CN102355910A - 利用abh抗原改善炎症性疾病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于改善炎症性疾病的组合物，更具体地涉及一种能够改善炎症反应和诸如皮肤的上皮组织的屏障功能，以提高抗老化性和皮肤弹性并防止或治疗老化的用于改善炎症性疾病的组合物。本发明使得可以通过调节ABH抗原的表达和活性来控制炎症反应，因此，本发明的组合物可以用作治疗剂的发展标记，该治疗剂被设计用于缓解、或治疗或辅助治疗由人体组织中、尤其是ABH抗原表达的皮肤中的炎症反应所导致的疾病，并且该组合物可以用于开发外用制剂以及化妆品，包含设计用于诸如通过调节角化细胞分化以及皮肤屏障功能来恢复皮肤的正常功能和润湿、改善皱纹、美白及弹性恢复的目的的外用制剂。

Description

利用ABH抗原改善炎症性疾病的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于改善炎症性疾病的组合物，更具体地涉及一种用于改善炎症性疾病以改善炎症反应和皮肤的屏障功能，从而提高抗老化性和皮肤弹性并防止或治疗老化的组合物。 

背景技术

ABH抗原是决定ABO血型的抗原。ABO血型由具有特殊结构的糖基化末端中的ABO基因活性差异决定。ABH抗原主要在红细胞的表面上表达，因此，当输入不同类型的血液时，它是导致排斥的主要原因。同样已知的是，除红细胞外，ABH抗原在不同的组织内表达，包括血管、唾腺、汗腺、小肠、大肠、和胰腺。在正常的皮肤组织中，这种抗原主要出现在颗粒层(granular layer)内(其中，角化细胞的分化进程最快)以及颗粒层前的细胞中，而在棘层和基底层中则很难观察到ABH抗原(Ravn et al.，APMIS 108：1-28(2000)；Lloyd，Glycoconjugate J 17：531-541(2000)；Greenwell，Glycoconjugate J 14：159-173(1997)；Dabelsteen et al.，J Invest dermatol 82：13-17(1984))。 

ABH抗原根据蛋白质或脂质的糖基化末端结构确定。当N-乙酰半乳糖胺结合在岩藻糖-半乳糖末端时，确定该抗原为抗原A(A型)。当半乳糖结合时，确定该抗原为抗原B(B型)。当N-乙酰半乳糖胺和半乳糖全部结合时，确定该抗原为AB型。当N-乙酰半乳糖胺和半乳糖均没有结合时，确定该抗原为抗原O(O型)(参见图1)。因此，组织学表达通过岩藻糖基转移酶1或2(FUT1或FUT2)的表达调节，后者调节共有的(common)岩藻糖-半乳糖末端的合成。 

人们在解释使用不同血型输血产生的排斥反应以及披露ABH抗原和各种疾病的发生之间的相互关系上已经做出了很多努力。然而，迄今为止，这些努力都没有成功，因此，仍然需要对ABH抗原自身的功能进行研究。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于改善炎症性疾病的组合物，包括ABH抗原或作为活性成分能够调节ABH抗原表达的物质。 

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于改善炎症性疾病的组合物，包括ABH抗原或作为活性成分能够调节ABH抗原表达的物质。在本发明中，炎症性疾病包括但不总局限于，诸如炎症性皮肤病和胃、食道、小肠、尿道、结膜炎症的疾病。本发明的组合物优选为但不总局限于，药用组合物或化妆用组合物形式。 

在本说明书中，术语“ABH抗原”不仅表示ABH抗原本身，还表示ABH抗原类似物以及ABH抗原/ABH抗原类似物的结合物。术语“ABH抗原类似物”可以是具有糖基化结构(该结构对ABH抗原具有反应性)的物质，或者是具有类似结构的物质以复制或抑制ABH抗原的生理功能；或是包括固定在特定载体分子上的此种类似物的另外结合物的物质。例如，ABH抗原类似物为其中诸如单糖或氨基酸的一种或多种化合物另外结合在ABH抗原上的物质，其功能与原始的ABH抗原相似。ABH抗原例如有单糖，如岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺以及N-乙酰葡糖胺；以及单糖类的混合物(例如，FG(岩藻糖∶半乳糖＝1∶1，H-抗原)、FGG(岩藻糖∶半乳糖＝1∶2，B-抗原)或FGGN(岩藻糖∶半乳糖∶N-乙酰半乳糖胺＝1∶1∶1，A-抗原))，但不总局限于此。在FG、FGG或FGGN中，构成混合物的每种单糖的比例可以与上述比例不同。 

