1985年；张等人(Zhang et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：1989-2001页，1996年)，从硫代-D-葡萄糖吡喃糖苷5制备了4-脱氧供体11。用吡啶和乙酸酐处理化合物5得到了3-O-乙酰中间体。随后在酸性条件下去除苯亚甲基保护基团并且用乙酰基在C6对原始羟基进行选择性保护，以69％的产率得到了化合物9。在化合物9的4位进行了硫代羰基咪唑化(Thiocarbonylimidazolylation)反应(TCDI)并且通过随后的自由基还原以81％的产率得到了4-脱氧葡萄糖胺供体11。
方案1(左)过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM的酶化学合成
方案2(右)过乙酰4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM的合成
在三氟甲基磺酸甲酯存在的条件下，采用尾原(Kajihara)及其同事的反应方案(尾原等人(Kajihara et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，306卷：361-378页，1998年)，将4与11轭合，以90％的产率得到了14。随后在吡啶和乙酸酐中的肼解和乙酰化得到了76％产率的4-脱氧二糖15。在化合物15的1H NMR波谱中的δ4.77(J＝7.9Hz)和δ4.44(J＝7.9Hz)峰证实了在所述二糖之间的β糖苷连接，在δ5.75(J＝6.5Hz)的峰证实了GlcNAc残基的N-乙酰基团的存在。大约制备了50mg，足以进行预期的细胞培养以及酶学实验。
实施例3GlcNAcβ3Gal-R二糖类似物的合成
已制备了一系列的GlcNAcβ3Gal-R二糖类似物，其中3’-，4’-和6’-的OH羟基被缺失、氟化、硫醇化、烷基化或氨基化。这些类似物能潜在的抑制一或多种涉及sLeX形成的半乳糖苷转移酶。类似物将与多种疏水性糖苷配基轭合并且采用不同的酯基进行封闭，从而确定抑制sLeX形成的最有效衍生物。放射性的二糖将被用于体内的放射示踪研究。表1所示为已合成或即将合成的过乙酰化二糖及其类似物。
         表1：GlcNAcβ3Gal-R类似物的结构
  3’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM(18)   进行中   X＝OAc，Y＝F，Z＝OAc，R＝NM
  3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM(41)   已计划   X＝OAc，Y＝SH，Z＝OAc，R＝NM
  3’-甲氧基-GlcNAcβ3Gal-O-NM(45)   已计划   X＝OAc，Y＝OMe，Z＝OAc，R＝NM
  3’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM(47)   已计划   X＝OAc，Y＝NH2，Z＝OAc，R＝NM
  6’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM(54)   已计划   X＝OAc，Y＝H，Z＝H，R＝NM
  6’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM(57)   已计划   X＝OAc，Y＝F，Z＝F，R＝NM
  6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM(61)   已计划   X＝OAc，Y＝OAc，Z＝SH，R＝NM
  6’-甲氧基-GlcNAcβ3Gal-O-NM(64)   已计划   X＝OAc，Y＝OMe，Z＝OMe，R＝NM
  6’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM(68)   已计划   X＝OAc，Y＝NH2，Z＝NH2，R＝NM
  GlcNAcβ3Galβ-O-R   进行中   X＝Y＝OAc，R＝2-萘甲醇基(NM)，8-甲氧基-NM，2-苄基，苯基，2-萘酚基，2-萘巯基，6-羟基喹啉，5-羟基吲哚，顺/反-十氢2-萘酚，2-[氧乙烯基]n-2-萘酚
  GlcN[3H]Acβ3Galβ-O-NM   已完成   X＝Y＝OAc，R＝NM
  GlcNAcβ3Galβ-O-[3H]NM   已计划   X＝Y＝OAc，R＝NM
表1中的化合物是基于关于β4GalTI，即公知的乳糖合成酶的信息选定的。所述酶将半乳糖添加到糖蛋白或糖脂的以GlcNAc为末端的寡糖上，在辅因子α-乳白蛋白的存在下将生成乳糖(伯杰等人(Bergeret al.)，《生物化学》(Biochimie.)，85卷，261-274页，2003年)。该酶是β4半乳糖苷转移酶多基因家族的一部分(赫奈特(Hennet)，《细胞分子生命科学》(Cell Mol.Life.Sci.)，59卷，1081-1095页，2002年；阿玛多等人(Amado et al.)，《生物化学与生物物理学学报普通科目版》(Biochim.Biophys.Acta Gen.Subj.)，1473卷，35-53页，1999年)。已对β4GalTI进行了动力学研究，已有文献详细记载了其底物特异性，也获得了其具有或没有UDP-Gal的X-光结构(贾斯廷奈尔等人(Gastinel et al.)，《欧洲分子生物学杂志》(EMBO J.)，18卷，3546-3557页，1999年；拉马科里什等人(Ramakrishnan et al.)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，310卷，205-218页，2001年；拉马科里什等人(Ramakrishnan et al.)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，318卷，491-502页，2002年)。
β4GalTI可以对游离的GlcNAc，具有GlcNAc末端的寡糖和GlcNAc糖苷，包括GlcNAcβ3Gal-R(表2)起作用。以下实施例中的数据表明4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM抑制了肿瘤细胞上的sLeX形成(图15)。因为在所述二糖上的受体位点被去除了，所以β4半乳糖基化就不能发生，说明4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM可以与β4GalT1结合并阻止其功能。之前的研究说明在乳白蛋白存在的情况下，4-脱氧Glc可作为β4GalT1的弱抑制剂(辛哈等人(Sinha et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，81卷，239-247页，1980年)，而其他研究说明4-脱氧GlcNAc-OMe(新德斯高尔等人(Hindsgaul et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，266卷，17858-17862，1991年)或4’-脱氧GlcNAcβ3Gal-OMe则对所述酶不产生抑制(尾原(Kajihara)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，229卷，C5-C9，1992年)。这种矛盾的一种可能性是我们化合物中的较大的芳香族糖苷配基可能促进与所述酶的结合。这一解释与所观察到含有芳香族糖苷配基的活性底物抑制所述酶对GlcNAc的作用，或者GlcNAc的Km值低于GlcNAc-Ome的Ki值(10-22μM比1-10mM)相一致(尾原(Kajihara)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，229卷，C5-C9，1992年；常等人(Chung et al.)，《生物体医学化学通报》(Bioorg.Med.Chem.lett.)，8卷：3359-3364页，1998年)。其他在GlcNAcβ3Gal-NM的4’OH的修饰，包括烷基化(帕里希克(Palcic)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，159卷，315-324页，1987年；尾原等人(Kajihara et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，306卷，361-378页，1998年)，卤化(尾原等人(Kajihara et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，306卷，361-378页，1998年)和氨化(常等人(Chung et al.)，《生物体医学化学通报》(Bioorg.Med.Chem.lett.)，8卷：3359-3364页，1998年；菲尔德等人(Field et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：391-394页，1994年)也可以导致其成为抑制剂。
表2：GlcNAc衍生物的受体特异性和抑制能力
  受体  Km   Vmax   Ki   文献
  单糖
  GlcNAcβ-O-Me  1.3mM1.8mM1.5mM   NR1(rel)1(rel)   -   123
  4-脱氧GlcNAcβ-O-Me  无活性   无活性   无抑制   1
  4-O-甲基-GlcNAcβ-O-Me  无活性   无活性   无抑制   4
  4-氟-GlcNAcβ-O-Me  无活性   无活性   无抑制   3
