JPH05222099A - 合成ｎ−結合グリコ複合体の製造法 - Google Patents
合成ｎ−結合グリコ複合体の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 β−アノマー配置が保存されたＮ−結合グリ
コ複合体を形成するオリゴサッカリドの誘導体化法を提
供する。 【構成】 サッカリド単位数が最大で９個までの複雑な
未保護オリゴサッカリドを約８〜約８．５のｐＨにおい
て飽和重炭酸アンモニウムと反応させて該オリゴサッカ
リドの未保護β−グリコシルアミン誘導体を形成し、そ
の後該未保護β−グリコシルアミン誘導体を、アミノ酸
残基数が約５〜約２５個であるペプチドであって、該ペ
プチドと該未保護β−グリコシルアミン誘導体との、β
−グリコシルアミンが結合したグリコ複合体を形成する
ことができる活性化されたカルボキシル基を有する該ペ
プチドと反応させることを含んで成る、ペプチドの合成
Ｎ−結合グリコ複合体をβ−アノマー配置を直接保護す
る条件下で製造する方法。
コ複合体を形成するオリゴサッカリドの誘導体化法を提
供する。 【構成】 サッカリド単位数が最大で９個までの複雑な
未保護オリゴサッカリドを約８〜約８．５のｐＨにおい
て飽和重炭酸アンモニウムと反応させて該オリゴサッカ
リドの未保護β−グリコシルアミン誘導体を形成し、そ
の後該未保護β−グリコシルアミン誘導体を、アミノ酸
残基数が約５〜約２５個であるペプチドであって、該ペ
プチドと該未保護β−グリコシルアミン誘導体との、β
−グリコシルアミンが結合したグリコ複合体を形成する
ことができる活性化されたカルボキシル基を有する該ペ
プチドと反応させることを含んで成る、ペプチドの合成
Ｎ−結合グリコ複合体をβ−アノマー配置を直接保護す
る条件下で製造する方法。
Description
【０００１】本発明はβ−アノマー配置を保持する条件
下で合成Ｎ−結合グリコ複合体を形成するオリゴサッカ
リドの誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）法に
関する。
下で合成Ｎ−結合グリコ複合体を形成するオリゴサッカ
リドの誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）法に
関する。
【０００２】炭水化物は、一般に、Ｎ（窒素）−グリコ
シド結合か、又はＯ（酸素）−グリコシド結合で種々の
複合体（例えば、蛋白質及び脂質）に結合される。ほと
んどの動物性糖蛋白質はＮ−アセチル−グルコサミン
（ＧｌｃＮＡｃ）／アスパラギン（Ａｓｎ）間のＮ−グ
リコシド結合でポリペプチド骨格に結合されているオリ
ゴサッカリドを含有する。糖蛋白質中の還元性の末端モ
ノサッカリド（ピラノース体）とアスパラギンとの間の
窒素グリコシド結合は以下の式Ｉで示されるβ−アノマ
ー配置を取っている。
シド結合か、又はＯ（酸素）−グリコシド結合で種々の
複合体（例えば、蛋白質及び脂質）に結合される。ほと
んどの動物性糖蛋白質はＮ−アセチル−グルコサミン
（ＧｌｃＮＡｃ）／アスパラギン（Ａｓｎ）間のＮ−グ
リコシド結合でポリペプチド骨格に結合されているオリ
ゴサッカリドを含有する。糖蛋白質中の還元性の末端モ
ノサッカリド（ピラノース体）とアスパラギンとの間の
窒素グリコシド結合は以下の式Ｉで示されるβ−アノマ
ー配置を取っている。
【化２】
【０００３】遊離の還元性末端基を有するオリゴサッカ
リドは種々の植物源及び動物源から単離することができ
る。更に、オリゴサッカリドは化学的な又は酵素的な方
法で糖蛋白質からはずすこともできる。これらのサッカ
リドも還元性の末端モノサッカリド残基、典型的にはＧ
ｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチル−ガラクト
サミン）を有する。
リドは種々の植物源及び動物源から単離することができ
る。更に、オリゴサッカリドは化学的な又は酵素的な方
法で糖蛋白質からはずすこともできる。これらのサッカ
リドも還元性の末端モノサッカリド残基、典型的にはＧ
ｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチル−ガラクト
サミン）を有する。
【０００４】これらのオリゴサッカリドの誘導体は天然
産グリコ複合体の炭水化物部分の機能に関する基礎的研
究活動において、また臨床研究や診断薬において、更に
臨床薬理学及び同治療学において有用である。次のリス
トはこれらの有用誘導体を例示するものである。
産グリコ複合体の炭水化物部分の機能に関する基礎的研
究活動において、また臨床研究や診断薬において、更に
臨床薬理学及び同治療学において有用である。次のリス
トはこれらの有用誘導体を例示するものである。
【０００５】１）オリゴサッカリドのビオチン複合体 ２）オリゴサッカリドの蛍光性複合体 ３）オリゴサッカリドの脂質複合体 ４）オリゴサッカリドのペプチド複合体 ５）オリゴサッカリドのアミノ酸複合体 ６）固体支持体（例えば、アガロースゲルカラム、シリ
コンチップ、ペトリ皿等）に対する固定化オリゴサッカ
リド ７）オリゴサッカリドの薬物複合体 ８）オリゴサッカリドの発色団複合体 ９）例えばカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）保護基又は９−
フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基を
持つ１−Ｎ−保護グルコシルアミン誘導体。
コンチップ、ペトリ皿等）に対する固定化オリゴサッカ
リド ７）オリゴサッカリドの薬物複合体 ８）オリゴサッカリドの発色団複合体 ９）例えばカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）保護基又は９−
フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基を
持つ１−Ｎ−保護グルコシルアミン誘導体。
【０００６】グリコシルアミン類も生物学的及び製剤上
の関心のあるＮ−ヌクレオシド、グリコシルチオ尿素及
びグリコシルアミノ複素環式化合物の合成において価値
ある中間体である。例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅ
ｓ．、１８８、３５−４４（１９８９）及びその中で引
用されている文献を参照されたい。
の関心のあるＮ−ヌクレオシド、グリコシルチオ尿素及
びグリコシルアミノ複素環式化合物の合成において価値
ある中間体である。例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅ
ｓ．、１８８、３５−４４（１９８９）及びその中で引
用されている文献を参照されたい。
【０００７】これらのオリゴサッカリド誘導体は式２に
おけるように糖蛋白質中に生じているアスパラギンと還
元性の末端ＧｌｃＮＡｃとの間の結合（即ち、ＧｌｃＮ
Ａｃ→Ａｓｎ）が保存されるように製造されるのが望ま
しいと思われる。即ち、β−アノマー配置、ピラノース
体及びアスパラギンのカルボニル成分とメチレン成分を
保持するのが望ましいと思われる。式３は糖蛋白質中の
ＧｌｃＮＡｃ→Ａｓｎ結合の本性を説明し、また式４は
ＧｌｃＮＡｃ→Ａｓｎ結合の特性を保存していると思わ
れる例示誘導体の化学的形態を示す。
おけるように糖蛋白質中に生じているアスパラギンと還
元性の末端ＧｌｃＮＡｃとの間の結合（即ち、ＧｌｃＮ
Ａｃ→Ａｓｎ）が保存されるように製造されるのが望ま
しいと思われる。即ち、β−アノマー配置、ピラノース
体及びアスパラギンのカルボニル成分とメチレン成分を
保持するのが望ましいと思われる。式３は糖蛋白質中の
ＧｌｃＮＡｃ→Ａｓｎ結合の本性を説明し、また式４は
ＧｌｃＮＡｃ→Ａｓｎ結合の特性を保存していると思わ
れる例示誘導体の化学的形態を示す。
【化３】
【化４】
【０００８】多数の公知のオリゴサッカリドの誘導体化
法が役に立つが、それら方法はＧｌｃＮＡｃ→Ａｓｎ結
合の前記の望ましい特性を全て保存する訳ではない。
法が役に立つが、それら方法はＧｌｃＮＡｃ→Ａｓｎ結
合の前記の望ましい特性を全て保存する訳ではない。
【０００９】１つの従来のオリゴサッカリド誘導体化法
は、例えばストーウェル（Ｓｔｏｗｅｌｌ）及びリー
（Ｌｅｅ）がＡｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．
ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍ．、３７、２２５−２７９（１９
８０）、特に第２４５頁に記載するように還元性アミノ
化を伴うものである。しかし、次の２つの説明反応式か
ら分かるように、記載される方法はピラノース体、及び
還元性の末端モノサッカリドのアノマー中心もアスパラ
ギンのカルボニル基及びメチレン基も保存しない。
は、例えばストーウェル（Ｓｔｏｗｅｌｌ）及びリー
（Ｌｅｅ）がＡｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．
ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍ．、３７、２２５−２７９（１９
８０）、特に第２４５頁に記載するように還元性アミノ
化を伴うものである。しかし、次の２つの説明反応式か
ら分かるように、記載される方法はピラノース体、及び
還元性の末端モノサッカリドのアノマー中心もアスパラ
ギンのカルボニル基及びメチレン基も保存しない。
【化５】
【化６】
【００１０】オリゴサッカリド誘導体化のもう１つの従
来法は、１９８８年６月１６日公開のＰＣＴ国際特許出
願第ＷＯ８８／０４３２３号明細書に説明されるグリコ
シルアミンの直接誘導体化によるグリコ複合体の形成を
伴うものである。これらの方法は還元性ＧｌｃＮＡｃの
ピラノース体を保存するけれども、それらは、次の説明
のための生成物の式７から分かるように、β−アノマー
配置（生成物の混合物が得られる）もアスパラギンのカ
ルボニル基及びメチレン基も必ずしも保存しない。更
に、この方法論は糖蛋白質に結合したＮ−結合オリゴサ
ッカリドにしか適用できず、そのためにそれは用途が限
られたものである。
来法は、１９８８年６月１６日公開のＰＣＴ国際特許出
願第ＷＯ８８／０４３２３号明細書に説明されるグリコ
シルアミンの直接誘導体化によるグリコ複合体の形成を
伴うものである。これらの方法は還元性ＧｌｃＮＡｃの
ピラノース体を保存するけれども、それらは、次の説明
のための生成物の式７から分かるように、β−アノマー
配置（生成物の混合物が得られる）もアスパラギンのカ
ルボニル基及びメチレン基も必ずしも保存しない。更
に、この方法論は糖蛋白質に結合したＮ−結合オリゴサ
ッカリドにしか適用できず、そのためにそれは用途が限
られたものである。
【化７】
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、この技術分野
においてβ−アノマー配置を保存しているＮ−結合グリ
コ複合体を形成する方法の開発が必要とされている。
においてβ−アノマー配置を保存しているＮ−結合グリ
コ複合体を形成する方法の開発が必要とされている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、β−ア
ノマー配置を保持する条件下で合成Ｎ−結合グリコ複合
体を形成する、オリゴサッカリド誘導体化の新規な方法
が提供される。かくして、このオリゴサッカリドのグリ
コシルアミン誘導体を所望とされるＮ−結合グリコ複合
体の形成前に中間体化合物としてのハロアセチル化誘導
体に転化することによってβ−アノマー配置を実質的に
保持することができることが見い出された。ハロアセチ
ル化誘導体はクロロアセチル化誘導体であるのが好まし
い。グリコシルアミンのハロアセチル化誘導体への転化
はグリコシルアミンにハロアセチル基を供与することが
できる試薬との反応によって行うことができる。本発明
によれば、しかして、還元性のモノサッカリド、又は還
元性モノサッカリドを有するポリサッカリドを誘導体化
することができる。
ノマー配置を保持する条件下で合成Ｎ−結合グリコ複合
体を形成する、オリゴサッカリド誘導体化の新規な方法
が提供される。かくして、このオリゴサッカリドのグリ
コシルアミン誘導体を所望とされるＮ−結合グリコ複合
体の形成前に中間体化合物としてのハロアセチル化誘導
体に転化することによってβ−アノマー配置を実質的に
保持することができることが見い出された。ハロアセチ
ル化誘導体はクロロアセチル化誘導体であるのが好まし
い。グリコシルアミンのハロアセチル化誘導体への転化
はグリコシルアミンにハロアセチル基を供与することが
できる試薬との反応によって行うことができる。本発明
によれば、しかして、還元性のモノサッカリド、又は還
元性モノサッカリドを有するポリサッカリドを誘導体化
することができる。
【００１３】本発明のもう１つの好ましい面によれば、
そのオリゴサッカリドの誘導体化は次の３工程より成る
総合法において用いられる：
そのオリゴサッカリドの誘導体化は次の３工程より成る
総合法において用いられる：
【００１４】１）ピラノース体及び還元性末端モノサッ
カリドのβ−配置（通常はＧｌｃＮＡｃ）が保存される
ようなオリゴサッカリドのグリコシルアミン誘導体の合
成。
カリドのβ−配置（通常はＧｌｃＮＡｃ）が保存される
ようなオリゴサッカリドのグリコシルアミン誘導体の合
成。
【００１５】２）グリコシルアミンのハロアセチル誘導
体の合成。この合成工程はグリコシルアミンのβ−配置
の変旋光を伴ってはならない。
体の合成。この合成工程はグリコシルアミンのβ−配置
の変旋光を伴ってはならない。
【００１６】３）ハロアセチル化誘導体の合成上有用な
中間体への転化、又は複合体によるハロアセチル化グリ
コシルアミンの直接誘導体化。
中間体への転化、又は複合体によるハロアセチル化グリ
コシルアミンの直接誘導体化。
【００１７】本発明の方法において、ハロアセチル化は
グリコシルアミンと過剰の無水クロロ酢酸（ｓｙｍ．無
水ジクロロ酢酸とも称される）との反応によって行うの
が好ましい。ブロモ−及びヨード−誘導体の場合は、そ
の酸のＮＨＳ−エステル、例えばＮ−（ヨードアセチル
オキシ）スクシンイミド（ＩＣＨ2 ＣＯＯＮＨＳ）を用
いることができる。かくして、少なくとも約５倍、例え
ば５〜１０倍モル過剰のＮ−アセチル化試薬が用いられ
る。無水クロロ酢酸をもちいると、驚くべきことに、β
−アノマー配置が従来法、例えば有意量のα−アノマー
生成物との混合物をもたらすダンシルクロリドに比較し
て約９８％残っている中間体がもたらされる。無水クロ
ロ酢酸はアミノ酸のＮ−アセチル化用の公知の試薬であ
り、またハロゲン脂肪酸のα−アミノ酸を製造するアミ
ノリシスも公知であるけれども〔ケロニス（Ｃｈｅｒｏ
ｎｉｓ）及びスピッツミューラー（Ｓｐｉｔｚｍｕｅｌ
ｌｅｒ）のＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、６１、
３４９−３７５（１９４１）〕、グリコシルアミンとの
その高いＮ−特異反応性及びＮ−結合オリゴサッカリド
の形成に際してのβ−配置の本明細書に記載されるよう
な保持性は予想外のものであった。かくして、変旋光の
傾向がある単純な糖類に関してしばしば必要とされるよ
うなα−アノマー配置のものとβ−アノマー配置のもの
との分離工程は不要である。オリゴサッカリドは結晶で
はなくガラス質のものを形成する傾向があり、また複雑
なオリゴサッカリドは一般に有機溶剤に可溶でなく、水
性媒体中で反応させることが必要であるので、オリゴサ
ッカリドには単純な糖類の場合に使用されるような有機
溶剤の媒体中での選択結晶化は応用できない。本明細書
において定義される通り、オリゴサッカリドは分子当た
り３〜２０個のサッカリド単位を含有しているのが好ま
しい。
グリコシルアミンと過剰の無水クロロ酢酸（ｓｙｍ．無
水ジクロロ酢酸とも称される）との反応によって行うの
が好ましい。ブロモ−及びヨード−誘導体の場合は、そ
の酸のＮＨＳ−エステル、例えばＮ−（ヨードアセチル
オキシ）スクシンイミド（ＩＣＨ2 ＣＯＯＮＨＳ）を用
いることができる。かくして、少なくとも約５倍、例え
ば５〜１０倍モル過剰のＮ−アセチル化試薬が用いられ
る。無水クロロ酢酸をもちいると、驚くべきことに、β
−アノマー配置が従来法、例えば有意量のα−アノマー
生成物との混合物をもたらすダンシルクロリドに比較し
て約９８％残っている中間体がもたらされる。無水クロ
ロ酢酸はアミノ酸のＮ−アセチル化用の公知の試薬であ
り、またハロゲン脂肪酸のα−アミノ酸を製造するアミ
ノリシスも公知であるけれども〔ケロニス（Ｃｈｅｒｏ
ｎｉｓ）及びスピッツミューラー（Ｓｐｉｔｚｍｕｅｌ
ｌｅｒ）のＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、６１、
３４９−３７５（１９４１）〕、グリコシルアミンとの
その高いＮ−特異反応性及びＮ−結合オリゴサッカリド
の形成に際してのβ−配置の本明細書に記載されるよう
な保持性は予想外のものであった。かくして、変旋光の
傾向がある単純な糖類に関してしばしば必要とされるよ
うなα−アノマー配置のものとβ−アノマー配置のもの
との分離工程は不要である。オリゴサッカリドは結晶で
はなくガラス質のものを形成する傾向があり、また複雑
なオリゴサッカリドは一般に有機溶剤に可溶でなく、水
性媒体中で反応させることが必要であるので、オリゴサ
ッカリドには単純な糖類の場合に使用されるような有機
溶剤の媒体中での選択結晶化は応用できない。本明細書
において定義される通り、オリゴサッカリドは分子当た
り３〜２０個のサッカリド単位を含有しているのが好ま
しい。
【００１８】３工程より成る総合法において、オリゴサ
ッカリドの最初のグリコシル化はオリゴサッカリドを飽
和重炭酸アンモニウム中で約８〜８．５と言う中度のア
ルカリ性ｐＨ、好ましくはｐＨ約８．３においてインキ
ュベートすることによって行うのが好ましい。これらの
条件下でのグリコシル化でβ−アノマー配置のグリコシ
ルアミンがもたらされる。
ッカリドの最初のグリコシル化はオリゴサッカリドを飽
和重炭酸アンモニウム中で約８〜８．５と言う中度のア
ルカリ性ｐＨ、好ましくはｐＨ約８．３においてインキ
ュベートすることによって行うのが好ましい。これらの
条件下でのグリコシル化でβ−アノマー配置のグリコシ
ルアミンがもたらされる。
【００１９】上記のハロアセチル化反応に続いて、所望
とされるハロアセチル化グリコシルアミン中間体を用い
て前記の、そして式４に示されるＮ−グリシル−β−グ
リコシルアミン、即ちＮ−結合グリコ複合体を合成する
ことができる。例えば、オリゴサッカリドの蛍光性複合
体はこのＮ−グリシル−β−グリコシルアミン中間体と
蛍光団、例えばフルオレセイン誘導体又はローダミン誘
導体との反応によって製造することができる。発色団、
例えばｐ−ニトロフェニルアラニンと同様の反応を行っ
てオリゴサッカリドの発色団複合体を製造することがで
きる。オリゴサッカリドの脂質複合体はＮ−グリシル−
β−グリコシルアミン中間体と例えばＰ 3 Ｃ（トリパル
ミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）のようなリポペ
プチドキャリアー（チオホスゲンによる活性化を行った
後）との反応によって製造することができる。オリゴサ
ッカリドのペプチド複合体の１例はβ−グリコシルアミ
ンか又はＮ−グリシル−β−グリコシルアミン中間誘導
体の活性化されたカルボキシル基を有する適当なペプチ
ド、例えばアトリオペプチンに対するネオ糖ホルモンを
生成させる直接カップリング反応によって製造すること
ができる。また例示説明のためのものであるが、上記中
間体の蛋白質複合体は、例えばゲンチオビオース／ヒト
血清アルブミンのような蛋白質に対するネオ糖蛋白質を
生成させるカップリング反応によって合成することがで
きる。オリゴサッカリドと固体支持体との複合の例を挙
げると、プラスチック表面、例えばポリスチレン又は蛋
白質被覆プラスチックの表面のようなプラスチック組織
培養プレートに対するカップリング反応によるものがあ
る。
とされるハロアセチル化グリコシルアミン中間体を用い
て前記の、そして式４に示されるＮ−グリシル−β−グ
リコシルアミン、即ちＮ−結合グリコ複合体を合成する
ことができる。例えば、オリゴサッカリドの蛍光性複合
体はこのＮ−グリシル−β−グリコシルアミン中間体と
蛍光団、例えばフルオレセイン誘導体又はローダミン誘
導体との反応によって製造することができる。発色団、
例えばｐ−ニトロフェニルアラニンと同様の反応を行っ
てオリゴサッカリドの発色団複合体を製造することがで
きる。オリゴサッカリドの脂質複合体はＮ−グリシル−
β−グリコシルアミン中間体と例えばＰ 3 Ｃ（トリパル
ミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）のようなリポペ
プチドキャリアー（チオホスゲンによる活性化を行った
後）との反応によって製造することができる。オリゴサ
ッカリドのペプチド複合体の１例はβ−グリコシルアミ
ンか又はＮ−グリシル−β−グリコシルアミン中間誘導
体の活性化されたカルボキシル基を有する適当なペプチ
ド、例えばアトリオペプチンに対するネオ糖ホルモンを
生成させる直接カップリング反応によって製造すること
ができる。また例示説明のためのものであるが、上記中