在本说明书中，“调节ABH抗原的表达的物质”表示能够上调或下调ABH抗原的表达的每种物质。能够上调ABH抗原表达的物质包括，任何种类的能够通过提高ABH抗原生物合成中每个阶段的糖基酶的表达或活性从而增加ABH抗原的生物合成的物质，例如ABO、FUT1、和FUT2，或者任何通过促进ABH抗原结合蛋白、脂类和糖类的表达从而增加ABH抗原的生物合成的物质。增加ABH抗原的生物合成的物质例如有编码ABH抗原合成中每个阶段的糖基酶的基因，包括ABO、FUT1、和FUT2，或具有(承载，harboring)该基因的载体。一旦该基因或载体应用在皮肤上，会上调ABH抗原的表达，引起皮肤分化的正常化，意味着免疫反应加强、且免疫系统得以平衡，而皮肤的屏障功能也被加强，使得皮肤更加健康。该载体可以通过本领域技术人员熟知的那些方法构建，或直接在市 场上购买。根据本发明的一个优选实施方式，提高ABH抗原表达的物质可以是柳树提取物或黄芩(Scutellaria radix)提取物(参见图6B)。 

同时，能够下调ABH抗原表达的物质包括，任何种类的能够降低ABH抗原生物合成中每个阶段的糖基酶的表达或活性的物质，包括ABO、FUTI、和FUT2，或者任何通过抑制ABH抗原结合蛋白、脂类和糖类的的表达以减少ABH抗原的生物合成的物质。能够减少ABH抗原的生物合成的物质例如有siRNA、shRNA、或包含siRNA、shRNA的载体或者能够抑制ABH抗原合成中每个阶段的糖基酶的表达的反义编码序列。一旦该基因或载体应用到皮肤上，会下调ABH抗原的表达，且结果导致抑制Th1炎症反应，这意味着减轻过度的炎症反应以缓解炎症性疾病的症状。该载体可以通过本领域技术人员熟知的方法构建，或直接在市场上购买。根据本发明的一个优选实施方式，可降低ABH抗原的表达的物质可以是刺五加(Acanthopanax senticosus)提取物、大蓟(Cirsium japonicum)提取物、香菇(Lentinus edodes)提取物、人参(ginseng)提取物、紫松果菊(Echinacea purpurea)提取物(参见图6A)。. 

本发明的组合物优选以组合物的总重量计0.001-10wt％的浓度包括ABH抗原或能够调节ABH抗原的表达的物质。如果该物质的含量低于0.001wt％，炎症性疾病的改善效果不够好。另一方面，如果该物质的含量高于10wt％，那么与其他成分的混溶性以及制剂稳定性可能会成为问题。因此，ABH抗原或能够调节ABH抗原表达的物质的优选含量为0.01-5wt％。 

本发明可以适用的炎症性疾病例如有炎症性皮肤病、以及其他组织如胃、食道、小肠、尿道和结膜中的炎症，但不总是局限于此。这里的皮肤病包括牛皮癣、遗传过敏性皮炎(异位性皮炎，atpoic dermatitis)、鱼鳞癣、天疱疮、痤疮、红斑狼疮、皮肤老化、皱纹等，但不总是局限于此。事实上，任何由皮肤上的炎症所导致的疾病都可包含在本发明的标准内。 

本发明的组合物的剂型不限于但优选为皮肤外用制剂。皮肤外用制剂的优选实例为护肤膏(skin)型、洗剂型、按摩霜型、营养霜型、敷剂(pack)型、凝胶型或粘胶型化妆用组合物(adhesive type cosmetic composition)。经皮制剂，如洗剂、油膏、凝胶、霜剂、贴片(patch)、或喷雾剂也为优选剂型。无论是怎样的剂型，用于外用制剂的组合物除基本活性成分外可 包括任何其他成分，而这些成分可由本领域中的技术人员通过考量该制剂的目的或剂型而进行选择。 

当本发明的组合物应用于化妆品中时，该组合物包含按照科学方法的(scientifically)皮肤可接受的介质或基质。适合的剂型可例如有溶液、凝胶、固体或无水面团(dough anhydride)、通过将油相分散在水相中而制备的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微粒剂(microgranule)、离子(脂质体)或非离子囊泡、霜剂、护肤膏、洗剂粉末(lotion powder)、喷雾剂、和遮瑕膏(conceal stick)。此外，化妆品可以配制为含泡沫或压缩气体(compressed propellant)的气溶胶组合物。此外，通过含有按照科学方法的皮肤可接受的介质或基质，其还可以配制为通常用于皮肤科学领域中的、局部或全身应用的补充剂(增补剂、辅剂，supplement)。 

本发明的组合物还可包括，常用于皮肤科学领域的补充剂，例如，脂肪物质、有机溶剂、溶剂(resolvent)、浓缩液、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂、添味剂(odorant)、表面活性剂、水、离子或非离子乳化剂、填充剂、螯合剂(sequestering agent)、螯化剂(chelating agent)、防腐剂(preserving agent)、维生素、阻滞剂、保湿剂、精油、染料、色素、亲水性或疏水性活化剂、脂质囊泡或其他常用于化妆术中的成分。上述补充物的含量可以按照化妆领域通常接受的(量)进行确定。 

