JPH05247100A - 両生動物の卵の粘液性被膜からの抗原決定基を有するオリゴ糖 - Google Patents

両生動物の卵の粘液性被膜からの抗原決定基を有するオリゴ糖

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JPH05247100A
JPH05247100A JP30114592A JP30114592A JPH05247100A JP H05247100 A JPH05247100 A JP H05247100A JP 30114592 A JP30114592 A JP 30114592A JP 30114592 A JP30114592 A JP 30114592A JP H05247100 A JPH05247100 A JP H05247100A
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Sarudaniya Jose
サルダニャ ジョゼ
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 抗原決定基を有するオリゴ糖および対応する
抱合体ならびに当該抱合体を含むワクチンを提供する。 【構成】 抗原決定基を有する構造のフコシル化オリゴ
糖（たとえば式（Ａ）、式（Ｅ）の糖）ならびに当該オ
リゴ糖を適宜なリンカーの介助によって結合している担
体よりなる糖抱合体、かゝる糖抱合体を本質的に含有し
ているワクチン、上記のオリゴ糖抗原決定基に特異的に
向けられているモノクローンまたはポリクローン抗体、
両生動物類、好ましくはサンショウウオ科の両生類の腹
子の粘液性被膜から分離・精製することによる、上記の
フコジル化オリゴ糖の調製法および前記ワクチンを利用
したイムノアツセイ法。 〔式中ＸはＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ−オール、
ｎは０または１であり、ＧａｌはＤ−ガラクトース、Ｇ
ｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｇａｌ
ＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ＧａｌＮ
Ａｃ−オールは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニト
ール、ＦｕＣはＬ−フュース、ＫＤＮは３−デオキシ−
Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロソン酸を表す〕

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、下記一般式、すなわち
【０００２】
【化２】 の、実質的に純粋なかたちの新規の抗原決定基を含むオ
リゴ糖に関する。
【０００３】ただし、上記式においてＸは、ＧａｌＮＡ
ｃまたはＧａｌＮＡｃ−オール、ｎは、０または１、Ｇ
ａｌはＤ−ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン、ＧａｌＮＡｃは、Ｎ−アセチル
−Ｄ−ガラクトサミン、ＧａｌＮＡｃ−オールは、Ｎ−
アセチル−Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｆｕｃは、Ｌ−
フコース、そしてＫＤＮは、３−デオキシ−Ｄ−グリセ
ロ−Ｄ−ガラクトノヌロソン酸を表す。
【０００４】本発明はさらに、オリゴ糖（Ａ）〜（Ｉ）
の調製法に関し、これは粘液性被膜を、両生類の、とく
にサンショウウオ（salamander）科の両生動物の腹子か
ら分離し、それに含まれる糖タンパク質（ムチン）を化
学的に、とくに還元的β−除去によって切断し、そして
得られる遊離のオリゴ糖の混合物を天然型またはアルジ
トール型にクロマトグラフィーによって精製し、適宜、
式中のｎが０である一般式（Ａ）〜（Ｄ）の化合物の場
合にはＫＤＮ残基を化学的に除去することを特徴とす
る、オリゴ糖（Ａ）〜（Ｉ）の調製法に関する。
【０００５】本発明はさらに、糖成分が、適宜、リンカ
ーを介して担体に結合しており、一般式（Ａ）〜（Ｉ）
のオリゴ糖である、糖成分および担体、とくにタンパク
質またはペプチド、を含む新規糖抱合体に関する。
【０００６】本発明はさらに、上記のように定義された
新規糖抱合体を本質的に含むワクチンに関する。
【０００７】本発明はさらに、一般式（Ａ）〜（Ｉ）の
オリゴ糖の抗原決定基に特異的に向けられることを特徴
とする、モノクローンまたはポリクローン抗体に関す
る。
【０００８】本発明はさらに、上記のように定義された
モノクローンまたはポリクローン抗体が結合するエピト
ープを含む腫瘍関連抗原に関する。
【０００９】本発明はさらに、一般式（Ａ）〜（Ｉ）の
オリゴ糖が結合する担体マトリックスからなる免疫吸着
体、さらに一般式（Ａ）〜（Ｉ）のオリゴ糖を精製する
ための上記抗体が結合するための担体マトリックスから
なる、上記のように定義された抗体の精製のための免疫
吸着体に関する。
【００１０】本発明はさらに、分離されたリンパ球の抗
原特異性刺激による免疫原性のインビトロ決定法に関
し、これはリンパ球を両生類の卵の粘液性被膜からのム
チンとともにまたは上記のように定義された新規糖抱合
体とともに再培養して、リンパ球の増殖を［3Ｈ］−チ
ミジンの取り込みによって測定することを特徴とする、
免疫原性のインビトロ決定法に関する。
【００１１】最後に、本発明は、両生類の、とくにサン
ショウウオ科の両生類の腹子からの粘液性被膜の多様な
新規の使用に関し、それには次のようなものが含まれ
る。 − 上記のように定義された少なくとも追加の一つのＦ
ｕｃ残基および少なくとももう一つのＧａｌ、ＧａｌＮ
Ａｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＦｕｃまたはＫＤＮ残基が存在す
る構造要素Ｇａｌ（β１−４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１−
３）を有するオリゴ糖を得るための使用。 − 抗−Ｌｅx、抗−Ｌｅyおよび抗−ＫＤＮ抗体の調製
のための使用。 − ３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロ
ソン酸（ＫＤＮ）の調製のための使用。 − イムノアッセイに提供するための使用。 − 腫瘍の治療のためのワクチンの調製のための使用。
【００１２】
【従来の技術】糖タンパク質および糖脂質（糖抱合体）
は自然界に広く分布している。これらは生物の生化学に
おいて広範の多様な機能を有しており、これらの重要性
は、一分子中の極性炭水化物部分（グリカン）および非
極性タンパク質または脂質部分の異なる性質に帰すると
ころが少なくない。
【００１３】このように、グリカン部分の構造は、組織
表面に、とくに腫瘍細胞にしばしば見出だされる（腫瘍
関連抗原）抗原決定基と同一であるエピトープを表すこ
とが知られている。これは、抗原作用を有する特定の糖
タンパク質または糖脂質が、健康な細胞よりも腫瘍細胞
表面に、通常、有意に多量に観察されることを意味して
いる。
【００１４】腫瘍関連抗原の場合には、これらは一般に
発達が制限された抗原として表現され、したがってま
た、腫瘍胎児型（oncofetal）抗原とも呼ばれる（Kakom
ori、 1989、 Adv. Cancer Res. 52、 257）。
【００１５】グリカン部分のいくつかの構造あるは部分
構造は、抗原決定基として詳細に特徴づけられている。
すなわち、LewisＸ（ＬｅxまたはＳＳＥＡ−１）決定基
は、分化している多数の細胞の表面に検出された（例え
ば、Feiziら、 1981、 Nature292、 5819: Hakomori、 198
4、 J. Biol. Chem. 259、 4672: Fukushiら、 1984、 J.Bi
ol. Chem. 259、 4681）。LewisＹ（Ｌｅy）と呼ばれる
別の決定基およびＡ−Ｌｅyと呼ばれるその変異体は種
々のガン細胞に見出だされて、検出されている（例え
ば、Hakomori、 1989、 Adv. Cancer Res. 52、 257: Magn
aniら、 1983、 Cancer Res. 43、 5489: Abeら、 1983、 J.