間体の蛋白質複合体は、例えばゲンチオビオース／ヒト
血清アルブミンのような蛋白質に対するネオ糖蛋白質を
生成させるカップリング反応によって合成することがで
きる。オリゴサッカリドと固体支持体との複合の例を挙
げると、プラスチック表面、例えばポリスチレン又は蛋
白質被覆プラスチックの表面のようなプラスチック組織
培養プレートに対するカップリング反応によるものがあ
る。
【００２０】オリゴサッカリドの１−Ｎ−グリシル−β
−グリコシルアミン誘導体により１−Ｎ−グリシル−β
−グリコシルアミンが結合したグリコ複合体を形成する
ことができる特定の基質の例が本明細書に記載されるけ
れども、本発明はこれらの特定の基質の使用に限定され
ないことは分かるだろう。
−グリコシルアミン誘導体により１−Ｎ−グリシル−β
−グリコシルアミンが結合したグリコ複合体を形成する
ことができる特定の基質の例が本明細書に記載されるけ
れども、本発明はこれらの特定の基質の使用に限定され
ないことは分かるだろう。
【００２１】グリコ複合体の形成に先立ってグリコシル
アミンの中間ハロアセチル化誘導体を形成するのにハロ
アセチル供与性試薬を使用することは本発明にとって重
要なことである。トラッピング剤、例えば酸クロリド、
酸無水物及びＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ８８／０４３２
３号明細書に開示される他の活性アシル化合物の使用に
よるようなグリコシルアミンの直接誘導体化はグリコ複
合体をβ−アノマー体として高収率で製造する実用的な
方法ではないことが見い出されたのである。また、酸ク
ロリドは糖のヒドロキシ基と反応する。即ち、それはＮ
−特異性の誘導体化試薬ではなく、また無水酢酸はグリ
コシルアミンの合成上の有用性が少ない誘導体を形成す
るのである。
アミンの中間ハロアセチル化誘導体を形成するのにハロ
アセチル供与性試薬を使用することは本発明にとって重
要なことである。トラッピング剤、例えば酸クロリド、
酸無水物及びＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ８８／０４３２
３号明細書に開示される他の活性アシル化合物の使用に
よるようなグリコシルアミンの直接誘導体化はグリコ複
合体をβ−アノマー体として高収率で製造する実用的な
方法ではないことが見い出されたのである。また、酸ク
ロリドは糖のヒドロキシ基と反応する。即ち、それはＮ
−特異性の誘導体化試薬ではなく、また無水酢酸はグリ
コシルアミンの合成上の有用性が少ない誘導体を形成す
るのである。
【００２２】発明の詳しい説明 本明細書は本発明をなすとみなされる主題を特に指摘し
かつ明確に特許請求する請求の範囲を以て始まっている
が、本発明は添付図面と共に説明される次の好ましい態
様の詳しい説明から更によく理解できると考える。
かつ明確に特許請求する請求の範囲を以て始まっている
が、本発明は添付図面と共に説明される次の好ましい態
様の詳しい説明から更によく理解できると考える。
【００２３】本発明の方法において用いられるオリゴサ
ッカリドは、例えば
ッカリドは、例えば
【００２４】（１）精製された糖蛋白質及び糖ホルモ
ン； （２）全血清及びその画分； （３）例えば尿、乳、胎便、粘液、初乳及び同様の物質
等の生物の分泌物； （４）全器官、例えば腎臓、肝臓、心臓、脾臓、すい
臓、肺臓； （５）植物の幹及び葉の抽出物； （６）種子物質； （７）レクチン；及び （８）エムルシン
ン； （２）全血清及びその画分； （３）例えば尿、乳、胎便、粘液、初乳及び同様の物質
等の生物の分泌物； （４）全器官、例えば腎臓、肝臓、心臓、脾臓、すい
臓、肺臓； （５）植物の幹及び葉の抽出物； （６）種子物質； （７）レクチン；及び （８）エムルシン
【００２５】等の種々の植物及び動物の物質から単離又
は誘導することができることは分かるだろう。
は誘導することができることは分かるだろう。
【００２６】ヒドラジノリシス等の化学的手段による斯
かる植物及び動物物質からのオリゴサッカリドの放出に
ついては米国特許第４，７１９，２９４号及び同第４，
７３６，０２２号明細書、並びにタカサキ（Ｔａｋａｓ
ａｋｉ）等のＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、８３、２６
３−２６８（１９８２）に記載されている。
かる植物及び動物物質からのオリゴサッカリドの放出に
ついては米国特許第４，７１９，２９４号及び同第４，
７３６，０２２号明細書、並びにタカサキ（Ｔａｋａｓ
ａｋｉ）等のＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、８３、２６
３−２６８（１９８２）に記載されている。
【００２７】酵素的方法によるオリゴサッカリドの放出
はヒラニ（Ｈｉｒａｎｉ）等がＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１６２、４８５−４９２（１９８７）に記載する
Ｎ−グリカナーゼの使用によって例証されている。
はヒラニ（Ｈｉｒａｎｉ）等がＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１６２、４８５−４９２（１９８７）に記載する
Ｎ−グリカナーゼの使用によって例証されている。
【００２８】β−アノマー配置を保持する条件下でのオ
リゴサッカリドの合成Ｎ−結合グリコ複合体を形成する
誘導体化を以下において３工程より成る総合法で詳細に
説明する。
リゴサッカリドの合成Ｎ−結合グリコ複合体を形成する
誘導体化を以下において３工程より成る総合法で詳細に
説明する。
【００２９】工程１．グリコシルアミンの形成 本発明以前は、グリコシルアミンの合成に適当な一般的
な方法はなかった。
な方法はなかった。
【００３０】従来述べられた方法は次の通りである。
【００３１】１．グリコシルアジドを経由するグリコシ
ルアミンの製造法〔ガーグ（Ｇａｒｇ）及びジーンロッ
ツ（Ｊｅａｎｌｏｚ）のＡｄｖ．Ｃａｒｏｈｙｄ．Ｃｈ
ｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４３、１３５−１３
９（１９８５）；カウレー（Ｃｏｗｌｅｙ）等のＣａｒ
ｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１９、２３１−２４１（１９
７１）；及びナカバヤシ（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ）等
のＩｄｉｄ．、１７４、２７９−２８９（１９８
８）〕。
ルアミンの製造法〔ガーグ（Ｇａｒｇ）及びジーンロッ
ツ（Ｊｅａｎｌｏｚ）のＡｄｖ．Ｃａｒｏｈｙｄ．Ｃｈ
ｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４３、１３５−１３
９（１９８５）；カウレー（Ｃｏｗｌｅｙ）等のＣａｒ
ｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１９、２３１−２４１（１９
７１）；及びナカバヤシ（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ）等
のＩｄｉｄ．、１７４、２７９−２８９（１９８
８）〕。
【００３２】２．メタノール性アンモニアを使用するグ
リコシルアミンの製造法〔フラッシュ（Ｆｒｕｓｈ）及
びイスベル（Ｉｓｂｅｌｌ）のＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．、２３、１３０９（１９５８）；フラッシュ及びイ
スベルのＪ．Ｒｅｓ．Ｎａｔｌ．Ｂｕｒ．Ｓｔｄｓ．、
４７（４）、２３９−２４７（１９５１）〕。この方法
はより大きな構造のものには適用できない。大きな構造
のものはこの溶媒系に不溶性で、かつ還元性の末端Ｎ−
アセチルグルコサミン残基がＣ２において塩基触媒エピ
メリ化を受け易いため、又は１−３結合したコアのフコ
ースがβ−脱離を起こすためである。
リコシルアミンの製造法〔フラッシュ（Ｆｒｕｓｈ）及
びイスベル（Ｉｓｂｅｌｌ）のＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．、２３、１３０９（１９５８）；フラッシュ及びイ
スベルのＪ．Ｒｅｓ．Ｎａｔｌ．Ｂｕｒ．Ｓｔｄｓ．、
４７（４）、２３９−２４７（１９５１）〕。この方法
はより大きな構造のものには適用できない。大きな構造
のものはこの溶媒系に不溶性で、かつ還元性の末端Ｎ−
アセチルグルコサミン残基がＣ２において塩基触媒エピ
メリ化を受け易いため、又は１−３結合したコアのフコ
ースがβ−脱離を起こすためである。
【００３３】３．飽和重炭酸アンモニウムを使用するサ
ッカリドとアンモニアとの１工程縮合法〔リコーシェル
ストフ（Ｌｉｋｈｏｓｈｅｒｓｔｏｖ）等のＣａｒｂｏ
ｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１４６、Ｃ１−Ｃ５（１９８
６）〕。
ッカリドとアンモニアとの１工程縮合法〔リコーシェル
ストフ（Ｌｉｋｈｏｓｈｅｒｓｔｏｖ）等のＣａｒｂｏ
ｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１４６、Ｃ１−Ｃ５（１９８
６）〕。
【００３４】４．糖蛋白質をβ−アスパルチルグリコシ
ルアミンアミドヒドロラーゼと反応させる酵素的方法
（ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ８８／０４３２３号明細
書）。
ルアミンアミドヒドロラーゼと反応させる酵素的方法
（ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ８８／０４３２３号明細
書）。
【００３５】本発明では一般的な重炭酸アンモニウム法
の修正法を用いる。モノサッカリドとアンモニアとの縮
合によるグリコシルアミンの形成は上記のようにフラッ
シュ及びイスベルによって広く研究されている。その反
応は非環式アンモニウムイオン（シッフ付加物）を経由
して進行し、続いて再環化してグリコシルアミンを与え
ると考えられている。リコーシェルストフ等の方法では
イスベル及びフラッシュが使用したメタノール性アンモ
ニアではなく、重炭酸アンモニウムがアンモニア源とし
て使用される。この方法は、大きなオリゴサッカリドが
この水性系に可溶性であると言うのが有利な点である。
アンモニウム塩は２個のグリコシルアミン分子間でのア
ンモニアの分離によってビスグリコシルアミンの形成を
増加させることができるが、低濃度の糖はこの副反応を
最小限に抑える。
の修正法を用いる。モノサッカリドとアンモニアとの縮
合によるグリコシルアミンの形成は上記のようにフラッ
シュ及びイスベルによって広く研究されている。その反
応は非環式アンモニウムイオン（シッフ付加物）を経由
して進行し、続いて再環化してグリコシルアミンを与え
ると考えられている。リコーシェルストフ等の方法では
イスベル及びフラッシュが使用したメタノール性アンモ
ニアではなく、重炭酸アンモニウムがアンモニア源とし
て使用される。この方法は、大きなオリゴサッカリドが
この水性系に可溶性であると言うのが有利な点である。
アンモニウム塩は２個のグリコシルアミン分子間でのア
ンモニアの分離によってビスグリコシルアミンの形成を
増加させることができるが、低濃度の糖はこの副反応を
最小限に抑える。
【００３６】グリコシルアミンは急速な開環転移反応を
受けるが、これらの結果はｐＨに大きく左右される。ｐ
Ｈが８．０より大では、イスベル及びフラッシュがＪ．
Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２３、３０９（１９５８）に示す
ように、グリコシルアミンは容易に変旋光を起こし、β
−体に有利なように平衡を確立する（図１を参照された
い）。グリコシルアミンは中度に酸性のｐＨ（〜４．
５）において容易に加水分解される（図１を参照された
い）。これらの化学的性質の結果として、準備操作とそ
れに続く合成反応は一般的な酸で触媒される加水分解
（図１に示される反応順序の逆による）をバランスさ
せ、かつそのグリコシルアミンを反応性の求核試薬（即
ち、脱プロトン化された）として保持するように十分に
ｐＨ調製して行われなければならない。
受けるが、これらの結果はｐＨに大きく左右される。ｐ
Ｈが８．０より大では、イスベル及びフラッシュがＪ．
Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２３、３０９（１９５８）に示す
ように、グリコシルアミンは容易に変旋光を起こし、β
−体に有利なように平衡を確立する（図１を参照された
い）。グリコシルアミンは中度に酸性のｐＨ（〜４．
５）において容易に加水分解される（図１を参照された
い）。これらの化学的性質の結果として、準備操作とそ
れに続く合成反応は一般的な酸で触媒される加水分解
（図１に示される反応順序の逆による）をバランスさ
せ、かつそのグリコシルアミンを反応性の求核試薬（即
ち、脱プロトン化された）として保持するように十分に
ｐＨ調製して行われなければならない。
【００３７】グリコシルアミンの形成と得られる収率
は、従って、出発原料の糖の副反応を最小限に抑える中
度の塩基性条件の使用とグリコシルアミンの加水分解を
触媒する酸性条件を回避するかどうかに依存する。更
に、Ｃ２における塩基で触媒されるエピメリ化とβ−脱
離反応の生起の可能性は、反応が約８−８．５と言う中
度にアルカリ性のｐＨ、好ましくは約８．３のｐＨにお
いて起こるならば、最小限に抑えることが可能である。
は、従って、出発原料の糖の副反応を最小限に抑える中
度の塩基性条件の使用とグリコシルアミンの加水分解を
触媒する酸性条件を回避するかどうかに依存する。更
に、Ｃ２における塩基で触媒されるエピメリ化とβ−脱
離反応の生起の可能性は、反応が約８−８．５と言う中
度にアルカリ性のｐＨ、好ましくは約８．３のｐＨにお
いて起こるならば、最小限に抑えることが可能である。
【００３８】リコーシェルストフ等の一般的な重炭酸ア
ンモニウム法の概要は次の反応説明式で示される：
ンモニウム法の概要は次の反応説明式で示される：
【００３９】
【式１】
【００４０】その著者等は、この方法が単純なモノサッ
カリド及びジサッカリドのグリコシルアミンを収率６０
％で生成させるときに効果的であると断言している。し
かし、本発明者はその著者等の収率を公開された方法を
用いて再現することはできなかった。次のことが観察さ
れた。
カリド及びジサッカリドのグリコシルアミンを収率６０
％で生成させるときに効果的であると断言している。し
かし、本発明者はその著者等の収率を公開された方法を
用いて再現することはできなかった。次のことが観察さ
れた。
【００４１】１）反応混合物の酸性化は、中度に酸性の
ｐＨでグリコシルアミンの加水分解は最も速いので（図
１を参照されたい）、非常に注意深くコントロールしな
ければならない。この工程は小さいオリゴサッカリド
（分析規模）に関してはコントロールが困難である。
ｐＨでグリコシルアミンの加水分解は最も速いので（図
１を参照されたい）、非常に注意深くコントロールしな
ければならない。この工程は小さいオリゴサッカリド
（分析規模）に関してはコントロールが困難である。
【００４２】２）使用されるイオン交換樹脂・アンバー
リストはメタノール性アンノニア溶離剤中では不安定で
ある。多回数の洗浄にもかかわらず、樹脂は可溶化さ
れ、変色した物として見えた。アンバーリスト樹脂の性
質を更に調べると（以下の実験を参照されたい）、樹脂
は公表されている条件下ではグリコシルアミンを定量的
に溶離することは可能でないことも示された。もう１種
の樹脂ＡＧ５０ｘ１２（Ｈ+ ）を試験したが、それはグ
リコシルアミンを酸性のｐＨにおいて強く結合した。Ｎ
−アセチルグルコサミンの単純なグリコシルアミンはこ
の樹脂のカラムから定量的に溶離することができなかっ
た。
リストはメタノール性アンノニア溶離剤中では不安定で
ある。多回数の洗浄にもかかわらず、樹脂は可溶化さ
れ、変色した物として見えた。アンバーリスト樹脂の性
質を更に調べると（以下の実験を参照されたい）、樹脂
は公表されている条件下ではグリコシルアミンを定量的
に溶離することは可能でないことも示された。もう１種
の樹脂ＡＧ５０ｘ１２（Ｈ+ ）を試験したが、それはグ
リコシルアミンを酸性のｐＨにおいて強く結合した。Ｎ
−アセチルグルコサミンの単純なグリコシルアミンはこ
の樹脂のカラムから定量的に溶離することができなかっ
た。
【００４３】実 験 飽和重炭酸アンモニウムの酸性化はリコシェルストフ等
の方法で行った。加水分解は軽い酸性のｐＨで最も速い
ので（上記）、これを注意深くコントロールした。
の方法で行った。加水分解は軽い酸性のｐＨで最も速い
ので（上記）、これを注意深くコントロールした。
【００４４】溶離実験のために、 3Ｈ−ＧｌｃＮＡｃを
含有する飽和重炭酸アンモニウム２００μＬ（５６０μ
ｅｑ）を３０℃において４日間インキュベートし、次い
でアンバーリスト樹脂４００μＬ（６００μｅｑ）のカ
ラムに適用した。アンバーリスト樹脂は１０カラム容量
の１Ｍ ＨＣｌ、１０カラム容量の０．５Ｍ ＭｅＯＨ
／ＮＨ3 、次いで２０カラム容量の水で前以て十分に洗
浄したものであった。非結合糖（遊離のＮ−アセチルグ
ルコサミン）を１０カラム容量の水で溶離し、蒸発乾固
し、計測した。結合グルコシルアミンは表１に示す種々
の濃度のアンモニア／メタノールを用いて溶離した。溶
離剤を乾燥し、計測した。
含有する飽和重炭酸アンモニウム２００μＬ（５６０μ
ｅｑ）を３０℃において４日間インキュベートし、次い
でアンバーリスト樹脂４００μＬ（６００μｅｑ）のカ
ラムに適用した。アンバーリスト樹脂は１０カラム容量
の１Ｍ ＨＣｌ、１０カラム容量の０．５Ｍ ＭｅＯＨ
／ＮＨ3 、次いで２０カラム容量の水で前以て十分に洗
浄したものであった。非結合糖（遊離のＮ−アセチルグ
ルコサミン）を１０カラム容量の水で溶離し、蒸発乾固
し、計測した。結合グルコシルアミンは表１に示す種々
の濃度のアンモニア／メタノールを用いて溶離した。溶
離剤を乾燥し、計測した。
【００４５】表１には樹脂からこれらの溶離剤を用いて
溶離した結合モノサッカリドの量が示される。これらの
データからアミンの大部分は樹脂に強く結合したままで
あることは明らかである。この相互作用の本性は未知で
ある。
溶離した結合モノサッカリドの量が示される。これらの
データからアミンの大部分は樹脂に強く結合したままで
あることは明らかである。この相互作用の本性は未知で
ある。
【００４６】
【表１】
【００４７】これらの問題が本発明者をしてオリゴサッ
カリドのグルコシルアミンに一般的に適用可能な他の単
離法（分析法と準備法の両方）の開発を思い付かせた。
カリドのグルコシルアミンに一般的に適用可能な他の単
離法（分析法と準備法の両方）の開発を思い付かせた。
【００４８】グルコシルアミンの合成の際のアンモニア
の除去 混合物からの重炭酸アンモニウムの完全な除去が主要問
題である。上記の結果から、イオン交換樹脂からのグル
コシルアミンの定量的回収が可能であるとは考えられな
い。より大きなグルコシルアミンの脱塩は水で溶離され
るゲル濾過グロマトグラフィ−を用いることによって簡
単に達成することができるが、これに結び付いて次のよ
うな問題が一般に生ずる：
の除去 混合物からの重炭酸アンモニウムの完全な除去が主要問
題である。上記の結果から、イオン交換樹脂からのグル
コシルアミンの定量的回収が可能であるとは考えられな
い。より大きなグルコシルアミンの脱塩は水で溶離され
るゲル濾過グロマトグラフィ−を用いることによって簡
単に達成することができるが、これに結び付いて次のよ
うな問題が一般に生ずる：
【００４９】１）グルコシルアミンの水中での加水分
解； ２）オリゴサッカリドはカラムマトリックスと相互作用
し、回収が非定量的となる。
解； ２）オリゴサッカリドはカラムマトリックスと相互作用
し、回収が非定量的となる。
【００５０】本発明者はメタノールを約９０容量％まで
添加することによってグルコシルアミンの加水分解なし
にアンモニウム塩の有意量を除去することができること
を見い出した。これは塩の溶解度を２２０ｍｇ／ｍＬ
（２０℃）から約０．０１ｍｇ／ｍＬまで減少させる。
沈澱した塩を濾別、洗浄することによって表面結合糖を
全て回収することが可能である。残っている塩は凍結乾
燥によって除去することができる。実際、小さいオリゴ
サッカリドは反応混合物から直接凍結乾燥できることが
見い出された。
添加することによってグルコシルアミンの加水分解なし
にアンモニウム塩の有意量を除去することができること
を見い出した。これは塩の溶解度を２２０ｍｇ／ｍＬ
（２０℃）から約０．０１ｍｇ／ｍＬまで減少させる。
沈澱した塩を濾別、洗浄することによって表面結合糖を
全て回収することが可能である。残っている塩は凍結乾
燥によって除去することができる。実際、小さいオリゴ
サッカリドは反応混合物から直接凍結乾燥できることが
見い出された。
【００５１】実施例１ 飽和重炭酸アンモニウム中オリゴサッカリドの試料（典
型的には、５０〜１００μＬ）を１ｍＬになるまで希釈
し、ドライアイスでシェル凍結（ｓｈｅｌｌｆｒｅｅｚ
ｅ）した。これらを次に１０3 バールのチャンバー内圧
力で凍結乾燥した。図２は重炭酸アンモニウムの除去率
と時間の関係を示す。実際は、重炭酸アンモニウムの除