当本发明的组合物应用到医药中时，该组合物包含ABH抗原或作为活性成分能够调节ABH抗原的表达的物质。本发明的组合物可以通过口服或肠胃外给予，且以药物剂型的一般形式使用。也就是说，通过与常用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂(膨胀剂，extenders)、粘合剂、润湿剂、崩解剂以及表面活性剂等混合，本发明用于改善炎症性疾病的组合物可以制备为用于口服给予或肠胃外给予。用于口服给予的固体剂型为片剂、药丸、粉末、颗粒以及胶囊。这些固体剂型通过混合ABH抗原或能够调节ABH抗原表达的物质和一种或多种合适的赋形剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等制备。除简单的赋形剂外，也可以使用润滑剂，如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给予的液体剂型为悬浮液、溶液、乳液和糖浆，除常用的简单稀释剂如水和液体石蜡外，上述剂型可以包含各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、和防腐剂。用于肠胃外给予的剂型为无菌水溶液、水不溶性赋形剂、悬浮液、乳液、冻干制剂以及栓剂。除一种或多种活性化合物外，水不溶性赋形剂和悬浮液可以包括，丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射脂(injectable ester)如油酸乙酯 (ethylolate)等。除一种或多种活性化合物外，栓剂可以包含硬脂酸甘油三酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可油脂、甘油三月桂酸酯(laurin butter)、甘油、明胶等，但不总是局限于此。 

在本发明中，活性成分可以根据常规方法配制，且在此时，可以适当使用常用的补充剂，例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂(preserving agents)、稳定剂、缓冲剂、和悬浮剂。 

可以根据患者的年龄、性别和体重、目标疾病或病状、病情的严重程度、给予途径以及开处方者的意见，决定ABH抗原或用作本发明组合物的活性成分的调节ABH抗原表达的物质的剂量。基于这些因素，可以由本领域的技术人员决定剂量。取决于本领域技术人员的判断，除注射剂外可以局部应用常用剂型。并且注射剂可以在真皮和皮下脂肪中局部注射，但不总是局限于此。通常，剂量确定在0.001mg/kg/天-2,000mg/kg/天的范围内。更优选的剂量为1μg/kg/天-100μg/kg/天。剂量单位可以包括，例如，1、2、3或4份单个剂量或单个剂量的1/2、1/3或1/4。单个剂量优选包含在一次应用中给予的有效化合物的量，其通常对应于日剂量的全部、1/2、1/3或1/4。 

在本发明的优选实施方式中，对各种炎症性皮肤病进行了研究，包括由于不同的遗传/环境因素导致的皮肤异常炎症反应以及其他伴随免疫系统失衡和异常角化细胞分化的炎症性失调(inflammatory disorder)，例如牛皮癣、遗传过敏性皮炎、鱼鳞癣以及天疱疮。结果观察到ABH抗原要么在颗粒层上几乎不表达，要么通过角化细胞的异常分化异常地表达(参见图4和图5)。在不同的皮肤病中观察到的这种异常的角化细胞分化为颗粒层，可能是导致皮肤屏障功能问题的主要原因。当用UV以诱导炎症最低强度两倍的强度辐射正常皮肤时，第三天不再观察到颗粒层中的ABH抗原的表达(参见图3)。 

在本发明的另一个优选实施方式中，用各种天然物质的提取物处理角化细胞。刺五加、大蓟、香菇、人参以及紫松果菊的提取物降低了血型相关抗原的表达，而柳树提取物和黄芩提取物则提高了血型相关抗原的表达(参见图6)。提高血型相关抗原的表达的物质可以用于增强免疫性，同时，降低血型相关抗原的表达的物质可以用于抑制过度炎症性反应。同样还研究了，进行ABH抗原或构成ABH抗原的单糖类的给予对血型相关抗原的表达会造成怎样的影响。结果，当用ABH抗原或构成ABH抗原的单糖类 进行处理时，细胞和皮肤内的血型相关糖类的表达提高(参见图7-9)。从上述结果确证，ABH抗原的表达与皮肤上的角化细胞的分化和炎症紧密相关。 