Biol. Chem. 258、 11793: Nudelmanら、 1986、 J. Bio
l. Chem. 261、 11247）。
【００１６】Ｌｅxは、構造要素Ｇａｌ（β１−４）−
［Ｆｕｃ（α１−３）］−Ｇｌｃ−Ｎａｃ（β１−３）
であることを意味し、Ｌｅyは構造要素Ｆｕｃ（α１−
２）−Ｇａｌ（β１−４）−［Ｆｕｃ（α１−３）］−
ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）を意味し、Ａ−Ｌｅyは構造
要素ＧａｌＮＡｃ（α１−３）−［Ｆｕｃ（α１−
２）］−Ｇａｌ（β１−４）−［Ｆｕｃ（α１−３）］
−ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）を意味し、略号の意味は上
記の通りである。
【００１７】抗原作用を有する天然産の糖抱合体の研究
されたものの多くで、グリカン部分はタンパク質マトリ
ックスに結合している（Ｏ−またはＮ−グリコシド結合
による）。ＧｌｃＮＡｃ−またはＧａｌＮＡｃ−が末端
糖残基としてしばしば見られる。ＧａｌＮＡｃ（α１−
３）−ＧａｌＮＡｃ（α１−３）−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の
ような組み合わせはまた、ヒト腸管癌細胞で見出だされ
た。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】抗原決定基を有するオ
リゴ糖または糖抱合体は、このように、診断医学、臨床
薬理学および癌の治療に重要な化合物である。したがっ
て、当然、対応する化合物を得るためのニーズがある。
このタイプの化合物は適切な組織からのみ、しかも少量
しか得られない。さらに、腫瘍細胞を得るのはきわめて
難しい。他の方法としては、基本的に要求されるオリゴ
糖の化学合成が考えられる。しかし、このタイプの合成
には多くの中間段階を経るという欠点があり、そのいく
つかは複雑で、立体化学的な特別の配慮を必要とする。
その結果、収率が通常は低くなる。
【００１９】したがって、本発明の目的は、抗原決定基
を有するオリゴ糖および対応する抱合物を簡単な方法
で、適正な費用で、経済的に充分な量で提供することで
ある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】オリゴ糖がきわめて簡単
に、また驚くほど大量に、高収量で、両生類の、とくに
サンショウウオ科の両生類の腹子の粘液性被膜から、粘
液性被膜に存在するムチンからの化学的除去によって得
ることができることが、今日、見出だされた。本発明に
よるオリゴ糖は全て、構造的要素Ｇａｌ（β１−４）−
ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）、プラスこれを介してムチン
のタンパク質部分への結合が起きている一つのＧａｌＮ
ＡｃまたはＧａｌＮＡｃ−オール残基を有しており、さ
らにフコースと結合する。化合物は、一般に構成分Ｇａ
ｌ、ＧａｌＮＡｃ（Ｇａｌ−ＮＡｃ−オール）、Ｇｌｃ
ＮＡｃ、Ｆｕｃおよび、場合によってまた、ＫＤＮから
なる。
【００２１】とくに、サンショウウオのPleurodelesお
よびAxolotl属における一般式（Ａ）〜（Ｉ）の化合物
は、分離されて、特徴づけされた。しかし、本発明によ
れば、両生類の卵の粘液性被膜は、一般に抗原決定基を
有し、かつ上記のそれぞれの構成分からなる多様な構造
物を有する、フコシル化オリゴ糖の豊かな提供源である
ことを強調しなくてはならない。
【００２２】両生類の卵の粘液性被膜に存在する多くの
糖抱合体は、グリカン部分にＫＤＮ残基を含む。ＫＤ
Ｎ、すなわち３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラク
トノウロソン酸は、天然産のノイラミン酸の脱アミノ誘
導体である。今日まで、ＫＤＮはマスおよびサケの腹子
からのみ検出されており、それから分離される量はわず
かである（Nadanoら、1986、 J. Biol. Chem. 261、 1155
0: Kanamoriら、 1990、 J. Biol. Chem. 265、 21811: In
oueら、 1991、 Proc. XIth Int. Symp. Glycoconj.、 Tor
onto）。ＫＤＮは、その直接的または間接的な抗原作用
（特異性、親和性）の点で重要な役割を果たす化合物と
みなされている。ＫＤＮは合成によって調製できないこ
とはないが、きわめて難しい。このような理由から、本
発明による両生類の卵の粘液性被膜はまた、ＫＤＮの調
製源として期待される。
【００２３】両生類の種に関係なく、両生類の卵の粘液
性被膜に対して炭水化物部分は、４５〜５５％、とくに
４８〜５２％の範囲を占めている。粘液性被膜それ自体
が腹子の大部分を構成し、これは大量のグリカンが得ら
れることを意味する。例えば、Pleurodeles waltliiの
粘液性被膜１６０ｍｇ（乾燥重量）から本発明による化
合物の一般式（Ａ）〜（Ｄ）の純粋な化合物の１６〜２
５ｍｇが得られ、本発明によるその他の化合物のそれぞ
れ４〜６ｍｇを単離することができる。このように、四
つの化合物（Ａ）〜（Ｄ）は、全グリカンの１０〜１５
％を占める。
【００２４】Axolotl mexicanumの場合は分画されたオ
リゴ糖のいくつだけが特徴づけあるいは同定されている
ことから、全体のグリカン中の化合物（Ｅ）〜（Ｉ）の
含量は比較的低いが、この場合も基本的にはPleurodele
s waltliiの場合と同様である。
【００２５】さらに、一般式（Ａ）〜（Ｄ）の本発明の
オリゴ糖は、新規糖ペプチド、新規糖タンパク質または
新規糖脂質などの新規抱合体の調製に適していることが
見出だされた。オリゴ糖がハプテンとしてのみ作用す
る、すなわち免疫応答を引き起こさないことから、本発
明のグリカン残基を直接に、あるいは適宜にリンカーを
介して、適当なタンパク質、ペプチドまたは脂質と結合
させることが必要である。このようにして調製される新
たな新規抱合体はまた、これら新規抱合体の一つまたは
それ以上を含むワクチンの調製、およびこれら抱合体の
グリカン部分の抗原決定基と相互反応することができる
モノクローンまたはポリクローン抗体の調製に用いるこ
とができる。
【００２６】さらに、適当な試料を精製するために適し
ている対応する免疫吸着体を簡単な方法で調製できるこ
とが見出だされた。
【００２７】抗体調製物を精製するために、本発明によ