  4-硫代-GlcNAcβ-O-Me  无活性   无活性   无抑制   3
  4-NH2-GlcNAcβ-O-Me  无活性   无活性   0.85nM   5
  3-脱氧-GlcNAcβ-O-Me  4.2mM   0.34(rel)   未检测   2，3
  3-O-甲基-GlcNAcβ-O-Me  77mM   2.4nmol/分钟   未检测   4
  6-脱氧-GlcNAcβ-O-Me  0.5mM   0.55(rel)   未检测   3
  6-O-甲基GlcNAcβ-O-Me  4mM0.5mM   1.1nmol/分钟0.55(rel)   未检测未检测   42
  双糖
  GlcNAcβ3Galβ-O-Me  1.1mM   1   -   2
  4’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-Me  无活性   无抑制   2
  4’-脱氧-GlcNAcβ6Galβ-O-Me  无活性   -   无抑制   3
  3’-氟-GlcNAcβ3Galβ-O-Me  -   ＜0.01(rel)   2.7mM   3
  6’-氟-GlcNAcβ3Galβ-O-Me  1.01   1(rel)0.94(rel)   未检测   2，3
  6’-硫代-GlcNAcβ3Galβ-O-Me  无活性   无活性   1mM   2
  6’-硫代-GlcNAcβ6Galβ-O-Me  1.2mM   0.33   未检测   3
  糖苷配基
  GlcNAcβ-O-1-萘酚  未报道   未报道   22μM   6
  GlcNAcβ-O-2-萘酚  未报道   未报道   9.5μM   6
  GlcNAcβ-O-2-溴萘酚  未报道   未报道   7.6μM   6
  GlcNAcβ-O-2-甲基萘酚  未报道   未报道   3.5μM   6
  GlcNAcβ3Galβ-O-2-NM  ＜10μM   未检测
rel＝数据相对于GlcNAcβ-O-Me
*1新德斯高尔等人(Hindsgaul et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，266卷，17858-17862，1991年。
2 尾原(Kajihara)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，229卷，C5-C9，1992年。
3 尾原(Kajihara.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，306卷，361-378页，1998年。
4 帕里希克(Palcic)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，159卷，315-324页，1987年。
5 菲尔德等人(Field et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：391-394页，1994年。
6 常等人(Chung et al.)，《生物体医学化学通报》(Bioorg.Med.Chem.lett.)，8卷：3359-3364页，1998年。
在以下合成方案中，以50mg批次对每一种化合物进行制备，以测定其在细胞培养和酶分析中的活性。然后以克量级制备活性抑制剂以进行肿瘤形成的体内研究。制备所述类似物的全部过程都基于公开的方法(尾原(Kajihara)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，229卷，C5-C9，1992年；尾原(Kajihara)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，247卷，179-193页，1993年；罗沃伊(Lowary)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，251卷，33-67页，1994年；张等人(Zhang et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：1989-2001页，1996年；菲尔德等人(Field et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：391-394页，1994年)。制备GlcNAcβ3Gal-NM的3’-OH，4’-OH和6’-OH衍生物的总策略是生成关键的构建模块，对每种修饰采用类似的化学方法(脱氧化，氟化，巯化，烷基化和氨化)。如同对待其他糖苷一样，也使用了1H，13C-NMR，元素分析和质谱来对所有新化合物的结构进行确定(沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，272卷，25608-25616，1997年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，279卷：161-171页，1995年；卢戈玛瓦等人(Lugemwaet al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，271卷，19159-19165页，1996年)。
选择GlcNAcβ3Gal-NM的脱氢-，氟化-，硫代-，甲氧基-和氨基衍生物的原则如下：由于所述受体羟基缺失，所以所述脱氧衍生物缺乏作为β4GalTI受体的活性。如果该羟基的去除并不影响结合，那么所述衍生物可作为竞争性抑制剂。氟是氧的同电子排列体，可与供体形成多个氢键，但却不能作为糖基受体。所以，对脱氧和氟化衍生物的比较可以深入理解所述羟基在结合中的相对重要性。所述硫代衍生物提供了强烈的氢键供体。所述甲氧基衍生物提供了在空间封阻所述活性位点的方式。例如，在相邻非反应羟基上含有甲基的三糖是GlcNAc转移酶V的较好的竞争性抑制剂(Ki＜Km)(可汗(Khan)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，268卷，2468-2473页，1993年)。所述氨基衍生物提供了在所述活性位点探测阴离子基团的方式。在中性pH条件下，所述氨基可以被质子化，潜在地通过电荷-电荷相互作用替换酶-受体的氢键(常等人(Chung et al.)，《生物体医学化学通报》(Bioorg.Med.Chem.lett.)，8卷：3359-3364页，1998年；菲尔德等人(Field et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：391-394页，1994年)。例如，具有类似修饰的二糖可以200nM的Ki值抑制A型血糖苷转移酶(罗沃伊(Lowary)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，251卷，33-67页，1994年；拉菲特等人(Laferte et al)，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)，267卷，4840-4849页，2000年)。
4’-OH修饰的过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM类似物的合成(方案3)
制备下列化合物：4’-氟，4’-硫代，4’-甲氧基和4’-氨基GlcNAcβ3Gal-NM。在上述实施例中讨论了过乙酰化4’-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM的合成(方案1)。
4-氟-GlcNAcβ3Gal-NM的化合物24的合成途径可见于方案3。根据文献(张等人(Zhang et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：1989-2001页，1996年)可从硫代乙基-D-葡萄糖吡喃糖苷19制备4-氟供体22。用乙酸酐和吡啶处理化合物19，得到3-O-乙酰基衍生物20。合成21的下两步涉及苯亚甲基保护基团的去除(中等酸性)和所述6-OH羟基的乙酰化(吡啶和乙酸酐)。然后用(二乙基氨基)三氟化硫(DAST)处理化合物21中的游离3’-OH，得到4-氟供体22。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物4(方案1)和化合物22轭合得到二糖中间体23。在吡啶中的肼解和N-乙酰化可得4’-氟-GlcNAcβ3Gal-NM的化合物24(方案3)。
Figure A20048002046100431
方案3过乙酰化4-羟基葡萄糖胺供体的合成
为了制备4-硫代乙酸供体26，需要在吡啶中使用p-甲苯磺酰氯将4-醇化合物9(方案1)转化为4-甲苯磺酸酯25(方案3)。用硫代乙酸钾处理4-甲苯磺酸酯，得到化合物26。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物26与半乳糖苷受体4(方案1)轭合，然后在DL-二-硫苏糖醇的存在下，经过使用NH4OH肼解，N-乙酰化和S-脱乙酰化，得到4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-NM的化合物29。为了生成4-甲氧基供体30，需要在DMF中使用甲基碘和NaH对4-醇化合物9进行甲基化(罗沃伊(Lowary)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，251卷，33-67页，1994年)(方案3)。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物30与半乳糖苷受体4(方案1)轭合，再经过肼解和N-乙酰化可得到4’-甲氧基-GlcNAcβ3Gal-NM的化合物32。