在本发明的另一个优选实施方式中，对ABH抗原的表达进行了人工去除。此时，观察到，通过干扰素-γ介导的Th1免疫反应受到抑制(参见图10-12)。在另一个试验中，ABH抗原的表达受到抑制后，用TNF-α和IL-1β进行处理。在那种情况下，对照(control)中的BD-2基因的高表达被降低(参见图13)。在另一个实例中，当ABH抗原的表达受到抑制时，角化细胞的移动速度减慢(参见图14)。至于遗传过敏性皮炎的发展阶段，在初始阶段观察到Th1炎症反应减少，其原因未被披露，但推断为细胞因子调节炎症反应的失衡(所致)。然后，在下一个阶段中，伴随免疫球蛋白E(IgE)的上调，Th2炎症反应迅速扩大，但是，还未清楚地识别出IgE的抗原。此时，可能由不同原因引起的颗粒层中ABH抗原表达的降低，似乎是初始的Th1炎症反应减少的部分原因。因此，暗示可以通过修正异常ABH抗原的表达，防止或治疗诸如遗传过敏性皮炎的皮肤病。当正常的皮肤持续暴露于由各种皮肤刺激引起的炎症反应时，皮肤组织持续地暴露于活性氧，因此，皮肤组织受到损伤、起皱且迅速老化。因此，可以通过适当地减缓和控制皮肤炎症反应，减少活性氧，从而防止皮肤损伤、皱纹和皮肤老化。 

在各种炎症性皮肤病中，当ABH抗原不足时，会出现异常炎症反应。结果可能损害正常的皮肤分化和原始皮肤防御系统。因此，如果有意从外部提供ABH抗原或增加可提高ABH抗原表达的物质，则可以加强正常的免疫反应。也就是说，如果增加颗粒层中的ABH抗原的表达，则可以增强皮肤的免疫反应，因此，将会对临时或遗传ABH抗原表达的减少形成补充，以正常维持皮肤免疫系统，防止和治疗各种由于失衡的、异常的皮肤免疫系统引起的皮肤病，且因而有助于通过增强皮肤屏障功能而保持皮肤健康。 

本发明提供了一种皮肤学有益的物质的筛选方法，包括通过加速体内或体外的表皮角化细胞的分化，从多种候选物质中选择出能够提高或降低ABH抗原表达的物质的步骤。具体地，在细胞培养后，所有的候选物质在同样的条件下等同地处理细胞。通过蛋白免疫印迹法(Western blotting)量化ABH抗原，从而选择符合要求的候选物。此外，这里可以使用本领域技术人员熟知的、用于选择有价值蛋白的任何常规的筛选方法。 

本发明还提供了一种皮肤护理方法，包括通过上调皮肤颗粒层中的ABH抗原以及通过促进抗菌肽表达及增强皮肤屏障功能从而增强内源免疫反应的方式。 

本发明还提供了一种用于缓解皮肤炎症的方法，包括通过暂时降低ABH抗原表达以抑制Th1炎症反应相关因素的表达，从而缓解由于过度炎症反应引起的皮肤病的症状的步骤。 

本发明还提供了一种用于恢复皮肤免疫功能的方法，包括通过在免疫性减弱的皮肤颗粒层中提高正常ABH抗原的表达以控制免疫反应达到正常，从而抑制角化细胞的缺陷分化以及异常的炎症反应的步骤。 

本发明的组合物具有改善或缓解在包括皮肤的多种组织中具有炎症的炎症性疾病的症状的效果。因此，通过加速抗菌肽的表达以及增强皮肤屏障功能，有助于保持皮肤健康，同时有助于皮肤病造成的受损皮肤的恢复。此外，本发明的组合物可以通过持续抑制炎症反应以防止或改善老化，同时增强皮肤弹性并防止或改善皮肤皱纹。因此，本发明的组合物可以有效地用于筛选能够改善炎症性皮肤病和老化的有用物质。 