るオリゴ糖を担体マトリックスと結合させる。適当な担
体材料、結合方法および精製方法は、当業者に既知であ
る。オリゴ糖または新規糖抱合体を精製するために、抗
体を担体マトリックスに結合させる。このための担体材
料、結合方法および精製方法は同じく、当業者に既知で
ある。
【００２８】最後に、ヒトリンパ球はインビトロで本発
明による新規糖抱合体または対応する天然の糖抱合体
（ムチン）によって刺激されることが見出だされた。こ
れは標識したチミジンの取り込みによって定量的に測定
することができる。
【００２９】この明細書に添付した図面を説明すると、
図１は、Pleurodeles waltliiからのオリゴ糖アルジト
ール混合物のＨＰＬＣを説明する図である。後者は、Pl
eurodeles waltliiの卵の粘液性被膜の凍結乾燥物から
還元的β−除去によって得られる。担体としては、アミ
ノプロピルシリル相を有するシリカゲル（SUPELCOSIL R
ＬＣ−ＮＨ2、スイスのSupelco社製）を用いる。移動
相：ＣＨ3ＣＮ／ＫＨ2ＰＯ4（３０ｍＭ、ｐＨ７．０）
＝６５：３５（ｖ／ｖ）、１ｍｌ／分、検出：２０６ｎ
ｍ。
【００３０】 ピークＩ： 一般式（Ａ）の化合物 ピークＩＩ： 一般式（Ｂ）の化合物 ピークＩＩＩ： 一般式（Ｃ）の化合物 ピークＩＶ： 一般式（Ｄ）の化合物を示す。
【００３１】図２は、Pleurodeles waltliiからの誘導
体化したオリゴ糖アルジトール混合物（メチルグリコシ
ドのトリフルオル酢酸塩）のＧＣを説明する図である。
オリゴ糖混合物は、Pleurodeles waltliiの卵の粘液性
被膜の凍結乾燥物からメタノリシスによって得られる。
Zanettaら（１９７２、J. Chromatogr. 69、 291）によ
る記載のようにして試料を調製する。カラム：クロモソ
ーブＱ、シリコーン５％、ＯＶ１０１（１ｍ×０．３２
ｃｍ）、バリアンＧＣ。
【００３２】メソイノシトールを標準として用いる。Ｆ
ｕｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃおよびＫＤ
Ｎの略号の意味は上記の通りである。
【００３３】図３は、Axolotl mexicanumからのオリゴ
糖アルジトール混合物のＨＰＬＣを説明する図である。
後者は、Axolotl mexicanumの卵の粘液性被膜の凍結乾
燥物から還元的β−除去によって得られる。担体として
は、アミノプロピルシリル相を有するシリカゲル（SUPE
LCOSILRＬＣ−ＮＨ2、スイスのSupelco社製）を用い
る。 （ａ）酸性分画ＩＩの混合物を説明する図（本文、実施
例を参照されたい）。
【００３４】 ピークＡ３： 一般式（Ｇ）の化合物 ピークＡ５： 一般式（Ｈ）の化合物 ピークＡ６： 一般式（Ｉ）の化合物 ピークＡ１、Ａ２、Ａ４はさらには調べられなかった。
【００３５】移動相：ＣＨ3ＣＮ／ＫＨ2ＰＯ4（３０ｍ
Ｍ、ｐＨ７．０）＝６５：３５（ｖ／ｖ）、１ｍｌ／
分、検出：ＵＶ２０６ｎｍ。 （ｂ）中性分画ＩＩＩ（本文、実施例を参照されたい）
の混合物を説明する図である。
【００３６】 ピークＮ３： 一般式（Ｅ）の化合物 ピークＮ４： 一般式（Ｆ）の化合物 ピークＮ１、Ｎ２、Ｎ５〜Ｎ１０はさらには調べられな
かった。
【００３７】移動相：ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ＝６５：３５
（ｖ／ｖ）、１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２０６ｎｍ。
【００３８】図４は、Axolotl mexicanumからの誘導体
化したオリゴ糖アルジトール混合物（メチルグリコシド
のトリフルオル酢酸塩）のＧＣを説明する図である。オ
リゴ糖混合物は、Axolotl mexicanumの卵の粘液性被膜
の凍結乾燥物からメタノリシスによって得られる。Zane
ttaら（１９７２、J. Chromatogr. 69、 291）による記
載のようにして試料を調製する。カラム：クロモソーブ
Ｑ、シリコーン５％、ＯＶ１０１（１ｍ×０．３２ｃ
ｍ）、バリアンＧＣ。Ｆｕｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、
ＧａｌＮＡｃおよびＫＤＮの略号の意味は上記の通りで
ある。
【００３９】とくに記載がなければ、文献から既知の従
来の標準法を、本発明による化合物および試薬の分離、
精製、特徴づけおよび調製のために用いる。
【００４０】サンショウウオ、カエルまたはヒキガエル
などの両生動物は広く分布しており、それらの天然の棲
息地で直接に捕獲するか、あるいは関連専門業者の水産
飼養所から入手することができる。これら動物の腹子も
同様で、これから必要な卵を得る。このように、本発明
を実施するための出発材料、すなわち卵の粘液性被膜の
獲得には問題がない。
【００４１】以下に、本発明を一般的なかたちで説明す
る。一般式（Ａ）〜（Ｄ）の化合物の調製 両生類の種であるPl. waltliiの腹子を、好ましくは機
械的に処理して、実質的に卵をそれをとりまいている厚
い粘液性被膜から除去する。ゼリー状の物質を凍結乾燥
して、乾燥材料をβ−除去に供する。
【００４２】β−除去によって、好ましくはＯ−グリコ
シド結合を有する糖タンパク質が切断される（例えば、
Downsら、 1977、 Int. J. Peptide Protein Res. 10、 31
5: Aminoffら、 1980、 Anal. Biochem. 101、 44）。すな
わち、凍結乾燥した材料を、５０〜１００ｍＭの例えば
ＫＯＨまたはＮａＯＨ、好ましくはＮａＯＨなどのアル
カリ溶液中で、好ましくはＮａＢＨ4またはＫＢＨ4、し
かしとくにＮａＢＨ4などの水素転移還元剤と、２０〜
４５℃、好ましくは３５〜４０℃で、約２０〜５０時
間、好ましくは２４〜３０時間反応させる（Carlson、 1
966、 J. Biol. Chem. 241、 2984）。
【００４３】Ｎ−グリコシド結合が存在すれば、その切
断はこれら条件で完全に除外することはできない（例え
ば、Anal. Biochem. (1982)、 119、 351）。
【００４４】上記の条件で、タンパク質残基が結合して
いた糖残基（これは本発明による化合物における残基Ｘ
である）が得られ、これをその解放鎖型（アルデヒド
型）に変換して、還元的条件によって対応する糖アルコ
ールに変換する。他の糖残基は不変のままで、もとの環