4’-氨基GlcNAcβ3Gal-NM的合成涉及4-叠氮化物供体33的生成，该叠氮化物是通过4-甲苯磺酸盐中间体25和叠氮化钠反应得到的。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物33与半乳糖苷受体4(方案1)轭合，再经过肼解和N-乙酰化和脱氢可得到4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-NM化合物36。
3’-OH修饰的过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM类似物的合成(方案4)
制备下列化合物：3’-脱氧，3’-氟，3’-硫代，3’-甲氧基和3’-氨基GlcNAcβ3Gal-NM。制备这些特异衍生物的原理可见于方案3。通过对转移反应的立体空间排阻，在3’-羟基端含有大量成分的二糖可作为β4GalTI的抑制剂。如果β4GalT1可以将这些化合物用作底物，那么所述产物就可以被一或多种α3果糖转移酶识别，其需要内部GlcNAc残基以具有活性。所以，半乳糖的3’-OH类似物(即Galβ4(3’-X)GlcNAcβ3Gal-NM，其中X＝H，F，SH，OMe或NH2)可以作为果糖转移酶的抑制剂(帕里希克(Palcic)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，159卷，315-324页，1987年；尾原(Kajihara)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，229卷，C5-C9，1992年)。
Figure A20048002046100441
方案4：过乙酰化3-羟基葡萄糖胺供体的合成
为了制备3-脱氧供体8，需要将中间体5与氢化三丁烯反应生成中间体7。然后将所述苯亚甲基保护基团去除，将所述6-OH乙酰化，得到化合物8。根据公开的文献(尾原等人(Kajihara et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，306卷：361-378页，1998年)，需要三步(方案4)才能从化合物5合成3-氟供体16。在DMF中将化合物5和甲基碘和NaH反应，然后去除所述苯亚甲基并乙酰化所述6-OH，得到了3’-甲氧基供体43。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，分别将3-脱氧供体8，3-氟供体16和3-甲氧基供体43与半乳糖受体4(方案1)轭合，然后在还原条件下肼解和N-乙酰化，分别得到GlcNAcβ3Gal-NM的3’-脱氧化合物13，3’-氟化合物18和3’-甲氧基化合物45。
使用硫代乙酸钾，然后去除苯亚甲基且乙酰化6-OH，可从甲苯酸盐中间体37制备3-硫代乙酸供体39。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物39与半乳糖受体4(方案1)轭合，然后在DL-二硫苏糖醇的存在下，经过使用NH4OH肼解，N-乙酰化和S-脱乙酰化，得到3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-NM化合物41。
3’-氨基-GlcNAcβ3Gal-NM的合成涉及3-叠氮化物供体44的生成，该叠氮化物44是通过3-甲苯磺酸盐中间体37和叠氮化钠反应得到的。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物44与半乳糖苷受体4(方案1)轭合，再经过肼解和N-乙酰化和脱氢可得到3’-氨基-GlcNAcβ3Gal-NM化合物47。
6’-OH修饰的过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM类似物的合成(方案5)
制备下列化合物：6’-脱氧，6’-氟，6’-硫代，6’-甲氧基和6’-氨基GlcNAcβ3Gal-NM。目前还不清楚对6’位的何种修饰会影响到半乳糖苷化。现有的数据提示所述6’-硫代甲基半乳糖苷是较弱的抑制剂(表2)。其他的化合物(6’-氟)没有检测。
对每一种适合的葡萄糖胺供体的合成路线可见于方案5。通过用60％乙酸水解得到4，6-二醇化合物48，从化合物5制备得到6-脱氧供体52。用叔丁基氯二甲基硅烷(buytlchlorodimethylsilane)进行选择性6-O-硅烷化，然后经过4-O-乙酰化可得化合物49。用60％乙酸的O-脱硅烷化可得所需的6-醇化合物50，在吡啶中使用p-甲苯磺酰氯可将化合物50转化为6-甲苯磺酸盐51。用碘化钠处理所述6-甲苯磺酸盐，然后用氢化三丁烯进行均裂还原可得6-脱氧供体52。可通过用DAST处理从6-醇化合物50得到6-氟供体55。也可以在DMF中使用甲基碘和NaH从6-醇化合物50得到6-OMe供体62。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将6-脱氧供体52，6-氟供体55和6-甲氧基供体62与半乳糖受体4轭合，然后经过肼解和N-乙酰化，可分别得到所需的GlcNAcβ3Gal-NM的6’-脱氧化合物54，6’-氟化合物57和6’-甲氧基化合物64。
方案5：6-羟基葡萄糖胺供体的合成
可采用硫代乙酸钾从6-甲苯磺酸盐51制备6-硫代乙酸盐供体58。在三氟甲基磺酸甲酯的存在下，将化合物58与半乳糖受体4(方案1)轭合，然后在DL-二硫苏糖醇的存在下，经过使用NH4OH肼解，N-乙酰化和S-脱乙酰化，可得到6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-NM化合物61。
通过在DMF中用叠氮化钠处理6-甲苯磺酸盐51，可以合成6-叠氮供体65。将所述叠氮化物与半乳糖苷受体4轭合，再经过肼解和N-乙酰化和脱氢可得到6’-氨基-GlcNAcβ3Gal-NM化合物68。
放射性二糖的合成
合成放射性二糖以用于在血液和其他组织中检测其水平。通过三步可化学合成过乙酰化GlcN[3H]Acβ3Gal-NM。使用肼解可将GlcNAcβ3Gal-NM选择性的脱N-乙酰化(肼，95℃，24小时)。在[3H]乙酸(MEM生命科学产品(MEM Life Sciences Product))存在下，可采用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)进行复-N-乙酰化。然后在吡啶中将所述化合物乙酰化得到过乙酰化的GlcN[3H]Acβ3Gal-NM。也可以使用[3H]乙酸酐进行合成，但该试剂仅根据订货生产且相当昂贵。
为了研究对糖苷配基的反应才制备了GlcN[3H]Acβ3Gal-NM。所需要的化合物可以通过用NaB3H4(MEM生命科学产品(MEM LifeSciences Product))还原商业购买的2-萘酚甲醛(Sigma)来生成3H-萘酚甲醇([2-3H]NM)。然后将[2-3H]NM与GlcNAcβ3Gal-Br(方案1)轭合，生成GlcN[3H]Acβ3Gal-NM。
封阻基团的变化
羟基基团的乙酰化是提高二糖摄取的关键，因为大量的羟基基团防止了穿过细胞膜的扩散。然而，其他的封阻策略也是有益的，如通过提高保护基团的去除率。由于氯的吸电子性，三氯乙酸酯可比乙酸酯更快地水解(谢沃尔(Silverman)，《药物设计与药物活性的有机化学》(The organic chemistry of drug design and drug action)，352-401页，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈，加利福尼亚，1992年)。由于乙酰基替换了糖以及分子内环化，琥珀酸酯和乙酰氧基甲基酯(acetoxymethyl ester)更容易水解(舒尔茨等人(Schultz et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，268卷，6316-6322页，1993年)。对封阻基团的选择至关重要，因为必须要达到水溶性，膜渗透性以及酯水解作用的平衡。
首先，可将GlcNAcβ3Gal-NM作为三氯乙酸酯，琥珀酸酯和乙酰氧基甲基酯进行制备。然后在LS180细胞进行检测，以比较这四种化合物与其过乙酰化衍生物对抑制sLeX形成的能力。如果某种封阻策略被证明比乙酰化更有效，则将这些基团引入到所述类似物中。
具有多种糖苷配基的GlcNAcβ3Gal-R二糖的合成
在由二糖引发和抑制的sLeX形成过程中，糖苷配基发挥重要作用。然而1-O-酰基和酰基糖苷缺乏活性，长链形式也具有不需要的去污剂性质。但是含有作为糖苷配基的萘甲醇的过乙酰化二糖GlcNAcβ3Gal-NM却具有诸多优点，可促进摄入细胞，使寡糖产物与C18Sep Pak色谱柱结合，并且通过UV吸收和荧光检测产物(沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92卷：3323-3327页，1995年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年；布朗等人(Brownet al)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，278卷，23352-23359页，2003年)。而且，也可将所述糖苷配基加以改变来检测萘甲醇是否最适于β4GalTI的体外抑制以及sLeX的体内形成。β4GalTI对具有芳香族糖苷配基底物的偏好为衍生物的制备选择提供了指导(常等人(Chung etal.)，《生物体医学化学通报》(Bioorg.Med.Chem.lett.)，8卷：3359-3364页，1998年)。在实践中，化合物的选择还依赖于适合试剂的可获得性，疏水性的不同(通过辛醇-水分配测定)，以及过去的引发剂的经验(丁等人(Ding et al.)，《糖化学杂志》(J.Carbohydr.Chem.)，18卷，471-475页，1999年；默尤拉等人(Miura et al.)，《糖配合物杂志》(GlycoconjugateJ.)，16卷，725-730页，1999年；内维尔等人(Neville et al.)，《生物化学杂志》(Biochem.J.)，307卷，791-797页，1995年；弗利茨等人(Fritzet al.)，《生物化学杂志》(J Biol.Chem.)，269卷，300-307页，1994年；孟等人(Mong et al.)，《化学生物化学》(Chembiochem.)，4卷，835-840页，2003年)。