附图说明

通过参照附图可以最好地理解本发明的优选实施方式的应用，其中； 

图1是示出血型糖的化学结构的示意图。 

图2是示出正常组织中ABH抗原表达的一组照片。 

图3是示出受辐射的皮肤中的ABH抗原(B型抗原)下调的一组照片。 

图4是示出具有多种皮肤病的皮肤组织中ABH抗原表达的一组照片。 

图5是示出具有多种皮肤病的皮肤组织的免疫组织化学染色结果的图表。 

图6是示出不同天然提取物对ABH抗原表达的影响的一组电泳照片。 

图7是示出ABH抗原治疗对血型抗原表达的影响的一组电泳照片。 

图8是示出构成ABH抗原的单糖类的给予对血型抗原表达的影响的一组免疫组织化学染色照片。 

图9是示出构成ABH抗原的单糖类的给予对血型抗原表达的影响的一组电泳照片。 

图10是示出通过去除ABH抗原下调ICAM-1和HLA-DR的一组蛋白免疫印迹图片。 

图11是示出实时PCR结果的图表，其中确认通过去除ABH抗原下调了IL-8和GM-CSF。 

图12是示出实时PCR结果的图表，其中确认通过去除ABH抗原下调了BD-2。 

图13是示出去除ABH抗原后通过TNF-α或IL-1β的处理抑制BD-2表达的一组图片。 

图14是示出ABH抗原表达对细胞迁移速度的影响的一组照片。 

具体实施方式

本发明在实践上目前所优选的实施方式是例示性的，如以下实施例所示出的。 

然而，本领域的技术人员应当理解，在本发明的精神和范围内，可以对本发明所披露的内容进行修改和改进。 

实验例1：不同人体组织内的ABH抗原表达的研究

进行活组织检查，从人体的各个部分获得不同的人体组织。通过使用ABH抗原特异性抗体进行免疫组织化学染色，以研究各组织中的ABH抗原表达。具体地，将活组织检查获得的组织用10％的福尔马林固定过夜。然后，去除福尔马林，并使组织脱水，从而制作石蜡块(paraffin block)。将组织块切成厚度为0.4μm的切片，放置到载玻片上。将载玻片放入58℃的烘箱中1小时使石蜡融化。为了完全清除石蜡，使用二甲苯处理载玻片4次，每次5分钟，然后将载玻片浸入100％乙醇中两次，每次1分钟，在95％乙醇中1分钟，在80％乙醇中1分钟，以及在70％乙醇中1分钟，从而使其逐步再水化。使用流动的自来水将载玻片冲洗5分钟，然后使用蒸馏水再将载玻片清洗5分钟。将其转移到pH 6.0TRS(Dao)中，并且以120℃进行10分钟的高压灭菌。利用双重煮沸(double boiling)将组织冷却10分钟，然后用蒸馏水清洗两次，每次持续5分钟。然后，使用PBS 再次清洗组织，持续5分钟；然后转移到使用PBS稀释的3％氧过氧化物(oxygen peroxide)溶液中，持续10分钟。使用PBS清洗组织3次，每次持续10分钟。使用PAP笔画出组织的边线，然后使用封闭液(blocking solution)(Seemed)处理组织，持续30分钟。使用识别A型或B型抗原的主要抗体处理组织，置于4℃，持续16小时。使用PBS清洗组织3次，每次持续10分钟，然后使用HRP(辣根过氧化物)结合的第二抗体(Santa Cruz)处理组织，持续15分钟。再次使用PBS清洗组织2次，每次持续10分钟，然后使用蒸馏水清洗2次，每次持续10分钟。使用AEC着色剂(Seemed)诱导着色，然后再次使用流动自来水清洗5分钟，且随后使用蒸馏水清洗5分钟。使用苏木精(Dako)对细胞核染色，然后使用流动水清洗10分钟。除去组织周围的水分，然后使用水性封片剂(aqueous mounting solution)(Dako)封片。然后，将组织放在显微镜下观察，取得组织的照片。 

结果确认，根据血型(参见图2)，ABH抗原不仅在红细胞中表达，而且也在很多不同的组织中表达，包括胃(A型)、食道(A型)、小肠(B型)、尿道(A型)、结膜(A型)以及皮肤(A型)。A血型的人的组织仅被A型抗原特异性抗体染色，而不被B型抗原特异性抗体染色。同样地，B血型的人的组织仅被B型抗原特异性抗体染色。在AB血型的人的情况下，组织被两种抗体染色，而O血型的人的组织则不被任何一种抗体染色。 

实验例2：通过UV辐射下调ABH抗原的表达

在正常的组织中，A血型的人的组织仅被A型抗原特异性抗体染色，其通常发生在表皮的颗粒层中(Dabelsteen et al.，J Invest dermatol82：13-17(1984))。最小红斑量(MED)，表示在UV照射后，观察到第一块红斑的强度，需要单独进行测量。通过2MED辐射每块皮肤，然后在UV辐射后的0、28、48、和72小时进行皮肤活体组织检查。通过与实验例1中所述相同的方法进行免疫组织化学染色，以研究ABH抗原的表达。 

结果，ABH抗原通常在UV辐射后24小时表达。然而，48-72小时后，ABH抗原的表达逐步降低(图3)。 

实验例3：在各种皮肤病中下调ABH抗原的表达

基于ABH抗原的表达在UV辐射达到诱发炎症的强度时减少的事实，在假定具有异常(irregulation)炎症反应所导致的症状的各种皮肤病中，对ABH抗原的表达进行研究。为了进行研究，通过活组织检查从患有牛皮癣(A型)、遗传过敏性皮炎(A型)、鱼鳞癣(A型)、蜂窝组织炎(A型)、盘状红斑(discoid lupus)(A型)、痤疮(B型)等的患者获取组织。通过与实验例1中所述相同的方式对组织进行免疫组织化学染色，以研究ABH抗原的表达。 

结果，在大多数病变组织中，颗粒层中的ABH抗原的表达不足。尽管有个体差异，在棘层或基底层中的异常ABH抗原的表达较为常见(图4和图5)。该结果表明，在颗粒层中有不完全分化，和/或在棘层或基底层中有异常分化。 