状型が保持される。
【００４５】反応を、好ましくは低温（０〜５℃）で、
例えばDowexT.M.（Biorad製）のような陽イオン交換樹
脂の添加によって停止させて、次いでｐＨを５〜６に調
整する。溶液を好ましくは濾過して、結果として生じる
ホウ酸を、例えばそのメチルエステルのかたちで、蒸留
によって、これから除去し、次いで溶液を標準法によっ
て脱塩する。
【００４６】還元されたグリカンを調製用あるいは半調
製用ＨＰＬＣを用いて、本発明の方法で分画する。分画
は、他の方法、例えばゲル濾過によっても同様に行うこ
とができる。
【００４７】ＨＰＬＣのための適当な担体材料は、アミ
ノ化された相を有するシリカゲルである。アミノプロピ
ルシリル相が好ましい。しかし、最終分析においては、
糖および糖誘導体の分離のために知られている全ての担
体および相が適している。溶出液として好ましく使用さ
れるものには、アセトニトリル／緩衝液またはアセトニ
トリル／水混合物がある。
【００４８】四つの画分が得られ、その三つは純粋型と
して（一般式（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）の化合物）、
四つ目の画分は主要成分が構造（Ｃ）を有する二つの異
性体として得られる（第１図）。
【００４９】本発明による物質は、標準法によって、好
ましくはガスクロマトグラフィー（Zanettaら、 1972、
J. Chromatogr. 69、 291）（第２図）、ペーパークロマ
トグラフィー、ＨＰＬＣ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペク
トル分析、薄層クロマトグラフィーおよびマススペクト
ルによって、特徴づけられる（実施例を参照された
い）。
【００５０】凍結乾燥した材料の糖タンパク質切断は、
本発明によれば弱アルカリ条件下で行うことができる。
弱アルカリ加水分解は、還元剤の添加以外は上述したの
と同様の条件下で、例えば０．５〜１０ｍＭのＮａＯＨ
を用いて行う。この場合には、結果として、環状構造が
完全に保持された天然の（非還元型）グリカンが得られ
る。
【００５１】天然型グリカンは、対応するアルジトール
に関する既述のものと同じ方法で同じ試薬を用いて分画
される。相対的保持時間を僅かだけ変化している類似し
たクロマトグラフィーパターン（第１図および第２図）
が得られる。一般式（Ｅ）〜（Ｉ）の化合物の調製 ：両生類の種であ
るA. Mexicanumの腹子を、好ましくは機械的に処理し
て、実質的に卵をそれをとりまいている厚い粘液性被膜
から除去する。ゼリー状の物質を凍結乾燥して、乾燥材
料をβ−除去に供する。
【００５２】Axolotalからのムチンの還元的β−除去
は、上記と同様に行う。β−除去の結果、脱塩の後に三
つの異なる不均質な画分が得られる。一つの画分（用い
られる凍結乾燥材料の約７〜８％）は、高分子量成分の
みを含み、この後更には用いられない。画分２（約４〜
５％）は、酸性成分を含み、ただちにクロマトグラフィ
ーによる精製に供される。ＨＰＬＣの後、第３（ａ）図
からのピークＡ１からＡ６までが得られる。この場合、
ピークＡ３、Ａ５およびＡ６は一般式（Ｇ）、（Ｈ）お
よび（Ｉ）の化合物に対応する。第三の画分（約１５〜
２０％）は中性および酸性成分を含み、好ましくは陰イ
オン交換樹脂上でさらに精製してから、脱塩する。
【００５３】ピークＮ１〜Ｎ１０は、ＨＰＬＣの後に中
性画分から得られ、ピークＮ３およびＮ４は化合物
（Ｅ）および（Ｆ）に対応する。第二および第三の画分
からの他のピークは、第三の画分からの酸性成分のよう
にさらなる特徴づけおよび使用は本発明では行われなか
った。
【００５４】精製および分析のための方法および試薬
は、Pleurodelesからのオリゴ糖の精製のための上記の
ものに対応する。ＫＤＮを含まない一般式（Ａ）〜（Ｉ）のオリゴ糖の調
製 ＫＤＮの調製 ：ＫＤＮ残基の除去は、本発明によれば、
好ましくは遊離のオリゴ糖またはそれらのアルジトール
から行われる。ＫＤＮ残基のみがオリゴ糖から除去され
て他のＦｕｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡ
ｃ残基は結合したままになるような化合物が選択され
る。除去は、好ましくは無機または有機の弱酸、例えば
ギ酸で、４０〜１２０℃の温度で行われる。ＫＤＮと脱
シアリル化オリゴ糖またはそれらのアルジトールとの分
離は、例えば標準法によるゲル濾過によって簡単に行わ
れる。新規糖タンパク質／ペプチドの調製 ：本発明によるオリ
ゴ糖（Ａ）〜（Ｉ）は、天然の非還元型であり、標準法
によって適当なタンパク質またはペプチドと結合させる
ことができ、これによってそれぞれ免疫原性を発揮する
ことができる。
【００５５】「Advances in Carbohydrate Chemistry」
（1980、 Vol. 37、 225）に、適切な結合法が多数記載さ
れている。オリゴ糖（Ａ）〜（Ｉ）の抱合物は、好まし
くはGrayの方法（Arch. Biochem. Biophys. 163、 (198
4)、 426）によって調製される。すなわち、タンパク質
またはペプチドの一つのアミノ基を、ＢＨ3ＣＮ-の作用
によってオリゴ糖のＯ−グリコシドのＣ原子に結合させ
る（化合物（Ａ）〜（Ｉ）中の残基Ｘで、Ｘは好ましく
はＧａｌＮＡｃである）。もちろん、対応する抱合体
を、例えば適当な保護基を炭水化物残基に導入するなど
の炭水化物またはタンパク質化学の他の既知の方法によ
って調製することも可能である。
【００５６】適当なタンパク質の例としては、ヒトまた
はウシの血清アルブミン（ＨＳＡ、ＢＳＡ）、キーホー
ルカサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）、コレラトキシンまたは破傷風トキシンなどがあ
る。
【００５７】タンパク質またはペプチドはまた、スペー
サーまたはリンカーを介して本発明のオリゴ糖の一つに
結合させることもできる。適当なリンカーの例として
は、ＣＨ2ＯＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＲの型の化合物が
ある。ここで、Ｒは１〜４個のＣ原子を有するアルキル
であり、ｎは４から１２までの、好ましくは８の、整数
である。
【００５８】このタイプの抱合体は、例えば、Lemieux
らの方法（J. Am. Chem. Soc. 97、 (1975)、 4076および