为了制备不同的糖苷，需要酶化学制备(方案1)大量的GlcNAcβ3Gal。轭合反应所需的糖苷配基清单如表1所述。可采用NMR，元素分析以及质谱对每一种新制备的化合物的结构进行确定。为了测定这些糖苷配基的效果，将所述糖苷配基用于测定对sLeX的抑制，同时与含有萘甲醇的所述母化合物相比，以期找到具有匹配和/或更好的抑制潜力。
已完成了制备或即将制备一系列GlcNAcβ3Gal-R的3’-，4’-和6’-OH类似物，其中所述羟基是缺失的、氟化的、烷基化的、巯化的或氨化的。已经或即将用多种疏水糖苷配基与类似物轭合，并用不同的酯基对这些类似物进行封阻，从而确定抑制sLeX形成的最有效的衍生物。制备放射性二糖用于体内示踪分析。
实施例4
细胞粘附与细胞溶解分析
细胞培养  从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection(Rockville，MD))购得衍生自人结肠(LS180，CCL187)或肺(A549，CCL185；A427，CCLHTB53)腺癌的肿瘤细胞株。由O.Matsuo(Kinki University，Japan)提供HAL-8人肺腺癌细胞。细胞生长在a-MEM培养液(LS180)、F12(A549)、F12/DMEM(A427)或RPMI 1640培养液(HAL-8)中。所有培养液(GIBCO)中都添加有10％(v/v)胎牛血清(FBS；HyClone Laboratories)、L-谷氨酰胺(0.3g/L)、硫酸链霉素(100μg/mL)以及青霉素(100单位/mL)。用ATV胰蛋白酶溶液(GIBCO)每4-6天进行传代。人微血管内皮细胞(HMVEC)生长在添加有10％FBS的EBM-2培养液中(Clonetics)，用0.025％胰蛋白酶/0.01％EDTA溶液再次培养，收集第一或第二代用于粘附分析。所有细胞株都保持在37℃，5％CO2和95％空气条件下的湿润的培养箱中。
如沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年所报道，制备GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇(AcGnG-NM)和Galβ1，3Galβ-萘甲醇(AcGG-NM)的过乙酰化形式。将所述化合物溶解在二甲亚砜(DMSO)并加入到培养液中以达到图中所示的浓度。然后将所述添加的培养液更换成建立细胞培养的培养液，从而避免向培养皿中直接加入浓缩的DMSO所引起的细胞溶解。将DMSO的终浓度调整到＜0.5％(v/v)。在特定的天数后，在2mM EDTA的PBS中(20分钟)收集细胞，用于以下的实验。
细胞分选  为测定相关的糖类决定子的存在与否，用CSLEX-1(抗-sLeX，5μg/mL，Becton-Dickinson)或CA-19-9(抗-Lea，14.5μg/mL，Chemicon)来标记细胞，并利用流式细胞仪(FACScan Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)进行分析。将约5×105细胞在含有CSLEX-1或CA-19-9的100μL PBS/1％BSA中4℃孵育1小时，随后加入藻红蛋白(PE)-轭合的兔抗-小鼠IgG(2μg/mL)。对于阴性对照组，将细胞与非特异小鼠同型匹配抗体(0.5μg/mL，Sigma)在100μLPBS/1％BSA中4℃孵育1小时，随后加入PE-轭合的兔抗-小鼠IgG(2μg/mL)。
细胞对固化选择素的粘附  用重组E-选择素(4μg/ml)或P-选择素(2μg/ml)(R&D Systems)在4℃包被96-孔板过夜，并用1％BSA/PBS封闭。用不同含量的乙酰化二糖来培养LS 180细胞5天，随后收集、在DMEM/1％FBS中用钙黄绿素(Calcein AM)(5μM，Molecular Probes)标记，并在室温下沉淀于选择素包被的小孔(5×104细胞/孔)上。随后以75rpm摇动30分钟(Orbit shaker，Lab-Line Instruments)，在充满Hank′s缓冲盐溶液(HBSS，Sigma)的容器中将其颠倒浸泡，使得没有粘附的细胞在重力的作用下沉降。参见圣约翰等人(St John et al.)，《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods)，170卷：159-166页，1994年。通过抽吸，用HBSS洗涤所述的小孔。因LS180细胞很少粘附到P-选择素上，因此在洗涤前没有必要进行浸泡的步骤。对照包括用Arthrobacterureafaciens唾液酸酶(AUS，Calbiochem；20mU/l×106细胞)在0.05MN-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)缓冲液(pH6.9)中在37℃处理肿瘤细胞1小时，用抗E-或P-选择素的单克隆抗体(1μg/孔；Pharmingen)预处理选择素包被的小孔，或在50μM失活的二糖引发剂，即过乙酰化的Galβ1，3Galβ-O-NM中生长细胞。用96孔荧光计(CytoFluor II)来检测荧光，测定三次测量的平均值±标准误。在每一实验结束时，通过苔盼兰排除法来判断细胞的活存为＞90％。
肿瘤细胞对活化的人内皮细胞的粘附  将HMVEC细胞加入到EBM-2培养液(Clonetics)的96孔板(1×104细胞/孔)中，并在2天后使其生长为融合单层。用TNF-α(20ng/ml；R&D Systems)在37℃活化所述细胞4小时。在不同水平的AcGnG-NM中生长5天后，收集用钙黄绿素标记的肿瘤细胞，将其加入到含有100μl DMEM的2.5×104HMVEC细胞/孔的培养板上，静置20分钟。用冷的PBS洗涤所述小孔2次，并用荧光计来测定结合的程度。在一些实验中，在加入肿瘤细胞之前先加入抗E-选择素mAb(2μg/孔)，然后用唾液酸酶处理细胞(20mU/106细胞)，或者省略TNF-α。
活化人血小板对肿瘤细胞的粘附  将肿瘤细胞种入6-孔板(5×104/孔)，并在有或没有50μM AcGnG-NM存在下使其生长为集落。3天后，将从15ml正常的人血液中分离的血小板收集到20％(v/v)酸-柠檬酸-右旋糖(ACD)抗凝剂中。通过离心来制备富含血小板的血浆并用PSG缓冲液(5mM HEPES，pH6.8，145mM NaCl，4mM KCl，0.5mM磷酸钠，5.5mM葡萄糖，0.5％BSA，以及25nM前列腺素E1[Sigma])来重复洗涤。随后用钙黄绿素AM(5μM)标记血小板，并用血细胞计数仪来计数。用HBSS来洗涤含肿瘤细胞的小孔，向1ml HBSS中加入3×106血小板，随后用人凝血酶(0.8IU/孔；Sigma)来活化。将所述培养板振荡10分钟，用HBSS洗涤小孔两次，用5％福尔马林HBSS溶液固定，并通过荧光显微镜来分析。对照包括用AUS唾液酸酶(在0.05NHEPES、pH 6.9、1mM CaCl2、1mM MgCl2中，20mU/孔)预处理肿瘤细胞，在加入血小板之前用O-唾液酸糖蛋白酶(O-sialoglycoproteinase)(2.4pg/ml；Cedarlane)预处理肿瘤细胞，在凝血酶活化与加入到肿瘤细胞前向所述血小板悬液中加入抗P-选择素mAb(10μg/ml，在HBSS中)或省略凝血酶。
通过配备有数码照相机(Nikon)的荧光显微镜(Nikon Diaphot)系统，可观察结合到肿瘤细胞的血小板，该数码照相机连接至安装有Adobe Photoshop软件的苹果Macintosh计算机。在所述细胞的相差照片上，表现所述血小板的荧光像是叠合的，并对粘附的血小板的数量进行了定量。利用肿瘤细胞占据的百分比区域除以肿瘤结合血小板的数量，可得每个孔的“血小板结合指数(Platelet Association Index)”。
小鼠中的生物分布研究  LS180细胞在有无50μM AcGnG-NM存在下生长3天。将[3H-甲基]胸腺嘧啶脱氧核苷(10μCi/ml，NEN LifeSciences Products)加入到培养液中，并将细胞再培养3天。用EDTA收集细胞，重悬于无菌的0.9％盐水中，并注射(1×105细胞/100μL)到麻醉(吸入甲氧氟烷，Janssen Pharmaceuticals)的6-8周龄的野生型C57BL/6小鼠或在相同背景下繁殖的P-选择素缺陷小鼠(JacksonLaboratory)的侧尾静脉中。参见等人(Mayadas et al.)，《细胞》(Cell)，74卷：541-554页，1993年。苏醒后，观察小鼠3小时，麻醉，取血(每只约200μL)，通过颈部脱位处死，解剖采集肺、肝、肾/肾上腺、脾和脑。在含1％十二烷基硫酸钠的2mL PBS中用蛋白酶K(0.15μg/ml，Boehringer Mannheim)在55℃过夜消化所述器官，并用18号针头重复通过进行匀浆。随后利用Easy DNA试剂盒(Invitrogen)和液闪计数仪来测定血液和器官提取物中的放射性DNA量。通过假设每只小鼠的总血量为2mL来估计血液中总的计数。按照加利福尼亚大学动物个体研究项目的规定，对动物实验伦理事项给予适当的注意。