去は水の添加と凍結乾燥との６時間の反復サイクルで加
速することができる（データは示さず）。凍結乾燥の終
点で、試料を乾燥剤の存在下、−２０℃において貯蔵し
た。これらの条件下で試料は少なくとも１カ月にわたっ
て安定であることが見い出された。以下に記載する 1Ｈ
−ＮＭＲスペクトロスコピーで測定したそれらの生成速
度を図３に示す。グルコサミンはα／βアノマー比が〜
１：２４のピラノース体となっていることに留意された
い。
型的には、５０〜１００μＬ）を１ｍＬになるまで希釈
し、ドライアイスでシェル凍結（ｓｈｅｌｌｆｒｅｅｚ
ｅ）した。これらを次に１０3 バールのチャンバー内圧
力で凍結乾燥した。図２は重炭酸アンモニウムの除去率
と時間の関係を示す。実際は、重炭酸アンモニウムの除
去は水の添加と凍結乾燥との６時間の反復サイクルで加
速することができる（データは示さず）。凍結乾燥の終
点で、試料を乾燥剤の存在下、−２０℃において貯蔵し
た。これらの条件下で試料は少なくとも１カ月にわたっ
て安定であることが見い出された。以下に記載する 1Ｈ
−ＮＭＲスペクトロスコピーで測定したそれらの生成速
度を図３に示す。グルコサミンはα／βアノマー比が〜
１：２４のピラノース体となっていることに留意された
い。
【００５２】グルコシルアミンの 1Ｈ−ＮＭＲスペクト
ル 還元性の糖からのグルコシルアミンの形成は 1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトロスコピーで追跡することができる。糖とア
ンモニアとの縮合は遊離糖のアノマー性プロトンのコラ
プスと立体配置上の理由（ 4Ｃ1 配置）から更に安定な
アノマーであるグルコシルアミンのβ−アノマーに関係
する主共鳴の出現で示される。Ｎ−アセチルグルコサミ
ンについては、遊離糖のアノマー性プロトンはそれぞれ
５．１９ｐｐｍ（α）と４．７０ｐｐｍ（β）において
共鳴し、〜３．５Ｈｚと〜８Ｈｚと言う関係Ｊ1,2 値を
持つことが見い出された。このグルコシルアミンは４．
１５ｐｐｍに主共鳴を有し、そしてＪ1,2 値は〜８Ｈｚ
からである。これはβ−アノマーであると同定すること
ができる。他の少量成分も同定可能で、その１つはα−
アノマー（４．３９ｐｐｍ、Ｊ1,2 〜４．７Ｈｚ）（α
／β比１：２４）である。
ル 還元性の糖からのグルコシルアミンの形成は 1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトロスコピーで追跡することができる。糖とア
ンモニアとの縮合は遊離糖のアノマー性プロトンのコラ
プスと立体配置上の理由（ 4Ｃ1 配置）から更に安定な
アノマーであるグルコシルアミンのβ−アノマーに関係
する主共鳴の出現で示される。Ｎ−アセチルグルコサミ
ンについては、遊離糖のアノマー性プロトンはそれぞれ
５．１９ｐｐｍ（α）と４．７０ｐｐｍ（β）において
共鳴し、〜３．５Ｈｚと〜８Ｈｚと言う関係Ｊ1,2 値を
持つことが見い出された。このグルコシルアミンは４．
１５ｐｐｍに主共鳴を有し、そしてＪ1,2 値は〜８Ｈｚ
からである。これはβ−アノマーであると同定すること
ができる。他の少量成分も同定可能で、その１つはα−
アノマー（４．３９ｐｐｍ、Ｊ1,2 〜４．７Ｈｚ）（α
／β比１：２４）である。
【００５３】実 験 ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ及び
Ｇａ１β１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６
〔Ｇａ１β１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→
３〕Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ
の試料を重炭酸アンモニウムを用いて誘導体化し、２４
時間の時点で試料を抜き出し、凍結乾燥した。これらの
試料を次に交換してＤ2 Ｏ（９９．９６原子）となし、
ＩＤ−スペクトルを得た。アノマー性領域の積分を取
り、メチル領域と比較することによって各々の種の百分
率を得た。得られた結果を図３に示す。これらのデータ
は、糖とアンモニアとの縮合は室温で３〜４日後に完結
することを示唆している。
Ｇａ１β１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６
〔Ｇａ１β１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→
３〕Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ
の試料を重炭酸アンモニウムを用いて誘導体化し、２４
時間の時点で試料を抜き出し、凍結乾燥した。これらの
試料を次に交換してＤ2 Ｏ（９９．９６原子）となし、
ＩＤ−スペクトルを得た。アノマー性領域の積分を取
り、メチル領域と比較することによって各々の種の百分
率を得た。得られた結果を図３に示す。これらのデータ
は、糖とアンモニアとの縮合は室温で３〜４日後に完結
することを示唆している。
【００５４】工程２ グルコシルアミンのハロアセチル
化 ハロアセチル化はグルコシルアミンを、例えば無水クロ
ロ酢酸と次の反応式で説明されるように反応させること
によって実施した：
化 ハロアセチル化はグルコシルアミンを、例えば無水クロ
ロ酢酸と次の反応式で説明されるように反応させること
によって実施した：
【化８】
【００５５】ブロモ−及びヨード−誘導体の場合は、Ｉ
ＣＨ2 ＣＯＯＮＨＳを使用する次の反応式で説明される
ようにその酸のＮＨＳ−エステルを用いることができ
る：
ＣＨ2 ＣＯＯＮＨＳを使用する次の反応式で説明される
ようにその酸のＮＨＳ−エステルを用いることができ
る：
【化９】
【００５６】実施例２ 重炭酸アンモニウムとの縮合によって14Ｃ−ラクトシル
アミン（０．３２ｍＣｉ／ミリモル）を製造した。前記
工程１に記載したようにしてアンモニウム塩の除去を行
った後、試料を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 に再懸濁させ、
そして５倍モル過剰のｓｙｍ．無水ジクロロ酢酸〔フル
カ バイオケミカルズ社（ＦｌｕｋａＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）〕の添加によりクロロアセチル化した。室温
で２時間インキュベートした後、第二の量の塩基と無水
物を加えた。更に６時間後、その混合物をＡＧ５０−Ｘ
１２（Ｈ+ ）イオン交換樹脂とＡＧ３−Ｘ４Ａ（Ｏ
Ｈ-）イオン交換樹脂との混合床を覆って通過させた。
溶離剤を集め、蒸発乾固した。反応混合物の分離はイオ
ン−抑制アミン吸収ＨＰＬＣを用い、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１３４、４４２（１９８４）のメリス（Ｍ
ｅｌｌｉｓ）及びベンジンガー（Ｂａｅｎｚｉｎｇｅ
ｒ）の方法に従って行った。反応生成物をトリエチルア
ミンアセテート（ＴＥＡ）緩衝剤５０ｍＭを含有するｐ
Ｈ５．５のＭｅＣＮ９０％／水１０％に再懸濁させ、そ
して同じ緩衝剤中で平衡させたバリアンミクロパック
（Ｖａｒｉａｎ Ｍｉｃｒｏｐａｋ）ＡＸ５カラムの上
に注加した。溶離は平衡条件に５分間保持した後、それ
に続いて２％／分のＴＥＡ緩衝剤勾配を用いて行った。
バートホールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）ＬＢ５０３ ＨＰ
ＬＣ放射性モニターを用いると、放射性生成物が検出さ
れた。典型的なプロフィールを図４に示す。放射性画分
をプールし、乾燥した。
アミン（０．３２ｍＣｉ／ミリモル）を製造した。前記
工程１に記載したようにしてアンモニウム塩の除去を行
った後、試料を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 に再懸濁させ、
そして５倍モル過剰のｓｙｍ．無水ジクロロ酢酸〔フル
カ バイオケミカルズ社（ＦｌｕｋａＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）〕の添加によりクロロアセチル化した。室温
で２時間インキュベートした後、第二の量の塩基と無水
物を加えた。更に６時間後、その混合物をＡＧ５０−Ｘ
１２（Ｈ+ ）イオン交換樹脂とＡＧ３−Ｘ４Ａ（Ｏ
Ｈ-）イオン交換樹脂との混合床を覆って通過させた。
溶離剤を集め、蒸発乾固した。反応混合物の分離はイオ
ン−抑制アミン吸収ＨＰＬＣを用い、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．、１３４、４４２（１９８４）のメリス（Ｍ
ｅｌｌｉｓ）及びベンジンガー（Ｂａｅｎｚｉｎｇｅ
ｒ）の方法に従って行った。反応生成物をトリエチルア
ミンアセテート（ＴＥＡ）緩衝剤５０ｍＭを含有するｐ
Ｈ５．５のＭｅＣＮ９０％／水１０％に再懸濁させ、そ
して同じ緩衝剤中で平衡させたバリアンミクロパック
（Ｖａｒｉａｎ Ｍｉｃｒｏｐａｋ）ＡＸ５カラムの上
に注加した。溶離は平衡条件に５分間保持した後、それ
に続いて２％／分のＴＥＡ緩衝剤勾配を用いて行った。
バートホールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）ＬＢ５０３ ＨＰ
ＬＣ放射性モニターを用いると、放射性生成物が検出さ
れた。典型的なプロフィールを図４に示す。放射性画分
をプールし、乾燥した。
【００５７】１−アミノ−クロロアセチル−グルコシル
アミンのＮＭＲ分析による以下に記載する通りの特性化
は、グリコシルアミンはハロアセチル化後も依然として
主としてβ−アノマー配置で、α／β比は１：２４であ
ることを示した。これは、以下に示されるように、変旋
光をもたらす、例えばダンシルクロリドによるグリコシ
ルアミンの直接誘導体化とは対照的な点である。
アミンのＮＭＲ分析による以下に記載する通りの特性化
は、グリコシルアミンはハロアセチル化後も依然として
主としてβ−アノマー配置で、α／β比は１：２４であ
ることを示した。これは、以下に示されるように、変旋
光をもたらす、例えばダンシルクロリドによるグリコシ
ルアミンの直接誘導体化とは対照的な点である。
【００５８】１−アミノ−Ｎ−アセチルグルコサミンの
Ｎ−クロロアセチル−及びＮ−アセチル−グリシル−誘
導体の 1Ｈ−ＮＭＲ分析 １−アミノ−Ｎ−アセチルグルコサミンの試料をＮ−ク
ロロアセチル化した。インキュベーション期間の終点
で、その混合物をＡＧ５０−Ｘ１２イオン交換樹脂とＡ
Ｇ３−Ｘ４Ａイオン交換樹脂との混合床を覆って通し
た。溶離剤を次に減圧下で蒸発乾固し、そして凍結乾燥
した。次いで、それを２回交換してＤ２０となし、１−
Ｄ 1Ｈ−ＮＭＲ分析に付した。得られたスペクトルは
アノマー領域に４種の異なるサッカリド成分が存在する
ことを示した。これらは遊離の糖及びＮ−クロロアセチ
ル誘導体のα−体及びβ−体である。これら４種の種の
積分を調べると、クロロアセチル誘導体形成の総収率は
〜７５％であり、そして２４：１の比率でβ−アノマー
が優位であった。
Ｎ−クロロアセチル−及びＮ−アセチル−グリシル−誘
導体の 1Ｈ−ＮＭＲ分析 １−アミノ−Ｎ−アセチルグルコサミンの試料をＮ−ク
ロロアセチル化した。インキュベーション期間の終点
で、その混合物をＡＧ５０−Ｘ１２イオン交換樹脂とＡ
Ｇ３−Ｘ４Ａイオン交換樹脂との混合床を覆って通し
た。溶離剤を次に減圧下で蒸発乾固し、そして凍結乾燥
した。次いで、それを２回交換してＤ２０となし、１−
Ｄ 1Ｈ−ＮＭＲ分析に付した。得られたスペクトルは
アノマー領域に４種の異なるサッカリド成分が存在する
ことを示した。これらは遊離の糖及びＮ−クロロアセチ
ル誘導体のα−体及びβ−体である。これら４種の種の
積分を調べると、クロロアセチル誘導体形成の総収率は
〜７５％であり、そして２４：１の比率でβ−アノマー
が優位であった。
【００５９】この混合物を次に５０℃におけるアミノリ
シスに付し、ＡＧ５０×１２−結合検定法を用いて反応
の時間推移を追跡した。そのグリシル−誘導体を次にＣ
Ｍ−セファロース ファースト フロー（ＣＭ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）の短いカラムで精
製し、始め水で、次に０．５Ｍ炭酸アンモニウムで溶離
した。次に、塩で溶離された物質をプールし、その塩を
蒸発により除去した。混合物を次に無水酢酸を用い、飽
和重炭酸ナトリウム中でＮ−アセチル化し、そしてＡＧ
５０樹脂／ＡＧ３樹脂を用いて脱塩した。生成物をＮＭ
Ｒ分析のために２つに分離した。一方の半分を乾燥し、
ＤＭＳＯ−ｄ５〔アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）〕
に再溶解し、他方を交換してＤ２０となし、上記のよう
に分析した。
シスに付し、ＡＧ５０×１２−結合検定法を用いて反応
の時間推移を追跡した。そのグリシル−誘導体を次にＣ
Ｍ−セファロース ファースト フロー（ＣＭ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）の短いカラムで精
製し、始め水で、次に０．５Ｍ炭酸アンモニウムで溶離
した。次に、塩で溶離された物質をプールし、その塩を
蒸発により除去した。混合物を次に無水酢酸を用い、飽
和重炭酸ナトリウム中でＮ−アセチル化し、そしてＡＧ
５０樹脂／ＡＧ３樹脂を用いて脱塩した。生成物をＮＭ
Ｒ分析のために２つに分離した。一方の半分を乾燥し、
ＤＭＳＯ−ｄ５〔アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）〕
に再溶解し、他方を交換してＤ２０となし、上記のよう
に分析した。
【００６０】ＤＭＳＯ中で得られたスペクトルの１部分
は通常はＤ２０中で交換されるダウンフィールド（ｄｏ
ｗｎｆｉｅｌｄ）ＮＨプロトンを示した。７．８４ｐｐ
ｍ及び７．８８ｐｐｍの２つの２重項は４．５５ｐｐｍ
（Ｈ１の３重項共鳴）での照射によりスピンの脱カップ
リングがおこることに基づくＮＨ１とＮＨ２のそれぞれ
の２重項と定めることができる。第三の共鳴、即ち８．
０９ｐｐｍにおける３重項は "グリシン" アセトアミド
基のＮＨに帰せられるものであった。この共鳴の照射は
グリシンスペースの２つのメチレンプロトンに帰せられ
る３．４０ｐｐｍと３．６０ｐｐｍとの間の共鳴を騒乱
させる。最後に、１．７０ｐｐｍと１．８０ｐｐｍに２
つの十分に分割されたメチルの共鳴が存在する。
は通常はＤ２０中で交換されるダウンフィールド（ｄｏ
ｗｎｆｉｅｌｄ）ＮＨプロトンを示した。７．８４ｐｐ
ｍ及び７．８８ｐｐｍの２つの２重項は４．５５ｐｐｍ
（Ｈ１の３重項共鳴）での照射によりスピンの脱カップ
リングがおこることに基づくＮＨ１とＮＨ２のそれぞれ
の２重項と定めることができる。第三の共鳴、即ち８．
０９ｐｐｍにおける３重項は "グリシン" アセトアミド
基のＮＨに帰せられるものであった。この共鳴の照射は
グリシンスペースの２つのメチレンプロトンに帰せられ
る３．４０ｐｐｍと３．６０ｐｐｍとの間の共鳴を騒乱
させる。最後に、１．７０ｐｐｍと１．８０ｐｐｍに２
つの十分に分割されたメチルの共鳴が存在する。
【００６１】グリコシルアミン（ダンシル誘導体及びフ
ルオレセイン誘導体）の反応性 １−アミノ−２−アセトアミド−１，２−ジデオキシ−
Ｄ−グルコピラノシル−アミンとジメチルアミノナフタ
レンスルホニルクロリド（ダンシルクロリド）との反応
をグレー（Ｇｒａｙ）がＭｅｔｈ．Ｅｎｚ．、ＸＸＶ、
１２１（１９７１）に記載する方法の修正法で行った。
即ち、上記アミン１０μモルを２００μＬの０．５Ｍ
ＮａＨＣＯ3 に溶解させた。次に、撹拌しながらダンシ
ルクロリド２４．５ｍｇを含有するエタノール２００μ
Ｌを添加し、反応を室温で２時間進行させた。若干の沈
澱した重炭酸ナトリウムを含有する褐色の溶液が得られ
た。水１００μＬを添加して沈澱を溶解させた後、生成
物をＵＶ（２５８ｎｍ）及びフルオレセイン検出（ｅｘ
ｉｔ．：３３６ｎｍ−ｅｍｉｓｓ．：５３６ｎｍ）を用
い、スフェリソーブ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ）Ｓ５０Ｄ
Ｓ２ ＳＰカラム（８．０×３００ｍｍ）による逆相ク
ロマトグラフィ−を用いて分離した。カラムの画分を集
め、５０μＬアリクオートを計測した。放射性を有する
プールされた画分を次に蒸発乾固し、水１ｍＬに再懸濁
させ、計測して収率を求めた。この方法で得られた典型
的な収率は出発糖基準で１０〜１５％である。
ルオレセイン誘導体）の反応性 １−アミノ−２−アセトアミド−１，２−ジデオキシ−
Ｄ−グルコピラノシル−アミンとジメチルアミノナフタ
レンスルホニルクロリド（ダンシルクロリド）との反応
をグレー（Ｇｒａｙ）がＭｅｔｈ．Ｅｎｚ．、ＸＸＶ、
１２１（１９７１）に記載する方法の修正法で行った。
即ち、上記アミン１０μモルを２００μＬの０．５Ｍ
ＮａＨＣＯ3 に溶解させた。次に、撹拌しながらダンシ
ルクロリド２４．５ｍｇを含有するエタノール２００μ
Ｌを添加し、反応を室温で２時間進行させた。若干の沈
澱した重炭酸ナトリウムを含有する褐色の溶液が得られ
た。水１００μＬを添加して沈澱を溶解させた後、生成
物をＵＶ（２５８ｎｍ）及びフルオレセイン検出（ｅｘ
ｉｔ．：３３６ｎｍ−ｅｍｉｓｓ．：５３６ｎｍ）を用
い、スフェリソーブ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ）Ｓ５０Ｄ
Ｓ２ ＳＰカラム（８．０×３００ｍｍ）による逆相ク
ロマトグラフィ−を用いて分離した。カラムの画分を集
め、５０μＬアリクオートを計測した。放射性を有する
プールされた画分を次に蒸発乾固し、水１ｍＬに再懸濁
させ、計測して収率を求めた。この方法で得られた典型
的な収率は出発糖基準で１０〜１５％である。
【００６２】この方法で得られたダンシル−アミノ糖を
凍結乾燥し、次いでＤ2 Ｏ（９９．９６原子）えと２回
交換することによってＮＭＲ分析用に調製し、最後に同
じ溶剤に再溶解した。１−Ｄ及び２−Ｄ分析を５００Ｈ
ｚのブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）分光計を用いて行っ
た。この誘導体の１Ｄスペクトルは特徴的なダウンフィ
ールドの芳香族共鳴、及び十分に分割されたアノマー性
骨格領域とアセトアミドメチル領域を示した。この誘導
体は未反応グルコシルアミンに観察された１：２４比と
比較して（上記を参照されたい）それぞれ１：４のα体
とβ体との比を示した。この観察結果については少なく
とも２つの説明が可能である。第一は、ダンシル誘導体
は開環体を経由して変旋光を受けることができると言う
説明であり、第二は、α−体はダンシルクロリドとβ−
体より速く反応し、そして誘導体を一旦形成するとそれ
は特定のアノマーとして固定されると言う説明である。
温度及びｐＨ依存性に関する研究は後者の解釈の方を支
持している（データは示さず）。
凍結乾燥し、次いでＤ2 Ｏ（９９．９６原子）えと２回
交換することによってＮＭＲ分析用に調製し、最後に同
じ溶剤に再溶解した。１−Ｄ及び２−Ｄ分析を５００Ｈ
ｚのブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）分光計を用いて行っ
た。この誘導体の１Ｄスペクトルは特徴的なダウンフィ
ールドの芳香族共鳴、及び十分に分割されたアノマー性
骨格領域とアセトアミドメチル領域を示した。この誘導
体は未反応グルコシルアミンに観察された１：２４比と
比較して（上記を参照されたい）それぞれ１：４のα体
とβ体との比を示した。この観察結果については少なく
とも２つの説明が可能である。第一は、ダンシル誘導体
は開環体を経由して変旋光を受けることができると言う
説明であり、第二は、α−体はダンシルクロリドとβ−
体より速く反応し、そして誘導体を一旦形成するとそれ
は特定のアノマーとして固定されると言う説明である。
温度及びｐＨ依存性に関する研究は後者の解釈の方を支
持している（データは示さず）。
【００６３】ダンシルクロリドについて得られた概ね貧
弱な収率はグルコシルアミンの反応に特有のものである
ことが見い出された。例えば、同様の収率がイソシアネ
ートとフルオレセインのＮＨＳ−エステルによっても得
られた。ダンシルクロリドのような酸クロリドはこれら
の極めて反応性の種によるＯ−アシル化の可能性が存在
すると言う困難を更に与える。確かに、このことは、種
々のグルコシルアミンによるダンシル化の動力学を調べ
たとき正にその通りであることが見い出された（データ
は示さず）。Ｏ−ダンシル誘導体の形成は酸クロリドが
消費されるだろう更に他のルートを示すものである。
弱な収率はグルコシルアミンの反応に特有のものである
ことが見い出された。例えば、同様の収率がイソシアネ
ートとフルオレセインのＮＨＳ−エステルによっても得
られた。ダンシルクロリドのような酸クロリドはこれら
の極めて反応性の種によるＯ−アシル化の可能性が存在
すると言う困難を更に与える。確かに、このことは、種
々のグルコシルアミンによるダンシル化の動力学を調べ
たとき正にその通りであることが見い出された（データ
は示さず）。Ｏ−ダンシル誘導体の形成は酸クロリドが
消費されるだろう更に他のルートを示すものである。
【００６４】結論は、従って、グルコシルアミンの直接
誘導体化は生成物のα／β混合物をもたらし、得られる
収率は一貫して低い、と言うことであった。