实验例4：天然提取物对ABH抗原表达的影响

研究各种天然提取物对ABH抗原表达的影响。为了进行研究，使用浓度分别为0.1％(v/v)、1％(v/v)以及2％(v/v)的未稀释的刺五加、大蓟、香菇、人参、紫松果菊、黄芩、柳树提取物(购自Biospectrum)处理HaCaT细胞，随后培养48小时。然后，进行蛋白免疫印迹以研究B型抗原的表达。作为对照，使用α-微管蛋白或STAT1α蛋白。 

结果，刺五加、大蓟、香菇、人参以及紫松果菊的提取物降低了HaCaT细胞中B型抗原的表达，而柳树提取物和黄芩提取物则提高了B型抗原的表达(参见图6)。 

实验例5：ABH抗原对血型抗原表达的影响

使用A、B、和H抗原(购自Dextra Laboratories)处理含有浓度为100nM的B抗原的HaCaT细胞，持续24小时，然后进行蛋白免疫印迹以研究B型抗原的表达。结果，通过B或H型抗原提高了B型抗原的表达。A型抗原没有提高B型抗原的表达(图7-10)。使用浓度为100nM或200nM的A或B型抗原处理HaCaT细胞48小时，A或B型抗原提高了B型抗原的表达(图7)。上述结果表明，A、B以及H抗原能够提高HaCaT细胞中B型抗原的表达。 

实验例6：构成ABH抗原的单糖类的给予对血型抗原的表达的影响(1)

一般现象是，与正常人相比，遗传过敏性皮炎患者的臀部皮肤中的血型抗原表达减少，尽管肉眼不能观察其中清楚的病变。研究了通过构成ABH抗原的单糖类的给予是否能够使降低的表达得以恢复。为此，将由100％半乳糖、FGG(岩藻糖∶半乳糖＝1∶2，B抗原组合物)以及FGGN(岩藻糖∶半乳糖∶N-乙酰半乳糖胺＝1∶1∶1，A抗原组合物)组成的糖混合物溶解在由聚二乙醇∶乙醇∶水＝3.5∶1.5∶5组成的混合溶剂中，浓度为0.5％(w/v)。溶解产物紧密地应用于年龄为30岁的、B型男性过敏性皮肤炎患者(志愿者)的臀部皮肤，以及年龄为24岁的、A型男性过敏性皮肤炎患者(志愿者)，持续48小时，并再重复(一次)(总共96小时)。然后，进行活组织检查以获得样本组织。通过使用与实验例1所述相同的方法对组织进行免疫组织化学染色，以研究ABH抗原的表达。 

结果，当用形成血型糖的物质处理时，在B型30岁男性遗传过敏性皮炎患者(志愿者)(图8A)和A型24岁男性遗传过敏性皮炎患者(志愿者)(图8B)的细胞和皮肤中，血型糖的表达提高。 

实验例7：构成ABH抗原的单糖类的给予对血型抗原的表达的影响(2)

使用构成A、B、和H抗原的FGG和FGGN混合物以及FG(岩藻糖∶半乳糖＝1∶1，H-抗原组合物)，还有作为构成A、B和H抗原的单糖类的葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺，以不同的浓度0.1、1和10μM，处理具有B型抗原的HaCaT细胞，持续24小时。进行蛋白免疫印迹法以研究B型抗原的表达。结果，在上述每种情况中，B型抗原的表达均提高(图9)。 

实验例8：通过去除ABH抗原减少ICAM-1和HLA-DR的表达

通常，在皮肤的炎症反应中，干扰素-γ(IFNg)，Th1细胞因子发挥重要作用，其提高了介导Th1免疫反应的各种因子的表达。具体地，当角化细胞作为抗原呈递细胞发挥作用时，ICAM-1和HLA-DR为最重要的分子(Barker et al.，Lancet 337：211-214(1991))。在补充有5％FBS(胎牛血清，Hyclone)的DMEM(由Dulbecco改良的Eagle培养基，Welgene)中，于孵育器中，培养HaCaT，具有B抗原的角化细胞系，直到细胞生长到 充满35mm培养皿的70％。然后，在Opti-MEM(Invitrogen)中培养细胞2个小时，然后通过使用2.5μl的脂质体(lipofectamine)2000(Invitrogen)，以250pmol的不具有靶基因的阴性对照RNA(Bioneer)以及等量的靶向FUT1基因的siRNA(Bioneer，SEQ.ID.NO：1)进行转染。第二天将培养基替换为无FBS的DMEM。次日，使用浓度为10ng/ml的干扰素-γ(Peprotech)处理细胞。在0、12、15、18、24、36以及48小时的时间点，从细胞中提取蛋白质。通过使用每种对应抗体(Abcam，Dako)进行蛋白免疫印迹，以研究B型抗原的表达(下调)和ICAM-1以及HLA-DR的改变，其为抗原呈递细胞的主要因子。将α-微管蛋白(SantaCruz)用作几乎不发生改变的对照蛋白(control protein)。 