肿瘤形成  LS180细胞在有无50μM AcGnG-NM存在下生长6天，用EDTA收集细胞，重悬于无菌的PBS中。将150μl PBS中的约3×105细胞注射到麻醉的7周龄的免疫缺陷小鼠(Fox Chase SCID；CharlesRiver)侧尾静脉中。并圈养在具有自由接触标准实验室鼠料与水的不含微生物的笼内，并定期观察任何的事故信号。4周后，在麻醉下利用CO2窒息将小鼠处死，并用Bouin′s溶液(Sigma)固定肺、肝、脑、肾/肾上腺和脾脏6小时，随后转移至70％乙醇中。在解剖显微镜下观察每只动物肺的表面肿瘤的总数量。检查组织切片的(苏木精/伊红)肿瘤病灶，并拍摄代表性的显微照片。对其他的器官也进行组织学观察肿瘤病灶。
细胞溶解分析  LS180细胞在有无50μM AcGnG-NM存在下生长6天，用2mM EDTA/PBS收集细胞，洗涤并重悬浮在含10％FBS和15μCi Na2 51CrO4(435mCi/mg，Dupont NEN)的RPMI 1640中。37℃、2小时后，用培养液洗涤细胞两次，并放入圆锥形的96-孔板(1500细胞/孔)中。通过切碎组织并通过细筛筛选，从正常的C57BL/6小鼠脾脏中制备效应细胞。通过重悬在0.83％NH4Cl的PBS溶液来溶解红细胞，并将富集的白细胞重悬在含10％FBS和200U/ml的重组人IL-2的RPMI培养液(GIBCO)中。培养3天后，将该白细胞加入到含肿瘤细胞的小孔中。一些小孔也接受有血小板(每肿瘤细胞104血小板)，该血小板分离自的通过与上述分离人血小板相同的步骤制备合并的全血(每组2-4只小鼠)。参见尼尔斯王尔德等人(Nieswandt，et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，59卷：1295-1300页，1999年。37℃、3小时后，通过在1500rpm离心该培养板，并采集上清的等分试样来分析51Cr的释放量。通过在仅有RPMI的培养液中培养靶细胞来检测放射性活性的自发释放(Rspont)。在2％十二烷基硫酸钠中完全溶解靶细胞后检查最大释放(Rmax)。根据以下等式来测定特异的细胞溶解：特异细胞溶解％＝(Rexp-Rspon)×100/(Rmax-Rspon)，其中Rexp＝在有效应细胞存在下的释放的计数。在一些实验中标记的肿瘤细胞被加入到人全血中(每个样品1.6ml，收集到20％v/v ACD抗凝血剂中)并在37℃振荡培养3小时。
实施例5
体外乙酰化二糖抑制细胞粘附
以往研究表明，细胞能够摄取和快速地将过乙酰化的二糖脱乙酰并将聚集寡糖在外源二糖上。参见沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92卷：3323-3327页，1995年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，272卷，25608-25616，1997年。该结果表明所述相关内源性末端寡糖(例如，sLeX)的细胞表面水平有所降低。图1所示为用二糖引发剂(primer)对肿瘤细胞表面sLeX的抑制。在其左侧，AcGnG-NM通过扩散被动进入细胞，进行快速的脱乙酰化，并作为Lewis型抗原相关寡糖聚集的底物。如右侧所示，此方式的“引发(primering)”抑制了内源性糖蛋白底物上的末端糖基化，导致细胞表面sLeX的降低。一些涉及携带sLeX决定子(determinants)的粘蛋白样寡糖的二糖，可作为有效的引发剂，具有呈现最高效能的过乙酰GlcNAcβ1，3Galβ-O-NM(AcGnG-NM)。参见沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年。此种方式的寡糖引发抑制HL-60和U-937细胞株的sLeX表达。检测了二糖对选择素结合与LS 180人结肠腺癌细胞的肿瘤形成特性的作用。由于这些细胞表达结合于E-选择素与P-选择素的公知糖类配体，并且它们能够在实验性小鼠血源性转移模型中形成肺肿瘤，所以选择这些细胞。参见金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年；伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年；金等人(Kim et al.)，《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)，155卷：461-472页，1999年；曼诺里等人(Mannori et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，55卷：4425-4431页，1995年；塞科尼(Cecconi et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，269卷：15060-15066页，1994年。
用AcGnG-NM处理LS180细胞能够降低细胞表面sLeX，而不是sLea
胃肠道肿瘤通常同时表达相对高水平的sLeX和sLea。因这些寡糖的任何一种均可介导对选择素的结合，因此实验检测了用AcGnG-NM处理LS180细胞是否会抑制所述细胞表面任一种寡糖的表达。用50μMAcGnG-NM进行处理能够导致细胞表面sLeX的显著抑制，而对细胞表面的sLea没有作用。如图2所示，AcGnG-NM改变了LS180细胞表面的唾液酸Lewis X。将在50μM AcGnG-NM存在下生长的LS180细胞用EDTA收集，如所示用单克隆抗体(CSLEX-1、抗-sLeX与CA19-9、抗sLea)标记，并用流式细胞仪进行检测(材料与方法)。相对于未用抑制剂处理细胞所获得的值，对每个样品的平均荧光值进行标准化。在每种情况下，非特异同型匹配抗体所得值＜10％由CSLEX-1或CA19-9的获得值。
在二糖处理的肿瘤细胞中，对选择素的粘附发生改变
用AcGnG-NM对LS180细胞的处理，根据生长曲线与苔盼兰(Trypan blue)分析，最高达100μM对细胞没有毒性。但是利用CSLEX-1mAb标记细胞表面，通过ELISA检测，用二糖处理能够以剂量依赖的方式对细胞表面sLeX的表达产生抑制。图3所示为AcGnG-NM处理的肿瘤细胞对固化选择素的粘附变化。如图所述，将LS180结肠癌细胞“平铺panned”在用重组E-或P-选择素预包被的小孔上。空心圆为对E-选择素的粘附；实心圆为对P-选择素的粘附。相对于未用二糖处理的细胞所获得的值对粘附的程度进行标准化。用唾液酸酶、抗E-或抗-P选择素mAb、或50μM的失活二糖引发剂乙酰化的Galβ1，3Galβ-O-NM处理的样品所得值分别为0.28-0.32、0.05-0.33、0.95-1.1。每个实验条件进行4次，给出平均值±标准误。当从培养液中撤出所述二糖，所述配体以约6小时的t1/2重新出现在所述细胞表面，表明没有发生细胞的永久性损伤。此种方式的sLeX表达抑制能够降低LS180细胞对固化在塑料平皿上的重组E-和P-选择素的粘附。在这样的条件下，P-选择素对抑制剂的的粘附比对E-选择素更加敏感。因用乙酰化的Galβ1，3Galβ-O-NM(AcGG-NM)孵育细胞，对sLeX的表达或对任意一种选择素轭合物的粘附都没有作用，因此AcGnG-NM的抑制作用是特异的。参见图3。抑制作用的最大程度接近用唾液酸酶或相应的选择素封闭抗体预处理细胞所得的值。
AcGnG-NM抑制对活化内皮和血小板的粘附
在循环中，肿瘤细胞能够遇到内皮细胞上表达的E-和P-选择素，血小板上的P-选择素，以及淋巴细胞上的L-选择素。由于固化在塑料表面时，细胞上受体的表现在排列上会有所不同，所以LS180细胞会被激发来结合在TNF-α活化人微血管内皮细胞(HMvEC)上表达的E-选择素。图4所示为AcGnG-NM处理的肿瘤细胞对培养的人微血管内皮细胞(HMVEC)的粘附变化。用TNF-α活化并用钙黄绿素(Calcein)-加载的LS180细胞来覆盖HMVEC。相对未用二糖处理细胞所得值来对粘附的程度标准化。用唾液酸酶(AUS)或抗E-选择素抗体处理一些样品，否则的话TNF-α不能活化HMVEC。每一条件下进行3次，并且平均所得值。在此系统中，粘附最大程度上依赖E-选择素表达，因为封闭抗体或TNF-α刺激的缺乏会显著降低粘附的程度。与用固化受体所观察到的情况类似，AcGnG-NM对粘附的抑制也是剂量依赖的。参见图3。抑制的最大程度与用唾液酸酶对肿瘤细胞或利用E-选择素的封闭抗体处理后的抑制程度类似，该唾液酸酶破坏了sLeX。
实验检测了当由P-选择素介导时，所述乙酰化二糖化合物如何影响血小板的粘附。图5所示，用AcGnG-NM处理后，血小板对培养的肿瘤细胞的粘附降低。将LS180细胞作为多细胞“岛”，在有无50μMAcGnG-NM存在下，在6孔培养板上生长3天。用钙黄绿素来标记人血小板，用人凝血酶来活化，并将其粘附到所述肿瘤细胞上。测定粘附血小板的数目/由肿瘤细胞占据的区域(血小板粘附指数，PAI)。针对血小板对未处理的肿瘤细胞的值，将所有孔的PAI值标准化。用唾液酸酶、O-唾液糖蛋白酶(OSGPase)、抗P-选择素抗体或没有用凝血酶活化的血小板来处理肿瘤细胞的一些样品。图5A为LS180结肠癌细胞；图5B为A549肺腺癌细胞；图5C为A427肺腺癌细胞。用荧光钙黄绿素染料来加载血小板，并用荧光显微镜来计数粘附到培养的LS180细胞岛上的血小板数量。AcGnG-NM引起剂量依赖的血小板粘附的抑制，用50μM二糖处理肿瘤细胞后，所述抑制能够降低60％。参见图5A。抑制的程度与由唾液酸酶、O-唾液糖蛋白酶处理的肿瘤细胞的程度类似，其需要断裂所述基础蛋白核心的簇寡糖链。参见曼诺里等人(Mannori et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，55卷：4425-4431页，1995年；麦勒斯等人(Mellors et al.)，《酶学方法》(MethodsEnzymol.)，248卷：728-740页，1995年。所述的抑制程度不如通过封闭抗体或省略凝血酶活化所实现的大，提示二糖不完全抑制sLeX的表达，或可选择地提示对于存在有P-选择素的含非唾液酸配体。在两种非腺癌细胞株A549与A427中，观察到了相似的结果。分别参见图5B和5C。这些细胞也表达选择素配体和sLeX决定子，但它们对唾液酸酶和AcGnG-NM的处理反应各异。