Can. J. Biochem. 55、 (1977)、 507）によって調製され
る。すなわち、オリゴ糖のリンカーとの最初の反応にお
いて、そのエステル基がヒドラジド基を介してアジド基
に変換される。最後に、後者が要求されるペプチドまた
はタンパク質と反応する。新規糖脂質の調製 ：本発明によるオリゴ糖はまた、標準
法によって脂質とも結合することができる。この場合、
Wangら（Anal. Biochem. 144 (1984)、 366）の還元的ア
ミノ化を用いることが可能であり、有利である。この方
法では、実際の脂質残基が官能基を介して導入される。
用いられる試薬には、例えば、市販のヘキサデシルアニ
リンがあげられる。また、他の脂質残基を同様にしてア
ニリンに結合させることも可能である。中間体として形
成されるイミドは、好ましくはＢＨ3ＣＮ-で還元され
る。この方法は、シアリル基（ＫＤＮ）を含む新規抱合
物のためにとくに適している。免疫吸着体の調製 ：本発明によって調製されるオリゴ糖
は、効果的な単一特異性の免疫吸着体の調製に用いるこ
とができる。このタイプの免疫吸着体は、例えば、血清
から望ましくない抗体を除去する場合および吸着／脱着
法による特異的抗体の分離および精製のために、きわめ
て重要である。これらの場合には、抗原決定基を含む糖
は担体に強固に結合している。
【００５９】他の場合には、抗体を担体に共有結合によ
って（例えば、ＣＮＢｒ-活性化セファロースＣ１−４
Ｂ、ファルマシア社製：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０／１５
／１０２、Biorad社製）または非共有結合によって（例
えば、スタフィロコッカスタンパク質Ａ−セファロース
Ｃ１−４Ｂ、ＳＰＡ−ＳｅｐｈT.M.、ファルマシア社
製）結合させることが可能で、これによって糖混合物中
の対応する抗原決定基をこのタイプの抱合体上で精製ま
たは分画することが可能である。
【００６０】免疫吸着体のための適当な担体材料として
は、アミノ化セファロース、アミノ化ポリスチレン、ポ
リビニルアミン、アミノ化ポリビニルアルコール、アミ
ノ化ポリビニルアクリルアミド、アミノエチルセルロー
ス、アミノ化カルボキシメチルセルロース、アミノ化カ
ルボキシメチルアガロース、アミノ化ガラスまたはアミ
ノ化シリカゲルがあげられる。これらの物質は、ビーズ
またはラテックスとして用いることができるが、無機ま
たは有機材料でつくられたプレート、チューブまたはチ
ューブ材料の表面に使うことも可能である。
【００６１】対応する免疫吸着体は、例えばEricksonら
（Biochem. Biophys. Res. Commun.43、 1164 (1971)）
による、またはEP-A 0 044 188またはUS 4、238、473また
はLemieux（Chem. Soc. Rev. 7、 (1978)、 423）またはM
azidら（Bioconjugate Chem.、 2、 (1991)、 32）によ
る、標準法によって調製することができる。インビトロの免疫原性の決定 インビトロイムノアッセイは、本発明によって提供され
る。ここでは、ヒト白血球を分離して、既知の方法で精
製して、本発明による新規糖抱合体、好ましくは新規糖
タンパク質／ペプチドとともにインキュベートする。こ
れによって、リンパ球が刺激されて、増殖が増す。この
増強される刺激は、加えた放射性標識したチミジンの取
り込みの増加によって簡単に測定することができる。本
発明によ って増加する増殖は、用いられる新規糖抱合体にもよる
が、４０〜６５％の間である。
【００６２】
【実施例】
［実施例１」Pleurodeles Waltliiからの凍結乾燥した
粘液性被膜１６０ｍｇを５０ｍＭのＮａＯＨおよび１．
０ＭのＮａＢＨ4（１０ｍｌ）中で攪拌しながら暗所で
３７℃で２４時間反応させる。反応を約４℃でDowex
T.M.５０×８（２５〜５０メッシュ、Ｈ+型、Biorad社
製）を添加して、ｐＨを約４．５に調整して、反応を止
める。溶液を濾過して、０．１ＭのＮａＯＨを用いてｐ
Ｈを５．５に調整して、濃縮する。結果として生じるホ
ウ酸をメタノール添加を繰り返しながら蒸留することに
よってメチルエステルとして除去する。次いで、バイオ
−ゲルＰ２カラム（２×５０ｃｍ、ファルマシア社製）
上で脱塩を行う。 ［実施例２］実施例１のようにして調製されたオリゴ糖
アルジトールをＨＰＬＣによって分画する。担体材料と
しては、アミノプロピルシリル相でコートしたシリカゲ
ルカラム（SupelcosilT.M.ＬＣ−ＮＨ2、スイスのSupel
co社によって供給される）を用いる。混合物をアセトニ
トリル／ＫＨ2ＰＯ4（３０ｍＭ、ｐＨ７．０）＝６５：
３５（１ｍｌ／分）で溶出する。検出をＵＶ２０６ｎｍ
で行う。第１図の四つのピークを得る。各分画で約６ｍ
ｇの純粋の物質が得られる。
【００６３】 ピークＩ： 一般式（Ａ）の化合物 ピークＩＩ： 一般式（Ｂ）の化合物 ピークＩＩＩ： 一般式（Ｃ）の化合物 ピークＩＶ： 一般式（Ｄ）の化合物 分析をガスクロマトグラフィー（第２図）および1Ｈ−
および13Ｃ−ＮＭＲ分光分析（BRUKER AM-400 WB分光
器）によって行う。化学的シフトを表１および表２に示
す（アセトン（２７℃でＤ2Ｏ中）およびＤＳＳをそれ
ぞれリファレンスとして測定）。一般式（Ａ）〜（Ｄ）
の化合物は、それぞれのアルジトールのかたちである
（Ｘ＝ＧａｌＮＡｃ−オール）。
【００６４】
【表１】化合物（Ａ）〜（Ｄ）の1Ｈ ＮＭＲシフト
【００６５】
【表２】化合物（Ｄ）の13Ｃ ＮＭＲシフト ［実施例３］実施例２のようにして得られたオリゴ糖ま
たはそれらのアルジトールを溶出液を取り除いた後に、
水に取り上げ、ギ酸を最終濃度が０．１Ｍになるように
加える。溶液を１００℃で約１時間インキュベートし
て、次いで０．１ＭのＮａＯＨで中和する。最後に、溶
液をセファデックスＧ−２５カラムに通す。ほとんど定
量的な収量で、一般式（Ａ）〜（Ｄ）の脱シアリル化オ
リゴ糖およびＫＤＮ（３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ
−ガラクトノヌロソン酸）が得られる。 ［実施例４］Axolotl mexicanumからの凍結乾燥した粘
液性被膜１．９ｇを５０ｍＭのＮａＯＨおよび１．０Ｍ
のＮａＢＨ4（３００ｍｌ）中で攪拌しながら暗所で３
７℃で２４時間反応させる。反応を約４℃でDowexT.M.