结果，在对照中，通过干扰素-γ显著提高了ICAM-1和HLA-DR的表达，而在使用250pmol/ml的FUT1siRNA处理以抑制B型抗原表达的实验组中干扰素-γ显著抑制了ICAM-1的表达。此外，直至第18个小时抑制了HLA-DR的上调，而在24小时之后至48小时时间点则恢复上调(图10)。 

实验例9：通过去除ABH抗原减少IL-8、GM-CSF和BD-2的表达

通过与实施例4中所述相同的方法，使用脂质体2000(对照，CNT)处理HaCaT，含有B抗原的角化细胞系，并用250pmol阴性对照RNA(NC)、靶向FUT1(SiFUT1)的SiRNA(Bioneer)以及靶向ABO(SiABO)的SiRNA(Bioneer)转染，得到四种样本，将其用浓度为10ng/ml的干扰素-γ处理或不处理。24小时后，从细胞中提取RNA。通过使用荧光染料sybrgreen(Takara预混试剂)进行RT-PCR(Applied Biosystems，7500实时PCR系统)确认36b4修饰(modified)的IL-8、GM-CSF以及BD-2(β-防御素2)的mRNA水平。此时，FUT1基因的siRNA序列与实验例4中的序列相同，且ABO基因的siRNA序列是表示为SEQ.ID.NO：2的核苷酸序列。人类IL-8的引物是表示为SEQ.ID.NO：3和NO：4的核苷酸序列。GM-CSF的引物是表示为SEQ.ID.NO：5和NO：6的核苷酸序列。BD-2的引物是表示为SEQ.ID.NO：7和NO：8的核苷酸序列。 

结果，在多个介导Th1免疫反应的因子中，通过去除B型抗原，干扰素-γ诱导的IL-8和GM-CSF的表达降低。干扰素没有提高BD-2(皮肤抗菌肽类之一)的表达，但是通过去除B型抗原，降低了BD-2的表达(图11和图12)。 

实验例10：去除ABH抗原后，通过TNF-α或IL-1β的处理抑制BD-2的表达

分别用能够过表达FUT1 siRNA的慢病毒载体和能够过表达ABOsiRNA的慢病毒载体(SantaCruz)转染HaCaT细胞系，然后使用嘌呤霉素选择性培养1个月。结果，构建了能够稳定地抑制FUT1或ABO表达的HaCaT细胞系。分别使用TNFα和IL-1β将细胞处理24小时。然后，利用36b4基因表达修饰BD-2mRNA的表达水平，再使用与实验例7中所述相同的方法进行RT-PCR。 

结果，不仅是没有进行任何处理的BD-2的表达，而且还有在经TNF-α和IL-1β处理后由炎症反应介导而提高的BD-2的表达，均降低到在HaCaT细胞系中抑制FUT1或ABO表达的相同程度(图13)。 

实验例11：ABH抗原的表达对细胞迁移速度的影响

不使用siRNA处理HaCaT细胞系，或不使用与实验例4中所述相同的方法(通过利用脂质体2000)用阴性对照siRNA(NC)、FUT1或ABOsiRNA转染HaCaT细胞系，然后进行培养直至细胞生长至充满培养皿。以规律间隔形成划痕，以形成没有细胞的空间。当在补充有10％FBS的DMEM中培养细胞时，在0、24、48、72以及96小时的时间点照相，以观察细胞迁移。 

结果，与没有用siRNA处理或没有用NC siRNA转染的细胞相比，在用ABO或FUT1 siRNA转染的细胞中，划痕的封闭速度(用细胞填补划痕)明显地降低。在用FUT1siRNA处理的细胞中，划痕的封闭速度甚至比用ABO siRNA处理的细胞更慢(图14)。上述结果表明，在伤口愈合过程中，当FUT1和ABO表达降低时，也就是血型抗原的表达降低时，角化细胞的移动速度变慢。 

如上文中解释的，基于在各种炎症性皮肤病中ABH抗原表达降低的事实，本发明的发明人强有力地抑制了角化细胞内ABH抗原的表达。结果，发明人确认，根据干扰素-γ诱发的各种Th1免疫反应因子的减少削弱了免疫系统。因此，确认通过调节ABH抗原的表达能够调节炎症性反应。 

制造例1：药用组合物的制备

<1-1>糖浆的制备

含有20％(重量/体积)的活性成分的糖浆的制备如下。首先，将H型抗原、糖精以及葡萄糖溶解在80g的温水中。将混合物冷却下来，向其中加入甘油、糖精、香料、乙醇、山梨酸以及蒸馏水的混合物。向混合物中加水，使其总体积为100ml。 

以下是糖浆的成分。 

<1-2>片剂的制备

将250g的B型抗原、175.9g的乳糖、180g的马铃薯淀粉以及32g的胶体硅酸(colloidal silicic acid)混合在一起。在混合物中加入10％明胶溶液，然后将其粉碎，并用14-目(mesh)筛过滤。干燥粉碎后的混合物，加入160g的马铃薯淀粉、50g的滑石以及5g的硬脂酸镁以制备片剂。 