誘導体化は生成物のα／β混合物をもたらし、得られる
収率は一貫して低い、と言うことであった。
【００６５】工程３．Ｎ−グリシル−β−グルコシルア
ミンの合成 ハロアセチル化グルコシルアミン誘導体は多数の合成法
に用いることができる。例えば、ハロ基は、例えばクロ
ロ酢酸を用いるグリシンの合成において第一アミンで置
換することができ、或いはヨード誘導体は、前記の反応
式で示されるように、これをチオールに結合させること
によってチオエーテルを形成することができる。
ミンの合成 ハロアセチル化グルコシルアミン誘導体は多数の合成法
に用いることができる。例えば、ハロ基は、例えばクロ
ロ酢酸を用いるグリシンの合成において第一アミンで置
換することができ、或いはヨード誘導体は、前記の反応
式で示されるように、これをチオールに結合させること
によってチオエーテルを形成することができる。
【００６６】実施例３ ハロアセテート誘導体のアミノリシスを密封管（アンモ
ニアの蒸発による損失を防ぐため）に入っている飽和炭
酸アンモニウム中での室温におけるインキュベーション
により行った。生成物を前記と同じＨＰＬＣ法を用いて
分析した。この反応において、１８．８分で溶離して来
るクロロ酢酸誘導体は〜２４分で溶離して来る、ニンヒ
ドリン感受性の生成物にゆっくり転化された（図５を参
照されたい）。反応は室温において９６時間後に本質的
に完結した（図５を参照されたい）。第二のアミノリシ
ス反応を５０℃において行うと、一夜のインキュベーシ
ョン後に完結することが見い出された（図６を参照され
たい）。第二高級アミンの形成を最小限に抑えるために
は、クロロアセチル基より過剰のアンモニアが必要であ
ることが見い出された。
ニアの蒸発による損失を防ぐため）に入っている飽和炭
酸アンモニウム中での室温におけるインキュベーション
により行った。生成物を前記と同じＨＰＬＣ法を用いて
分析した。この反応において、１８．８分で溶離して来
るクロロ酢酸誘導体は〜２４分で溶離して来る、ニンヒ
ドリン感受性の生成物にゆっくり転化された（図５を参
照されたい）。反応は室温において９６時間後に本質的
に完結した（図５を参照されたい）。第二のアミノリシ
ス反応を５０℃において行うと、一夜のインキュベーシ
ョン後に完結することが見い出された（図６を参照され
たい）。第二高級アミンの形成を最小限に抑えるために
は、クロロアセチル基より過剰のアンモニアが必要であ
ることが見い出された。
【００６７】Ｎ−グリシル−β−グリコシルアミンの誘
導体の合成 １）ダンシル誘導体 アミノリシス生成物（上記工程３）を精製し、グレーが
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、ＸＸＶ、１２１（１９７
１）に記載する方法に従ってダンシル化した。収率はラ
クトシルアミンの直接ダンシル化で得られた収率に匹敵
するものであった（中間体のＮ−ハロアセチル化グリコ
シルアミンの形成はない）。これは２つの反応混合物を
ジアミノブタン０．０５％を含有する７：１のＭｅＣＮ
／水を用いてシリカ（Ｓｉｌｉｃａ）６０ ＴＬＣで実
験した。ダンシル化生成物をＵＶ光（３６６ｎｍ）の下
で同定し、これら生成物及び元の反応体（遊離のラクト
ース／Ｎ−グリシル−ラクトシルアミン）を溶離し、計
測した。得られた結果を下記表２に示す。
導体の合成 １）ダンシル誘導体 アミノリシス生成物（上記工程３）を精製し、グレーが
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、ＸＸＶ、１２１（１９７
１）に記載する方法に従ってダンシル化した。収率はラ
クトシルアミンの直接ダンシル化で得られた収率に匹敵
するものであった（中間体のＮ−ハロアセチル化グリコ
シルアミンの形成はない）。これは２つの反応混合物を
ジアミノブタン０．０５％を含有する７：１のＭｅＣＮ
／水を用いてシリカ（Ｓｉｌｉｃａ）６０ ＴＬＣで実
験した。ダンシル化生成物をＵＶ光（３６６ｎｍ）の下
で同定し、これら生成物及び元の反応体（遊離のラクト
ース／Ｎ−グリシル−ラクトシルアミン）を溶離し、計
測した。得られた結果を下記表２に示す。
【００６８】
【表２】 表 ２ 生成物 全％ ダンシル−Ｎ−グリシル−ラクトシルアミン ６９．５ Ｎ−グリシル−ラクトシルアミン ３０．５ Ｎ−ダンシル−ラクトシルアミン １０．１ 遊離ラクトース ８９．９
【００６９】２）フルオレセイン誘導体 Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−グリシル−β−グリコ
シルアミン誘導体を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μ
Ｌに溶解した。これに１０倍過剰の５（−６）−カルボ
キシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル〔オレゴン州（Ｏｒｅｇｏｎ）オイゲン（Ｅｕ
ｇｅｎｅ）のモレキュラー プローブス社（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｓ，Ｉｎｃ．）〕を含有するＤＭＦ
１００μＬを加えた。反応を室温で６時間進行させた。
次に、混合物を乾燥し、水に再溶解し、氷酢酸を用いて
酸性化し、最後にエーテル抽出して遊離のフルオレセイ
ンを除去した。次いで、水性相をＵＶ（２５８ｎｍ）を
使用するスフェリソーブＳ５０ＤＳ２ ＳＰカラム
（８．０×３００ｍｍ）による逆相ＨＰＬＣ、及びフル
オレセインの検出（ｅｘｓｉｔ．３３６ｎｍ−ｅｍｉｓ
ｃ．５３６ｎｍ）に適用した。得られた画分の５０μＬ
アリクオートを計測した。典型的なプロフィールを図７
に示す。次に、遊離の糖を含有する画分及びフルオレセ
イン複合体をプールし、乾燥し、そして計測して以下の
表３に示される出発糖基準の総収率を得た。同様の結果
が５（−６）−カルボキシテトラメチル−ローダミン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの誘導体によっ
ても得られた（データは示さず）。
シルアミン誘導体を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μ
Ｌに溶解した。これに１０倍過剰の５（−６）−カルボ
キシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル〔オレゴン州（Ｏｒｅｇｏｎ）オイゲン（Ｅｕ
ｇｅｎｅ）のモレキュラー プローブス社（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｓ，Ｉｎｃ．）〕を含有するＤＭＦ
１００μＬを加えた。反応を室温で６時間進行させた。
次に、混合物を乾燥し、水に再溶解し、氷酢酸を用いて
酸性化し、最後にエーテル抽出して遊離のフルオレセイ
ンを除去した。次いで、水性相をＵＶ（２５８ｎｍ）を
使用するスフェリソーブＳ５０ＤＳ２ ＳＰカラム
（８．０×３００ｍｍ）による逆相ＨＰＬＣ、及びフル
オレセインの検出（ｅｘｓｉｔ．３３６ｎｍ−ｅｍｉｓ
ｃ．５３６ｎｍ）に適用した。得られた画分の５０μＬ
アリクオートを計測した。典型的なプロフィールを図７
に示す。次に、遊離の糖を含有する画分及びフルオレセ
イン複合体をプールし、乾燥し、そして計測して以下の
表３に示される出発糖基準の総収率を得た。同様の結果
が５（−６）−カルボキシテトラメチル−ローダミン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの誘導体によっ
ても得られた（データは示さず）。
【００７０】
【表３】 表 ３ 生成物 3Ｈ ｄｐｍ 全％ 遊離ＧＬｃＮＡｃ ３．１９Ｅ５ ９０．３ フルオレセイン−ＧＬｃＮＡｃ（直接） ３．４３Ｅ４ ９．７ 遊離ＧＬｃＮＡｃ＋グリシルＧＬｃＮＡｃ １．２４Ｅ５ ４７．３ フルオレセイン−グリシルＧＬｃＮＡｃ １．３８Ｅ５ ５２．６
【００７１】上記のデータは、ハロアセチル化−グリコ
シルアミンはβ−Ｎ−結合サッカリド複合体の合成にお
ける効果的な中間体であることを示している。これら工
程の各々は実際上完結するまで進行するので、誘導体を
全出発化合物の７０〜８０％に近い収率で製造すること
ができる。
シルアミンはβ−Ｎ−結合サッカリド複合体の合成にお
ける効果的な中間体であることを示している。これら工
程の各々は実際上完結するまで進行するので、誘導体を
全出発化合物の７０〜８０％に近い収率で製造すること
ができる。
【式２】 オリゴサッカリドの誘導体化の一般的方法 オリゴサッカリドを飽和ＮＨ4 ＨＣＯ3 に溶解 ３０℃で４日間インキュベート ↓ 水を繰り返し添加して凍結乾燥 ↓ Ｎ−ハロアセチル化→直接誘導体化 ↓ 飽和（ＮＨ4 ）2 ＣＯ3 を添加 ｏ／ｎ５０℃でインキュベート ↓ 残留グリシン、塩類を除去 ↓ Ｎ−グリシル−グリコシルアミンの誘導体化
【００７２】これら誘導体の有用性の追加の例について
は次の反応式を参照されたい。ここで再び指摘しなけれ
ばならないことは、これら誘導体の構造は糖蛋白質中の
Ｎ−結合した炭化水素とアスパラギンとの間の生物学的
結合に見い出されるアミド結合とメチレン基を含むと言
うことである。ハロアセチル化グルコシルアミン及びグ
リシルグルコシルアミンと、例えばチオグリコール酸及
び無水琥珀酸との反応性はそれぞれカルボキシ末端基の
組み込みを可能にする。これは常用のＥＤＣ／ＮＨＳ化
学〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのカ
ップリング反応〕によりオリゴサッカリドを糖蛋白質若
しくは同ぺプチド又は蛋白質に対してカップリングさせ
るのに用いることができる。
は次の反応式を参照されたい。ここで再び指摘しなけれ
ばならないことは、これら誘導体の構造は糖蛋白質中の
Ｎ−結合した炭化水素とアスパラギンとの間の生物学的
結合に見い出されるアミド結合とメチレン基を含むと言
うことである。ハロアセチル化グルコシルアミン及びグ
リシルグルコシルアミンと、例えばチオグリコール酸及
び無水琥珀酸との反応性はそれぞれカルボキシ末端基の
組み込みを可能にする。これは常用のＥＤＣ／ＮＨＳ化
学〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのカ
ップリング反応〕によりオリゴサッカリドを糖蛋白質若
しくは同ぺプチド又は蛋白質に対してカップリングさせ
るのに用いることができる。
【化１０】
【００７３】実施例４〜９は前記一般式４に例示される
種々のＮ−グリシル−β−グルコシルアミン又はＮ−結
合グリコ複合体の合成に対するハロアセチル化グリコサ
ミン中間体の独特の使用を更に例証するものである。
種々のＮ−グリシル−β−グルコシルアミン又はＮ−結
合グリコ複合体の合成に対するハロアセチル化グリコサ
ミン中間体の独特の使用を更に例証するものである。
【００７４】実施例４ 蛍光標識付きオリゴサッカリド
の合成法 序論 蛍光標識付きプローブには細胞生物学において広範な用
途がある。例えば、蛍光標識付きモノクローナル抗体は
臨床研究に日常的に使用されている。ＦＡＣＳ−分析法
（蛍光活性化細胞分類法）又は蛍光鏡検法が広く使用さ
れているそれらの検出法である。
の合成法 序論 蛍光標識付きプローブには細胞生物学において広範な用
途がある。例えば、蛍光標識付きモノクローナル抗体は
臨床研究に日常的に使用されている。ＦＡＣＳ−分析法
（蛍光活性化細胞分類法）又は蛍光鏡検法が広く使用さ
れているそれらの検出法である。
【００７５】最近、細胞表面が細胞接着事象において重
要な蛋白質（例えば、セレクチン類：Ｓｅｌｅｃｔｉｎ
ｓ）を結合している種々の細胞表面炭水化物を含有して
いることが明らかになった。炭水化物の蛍光性誘導体に
は、従って、ＦＡＣＳ−分析法か蛍光鏡検法を用いるこ
れらリセプタの検出において広い用途がある。オリゴサ
ッカリドの蛍光性プローブの開発には還元性の末端モノ
サッカリド残基の環構造、この残基のアノメリシティー
（ａｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）及びプローブに対する生物
学的結合によく似ている適切な結合体（リンカー：ｌｉ
ｎｋｅｒ）を保持する化学的方法が必要になる。本実施
例はオリゴサッカリドの１−Ｎ−グリシル−β−誘導体
の合成及びこの化合物とフルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）との蛍光性誘導体を生成させる反応
（図８Ａ）を説明するものである。この合成には還元性
の末端オリゴサッカリドを含有する任意の炭水化物を蛍
光性誘導体に転化できる等の一般的適用性がある。
要な蛋白質（例えば、セレクチン類：Ｓｅｌｅｃｔｉｎ
ｓ）を結合している種々の細胞表面炭水化物を含有して
いることが明らかになった。炭水化物の蛍光性誘導体に
は、従って、ＦＡＣＳ−分析法か蛍光鏡検法を用いるこ
れらリセプタの検出において広い用途がある。オリゴサ
ッカリドの蛍光性プローブの開発には還元性の末端モノ
サッカリド残基の環構造、この残基のアノメリシティー
（ａｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）及びプローブに対する生物
学的結合によく似ている適切な結合体（リンカー：ｌｉ
ｎｋｅｒ）を保持する化学的方法が必要になる。本実施
例はオリゴサッカリドの１−Ｎ−グリシル−β−誘導体
の合成及びこの化合物とフルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）との蛍光性誘導体を生成させる反応
（図８Ａ）を説明するものである。この合成には還元性
の末端オリゴサッカリドを含有する任意の炭水化物を蛍
光性誘導体に転化できる等の一般的適用性がある。
【００７６】方法 蛍光性炭水化物複合体の合成 １．グリコシルアミンの製造 Ｇ（０）＝ＧｌｃＮＡｃ β２ Ｍａｎ α３（Ｇｌｃ
ＮＡｃ β２ Ｍａｎα６）Ｍａｎ β４ ＧｌｃＮＡ
ｃ β４ ＧｌｃＮＡｃのグルコシルアミンの形成は次
のようにして行った。即ち、オリゴサッカリド１ｍｇを
回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用いて調製した
飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬに再懸濁さ
せた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加えてインキュ
ベーション期間中その溶液の飽和を維持した。それらの
管をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で密封し、次い
でニードルを用いて穴をあけた（塩の分解により発生す
るアンモニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にする）。
３０℃において３〜４日間インキュベートした後、Ｇ
（０）グリコシルアミン製造物を反応混合物の蒸留水１
ｍＬ中で直接凍結乾燥により脱塩した。
ＮＡｃ β２ Ｍａｎα６）Ｍａｎ β４ ＧｌｃＮＡ
ｃ β４ ＧｌｃＮＡｃのグルコシルアミンの形成は次
のようにして行った。即ち、オリゴサッカリド１ｍｇを
回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用いて調製した
飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬに再懸濁さ
せた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加えてインキュ
ベーション期間中その溶液の飽和を維持した。それらの
管をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で密封し、次い
でニードルを用いて穴をあけた（塩の分解により発生す
るアンモニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にする）。
３０℃において３〜４日間インキュベートした後、Ｇ
（０）グリコシルアミン製造物を反応混合物の蒸留水１
ｍＬ中で直接凍結乾燥により脱塩した。
【００７７】２．Ｎ−グリシル誘導体の製造 （ａ）グリコシルアミンのＮ−クロロアセチル化 Ｇ（０）グリコシルアミンをＮ−クロロアセチル化とア
ンモノリシスとの組み合わせを用い、Ｎ−クロロアセト
アミド誘導体を経由して１−Ｎ−グリシル−β−誘導体
に転化した。即ち、Ｇ（０）グリコシルアミンを１Ｍ重
炭酸ナトリウム１００μＬに溶解し、氷冷した。これに
５倍モル過剰の固体無水クロロ酢酸を加え、その反応混
合物を室温まで加温した。ｐＨを必要なときに重炭酸ナ
トリウムを添加することによって７．０以上に保持し
た。反応の進行を溶剤として７：４（ｖ／ｖ）のアセト
ニトリル／水及び０．０５％のジアミノブタンを用いて
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニターした。反
応の完結に全３時間を要した。クロロアセチル化に続い
て、混合物をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ５０−Ｘ
１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂がＡＧ３−Ｘ４Ａ（ＯＨ
- ）アニオン交換樹脂の上に層をなして配置されている
カラムを覆って通過させることによって脱塩した。溶離
剤を集め、蒸発乾固し、水２００μＬに再懸濁させ、そ
の後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣにより分析した。
ンモノリシスとの組み合わせを用い、Ｎ−クロロアセト
アミド誘導体を経由して１−Ｎ−グリシル−β−誘導体
に転化した。即ち、Ｇ（０）グリコシルアミンを１Ｍ重
炭酸ナトリウム１００μＬに溶解し、氷冷した。これに
５倍モル過剰の固体無水クロロ酢酸を加え、その反応混
合物を室温まで加温した。ｐＨを必要なときに重炭酸ナ
トリウムを添加することによって７．０以上に保持し
た。反応の進行を溶剤として７：４（ｖ／ｖ）のアセト
ニトリル／水及び０．０５％のジアミノブタンを用いて
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニターした。反
応の完結に全３時間を要した。クロロアセチル化に続い
て、混合物をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ５０−Ｘ
１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂がＡＧ３−Ｘ４Ａ（ＯＨ
- ）アニオン交換樹脂の上に層をなして配置されている
カラムを覆って通過させることによって脱塩した。溶離
剤を集め、蒸発乾固し、水２００μＬに再懸濁させ、そ
の後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣにより分析した。
【００７８】（ｂ）Ｎ−クロロアセチル化グリコシルア
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化グリコシルアミンを飽和重炭酸ア
ンモニウム５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸
発によるアンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃におい
て１夜インキュベートした。次に、重炭酸アンモニウム
を蒸留水１ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化グリコシルアミンを飽和重炭酸ア
ンモニウム５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸
発によるアンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃におい
て１夜インキュベートした。次に、重炭酸アンモニウム
を蒸留水１ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
【００７９】３．フルオレセインイソチオシアネートへ
の複合 Ｇ（０）オリゴサッカリドの１−Ｎ−グリシル−β−誘
導体をｐＨ１０の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １００μＬに
溶解し、そしてＭｅＯＨに溶解したＦＩＴＣ（１０倍モ
ル過剰）と混合した。反応混合物を室温で１夜攪拌し
た。混合物を溶剤として７：４（ｖ／ｖ）のアセトニト
リル／水及び０．０５％のジアミノブタンを用いてＴＬ
Ｃで分析した。ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ−Ｇ（０）及びグリ
シルＧ（０）のＲf 値はそれぞれ０．７６、０．５７及
び０．０３であった。ＦＩＴＣ−Ｇ（０）を表すバンド
を少量の水で湿潤し、マイクロ遠心管にかき落とした。
シリカを４〜５回水で洗浄し、遠心分離した。上澄み液
を乾燥し、水１００μＬに再懸濁させた。それを０〜５
０％の勾配の、トリフルオロ酢酸０．１％を含有する水
とアセトニトリルを用いる、Ｓ５０ＤＳ２カラム（８×