５０×８（２５〜５０メッシュ、Ｈ+型、Biorad社製）
を添加して、ｐＨを約４．５に調整して、反応を止め
る。溶液を濾過して（濾液約１．３ｇ）、０．１ＭのＮ
ａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整して、濃縮する。結
果として生じるホウ酸をメタノール添加を繰り返しなが
ら蒸留することによってメチルエステルとして除去す
る。次いで、バイオ−ゲルＰ４カラム（２×８０ｃｍ、
Pharmacia社製）上で脱塩を行う。
【００６６】三つの画分が得られる。Ｐ４カラムからの
画分（ピーク）Ｉは高分子量化合物（１２３ｍｇ）のみ
を含んでおり、これは廃棄される。画分（ピーク）ＩＩ
は酸性成分（８０ｍｇ）を含み、直接にＨＰＬＣ精製に
供される（実施例５）。画分（ピーク）ＩＩＩは酸性お
よび中性化合物（３２０ｍｇ）を含む。混合物をDowes
T.M.１×２カラム（Biorad社製、メッシュ２００〜４０
０、ＨＣＯＯ-型、２×１５ｃｍ）上にのせる。カラム
から、中和成分を水で溶出し、酸性成分を酢酸ピリジン
緩衝液（４０ｍＭ）で溶出する。 ［実施例５］実施例４のようにして調製されたオリゴ糖
アルジトールをＨＰＬＣによって分画する。担体材料と
して、アミノプロピルシリル相でコートされたシリカゲ
ル（SupelcosilT.M.ＬＣ−ＮＨ2、スイスのSupelco社
製）を用いる。酸性化合物の混合物をアセトニトリル／
ＫＨ2ＰＯ4（３０ｍＭ、ｐＨ７）＝６５／３５で溶出
し、中性化合物の混合物をアセトニトリル／水＝６５／
３５（１ｍｌ／分）で溶出する。検出はＵＶ２０６ｎｍ
によって行う。
【００６７】画分ＩＩＩ（実施例４）の酸性化合物は、
本発明ではさらには使用しない。
【００６８】画分ＩＩの酸性化合物は、第３図（ａ）の
ＨＰＬＣパターンを示す。ここで、ピークＡ３、Ａ５お
よびＡ６は本発明の化合物（Ｇ）、（Ｈ）および（Ｉ）
に対応する。
【００６９】画分ＩＩＩの中性化合物は、第３図（ｂ）
のＨＰＬＣパターンを示す。
【００７０】 ピークＮ３： 一般式（Ｅ）の化合物 ピークＮ４： 一般式（Ｆ）の化合物 ピークＮ１、Ｎ２、Ｎ５〜Ｎ１０はさらには調べられな
い。
【００７１】ピークＮ２は、既知の構造物ＧｌｃＮＡｃ
（β１−３）−ＧａｌＮＡｃ−オールに対応する。
【００７２】分析を、ガスクロマトグラフィー（第４
図）および1Ｈ−および13Ｃ：ＮＭＲ分光分析（BRUKER
AM-400 WB分光器）によって行う。化学的シフトを表１
および２に示す（アセトン（２７℃でＤ2Ｏ中）および
ＤＳＳをそれぞれリファレンスとして測定）。一般式
（Ｅ）〜（Ｉ）の化合物は、それぞれのアルジトールの
かたちである（Ｘ＝ＧａｌＮＡｃ−オール）。
【００７３】表３〜５は、化合物（Ｇ）〜（Ｉ）の1Ｈ
および13Ｃ ＮＭＲシフトに関するデータを含む。
【００７４】
【表３】化合物（Ｇ）の1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲシフト
【００７５】
【表４】化合物（Ｈ）の1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲシフト
【００７６】
【表５】化合物（Ｉ）の1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲシフト
【００７７】
【表６】化合物（Ｅ）（＝ピークＮ３）、（Ｆ）（＝ピ
ークＮ４）およびピークＮ２の1Ｈ ＮＭＲシフト ［実施例６］実施例２のようにして得られたオリゴ糖ま
たはそれらのアルジトールを溶出液を取り除いた後に、
水に取り上げ、ギ酸を最終濃度が０．１Ｍになるように
加える。溶液を１００℃で約３時間インキュベートし
て、次いで０．１ＭのＮａＯＨで中和する。最後に、溶
液をセファデックスＧ−２５カラムに通す。ほとんど定
量的な収量で、一般式（Ａ）〜（Ｄ）の脱シアリル化オ
リゴ糖およびＫＤＮ（３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ
−ガラクトノヌロソン酸）が得られる。 ［実施例７］式中のＸがＧａｌＮＡｃである一般式
（Ｂ）の精製された化合物３００μmolおよびウシ血清
アルブミン１μmolを０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２．５ｍｌ＋トルエン１滴に溶解する。１．６mmol
のＮａＢＨ3ＣＮを加えて、混合物を３７℃で連続して
攪拌しながら約７日間インキュベートする。次いで、結
合していないオリゴ糖および過剰の試薬を膜フィルター
（ＰＭ １０、ミリポア社製）を通す濾過によって除去
し、抱合体を水による繰り返しの充分な洗浄によって得
る。
【００７８】反応の進行をガスクロマトグラフィーで追
跡する。 ［実施例８］一般式（Ｅ）のオリゴ糖とヒト血清アルブ
ミンとの糖抱合体を実施例７と同様にして調製する。 ［実施例９］化合物（Ｃ）および８−メトキシカルボニ
ルオクタノールから対応する８−メトキシカルボニルオ
クチルサッカリドおよび、これにエタノールに溶かした
ヒドラジンから対応するヒドラジド化合物を調製するた
めに、Lemieuxら（前出）の方法を用いる。１００μmol
の乾燥した、ヒドラジンを含まない化合物を１．５ｍｌ
の乾燥ＤＭＦ中にとりいれ、無水ジオキサンに溶かした
４００μmolの３．６Ｍ ＨＣｌを加える。溶液を約−２
０℃に冷却して、１００μｌのＤＭＦに溶かした１４０
μmolの亜硝酸ｔ−ブチルを加える。３０分の後に、Ｄ
ＭＦ（１００μｌ）に溶かした４０μmolのスルファミ
ン酸を加えて、温度を−３０℃まで下げる。２μmolの
ウシ血清アルブミンを０．０８ＭのＮａ2Ｂ4Ｏ7に溶か
した０．３５ＭのＫＨＣＯ3 からなる緩衝液（ｐＨ９．
０）に溶解し（２５ｍｇタンパク質／ｍｌ緩衝液）、ア
ジ化物を含む溶液に加える。リンカー−Ｏ−（ＣＨ2）8
−ＣＯ−を介して結合した対応する新規糖抱合体が得ら
れる。 ［実施例１０］糖抱合体を、一般式（Ｉ）のオリゴ糖お
よびヒト血清アルブミンから実施例９と同様にして調製
する。 ［実施例１１］５ｍｇの一般式（Ｄ）の天然のオリゴ糖
を５０μｌの水に溶解し、２５０μｌのヘキサデシルア
ニリン溶液（３６ｍｇを２５０μｌクロロホルム中に溶
解）を加える。溶液を５０℃で２時間インキュベートし
て、次いで２５０μｌのシアノホウ水素化ナトリウム溶
液（２５ｍｇを２５０μｌメタノール中に溶解）を加え
る。溶液を３７℃で１６時間インキュベートして、窒素
下で乾燥するまで蒸発させる。残滓をアルカリ水（ＮＨ
3でｐＨ９にしたもの）にとりあげ、これを各回１ｍｌ
のクロロホルムで数回抽出する。新規糖脂質は水相に存
在する。反応をＴＬＣ（シリカゲル６０（独国メルク社
製）、クロロホルム／メタノール／水＝１３０／５０／
９、オルシノール／Ｈ2ＳＯ4による染色）でチェックす
る。 ［実施例１２］有孔ガラスビーズ（０．０７５〜０．１
５ｍｍ）を、３−アミノプロピルトリエトキシランを用
いて標準条件下でアミノ化する（Westphalら、 1974、 Me
thodsof Enzymology 34(b)、 64）。アミン含量は、Esko
ら（Acta Chem. Scand. 22 (1968)、 3342）の方法によ
って７５μmol／ｇと決定される。
【００７９】環状型または解放鎖アルデヒド型の一般式
（Ｆ）の化合物を、標準法（上記を参照されたい）によ
って対応するアジ化アシルに変換し、既知の方法（上記
を参照されたい）で担体のＮＨ2基に結合させる。次い
で、過剰のアミノ基を５％無水酢酸の飽和重炭酸ナトリ
ウム水溶液で室温で２０分間処理することによってアセ
チル化する。最後にビーズを水で洗浄して、空気乾燥さ
せる。 ［実施例１３］カルボキシル基を含むポリアクリル樹脂
を、標準条件下で、１００ｍｌの水に溶かしたエチレン
ジアミン（２１ｇ）および１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリノ−エチル）カルボジイミドメト−ｐ−
トルエンスルホネート（１５ｇ）の混合物を用いてｐＨ
５で２４時間でアミノ化する。次いで、洗浄して乾燥し
た樹脂を、リンカーとして８−ヒドロキシカルボニルオ
クチルを上記のようにして結合させた一般式（Ｈ）のオ
リゴ糖と反応させる。担体の未反応のアミノ基を再びア
セチル化する。 ［実施例１４］ヒト白血球を、ヘパリンを加えたヒト末
梢血からデキストラン沈降およびフィコールハイパック