以下为片剂的成分。 

<1-3>可注射溶液的制备

如下制备包含10mg活性成分的可注射溶液。 

将1g的A型抗原、0.6g的氧化钠以及0.1g的抗坏血酸溶解在蒸馏水中，以制成100ml的溶液。将溶液放入瓶子中并以20℃加热30分钟进行消毒。 

以下为可注射溶液的成分。 

制造例2：化妆用组合物的制备

<2-1>乳化型化妆品的制备

根据表1所示组合物制备乳化型化妆品。以下为制备方法。 

1)以65-70℃加热包含原料1-9组成的混合物； 

2)向步骤1)的混合物中添加原料10； 

3)通过以65-70℃加热，使包含原料11-13的混合物溶解； 

4)在进行步骤3)期间，缓慢地加入步骤2)的混合物，然后以8,000rpm将其乳化2-3分钟； 

5)将原料14溶于水中，然后向步骤4)的混合物中添加该溶液，然后乳化2分钟。 

6)对原料15-17称重，将其加入步骤5)中的混合物中，然后乳化30秒；以及 

7)将乳化过程完成后的步骤6)的混合物脱气，然后以25-35℃使其冷却以形成乳化型化妆品。 

【表1】 

<2-2>溶解型化妆品(solubilized cosmetics)的制备

根据表2所示组合物制备溶解型化妆品。以下为制备方法。 

1)向原料1(纯净水)中加入原料2-6，使用Agi-混合器(Agi-mixer)将其溶解； 

2)向原料7(乙醇)中加入原料8-11并使其完全溶解；以及 

3)向步骤1)中的混合物中缓慢加入步骤2)中的混合物，随后使其溶解。 

【表2】 

Claims (15)

1.一种用于改善炎症性疾病的组合物，包括ABH抗原或作为活性成分调节ABH抗原的表达的物质。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述炎症性疾病选自由炎症性皮肤病和胃、食道、小肠、尿道和结膜的炎症性疾病所构成的组中。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述调节ABH抗原的表达的物质为提高ABH抗原的表达的物质或降低ABH抗原的表达的物质。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述提高ABH抗原的表达的物质为选自由ABO、FUT1和FUT2构成的组中的基因，或包含所述基因的载体。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述降低ABH抗原的表达的物质为选自由siRNA和shRNA，以及包含所述siRNA或shRNA的反义编码序列的载体所构成的组中的物质，所述siRNA和shRNA抑制选自由ABO、FUT1和FUT2构成的组中的基因的表达。

6.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述炎症性皮肤病选自由牛皮癣、遗传过敏性皮炎、鱼鳞癣、天疱疮、痤疮、红斑狼疮、皮肤老化和皱纹所构成的组中。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中，ABH抗原或所述调节ABH抗原的表达的物质以所述组合物总重量的0.001-10wt％的浓度包含在所述组合物中。

8.根据权利要求1至权利要求7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以药用组合物或化妆用组合物的形式制备。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，将所述组合物配制为用于皮肤的外用制剂。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述化妆用组合物选自由护肤膏型、皮肤滋养膏型、按摩霜型、营养霜型、敷剂型、凝胶型、粘胶型化妆制剂、洗剂、油膏、凝胶、霜剂、贴片和喷雾剂所构成的组中。

11.根据权利8所述的组合物，其中，所述药用组合物为用于口服给予或肠胃外给予的形式，其选自由固体、半固体和液体制剂所构成的组中。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述ABH抗原选自由A型抗原、B型抗原、AB型抗原和H型抗原所构成的组中，在所述A型抗原中，N-乙酰半乳糖胺结合在岩藻糖-半乳糖末端上，在所述B型抗原中，半乳糖结合在岩藻糖-半乳糖末端上，在所述AB型抗原中，N-乙酰半乳糖胺和半乳糖二者均结合在岩藻糖-半乳糖末端上，以及在所述H型抗原中，N-乙酰半乳糖胺和半乳糖二者均不结合在岩藻糖-半乳糖末端上。

13.根据权利要求1或权利要求11所述的组合物，其中，所述ABH抗原选自由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、FG(岩藻糖∶半乳糖＝1∶1，H-抗原组合物)、FGG(岩藻糖∶半乳糖＝1∶2，B-抗原组合物)以及FGGN(岩藻糖∶半乳糖∶N-乙酰半乳糖胺＝1∶1∶1，A-抗原组合物)所构成的组中。

14.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述提高ABH抗原的表达的物质为柳树提取物或黄芩提取物。

15.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述降低ABH抗原的表达的物质选自由刺五加提取物、大蓟提取物、香菇提取物、人参提取物以及紫松果菊提取物所构成的组中。

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