２５０ｍｍ）による逆層ＨＰＬＣによって３０分間更に
精製した（図８Ｂ）。精製されたＦＩＴＣ−Ｇ（０）の
質量をラサマット（ＬＡＳＥＲＭＡＴ）機〔英国、ハー
トフォードシェア（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）のフ
ィネガンマット、ヘメル ヘンプステッド社（Ｆｉｎｎ
ｅｇａｎＭａｔ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ）〕
を使用するレーザー脱着質量分析法で定量した（図８
Ｃ）。
の複合 Ｇ（０）オリゴサッカリドの１−Ｎ−グリシル−β−誘
導体をｐＨ１０の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １００μＬに
溶解し、そしてＭｅＯＨに溶解したＦＩＴＣ（１０倍モ
ル過剰）と混合した。反応混合物を室温で１夜攪拌し
た。混合物を溶剤として７：４（ｖ／ｖ）のアセトニト
リル／水及び０．０５％のジアミノブタンを用いてＴＬ
Ｃで分析した。ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ−Ｇ（０）及びグリ
シルＧ（０）のＲf 値はそれぞれ０．７６、０．５７及
び０．０３であった。ＦＩＴＣ−Ｇ（０）を表すバンド
を少量の水で湿潤し、マイクロ遠心管にかき落とした。
シリカを４〜５回水で洗浄し、遠心分離した。上澄み液
を乾燥し、水１００μＬに再懸濁させた。それを０〜５
０％の勾配の、トリフルオロ酢酸０．１％を含有する水
とアセトニトリルを用いる、Ｓ５０ＤＳ２カラム（８×
２５０ｍｍ）による逆層ＨＰＬＣによって３０分間更に
精製した（図８Ｂ）。精製されたＦＩＴＣ−Ｇ（０）の
質量をラサマット（ＬＡＳＥＲＭＡＴ）機〔英国、ハー
トフォードシェア（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）のフ
ィネガンマット、ヘメル ヘンプステッド社（Ｆｉｎｎ
ｅｇａｎＭａｔ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ）〕
を使用するレーザー脱着質量分析法で定量した（図８
Ｃ）。
【００８０】実施例５ プラスチック表面の炭水化物に
よる誘導体化法 序論 酵素結合済み免疫吸着検定（エリサ：ＥＬＩＳＡ）に基
づく検定法で行われるようなプラスチック表面への蛋白
質の吸着は診断薬に革命をもたらした。炭水化物リガン
ドをプラスチック表面に、還元性の末端モノサッカリド
の一体性と蛋白質に対するその結合を保持するように結
合させる適当な方法は今日までのところ存在しない。
よる誘導体化法 序論 酵素結合済み免疫吸着検定（エリサ：ＥＬＩＳＡ）に基
づく検定法で行われるようなプラスチック表面への蛋白
質の吸着は診断薬に革命をもたらした。炭水化物リガン
ドをプラスチック表面に、還元性の末端モノサッカリド
の一体性と蛋白質に対するその結合を保持するように結
合させる適当な方法は今日までのところ存在しない。
【００８１】蛋白質を結合している多くの炭水化物は還
元性の末端モノサッカリドを他の更に周囲の炭水化物エ
ピトープ〔即ち、レンズ カルシナリス（Ｒｅｎｓ ｃ
ｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチン）と共に認識する。これら
残基の一体性を保持することはこのレクチンの結合にお
いて重要である。炭水化物のプラスチック表面に対する
不動態化能は細胞表面の検出と炭水化物の結合性パテン
ト（ｂｉｎｄｉｎｇｐａｔｅｎｔ）の循環を同時に行う
際に診断上重要な助けになる。
元性の末端モノサッカリドを他の更に周囲の炭水化物エ
ピトープ〔即ち、レンズ カルシナリス（Ｒｅｎｓ ｃ
ｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチン）と共に認識する。これら
残基の一体性を保持することはこのレクチンの結合にお
いて重要である。炭水化物のプラスチック表面に対する
不動態化能は細胞表面の検出と炭水化物の結合性パテン
ト（ｂｉｎｄｉｎｇｐａｔｅｎｔ）の循環を同時に行う
際に診断上重要な助けになる。
【００８２】本実施例はオリゴサッカリドの１−Ｎ−グ
リシル−β−誘導体の合成、チオシアネート誘導体を与
えるチオホスゲンとのその反応及び表面変成されたプラ
スチックのファルコン プリマリア（Ｆａｌｃｏｎ Ｐ
ｒｉｍａｒｉａ）組織培養プレートに対するそのチオシ
アネート誘導体のカップリングを説明するものである。
この方法の利用性はアンチ−炭水化物モノクローナル抗
体の上記プレートに対する結合によって証明される（図
９）。
リシル−β−誘導体の合成、チオシアネート誘導体を与
えるチオホスゲンとのその反応及び表面変成されたプラ
スチックのファルコン プリマリア（Ｆａｌｃｏｎ Ｐ
ｒｉｍａｒｉａ）組織培養プレートに対するそのチオシ
アネート誘導体のカップリングを説明するものである。
この方法の利用性はアンチ−炭水化物モノクローナル抗
体の上記プレートに対する結合によって証明される（図
９）。
【００８３】方法 ファルコン エリサプレートに対する炭水化物の不動態
化
化
【００８４】１．グリコシルアミンの製造 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミン
の形成は次のようにして行った。即ち、糖試料５ｍｇを
回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用いて調製した
飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬに再懸濁さ
せた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加えてインキュ
ベーション期間中その溶液の飽和を維持した。それらの
管をパラフィルムで密封し、次いでニードルを用いて穴
をあけた（塩の分解により発生するアンモニアと二酸化
炭素を逃がすのを可能にする）。３０℃において３〜４
日間インキュベートした後、グリコシルアミン製造物を
反応混合物の蒸留水１ｍＬ中での直接凍結乾燥により脱
塩した。
の形成は次のようにして行った。即ち、糖試料５ｍｇを
回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用いて調製した
飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬに再懸濁さ
せた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加えてインキュ
ベーション期間中その溶液の飽和を維持した。それらの
管をパラフィルムで密封し、次いでニードルを用いて穴
をあけた（塩の分解により発生するアンモニアと二酸化
炭素を逃がすのを可能にする）。３０℃において３〜４
日間インキュベートした後、グリコシルアミン製造物を
反応混合物の蒸留水１ｍＬ中での直接凍結乾燥により脱
塩した。
【００８５】２．Ｎ−グリシル誘導体の製造 （ａ）グリコシルアミンのＮ−クロロアセチル化 上記グリコシルアミンをＮ−クロロアセチル化とアンモ
ノリシスとの組み合わせを用い、Ｎ−クロロアセトアミ
ド誘導体を経由して１−Ｎ−グリシル−β−誘導体に転
化した。即ち、グリコシルアミンを１Ｍ重炭酸ナトリウ
ム１００μＬに溶解し、氷冷した。これに５倍モル過剰
の固体無水クロロ酢酸を加え、その反応混合物を室温ま
で加温した。ｐＨを重炭酸ナトリウムを必要なときに添
加することによって７．０以上に保持した。反応の進行
を溶剤として７：４（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水及
び０．０５％のジアミノブタンを用いて薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）でモニターした。反応の完結に全３
時間を要した。クロロアセチル化に続いて、混合物をダ
ウエックスＡＧ５０−Ｘ１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂
がＡＧ３−Ｘ４Ａ（ＯＨ- ）アニオン交換樹脂の上に層
をなして配置されているカラムを覆って通過させること
によって脱塩した。溶離剤を集め、蒸発乾固し、水２０
０μＬに再懸濁させ、その後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣに
より分析した。
ノリシスとの組み合わせを用い、Ｎ−クロロアセトアミ
ド誘導体を経由して１−Ｎ−グリシル−β−誘導体に転
化した。即ち、グリコシルアミンを１Ｍ重炭酸ナトリウ
ム１００μＬに溶解し、氷冷した。これに５倍モル過剰
の固体無水クロロ酢酸を加え、その反応混合物を室温ま
で加温した。ｐＨを重炭酸ナトリウムを必要なときに添
加することによって７．０以上に保持した。反応の進行
を溶剤として７：４（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水及
び０．０５％のジアミノブタンを用いて薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）でモニターした。反応の完結に全３
時間を要した。クロロアセチル化に続いて、混合物をダ
ウエックスＡＧ５０−Ｘ１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂
がＡＧ３−Ｘ４Ａ（ＯＨ- ）アニオン交換樹脂の上に層
をなして配置されているカラムを覆って通過させること
によって脱塩した。溶離剤を集め、蒸発乾固し、水２０
０μＬに再懸濁させ、その後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣに
より分析した。
【００８６】（ｂ）Ｎ−クロロアセチル化グリコシルア
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化混合物を飽和重炭酸アンモニウム
５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸発によるア
ンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃において１夜イン
キュベートした。次に、重炭酸アンモニウムを蒸留水１
ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化混合物を飽和重炭酸アンモニウム
５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸発によるア
ンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃において１夜イン
キュベートした。次に、重炭酸アンモニウムを蒸留水１
ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
【００８７】３．Ｎ−グリシルイソチオシアネート誘導
体の製造 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの１−Ｎ−グリシル
−β−誘導体のｐＨ８．５の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １
ｍＬに溶解し、そしてチオホスゲン（２．５倍モル過
剰）を含有するクロロホルム１．２５ｍＬを覆って層と
なした。反応混合物を換気されたヒュームフード内で室
温において少なくとも１時間攪拌した。反応混合物をク
ロロホルム１ｍＬで４回抽出した。これら混合物をエッ
ペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機で最終回転さ
せた後の上層の水性層を注意深く除去した。
体の製造 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの１−Ｎ−グリシル
−β−誘導体のｐＨ８．５の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １
ｍＬに溶解し、そしてチオホスゲン（２．５倍モル過
剰）を含有するクロロホルム１．２５ｍＬを覆って層と
なした。反応混合物を換気されたヒュームフード内で室
温において少なくとも１時間攪拌した。反応混合物をク
ロロホルム１ｍＬで４回抽出した。これら混合物をエッ
ペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機で最終回転さ
せた後の上層の水性層を注意深く除去した。
【００８８】４．アミノ−誘導体化されたファルコン
エリサプレートへの複合 上記のＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの１−Ｎ−グ
リシル−β−イソチオシアネート誘導体（１２μモル／
ｍＬ）をアミノ−誘導体化エリサプレート（ファルコ
ン）に複合させた。即ち、その水性層１００μＬを連続
的に０．１Ｍ ＮａＣＯ3 中０．３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
１０）で２倍希釈し、各希釈物５０μＬをエリサプレー
トに加えた。室温で１夜インキュベートした後、プレー
トをホスフェートで緩衝した塩水（ＰＢＳ）で完全に洗
浄して未結合糖を除去した。そのプレートをアンチ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ抗体の結合に先立ってＰＢＳ中４％のウシの
血清アルブミン（ＢＳＡ）によりクエンチした。一次抗
体（ＩｇＭサブクラス）の検出はプレートをワサビダイ
コンペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合で複合され
たアンチ−μ抗体と共にインキュベートすることによっ
て行った。プレートを５０μＬの基質・２，２′−アジ
ノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）（Ａ
ＢＴＳ）（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて発育させた。
４９９ｎｍ及び６２０ｎｍにおける吸光度をプレート読
取器で読み取った（図９）。陰性の対照について、プレ
ートをＰＢＳ単独と共に、又は拮抗阻害剤のＧｌｃＮＡ
ｃ（６０ｍＭ）の存在下でインキュベートした。
エリサプレートへの複合 上記のＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの１−Ｎ−グ
リシル−β−イソチオシアネート誘導体（１２μモル／
ｍＬ）をアミノ−誘導体化エリサプレート（ファルコ
ン）に複合させた。即ち、その水性層１００μＬを連続
的に０．１Ｍ ＮａＣＯ3 中０．３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
１０）で２倍希釈し、各希釈物５０μＬをエリサプレー
トに加えた。室温で１夜インキュベートした後、プレー
トをホスフェートで緩衝した塩水（ＰＢＳ）で完全に洗
浄して未結合糖を除去した。そのプレートをアンチ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ抗体の結合に先立ってＰＢＳ中４％のウシの
血清アルブミン（ＢＳＡ）によりクエンチした。一次抗
体（ＩｇＭサブクラス）の検出はプレートをワサビダイ
コンペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合で複合され
たアンチ−μ抗体と共にインキュベートすることによっ
て行った。プレートを５０μＬの基質・２，２′−アジ
ノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）（Ａ
ＢＴＳ）（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて発育させた。
４９９ｎｍ及び６２０ｎｍにおける吸光度をプレート読
取器で読み取った（図９）。陰性の対照について、プレ
ートをＰＢＳ単独と共に、又は拮抗阻害剤のＧｌｃＮＡ
ｃ（６０ｍＭ）の存在下でインキュベートした。
【００８９】実施例６ リポグリカン免疫モジュレータ
ーの合成法 序論 抗原の発現は免疫応答において決定的に重要である。外
部から投与されたぺプチドは通常免疫過程を通じて一次
応答を開始しない。対照的に、リボぺプチドワクチンは
抗原の対抗に続いて起こる免疫応答に対してリンパ球を
準備することができる。リボぺプチドワクチンはキャリ
アーであるＰ3 ＣＳＳ（トリパルミトイル−Ｓ−グリセ
リルシステイニル−セリル−セリン）又はＰ3 Ｃ（トリ
パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）に結合した
ぺプチドより成る。
ーの合成法 序論 抗原の発現は免疫応答において決定的に重要である。外
部から投与されたぺプチドは通常免疫過程を通じて一次
応答を開始しない。対照的に、リボぺプチドワクチンは
抗原の対抗に続いて起こる免疫応答に対してリンパ球を
準備することができる。リボぺプチドワクチンはキャリ
アーであるＰ3 ＣＳＳ（トリパルミトイル−Ｓ−グリセ
リルシステイニル−セリル−セリン）又はＰ3 Ｃ（トリ
パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）に結合した
ぺプチドより成る。
【００９０】Ｐ3 ＣＳＳ又はＰ3 Ｃは細胞膜に対する結
合、細胞質への内在化を仲介し、そしてマクロファージ
を活性化してサイトカインを分泌すると考えられる。ぺ
プチドに対する免疫応答は広く研究されて来たが、炭水
化物抗原に対する免疫応答の機作は知られていない。実
際、炭水化物に対する免疫応答はウイルス、バクテリ
ア、マイコバクテリア及び寄生虫を含めて感染因子の全
宿主に対する防御免疫化において極めて重大である。
合、細胞質への内在化を仲介し、そしてマクロファージ
を活性化してサイトカインを分泌すると考えられる。ぺ
プチドに対する免疫応答は広く研究されて来たが、炭水
化物抗原に対する免疫応答の機作は知られていない。実
際、炭水化物に対する免疫応答はウイルス、バクテリ
ア、マイコバクテリア及び寄生虫を含めて感染因子の全
宿主に対する防御免疫化において極めて重大である。
【００９１】更に、炭水化物に対する不適切なアンチ−
炭水化物免疫応答は多数の自己免疫病において重要であ
るであろう。その応答をモジュレートすることが治療に
おいては決定的に重要である。
炭水化物免疫応答は多数の自己免疫病において重要であ
るであろう。その応答をモジュレートすることが治療に
おいては決定的に重要である。
【００９２】本実施例は１−Ｎ−グリシル−β−炭水化
物誘導体の使用による炭水化物のＰ 3 Ｃ複合体の合成を
説明するものである。この化学は多数の病気の予防と治
療の両方に対する新規な薬剤の開発において、重要であ
る。
物誘導体の使用による炭水化物のＰ 3 Ｃ複合体の合成を
説明するものである。この化学は多数の病気の予防と治
療の両方に対する新規な薬剤の開発において、重要であ
る。
【００９３】方法 リポグリカンの合成 １．グリコシルアミンの製造 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミン
の形成は次のようにして行った。即ち、この糖６ｍｇを
回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用いて調製した
飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬに再懸濁さ
せた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加えてインキュ
ベーション期間中その溶液の飽和を維持した。それらの
管をパラフィルムで密封し、次いでニードルを用いて穴
をあけた（塩の分解により発生するアンモニアと二酸化
炭素を逃がすのを可能にする）。３０℃において３〜４
日間インキュベートした後、グリコシルアミン製造物を
反応混合物の蒸留水１ｍＬ中で直接凍結乾燥により脱塩
した。
の形成は次のようにして行った。即ち、この糖６ｍｇを
回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用いて調製した
飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬに再懸濁さ
せた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加えてインキュ
ベーション期間中その溶液の飽和を維持した。それらの
管をパラフィルムで密封し、次いでニードルを用いて穴
をあけた（塩の分解により発生するアンモニアと二酸化
炭素を逃がすのを可能にする）。３０℃において３〜４
日間インキュベートした後、グリコシルアミン製造物を
反応混合物の蒸留水１ｍＬ中で直接凍結乾燥により脱塩
した。
【００９４】２．Ｎ−グリシル誘導体の製造 （ａ）グリコシルアミンのＮ−クロロアセチル化 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミン
をＮ−クロロアセチル化アンモノリシスとの組み合わせ
を用い、Ｎ−クロロアセトアミド誘導体を経由して１−