（Ficoll Hypaque）濃度勾配遠心分離によって精製す
る。精製した白血球を、５％ヒト血清を加えたこの目的
に適した培地（例えば、米国ギブコ社製のＲＰＭＩ１６
４０）に再懸濁させる（２×１０6細胞／ｍｌ）。実施
例９の新規糖タンパク質を加えて、インキュベーション
を３７℃で４日間行う。
【００８０】０．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを加えて、
インキュベーションを２４時間続ける。次いで細胞を集
めて、放射能活性の取り込みを液体シンチレーションカ
ウンターで測定する。白血球増殖の増加が５８％と算出
される。 ［実施例１５］実施例８の新規糖抱合体を燐酸塩緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、この１
ｍｌを１ｍｌのフロインドの完全アジュバントとともに
混合する。
【００８１】四羽のウサギにそれぞれ各回０．１ｍｌの
エマルジョンを注射して免疫する。注射は１週間間隔で
３回行い、３カ月後に再度行った。免疫された動物から
の血清をポリクローン抗体に関してＥＬＩＳＡで調べ
る。 ［実施例１６］実施例１０のようにして得られた新規糖
抱合体を燐酸塩緩衝生理食塩水に溶解し（１ｍｇ／ｍ
ｌ）、この１ｍｌを１ｍｌのフロインドの完全アジュバ
ントとともに乳化する。１０週令の雌マウスに２５μｇ
の抗原を腹腔内に注射してそれぞれ免疫する。注射は週
に１回５週間行う。さらなる注射を続いて１月間隔で２
回行う。融合（Fusion）を標準法（KohlerおよびMilste
in (1975)、 Nature 256、 495）で最後のブースター注射
後３日に行う。動物を殺し、脾臓を取り出す。分離され
た脾臓細胞をアミノプテリン感受性マウスＰ３×６３Ａ
ｇ８ミエローマ細胞と１０：１の割合でポリエチレング
リコール溶液（３５％）中で融合させる。ハイブリドー
マ細胞を、４５％ハイブリドーマ培地（ギブコ社製）、
１０％ウシ胎児血清、４５％ＲＰＭＩ培地およびアミノ
プテリンを含む培地中で培養する。それぞれの細胞系を
抗原との反応性に関して、ＥＬＩＳＡ（実施例１７およ
び１８）および免疫染色法（実施例１９）を用いて調べ
た。 ［実施例１７］実施例１１のようにして調製した新規糖
脂質をエタノールに溶解して（１ｍｇ／ｍｌ）、短時間
超音波処理して、次いで燐酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．５）で希釈して、最終濃度を５μｇ／ｍｌにする。
【００８２】この溶液の５０μｌをポリスチレンプレー
ト（例えばNunc社製の高結合性プレート）のウェルにピ
ペットで入れ、４℃で一晩インキュベートして、燐酸塩
緩衝生理食塩水＋１％ＢＳＡ（ｐＨ７．５）で３回洗浄
する。
【００８３】ブロッキングステップを燐酸塩緩衝生理食
塩水＋１％ＢＳＡ（ｐＨ７．５）を加えることによって
３７℃で１時間行う。
【００８４】５０μｌのハイブリドーマ上清をそれぞれ
のウェルにピペットで入れて、３７℃で２時間インキュ
ベートする。未結合の抗体材料を３回洗浄することによ
って除去する。
【００８５】結合した第一の抗体は、ペルオキシダーゼ
で標識された第二の抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ−カッ
パＬ鎖−ＨＲＰＯ、１：５００希釈）で検出される（５
０μｌ／ウェル）。インキュベーションは３７℃で２時
間行う。未結合の抗体を上記のようにして洗い出す。
【００８６】ペルオキシダーゼを検出するための試薬
は、０．０１％Ｈ2Ｏ2を含む燐酸塩／クエン酸塩緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶かした０．０４％ｏ−フェニレンジ
アミンであり、測定はＳＬＴリーダーで４９２ｎｍで行
う。 ［実施例１８］ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法） 調製法 実施例１０のようにして調製した新規糖タンパク質を、
燐酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に溶解する（５μ
ｇ／ｍｌ）。
【００８７】この溶液の５０μｌをポリスチレンプレー
ト（例えば、Nunc社製の高結合性プレート）のそれぞれ
のウェルにピペットで入れ、４℃で一晩インキュベート
して、燐酸塩緩衝生理食塩水＋１％ＢＳＡ（ｐＨ７．
５）で３回洗浄する。
【００８８】ブロッキングステップを燐酸塩緩衝生理食
塩水＋１％ＢＳＡ（ｐＨ７．５）を加えることによって
３７℃で１時間行う。 方法 ５０μｌのハイブリドーマ上清をそれぞれのウェルにピ
ペットで入れて、３７℃で２時間インキュベートする。
未結合の抗体材料を３回洗浄することによって除去す
る。
【００８９】結合した第一の抗体は、ペルオキシダーゼ
で標識された第二の抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ−カッ
パＬ鎖−ＨＲＰＯ、１：５００希釈）で検出される（５
０μｌ／ウェル）。インキュベーションは３７℃で２時
間行う。未結合の抗体を上記のようにして洗い出す。
【００９０】ペルオキシダーゼを検出するための試薬は
０．０１％Ｈ2Ｏ2を含む燐酸塩／クエン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）に溶かした０．０４％ｏ−フェニレンジアミ
ンであり、測定はＳＬＴリーダーで４９２ｎｍで行う。 ［実施例１９］ 薄層クロマトグラフィー免疫染色（ＴＬＣ免疫染色） ＴＬＣ免疫染色法は、本質的にはMagnaniによる文献
（J. Biol. Chem.、 257、14365、 1982）に記載の方法で
行う。必要な詳細はこの文献に見出だされる。新規糖脂
質を、クロロホルム／メタノール／０．０２％ＣａＣｌ
2（６０：３５：８または５５：４５：１０）を用いる
ＴＬＣによって分析する。０．２ｍｍシリカゲル６０
（メルクＮｏ．５５４８）でコートした高速薄層クロマ
トグラフィープレートを用いる。実施例１１のようにし
て調製された新規糖脂質をエタノールに１ｍｇ／ｍｌに
溶解して、３〜５μｌの試料溶液を使用する。展開した
プレートを空気乾燥して、２％プレキシガム溶液（独国
Roth社製）でコートする。非特異的結合を防ぐために、
続いて燐酸塩緩衝生理食塩水＋１％ＢＳＡ（ｐＨ７．
５）を用いてコートし、再び空気乾燥する。
【００９１】実施例１６からの培養上清でプレートをコ
ートして、室温で一晩インキュベートする。未結合の抗
体を洗い出す（燐酸塩緩衝生理食塩水＋１％ＢＳＡ（ｐ
Ｈ７．５）で５回）。抗−マウスＩｇＧ（１：５００）
をペルオキシダーゼで標識した第二抗体として用いる。
インキュベーションは、緩やかに振盪しながら室温で２
時間行う。プレートを上記のようにして洗浄して、検出
試薬（エタノールに溶かした４−クロロ−１−ナフトー
ルおよび０．０１％Ｈ2Ｏ2を含むトリス緩衝生理食塩
水）を加える。インキュベーションは、緩やかに振盪し
ながら、暗所で１５分間行う。次いで、検出試薬を注ぎ
出し、トリス緩衝生理食塩水を加える。肉眼観察によっ
て、新規糖脂質と抗体との反応による紫色のバンドが認
められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Pleurodeles waltlii 由来オリゴ糖アルジトー
ル混合物高速液体クラマトグラム。
【図２】Pleurodeles waltlii 由来オリゴ糖アルジトー
ル混合物（メチルグリコシドのトリフルオル酢酸塩）の
ガスクロマトグラム。
【図３】Axolotl mexicum 由来オリゴ糖アルジトール混
合物高速液体クラマトグラムであり（ａ）は酸性分画II
の混合物（ｂ）は中性分画III の混合物のものである。
【図４】Axolotl mexicum 由来オリゴ糖アルジトール混
合物（メチルグリコシドのトリフルオル酢酸塩）のガス
クロマトグラム。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｂ 37/18 7433−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｇ 8413−4Ｃ (72)発明者 メアリー エム． ベンディグ イギリス国 エヌダブリュ６ １ティーエ ックス ロンドン ウェスト ハンプステ ッド ソレント ロード 64 (72)発明者 キャサリン エー． ケトルバラ イギリス国 ダブリュディー２ ５ダブリ ュ ハートフォードシャー ワットフォー ド ミルトン ストリート 28 (72)発明者 ジョゼ サルダニャ イギリス国 イーエヌ１ アイティーイー ミドルセックス エンフィールド リン カーン ウェイ 22