AcGnG-NM处理肿瘤细胞的生物分布变化
对进入静脉循环的肿瘤细胞而言，肺是首要的“第一关”粘附靶标靶。图6所示为抑制剂处理的小鼠肿瘤细胞生物分布变化。将放射性标记的细胞注射入C57BL/6小鼠外侧尾静脉中并使其循环3小时。处死小鼠并从器官匀浆与全血中提取DNA。将所述计数对总回收计数进行标准化，其通常代表注射样本的80-90％。在图6A中，每一值代表4只野生型小鼠的平均回收±平均值的标准差。如图6B所示，在向P-选择素缺陷C57BL/6小鼠中注射对照或AcGnG-NM-处理的LS 180细胞重复实验。将放射性标记的LS180细胞注射入小鼠侧尾静脉后10分钟，在肺中发现了超过90％的回收计数。3小时后，约60％的回收计数保留在肺中、约20％保留在肝脏中，约15％保留在血液中，以及少量保留在其他的器官中。参见图6A。抑制剂处理的细胞在注射后，表现出不同的生物分布。肺的种植大幅度减少，并伴随在血室(bloodcompartment)中计数回收的相应的增加，而在其他的组织中则没有显著的差异。当处理或未处理的细胞被注射进入P-选择素缺陷的小鼠中时，尽管与野生型小鼠比较，种植的程度有所减少，但细胞的分布没有差异。参见图6B。因此，改变P-选择素或其糖类配体都具有相似的效果，提示肿瘤细胞聚糖与表达P-选择素的宿主细胞单元的相互作用都会影响所述细胞的命运。
转移性肿瘤形成的减弱
现有技术的研究表明，小鼠中P-选择素的缺失，能够改变血源性分布的LS180细胞的致肿瘤性。参见金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年。图7表明，用AcGnG-NM处理抑制了转移性肺肿瘤形成。在有或没有50μM AcGnG-NM条件下，LS180细胞生长6天。为检测改变所述肿瘤细胞上的糖类配体是否具有相似的效果，将正常或二糖处理的LS180细胞通过尾静脉注射到SCID小鼠中。4周后，处死动物，尸体解剖后，通过计数肺表面的瘤体或组织切片来评价肺肿瘤病灶形成。注射未处理细胞的动物肺中存在大量的病灶，而接受二糖处理细胞的动物病灶的数目较少(n＝8，p＜0.0002，学生氏t-检验)。参见图7C。在组织学切片检测中可观察到相似的趋势(p＜0.02)。通过表面和组织学观察在其他器官中没有发现病灶。还检测了人转移性肺腺癌细胞株(HAL8)。尽管肿瘤病灶的绝对数量低得多，但这些细胞行为相似。
肿瘤细胞的细胞溶解受血小板保护变化的影响
AcGnG-NM处理肿瘤细胞后，血小板的粘附改变，可在上述报道的体内发现中发挥重要的机制性作用，有可能保护肿瘤细胞不发生免疫介导的溶胞。参见伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年；尼尔斯王尔德等人(Nieswandt，et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，59卷：1295-1300页，1999年；曼乃尔等人(Mannel et al.)，《分子病理学》(MolPathol.)，50卷，175-185页，1997年。参见图5。为了检测这种可能性，用51Cr加载LS180肿瘤细胞，并与不同数目的溶胞免疫效应物细胞混合。参见图8。细胞溶胞的程度与效应物与靶标的比值(E∶T)成比例。尽管一些溶胞具有非常高的E∶T值，超出小鼠通常实验性转移分析中出现的值的范围(如图8中的垂直虚线所示)，但在孵育中加入血小板可显著地降低细胞溶解。P-选择素缺陷血小板在相同范围内表现出其保护肿瘤细胞的能力的显著降低。
用AcGnG-NM处理肿瘤细胞后，血小板的保护作用也显著降低。二糖处理和未处理的LS180细胞对全人血的暴露产生了类似的结果(图8，插入部分)，尽管溶胞的整体作用和程度显著升高。总之，这些发现证明血小板上的P-选择素与肿瘤细胞上sLeX决定子的结合为白细胞介导的细胞溶解提供了保护作用。
此外，这些还表明用AcGnG-NM进行的处理抑制了血小板介导的所述细胞的保护作用。垂直的虚线代表对生物分布实验中在体内发生的E∶T比值范围的估计(外周血单核细胞对肿瘤细胞)。空心圆代表没有血小板加入；实心三角代表加入了P-选择素阳性血小板；空心三角代表加入了P-选择素-阴性血小板；实心方块代表用乙酰化GnG-NM处理肿瘤细胞并与P-选择素-阳性血小板混合。所述实验进行三次，数值以平均值+/-标准差表示。
实施例6
乙酰化二糖抑制体内人腺癌细胞的转移能力
治疗或预防肿瘤性疾病或转移性疾病的化合物和方法使用了一类化疗试剂，其包括乙酰化二糖。实验表明用基于二糖的sLeX引发剂，例如乙酰化二糖对人腺癌细胞进行处理，能够显著抑制体内这些细胞的转移潜力。从机制上，这些化合物能够发挥作用是通过(i)引发相对于Lewis抗原的寡糖合成，(ii)阻断细胞表面糖轭合物sLeX的功能，以及(iii)抑制选择素依赖的促进血源性转移的事件，包括血小板粘附以及对内皮细胞的附着。血小板粘附表现出对免疫细胞溶解反应的保护作用。这些发现补充了最近的小鼠的研究，表明改变宿主选择素表达对循环中肿瘤细胞的转移潜力具有深远的作用。参见拜安科恩等人(Biancone et al.)，《试验医学杂志》(J.Exp.Med.)，183卷：581-587页，1996年；弗伦特等人(Frenette et al.)，(Thromb Haemost)，78卷：60-64页，1997年；金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年；伯斯基等人(Borsig etal.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年。肿瘤细胞sLeX的丧失也会导致伴随和相等的体外与E选择素相互作用的能力降低，其可显著干扰对活化的内皮的粘附。可以预见，在肿瘤细胞上表达L-选择素配体也会受到影响，其将防止促进肿瘤生长的白细胞的相互作用。参见伯斯基等人(Borsiget al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，99卷：2193-2198页，2002年。总之，这些发现表明AcGnG-NM以及相关的化合物在血源性转移中，可抑制肿瘤细胞与含选择素的宿主单元(血小板、内皮以及白细胞)间的多种类型的相互作用。
作为改变血小板粘附作用的结果，用AcGnG-NM对肿瘤细胞进行处理对转移能力具有特别重要的作用。如图8所示，选择素-介导的血小板粘附赋予肿瘤细胞对免疫介导的细胞溶解的显著的保护作用，其可解释与用二糖抑制剂处理的细胞比较，未处理的细胞具有较高的致肿瘤性(图7)。因这些实验在SCID小鼠上进行，所以并不涉及体液因子和T细胞介导的反应，但先天免疫单元(例如先天细胞毒反应、NK细胞等等)则可能发挥作用。参见等人(Ohyama et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，99卷：13789-13794页，2002年。由血小板产生的肿瘤细胞的显著的保护作用关键依赖于P-选择素-糖类相互作用，因为P-选择素缺乏能够在体内与体外使这种作用阻抑。对处理细胞进行注射后，sLeX开始以约6小时的t1/2重新出现在细胞的表面。这提示细胞溶解的发生相对较快，且其在释放入循环不久后对血小板与肿瘤细胞粘附的干扰将使得所述细胞对杀伤更加敏感。其他的抑制性试剂，诸如肝素或粘蛋白片段，也可瞬时阻断选择素依赖的粘附并阻断肿瘤的形成。参见伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年。这些试剂可从循环中快速地清除，但无论如何，对转移细胞在肺中的集落形成具有深远的作用。因此，靶向选择素-糖类相互作用的抗转移试剂只能在较短的时间框架内发挥作用。
最终的考虑是选择素在参与新的循环肿瘤细胞在器官毛细血管床的“停留(arresting)”中的能力。栓的捕获对肿瘤“种子”的最后摄取和生长成为大的转移肿瘤病灶能够产生重要的结果。AcGnG-NM处理LS180细胞显示，在尾静脉传输获得细胞4周后，免疫缺陷小鼠肺中最终生长为肿瘤的努力能力被限制(图7)。当肿瘤的改变可对肿瘤生长(包括凋亡)具有尚未解释的作用时，选择素介导的毛细血管停留的起始抑制对肿瘤转移的存在可能起决定作用。支持此观点的其他证据包括：(i)用AcGnG-NM(最高达50μM)对腺癌细胞的处理对培养的LS180生长具有最小的作用；(ii)在肿瘤细胞注射后，实验小鼠没有保持药理学的AcGnG-NM的作用，提示该作用时快速且不依赖于连续的抑制作用；以及(iii)当在实验小鼠中生长的肿瘤数量显著减少时，两组中肿瘤的大小是大约相同的。最近的研究突出了在外渗与摄取之前，血管内肿瘤定居与增殖的早期阶段的重要性。参见Al-Mehdi等人，《自然-医学》(Nat.Med.)，6卷：100-102页，2000年。确保延长血管内停留阶段的概率，将会增加后续的选择素-介导的血小板肿瘤栓的形成及肿瘤细胞与内皮选择素的直接接触。sLeX介导的粘附抑制将有望降低这些参数。最近的研究表明，B3整合素(integrin)的抑制也会以血小板依赖的方式干预血源性转移，与上述观点一致。参见Trikha等人，《癌症研究》(Cancer Res.)，62卷：2824-2833页，2002年。这些发现说明AcGnG-NM或相关化合物作为可能的抗转移试剂用于治疗人类癌症的潜在作用。