Ｎ−グリシル−β−誘導体に転化した。即ち、上記グリ
コシルアミンを１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μＬに溶解
し、氷冷した。これに５倍モル過剰の固体無水クロロ酢
酸を加え、その反応混合物を室温まで加温した。ｐＨを
重炭酸ナトリウムを必要なときに添加することによって
７．０以上に保持した。反応の進行を溶剤として７：４
（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水及び０．０５％のジア
ミノブタンを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
でモニターした。反応の完結に全３時間を要した。クロ
ロアセチル化に続いて、混合物をダウエックスＡＧ５０
−Ｘ１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂がＡＧ３−Ｘ４Ａ
（ＯＨ- ）アニオン交換樹脂の上に層をなして配置され
ているカラムを覆って通過させることによって脱塩し
た。溶離剤を集め、蒸発乾固し、水２００μＬに再懸濁
させ、その後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣにより分析した。
をＮ−クロロアセチル化アンモノリシスとの組み合わせ
を用い、Ｎ−クロロアセトアミド誘導体を経由して１−
Ｎ−グリシル−β−誘導体に転化した。即ち、上記グリ
コシルアミンを１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μＬに溶解
し、氷冷した。これに５倍モル過剰の固体無水クロロ酢
酸を加え、その反応混合物を室温まで加温した。ｐＨを
重炭酸ナトリウムを必要なときに添加することによって
７．０以上に保持した。反応の進行を溶剤として７：４
（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水及び０．０５％のジア
ミノブタンを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
でモニターした。反応の完結に全３時間を要した。クロ
ロアセチル化に続いて、混合物をダウエックスＡＧ５０
−Ｘ１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂がＡＧ３−Ｘ４Ａ
（ＯＨ- ）アニオン交換樹脂の上に層をなして配置され
ているカラムを覆って通過させることによって脱塩し
た。溶離剤を集め、蒸発乾固し、水２００μＬに再懸濁
させ、その後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣにより分析した。
【００９５】（ｂ）Ｎ−クロロアセチル化グリコシルア
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化混合物を飽和重炭酸アンモニウム
５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸発によるア
ンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃において１夜イン
キュベートした。次に、重炭酸アンモニウムを蒸留水１
ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化混合物を飽和重炭酸アンモニウム
５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸発によるア
ンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃において１夜イン
キュベートした。次に、重炭酸アンモニウムを蒸留水１
ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
【００９６】３．Ｐ3 Ｃへの複合 ＤＭＳＯ６８μＬ及びＤＭＦ４０μＬ中７μモルの、
Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのＮ−グリシル誘導
体、ＤＭＦ／ジクロロメタン（１：１）４０ｍＬ中２μ
モルのＰ3 Ｃ及びＤＭＦ１２０μＬ中４モルのＨＢＴＵ
／ＨＯＢＴを含有する混合物を室温で２日間攪拌した。
Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのＮ−グリシル誘導
体、ＤＭＦ／ジクロロメタン（１：１）４０ｍＬ中２μ
モルのＰ3 Ｃ及びＤＭＦ１２０μＬ中４モルのＨＢＴＵ
／ＨＯＢＴを含有する混合物を室温で２日間攪拌した。
【００９７】この混合物をそのカップリング反応後−２
０℃で１夜貯蔵した。次に、クロロホルム／メタノール
（１：１）１ｍＬを加えてＰ3 Ｃを再結晶化した。混合
物を−２０℃で１夜放置した後エッペンドルフ遠心機で
最大速度で１０分間回転させた。上澄み液を注意深く除
去した。小さい白色沈澱物をｔ−ブタノール／水（４：
１）４０μＬに再懸濁させ、そしてＴＬＣにより非複合
Ｐ3 Ｃと共に分析した。
０℃で１夜貯蔵した。次に、クロロホルム／メタノール
（１：１）１ｍＬを加えてＰ3 Ｃを再結晶化した。混合
物を−２０℃で１夜放置した後エッペンドルフ遠心機で
最大速度で１０分間回転させた。上澄み液を注意深く除
去した。小さい白色沈澱物をｔ−ブタノール／水（４：
１）４０μＬに再懸濁させ、そしてＴＬＣにより非複合
Ｐ3 Ｃと共に分析した。
【００９８】 ＨＯＢＴ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イ
ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキ
サフルオロホスヘェート
ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキ
サフルオロホスヘェート
【００９９】実施例７ 糖ぺプチドの合成法 アトリオぺプチンネオ糖ホルモンの合成 序論 合成ぺプチドは医学の研究、診断及び治療のいづれにお
いても著しく重要なものである。多くの小さい合成生物
活性ホルモンには、十分な血清半減期を獲得することが
できれば、潜在的な薬理学的用途がある。特定の細胞リ
セプタによるクリアランス又は肝汁若しくは腎臓経由の
特定の細胞による非特異性クリアランスはこれら分子の
多くの半減期を数分まで短縮する。ぺプチドのグリコシ
ル化体の合成はそのグリコシル化体の血清中での安定性
及び半減期が大きいので望ましいと思われる。
いても著しく重要なものである。多くの小さい合成生物
活性ホルモンには、十分な血清半減期を獲得することが
できれば、潜在的な薬理学的用途がある。特定の細胞リ
セプタによるクリアランス又は肝汁若しくは腎臓経由の
特定の細胞による非特異性クリアランスはこれら分子の
多くの半減期を数分まで短縮する。ぺプチドのグリコシ
ル化体の合成はそのグリコシル化体の血清中での安定性
及び半減期が大きいので望ましいと思われる。
【０１００】合成ぺプチドのワクチンも、Ｔ−細胞認識
ぺプチドがグリコシル化されていると、効力が制限され
る可能性がある。例えば、狂犬病免疫性マウスからのＴ
−細胞は狂犬病ウイルス糖蛋白質の臭化シアン断片によ
り刺激され得る。２つの断片ＣＲ２及びＣＲ３（両者共
にウイルスにより誘導された物質においてグリコシル化
されている）の合成類縁体はＴ−細胞を刺激しない。こ
のことは、認識されるのは糖蛋白質であって、ぺプチド
ではないことを示している。この場合、糖蛋白質の合成
が合成ワクチンとして有用であろう。生物起源の、未保
護ヒドロキシル基を有する大きい複雑なオリゴサッカリ
ドを含有する糖蛋白質はこれまで化学的には合成されて
いない。
ぺプチドがグリコシル化されていると、効力が制限され
る可能性がある。例えば、狂犬病免疫性マウスからのＴ
−細胞は狂犬病ウイルス糖蛋白質の臭化シアン断片によ
り刺激され得る。２つの断片ＣＲ２及びＣＲ３（両者共
にウイルスにより誘導された物質においてグリコシル化
されている）の合成類縁体はＴ−細胞を刺激しない。こ
のことは、認識されるのは糖蛋白質であって、ぺプチド
ではないことを示している。この場合、糖蛋白質の合成
が合成ワクチンとして有用であろう。生物起源の、未保
護ヒドロキシル基を有する大きい複雑なオリゴサッカリ
ドを含有する糖蛋白質はこれまで化学的には合成されて
いない。
【０１０１】本実施例は最大９個までのサッカリド単位
を有する大きい複雑なオリゴサッカリド乃至約５〜２５
個のアミノ酸残基を有するぺプチドの未保護グリコシル
アミン誘導体の直接カップリング法を使用するグリコぺ
プチドの合成を説明するものである。ペンタぺプチドの
実例は次の通りである。
を有する大きい複雑なオリゴサッカリド乃至約５〜２５
個のアミノ酸残基を有するぺプチドの未保護グリコシル
アミン誘導体の直接カップリング法を使用するグリコぺ
プチドの合成を説明するものである。ペンタぺプチドの
実例は次の通りである。
【０１０２】Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、及びＡ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ。
ｅ、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ、及びＡ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ。
【０１０３】本実施例は更にその利用性をアトリオぺプ
チンとして知られる２５個のアミノ酸残基を有する生物
活性ホルモンの２種の異なるグリコシル化体の合成によ
り証明するものである。例えば米国特許第４，４９６，
５４４号明細書に記載されるアトリオぺプチンＩ、ＩＩ
及びＩＩＩがまた有用なぺプチドの典型的なものであ
る。
チンとして知られる２５個のアミノ酸残基を有する生物
活性ホルモンの２種の異なるグリコシル化体の合成によ
り証明するものである。例えば米国特許第４，４９６，
５４４号明細書に記載されるアトリオぺプチンＩ、ＩＩ
及びＩＩＩがまた有用なぺプチドの典型的なものであ
る。
【０１０４】方法 グリコぺプチドの合成 １．グリコシルアミンの製造 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースとＭａｎ α３
（Ｍａｎα６） （Ｘｙｌ β２） Ｍａｎ β４ Ｇ
ｌｃＮＡｃ β４ （Ｆｕｃ α６） ＧｌｃＮＡｃ
（植物誘導オリゴサッカリド）及びＧａ１β４Ｇ１ｃＮ
Ａｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β４Ｇ１ｃＮＡｃＭａｎα
３）Ｍａｎβ４−Ｇ１ｃＮＡｃβ４Ｇ１ｃＮＡｃ（ほ乳
動物誘導オリゴサッカリド）とのグリコシルアミンの形
成は次のようにして行った。即ち、Ｎ，Ｎ′−ジアセチ
ルキトビオース５ｍｇ、Ｍａｎ α３（Ｍａｎα６）
（Ｘｙ１ β２） Ｍａｎ β４ Ｇ１ｃＮＡｃ β４
（Ｆｕｃ α６） Ｇ１ｃＮＡｃ１ｍｇ及びＧａ１β
４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡ
ｃ１ｍｇを回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用い
て調製した飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬ
に再懸濁させた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加え
てインキュベーション期間中その溶液の飽和を維持し
た。それらの管をパラフィルムで密封し、次いでニード
ルを用いて穴をあけた（塩の分解により発生するアンモ
ニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にする）。３０℃に
おいて３〜４日間インキュベートした後、グリコシルア
ミン製造物を反応混合物の蒸留水１ｍＬ中での直接凍結
乾燥により脱塩した。グリコシルアミンの試料をＴＬＣ
と 1Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
（Ｍａｎα６） （Ｘｙｌ β２） Ｍａｎ β４ Ｇ
ｌｃＮＡｃ β４ （Ｆｕｃ α６） ＧｌｃＮＡｃ
（植物誘導オリゴサッカリド）及びＧａ１β４Ｇ１ｃＮ
Ａｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β４Ｇ１ｃＮＡｃＭａｎα
３）Ｍａｎβ４−Ｇ１ｃＮＡｃβ４Ｇ１ｃＮＡｃ（ほ乳
動物誘導オリゴサッカリド）とのグリコシルアミンの形
成は次のようにして行った。即ち、Ｎ，Ｎ′−ジアセチ
ルキトビオース５ｍｇ、Ｍａｎ α３（Ｍａｎα６）
（Ｘｙ１ β２） Ｍａｎ β４ Ｇ１ｃＮＡｃ β４
（Ｆｕｃ α６） Ｇ１ｃＮＡｃ１ｍｇ及びＧａ１β
４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡ
ｃＭａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡ
ｃ１ｍｇを回転蒸発により乾固し、それを滅菌水を用い
て調製した飽和重炭酸アンモニウム（１Ｍ）２００μＬ
に再懸濁させた。次に、固体重炭酸アンモニウムを加え
てインキュベーション期間中その溶液の飽和を維持し
た。それらの管をパラフィルムで密封し、次いでニード
ルを用いて穴をあけた（塩の分解により発生するアンモ
ニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にする）。３０℃に
おいて３〜４日間インキュベートした後、グリコシルア
ミン製造物を反応混合物の蒸留水１ｍＬ中での直接凍結
乾燥により脱塩した。グリコシルアミンの試料をＴＬＣ
と 1Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０１０５】２．グリコシルアミンの合成ぺプチドへの
カップリング 上記のＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオース、Ｍａｎ α
３ （Ｍａｎα６）（Ｘｙｌ β２） Ｍａｎ β４
ＧｌｃＮＡｃ β４ （Ｆｕｃ α６） ＧｌｃＮＡｃ
及びＧａ１β４Ｇ１ｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β
４Ｇ１ｃＮＡｃＭａｎα３）Ｍａｎβ４Ｇ１ｃＮＡｃβ
４Ｇ１ｃＮＡｃのグリコシルアミンを次の手順を用いて
合成ぺプチドのＣＢＺ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−ＮＨ2 及びＦＭＯＣ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2 に対してそれ
ぞれカップリングさせた。即ち、ＤＭＦ５０μＬ中のそ
れぞれのぺプチド５μモル（３．５ｍｇ）をＤＭＳＯ８
５μＬ及びＤＭＦ５０μＬ中のＮ，Ｎ′−ジアセチルキ
トビオースグリコシルアミン１０μモル（３．７ｍｇ）
又はＭａｎ α３ （Ｍａｎα６） Ｘｙｌ β２ Ｍ
ａｎ β４ ＧｌｃＮＡｃ β４ （Ｆｕｃ α６）
ＧｌｃＮＡｃグリコシルアミン１μモルに加えた。Ｇａ
１β４Ｇ１ｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β４Ｇ１ｃ
ＮＡｃＭａｎα３）Ｍａｎβ４Ｇ１ｃＮＡｃβ４Ｇ１ｃ
ＮＡｃ０．６μモルについては、カップリング剤のＨＢ
ＴＵ（ＤＭＦ１００μＬ中１５μモル）に対してＦＭＯ
Ｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2
ぺプチド２μモルしか用いず、そしてグリコシルアミン
とぺプチドとの混合物に触媒のＨＯＢＴ（ＤＭＦ５０μ
Ｌ中５μモル）を加えた。反応混合物をピアース（Ｐｉ
ｅｒｃｅ）ガラスバイアル中で室温において攪拌し、そ
してＨＰＬＣ Ｃ４分析カラム（溶離条件：２０分で５
〜１００％のアセトニトリル）により糖ぺプチドの分析
を行った。糖ぺプチドの合成は、Ｍａｎ α３ （Ｍａ
ｎα６） （Ｘｙｌ β２） Ｍａｎβ４ ＧｌｃＮＡ
ｃ β４ （Ｆｕｃ α６） ＧｌｃＮＡｃグリコシル
アミンについては４〜５日で、またＧａ１β４Ｇ１ｃＮ
Ａｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β４Ｇ１ｃＮＡｃＭａｎα
３）Ｍａｎβ４Ｇ１ｃＮＡｃβ４Ｇ１ｃＮＡｃについて
は１日で生じたのに比較してＮ，Ｎ′−ジアセチルキト
ビオースグリコシルアミンについては４時間で生じた。
生成物を糖及びアミノ酸の組成の存在についてはピコタ
グ（Ｐｉｃｏｔａｇ）法で、また質量についてはラサマ
ット（Ｌａｓｅｒｍａｔ）機を使用するレーザー脱着質
量分析法で分析した（図１１及び１２）。
カップリング 上記のＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオース、Ｍａｎ α
３ （Ｍａｎα６）（Ｘｙｌ β２） Ｍａｎ β４
ＧｌｃＮＡｃ β４ （Ｆｕｃ α６） ＧｌｃＮＡｃ
及びＧａ１β４Ｇ１ｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β
４Ｇ１ｃＮＡｃＭａｎα３）Ｍａｎβ４Ｇ１ｃＮＡｃβ
４Ｇ１ｃＮＡｃのグリコシルアミンを次の手順を用いて
合成ぺプチドのＣＢＺ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−ＮＨ2 及びＦＭＯＣ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2 に対してそれ
ぞれカップリングさせた。即ち、ＤＭＦ５０μＬ中のそ
れぞれのぺプチド５μモル（３．５ｍｇ）をＤＭＳＯ８
５μＬ及びＤＭＦ５０μＬ中のＮ，Ｎ′−ジアセチルキ
トビオースグリコシルアミン１０μモル（３．７ｍｇ）
又はＭａｎ α３ （Ｍａｎα６） Ｘｙｌ β２ Ｍ
ａｎ β４ ＧｌｃＮＡｃ β４ （Ｆｕｃ α６）
ＧｌｃＮＡｃグリコシルアミン１μモルに加えた。Ｇａ
１β４Ｇ１ｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β４Ｇ１ｃ
ＮＡｃＭａｎα３）Ｍａｎβ４Ｇ１ｃＮＡｃβ４Ｇ１ｃ
ＮＡｃ０．６μモルについては、カップリング剤のＨＢ
ＴＵ（ＤＭＦ１００μＬ中１５μモル）に対してＦＭＯ
Ｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2
ぺプチド２μモルしか用いず、そしてグリコシルアミン
とぺプチドとの混合物に触媒のＨＯＢＴ（ＤＭＦ５０μ
Ｌ中５μモル）を加えた。反応混合物をピアース（Ｐｉ
ｅｒｃｅ）ガラスバイアル中で室温において攪拌し、そ
してＨＰＬＣ Ｃ４分析カラム（溶離条件：２０分で５
〜１００％のアセトニトリル）により糖ぺプチドの分析
を行った。糖ぺプチドの合成は、Ｍａｎ α３ （Ｍａ
ｎα６） （Ｘｙｌ β２） Ｍａｎβ４ ＧｌｃＮＡ
ｃ β４ （Ｆｕｃ α６） ＧｌｃＮＡｃグリコシル
アミンについては４〜５日で、またＧａ１β４Ｇ１ｃＮ
Ａｃβ２Ｍａｎα６（Ｇａ１β４Ｇ１ｃＮＡｃＭａｎα
３）Ｍａｎβ４Ｇ１ｃＮＡｃβ４Ｇ１ｃＮＡｃについて
は１日で生じたのに比較してＮ，Ｎ′−ジアセチルキト
ビオースグリコシルアミンについては４時間で生じた。
生成物を糖及びアミノ酸の組成の存在についてはピコタ
グ（Ｐｉｃｏｔａｇ）法で、また質量についてはラサマ
ット（Ｌａｓｅｒｍａｔ）機を使用するレーザー脱着質
量分析法で分析した（図１１及び１２）。
【０１０６】糖のアトリオぺプチン類縁体に体する結合 １．グリコシルアミンの製造 Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミン
の形成は次のようにして行った。即ち、Ｎ，Ｎ′−ジア
セチルキトビオース５ｍｇを回転蒸発により乾固し、そ
れを滅菌水を用いて調製した飽和重炭酸アンモニウム
（１Ｍ）２００μＬに再懸濁させた。次に、固体重炭酸
アンモニウムを加えてインキュベーション期間中その溶
液の飽和を維持した。その管をパラフィルムで密封し、
次いでニードルを用いて穴をあけた（塩の分解により発
生するアンモニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にす
る）。３０℃において３〜４日間インキュベートした
後、グリコシルアミン製造物を反応混合物の蒸留水１ｍ
Ｌ中での直接凍結乾燥により脱塩した。グリコシルアミ
ンの試料をＴＬＣと 1Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
の形成は次のようにして行った。即ち、Ｎ，Ｎ′−ジア
セチルキトビオース５ｍｇを回転蒸発により乾固し、そ
れを滅菌水を用いて調製した飽和重炭酸アンモニウム
（１Ｍ）２００μＬに再懸濁させた。次に、固体重炭酸
アンモニウムを加えてインキュベーション期間中その溶
液の飽和を維持した。その管をパラフィルムで密封し、
次いでニードルを用いて穴をあけた（塩の分解により発
生するアンモニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にす
る）。３０℃において３〜４日間インキュベートした
後、グリコシルアミン製造物を反応混合物の蒸留水１ｍ