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記一般式、すなわち 【化１】 の、実質的に純粋なかたちの新規の抗原決定基を含むオ
    リゴ糖。ただし、上記式においてＸは、ＧａｌＮＡｃ、
    ＧａｌＮＡｃ−オール、 ｎは、０または１、 ＧａｌはＤ−ガラクトース、 ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、 ＧａｌＮＡｃは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、 ＧａｌＮＡｃ−オールは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
    サミニトール、 Ｆｕｃは、Ｌ−フコース、そしてＫＤＮは、３−デオキ
    シ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロソン酸を表す。
  2. 【請求項２】 一般式（Ａ）〜（Ｄ）中のｎが１である
    ことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴ糖。
  3. 【請求項３】 粘液性被膜を、両生動物の腹子から分離
    し、それに含まれる糖タンパク質（ムチン）を化学的に
    切断し、そして得られる遊離のオリゴ糖の混合物を天然
    型またはアルジトール型にクロマトグラフィーによって
    精製し、適宜、式中のｎが０である一般式（Ａ）〜
    （Ｄ）の化合物の場合にはＫＤＮ残基を化学的に除去す
    ることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴ糖の調製
    法。
  4. 【請求項４】 ムチンの切断を還元的β−除去によって
    化学的に行うことを特徴とする、請求項３に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 ムチンの原材料としてサンショウウオ科
    の動物の腹子を選択することを特徴とする、請求項３ま
    たは４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 PleurodelesまたはAxolotl属、とくにPl
    eurodeles waltliiまたはAxolotl mexicanum種の動物を
    選択することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 糖成分が請求項１に記載のオリゴ糖であ
    ることを特徴とする、糖成分が適宜リンカーを介して担
    体に結合している糖成分および担体を含む新規糖抱合
    体。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の新規糖タンパク質、新
    規糖ペプチドまたは新規糖脂質。
  9. 【請求項９】 本質的に請求項７または８に記載の新規
    糖抱合体を含むワクチン。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載のオリゴ糖の抗原決定
    基に特異的に向けられることを特徴とする、モノクロー
    ンまたはポリクローン抗体。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のモノクローンまた
    はポリクローン抗体に結合するエピトープを含むことを
    特徴とする、腫瘍関連抗原。
  12. 【請求項１２】 一般式（Ａ）〜（Ｉ）のオリゴ糖が結
    合している担体マトリックスからなる、請求項１０に記
    載の抗体を精製するための免疫吸着体。
  13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の抗体が結合してい
    る担体マトリックスからなる、一般式（Ａ）〜（Ｉ）の
    オリゴ糖を精製するための免疫吸着体。
  14. 【請求項１４】 リンパ球を両生類の卵の粘液性被膜か
    らのムチンとともにまたは請求項７または８に記載の新
    規糖抱合体とともに再培養して、リンパ球の増殖を［3
    Ｈ］−チミジンの取り込みによって測定することを特徴
    とする、分離されたリンパ球の抗原特異性刺激による免
    疫原性のインビトロ決定法。
  15. 【請求項１５】 少なくとも追加の一つのＦｕｃ残基
    および少なくとももう一つのＧａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇ
    ｌｃＮＡｃ、ＦｕｃまたはＫＤＮ残基が存在する構造要
    素Ｇａｌ（β１−４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）を有
    するオリゴ糖を得るための、両生動物の腹子の粘液性被
    膜の使用。ただし、略号は上記の意味を表す。
  16. 【請求項１６】 抗−Ｌｅx、抗−Ｌｅyおよび抗−ＫＤ
    Ｎ抗体の調製のための、両生動物の腹子の粘液性被膜の
    使用。
  17. 【請求項１７】 ３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガ
    ラクトノヌロソン酸（ＫＤＮ）の調製のための、両生動
    物の腹子の粘液性被膜の使用。
  18. 【請求項１８】 イムノアッセイに提供するための両生
    動物の腹子の粘液性被膜の使用。
  19. 【請求項１９】 腫瘍の治療のためのワクチンの調製の
    ための、両生動物の腹子からの粘液性被膜の使用。
  20. 【請求項２０】 サンショウウオ科、とくにPleurodele
    sおよびAxolotl属の両生動物の腹子の粘液性被膜を用い
    ることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項
    に記載の使用。
JP30114592A 1991-11-13 1992-11-11 両生動物の卵の粘液性被膜からの抗原決定基を有するオリゴ糖 Pending JPH05247100A (ja)

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DE19914137236 DE4137236A1 (de) 1991-11-13 1991-11-13 Oligosaccharide mit antigenen determinanten aus der schleimhuelle von amphibieneiern
DE4137236-0 1991-11-13

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JP30114592A Pending JPH05247100A (ja) 1991-11-13 1992-11-11 両生動物の卵の粘液性被膜からの抗原決定基を有するオリゴ糖

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006058260A (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 Tokai Univ 糖結合性ファージ提示型抗体の解析方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2006058260A (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 Tokai Univ 糖結合性ファージ提示型抗体の解析方法

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EP0542145A1 (de) 1993-05-19
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