实施例7
作为抗转移试剂的合成的乙酰化二糖诱饵(decoy)
按(沙尔卡等人(Sarkar et al.)，1997年；布里克斯特等人(Blixt etal.)，2001年)的报道，制备了合成的二糖诱饵，过乙酰化GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇(GlcNAcβ3Gal-NM)。GlcNAcβ3Gal-NM的结构如图9所示。
本发明的乙酰化二糖的通用结构包括但不限于，过-O-乙酰化GlcNAc  3Galβ-O-萘甲醇(GlcNAcβ1，3Gal-NM)；过-O-乙酰化Galβ1，4GlcNAc-X-R；过-O-乙酰化Galpβ1，3GlcNAc-X-R；过-O-乙酰化Galβ1，3GalNAc-X-R；过-O-乙酰化GlcNAcβ1，3Gal-X-R；过-O-乙酰化GlcNAcβ1，3GalNAc-X-R；过-O-乙酰化GlcNAcβ1，6GalNAc-X-R；过-O-乙酰化GlcNAcβ1，4GlcNAc-X-R；其中R为糖苷配基，包括但不限于苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或多卤烃。
表3显示了合成的乙酰化二糖诱饵的示例性和其他的类似结构，在基于体外的细胞分析中证明其有活性。
表3：合成的乙酰化二糖组合物
  过-O-乙酰化Galβ1，4GlcNAc-O-NM
  过-O-乙酰化GlcNAcβ1，3Gal-O-NM
  过-O-乙酰化GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn
  过-O-乙酰化GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph
  过-O-乙酰化GlcNAc 1，3Gal-O-2-萘酚
  过-O-乙酰化Galβ1，3GalNAc-O-NM
  过-O-乙酰化GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM
  过-O-乙酰化GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM
  过-O-乙酰化3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM
  过-O-乙酰化4-脱氧-GlcNAc1，3Gal-O-NM
  过-O-乙酰化3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM
  过-O-乙酰化4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM
  过-O-乙酰化Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM
  过-O-乙酰化3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn
  过-O-乙酰化4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn
实施例8
二糖处理后LLC细胞的体外特性
在有无50μM过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM存在下，处理培养的LLC细胞4天。参见图10A。为定量LLC细胞表面的sLex按报道所述(布朗等人(Brown et al)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，278卷，23352-23359页，2003年)检测单克隆抗体CSLEX-1对所述细胞的结合。数据表明，用所述化合物对该细胞的处理降低了sLex的表达。参见图10B。使用流式细胞仪分析细胞表面糖类结构(考涅格等人(Koeniget al.)，1998年)。AAL与MAH为植物外源凝集素。PsIg为小鼠选择素嵌合体。用二糖对LLC细胞的处理降低了AAL反应性(岩藻糖降低)但对唾液酸化(sialylation MAH)没有作用。用唾液酸酶处理能够消除PsIg结合。唾液酸转移酶(sialyltransferase)与墨角藻糖基转移酶(fucosyltransferase)酶分析。参见图10C。LLC细胞的的唾液酸转移酶活性比墨角藻糖基转移酶活性高。此情况下的岩藻糖基化中，我们发现本发明的化合物通常以最小的活性封闭所述途径来抑制sLex的形成。
实施例9
二糖处理细胞对固化的P-选择素的粘附变化
如报道所述布朗等人(Brown et al)，2003；弗斯特等人(Fuster etal.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，63卷：2775-2781页，2003年)将LLC细胞“平铺(panned)”在预包被重组P-选择素(R&D Systems，Minneapolis，MN)的小孔上。参见图11。相对未用二糖处理的细胞所得值，将粘附的程度标准化。对照包括唾液酸酶和抗Ps单克隆抗体处理。二糖处理引起细胞粘附处理的中等程度的降低。
实施例10
过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM抑制实验性转移
用过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM或载体(DMSO/丙二醇，v/v 1∶1)处理培养的(A)LLC细胞4天。参见图12。将单细胞悬液(2×105)注射入Esl(e)小鼠的尾静脉中。3周后，处死小鼠并通过目测观察测定肺表面出现的肿瘤数量。二糖处理细胞的注射能够显著减少肿瘤病灶。
实施例11
过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM抑制自发肿瘤转移
将含载体或过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM的渗透泵(ref 4)外科植入到Esl(e)小鼠的背侧皮肤皱襞，并将LLC细胞(5×105)皮下植入到后腿及臀部。参见图13。化合物的剂量值约为1mg/天/小鼠。图版A为：为测定在肺中的肿瘤细胞，4周后，给每只动物腹膜内注射BrdU(溴脱氧尿苷(BrdU)，摄取有分裂的肿瘤细胞，且当用抗BrdU抗体标记来自肺的细胞时，由此来指示所述肺中肿瘤细胞的数量)。处死动物，用PBS灌流心脏，并移出肺。用胶原酶孵育每个肺(10mg/ml、1h、37℃)，用18号针头灌洗并通过40μM孔径尼龙过滤器过滤，随后固定细胞(70％乙醇，1×106细胞/ml)。通过流式细胞仪(FACS)，利用小鼠抗BrdU-FITC抗体来测定所述肺中BrdU-标记的相对数量。用小鼠IgG-FITC抗体进行对照实验。利用一元方差检验进行统计分析，来比较3组的4-7只动物。在图B中，除一组动物用失活的过乙酰化二糖Galβ3Gal-NM进行给药外，严格按照图A进行实验，通过学生氏t检验进行统计分析，来比较2组的4-7只动物。
实施例12
小鼠中P-Sel-/-拟表型AcGnG-NM处理
将LLC细胞(6×105)皮下种植在P-Sel-/-小鼠的后腿及臀部。参见图14。为测定所述肺中的肿瘤，4周后，对每只动物腹膜内注射1mg的BrdU。处死动物，用PBS灌流心脏，并移出肺。如图5所述测定所述肺中BrdU标记细胞的相对数量。用学生氏t检验进行统计学分析来比较2组的4-7只动物。
实施例13
用AcGlcNAcβ3Gal-NM处理不影响血细胞计数
表4显示，用所述化合物AcGlcNAcβ3Gal-NM进行体外处理并不影响血细胞组分的水平。这些结果证明所述化合物没有毒性且提示该化合物能够直接作用于肿瘤细胞。在诱导腹膜炎后，所述化合物对实验没有影响。
表4.血细胞计数
  细胞类型   未处理(n＝375)   载体处理(n＝15)  AcGlcNAcβ3Gal-NM处理(n＝13)
  白细胞总数(K/μL)   6.5±2.8   7.9±1.6  7.8±2.6
  中性白细胞(K/μL)   1.1±0.7   1.9±1.0  1.5±0.5
  淋巴细胞(K/μL)   5.0±2.5   5.6±0.7  6.1±2.1
  血小板(K/μL)   961±267   1146±251  1031±174
  红细胞M/μL)   8.64±1   10.8±1.8  10.5±0.9
K＝103，M＝106
实施例14
寡糖引发与sLeX表达的抑制
在没有寡糖引发的存在下，4-脱氧修饰的乙酰化二糖抑制sLeX的表达。(A)过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM(AcGnG-NM)刺激[6-3H]Gal整合进入混合的寡糖，但过乙酰化4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM(4-脱氧AcGnG-NM)则不能。(B)AcGnG-NM与4-脱氧AcGnG-NM都可抑制单核白血病细胞株U937细胞中的sLeX表达，参见图15。
实施例15
诱饵AcGnG-NM抑制Lewis肺癌(LLC)细胞的实验性转移
用4-脱氧AcGnG-NM、AcGnG-NM或载体(DMSO：丙二醇)处理培养的LLC细胞5天，随后在小鼠尾静脉中注入单细胞悬液(2×105细胞)。3周后，测定所述肺表面肿瘤细胞的数量。4-脱氧AcGnG-NM能够抑制LLC细胞的实验性转移。参见图16。
本说明书引用的所有出版物和专利申请，针对全部目的，在此全部引用作为参考，就如特别和单独地指出每一单独的出版物或专利申请，针对全部目的，作为参考引用一样。