Ｌ中での直接凍結乾燥により脱塩した。グリコシルアミ
ンの試料をＴＬＣと 1Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０１０７】２．グリコシルアミンのアトリオぺプチン
類縁体に対するカップリング Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミン
を次の手順を用いてアトリオぺプチン類縁体Ａ及びＤに
対してカップリングさせた（図１０）。即ち、ＤＭＦ５
０μＬ中ぺプチド１ｍｇ（０．４μモル）をＤＭＳＯ８
５μＬ及びＤＭＦ５０μＬ中のＮ，Ｎ′−ジアセチルキ
トビオースグリコシルアミン１μモルに加えた。グリコ
シルアミンとぺプチドとの混合物にカップリング剤のＨ
ＢＴＵ（ＤＭＦ１００μＬ中１．２μモル）及び触媒の
ＨＯＢＴ（ＤＭＦ５０μＬ中０．５μモル）を加えた。
反応混合物をピアースガラスバイアル中で室温において
攪拌し、そしてＨＰＬＣ Ｃ４分析カラム（溶離条件：
２０分で５〜１００％のアセトニトリル）により糖ぺプ
チドの分析を行った（図１３）。糖ぺプチドの合成は４
時間で生じた。生成物を糖及びアミノ酸の組成の存在に
ついてはザンツェ（Ｚａｍｚｅ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ，、２６６、２０２４４−２０２６１（１９９
１）に記載するウォータース ピコタグ法で、また質量
についてはフィニガン ラサマット（Ｆｉｎｎｉｇａｎ
Ｌａｓｅｒｍａｔ）機を使用するレーザー脱着質量分
析法で分析した。
類縁体に対するカップリング Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースのグリコシルアミン
を次の手順を用いてアトリオぺプチン類縁体Ａ及びＤに
対してカップリングさせた（図１０）。即ち、ＤＭＦ５
０μＬ中ぺプチド１ｍｇ（０．４μモル）をＤＭＳＯ８
５μＬ及びＤＭＦ５０μＬ中のＮ，Ｎ′−ジアセチルキ
トビオースグリコシルアミン１μモルに加えた。グリコ
シルアミンとぺプチドとの混合物にカップリング剤のＨ
ＢＴＵ（ＤＭＦ１００μＬ中１．２μモル）及び触媒の
ＨＯＢＴ（ＤＭＦ５０μＬ中０．５μモル）を加えた。
反応混合物をピアースガラスバイアル中で室温において
攪拌し、そしてＨＰＬＣ Ｃ４分析カラム（溶離条件：
２０分で５〜１００％のアセトニトリル）により糖ぺプ
チドの分析を行った（図１３）。糖ぺプチドの合成は４
時間で生じた。生成物を糖及びアミノ酸の組成の存在に
ついてはザンツェ（Ｚａｍｚｅ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ，、２６６、２０２４４−２０２６１（１９９
１）に記載するウォータース ピコタグ法で、また質量
についてはフィニガン ラサマット（Ｆｉｎｎｉｇａｎ
Ｌａｓｅｒｍａｔ）機を使用するレーザー脱着質量分
析法で分析した。
【０１０８】実施例８ ネオ糖蛋白質の合成法 免疫抑制性ネオ糖蛋白質の合成 序論 糖蛋白質は明らかに蛋白質の最も大きな群をなす。ほ乳
動物、植物、昆虫の組織等、ほとんど全ての細胞表面及
び循環性（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）蛋白質にはセリン
若しくはトレオニンへのＯ−結合か又はアスパラギンへ
のＮ−結合のいずれかを介して炭水化物が結合、含有さ
れている。更に、多数の炭水化物結合性蛋白質は循環性
であるか、又は細胞表面が関係していることが見い出さ
れている。これらの炭水化物結合性蛋白質の１つの特徴
はそれらが糖蛋白質で架橋結合され得ることである。こ
れは、ほとんどの糖蛋白質は多種多様なグリコシル化部
位を含有するか、又は１つより多いグリコシル化された
サブユニットを含有すると言う事実から来ている。
動物、植物、昆虫の組織等、ほとんど全ての細胞表面及
び循環性（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）蛋白質にはセリン
若しくはトレオニンへのＯ−結合か又はアスパラギンへ
のＮ−結合のいずれかを介して炭水化物が結合、含有さ
れている。更に、多数の炭水化物結合性蛋白質は循環性
であるか、又は細胞表面が関係していることが見い出さ
れている。これらの炭水化物結合性蛋白質の１つの特徴
はそれらが糖蛋白質で架橋結合され得ることである。こ
れは、ほとんどの糖蛋白質は多種多様なグリコシル化部
位を含有するか、又は１つより多いグリコシル化された
サブユニットを含有すると言う事実から来ている。
【０１０９】糖蛋白質のグリコシル化は不均一である。
糖蛋白質は、従って、グリコ体集団（蛋白質は同一であ
るが、炭水化物が異なる）より成る。それはグリコシル
化の細胞タイプを特異性にする各グリコ体の相対的なモ
ル割合における定性的及び定量的変化である。これまで
は、均一なグリコシル化度の糖蛋白質を実験的に製造す
る方法もグリコ体集団を別々のグリコ体に分離する方法
もなかった。従って、蛋白質当りに多数の炭水化物鎖を
有する均一な炭水化物構造のグリコ体を製造する方法が
あることが望ましい。
糖蛋白質は、従って、グリコ体集団（蛋白質は同一であ
るが、炭水化物が異なる）より成る。それはグリコシル
化の細胞タイプを特異性にする各グリコ体の相対的なモ
ル割合における定性的及び定量的変化である。これまで
は、均一なグリコシル化度の糖蛋白質を実験的に製造す
る方法もグリコ体集団を別々のグリコ体に分離する方法
もなかった。従って、蛋白質当りに多数の炭水化物鎖を
有する均一な炭水化物構造のグリコ体を製造する方法が
あることが望ましい。
【０１１０】本実施例は炭水化物の１−Ｎ−グリコシル
−β−誘導体の合成、これら化合物とチオホスゲンとの
イソチオシアネートを与える反応及びこれら中間体と非
グリコシル化蛋白質キャリアーとの反応を説明するもの
である。これらのものの１つであるゲンチオビオース−
ＨＳＡは１０-9Ｍの濃度で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
を抑制することができる（図１５）。単一のオリゴサッ
カリドの多数のコピーを含有するこれらネオ糖蛋白質に
は医学研究や治療用途に広い応用分野がある。
−β−誘導体の合成、これら化合物とチオホスゲンとの
イソチオシアネートを与える反応及びこれら中間体と非
グリコシル化蛋白質キャリアーとの反応を説明するもの
である。これらのものの１つであるゲンチオビオース−
ＨＳＡは１０-9Ｍの濃度で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
を抑制することができる（図１５）。単一のオリゴサッ
カリドの多数のコピーを含有するこれらネオ糖蛋白質に
は医学研究や治療用途に広い応用分野がある。
【０１１１】方法 ネオ糖蛋白質の合成 １．グリコシルアミンの製造 ５．８個の糖＝Ｍａｎ α３ （Ｍａｎ α６） （Ｘ
ｙｌ β２） Ｍａｎβ４ ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ，Ｎ′−
ジアセチルキトビオース及びゲンチオビオースのグリコ
シルアミンの形成は次のようにして行った。即ち、これ
ら３種の糖試料各１ｍｇを回転蒸発により乾固し、それ
を滅菌水を用いて調製した飽和重炭酸アンモニウム（１
Ｍ）２００μＬに再懸濁させた。次に、固体重炭酸アン
モニウムを加えてインキュベーション期間中その溶液の
飽和を維持した。それらの管をパラフィルムで密封し、
次いでニードルを用いて穴をあけた（塩の分解により発
生するアンモニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にす
る）。３０℃において３〜４日間インキュベートした
後、グリコシルアミン製造物を反応混合物の蒸留水１ｍ
Ｌ中での直接凍結乾燥により脱塩した。
ｙｌ β２） Ｍａｎβ４ ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ，Ｎ′−
ジアセチルキトビオース及びゲンチオビオースのグリコ
シルアミンの形成は次のようにして行った。即ち、これ
ら３種の糖試料各１ｍｇを回転蒸発により乾固し、それ
を滅菌水を用いて調製した飽和重炭酸アンモニウム（１
Ｍ）２００μＬに再懸濁させた。次に、固体重炭酸アン
モニウムを加えてインキュベーション期間中その溶液の
飽和を維持した。それらの管をパラフィルムで密封し、
次いでニードルを用いて穴をあけた（塩の分解により発
生するアンモニアと二酸化炭素を逃がすのを可能にす
る）。３０℃において３〜４日間インキュベートした
後、グリコシルアミン製造物を反応混合物の蒸留水１ｍ
Ｌ中での直接凍結乾燥により脱塩した。
【０１１２】２．Ｎ−グリシル誘導体の製造 （ａ）グリコシルアミンのＮ−クロロアセチル化 上記３種のグリコシルアミンをＮ−クロロアセチル化と
アンモノリシスとの組み合わせを用い、それらのＮ−ク
ロロアセトアミド誘導体を経由してそれらの１−Ｎ−グ
リシル−β−誘導体に転化した。即ち、それらグリコシ
ルアミンの各々を１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μＬに溶
解し、氷冷した。これに５倍モル過剰の固体無水クロロ
酢酸を加え、その反応混合物を室温まで加温した。ｐＨ
を重炭酸ナトリウムを必要なときに添加することによっ
て７．０以上に保持した。反応の進行を溶剤として７：
４（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水及び０．０５％のジ
アミノブタンを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）でモニターした。反応の完結に全３時間を要した。
クロロアセチル化に続いて、混合物をダウエックスＡＧ
５０−Ｘ１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂がＡＧ３−Ｘ４
Ａ（ＯＨ- ）アニオン交換樹脂の上に層をなして配置さ
れているカラムを覆って通過させることによって脱塩し
た。溶離剤を集め、蒸発乾固し、水２００μＬに再懸濁
させ、その後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣにより分析した。
アンモノリシスとの組み合わせを用い、それらのＮ−ク
ロロアセトアミド誘導体を経由してそれらの１−Ｎ−グ
リシル−β−誘導体に転化した。即ち、それらグリコシ
ルアミンの各々を１Ｍ重炭酸ナトリウム１００μＬに溶
解し、氷冷した。これに５倍モル過剰の固体無水クロロ
酢酸を加え、その反応混合物を室温まで加温した。ｐＨ
を重炭酸ナトリウムを必要なときに添加することによっ
て７．０以上に保持した。反応の進行を溶剤として７：
４（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水及び０．０５％のジ
アミノブタンを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）でモニターした。反応の完結に全３時間を要した。
クロロアセチル化に続いて、混合物をダウエックスＡＧ
５０−Ｘ１２（Ｈ+ ）カチオン交換樹脂がＡＧ３−Ｘ４
Ａ（ＯＨ- ）アニオン交換樹脂の上に層をなして配置さ
れているカラムを覆って通過させることによって脱塩し
た。溶離剤を集め、蒸発乾固し、水２００μＬに再懸濁
させ、その後 1Ｈ−ＮＭＲ及びＴＬＣにより分析した。
【０１１３】（ｂ）Ｎ−クロロアセチル化グリコシルア
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化混合物の各々を飽和重炭酸アンモ
ニウム５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸発に
よるアンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃において１
夜インキュベートした。次に、重炭酸アンモニウムを蒸
留水１ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
ミンのアンモノリシス 上記クロロアセチル化混合物の各々を飽和重炭酸アンモ
ニウム５００μＬに溶解し、ガラス管に封入して蒸発に
よるアンモニアの減損を防ぎ、そして５０℃において１
夜インキュベートした。次に、重炭酸アンモニウムを蒸
留水１ｍＬ中での直接凍結乾燥により除去した。
【０１１４】３．Ｎ−グリシルイソチオシアネート誘導
体の製造 上記３種の糖の各々の１−Ｎ−グリシル−β−誘導体を
ｐＨ８．５の０．１ＭＮａＨＣＯ3 １ｍＬに溶解し、そ
してチオホスゲン（２．５倍モル過剰）を含有するクロ
ロホルム１．２５ｍＬの上に層となした。これらの反応
混合物を換気されたヒュームフードの中で室温において
少なくとも１時間攪拌した。それら反応混合物をクロロ
ホルム１ｍＬで４回抽出した。エッペンドルフ遠心機中
での混合物の最終回転の後上層の水性層を注意深く除去
した。
体の製造 上記３種の糖の各々の１−Ｎ−グリシル−β−誘導体を
ｐＨ８．５の０．１ＭＮａＨＣＯ3 １ｍＬに溶解し、そ
してチオホスゲン（２．５倍モル過剰）を含有するクロ
ロホルム１．２５ｍＬの上に層となした。これらの反応
混合物を換気されたヒュームフードの中で室温において
少なくとも１時間攪拌した。それら反応混合物をクロロ
ホルム１ｍＬで４回抽出した。エッペンドルフ遠心機中
での混合物の最終回転の後上層の水性層を注意深く除去
した。
【０１１５】４．ネオ糖蛋白質を形成する蛋白質の複合 糖５．８個及びＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの１
−Ｎ−グリシル−β−イソチオシアネートをウシ血清ア
ルブミンに複合させ、これに対してゲンチビオースの同
じ誘導体をヒト血清アルブミンに複合させた。即ち、上
記水性層を色々な量の蛋白質を含有する０．１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ3 中０．３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ１０）１ｍＬに直
接加えた（使用した糖対蛋白質のモル比はそれぞれ６：
１、１０：１及び５：１／３０：１であった）。それら
の反応混合物を室温で１夜攪拌した。ネオ糖蛋白質類を
３回の水の変化に対して透析し、そして凍結乾燥した。
炭水化物対蛋白質のモル比をピコタグ法で測定すると、
それぞれ１３、１６及び２５であった。Ｎ，Ｎ′−ジア
セチルキトビオース及び５．８個の糖のウシ血清アルブ
ミンネオ糖蛋白質もＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で分析し、そしてそれぞれアンチ−ＧｌｃＮＡ
ｃ抗体及びジスコイジン（レクチン）に対するそれらの
結合について試験した（図１６）。ゲンチオビオース−
ヒト血清アルブミンネオ糖蛋白質を用いて混合リンパ球
反応を抑制した（図１５）。
−Ｎ−グリシル−β−イソチオシアネートをウシ血清ア
ルブミンに複合させ、これに対してゲンチビオースの同
じ誘導体をヒト血清アルブミンに複合させた。即ち、上
記水性層を色々な量の蛋白質を含有する０．１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ3 中０．３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ１０）１ｍＬに直
接加えた（使用した糖対蛋白質のモル比はそれぞれ６：
１、１０：１及び５：１／３０：１であった）。それら
の反応混合物を室温で１夜攪拌した。ネオ糖蛋白質類を
３回の水の変化に対して透析し、そして凍結乾燥した。
炭水化物対蛋白質のモル比をピコタグ法で測定すると、
それぞれ１３、１６及び２５であった。Ｎ，Ｎ′−ジア
セチルキトビオース及び５．８個の糖のウシ血清アルブ
ミンネオ糖蛋白質もＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で分析し、そしてそれぞれアンチ−ＧｌｃＮＡ
ｃ抗体及びジスコイジン（レクチン）に対するそれらの
結合について試験した（図１６）。ゲンチオビオース−
ヒト血清アルブミンネオ糖蛋白質を用いて混合リンパ球
反応を抑制した（図１５）。
【０１１６】５．プラスチック表面に不動態化された
Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースＢＳＡネオ糖蛋白質
に対するアンチ−Ｇｌｃ抗体の結合 全ての手順を室温で行った。各希釈度のＮ，Ｎ′−ジア
セチルキトビオース−ＢＳＡネオ糖蛋白質（糖１３個／
ＢＳＡ）の連続希釈物を９６ウェル ファルコン プラ
スチック エリサプレート中で２時間インキュベートし
た（出発濃度：蛋白質１．５ｍｇ／ｍＬ）。未結合ネオ
糖蛋白質をＰＢＳ中で洗い落とした。次に、ファルコン
プレートをＰＢＳ中４％のＢＳＡを用いて２時間急冷し
た。ＰＢＳ中で数回洗浄した後、ファルコンプレートを
アンチ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体（ＩｇＭサブ
クラス）の溶液（希釈度１：１０００）５０μＬと共に
更に２時間インキュベートした。未結合の抗体を、プレ
ートをＰＢＳで数回洗浄することによって除去した。ア
ンチ−ＧｌｃＮＡｃ抗体の検出はプレートをアンチ−μ
−ワサビダイコンペルオキシダーゼ複合物（希釈度１：
５００）と共に２時間インキュベートすることによって
行った。過剰の複合物はＰＢＳ中で数回洗浄することに
よって除去した。エリサをワサビダイコンペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）用の基質の添加により完結させた。０．
１５Ｍのクエン酸塩燐酸塩緩衝液中ＡＢＴＳ（１２．５
ｍｇ／ｍＬ）（ｐＨ５．０）５０μＬを各ウェルに０．
１５％のＨ2 Ｏ2 と共に加えた。色が１５〜２０分間発
現した。４９２〜６２０ｎｍにおける吸光度を読み取っ
た（図１７）。
Ｎ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースＢＳＡネオ糖蛋白質
に対するアンチ−Ｇｌｃ抗体の結合 全ての手順を室温で行った。各希釈度のＮ，Ｎ′−ジア
セチルキトビオース−ＢＳＡネオ糖蛋白質（糖１３個／
ＢＳＡ）の連続希釈物を９６ウェル ファルコン プラ
スチック エリサプレート中で２時間インキュベートし
た（出発濃度：蛋白質１．５ｍｇ／ｍＬ）。未結合ネオ
糖蛋白質をＰＢＳ中で洗い落とした。次に、ファルコン
プレートをＰＢＳ中４％のＢＳＡを用いて２時間急冷し
た。ＰＢＳ中で数回洗浄した後、ファルコンプレートを
アンチ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体（ＩｇＭサブ
クラス）の溶液（希釈度１：１０００）５０μＬと共に
更に２時間インキュベートした。未結合の抗体を、プレ
ートをＰＢＳで数回洗浄することによって除去した。ア
ンチ−ＧｌｃＮＡｃ抗体の検出はプレートをアンチ−μ
−ワサビダイコンペルオキシダーゼ複合物（希釈度１：
５００）と共に２時間インキュベートすることによって
行った。過剰の複合物はＰＢＳ中で数回洗浄することに
よって除去した。エリサをワサビダイコンペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）用の基質の添加により完結させた。０．
１５Ｍのクエン酸塩燐酸塩緩衝液中ＡＢＴＳ（１２．５
ｍｇ／ｍＬ）（ｐＨ５．０）５０μＬを各ウェルに０．
１５％のＨ2 Ｏ2 と共に加えた。色が１５〜２０分間発
現した。４９２〜６２０ｎｍにおける吸光度を読み取っ
た（図１７）。
【化１１】
【０１１７】上式はグリコシルアミンの１−Ｎ−クロロ
アセトアミド誘導体の形成による簡単なスペーサー基の
導入式（工程２）である。これは次いでアンモノリシス
により１−Ｎ−グリシル誘導体に転化可能である（工程
３）。この１−Ｎ−グリシル誘導体はオリゴサッカリド
プローブの形成のための基本的中間体をなす。
アセトアミド誘導体の形成による簡単なスペーサー基の
導入式（工程２）である。これは次いでアンモノリシス
により１−Ｎ−グリシル誘導体に転化可能である（工程
３）。この１−Ｎ−グリシル誘導体はオリゴサッカリド
プローブの形成のための基本的中間体をなす。
【０１１８】実施例９ ネオ糖脂質の合成法 序論 糖脂質は全ての細胞膜の重要な成分である。糖蛋白質と
同様に、糖脂質も極めて不均一で、精製するのが困難で
ある。糖脂質は多数の病気の治療剤として提案されて来
た。急性脊髄損傷の治療におけるそれらの効能が最近証
明された。この場合は、しかし、天然産の糖脂質の混合
物が注射された。それ故、糖脂質を化学的に定義された
成分を用いて容易に合成することができる方法があると
有利であろう。
同様に、糖脂質も極めて不均一で、精製するのが困難で
ある。糖脂質は多数の病気の治療剤として提案されて来
た。急性脊髄損傷の治療におけるそれらの効能が最近証
明された。この場合は、しかし、天然産の糖脂質の混合
物が注射された。それ故、糖脂質を化学的に定義された
成分を用いて容易に合成することができる方法があると
有利であろう。
【０１１９】本実施例は炭水化物の１−Ｎ−β−グリシ
ル誘導体のイソチオシアネートをモノオクチルアミンか
ビスオクチルアミンのいずれかにカップリングさせるこ
とによるネオ糖脂質の合成を説明するものである。
ル誘導体のイソチオシアネートをモノオクチルアミンか
ビスオクチルアミンのいずれかにカップリングさせるこ
とによるネオ糖脂質の合成を説明するものである。
【０１２０】方法 脂質へのネオ糖脂質を形成する複合 ＬＮＦＰＩＩＩ（＝Ｇａ１β４（Ｆｕｃα３）Ｇ１ｃＮ
Ａｃβ３Ｇａ１β４Ｇａｌ）の１−Ｎ−グリシル−β−
グリコシルアミンのイソチオアネート誘導体（〜０．６
μモル）をＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ（１：１）中でオクチ
ルアミン（３μモル）又はジ−ｎ−オクチルアミン（３
μモル）に複合させた。これらの反応混合物を１夜攪拌
し、続いて回転蒸発により乾燥した。乾燥された混合物
をＣＨＣｌ3 ：Ｈ2 Ｏ（１：１）で３回抽出して未結合
糖誘導体を除去した。ＣＨＣｌ3層を最後に回転蒸発に
より乾燥し、そして溶剤としてＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ
（１：１）を使用するＴＬＣ分析のためにＣＨＣｌ3 ：
ＭｅＯＨ（１：１）に再懸濁させた。オクチルアミンと
ジ−ｎ−オクチルアミンは共にニンヒドリンに感受性
で、それぞれ０．６２及び０．８１のＲｆ値を有する。
両ネオ糖脂質はニンヒドリンに対して陰性である。対照
的に、オクチルアミンとジ−ｎ−オクチルアミンの両者
はオルシノール不感受性であり、これに対してネオ糖脂
質はそのオルシノールと反応する。ＬＮＦＰＩＩＩ−オ
クチルアミンネオ糖脂質及びＬＮＦＰＩＩＩ−ジ−ｎ−
オクチルアミンネオ糖脂質のＲｆはそれぞれ０．８６及
び０．８４であった。非複合ＬＮＦＰＩＩＩはオルシノ
ール感受性で、Ｒｆ値＝０．８８を有する。
Ａｃβ３Ｇａ１β４Ｇａｌ）の１−Ｎ−グリシル−β−
グリコシルアミンのイソチオアネート誘導体（〜０．６
μモル）をＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ（１：１）中でオクチ
ルアミン（３μモル）又はジ−ｎ−オクチルアミン（３
μモル）に複合させた。これらの反応混合物を１夜攪拌
し、続いて回転蒸発により乾燥した。乾燥された混合物
をＣＨＣｌ3 ：Ｈ2 Ｏ（１：１）で３回抽出して未結合
糖誘導体を除去した。ＣＨＣｌ3層を最後に回転蒸発に
より乾燥し、そして溶剤としてＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ
（１：１）を使用するＴＬＣ分析のためにＣＨＣｌ3 ：
ＭｅＯＨ（１：１）に再懸濁させた。オクチルアミンと
ジ−ｎ−オクチルアミンは共にニンヒドリンに感受性
で、それぞれ０．６２及び０．８１のＲｆ値を有する。
両ネオ糖脂質はニンヒドリンに対して陰性である。対照
的に、オクチルアミンとジ−ｎ−オクチルアミンの両者
はオルシノール不感受性であり、これに対してネオ糖脂
質はそのオルシノールと反応する。ＬＮＦＰＩＩＩ−オ
クチルアミンネオ糖脂質及びＬＮＦＰＩＩＩ−ジ−ｎ−
オクチルアミンネオ糖脂質のＲｆはそれぞれ０．８６及
び０．８４であった。非複合ＬＮＦＰＩＩＩはオルシノ
ール感受性で、Ｒｆ値＝０．８８を有する。
【０１２１】他の色々な例は前記の特許請求の範囲の精
神と範囲から逸脱することなく本明細書の開示を読めば
当業者には明白であって、そのような他の例も全て前記
特許請求の範囲内に含まれるものである。例えば、特許
請求されるＮ−結合糖複合体は１−Ｎ−グリシル−β−
グリコシルアミンのイソチオシアネート誘導体の多数の
複合部位（クラスターリガンド）を含有するもののよう
な他のキャリアーの使用によって製造することができ
る。例を挙げると、ポリ−Ｌ−リシン、アミノ誘導体化
剤、１，３，５−トリアゼン−２，４，６−トノアミ
ン、モノ−及びビス−オクチルアミンのような脂質のア
ミノ誘導体並びに各種固体支持体が有用なキャリアーで
ある。また、他の蛍光団、脂質、ぺプチド、蛋白質及び
プラスチック表面もＮ−結合グリコ複合体を形成する際
に実質的に同様の結果を以て本明細書で具体的に説明し
た物質に代えて用いることができる。
神と範囲から逸脱することなく本明細書の開示を読めば
当業者には明白であって、そのような他の例も全て前記
特許請求の範囲内に含まれるものである。例えば、特許
請求されるＮ−結合糖複合体は１−Ｎ−グリシル−β−
グリコシルアミンのイソチオシアネート誘導体の多数の
複合部位（クラスターリガンド）を含有するもののよう
な他のキャリアーの使用によって製造することができ
る。例を挙げると、ポリ−Ｌ−リシン、アミノ誘導体化
剤、１，３，５−トリアゼン−２，４，６−トノアミ
ン、モノ−及びビス−オクチルアミンのような脂質のア
ミノ誘導体並びに各種固体支持体が有用なキャリアーで
ある。また、他の蛍光団、脂質、ぺプチド、蛋白質及び
プラスチック表面もＮ−結合グリコ複合体を形成する際
に実質的に同様の結果を以て本明細書で具体的に説明し
た物質に代えて用いることができる。
【０１２２】配列番号：１ 配列の長さ：アミノ酸５個 配列の型：アミノ酸 トポロジー：線形 配列の種類：ぺプチド
【０１２３】配列番号：２ 配列の長さ：アミノ酸５個 配列の型：アミノ酸 トポロジー：線形 配列の種類：ぺプチド
【０１２４】配列番号：３ 配列の長さ：アミノ酸５個 配列の型：アミノ酸 トポロジー：線形 配列の種類：ぺプチド
【図１】図１はグリコシルアミンの変旋光性と加水分解
性のｐＨ依存性を示すグラフである。
性のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図２】図２は凍結乾燥中のオリゴサッカリドからの重
炭酸アンモニウムの除去と時間の関係を示すグラフであ
る。
炭酸アンモニウムの除去と時間の関係を示すグラフであ
る。
【図３】図３は本発明の１つの態様における、オリゴサ
ッカリドの飽和重炭酸アンモニウム中でのインキュベー
ション中のグリコシルアミンの形成速度を示すグラフで
ある。
ッカリドの飽和重炭酸アンモニウム中でのインキュベー
ション中のグリコシルアミンの形成速度を示すグラフで
ある。
【図４】図４は図３のグリコシルアミンのクロロアセチ
ル化によって得られた生成物のＨＰＬＣ溶離プロフィー
ルを示すグラフである。
ル化によって得られた生成物のＨＰＬＣ溶離プロフィー
ルを示すグラフである。
【図５】図５は図４のクロロアセチル化グリコシルアミ
ンのアンモノリシスにより得られた生成物のＨＰＬＣ溶
離プロフィールを示すグラフである。
ンのアンモノリシスにより得られた生成物のＨＰＬＣ溶
離プロフィールを示すグラフである。
【図６】図６は図５の如き第二のアンモノリシス反応の
完結を示すグラフである。
完結を示すグラフである。
【図７】図７は本発明のもう一つの態様における、Ｎ−
アセチルグルコサミンのＮ−グリシル−グリコシルアミ
ンのフルオレセイン誘導体の逆相ＨＰＬＣ溶離プロフィ
ールを示すグラフである。
アセチルグルコサミンのＮ−グリシル−グリコシルアミ
ンのフルオレセイン誘導体の逆相ＨＰＬＣ溶離プロフィ
ールを示すグラフである。
【図８】図８は蛍光標識付きオリゴサッカリドの説明図
である。図８ＡはＧＬｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇｌｃ
ＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４Ｇ
ｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃの１−Ｎ−グリシル−β−
グリコシルアミンのＦＩＴＣ−Ｇ（０）フルオレセイン
誘導体の構造を示す図である。図８ＢはＦＩＴＣ−Ｇ
（０）の易動度と純度を示す、蛍光検出によるＨＰＬＣ
クロマトグラムである。図８Ｃは予想された化合物の分
子量を１７６０ｍ／Ｚとして確認しているレーザー脱着
質量分析のグラフである。
である。図８ＡはＧＬｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｇｌｃ
ＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４Ｇ
ｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃの１−Ｎ−グリシル−β−
グリコシルアミンのＦＩＴＣ−Ｇ（０）フルオレセイン
誘導体の構造を示す図である。図８ＢはＦＩＴＣ−Ｇ
（０）の易動度と純度を示す、蛍光検出によるＨＰＬＣ
クロマトグラムである。図８Ｃは予想された化合物の分
子量を１７６０ｍ／Ｚとして確認しているレーザー脱着
質量分析のグラフである。
【図９】図９はＩｇＭアンチ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（ＧＮ
７）の、Ｎ′，Ｎ′−ジアセチルキトビオースにより誘
導体化されたファルコン プレマリアペトリ皿に対する
結合を示すグラフであって、ＸはＰＢＳ対照であり、点
はアンチ−ＧＮ７抗体の色々な希釈度である。
７）の、Ｎ′，Ｎ′−ジアセチルキトビオースにより誘
導体化されたファルコン プレマリアペトリ皿に対する
結合を示すグラフであって、ＸはＰＢＳ対照であり、点
はアンチ−ＧＮ７抗体の色々な希釈度である。
【図１０】図１０は糖の結合位置が箱で示されている、
アトリオぺプチンＡ及びＤのネオ糖ぺプチド類縁体の模
式図である。
アトリオぺプチンＡ及びＤのネオ糖ぺプチド類縁体の模
式図である。
【図１１】図１１Ａはｍ／Ｚ２５４２の出発物質プラス
糖２９６３ｍＺである、Ｎ′，Ｎ′−ジアセチルキトビ
オースによる誘導体化を行った後の類縁体・アトリオぺ
プチンＡの分子質量を示すレーザー脱着質量分析図であ
る。図１１Ｂはｍ／Ｚ２５９９の出発物質プラス糖３０
０７ｍＺである、Ｎ′，Ｎ′−ジアセチルキトビオース
による誘導体化を行った後の類縁体・アトリオぺプチン
Ｂの分子質量を示すレーザー脱着質量分析図である。
糖２９６３ｍＺである、Ｎ′，Ｎ′−ジアセチルキトビ
オースによる誘導体化を行った後の類縁体・アトリオぺ
プチンＡの分子質量を示すレーザー脱着質量分析図であ
る。図１１Ｂはｍ／Ｚ２５９９の出発物質プラス糖３０
０７ｍＺである、Ｎ′，Ｎ′−ジアセチルキトビオース
による誘導体化を行った後の類縁体・アトリオぺプチン
Ｂの分子質量を示すレーザー脱着質量分析図である。
【図１２】図１２Ａは誘導体化前（ａ）の指定されたぺ
プチドの分子質量を示すレーザー脱着質量分析図であ
る。図１２Ｂは誘導体化後（ｂ）の指定されたぺプチド
の分子質量を示すレーザー脱着質量分析図である。
プチドの分子質量を示すレーザー脱着質量分析図であ
る。図１２Ｂは誘導体化後（ｂ）の指定されたぺプチド
の分子質量を示すレーザー脱着質量分析図である。
【図１３】図１３はＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎ
α６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎ
β４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＦＭＯＣ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2 のβ−グ
リコシルアミンのＨＯＢＴ及びＨＢＴＵの存在下におけ
る反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
α６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎ
β４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＦＭＯＣ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2 のβ−グ
リコシルアミンのＨＯＢＴ及びＨＢＴＵの存在下におけ
る反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４】図１４はＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎ
α６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎ
β４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＦＭＯＣ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2 のβ−グ
リコシルアミンのＨＯＢＴ及びＨＢＴＵの存在下におけ
る反応によって形成された糖ぺプチドのレーザー脱着質
量分析図である。
α６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎ
β４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＦＭＯＣ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ2 のβ−グ
リコシルアミンのＨＯＢＴ及びＨＢＴＵの存在下におけ
る反応によって形成された糖ぺプチドのレーザー脱着質
量分析図である。
【図１５】図１５は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけ
るリンパ球の増殖に及ぼすネオ糖蛋白質ＨＳＡ−ゲンチ
オビオースの影響を示すグラフである。組み込まれた 3
Ｈ−チミジンの量（ｃｐｍ）はゲンチオビオース単独、
ＨＳＡ、ＨＳＡ（ゲンチオビオース）5 及びＨＳＡ（ゲ
ンチオビオース）30の添加４日後に測定した。ｃｐｍの
減少はリンパ球の増殖の抑制を示す。図１５ＡはＭＬＲ
培養物に色々な濃度のゲンチオビオース単独を添加した
場合の同グラフである。図１５ＢはＭＬＲ培養物に色々
な濃度のＨＳＡを添加した場合の同グラフである。図１
５ＣはＭＬＲ培養物に色々な濃度のＨＳＡ（ゲンチオビ
オース）5 を添加した場合の同グラフである。図１５Ｄ
はＭＬＲ培養物に色々な濃度のＨＳＡ（ゲンチオビオー
ス）30を添加した場合の同グラフである。
るリンパ球の増殖に及ぼすネオ糖蛋白質ＨＳＡ−ゲンチ
オビオースの影響を示すグラフである。組み込まれた 3
Ｈ−チミジンの量（ｃｐｍ）はゲンチオビオース単独、
ＨＳＡ、ＨＳＡ（ゲンチオビオース）5 及びＨＳＡ（ゲ
ンチオビオース）30の添加４日後に測定した。ｃｐｍの
減少はリンパ球の増殖の抑制を示す。図１５ＡはＭＬＲ
培養物に色々な濃度のゲンチオビオース単独を添加した
場合の同グラフである。図１５ＢはＭＬＲ培養物に色々
な濃度のＨＳＡを添加した場合の同グラフである。図１
５ＣはＭＬＲ培養物に色々な濃度のＨＳＡ（ゲンチオビ
オース）5 を添加した場合の同グラフである。図１５Ｄ
はＭＬＲ培養物に色々な濃度のＨＳＡ（ゲンチオビオー
ス）30を添加した場合の同グラフである。
【図１６】図１６ＡはＢＳＡとＮ，Ｎ′−ジアセチルキ
トビオースとのネオ糖蛋白質誘導体のＳＤＳ ＰＡＧＥ
を示し、レーンＡＩはＢＳＡ−（ＧｌｃＮＡｃβ４Ｇｌ
ｃＮＡｃ）16を、レーンＡＩＩはＢＳＡ予備誘導体化
を、そしてＳｔｄは標準ｍ．ｗ．マーカーをそれぞれ示
す。図１６ＢはＢＳＡと糖５．８個とのネオ糖蛋白質の
ＳＤＳ ＰＡＧＥを示し、レーンＢＩはＢＳＡ−（５，
８）13を、レーンＢＩＩはＢＳＡ予備誘導体化を、そし
てＳｔｄは標準ｍ．ｗ．マーカーをそれぞれ示す。
トビオースとのネオ糖蛋白質誘導体のＳＤＳ ＰＡＧＥ
を示し、レーンＡＩはＢＳＡ−（ＧｌｃＮＡｃβ４Ｇｌ
ｃＮＡｃ）16を、レーンＡＩＩはＢＳＡ予備誘導体化
を、そしてＳｔｄは標準ｍ．ｗ．マーカーをそれぞれ示
す。図１６ＢはＢＳＡと糖５．８個とのネオ糖蛋白質の
ＳＤＳ ＰＡＧＥを示し、レーンＢＩはＢＳＡ−（５，
８）13を、レーンＢＩＩはＢＳＡ予備誘導体化を、そし
てＳｔｄは標準ｍ．ｗ．マーカーをそれぞれ示す。
【図１７】図１７はＩｇＭ−アンチ−ＧｌｃＮＡｃ抗体
（ＧＮ７）のネオ糖蛋白質で誘導体化されたペトリ皿に
対する結合を示すグラフである。
（ＧＮ７）のネオ糖蛋白質で誘導体化されたペトリ皿に
対する結合を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イアン デビッド マンガー アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，マックファーソン アベニュー 4627 (72)発明者 トーマス ウィリアム ラデマッカー イギリス国オックスフォード ０エックス １ ３キューユー，サウス パークス ロ ード（番地なし）ユニバーシティ オブ オックスフォード デパートメント オブ バイオケミストリィ 気付 (72)発明者 シモン ユック チュン ウォング イギリス国オックスフォード ０エックス １ ３キューユー，サウス パークス ロ ード（番地なし）ユニバーシティ オブ オックスフォード デパートメント オブ バイオケミストリィ 気付
Claims (5)
- 【請求項１】 サッカリド単位数が最大で９個までの複
雑な未保護オリゴサッカリドを約８〜約８．５のｐＨに
おいて飽和重炭酸アンモニウムと反応させて該オリゴサ
ッカリドの未保護β−グリコシルアミン誘導体を形成
し、その後該未保護β−グリコシルアミン誘導体を、ア
ミノ酸残基数が約５〜約２５個であるペプチドであっ
て、該ペプチドと該未保護β−グリコシルアミン誘導体
との、β−グリコシルアミンが結合したグリコ複合体を
形成することができる活性化されたカルボキシル基を有
する該ペプチドと反応させることを含んで成る、ペプチ
ドの合成Ｎ−結合グリコ複合体をβ−アノマー配置を直
接保護する条件下で製造する方法。 - 【請求項２】 該ペプチドがペンタペプチドである、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該ぺンタペプチドを次の 【化１】 より成る群から選択する、請求項２に記載の方法。
- 【請求項４】 該ペプチドがアトリオペプチドである、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 該オリゴサッカリドの未保護β−グリコ
シルアミン誘導体と該ペプチドとをＤＭＦ約８５容量部
及びＤＭＳＯ約５０容量部の割合の溶剤混合物中で反応
させる、請求項４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/776,911 US5212298A (en) | 1989-08-16 | 1991-10-15 | Method for producing synthetic N-linked glycoconjugates |
| US776911 | 1992-08-11 | ||
| US07/926,786 US5280113A (en) | 1989-08-16 | 1992-08-11 | Method for producing synthetic N-linked glycoconjugates |
| US926786 | 1992-08-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05222099A true JPH05222099A (ja) | 1993-08-31 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4275945A Pending JPH05222099A (ja) | 1991-10-15 | 1992-10-14 | 合成ｎ−結合グリコ複合体の製造法 |
Country Status (4)
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|---|---|
| US (1) | US5280113A (ja) |
| EP (1) | EP0538230A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05222099A (ja) |
| CA (1) | CA2080502A1 (ja) |
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| WO2015111627A1 (ja) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | 味の素株式会社 | 糖アミノ酸およびその用途 |
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-
1992
- 1992-08-11 US US07/926,786 patent/US5280113A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-14 JP JP4275945A patent/JPH05222099A/ja active Pending
- 1992-10-14 CA CA002080502A patent/CA2080502A1/en not_active Abandoned
- 1992-10-14 EP EP92870165A patent/EP0538230A1/en not_active Withdrawn
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