尽管为了清楚理解的目的，已经以说明和示例的方式对前述发明进行了某种程度上的详细描述，但是，本领域所属技术人员显而易见的是，在本发明的教导下，在不偏离所附权利要求的精神或范围下，可以对本发明做出某些变化和修改。

Claims (33)

1.糖基转移酶的二糖抑制剂，包括结构：
                糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
2.药物组合物，包括制药可接受的载体和有效剂量的权利要求1的乙酰化二糖。
3.哺乳动物个体疾病的治疗方法，包括进行治疗有效剂量的权利要求2所述的组合物的给药。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述疾病为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。
5.如权利要求3所述方法，其中所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg的剂量给药。
6.如权利要求1所述的二糖，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R、
过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R、
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R、
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R、
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R、
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R，或
过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，
其中R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；Y为氧原子。
7.如权利要求1所述的二糖，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚，
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)，或
过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。
8.如权利要求1所述的二糖，其中所述二糖为
GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
GlcNAcβ3Galβ-O-R，
其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM、2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]n-2-萘酚；GlcN[3H]Acβ3Galβ-O-NM或GlcNAcβ3Galβ-O-[3H]NM。
9.减轻哺乳动物个体癌症的方法，包括对所述哺乳动物个体进行治疗有效剂量的组合物的给药，所述组合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
或其制药可接受的盐或前药；
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
且其中所述哺乳动物个体中的所述癌症被减轻。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述癌症为转移性癌症。
12.如权利要求9所述方法，其中所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg剂量给药。
13.抑制哺乳动物个体肿瘤转移的方法，包括治疗有效剂量的组合物的给药，所述组合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基-，芳基-，环氧基-，酰氨基-，巯基-或卤素-取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R，
过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R，
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R，
过-O-乙酰GlcNAcβl，3Gal-Y-R，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R，或
过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，
其中，R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβl，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)，
过-O-乙酰GlcNAcβl，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph，
过-O-乙酰GlcNAcβl，3Gal-O-2-萘酚，
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβl，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβl，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)，或
过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述二糖为
GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
GlcNAcβ3Galβ-O-R，
其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM、2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]n-2-萘酚；GlcN[3H]Acβ3Galβ-O-NM；或GlcNAcβ3Galβ-O-[3H]NM。
17.调节细胞中天然发生多糖的生物合成的方法，包括用药物有效剂量的组合物接触细胞的步骤，所述组合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基-，芳基-，环氧基-，酰氨基-，巯基-或卤素-取代；
所述每一种糖的羟基独立地被O-酰基、S-酰基、N-酰基、C-酰基取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被O-芳基、S-芳基或N-芳基取代。
18.鉴别有效癌症治疗的方法，
包括步骤：
用有效剂量的二糖接触肿瘤细胞培养物，所述二糖具有结构：
                糖-X-糖-Y-R，
或其制药可接受的盐或前药；
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
还包括步骤：
检测培养的所述肿瘤细胞的结合；及
通过所述培养的肿瘤细胞的结合减少来确定对于哺乳动物个体的所述有效的癌症治疗。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤细胞为腺癌细胞。
20.如权利要求18所述的方法，还包括检测所述肿瘤细胞与选择素包被的培养皿的结合。
21.如权利要求18所述的方法，还包括检测所述所述肿瘤细胞与凝血酶活化的血小板的结合。
22.如权利要求18所述的方法，还包括检测所述所述肿瘤细胞与肿瘤坏死因子α(TNFα)-活化的内皮细胞的结合。
23.如权利要求18所述的方法，还包括在免疫缺陷小鼠中检测二糖处理的肿瘤细胞的肺集落形成，并通过减少所述免疫缺陷小鼠中的肿瘤转移来鉴定对哺乳动物个体的所述有效的治疗。
24.减轻哺乳动物疾病状态的方法，所述哺乳动物对用阻断细胞表面糖类抗原表达的化合物的治疗有反应，所述方法包括对所述哺乳动物进行治疗有效剂量的化合物的给药，所述化合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
或其制药可接受的盐或前药；
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
25.如权利要求24所述方法，其中所述糖类抗原为细胞表面受体的配体。
26.如权利要求25所述方法，其中所述糖类抗原为Lewis糖类抗原。
27.如权利要求26所述方法，其中所述Lewis糖类抗原为唾液酸(sLex)糖或唾液酸(sLea)糖。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述的糖类抗原为选择素的配体。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述的选择素为E-选择素、P-选择素或L-选择素。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述的疾病状态为肿瘤性疾病。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述的肿瘤性疾病为转移性疾病。
33.如权利要求24所述的方法，其中所述的疾病状态为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。
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